CN116083622A - 与烟草叶型相关基因qLL和qWL，连锁SSR标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与烟草叶型相关基因qLL和qWL，连锁SSR标记及其应用，所述的烟草叶型相关性状包含烟草叶片长度性状和烟草叶片宽度性状，且控制上述两个性状的基因分别为qLL和qWL。所述的与烟草叶型相关基因qLL和qWL紧密连锁的共显性SSR标记的编号为TMs06601和TM16362，其PCR扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。所述的应用为所述的与烟草叶型相关基因qLL和qWL紧密连锁的共显性SSR标记在检测烟草基因组DNA中是否存在叶型相关基因qLL和qWL中的应用。本发明所述的共显性SSR标记具有快捷、稳定、精准且低成本的特点，因此该分子标记可以作为烟草叶型相关性状育种中qLL和qWL基因分子标记辅助选择的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与烟草叶型相关基因qLL和qWL紧密连锁的共显性SSR标记及其应用。
背景技术
烟草是叶用型经济作物,其叶数是构成经济产量的重要因素。因此，围绕着烟草自然叶片数量及形状来实现提高烟草经济产量的研究主要集中在遗传、育种和分子生物学等领域。大量的研究表明，植物叶数及叶型相关性状属于受多基因控制和生长环境影响的数量性状，较难实现将叶片数目及叶型等农艺性状遗传转育到目前生产上大面积栽培的主流品种中以提高叶片的产量。Lewis等(Lewis RS,Milla SR,Kernodle SP,Analysis of anintrogressed Nicotiana tomentosa genomic region affecting leaf number andcorrelated traits in Nicotiana tabacum.Theor Appl Genet,2007,114:841-854)为了提高烟叶产量，利用具有多叶性状的野生烟草-Tomentosa与栽培烟草进行远缘杂交，再通过染色体加倍技术和多代的回交，最终获得了多叶性状遗传稳定的烟草材料，基于此材料，将控制叶片数量的主效QTLs定位在AFLP标记M1和M5之间的3.1cM区域内，并借助AFLP标记M1和M5对多叶性状进行苗期的分子标记辅助选择育种上。迄今，针对烟草叶型相关性状(包含叶片长度(叶长)和叶片宽度(叶宽))基因的专利尚未见报道。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种与烟草叶型相关基因qLL和qWL紧密连锁的共显性SSR标记；第二目的在于提供所述的与烟草叶型相关基因qLL和qWL紧密连锁的共显性SSR标记的应用。
本发明采用如下技术方案实现。
为了简捷、高效选择具有合理叶型的烟草品种，本发明提供一种用于检测烟草叶型相关基因qLL和qWL的分子标记TMs06601和TM16362，该分子标记采用数量性状连锁分析(QTL)法，在烟草全基因组范围内筛选获得与烟草叶型相关基因qLL和qWL连锁的共显性SSR标记，可用于叶型相关性状基因qLL和qWL的辅助选择，以提高分子标记辅助选择的效率及合理叶型烟草品种选育的效率。
一种与烟草叶型相关基因qLL和qWL，本发明所述的叶型相关性状包含烟草叶片长度性状和烟草叶片宽度性状，控制烟草叶型相关性状基因为qLL和qWL且属于数量性状基因位点。
一种与烟草叶型相关基因qLL和qWL紧密连锁的共显性SSR标记，本发明所述的与烟草叶型相关性状基因qLL和qWL紧密连锁的共显性SSR标记的编号为TMs06601和TM16362；其PCR扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4所示。
本发明所述的分子标记所对应的2个位点的引物序列分别为：
TMs06601序列为：
TMs06601F：5’-CGCTGATTTTCAACTTTCACAC-3’(SEQ ID NO.5)，
TMs06601R：5’-CTCCGCCTCTACTCTTCACG-3’(SEQ ID NO.6)；
TM16362序列为：
TMTM16362F：5’-GGTTTCTTGAAAGGGCAAAG-3’(SEQ ID NO.7)，
TMTM16362R：5’-GAAAAATCACGGGGAAATGA-3’(SEQ ID NO.8)。
本发明上述的与烟草叶型相关基因qLL和qWL紧密连锁的共显性SSR标记的应用，所述的与烟草叶型相关基因qLL和qWL紧密连锁的共显性SSR标记在检测烟草基因组DNA中是否存在叶型相关性状基因qLL和qWL中的应用。
本发明所述应用的步骤包括：以TMs06601序列的引物和TM16362序列的引物分别扩增待检测烟草基因组DNA，
