CN111088389B - 玉米叶宽紧密连锁的ssr分子标记及其扩增引物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及玉米叶宽紧密连锁的SSR分子标记及其扩增引物和应用。控制玉米窄叶基因型的SSR分子标记为NL16‑409，核苷酸序列如SEQ IN NO.1所示，控制玉米宽叶基因型的SSR分子标记为NL16‑665，核苷酸序列如SEQ IN NO.2所示。利用该标记对耐密叶形改良和耐密理想株型玉米的分子标记辅助选择提供了依据和参考,为明确该窄叶位点的候选基因以及窄叶种质在育种中的利用提供材料基础。

Description

玉米叶宽紧密连锁的SSR分子标记及其扩增引物和应用

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及一种玉米叶宽紧密连锁的SSR分子标记及其扩增引物和应用。

背景技术

玉米作为重要的粮食、饲料及工业原料，近年来已发展成为我国第二大粮食作物。提高玉米产量对于保证粮食总产量持续提升发挥重要作用。但是我国可耕地面积已接近18亿亩红线，单纯依靠增加种植面积来提高玉米产量的空间非常有限，研究发现大幅提高玉米单产成为实现我国玉米高产突破的重要措施。因此，充分发掘玉米增产的巨大潜力来提高玉米产量，对于确保国家粮食安全，促进农业发展具有重要作用。

玉米种植密度是直接影响产量的关键因素之一。实践证明，通过增加种植密度来提高玉米单位面积产量，是缓解我国耕地面积减少与玉米需求量增加这一矛盾的有效措施，而提高种植密度主要依赖于耐密理想株型玉米的培育和改良。

玉米叶片宽度和长度等叶形特性是决定植株形态进而影响种植密度的重要农艺性状。叶片是玉米进行光合作用的重要场所，也是进行蒸腾作用和抗逆作用的主要器官。对于大面积种植的农作物，高密度种植时叶片较宽的群体容易出现叶片重叠相互遮荫的情况，导致避荫综合症(SAS，Shade Avoidance Syndrome)，不仅使植株的茎杆细长，叶面积减小，而且影响群体冠层的通风透气性，加剧病虫害的发生，导致生物量和产量降低。玉米耐密株型的合理叶片宽度有利于改良理想株型，提高叶面积指数，减少植株的避荫反应(Shade avoidance response)，使个体间竞争最小化。玉米叶片的光合作用对于干物质的积累及产量有非常重要的影响，玉米育种过程中，选育适宜高密度种植的合理叶宽玉米，是提高玉米产量最重要的技术手段之一。

叶片如何感知并决定其宽度和大小是一个重要的发育生物学问题。合理的叶片宽度能够改善植株形态和群体的光照分布及通风透气性，提高种植密度。通过开发不同叶片宽度紧密连锁的SSR分子标记，该分子标记可鉴定玉米宽、窄叶分裂群体及自然群体中的不同叶宽株系，能够用于玉米合理叶宽的耐密窄叶育种，不仅对窄叶发育分子机理的解析具有重要意义，而且为耐密窄叶株型玉米的培育提供了依据。

叶片是主要的侧生器官,其发育是一个复杂的过程,主要由遗传因素决定。大量分析叶宽遗传效应的研究结果表明，加性效应是影响叶宽遗传的主要因素，显性效应表现显著，同时受非加性效应影响，部分表现出上位性效应，广义遗传力低。另外，与水稻和拟南芥相比,玉米叶片具有较大的尺寸和线性形态,更有利于研究叶片生长发育过程中的形态变化和分子特征,同时玉米叶宽受环境影响较小，因此，玉米是研究叶片形态及叶宽最为理想的模式作物之一。

