CN106011275A - 一种东乡野生稻genic-SSR分子标记开发方法 - Google Patents

一种东乡野生稻genic-SSR分子标记开发方法 Download PDF

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Abstract

一种东乡野生稻genic‑SSR分子标记开发方法，所述方法步骤为：东乡野生稻Unigene‑EST序列的获得；东乡野生稻SSR序列的识别；东乡野生稻genic‑SSR引物的设计；东乡野生稻genic‑SSR引物的有效性和通用性鉴定。本发明利用生物信息学方法从东乡野生稻Unigene‑EST序列中挖掘SSR位点，进行genic‑SSR分子标记的开发，克服了东乡野生稻genic‑SSR分子标记获取困难的问题；使用东乡野生稻和不同品种的现代栽培稻对开发的genic‑SSR引物进行PCR鉴定，结果真实可靠；本发明方法简单，操作简便，获得的分子标记数量巨大，为东乡野生稻的遗传学研究及分子育种等奠定基础。

Description

一种东乡野生稻genic-SSR分子标记开发方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种东乡野生稻genic-SSR分子标记开发方法。
背景技术
长期以来，由于育种者片面地追求高产及品种推广的单一化，导致现代栽培稻遗传多样性显著降低。水稻野生资源处于自然生长状态，蕴藏着丰富的基因资源和遗传多样性，是水稻改良极其宝贵的遗传资源。东乡野生稻起源于江西省东乡县（28o14’），是迄今发现的中国乃至全球分布最北的普通野生稻，富含众多优异特性（如高产、胞质不育、育性恢复、强分蘖等）和丰富的抗逆特性（如耐冷、耐旱、抗病、抗虫等），利用东乡野生稻优异基因资源改良栽培稻是水稻育种有效途径。
然而，将野生稻优异基因转移到栽培稻培育新品种往往需要耗费很长的时间。此外，由于野生稻的优异基因常与不利基因紧密连锁，使得育种过程具有较大困难。DNA分子标记可以大大加快育种进程，并且可以定位优异基因的染色体位置，分离优异基因，降低育种难度。在已发明的DNA分子标记中，SSR（simple sequence repeat，简单重复序列）分子标记被认为是最有效和最理想的DNA分子标记，具有许多优点，例如共显性遗传、丰富的基因组多态性、高重复性和多等位性等。此外，SSR分子标记只需要简单和廉价的PCR（聚合酶链式反应）扩增，其产物多态性通常可以通过琼脂糖凝胶电泳分离检测。
依据SSR分子标记在基因组中的位置，可以将其分为两种基本类型，即genomic-SSR分子标记和genic-SSR分子标记。与genomic-SSR分子标记相比，genic-SSR分子标记位于基因的编码区，具有信息量大和通用性好等优点。近几年，随着转录组测序技术快速发展，使得针对没有全基因组参考序列的物种，开发大规模genic-SSR分子标记成为可能。
迄今为止，基于转录组测序技术已有大量genic-SSR分子标记在许多物种中被开发和利用，例如萝卜、亚麻籽、梨、金钱槭等。然而，利用东乡野生稻转录组数据开发genic-SSR分子标记尚未见报道，同时，目前东乡野生稻可用的genic-SSR分子标记也十分有限。因此，利用东乡野生稻转录组序列信息，批量开发genic-SSR分子标记，将会对东乡野生稻种质资源鉴定、遗传多样性、优异性状基因定位及分子标记辅助选择育种等方面起重要推动作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种东乡野生稻genic-SSR分子标记的开发方法，通过网络数据库下载转录组测序数据，利用生物信息学方法获得东乡野生稻Unigene-EST序列，发掘SSR位点，开发引物，构建东乡野生稻genic-SSR分子标记体系。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种东乡野生稻genic-SSR分子标记开发方法步骤为：
1）东乡野生稻Unigene-EST序列的获得：
通过美国国立生物技术信息中心网络数据库下载东乡野生稻转录组高通量测序数据，进行去接头污染序列及低质量reads的处理，获得Unigene集，然后利用TIGR Gene IndicesClustering软件和CD-HIT软件进行组装，最终获得东乡野生稻非冗余Unigene-EST序列。
2）东乡野生稻SSR序列的识别：
采用SSR检索软件MISA对上述步骤(1)得到的非冗余Unigene-EST序列进行SSR位点查找。检索的限定条件为：重复基序为1-6个碱基，重复单元数依次大于12次、6次、5次、5次、4次和4次。
3）东乡野生稻genic-SSR引物的设计：
根据上述步骤(2)识别的SSR位点，使用primer3.0软件批量设计genic-SSR引物，引物设计参数设定为：引物长度18-28 bp；熔解温度55-65oC，60oC为最优温度；产物大小为80-300 bp。
4）东乡野生稻genic-SSR引物的有效性和通用性鉴定：
提取东乡野生稻和现代栽培稻不同品种的基因组DNA，以其为模板进行PCR扩增。PCR扩增反应采用15 μL的反应体系，其中包括50 ng模板DNA、1.5 μL 10×PCR buffer、0.5 mMdNTPs、0.2 μM引物和1U TaqDNA聚合酶；
所述PCR扩增反应程序：95oC预变性5 min；然后进入35个循环95oC变性30s，55-63oC退火30s，72oC延伸30s；最后72oC延伸10 min。