TMs06601序列为：
TMs06601F：5’-CGCTGATTTTCAACTTTCACAC-3’(SEQ ID NO.5)，
TMs06601R：5’-CTCCGCCTCTACTCTTCACG-3’(SEQ ID NO.6)；
TM16362序列为：
TMTM16362F：5’-GGTTTCTTGAAAGGGCAAAG-3’(SEQ ID NO.7)，
TMTM16362R：5’-GAAAAATCACGGGGAAATGA-3’(SEQ ID NO.8)；
检测PCR扩增产物；分析PCR扩增产物。
本发明所述PCR扩增产物为：如果PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.1和SEQIDNo.3所示序列则表明该待测烟草植株含有叶型相关性状的显性纯合等位基因qLLqLL和qWLqWL，基因型记为LSLS；
本发明所述PCR扩增产物为：如果PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.2和SEQIDNo.4所示序列则为待测烟草植株含有叶型相关性状的隐性纯合等位基因qllqll和qwlqwl，基因型记为lsls；
本发明所述PCR扩增产物为：如果PCR扩增产物中含有如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示序列，或含有如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列，或含有如SEQ ID No.1、SEQIDNo.3和SEQ ID No.4所示序列，或含有如SEQ ID No.3、SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列即为含有株高相关性状的杂合等位基因qLLqll和qWLqwl、qLLqLL和qWLqwl、qLLqll和qWLqWL，基因型记为LSls。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：本发明所述的共显性SSR标记具有快捷、稳定、精准且低成本的特点，因此该分子标记可以作为烟草叶型相关性状育种中qLL和qWL基因分子标记辅助选择的应用。利用上述两个共显性紧密连锁SSR标记，不仅可以精准、高效、便捷且低成本的实现烟草幼苗期的叶型相关性状鉴定，而且也可清晰鉴别待测植株中的叶型相关性状基因型状态，此既提高了叶型相关性状烟草新品种选育的科学性、可预测性，又加速了育种进程。
附图说明
图1是基于烟草重组自交系群体(RILs_F7:8；红花大金元×Beinhart1000-1)的叶型相关性状QTL分析曲线图。
其中，QTL定位软件为：WinQTLCart v2.5；参数设置：定位方法为CIM：CompositeInterval Mapping QTL，迭代次数为1000(Permutation times＝1000)，显著性为0.01(Significance＝0.01)，步长为0.5cM(Walk speed＝0.5cM)。图中横坐标为遗传距离(单位：厘摩cM)；纵坐标为LOD值。图中的横向虚线是在0.01显著性阈值下的LOD值＝3.2；LOD曲线最高点为烟草叶型相关性状的主效基因/QTL(qLL20和qWL20)。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明利用雪茄烟品种Beinhart1000-1(叶片近似长椭圆形)和烤烟品种红花大金元(叶片近似卵圆形)为亲本，通过杂交、连续套袋自交，构建一个含有341份株系的烟草重组自交系(RILs_F7:8)为作图群体，利用数量性状连锁分析(QTL)法，在烟草全基因组范围内筛选获得与烟草叶型相关基因qLL和qWL紧密连锁的共显性SSR标记，加速分子标记辅助选择(Marker Assistant Selection，MAS)在合理叶型烟草品种选育中的利用。
本发明所述的共显性SSR标记具有稳定、可靠、简便、快捷和低成本的特点，因此该分子标记可以作为烟草叶型相关性状育种中qLL和qWL基因分子标记辅助选择的应用。
本发明所述的与烟草叶型相关基因qLL和qWL紧密连锁的共显性SSR标记的编号为TMs06601和TM16362，其PCR扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2、SEQID No.3和SEQ ID No.4所示。
所述的分子标记所对应的2个位点的引物序列分别为：
TMs06601序列为：
TMs06601F：5’-CGCTGATTTTCAACTTTCACAC-3’，
TMs06601R：5’-CTCCGCCTCTACTCTTCACG-3’；
