CN117778616B - 小麦粒重相关基因TaSINA101分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及小麦粒重相关基因TaSINA101的KASP分子标记及应用。所述KASP分子标记为KASP‑TaSINA101,该标记是根据3B染色体17900156‑31813747bp控制小麦千粒重性状的MQTL,在26748792bp处检测到一个SNP位点(G/C),即E3泛素蛋白连接酶基因TaSINA101启动子区距离起始密码子‑556bp处。TaSINA101转基因水稻的粒重及粒型增加。本发明提供的小麦E3泛素蛋白连接酶基因TaSINA101的功能KASP分子标记可用于鉴定小麦品种/品系中是否存在TaSINA101优异等位基因,以及在辅助选择育种及与其他已知粒重相关基因聚合育种中应用。
Description
技术领域
本发明属于植物生物工程技术领域,具体涉及小麦粒重相关基因TaSINA101分子标记及应用。
背景技术
小麦(Triticum aestivum L.)是中国的主要粮食,目前中国小麦产量和消费量均居世界首位,中国小麦产量约占世界小麦产量的17%。然而,中国仍然需要从美国、加拿大和澳大利亚进口小麦。小麦产量由单位面积的穗数、每穗粒数和粒重组成,其中粒重具有较高的遗传力和稳定性,具有很大的改进潜力。
与传统的育种方法相比,分子标记辅助选择(Marker-assisted selection,MAS)具有易操作、较稳定和可信度大等特点,可在分子水平上分析个体的遗传组成,以选择更优异的基因型,从而加快了作物的育种进程。在小麦育种过程中,目前主要应用的分子标记技术是SSR和SNP分子标记。其中SSR操作简便,但存在基因组密度低、覆盖率低和价格昂贵等局限性。相比SSR标记,SNP遗传力更稳定,位点更加丰富且分布广泛,对于数量性状定位更加高效。随着全基因组测序的完成,推动了分子功能标记的发展,大量的分子标记开发可以根据同一基因在不同材料中的碱基不同而分出不同的基因型,目前,SNP分型方法主要是KASP和CAPS/dCAPS标记。
KASP标记应用于基因组DNA样品中SNP位点的检测,通过对SNP多态性位点和插入缺失(Insertion-deletion,InDel)进行精准的等位基因判断,在大批量样本中区分基因型。近年来KASP标记在小麦育种中广泛应用,并在实践中得到有效应用,例如张维军等利用KASP标记对4个粒重相关基因TaGASR、TaGW2-6B、TaGS-D1和TaCWI-4在209份小麦种质进行基因型检测,发现4个粒重基因都具有两种单倍型,进一步对其关联分析发现,4个粒重基因与籽粒性状显著关联,且在209份材料中共筛选到14份高千粒重材料,其中有9份材料聚合了多个粒重相关基因的优异单倍型。因此,粒重作为产量性状的重要指标,开发与粒重相关的分子标记,对提高我国未来小麦育种中的粒重和产量具有重要的科研价值和广阔的应用前景。
发明内容
鉴于现有技术的不足,本发明提供了小麦粒重相关基因TaSINA101分子标记及应用。为了达到上述目的,本发明采用了如下的技术方案:
1、小麦粒重相关基因TaSINA101分子标记,所述分子标记采用如下两组引物进行鉴定:KASP-TaSINA101-F1:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGGGTCGTGGTCTCCTGG-3’和KASP-TaSINA101-R:5’-CAGCGGCCTTCCCCAT-3’;KASP-TaSINA101-F2:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGGGTCGTGGTCTCCTGC-3’和KASP-TaSINA101-R:5’-CAGCGGCCTTCCCCAT-3’。
2、小麦粒重相关基因TaSINA101分子标记,所述分子标记包括如序列表SEQ IDNo.2所示的CC型,其第51为A;SEQ ID No.3所示的GG型,其第51为G。
3、小麦粒重相关基因TaSINA101分子标记,所述分子标记为TaSINA101基因(TraesCS3B02G052800)启动子区域距离起始密码子-556bp处的SNP变异位点,可分为CC和GG型两种不同的单倍型。
