CN104073488A

CN104073488A - 一种矮化小麦标记基因的分子标记及其引物和应用

Info

Publication number: CN104073488A
Application number: CN201410340571.XA
Authority: CN
Inventors: 曹爱忠; 卢媛; 邢莉萍; 陈佩度; 王秀娥; 张瑞奇; 王海燕; 张守忠; 肖进
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2014-07-16
Filing date: 2014-07-16
Publication date: 2014-10-01
Anticipated expiration: 2034-07-16
Also published as: CN104073488B

Abstract

本发明属于分子遗传育种领域，公开一种矮化小麦标记基因的分子标记及其引物和应用。本发明确定了小麦矮化基因Rht‐x的分子标记GWM122、WMC296，两者与Rht‐x的距离分别为4.7cM、5.5cM。同时，本发明还公开了两个分子标记引物对序列，通过该引物序列进行PCR扩增、多态性统计分析以及Joinmap4.0作图软件确定分子标记的方法。上述分子标记及其引物可以在分子水平上快速筛选出矮化基因，从而用于矮化小麦育种，简便、快速，可大大提高育种效率。

Description

一种矮化小麦标记基因的分子标记及其引物和应用

技术领域

本发明属于分子遗传育种领域，涉及一种矮化小麦标记基因的分子标记及其引物和应用。

背景技术

小麦是全球性的重要粮食作物，全世界有35％‐40％的人以小麦为主食。株高是禾本科作物的重要农艺性状，其不仅影响了植株表型，还会影响作物产量。随着小麦生产条件的不断改善，小麦品种的倒伏仍是小麦减产的重要因素，因此，通过矮化育种提高小麦的单位面积产量就成了全球育种家们的研究热点。

普通小麦(Triticum aestivum L.)有21对染色体，每对染色体包含两条一样的染色体，这21条染色体分别为1A，1B，1D，2A，2B，2D，3A，3B，3D，4A，4B，4D，5A，5B，5D，6A，6B，6D，7A，7B，7D，普通小麦常用AABBDD表示。

近年来，随着分子标记技术的发展、高密度的分子遗传图谱的出现，通过分子标记辅助育种，进行小麦优良性状选育育种已进行了较多研究，但主要集中于小麦抗病性选育工作中，如中国专利CN102618638A中获得了小麦基因Xbarc1096、Xwmc310的特异性片段以此作为分子标记选育小麦抗条锈病基因Yr50；中国专利CN101935654A中获得小麦黄花叶病主效基因QTL的分子标记Xwmc327‐180、Xgwm154‐105进行小麦抗病品系选育。但少有报道通过分子标记在分子水平上进行矮化小麦选育工作。

目前，小麦中定名的矮秆基因已有34个(Ji,Y.,M.Miao,and X.Chen,Progresses on themolecular genetics of dwarf character in plants.Molecular Plant Breeding,2006.14.)，分布于小麦染色体的不同位置，这些矮秆基因可以引入或聚合到高秆品种中，选育出矮化、高产品种。但传统育种方法费时、费力、表型鉴定困难、育种效率低，通过分子标记辅助选择育种可以有效解决这一问题。

发明内容

本发明的目的是确定一种经过诱变的矮秆小麦连锁遗传图谱，从而对该小麦矮秆基因进行定位确定，寻找出与该基因紧密相连的分子标记，可用于小麦矮化育种、矮化性状的早期分子辅助选择，以提高育种效率。

为实现上述目的，本发明采用了以下方案：

获得突变矮秆小麦即本发明所利用的对象，具体方法为：(1)用0.35％的EMS(甲基磺酸乙酯)处理南农9918；(2)对M₁代按单穗收获；(3)播种M₂代穗行，对其田间农艺性状进行全生育期观察，寻找矮秆突变体；(4)该突变体按单株收获；(5)将此单株种植M₃代株系，进行表型鉴定，M₃代株系突变性状能够稳定遗传，命名为NM9。(6)M₄代重复鉴定其表型，其矮秆突变性状能稳定遗传，从而获得该矮秆小麦，命名为NM9，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014.5.22，保藏号为CCTCC P201408。