玉米叶宽的形成是一个多基因调控的复杂生物学过程。目前，国内外开展了大量关于玉米叶宽QTL的定位研究，鲜有关于叶宽QTL克隆的研究结果，所以，通过分析叶宽QTLs对叶宽表型变异的影响，进一步分离并挖掘这些主效QTLs是非常必要的。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了玉米叶宽紧密连锁的SSR分子标记，控制玉米窄叶基因型的SSR分子标记为NL16-409，核苷酸序列如SEQ IN NO.1所示，控制玉米宽叶基因型的SSR分子标记为NL16-665，核苷酸序列如SEQ IN NO.2所示。

本发明还提供了用于上述与玉米叶宽紧密连锁的SSR分子标记的扩增引物，所述扩增引物的核苷酸序列为：

上游引物：5’-ATTGCGGCTCGGCGTCTGT-3’；

下游引物：5’-TGGCGTCTCCATGTTTGCTGTT-3’；

进一步的，利用上述扩增引物检测玉米叶宽基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，提取待检测玉米的基因组DNA；

S2，以S1的玉米的基因组DNA为模板，利用上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到扩增产物，电泳检测，如果扩增产物为SEQ IN NO.1所示序列，则为窄叶基因型；如果扩增产物为SEQ IN NO.2所示序列，则为宽叶基因型。

更进一步的，S2中，PCR扩增体系为：

每15μL反应体系中含有：Taq Master Mix 7.5μl，浓度为10μmol/μl的上、下游引物各0.75μl，模板1.0μl，ddH2O 5ul。

本发明还提供了所述的SSR分子标记在玉米耐密叶形分子标记辅助选择中的应用。

本发明还提供了所述引物在玉米耐密窄叶育种中的应用。

本发明提供的玉米叶宽紧密连锁的SSR分子标记及其扩增引物和应用，该分子标记可鉴定玉米宽、窄叶分裂群体及自然群体中的不同叶宽株系，能够用于玉米合理叶宽的耐密窄叶株型育种，一方面，为深入解析叶片发育的分子机制奠定基础，另一方面，为玉米耐密高产分子辅助选择育种提供依据。

本发明的第一个目的是提供玉米叶宽紧密连锁的SSR分子标记，控制窄型玉米叶的SSR分子标记为NL16-409，核苷酸序列SEQ IN NO.1，控制宽型玉米叶的SSR分子标记为NL16-665，核苷酸序列SEQ IN NO2。

本发明的第二个目的是提供用于扩增上述与玉米叶宽紧密连锁的SSR分子标记的扩增引物，所述扩增引物的核苷酸序列为：

NL16-F：5’-ATTGCGGCTCGGCGTCTGT-3’，如SEQ IN NO.3；

NL16-R：5’-TGGCGTCTCCATGTTTGCTGTT-3’，如SEQ IN NO.4；

本发明的第三个目的是提供上述扩增引物检测玉米叶宽基因型的方法，包括以下步骤：

S1，提取待检测玉米的基因组DNA；

S2，以所述玉米的基因组DNA为模板，以上游引物上游引物NL16-F和下游引物下游引物NL16-R为引物进行PCR扩增，得到扩增产物，电泳检测，如果扩增产物大小为197bp，则为窄型；如果扩增产物大小为182bp，则为宽型。

本发明的第四个目的是提供上述SSR分子标记在玉米耐密叶形分子标记辅助选择中的应用。

本发明的第五个目的是提供上述引物对在玉米耐密窄叶育种中的应用。

与现有技术相比，本发明提供的玉米叶宽紧密连锁的SSR分子标记及其扩增引物应用，具有如下有益效果：

1、本发明中开发窄叶标记所利用的窄叶突变系NL409，是在玉米育种过程中发现可直接应用的突变材料，并且该位点不存在精细定位结果，是研究叶宽和耐密叶形改良的典型材料，而已报道的其它窄叶突变体叶片非正常发育存在缺陷，不具有直接应用于育种实践的独特优势。此外，该位点不存在针对宽、窄叶鉴定及分子辅助选择标记，窄叶连锁标记的开发为新发现的窄叶突变系的利用及该窄叶位点在耐密叶形的遗传改良研究提供了极大地便利。