4、小麦粒重相关基因TaSINA101分子标记的获得方法,具体如下:(1)提取小麦DNA,(2)SNP位点检测,(3)数据分析。
5、小麦粒重相关基因TaSINA101分子标记在辅助育种中的应用,具体如下:
(1)对小麦自然群体后代提取DNA,采用上述1中所述引物扩增,对产物进行基因分型。(2)通过检测扩增产物的荧光信号确定基因型,若所述产物仅显示SEQ ID NO.2所示DNA分子5′端连接荧光标签的颜色,则所述待测小麦SNP标记的基因型为CC;若所述产物仅显示SEQ ID NO.3所示DNA分子5′端连接荧光标签的颜色,则所述待测小麦SNP标记的基因型为GG。该KASP标记在小麦自然群体材料中与产量性状千粒重显著相关,且基因型为GG型为高千粒重品系。说明本发明中开发的KASP标记可以对小麦产量实现辅助选择作用,为选育高产稳产品质小麦品种奠定理论基础且提供分子辅助选择手段。
有益效果:本申请针对E3泛素蛋白连接酶基因TaSINA101启动子区的SNP位点开发了KASP标记,在168份我国不同生态区的小麦种质资源材料进行基因分型和表型关联分析。结果显示,KASP-TaSINA101标记可将不同品种小麦分为2种基因型:CC、GG。结合表型数据,对不同基因型的材料进行关联分析,发现携带GG基因型的小麦材料在4个环境下千粒重显著高于携带GG基因型的材料,在3个环境下粒宽显著高于携带GG基因型的材料,在1个环境下粒长显著高于携带GG基因型的材料。表明基因型GG为优异等位变异,对小麦籽粒产量有正向作用。在育种过程中,有利突变等位基因的聚合与作物育种进程中产量增加的结果相一致,所以本专利提供的KASP-TaSINA101分子标记可高效检测和追踪小麦品种/品系中的TaSINA101基因,为改善小麦产量性状和小麦分子育种提供技术支持。
6、小麦粒重相关基因TaSINA101在转基因水稻中的应用,具体如下:
(1)克隆TaSINA101基因,构建转基因过表达重组载体。(2)利用农杆菌介导的遗传转化方法将重组载体导入受体材料中花11;筛选获得TaSINA101过表达纯合体株系。(3)受体中花11及转基因纯合体水稻进行籽粒拍照,及千粒重、粒长、粒宽性状的测量统计。
附图说明
图1是TaSINA101基因编码区及启动子区SNP位点分布情况
其中,方框表示编码区,虚线表示内含子,实线表示编码区上下游,HapⅠ表示单倍型Ⅰ,HapⅡ表示单倍型Ⅱ,与单倍型连线处表示SNP位点。
图2是KASP标记引物组对我国不同麦区的小麦种质资源的基因型鉴定结果。
其中,左上方框内散点表示HEX型等位基因C,右下方框内散点表示FAM型等位基因G。
图3是TaSINA101不同基因型小麦种质资源中千粒重、粒长和粒宽的比较。
其中,GG基因型相较CC基因型具有更高的千粒重、粒长和粒宽。
图4是TaSINA101两种基因型小麦种质资源的时间分布频率图。
其中,CC基因型相较GG基因型在我国主要小麦种植区(如河南,陕西,山西,山东,河北)的分布中占据主要地位,但随着时间的发展,GG基因型在育成的小麦品种中比例逐渐增多,说明得到正向选择。
图5是TaSINA101转基因水稻的表型图片及统计分析。
其中,上方为水稻受体材料中花11(ZH11)和不同TaSINA101转基因纯合体水稻株系的千粒重、粒长、粒宽表型数据统计分析;下方为不同材料间的籽粒表型图片。
图6是TaSINA101分子标记位点。
具体实施方式
为使发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的,并且本发明并不限于这些实施方式。
在此,还需要说明的是,为了避免因不必要的细节而模糊了本发明的技术方案,在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤,而省略了关系不大的其他细节。
实施例1
本实施例提供小麦粒重相关基因TaSINA101分子标记,具体如下:
小麦粒重相关基因TaSINA101,编码E3泛素蛋白连接酶,其N端含有RING结构域,C端含有一个SINA结构域。其中,RING结构域决定SINA的泛素连接酶活性,而SINA结构域可识别和结合特异的靶蛋白。根据小麦基因组变异联合数据库(http://wheat.cau.edu.cn/WheatUnion/)677份六倍体小麦重测序数据进行分析,发现TaSINA101基因在启动子区,编码区和内含子处各有多个SNP变异位点,可分为两种不同的单倍型(图1)。
本实施例的用于小麦粒重相关基因TaSINA101的KASP分子标记位于启动子区域距离起始密码子-556bp处,所述KASP标记引物组包括引物KASP-TaSINA101-F1,引物KASP-TaSINA101-F2和共用引物KASP-TaSINA101-R,所述引物KASP-TaSINA101-F1的核苷酸序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGGGTCGTGGTCTCCTGG-3’,所述引物KASP-TaSINA101-F2的核苷酸序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGGGTCGTGGTCTCCTGC-3’,所述共用引物KASP-TaSINA101-R的核苷酸序列为5’-CAGCGGCCTTCCCCAT-3’。
如序列表SEQ No.1所示,TaSINA101启动子区用于开发了KASP标记开发的SNP位点及其附近序列信息(±100bp),下划线所示为KASP标记引物扩增序列。如序列表SEQ No.2所示为分子标记CC型扩增序列,第51为A。如序列表SEQ No.3所示为分子标记GG型扩增序列,第51为G(图6)。
实施例2
本实施例提供小麦粒重相关基因TaSINA101分子标记的获得方法,具体如下:
1.提取小麦DNA
利用CTAB法提取小麦两叶一心期幼苗叶片DNA,随机抽取若干个DNA工作液,使用NanoDrop2000测浓度,A260/A280比值在1.8左右说明样品质量合格。
2.SNP位点检测
使用一组包括两个温度步骤的PCR反应体系:DNA在较高的温度下变性,然后在一个较低的相同温度退火和延伸。PCR扩增可在任何合适的PCR基因扩增仪上进行。PCR反应体系为:2xTaq DNA Polymerase Mix 2μL,SNP Primer Mix(4x)1μL,DNA 2μL。PCR扩增体系为:(1)94℃,15min;(2)94℃,20s;61~55℃每循环递减0.6℃;共10个循环;(3)94℃,20s;55℃,45s,37个循环。PCR扩增循环结束后,利用OMEGA SNP分型仪读取荧光值。在本方法中,SNP位点检测使用荧光团FAM(激发光485nm,发射光520nm)和VIC(激发光535nm,发射光556nm)来区分两个等基因位点。被动参比染料ROX(激发光575nm,发射光610nm)用于校正孔与孔之间由于反应体积误差导致的信号差异。
3.数据分析
使用基因型读取软件Kluster Caller对数据进行分析,在该软件中,VIC和FAM数据分别绘制在x轴和y轴上。每个反应孔的VIC和FAM值通过该特定孔参比染料(ROX)的值进行矫正,将数据荧光值进行标准化处理,获取每一个PCR反应孔的VIC和FAM对应的相对荧光值。根据相对荧光值,对样品进行聚类分簇,进一步根据样品簇和荧光类型确定基因型。
实施例3
本实施例提供小麦粒重相关基因TaSINA101分子标记的应用,具体如下:
1.使用表1中来自于我国不同生态区的168份小麦种质资源材料,材料分别于2021-2022年度种植于甘肃省通渭县试验站(E1)和甘肃省庄浪县南湖试验站(E2),2020-2021年度种植于甘肃省通渭县试验站采用正常灌溉(E3)和雨养(E4)两种方式,2019-2020年度种植于甘肃省通渭县试验站(E5)。田间试验采取随机区组试验,设置3次重复。每份材料种植3行,行距20cm,行长1m,每行种植60粒种子。
2.小麦籽粒成熟后,在每个环境中随机取样5株进行脱粒,待籽粒风干后,使用SC-G自动考种分析仪(万深科技有限公司(杭州))测定小麦籽粒千粒重,粒长和粒宽,表型值为3次重复的平均值,具体数据见表1。