所述PCR扩增反应程序结束后，扩增产物加入2 μL loading buffer，以50 bp DNALadder为DNA分子量标准，进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度为3-4%。电泳结束后，采用紫外凝胶成像系统观察并拍照。依据每条引物扩增的目的片段长度，若有80-300 bp扩增产物检测出，该引物即为有效引物。
利用现代栽培稻的基因组DNA进行引物通用性鉴定，依据每条引物的目的片段长度，若有80-300 bp扩增产物检测出，该引物即具有通用性。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和积极效果：
1）本发明通过网络数据库下载东乡野生稻转录组测序数据进行组装，获得大量东乡野生稻非冗余Unigene-EST序列，极大地增加了genic-SSR分子标记开发所用的原始数据；
2）本发明利用生物信息学方法从东乡野生稻Unigene-EST序列中挖掘SSR位点，进行genic-SSR分子标记的开发，克服了东乡野生稻genic-SSR分子标记获取困难的问题；
3）使用东乡野生稻和不同品种的现代栽培稻对开发的genic-SSR引物进行PCR鉴定，结果真实可靠；
4）方法简单，操作简便，获得的分子标记数量巨大，为东乡野生稻的遗传学研究及分子育种等奠定基础。
附图说明
图 1为本发明中部分SSR重复基序类型和数量：
图中纵坐标轴表示SSR数量，横坐标轴表示SSR重复基序类型；
图 2为随机选取25条genic-SSR分子标记，利用东乡野生稻基因组DNA进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳：
图中：1-18为成功扩增的引物，M：50 bp DNA Ladder；1-18：引物编号；
图 3为利用东乡野生稻和15个现代栽培稻品种的基因组DNA进行genic-SSR分子标记通用性检测（引物 5）；
图中M：50 bp DNA Ladder；1：东乡野生稻；2-16：15个现代栽培稻品种。
具体实施方式
一种东乡野生稻genic-SSR分子标记开发方法，其具体实施方式包括以下步骤：
1）东乡野生稻Unigene-EST序列的获得：
登陆美国国立生物技术信息中心（NCBI）网络数据库，下载东乡野生稻转录组高通量测序数据，进行去接头污染序列及低质量reads的处理，获得地上和地下部分Unigene集。然后利用TIGR Gene Indices Clustering（TGICL，http://sourceforge.net/projects/tgicl/files/tgicl%20v2.1/）软件和CD-HIT（http://www.bioinformatics,org/cd-hit/）软件进行组装，最终获得东乡野生稻非冗余Unigene-EST序列。
2）东乡野生稻SSR序列的识别：
采用SSR检索软件MISA（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa）对得到的非冗余Unigene-EST序列进行SSR位点查找，软件参数设置如下：重复基序为1-6个碱基，重复单元数依次大于12次，6次，5次，5次，4次和4次。
3）东乡野生稻genic-SSR引物的设计：
使用primer3.0（https://sourceforge.net/projects/primer3/files/）软件对SSR位点批量设计genic-SSR引物，引物设计参数设定为：引物长度18-28 bp；熔解温度55-65oC，60oC为最优温度；产物大小为80-300 bp。
4）东乡野生稻genic-SSR引物的有效性和通用性鉴定：
提取东乡野生稻和现代栽培稻不同品种的基因组DNA，以其为模板进行PCR扩增。PCR扩增反应采用15 μL的反应体系，其中包括50 ng模板DNA、1.5 μL 10×PCR buffer、0.5 mMdNTPs、0.2 μM引物和1U TaqDNA聚合酶。
PCR反应程序：95oC预变性5 min；然后进入35个循环95oC变性30s，55-63oC退火30s，72oC延伸30s；最后72oC延伸10 min。
PCR反应结束后，扩增产物加入2 μL loading buffer，以50 bp DNA Ladder为DNA分子量标准，进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度为3-4%。电泳结束后，采用紫外凝胶成像系统观察并拍照。
实施例 1：
应用上述方法从美国国立生物技术信息中心（NCBI）网络数据库中下载获得东乡野生稻正常培养的地上和地下部分组织转录组高通量测序数据，分别进行去接头污染序列及低质量reads的处理，然后组装获得76258条东乡野生稻非冗余Unigene-EST序列（表 1），应用MISA软件共发掘出21226个SSR位点，其中SSR变异类型的频率分布见图 1，使用Primer 3.0软件开发SSR引物3681对。
从3681对设计的SSR引物中随机选取25对，使用东乡野生稻和15个现代栽培稻（表2）的基因组DNA进行引物通用性验证，具体材料信息详见表 2。结果表明：选取的25对引物中18对可在东乡野生稻中检测到清晰的目的扩增条带（表 3），成功率达到72%，说明引物的设计成功率较高（图 2）；以现代栽培稻为模板DNA进行PCR扩增，也可以检测到清晰的目的扩增条带，并且不同品种之间存在多态性，说明这些genic-SSR引物在栽培稻中具有较好的通用性（图 3）。
。
。