2、窄叶紧密连锁分子标记的开发，一方面，为利用该标记对国内骨干种质及自交系的耐密叶形改良和耐密理想株型玉米的分子标记辅助选择提供了依据和参考；另一方面为明确该窄叶位点的候选基因以及窄叶种质在育种中的利用提供材料基础。

附图说明

图1为NL409和WB665叶宽表型。

图2为NL409和WB665叶宽箱体图。

图3为F₂群体叶宽频数分布图。

图4为F₂群体宽窄叶分离单株的叶片宽度。

图5为F₂分离群体极端个体植株编号1-25号的电泳检测图。

图6为F₂分离群体极端个体植株编号26-51号的电泳检测图。

图7为F₂分离群体极端个体植株编号52-62号的电泳检测图。

图8为DNA混池重测序实验流程图。

图9为各测序池Clean Reads碱基分布图。

图10为各测序池Clean Reads碱基平均质量分布图。

图11为各测序池测序深度分布图。

图12为累积测序深度分布图。

图13为插入片段分布。

图14为index计算方法。

图15为SNP-index分布图。

图16为ΔSNP-index分布图

图17为ΔSNP-index分布图。

图18为21对标记定位结果。

图19为开发标记定位结果

图20为标记NL16在NL409和WB665中的序列比对结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中利用的实验材料包括：以宽叶性状的自交系WB665为父本，以窄叶性状的自交系NL409为母本，于2016年夏种植于河南省农业科学院现代农业科技试验示范基地，并获得F₁种子，2016年冬将F₁种植于海南三亚自交获得F₂种子。2017年夏将F₂分离群体种植于河南省农业科学院现代农业科技试验示范基地进行表型性状鉴定及后续试验。

本发明提供的玉米叶宽紧密连锁的SSR分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ IN NO.1所示。

实施例1

玉米叶宽紧密连锁的SSR分子标记SSR分子标记的获得方法

具体步骤如下：

1性状调查

授粉后2周，对亲本和F₂群体的上部叶片宽度进行测量(穗位叶至次顶叶)，选取叶片最宽处进行测量(测量位置位于叶片靠近基部的1/3处)，并进行记录，NL409和WB665叶宽表型如图1，图2为NL409和WB665叶宽箱体图，NL409和WB665叶宽为穗位及以上叶片的单株平均叶宽，图3为F₂群体叶宽频数分布图，F₂群体叶宽为穗位及以上叶片的单株平均叶宽，F₂群体宽窄叶分离单株的叶片宽度见图4；

F₂群体叶宽统计分析结果见表1。

分析F₂群体叶宽调查统计结果，发现F₂群体叶宽单样本K-S检验的近似相伴概率值为0.01，小于等于一般的显著水平0.05，不符合正态分布。叶宽7.4cm(F₂群体叶宽7-8cm之间分布频数较少的值)以下的群体数量与8.0cm(宽叶亲本WB665叶宽极小值)以上的群体数量接近1:3(837/303＝2.76)，基本符合孟德尔遗传分离比例。

表1 F2群体叶宽统计分析结果

2混池重测序

2.1田间取样

在玉米苗期(大约在7叶期左右)对双亲植株和F2群体进行编号，取样时将各单株样品放入相应编号的5ml的离心管中，置于液氮中，带回实验室放入-80℃冰箱以备后期提取DNA使用。

2.2玉米叶片DNA提取

根据田间调查的玉米叶宽的实验数据，从F2群体中分别选取30个极端宽、窄叶单株的叶片提取DNA并混合成2个DNA池，提取亲本各随机挑选1株的DNA，构成2个亲本池。使用CTAB法提取全基因组DNA，测量DNA的浓度并检测其质量，浓度检测数据见表2。

表2 F₂分离群体极端个体植株及亲本的DNA质量

使用1％的琼脂糖胶电泳对DNA的质量进行检测，检测结果如图5-7所示。凝胶电泳条带显示，一条DNA主带清晰可见，无拖尾、弥散，但有少量的蛋白残留，说明提取的DNA质量良好，能够保证后续文库构建试验的进行。