确定该种矮秆小麦的矮化基因：通过利用矮化突变体NM9(♀)和其野生型南农9918(♂)杂交获得F₁，自交获得F₂分离群体，提取分离群体各单株的DNA，通过遗传分析明确NM9矮杆小麦的矮化由一对部分隐性基因控制，命名为Rht‐x。

小麦矮化基因Rht‐x连锁的分子标记，选自分子标记GWM122或WMC296中的任意一种；

用上游引物GWM122-F：SEQ ID NO.1,下游引物GWM122-R:SEQ ID NO.2对矮化小麦NM9基因组DNA进行PCR扩增，扩增出一条150bp的特异性片段为分子标记GWM122，利用Joinmap4.0作图软件进行统计分析，测得该标记与矮化基因Rht-x距离为4.7cM；

或用上游引物WMC296-F：SEQ ID NO.3，下游引物WMC296-R：SEQ ID NO.4对矮化小麦NM9基因组DNA进行PCR扩增，扩增出一条170bp特异性片段为分子标记WMC296，利用Joinmap4.0作图软件进行统计分析，测得该标记与矮化基因Rht-x距离为5.5cM。

本发明所述的矮化基因Rht‐x连锁的分子标记在小麦种质资源中矮化基因Rht‐x鉴定中的应用，其中Rht‐x位于小麦2A染色体GWM122和GWM71之间，利用分子标记GWM122或WMC296的引物对小麦矮化突变体NM9或其衍生品种的基因组DNA进行扩增，扩增产物电泳分离，如果能够扩增到所述分子标记对应的目标条带，则说明待鉴定小麦品种中含有矮化基因Rht‐x，反之，则不含该基因；所述的小麦矮化突变体NM9衍生品种是指以小麦矮化突变体NM9为亲本，通过杂交或遗传转化方法获得的小麦品种。

本发明所述的矮化基因Rht‐x连锁的分子标记在筛选矮化小麦中的应用，利用分子标记GWM122或WMC296的引物对小麦矮化突变体NM9或其衍生品种的基因组DNA进行扩增，扩增产物电泳分离，通过判断能否扩增到所述分子标记对应的目标条带，预测待筛选品种是否属于矮化小麦；所述的小麦矮化突变体NM9衍生品种是指以小麦矮化突变体NM9为亲本，通过杂交或遗传转化方法获得的小麦品种。

用于扩增所述的分子标记GWM122或WMC296的引物，分子标记GWM122引物如下：GWM122‐F:5'GGGTGGGAGAAAGGAGATG3'(SEQ ID NO.1)；

GWM122‐R:5'AAACCATCCTCCATCCTGG3'(SEQ ID NO.2)。

分子标记WMC296引物如下：

WMC296‐F:5'GAATCTCATCTTCCCTTGCCAC3'(SEQ ID NO.3)；

WMC296‐R:5'ATGGAGGGGTATAAAGACAGCG3'(SEQ ID NO.4)。

本发明所述的分子标记引物在克隆小麦矮化基因Rht‐x中的应用。

本发明所述的分子标记引物在鉴定小麦矮化基因Rht‐x中的应用，其特征在于利用分子标记GWM122或WMC296的引物对小麦矮化突变体NM9或其衍生品种的基因组DNA进行扩增，扩增产物电泳分离，如果能够扩增到所述分子标记对应的目标条带，则说明待鉴定小麦品种中含有矮化基因Rht‐x，反之，则不含该基因；所述的小麦矮化突变体NM9衍生品种是指以小麦矮化突变体NM9为亲本，通过杂交或遗传转化方法获得的小麦品种。

本发明所述的分子标记引物在筛选矮化小麦中的应用，利用分子标记GWM122或WMC296的引物对小麦矮化突变体NM9或其衍生品种的基因组DNA进行扩增，扩增产物电泳分离，通过判断能否扩增到所述分子标记对应的目标条带，预测带筛选品种是否属于矮化小麦；所述的小麦矮化突变体NM9衍生品种是指以小麦矮化突变体NM9为亲本，通过杂交或遗传转化方法获得的小麦品种。

