CN105525000B - 一种基于QTL-seq发掘东乡野生稻耐冷基因的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于QTL‑seq发掘东乡野生稻耐冷基因的方法。本发明以栽培稻‘协青早B’为受体亲本为母本，东乡野生稻为父本，远缘杂交后连续回交自交获得的重组自交系BC1F10进行耐冷鉴定，获得20耐冷株系组成耐冷基因池，20个冷敏感株系组成的冷敏感基因池。对两个基因池进行高通量测序及QTL‑seq分析，获得两个基因池的差异SNP标记和耐冷性状相关的QTL位点，对候选耐冷基因进行荧光定量PCR检测，最后鉴定检测到东乡野生稻中有5个耐冷相关基因。本发明可快速准确地探明和发掘东乡野生稻耐冷基因，可为全面阐明东乡野生稻耐冷性状的遗传机理提供有力证据，为东乡野生稻耐冷基因的克隆、功能分析奠定基础，促进东乡野生稻耐冷基因用于育种实践。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于QTL-seq发掘东乡野生稻耐冷基因的方法。
背景技术
冷害是水稻生产的主要灾害之一，是影响早春季节和高纬度地区水稻生长发育的重要限制因素。当遇上10-15℃以下的寒潮天气，轻者导致水稻秧苗黄化，生长迟钝；重者导致烂秧、烂芽和死苗等现象，严重影响早稻生产。全世界每年大约有100万hm2水稻在不同生长时期遭受寒害和冷害。因此，水稻耐冷性已成为新时期育种学家普遍关注的课题，并认为选用避冷、耐冷品种是解决水稻冷害的最有效办法。
东乡野生稻是迄今全世界分布最北的普通野生稻，是江西特有的野生资源，素有植物中的‘大熊猫’之称。具有高产、优质、强耐冷、抗旱、抗多种病虫害等优良特性，而其中最突出就是耐冷性。据报道，东乡野生稻地下茎能耐受-12.8℃低温，且苗期耐冷性特强，比粳稻高1个等级。因此，如何更好地保护和发掘这一强耐冷野生稻种资源具有深远的理论和实践意义。
水稻耐冷性状是多基因控制的数量性状，其遗传机理及分子调控网络机制非常复杂，通过传统育种手段挖掘和利用近缘野生种耐冷基因的效率非常低。近年来，随着分子生物学技术的发展以及高密度遗传连锁图谱的构建，为将多个数量性状位点(QuantitativeTraits Loci，QTL)分解成单个可操纵的孟德尔因子提供了强有力的手段和途径。它的基本原理是依据连锁遗传规律，借助分子标记对每个个体基因型分类，分析使用的作图群体中每个个体的基因型与目标性状的表现型之间的关系，从而预测目标性状的QTL位点与分子标记的遗传连锁关系及遗传距离。
传统的QTL定位方法需要依赖于作图群体的构建以及分子标记的发展，这个过程周期长，工作量大，这些严重制约了QTL定位的效率和准确性。高通量测序是对传统测序一次革命性的改变，可以一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。随着测序成本的降低以及生物信息学的发展，将高通量测序与混合分组分析(Bulked Segregant Analysis，BSA)法相结合对数量性状进行快速定位，找到了一种通用方便易于操作的对数量性状进行定位的新方法——QTL-seq。该技术是对BSA混池进行高通量测序，检测常用作图群体如RIL群体或F2群体中极端分离混池的差异SNP标记，分析预测差异SNP标记连锁的候选基因，具有快速、准确定位数量性状等优点，在黄瓜、拟南芥等作物中都已成功应用。本发明利用该技术探明和发掘东乡野生稻中的耐冷基因，为全面阐明东乡野生稻耐冷性状的遗传机理提供有力证据；为东乡野生稻耐冷基因的克隆、功能分析奠定基础，促进东乡野生稻耐冷用于育种实践，加速东乡野生稻有利基因挖掘的分子育种进程。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于QTL-seq发掘东乡野生稻耐冷基因的方法，本发明利用该技术探明和发掘东乡野生稻中的耐冷基因，为全面阐明东乡野生稻耐冷性状的遗传机理提供有力证据；为东乡野生稻耐冷基因的克隆、功能分析奠定基础，促进东乡野生稻耐冷用于育种实践，加速东乡野生稻有利基因挖掘的分子育种进程。
本发明通过以下技术方案来实现的：
(1)耐冷性状极端分离混合基因池的构建：以栽培稻‘协青早B’为受体亲本为母本，东乡野生稻为父本进行远缘杂交，经回交和连续自交获得重组自交系BC1F10，对BC1F10进行耐冷鉴定获得20个强耐冷株系，20个冷敏感株系。分别收集各株系等量的新鲜叶片，将强耐冷株系等量混合组成耐冷基因池，简称R池；将冷敏感株系株系等量混合组成冷敏感基因池，简称S池。用CTAB法提取两个混池的基因组DNA，用琼脂糖电泳的方法检测混池DNA的浓度。技术指标：R池的活苗率80％以上，S池的活苗率低于20％，DNA浓度和纯度达到基因组文库构建要求；