TM16362序列为：
TM16362F：5’-GGTTTCTTGAAAGGGCAAAG-3’；
TM16362R：5’-GAAAAATCACGGGGAAATGA-3’。
本发明所述的与烟草叶型相关基因qLL和qWL紧密连锁的共显性SSR标记的应用为所述的与烟草叶型相关基因qLL和qWL紧密连锁的共显性SSR标记在检测烟草基因组DNA中是否存在烟草叶型相关基因qLL和qWL中的应用。
所述的与烟草叶型相关基因qLL和qWL紧密连锁的共显性SSR标记的应用是分别以TMs06601序列的引物和TM16362序列的引物分别扩增待检测烟草基因组DNA，检测PCR扩增产物，如果PCR扩增产物中含有如SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示序列即为该烟草植株含有叶型相关性状的显性纯合等位基因qLLqLL和qWLqWL；如果PCR扩增产物中含有如SEQIDNo.2或SEQ ID No.4所示序列即为含有叶型相关性状的隐性纯合等位基因qllqll和qwlqwl；如果PCR扩增产物中含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列，或含有如SEQ IDNo.3和SEQ IDNo.4所示序列，或含有如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列，或含有如SEQ IDNo.3、SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列即为含有株高相关性状的杂合等位基因qLLqll和qWLqwl、qLLqLL和qWLqwl、qLLqll和qWLqWL。
下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：
实施例1
利用数量性状连锁分析(QTL)法，在烟草全基因组范围内筛选与烟草叶型相关性状基因qLL和qWL连锁的共显性SSR标记
一、实验材料以综合性状优良烤烟品种红花大金元为母本(叶片近卵圆形)，以雪茄烟品种Beinhart1000-1(叶片近长椭圆型)为父本，经杂交、连续自交，获得341份株系的重组自交系(RILs_F7:8)作为遗传作图群体。
二、亲本及RILs_F7:8群体叶型相关性状表型数据获得
叶型相关性状调查按照烟草行业标准YC/T 369-2-10进行，其中包括烟草腰部叶片长度(腰叶长)和腰部叶片宽度(腰叶宽)，具体测量方法如下：
腰叶长：选择腰部最大叶片，测量茎叶连接处至叶尖的直线长度。
腰叶宽：选择腰部最大叶片，测量与主脉垂直的叶面最宽处长度。
三、SSR标记分析
烟草基因组DNA提取：采用常规CTAB法或植物组织DNA提取试剂盒均可，方法可参考已有的文献或试剂盒中的说明书。
PCR扩增及电泳检测：PCR扩增体系是常规的体系可参照已发表的文献；PCR扩增程序中，上述2对引物的退火温度均为60℃，具体的PCR扩增程序信息可参照相关文献；电泳检测也是采用常规的方法，可参照已发表的相关文献。
利用本实验室开发的SSR标记，对341份RILs_F7:8样品进行基因型分析和连锁分析，并绘制一张含有24条连锁群且均匀分布1974个SSR标记，覆盖烟草基因组长度为3213.138cM的高质量烟草SSR遗传连锁图谱。以此图谱及SSR标记的基因型值作为RILs_F7:8群体的基因型值，用于下一步的QTL连锁分析。
四、烟草叶型相关性状基因(qLL和qWL)的全基因组QTL分析
利用QTL定位分析软件WinQTLCart v2.5对RILs_F7:8群体的基因型数据和表型数据，对烟草叶型相关性状基因qLL和qWL进行全基因组QTL扫描。其中，相关参数设置为：定位方法选CIM：Composite Interval Mapping QTL，迭代次数为1000(Permutation times＝1000)，显著性为0.01(Significance＝0.01)，步长为0.5cM(Walk speed＝0.5cM)。最后，在全基因组范围内的LOD＝3.2条件下，位于第20号连锁群的129.40cM处定位获得连续2年(2021和2022)的烟草叶型相关性状的1个主效QTL(命名为qLL20和qWL20)。该主效QTL可解释约5.46％(qWL20，2021)～9.67％(qLL20，2021)的表型变异率，且LOD值约为6.43(qLL20，2021)～7.02(qLL20，2021)，详见图1和表1。
表1烟草叶型相关性状QTL(qLL和qWL)信息统计
实施例2
共显性连锁标记在RILs_F8:9群体单株中的验证