本发明所述的分子标记的确定方法，包括如下步骤：

(1)利用矮化突变体NM9和高秆品种苏麦3号杂交获得F₂后代单株；

(2)取矮化突变体NM9、高秆品种苏麦3号以及步骤(1)中杂交后代小麦样品，用CTAB法提取各组小麦样品基因组DNA；

(3)利用其他图谱中SSR和EST标记，以步骤2)中提取的小麦基因组DNA为模板进行PCR扩增，对NM9和苏麦3号及其杂交后代基因组DNA进行统计分析，统计分析在亲本间具有多态性的位点在后代群体中的遗传类型，构建NM9矮化小麦的遗传连锁图谱，确定与矮化基因紧密连锁分子标记。

其中，PCR扩增的反应体系中PCR试剂组成为：含20‐100ngDNA的1μL DNA模板，1.0μL10×PCR buffer，0.8μL MgCl₂，0.8μL dNTP，左右引物各0.2μL，0.15μL Taq DNA polymerase，4.85μL ddH2O；PCR程序为：94℃预变性3min；然后94℃变性30s，55℃复性50s，72℃延伸1min，36个循环；最后72℃延伸10min；10℃保存；PCR扩增反应后扩增产物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺质量比19:1的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，再用银染法检测。

本发明的有益效果为：

(1)本发明不受环境条件影响，通过获得的与矮化基因Rht‐x连锁的分子标记GWM122、WMC296预测小麦矮化性，在已知的分子标记中GWM122与Rht‐x最为紧密，距离仅为4.7cM，为准确鉴定矮化基因Rht‐x从而筛选出矮秆品系提供可能，这将大大提高产矮化小麦育种效率。

(2)矮化基因Rht‐x为一对部分隐性基因控制，而位于小麦2A染色体上的分子标记GWM122和WMC296与该矮秆基因紧密连锁，从而可以在筛选出该矮秆基因基础上，通过简单杂交和农艺性状观察选择，便可在低世代选育出稳定的矮化小麦品系，这可以大大减少育种中操作过程，降低育种成本。

(3)本发明另一个贡献是提供了该矮化小麦的连锁遗传图谱，从而为接下来该矮化基因Rht‐x精细定位、克隆研究提供方便。此外，本发明提供的2个最为紧密连锁遗传的分子标记即GWM122、WMC296均为SSR标记，较之其他类型使用更为方便、快速。

附图说明

图1NM9及其野生型表型；

图2为2个共显性SSR标记WMC296，GWM122对NM9×苏麦3号F₂代部分单株的扩增结果；

由图2可见，SSR共显性标记WMC296、GWM122在矮秆亲本NM9(Pd)、矮秆DNA混合池(Bd)及纯合矮秆单株(D)中均能分别扩增出一条170bp、150bp的PCR特异条带。而WMC296、GWM122在高秆亲本苏麦3号(Pt)、高秆DNA混合池(Bt)及纯合高秆单株(T)中分别扩增出了180bP和170bP的特异条带，未能扩增出150bp的特异条带。WMC296、GWM122在重组体中扩增出杂合带型。以上结果表明，SSR共显性标记WMC296、GWM122与Rht‐x紧密连锁。

M:Marker；Pd：矮秆亲本NM9；Pt：高秆亲本苏麦3号；Bd：矮秆DNA池；Bt：高秆DNA池；D:纯合矮秆株；T：纯合高秆株；*：重组体基因型。

图3在2A染色体上Rht‐x的图谱位置；

图42个共显性SSR标记WMC296，GWM122在21份普通小麦中国春缺体‐四体材料上的扩增结果；

1,Marker；2,水对照；3,中国春；4,NM9；5,苏麦3号；6,N1AT1D；7,N1BT1D；8,N1DT1B；9,N2AT2D；10,N2BT2D；11,N2DT2A；12,N3AT3D；13,N3B/T3D；14,N3DT3B；15,N4AT4D；16,N4BT4D；17,N4DT4B；18,N5AT5D；19,N5BT5A；20,N5DT5B；21,N6AT6D；22,N6BT6A；23,N6DT6B；24,N7AT7D；25,N7BT7D；26,N7DT7B.