(2)基因组文库构建：检测合格的DNA样品用Covaris超声波破碎仪随机打断成长度为350bp的片段，经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库的构建。随后先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/ul，再使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求进行分型后采用Illumina HiSeq 2500进行测序。技术指标：文库有效浓度＞2nM；
(3)高通量测序：采用Illumina HiSeqTM2500/MiseqTM测序得到的原始图像数据文件经CASAVA碱基识别分析转化为原始测序序列，我们称之为Raw Data或Raw Reads，结果以FASTQ文件格式存储，其中包含各测序reads的序列信息以及其对应的测序质量信息。本次测序R池产生的Raw data为10.933G，过滤后的Clean data 10.785G；S池的Raw data为11.153G，过滤后的Clean data 11.019G的数据量，Q20>＝94.3％、Q30>＝89.4％，GC含量在42.77％-45.06％之间。表明本发明的所有样本的测序数据量足够大，测序质量合格，GC分布正常，建库测序成功。技术指标：每个样品的raw data测序量不低于10G，GC含量需在35-65％正常范围内，Q20>85％；
(4)SNP标记的过滤及SNP-index图的绘制：将R池和S池测序获得的序列与极端耐冷亲本东乡野生稻的基因组序列进行比对，获得两个混池子代与亲本间的SNP标记1,290,297个，计算两混池的SNP-index。SNP-index是指某个SNP位点含有SNP的reads数占该位点所有reads数的比例。某位点的碱基完全与东乡野生稻完全相同时的SNP-index为0；完全与其不同时的SNP-index为1。过滤掉可靠性不高的SNP标记。最后绘制成耐冷池和冷敏感池的SNP-index图谱。技术指标：过滤掉两个子代中SNP-index都小于0.3，并且SNP深度都小于7的SNP位点，另外还过滤掉任何一个混池中SNPindex缺失的SNP位点；
(5)两极端混池的Δ(SNP-index)计算及其图谱绘制：按照绘制SNP-index图的方法绘制两极端混池的Δ(SNP-index)图谱，其中Δ(SNP-index)是耐冷池和冷敏感池中每个SNP标记的SNP-index的差值；
(6)耐冷候选SNP标记的筛选及耐冷性状的定位：选取99％置信水平作为筛选的阈值，分析两个子代SNP-index差异显著的区域，进行1000次置换检验。挑选冷敏感S池中SNP-index接近1，并且耐冷R池的SNP-index接近0的位点，符合这些特点的区域就可能为与耐冷性状相关的QTL位点。结果在99％置信水平下发现候选区域主要位于12号染色体上，在该区域共挑选出2,333个SNP标记。对于12号染色体上的2,333个候选的多态性标记位点，提取ANNOVAR的注释结果。其中有24个SNP非同义突变位点位于基因上，1个在stop loss上，涉及17个基因。在其他染色体上276个SNP位点，涉及9个基因。技术指标：99％置信水平作为筛选的阈值，Δ(SNP-index)接近1；
(7)荧光定量PCR鉴定：参照Invitrogen公司的TRIZOL试剂使用说明书分别提取东乡野生稻和协青早B的总RNA，同时参照Promega公司的Frist-Strand Synthesis of cDNA试剂盒说明书合成cDNA。根据候选SNP标记所涉及基因的编码序列，利用Primer 3.0在线设计荧光定量PCR引物。以水稻肌动蛋白Actin基因作为内标检测基因，检测候选基因的在亲本之间的表达量。荧光定量PCR分析表明，有5个基因在亲本之间表达差异明显，实验重复好。这5个基因分别是8号染色体上的Os08CR，9号染色体上的OS09CR，以及12号染色体上的OS12CR-1，OS12CR-2和OS12CR-3。技术指标：荧光定量PCR重复性好，亲本间的差异表达稳定。