Claims (1)

1.一种东乡野生稻genic-SSR分子标记开发方法，其特征在于，所述方法步骤为：
1）东乡野生稻Unigene-EST序列的获得：
通过美国国立生物技术信息中心网络数据库下载东乡野生稻转录组高通量测序数据，进行去接头污染序列及低质量reads的处理，获得Unigene集，然后利用TIGR Gene IndicesClustering软件和CD-HIT软件进行组装，最终获得东乡野生稻非冗余Unigene-EST序列；
2）东乡野生稻SSR序列的识别：
采用SSR检索软件MISA对上述步骤(1)得到的非冗余Unigene-EST序列进行SSR位点查找；检索的限定条件为：重复基序为1-6个碱基，重复单元数依次大于12次、6次、5次、5次、4次和4次；
3）东乡野生稻genic-SSR引物的设计：
根据上述步骤(2)识别的SSR位点，使用primer3.0软件批量设计genic-SSR引物，引物设计参数设定为：引物长度18-28 bp；熔解温度55-65oC，60oC为最优温度；产物大小为80-300 bp；
4）东乡野生稻genic-SSR引物的有效性和通用性鉴定：
提取东乡野生稻和现代栽培稻不同品种的基因组DNA，以其为模板进行PCR扩增；PCR扩增反应程序采用15 μL的反应体系，其中包括50 ng模板DNA、1.5 μL 10×PCR buffer、0.5mM dNTPs、0.2 μM引物和1U TaqDNA聚合酶；
所述PCR扩增反应程序：95oC预变性5 min；然后进入35个循环95oC变性30s，55-63oC退火30s，72oC延伸30s；最后72oC延伸10 min；
所述PCR扩增反程序结束后，扩增产物加入2 μL loading buffer，以50 bp DNALadder为DNA分子量标准，进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度为3-4%；电泳结束后，采用紫外凝胶成像系统观察并拍照；依据每条引物扩增的目的片段长度，若有80-300 bp扩增产物检测出，该引物即为有效引物。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109402280A (zh) * 2018-08-01 2019-03-01 中国水稻研究所 一种用于鉴别籼粳的ssr标记、筛选方法及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102424826A (zh) * 2011-12-23 2012-04-25 湖北光芒能源植物有限公司 一种芒属植物Genic-SSR标记的制备方法及应用
CN105525000A (zh) * 2016-01-20 2016-04-27 江西师范大学 一种基于QTL-seq发掘东乡野生稻耐冷基因的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102424826A (zh) * 2011-12-23 2012-04-25 湖北光芒能源植物有限公司 一种芒属植物Genic-SSR标记的制备方法及应用
CN105525000A (zh) * 2016-01-20 2016-04-27 江西师范大学 一种基于QTL-seq发掘东乡野生稻耐冷基因的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J.XIE.H等: "Genetic diversity associated with conservation of endangered dongxiang wild rice(oryza rufipogon)", 《GENET RESOUR CROP EVOL》 *
TI FENG SHAN等: "De novo transcriptome analysis of the gametophyte of Undaria pinnatifida(Phaeophyceae)", 《J.APPL.PHYCOL》 *
孔德利等: "东乡野生稻原位圃遗传多样性的微卫星标记分析", 《农业生物技术学报》 *
李小白等: "利用建兰转录数据开发genic-SSR标记", 《农业生物技术学报》 *
高阳等: "基于陆地棉茎尖转录组序列genic-SSR标记的开发与评价", 《植物遗传资源学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109402280A (zh) * 2018-08-01 2019-03-01 中国水稻研究所 一种用于鉴别籼粳的ssr标记、筛选方法及应用

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