图5共显性SSR标记GWM122在含不同小麦矮秆基因的小麦品种DNA中的扩增；

M：Maker；1：NM9；2：苏麦3号(Rht8)；3：中国春(不含小麦矮秆基因)；4：郑9405(Rht‐B1b,Rht‐D1b)；5：烟农19(Rht‐D1b)；6：矮苏麦3号(Rht‐B1c)；7：扬麦5号(Rht8)；8：西农04(Rht‐D1c)；9：烟农23(Rht‐B1b,Rht‐D1b)；10：XN0004(Rht21)。

生物样品保藏信息

小麦种子NM9(Triticum aestivum NM9)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014.5.22，保藏号为CCTCC P201408，保藏地址为中国武汉大学。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做详细描述。

实施例1

1.矮化小麦获得：

2007年，于南京农业大学细胞遗传研究所用0.35％的EMS(甲基磺酸乙酯)处理南农9918，2008年M₁代按单穗收获。2008年11月播种M₂代穗行，2009年对其田间农艺性状进行全生育期观察，发现一个矮秆突变体，将该突变体按单株收获。2009年将此单株种植M₃代株系，并于2010年进行表型鉴定，发现M₃代株系突变性状能够稳定遗传，命名为NM9，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014.5.22，保藏号为CCTCC P201408。

2.NM9×南农9918和NM9×苏麦3号杂交后代群体构建及表型鉴定：

(1)杂交后代群体构建：通过利用矮化突变体NM9(♀)和其野生型南农9918(♂)杂交获得F₁，自交获得F₂，每个F₂单株自交获得F_2：3株系，用于矮秆基因的遗传分析。通过利用矮化突变体NM9(♀)和高秆品种苏麦3号(♂)杂交获得F₁，自交获得F₂，每个F₂单株自交获得F_2：3株系，用于矮秆基因的遗传图谱的构建。

(2)表型鉴定：用于遗传分析的材料于2010‐2011年种植于南京农业大学江浦农场塑料大棚中。用于遗传图谱构建的材料于2011‐2012年种植于南京农业大学牌楼试验站。播种期为每年的11月5至10日，行长1.2m,行距20cm，每行播10粒，二叶一心期间苗，每行保留长势一致的6株(株距16cm)。塑料大棚在冬季气温较低时，棚内外环境隔离，以提升棚内的温度，提高材料的生长速度；在气温较高的3月中旬至成熟，打开大棚两侧通风降温。所有种植于塑料大棚的F₂、F_2:3均正常成熟。在成株期测量小麦株高，以从植株基部到穗顶(不包括芒)的距离为株高。

3.矮化基因确定

利用矮化突变体NM9(♀)和其野生型南农9918(♂)杂交获得F₁，自交获得F₂分离群体，用于遗传分析，明确NM9的矮化由一对部分隐性基因控制，命名为Rht‐x。

4.标记多态性筛选

利用CTAB法提取亲本NM9、苏麦3号以及矮化突变体NM9(♀)和高秆品种苏麦3号(♂)杂交获得F₂后代单株的DNA，以上述提取的DNA模板，用GrainGenes2.0网站上公布的小麦SSR标记(http://wheat.pw.usda.gov/GG2/index.shtml)进行引物设计，利用设计好的引物进行PCR扩增，对NM9、苏麦3号及其杂交后代基因组DNA进行统计分析，统计分析在亲本间具有多态性的位点在后代群体中的遗传类型，筛选可能的标记分子。

其中引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

PCR扩增的反应体系：PCR试剂组成为：含20‐100ngDNA的1μL DNA模板，1.0μL10×PCR buffer，0.8μL MgCl₂，0.8μL dNTP，上下游引物各0.2μL，0.15μL Taq DNA polymerase，4.85μL ddH2O；PCR程序为：94℃预变性3min；然后94℃变性30s，55℃复性50s，72℃延伸1min，36个循环；最后72℃延伸10min；10℃保存；PCR扩增反应后扩增产物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺质量比19:1的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，再用银染法检测。