2.3 DNA混池重测序实验流程

样品DNA检测合格后，首先，分别选取极端单株等量的DNA构建极端性状混合池和亲本池。将F2群体中宽、窄叶分离单株提取的DNA，分别取等量的DNA(大于0.5ug)混合。并对基因组DNA进行随机打断，经电泳回收350bp左右的DNA片段，添加接头引物，制备得到所需的文库，进行质量检测，对合格的文库进行上机测序。具体实验流程图如图8所示。

2.4原始测序数据

Illumina高通量测序结果原始数据以图像文件存在，经CASAVA软件进行碱基识别(Base Calling)后转化为原始测序序列(Sequenced Reads)，称作Raw Data，以FASTQ(简称为fq)格式文件存储。在FASTQ文件中，每个碱基对应一个碱基质量字符，每个碱基质量字符对应的ASCII码值减去33(Sanger质量值体系)，即为该碱基的测序质量得分(PhredQuality Score)。不同Phred Quality Score代表不同的碱基测序错误率，如PhredQuality Score值为20和30分别表示碱基测序错误率为1％和0.1％，Illumina Casava碱基识别与Phred分值之间的简明对应关系如表3所示。

表3 Illumina Casava碱基识别与Phred分值之间的简明对应关系

经过Illumina HiSeq 2500测序得到的原始序列(Raw Reads)中，包含低质量的序列、接头污染的序列、含N大于5％的序列和过滤后剩余的序列数(Clean Reads)。这四个测序池经过数据过滤，得到表4中的数据。

原始数据过滤

测序得到的一些原始测序序列含有接头的、低质量的序列，为了保证信息分析质量，必须对原始序列进行过滤，从而得到数据质量高的Clean Reads，然后基于Clean Reads进行后续的分析。数据按以下步骤进行过滤：

(1)去除接头污染的Reads(中接头污染的碱基数大于5bp)；

(2)去除低质量的Reads(超过15％的碱基质量值低于19的Reads)；

(3)去除含N比例大于5％的Reads。

表4亲本及分离单株混池重测序结果

(1)Raw Reads：原始的未过滤测序的序列数；

(2)Raw Bases：原始的未过滤的碱基数；

(3)Clean Reads：过滤后的剩余的序列数；

(4)Clean Bases：过滤后的剩余的碱基数；

(5)Clean Reads Rate(％)：过滤后剩余的序列数的比例。这个值越大，说明测序质量或者文库质量越好；

(6)Low-quality Reads：被低质量过滤标准去掉的序列数；

(7)Low-quality Reads Rate(％)：被低质量过滤标准去掉的序列的比例；

(8)Ns Reads：含碱基N的比例大于5％的Reads数；

(9)Ns Reads Rate(％)：含碱基N的比例；

(10)Adapter Polluted Reads：含有接头污染被去掉的序列数；

(11)Adapter Polluted Reads Rate(％)：含有接头污染去掉的序列的比例；

(12)Raw Q30 Bases Rate(％)：在过滤前，原始序列中质量值大于30(错误率小于0.1％)的碱基数占总碱基数的比例；

(13)Clean Q30 Bases Rate(％)：过滤后，总序列中质量值大于30(错误率小于0.1％)的碱基数的比例。该值越大说明测序质量越好。

由表4可知，四个混池测序结果过滤后Clean Reads的比例接近98％，说明其文库质量较好且测序质量符合要求，可用于后续实验。通过对Raw Reads的过滤，亲本池和极端植株分离池过滤后的总碱基个数，分别是全因组的22倍和35倍，且过滤后序列中质量大于Q30(错误率小于0.1％)的碱基数的比例相对于过滤前有所提高，说明过滤掉一些低质量的Reads，提高了测序序列的质量，增加了后续检测的准确性。