本发明的技术效果是：本发明利用该技术快速准确地鉴定了东乡野生稻中5个耐冷相关基因，具有高效准确、周期短、工作量小等优点。本发明结果可为全面阐明东乡野生稻耐冷性状的遗传机理提供有力的证据，为东乡野生稻耐冷的克隆、功能分析奠定基础，促进东乡野生稻耐冷用于育种实践，加速东乡野生稻有利基因挖掘的分子育种进程。
附图说明
图1为极端耐冷混合基因池冷处理后的表现，各株系成活率80％以上。
图2为极端冷敏感混合基因混池冷处理后的表现，各株系基本死亡。
图3为耐冷池SNP-index图谱，纵坐标为平均SNP-index值，横坐标为各染色体序号及物理位置，图中的曲线为耐冷R池中不同染色体位置上对应的SNP-index值。
图4冷敏感池的SNP-index图谱，纵坐标为平均SNP-index值，横坐标为各染色体序号及物理位置，图中的曲线为冷敏感S池中不同染色体位置上对应的SNP-index值。
图5各条染色体的Δ(SNP-index)图谱，是耐冷池和冷敏感池中每个SNP的SNP-index的差值。图谱的纵坐标是Δ(SNP-index)，横坐标为各条染色体序号及物理位置，图中的曲线为不同染色体位置上对应的Δ(SNP-index)值。Δ(SNP-index)接近1的区域表明有耐冷的候选基因。
具体实施方式
下面将结合附图1-5来详细说明本发明所具有的有益效果，旨在帮助阅
读者更好地理解本发明的实质，但不能对本发明的实施和保护范围构成任何限定。
(1)极端分离混合基因池的构建：以东乡野生稻为供体亲本，与栽培稻“协青早B”杂交获得种间杂种F1，F1代与协青早B回交获得BC1F1群体，经单粒传的连续自交获得BC1F10群体。以活苗率为耐冷鉴定指标。活苗率＝(活苗数/总苗数)×100％。在3叶1心期对BC1F10群体进行耐冷处理(8±1℃处理7d)，随后在25℃条件下恢复生长7d，考察BC1F10群体的活苗率，实验重复3次。结果发现东乡野生稻的活苗率为100％，协青早B的活苗率为17.14％，229个BILs群体活苗率范围为0％～96.16％，平均活苗率为21.59％，最后获得20个活苗率大于80％的耐冷株系(参见图1)，20个活苗率为0的冷敏感株系(参见图2)；
(2)极端基因混池及其双亲的基因组文库构建：将耐冷株系、冷敏感株系及其双亲播种发芽。待所有材料在长至三叶一心时期取幼嫩的叶片，将强耐冷株系等量混合组成耐冷基因池，简称R池；将冷敏感株系株系等量混合组成冷敏感基因池。简称S池。用CTAB法提取两个混池及其双亲的基因组DNA，用琼脂糖电泳的方法检测混池DNA的浓度和纯度。检测合格的DNA样品用Covaris超声波破碎仪随机打断成长度为350bp左右的片段，经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库的构建。随后先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/ul，再使用Agilent 2100对基因组文库的片段大小进行检测，片段大小符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度＞2nM)，以保证文库质量。库检合格后，把不同基因组文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求进行分型(pooling)后采用Illumina HiSeq 2500进行测序；
表1耐冷性状分离后代的极端混池及其双亲高通量测序的主要结果
| 样品 | 测序原始数据(b<sub>p</sub>) | 过滤后的数据(b<sub>p</sub>) | 有效率(％) | 错误率(％) | Q<sub>20</sub>(％) | Q<sub>30</sub>(％) | GC含量(％) |
| R池 | 10,933,824,000 | 10,785,594,000 | 98.64 | 0.04 | 94.30 | 89.40 | 45.06 |
| S池 | 11,153,471,000 | 11,019,870,500 | 98.80 | 0.04 | 94.47 | 89.71 | 42.77 |
| DY | - | 25,414,545,780 | - | - | 96.36％ | - | 43.05％ |
| XB | - | 24,561,463,860 | - | - | 97.12％ | - | 42.76％ |