首先，利用获得的与烟草叶型相关性状基因qLL和qWL两侧紧密连锁的共显性SSR标记TMs06601和TM16362，对苗期的RILs_F8:9群体(红花大金元×Beinhart1000-1)单株进行基因型分析，获得RILs_F8:9群体各单株的基因型数据。其次，按照烟草行业标准YC/T369-2-10对各株系的叶型相关性状进行测量。最后，分析341份RILs_F8:9群体的基因型数据与叶型相关性状的表型值，发现本发明公布的两个共显性SSR标记TMs06601和TM16362的基因型值与表型值完全吻合，即，一致率达100％。具体的分析方法为：通过测量获得各株系的腰部叶片长度和腰部叶片宽度表型值高于或等于高值亲本Beinhart1000-1时，该株系的基因型中也是同时呈现如SEQ ID NO.1(277bp)和SEQ ID NO.3(254bp)所示序列即为该株系含有叶型相关性状的显性纯合等位基因qLLqLL和qWLqWL；鉴定获得的各株系的腰叶长和腰叶宽表型值等于或低于低值亲本红花大金元时，该株系的基因型中也是同时呈现如IDNO.2(289bp)和SEQ ID NO.4(248bp)所示序列即为该株系含有叶型相关性状的隐性纯合等位基因qllqll和qwlqwl；而当鉴定获得的各株系的腰叶长和腰叶宽表型值介于低值亲本红花大金元与高值亲本Beinhart1000-1之间，也即与子一代(F1)相近时，该株系的基因型中也是同时呈现如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示序列，或含有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列，或含有SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列，或含有SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示序列即为该株系含有叶型相关性状的杂合等位基因qLLqll和qWLqwl、qLLqLL和qWLqwl、qLLqll和qWLqWL。
以上结果表明，共显性标记TMs06601和TM16362分别与烟草叶型相关性状基因qLL和qWL紧密连锁，该两个标记位于目的基因/QTL(qLL20和qWL20)两侧，且两个标记间遗传距离约为0.83cM。利用上述两个共显性紧密连锁SSR标记，不仅可以精准、高效、便捷且低成本的实现烟草幼苗期的叶型相关性状鉴定，而且也可清晰鉴别待测植株中的叶型相关性状基因型状态，此既提高了叶型相关性状烟草新品种选育的科学性、可预测性，又加速了育种进程。
SEQ ID NO.1：
CGCTGATTTTCAACTTTCACACTTTCTTATCAATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATAGCAATACTAAAAGACTCCTAGAAAACTATAAAACTTAAAGTAAACACACTAACATGACTAAAATAATTAATCACAACCTAATATCTTGGTACTTTTTAACAGCAACACCTGTTATTGCCAAGCTTGTATTTCTTTTTGGTTTTATGTACGTGAAGAGTAGAGGCGGAG
SEQ ID NO.2：
CGCTGATTTTCAACTTTCACACTTTCTTATCAAAATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATAGCAATACTAAAAGACTCCTAGAAAACTATAAAACTTAAAGTAAACACACTAACATGACTAAAATAATTAATCACAACCTAATATCTTGGTACTTTTTAACAGCAACACCTGTTATTGCCAAGCTTGTATTTCTTTTTGGTTTTATGTACGTGAAGAGTAGAGGCGGAG
SEQ ID NO.3：
GGTTTCTTGAAAGGGCAAAGAATAGGAAGGTCAAAAGAAAGCTACTGTGATTGTTTCCTCCTTCTTCTTCTTGTTCTTGTTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTACAACGACTTTTTATTATAGTAAGAAGAAAGCAAATCTATTTTTTGTCAAATCACATGCTACTAGAACATATACTATACAGTTGTTGTTATAGCTATCATTTCCCCGTGATTTTTC
SEQ ID NO.4：
GGTTTCTTGAAAGGGCAAAGAATAGGAAGGTCAAAAGAAAGCTACTGTGATTGTTTCCTCCTTCTTCTTCTTGTTCTTGTTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTACAACGACTTTTTATTATAGTAAGAAGAAAGCAAATCTATTTTTTGTCAAATCACATGCTACTAGAACATATACTATACAGTTGTTGTTATAGCTATCATTTCCCCGTGATTTTTC