2.5原始数据比对及质量控制

(1)碱基含量分布

碱基含量分布指的是过滤后的Reads上每个碱基位置上ATCGN的比例分布图，正常情况下，由于碱基互补配对原则和测序的随机性，在每个测序位置A碱基和T碱基比例相等，G碱基和C碱基比例相等，通过比较Reads的碱基含量分布图，可以对测序结果的质量起到辅助说明的作用，碱基分布如图9所示，每个测序池测出的A与T、C与G碱基含量分布相同，符合预期碱基分布，测序序列中A、T的含量在25％-30％，G、C含量在20％-25％，N的含量在测序序列中接近0，符合实验前的预期。

为了反映测序过程中测序质量的稳定性，以Clean Reads的碱基位置作为横坐标，每个位置的平均测序质量值作为纵坐标，得到每次测序数据测序质量的分布图(图10)。由图10可知，每个测序池的Clean Reads碱基平均质量QPhred值均在30以上，说明碱基发生错误概率小于0.1％，其Clean Reads的碱基质量符合试验要求。

(2)测序深度分布

测序深度的分布可以反映建库测序的均一性及对基因组覆盖的详细情况。其中单碱基深度分布能够反映特定深度下对应的基因组覆盖情况。累积深度分布反映了大于特定深度下的基因组覆盖度。

单碱基深度分布图以测序深度为横坐标，相应深度的碱基位点比例为纵坐标，此处Fraction of Bases＝(特定深度对应的碱基位点数/基因组长度)，它反映了特定深度下对应的基因组覆盖情况。图11为测序深度分布图，由图11可知亲本池测序深度覆盖基因组20×，极端单株池覆盖基因组30×，测序结果符合实验预期。

累积深度分布图以测序深度为横坐标，大于相应深度的碱基位点比例为纵坐标，此处Fraction of bases(大于此深度的碱基位点数/基因组长度)，它反映了大于特定深度下的基因组覆盖度。图12为累积深度分布图。

(3)插入片段分布

插入片段的分布可以评估文库构建的情况，评估文库片段大小是否与预期一致。通过对测序的Reads碱基数的统计，得到插入片段大小的统计图，若插入片段的大小与打断DNA后得到的DNA片段的大小相一致，说明构建文库的质量良好。

由于在构建文库时，设计的插入的片段大小在350左右。插入片段的分布可以评估文库构建的情况，检验文库片段大小与预期是否一致。如图13所示插入的片段主要集中在250bp到400bp之间，与构建文库时回收的片段大小的一致，说明构建的文库质量符合预期，实验数据准确可靠。

(4)比对信息统计

利用基因组比对软件BWA，将过滤后的Clean Reads比对到参考基因组上，统计比对结果。对于重测序分析而言，比对率以及覆盖度指标能反映样本、建库及测序的质量。这一系列统计信息都将作为分析的质控的重要指标。

将过滤后的Clean Reads与参考基因组(ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-22/fasta/zea_mays/dna)比对，统计比对结果见表5。

表5各测序池与参考基因组比对统计

(1)Genome Length(bp)：参考基因组大小；

(2)Mapped Reads：比对到参考基因组上的Reads个数；

(3)Mapping Rate(％)：比对到参考基因组上的Reads的百分比；

(4)Uniq Rate(％)：比对得分10以上的比对Reads所占的百分比；

(5)Duplication Reads：PCR重复或光学重复的Reads数；

(6)Duplication Rate(％)：PCR重复的Reads数占Mapped Reads的比例；

(7)Mean Depth：比对到参考基因组上的平均深度；

(8)Coverage Rate(％)：覆盖度，即参考序列中有多大比例的区域至少测到了1次；

(9)Mismatch Rate(％)：错配碱基占比对到参考基因组碱基数的百分比。

由表5可知，四个混池的测序结果比对到参考基因组上的Reads占总测序Reads的99％；测序结果覆盖全基因组序列的90％左右；与参考基因组相比，错配的碱基数大概占1.3％左右，我们所需要的变异SNPs位点就包含在这些错配碱基中。