(3)极端混池的高通量测序：采用Illumina HiSeqTM2500/MiseqTM进行高通量测序得到的原始图像数据文件经CASAVA碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列，我们称之为Raw Data或Raw Reads，结果以FASTQ(简称为fq)文件格式存储，其中包含各测序reads的序列信息以及其对应的测序质量信息。本次测序结果的主要参数见列于表1中，其中R池和S池的原始数据Raw data达22.087G，过滤后数据Clean data达21.805G。衡量测序质量的Q20>＝94.3％，Q30>＝89.4％，GC含量在42.77％～45.06％之间。综上，所有样本的数据量足够，测序质量合格，GC分布正常，建库测序成功；
(4)SNP标记的过滤及SNP-index图的绘制：将耐冷池和冷敏感池获得的测序序列使用BWA软件与东乡野生稻基因组进行比对，分析计算两个子代在亲本间的SNP-index。SNP-index是指某个SNP位点含有SNP的reads数占该位点所有reads数的比例。某位点的碱基完全与东乡野生稻完全相同时的SNP-index为0；完全与其不同时的SNP-index为1。过滤掉两个子代中SNP-index都小于0.3，并且SNP深度都小于7的位点，另外还过滤掉一个子代SNP-index缺失的位点。经过以上筛选，得到过滤后的1,290,297个多态性SNP标记位点。为直观反映两混池SNP-index在染色体上的分布情况，对SNP-index在染色体上的分布进行作图，以每条染色体的物理位置为横坐标，平均SNP-index为纵坐标，分别绘制耐冷池的SNP-index图谱(参见图3)和冷敏感池的SNP-index图谱(参见图4)。
(5)Δ(SNP-index)的计算及其图谱绘制：Δ(SNP-index)是耐冷池和冷敏感池中每个SNP的SNP-index的差值。按照绘制SNP-index图的方法绘制Δ(SNP-index)图。进行1000次置换检验，选取99％置信水平作为筛选的阈值。最终绘制的Δ(SNP-index)图(参见图5)。
(6)候选SNP位点筛选及耐冷性状定位：分析两个极端混池子代的SNPindex差异显著的区域，挑选S池(极端冷敏感混池)的SNPindex接近1，并且R池(极端耐冷混池)SNPindex接近0的位点，符合这些特点的区域就可能为与耐冷性状相关的QTL位点。在99％置信水平下发现候选区域主要位于12号染色体上，在该区域共挑选出2333个SNP位点，对于12号染色体上的2,333个候选的多态性标记位点，提取ANNOVAR的注释结果，其中有24个SNP非同义突变位点位于基因上，1个在stop loss上，涉及17个基因。在其他染色体上276个SNP位点，涉及9个基因。
(7)候选基因的荧光定量PCR鉴定：参照Invitrogen公司的TRIZOL试剂使用说明书分别提取东乡野生稻和协青早B的总RNA，同时参照Promega公司的Frist-StrandSynthesis of cDNA试剂盒说明书合成cDNA。根据候选SNP所涉及基因的编码序列，利用Primer 3.0在线设计荧光定量PCR引物。以水稻肌动蛋白Actin基因作为内标检测基因，检测候选基因的在亲本之间的表达量。反应体系及扩增程序参照Fast SYBR Green MasterMix(2×)(ABI，USA)说明书设定，每样品3重复。荧光定量PCR反应在实时定量PCR分析系统(Step One TM and Step One Plus TM Real-Time PCR Systems，ABI，USA)上进行。荧光定量PCR程序为95℃5min，95℃30s，60℃30s，共40个循环。
荧光定量PCR分析表明，有5个基因在亲本之间表达差异明显，实验重复好。这5个基因分别命名为Os08CR，OS09CR，OS12CR-1，OS12CR-2和OS12CR-3。其中Os08CR位于8号染色体上，OS09CR位于9号染色体上，OS12CR-1，OS12CR-2和OS12CR-3位于12号染色体上。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (1)
1.一种基于QTL-seq发掘东乡野生稻耐冷基因的方法，其特征在于：
(1)耐冷性状极端分离混合基因池的构建：以栽培稻‘协青早B’为受体亲本为母本，东乡野生稻为父本进行远缘杂交，经回交和连续自交获得重组自交系BC1F10，经耐冷鉴定获得20株强耐冷株系，20个冷敏感的株系，分别收集个株系等量的新鲜叶片，将强耐冷株系等量混合组成耐冷基因池，简称R池；将冷敏感株系株系等量混合组成冷敏感基因池，简称S池，用CTAB法提取两个混池的基因组DNA，用琼脂糖电泳的方法检测混池DNA的浓度和纯度，技术指标：R池的活苗率80％以上，S池的活苗率低于20％，DNA浓度和纯度达到基因组文库构建要求；