5.分子标记获得

根据F_2:3家系的鉴定结果,从F₂代分离群体中选取10株矮秆单株和10株株高正常的单株DNA，等量混合建立株高矮化型池和株高正常型池,用混合分组分析法(bulked segregantanalysis,BSA)对多态性标记进行筛选，分析其与株高矮化性状之间的关系。如果某标记在高秆池电泳结果与其高秆亲本一致，矮秆池电泳结果与其矮秆亲本一致，则说明该标记可能与矮秆基因紧密连锁，最终获得连锁遗传的分子标记GWM122和GWM71。

6.紧密连锁分子标记验证

将与矮秆基因连锁的标记分子在利用矮化突变体NM9(♀)和高秆品种苏麦3号(♂)杂交获得F₁，自交获得F₂分离群体中进行连锁分析，利用Joinmap4.0作图软件进行统计分析，获得NM9矮化小麦的遗传连锁图谱。最终确定矮化基因Rht‐x位于小麦2A染色体GWM122和GWM71之间，与GWM122的遗传距离最近为4.7cM，与GWM71的遗传距离为26.3cM。

实施例2

利用中国春及其21个缺体四体系对Rht‐x连锁标记WMC296、GWM122进行缺体四体定位。21份普通小麦中国春缺体‐四体材料(N1AT1B,N1BT1A,N1DT1A,N2AT2D,N2BT2D,N2DT2A,N3AT3D,N3BT3D,N3DT3B,N4AT4D,N4BT4D,N4DT4B,N5AT5D,N5BT5A,N5DT5B,N6AT6D,N6BT6D)，从美国堪萨斯州立大学引进,由南京农业大学细胞遗传研究所保存。

PCR扩增的反应体系：PCR试剂组成为：含20‐100ngDNA的1μL DNA模板，1.0μL10×PCR buffer，0.8μL MgCl2，0.8μL dNTP，上下游引物各0.2μL，0.15μL Taq DNA polymerase，4.85μL ddH2O；PCR程序为：94℃预变性3min；然后94℃变性30s，55℃复性45s，72℃延伸50s，36个循环；最后72℃延伸10min；10℃保存；PCR扩增反应后扩增产物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺质量比39:1的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，再用银染法检测。

由图4可见，SSR标记WMC296、GWM122除了在N2AT2D中未能扩增出特异条带外，其在作图群体亲本NM9、苏麦3号、中国春及其他20个缺体四体系均能扩增出特异条带，结果表明标记WMC296、GWM122及与其紧密连锁的Rht‐x定位于小麦2A染色体上。

实施例3

利用与Rht‐x紧密连锁的SSR标记GWM122在含有不同Rht基因的小麦材料NM9、苏麦3号(Rht8)、中国春(不含小麦矮秆基因)、郑9405(Rht‐B1b,Rht‐D1b)、烟农19(Rht‐D1b)、矮苏麦3号(Rht‐B1c)、扬麦5号(Rht8)、西农04(Rht‐D1c)、烟农23(Rht‐B1b,Rht‐D1b)、XN0004(Rht21)的DNA中进行PCR扩增。

PCR扩增的反应体系：PCR试剂组成为：含20‐100ngDNA的1μL DNA模板，1.0μL10×PCRbuffer，0.8μL MgCl2，0.8μL dNTP，上下游引物各0.2μL，0.15μL Taq DNA polymerase，4.85μL ddH2O；PCR程序为：94℃预变性3min；然后94℃变性30s，55℃复性45s，72℃延伸50s，36个循环；最后72℃延伸10min；10℃保存；PCR扩增反应后扩增产物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺质量比19:1的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，再用银染法检测。

由图5可见，与Rht‐x紧密连锁的SSR标记GWM122在含有Rht‐x的小麦矮秆材料NM9中能扩增出150bp的特异条带。在不含小麦矮秆基因的中国春，及含不同已知小麦矮秆基因的材料苏麦3号(Rht8)、郑9405(Rht‐B1b,Rht‐D1b)、烟农19(Rht‐D1b)、矮苏麦3号(Rht‐B1c)、西农04(Rht‐D1c)、烟农23(Rht‐B1b,Rht‐D1b)、XN0004(Rht21)中扩增出了160bp的片段，在扬麦5号(Rht8)中扩增出了130bp的片段。GWM122在这些不含Rht‐x的小麦品种中均不能扩增出150bp的特异条带。以上结果表明，SSR标记GWM122在含有Rht‐x的小麦材料中能扩增出150bp的特异条带，可应用于对Rht‐x分子标记辅助选择育种中，加快育种进程。