3SNP的差异分析

(1)变异位点检测

使用突变分析软件GATK^[117]检测混合池中SNP和INDEL，再根据质量值、深度、重复性等因素做进一步的过滤筛选，最终得到高度可信的变异位点，使用ANNOVAR^[118]软件及已有的基因组注释文件(gff/gtf)对检测到的候选SNP进行相应的注释。

通过与参考基因组比对，得到测序序列与参考基因组存在差异的SNPs和INDELs位点，对四个测序池在每条染色体上总的SNPs和INDELs差异位点数量进行统计(表6)。

表6变异位点数量统计

(1)Chr：染色体编号；

(2)SNP_Number：每条染色体上检测的SNP数量；

(3)INDEL_Number：每条染色体上检测的INDEL数量；

(4)Others:位于scaffold上的变异位点数量；

(5)Total：每条染色体上检测到的变异位点数量。

(2)SNP-index的定义

SNP-index是对每个差异位点进行定义的，表示比对到该位置突变碱基占所有比对上该位点上Reads的比例，具体计算方法如图14：

本实验在传统index的基础上，增加了INDEL(插入缺失突变)的index计算，计算方法与SNP的index相同。其中INDEL为多碱基的插入或者缺少，相对于仅只有SNP位点的实验数据，加入这些插入或者缺失位点可以增加实验的精确性和增大实验数据的可靠性，而且INDEL为多碱基变异，更有可能导致基因发生移码突变，对基因的影响较大。

(3)样品SNP-index的过滤标准

在分型结果中得到SNP位点数据较多，为得到造成子代性状差异的候选位点，我们首先计算子代中每个位置的SNP-index，为减少测序错误和比对错误造成的影响，对计算出的SNP-index进行过滤筛选，过滤标准如下(符合任意一条标准的SNP不再使用)：

a、亲本基因型为杂合；

b、亲本和子代未覆盖相应位点，或者深度低于10；

c、两个子代中SNP-index均小于0.3，两个子代中SNP-index均大于0.7；

d、位于scaffold等非主要染色体上的SNP。

若亲本基因型为杂合，说明亲本在该位点就存在变异，不能够作为子代比对的标准；若亲本和子代未覆盖相应位点，亲本和子代间不能够进行比较分析，或深度低于10测序结果的可靠性不高，不能够作为最终序列；若两个子代中SNP-index均小于0.3，两个子代中SNP-index均大于0.7，不能够区分这个SNP位点是由于测序错误引起的或者是由于校准引起的，故舍去；位于scaffold等非主要染色体上的SNP，在生物的生长发育中起的作用较小。

(4)计算各个变异位点的SNP-index

计算各个变异位点的SNP-index，并对变异位点进行筛选。对满足条件的变异位点，根据预先设定的滑动窗口(窗口大小为1Mb，步长为100Kb)，计算每一个窗口中的SNP-index的均值。最后对SNP-index和窗口平均SNP-index作图。

按样品SNP-index的过滤标准对表6中的原始SNPs和INDELs进行过滤筛选，得到可用于SNP-index计算的变异位点见表7。过滤标准如下(符合任意一条标准的SNP不再使用)：(1)亲本基因型为杂合；(2)亲本和子代未覆盖相应位点，或者深度低于10；(3)两个子代中SNP-index均小于0.3，两个子代中SNP-index均大于0.7；(4)位于scaffold等非主要染色体上的SNP。

表7用于SNP-index计算的变异位点统计

(1)Chr：染色体编号；

(2)SNP_Number：每条染色体上检测的SNP数量；

(3)INDEL_Number：每条染色体上检测的INDEL数量；

(4)Total：检测到的变异位点数量总和。

对满足条件的变异位点，根据预先设定的滑动窗口(窗口大小为1Mb，步长为100Kb)，计算每个窗口中SNP-index的均值。最后对SNP-index和窗口平均SNP-index作图，图15中的散点表示所有位置SNP-index的分布情况，红线表示窗口内平均SNP-index的分布情况。