3.采用实施例1中提供的TaSINA101分子标记,采用实施例2中提供的方法,分析不同生态区的小麦种质资源的TaSINA101基因型,分型结果如图2所示。利用Excel(2016)软件的单因素方差分析方法,分析携带不同基因型的小麦品种千粒重、粒长和粒宽是否有显著差异,结果如图3所示,具体数据见表1。
我国主要小麦种植区(河南,陕西,山西,山东,河北等地),基因型为CC的材料占据主要地位,但随着时间的发展,GG基因型在育成的小麦品种中逐渐被选择。具体小麦种质资源地理信息见表2,TaSINA101两种单倍型在中国小麦品种中频率随时间的变化信息见表3,信息来源为小麦基因组变异联合数据库、“第一种业审定品种信息查询”和庄巧生《中国小麦品种改良及系谱分析》。
表1不同生态区小麦种质资源的基因型及其籽粒表型
表2小麦种质资源地理发布情况
表3TaSINA101两种单倍型在中国小麦品种中频率随时间的变化信息
TaSINA101两种基因型小麦种质资源在我国主要小麦种植区的时空分布。CC基因型相较GG基因型在我国主要小麦种植区(如河南,陕西,山西,山东)的分布中占据主要地位,但随着时间的发展,GG基因型在育成的小麦品种中逐渐被选择。
实施例4
本实施例提供小麦粒重相关基因TaSINA101转基因水稻的应用,具体如下:
1.小麦TaSINA101基因克隆及转基因载体构建
利用Trizal法提取小麦幼穗总RNA,使用NanoDrop2000测浓度,A260/A280比值在2.0左右说明样品质量合格。克隆TaSINA101基因的编码区,利用同源重组的方法构建由35S启动子驱动的过表达重组载体。
2.转基因水稻构建及纯合体株系筛选
利用农杆菌介导的遗传转化方法将重组载体导入受体材料中花11中,经抗性筛选、分化、生根、壮苗等过程获得水稻转基因株系;通过逐代抗性筛选获得TaSINA101过表达纯合体株系。
3.转基因水稻表型分析
将受体中花11及转基因纯合体水稻均盆栽种植于温室,待成熟后每种材料随机取样30株进行籽粒拍照,利用万深SC-G型自动种子考种分析仪对千粒重、粒长、粒宽性状进行测量统计。表型值为3次重复的平均值。
如图5所示,TaSINA101转基因水稻相比受体中花11,其粒长与粒宽明显增大。统计学分析表明,TaSINA101转基因水稻的千粒重、粒长、粒宽均显著高于受体中花11。
以上所述仅是本申请的具体实施方式,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本申请原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些也应视为本申请的保护范围。
Claims (1)
1.小麦粒重相关基因TaSINA101分子标记在辅助育种中的应用,其特征在于所述TaSINA101分子标记是TaSINA101基因启动子区域距离起始密码子-556bp处的SNP变异位点,包括如序列表SEQ ID No.2所示的CC型,其第51位为C;和如序列表SEQ ID No.3所示的GG型,其第51位为G;
所述分子标记在辅助育种中的应用采用如下方法实现:
(1)对小麦自然群体后代提取DNA,采用如下两对引物扩增,对产物进行基因分型;
KASP-TaSINA101-F1:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGGGTCGTGGTCTCCTGG-3’和KASP-TaSINA101-R:5’-CAGCGGCCTTCCCCAT-3’;
KASP-TaSINA101-F2:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGGGTCGTGGTCTCCTGC-3’和KASP-TaSINA101-R:5’-CAGCGGCCTTCCCCAT-3’;
(2)通过检测扩增产物的荧光信号确定基因型,若所述产物仅显示如序列表SEQ IDNO.2所示DNA分子5′端连接荧光标签的颜色,则所述待测小麦SNP标记的基因型为CC;若所述产物仅显示如序列表SEQ ID NO.3所示DNA分子5′端连接荧光标签的颜色,则所述待测小麦SNP标记的基因型为GG;
(3)鉴定为基因型为GG型的后代为高千粒重品系。
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