(2)基因组文库的构建：检测合格的DNA样品用Covaris超声波破碎仪随机打断成长度为350bp的片段，经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库的构建，随后先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/ul，再使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量，库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求进行分型后采用Illumina HiSeq 2500进行测序，技术指标：文库有效浓度＞2nM；
(3)耐冷性状极端分离混池的高通量测序：Illumina HiSeqTM2500/MiseqTM得到的原始图像数据文件经CASAVA碱基识别分析转化为原始测序序列，我们称之为Raw Data或RawReads，结果以FASTQ件格式存储，其中包含测序reads的序列信息以及其对应的测序质量信息，本次测序R池产生的Raw data为10.933G，过滤后的Clean data为10.785G；S池的Rawdata 11.153G，过滤后的Clean data 11.019G，Q20>＝94.3％，Q30>＝89.4％，GC含量在42.77-45.06％之间，各样品的测序质量合格，数据量足够，GC分布正常，建库测序成功，技术指标：每个样品的raw data测序量不低于10G，GC含量需在35-65％正常范围内，Q20>85％；
(4)SNP过滤及SNP-index绘图：将耐冷池和冷敏感池获得的测序序列与极端耐冷亲本东乡野生稻进行比对，获得两个混池子代与亲本间的SNP标记1,290,297个，计算R池和S池的SNP-index，SNP-index是指某个SNP位点含有SNP的reads数占该位点所有read数的比例，混池子代与东乡野生稻完全相同的SNP-index为0；完全与其不同的SNP-index为1，过滤掉可靠性不高的SNP，绘制了耐冷池和冷敏感池的SNP-index图谱，技术指标：过滤掉两个子代中SNP-index都小于0.3，并且SNP深度都小于7的SNP位点，另外还过滤掉一个子代SNPindex缺失的SNP位点；
(5)两极端混池的Δ(SNP-index)计算及其图谱绘制：按照绘制SNP-index图的方法绘制两极端混池的Δ(SNP-index)图谱，其中Δ(SNP-index)是耐冷池和冷敏感池中每个SNP的SNP-index的差值；
(6)耐冷候选SNP位点筛选及耐冷性状的定位：选取99％置信水平作为筛选的阈值，分析两个子代SNPindex差异显著的区域，进行1000次置换检验，挑选冷敏感S池中SNPindex接近1，并且耐冷R池的SNPindex接近0的位点，符合这些特点的区域就可能为与耐冷性状相关的QTL位点，在99％置信水平下发现候选区域主要位于12号染色体上，在该区域共挑选出2333个SNP位点，对于12号染色体上的2,333个候选的多态性标记位点，提取ANNOVAR的注释结果，其中有24个SNP非同义突变位点位于基因上，1个在stop loss上，涉及17个基因，在其他染色体上276个SNP位点，涉及9个基因，技术指标：99％置信水平作为筛选的阈值，Δ(SNP-index)接近1；
(7)荧光定量PCR鉴定：参照Invitrogen公司的TRIZOL试剂使用说明书分别提取东乡野生稻和协青早B的总RNA，同时参照Promega公司的Frist-Strand Synthesis of cDNA试剂盒说明书合成cDNA，根据候选SNP所涉及基因的编码序列，利用Primer 3.0在线设计荧光定量PCR引物，以水稻肌动蛋白Actin基因作为内标检测基因，检测候选基因的在亲本之间的表达量，荧光定量PCR分析表明，有5个基因在亲本之间表达差异明显，实验重复好，这5个基因分别为8号染色体上的Os08CR，9号染色体上的OS09CR，以及12号染色体上的OS12CR-1，OS12CR-2和OS12CR-3，技术指标：荧光定量PCR重复性好，亲本间的差异表达稳定。
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