(5)标准候选区域计算

标准侯选区域筛选方法，是使用参考文章中所使用的SNP-index筛选方法，所要求的混池性状为极端性状所构建的混合池。对极端性状的两个子代的SNP-index作差(ΔSNP-index)，那么就可以得到两个子代间的ΔSNP-index分布情况。

ΔSNP-index＝Sample1_SNP-index–Sample2_SNP-index

由于SNP-index的定义，所以ΔSNP-index值可以为正或负，所以每一个置信水平有正负两条线。为了得到候选区域，我们假设该位置不存在QTL，也就是说这个位点的基因型在遗传过程中是随机的分配在两个子代间的，这里通过计算机模拟的方法得到ΔSNP-index在0.1、0.05和0.01这3个置信水平下的置信区间，通常根据实验要求选取相应的置信区间。

如图16所示，图16中两个混合池同一位置的SNP-index作差得到两个混合池在同一变异位置的ΔSNP-index其中散点表示所有位置的ΔSNP-index的分布情况，红线表示滑动窗口内的平均的ΔSNP-index分布，三条浅颜色的线，从里到外依次表示置信水平为0.1、0.05和0.01三个置信水平的置信。

这里我们选取置信水平为0.01的置信区间，将落在该区间外的位置作为目标性状定位的候选区域。侯选区域位置信息如下表所示：

表8侯选区域统计结果

(1)Chr：侯选区域所在的染色体号；

(2)Start：侯选区域所在的起始位置，以bp为单位；

(3)End：侯选区域所在的终止位置，以bp为单位；

(4)SNP_Number：侯选区域内超过阈值的SNP的数量；

(5)INDEL_Number：侯选区域内超过阈值的INDEL数量；

(6)Gene_Number：侯选区内在外显子区域存在非同义突变变异位点的基因数；

(7)mRNA_Number：侯选区内在外显子区域存在非同义突变变异位点的转录本数；

(8)mRNA_Anno_Number：侯选区域内发生非同义突变且有注释结果的转录本数。

QTG-Seq是整合了QTL分离技术、极端表型样本混池及高通量测序的定位方法，采用新方法smoothLOD进行关联分析，能够用于QTL的快速精细定位与克隆。利用混池样本群体的SNPs进行QTG-Seq定位，将关联的候选基因定位在3.411Mb-5.964Mb的区间内，如图17。

4候选位点的验证及标记开发

通过窄叶亲本NL409和宽叶亲本WB665，筛选分布于第4染色体具有多态性的SSR标记，利用筛选出的多态性标记，选取F₂群体中宽、窄叶分离单株进行定位，筛选候选位点的交换单株。

具体的，利用第四染色体筛选出的21对具有较好多态性的标记，结合F₂群体中1200株窄叶分离单株进行定位，对简化序结果进行验证，将候选区间定位在umc1017至umc1509两标记间(3,004,636–5,462,256bp)2.46Mb的范围内(图18)，与QTL-Seq和QTG-Seq的定位结果一致。

结合混池测序定位和SSR标记初定位结果，在MaizeGDB数据库中下载初定位标记附近的BAC(AC183974.5)序列，使用SSR Hunter进行SSR位点搜寻，筛选出28个SSR位点，利用Primer6.0软件对筛选出的SSR位点序列进行引物设计。通过窄叶亲本NL409和宽叶亲本WB665基因组总DNA，鉴定所设计SSR标记引物的多态性，发现标记NL8、Nl13、NL16、NL20、NL26可用于进一步的定位，利用上述多态性标记。

利用F₂群体中的窄叶分离单株筛选出20株交换单株(图19，B组)，将目标区间定位在NL8和umc1509两标记间，同时在400株宽叶分离单株筛选到6株宽叶交换单株，将目标区间缩小到在NL13和umc1509两标记间(图19，A组)，最终将目标区间定位在NL13与umc1509两标记间2.01Mb区间内。