可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。

Claims

1.小麦矮化基因Rht-x连锁的分子标记，其特征在于：选自分子标记GWM122或WMC296中的任意一种；

2.权利要求1所述的矮化基因Rht-x连锁的分子标记在小麦种质资源中矮化基因Rht-x鉴定中的应用，其中Rht-x位于小麦2A染色体GWM122和GWM71之间，其特征在于利用分子标记GWM122或WMC296的引物对小麦矮化突变体NM9或其衍生品种的基因组DNA进行扩增，扩增产物电泳分离，如果能够扩增到所述分子标记对应的目标条带，则说明待鉴定小麦品种中含有矮化基因Rht-x，反之，则不含该基因；所述的小麦矮化突变体NM9衍生品种是指以小麦矮化突变体NM9为亲本，通过杂交或遗传转化方法获得的小麦品种。

3.权利要求1所述的矮化基因Rht-x连锁的分子标记在筛选矮化小麦中的应用，其特征在于：利用分子标记GWM122或WMC296的引物对小麦矮化突变体NM9或其衍生品种的基因组DNA进行扩增，扩增产物电泳分离，通过判断能否扩增到所述分子标记对应的目标条带，预测待筛选品种是否属于矮化小麦；所述的小麦矮化突变体NM9衍生品种是指以小麦矮化突变体NM9为亲本，通过杂交或遗传转化方法获得的小麦品种。

4.用于扩增权利要求1所述的分子标记GWM122或WMC296的引物，其特征在于：分子标记GWM122上游引物GWM122-F：SEQ ID NO.1,下游引物GWM122-R:SEQ ID NO.2；分子标记WMC296上游引物WMC296-F：SEQ ID NO.3，下游引物WMC296-R：SEQ ID NO.4。

5.权利要求4所述的分子标记引物在克隆小麦矮化基因Rht-x中的应用。

6.权利要求4所述的分子标记引物在鉴定小麦矮化基因Rht-x中的应用，其特征在于利用分子标记GWM122或WMC296的引物对小麦矮化突变体NM9或其衍生品种的基因组DNA进行扩增，扩增产物电泳分离，如果能够扩增到所述分子标记对应的目标条带，则说明待鉴定小麦品种中含有矮化基因Rht-x，反之，则不含该基因；所述的小麦矮化突变体NM9衍生品种是指以小麦矮化突变体NM9为亲本，通过杂交或遗传转化方法获得的小麦品种。

7.权利要求4所述的分子标记引物在筛选矮化小麦中的应用，其特征在于：利用分子标记GWM122或WMC296的引物对小麦矮化突变体NM9或其衍生品种的基因组DNA进行扩增，扩增产物电泳分离，通过判断能否扩增到所述分子标记对应的目标条带，预测待筛选品种是否属于矮化小麦；所述的小麦矮化突变体NM9衍生品种是指以小麦矮化突变体NM9为亲本，通过杂交或遗传转化方法获得的小麦品种。

8.权利要求1所述的分子标记的确定方法，其特征在于包括如下步骤：

(3)利用其他图谱中SSR和PLUG标记，以步骤2)中提取的小麦基因组DNA为模板进行PCR扩增，对NM9和苏麦3号及其杂交后代基因组DNA进行统计分析，统计分析在亲本间具有多态性的位点在后代群体中的遗传类型，构建NM9矮化小麦的遗传连锁图谱，确定与矮化基因紧密连锁分子标记。

9.根据权利要求8所述的确定方法，其特征在于，PCR扩增的反应体系中PCR试剂组成为：含20-100ngDNA的1μL DNA模板，1.0μL10×PCR buffer，0.8μL MgCl₂，0.8μL dNTP，上、下游引物各0.2μL，0.15μL Taq DNA聚合酶，4.85μL ddH2O；PCR程序为：94℃预变性3min；然后94℃变性30s，55℃复性50s，72℃延伸1min，36个循环；最后72℃延伸10min；10℃保存；PCR扩增反应后扩增产物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺质量比19:1的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，再用银染法检测。