SEQ ID NO.5：
CGCTGATTTTCAACTTTCACAC
SEQ ID NO.6：
CTCCGCCTCTACTCTTCACG
SEQ ID NO.7：
GGTTTCTTGAAAGGGCAAAG
SEQ ID NO.8：
GAAAAATCACGGGGAAATGA
以上所述的仅是本发明的部分具体实施例，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述(包括但不仅限于简写、缩写、本领域惯用的单位)。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (8)
1.一种与烟草叶型相关基因qLL和qWL，其特征在于，所述的叶型相关性状包含烟草叶片长度性状和烟草叶片宽度性状，控制烟草叶型相关性状基因为qLL和qWL且属于数量性状基因位点。
2.一种与烟草叶型相关基因qLL和qWL紧密连锁的共显性SSR标记，其特征在于，所述的与烟草叶型相关性状基因qLL和qWL紧密连锁的共显性SSR标记的编号为TMs06601和TM16362；其PCR扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
3.根据权利要求2所述的与烟草叶型相关基因qLL和qWL紧密连锁的共显性SSR标记，其特征在于，所述的分子标记所对应的2个位点的引物序列分别为：
TMs06601序列为：
TMs06601F：5’-CGCTGATTTTCAACTTTCACAC-3’；
TMs06601R：5’-CTCCGCCTCTACTCTTCACG-3’；
TM16362序列为：
TMTM16362F：5’-GGTTTCTTGAAAGGGCAAAG-3’；TMTM16362R：5’-GAAAAATCACGGGGAAATGA-3’。
4.如权利要求2或3所述的与烟草叶型相关基因qLL和qWL紧密连锁的共显性SSR标记的应用，其特征在于，所述的与烟草叶型相关基因qLL和qWL紧密连锁的共显性SSR标记在检测烟草基因组DNA中是否存在叶型相关性状基因qLL和qWL中的应用。
5.根据权利要求4所述的与烟草叶型相关基因qLL和qWL紧密连锁的共显性SSR标记的应用，其特征在于，所述应用的步骤包括：以TMs06601序列的引物和TM16362序列的引物分别扩增待检测烟草基因组DNA，
TMs06601序列为：
TMs06601F：5’-CGCTGATTTTCAACTTTCACAC-3’；
TMs06601R：5’-CTCCGCCTCTACTCTTCACG-3’；
TM16362序列为：
TMTM16362F：5’-GGTTTCTTGAAAGGGCAAAG-3’；TMTM16362R：5’-GAAAAATCACGGGGAAATGA-3’；
检测PCR扩增产物；分析PCR扩增产物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增产物为：如果PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示序列则表明该待测烟草植株含有叶型相关性状的显性纯合等位基因qLLqLL和qWLqWL，基因型记为LSLS。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增产物为：如果PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示序列则为待测烟草植株含有叶型相关性状的隐性纯合等位基因qllqll和qwlqwl，基因型记为lsls。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增产物为：如果PCR扩增产物中含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列，或含有如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列，或含有如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列，或含有如SEQ ID No.3、SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列即为含有株高相关性状的杂合等位基因qLLqll和qWLqwl、qLLqLL和qWLqwl、qLLqll和qWLqWL，基因型记为LSls。
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