分析发现标记NL16在F2群体中能够与叶片宽度紧密连锁，控制玉米窄叶基因型的SSR分子标记为NL16-409，核苷酸序列如SEQ IN NO.1所示，控制玉米宽叶基因型的SSR分子标记为NL16-665，随后利用上游引物：5’-ATTGCGGCTCGGCGTCTGT-3’，如SEQ IN NO.2所示；下游引物：5’-TGGCGTCTCCATGTTTGCTGTT-3’，如SEQ IN NO.3所示；扩增双亲NL409和WB665的DNA片段并测序，

检测方法包括以下步骤：

S1、提取待检测双亲NL409和WB665的基因组DNA；

S2，以S1的双亲NL409和WB665的基因组DNA为模板，利用上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到扩增产物，电泳检测，

PCR扩增体系为：

每15μL反应体系中含有：Taq Master Mix 7.5μl，浓度为10μmol/μl的上、下游引物各0.75μl，模板1.0μl，ddH2O 5ul。

PCR反应在PCR反应仪上进行，程序如下：

Stepl：95℃3min；

Step2：95℃45s；

Step3：65℃30s，-1℃/cycle；

Step4：72℃30s；

Step5：goto step 2，8times；

Step6：95℃30s；

Step7：58℃30s；

Step8：72℃30s；

Step9：goto step 6,26times；

Stepl0：72℃10min；

Step11：4℃保存。

结果：发现NL409比WB665序列多出12bp的碱基，图20所示。

实施例2

紧密连锁标记的应用

为了验证该标记在不同材料中与叶片宽度的相关性，分析发现该标记的基因型在不同材料中与叶宽表型一致(表9)，可用于耐密窄叶分子标记辅助选择育种，改良不同材料叶宽的耐密性。

表9不同自交系的基因型分析

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 河南省农业科学院粮食作物研究所

<120> 玉米叶宽紧密连锁的SSR分子标记及其扩增引物和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 197

<212> DNA

<213> 玉米

<400> 1

attgcggctc ggcgtctgtc gagctccccg gtagcgctcg cccccttctg gaaacggagg 60

cggaggagga ggaggaggag gctggtatcc gagcctgaac cctactgccg caaccgcaat 120

cccgccgccc accaccaccc tgtcacctgt gctgtgagtg actagctcac ctgcaaacag 180

caaacatgga gacgcca 197

<210> 2

<211> 185

<212> DNA

<213> 玉米

<400> 2

attgcggctc ggcgtctgtc gagctccccg gtagcgctcg cccccttctg gaaacggagg 60

aggaggaggc tggtatctga gcctgaaccc tactgccgca accgcaatcc cgccgcccac 120

caccaccctg tcacctgtgc tgtgagtgac tagctcacct gcaaacagca aacatggaga 180

cgcca 185

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

attgcggctc ggcgtctgt 19

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tggcgtctcc atgtttgctg tt 22

Claims (4)

1.玉米叶宽紧密连锁的SSR分子标记在检测玉米叶宽基因型中的应用，其特征在于，控制玉米窄叶基因型的SSR分子标记为NL16-409，核苷酸序列如SEQ IN NO.1所示，控制玉米宽叶基因型的SSR分子标记为NL16-665，核苷酸序列如SEQ IN NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，扩增所述SSR分子标记的引物的核苷酸序列为：

上游引物：5’-ATTGCGGCTCGGCGTCTGT-3’；

下游引物：5’-TGGCGTCTCCATGTTTGCTGTT-3’。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

S1，提取待检测玉米的基因组DNA；

S2，以S1的玉米的基因组DNA为模板，利用上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到扩增产物，电泳检测，如果扩增产物为SEQ IN NO.1所示序列，则为窄叶基因型；如果扩增产物为SEQ IN NO.2所示序列，则为宽叶基因型。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，S2中，PCR扩增体系为：

每15μL反应体系中含有：Taq Master Mix 7.5μl，浓度为10μmol/μl的上、下游引物各0.75μl，模板1.0μl，ddH2O 5ul。

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