CN101962640A

CN101962640A - 甘蓝型油菜粒重相关基因的特异分子标记及应用

Info

Publication number: CN101962640A
Application number: CN 201010169042
Authority: CN
Inventors: 周永明; 傅廷栋; 范楚川; 蔡光勤
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2010-05-04
Filing date: 2010-05-04
Publication date: 2011-02-02
Anticipated expiration: 2030-05-04
Also published as: CN101962640B

Abstract

本发明属于油菜分子育种领域，涉及一种甘蓝型油菜粒重相关基因MINI3和TTG2的特异性分子标记的制备。以甘蓝型油菜甲A254为母本与甘蓝型油菜甲A177为父本杂交构建双单倍体群体(DH)，对该DH群体基因型和千粒重数据进行分析，获得粒重性状的QTLs位点。通过同源序列法克隆了甲A254和甲A177的MINI3和TTG2基因，根据序列差异位点设计MINI3和TTG2基因的特异分子标记MINI3a和TTG2a，将分子标记MINI3a和TTG2a定位在A5连锁群的二个粒重QTLs位点上，进行了相关的验证和应用，证明本发明制备的分子标记是一种新的遗传标记。所述的基因序列也是本发明首次获得的。本发明为油菜粒重的分子育种提供了新的标记，也为甘蓝型油菜的千粒重性状位点的候选基因克隆和标记辅助选择提供了有用的信息。

Description

甘蓝型油菜粒重相关基因的特异分子标记及应用

技术领域

本发明属于油菜分子育种和生物技术领域，具体涉及甘蓝型油菜粒重相关基冈的发现、克隆和鉴定，以及相关基因的特异分子标记的开发和应用。

背景技术

甘蓝型油菜(Brassica napus L.，以下简称油菜)是世界上最重要的油料作物之一。油菜的种子不仅是油和蛋白质的储藏器官，同时也是植物生命周期延续的器官。种子大小或重量是非常重要的经济性状。首先粒重是构成植物单株产量的三大因素之一(单株有效角果数、每角果粒数、粒重)，因此也决定着产量(Clarke and Simpson，1978；Butruille et al.，1999；Shi et al.，2009)；其次，种子大小也与含油量和蛋白质含量有关系(Morgan et al.，1998；Lionneton et al.，2004)；再次，大种子通常在萌发过程中有更好的适应性。因此，弄清种子大小或重量形成的遗传基础，对油菜产量和品质的改良十分重要。此外，从进化的角度来看，弄清种子大小的变化也有着非常重要的意义。

尽管油菜的种子大小非常重要，但目前对其遗传控制仍缺乏深入的了解。和其它产量相关性状相比，粒重的遗传力较高(Liu et al.，1987；Qi et al.，2004；Shi et al.，2009)。随着分子标记技术的发展，目前也定位了一些油菜粒重的数量性状位点(Quantitative Trait Loci，QTL)。Quijada et al.(2006)利用四个群体的二年二点试验定位了三个与粒重有关的QTLs(位于N7，N17和N19)，但在不同群体间没有相同的QTL存在；Udall et al.(2006)分别在Hua Double Haploid(DH)群体、SYN DH群体和测交群体等三个不同群体间分别检测到6个、4个和5个粒重有关的QTLs，只有一个位于N14上的QTL能在不同群体和不同环境间稳定检测到；最近，Shi et al.(2009)利用油菜的二个群体在10个不同环境下一共检测到159个粒重QTLs，这些QTLs分布在除了C1以外的其它所有染色体上。

利用模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)，在过去的十多年中利用突变体分析等手段，对种子大小的分子调控机理进行了研究。Alonson-Blanco et al.，(1999)定位了11个和种子大小有关的QTLs，第一次揭示了这个性状在不同材料间的遗传复杂性。最近，对大量突变体的分析，进一步阐明了许多决定种子大小的分子机理。例如TTG2(Transparent Testa Glabrous 2)基因突变体，影响种皮中的类黄酮素的积累，通常会减少粒重(Debeaujon et al.，2000，2003)。而AP2(APETELA2)或者ARF2(Auxin Response Factor 2)等转录因子的突变可使种子变大(Jofuku et al.，2005；Ohto et al.，2005；Schruff et al.，2005)。Luo et al.(2005)鉴定了二个小种子突变体IKU2(HAIKU2)和MINI3(MINISEED3)，并首次提出种子大小遗传控制的可能代谢途径。鉴于油菜和拟南芥非常相近的同源关系，预期可以利用拟南芥的信息，从油菜基因组中获得有关控制种子大小的同源基因。

目前在油菜中未见对粒重有关基因的克隆和分析的报道。鉴于粒重性状的重要性，对油菜中粒重有关基因的发现、克隆和鉴定，以及基因特异分子标记的开发对促进油菜产量和品质育种是十分必要的。

发明内容

本发明的目的是提供甘蓝型油菜粒重相关基冈MINI3和TTG2及上述2个基因特异的分子标记，并将其用于油菜粒重性状的选育封面。这些分子标记及方法可为甘蓝型油菜粒重育种提供新的手段，从而加速甘蓝型油菜粒重性状的改良进程，提高甘蓝型油菜育种的准确性和选择效率。

本发明是通过以下方案实现的。

a)甘蓝型油菜甲A254(大粒纯系，该材料的种子已于2009年11月20日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO：P200909)与甘蓝型油菜甲A177(小粒纯系，该材料的种子已于2009年11月20日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO：P200908)杂交，得到F1；

b)由杂种F1的花蕾通过小孢子培养(余风群等，1997)获得分离的双单倍体系(DH系)群体；

c)对DH系群体的每一个株系进行分子标记分析，并对每个株系的基因型进行描述；具体方法：分离DH群体每一个系的基因组DNA，采用SSR引物进行PCR扩增，扩增产物在6％(100ml聚丙烯酰胺胶溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉-双丙烯酰胺)的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，经银染、显影后，获得每个株系基因型；

d)基于孟德尔和摩尔根遗传连锁和分离规律，用获得的分子标记信息构建甘蓝型油菜遗传连锁图。遗传连锁图的构建采用MAPMAKER 3.0(Lincoln et al.，1992)软件进行；

e)测定DH群体每个系的成熟种子的千粒重数值；

f)将DH群体每个株系的千粒重与甘蓝型油菜遗传连锁图中的分子标记进行连锁和QTL分析，QTL检测采用QTL Cartographer V2.0(Wang et al.，2007)软件中的复合区间作图法(CIM)进行，以2.0为LOD阈值，大于2.0说明存在一个QTL位点。得到和粒重有关的QTL位点：TSW1、TSW2、TSW5a、TSW5b、TSW5c、TSW7a、TSW7b、TSW10和TSW14等9个QTLs位点，其中TSW7a和TSW7b是主效QTLs位点，一共能解释所有粒重变异的27.64-37.90％。

g)在拟南芥中，MINI3和TTG2是已经被证明控制种子大小和粒重的重要基因。通过搜寻NCBI核苷酸数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)，找到了二个分别和拟南芥MINI3和TTG2基因序列高度同源的白菜BAC克隆：AC189531和AC232555，根据基因序列信息，设计了二对扩增基因全长的引物MINI3F/R和TTG2F/R。从甘蓝型油菜甲A254和甘蓝型油菜甲A177中分别扩增出这二个基因的基因组片段，克隆，测序。经过仔细验证后，基于二个亲本基因组核苷酸序列的不同，开发了MINI3基因的一个CAPs标记(Pst I酶切)MINI3a和TTG2基因的一个SNP标记TTG2a，这二个标记分别定位在上述DH群体的A5连锁群上。MINI3a正好定位在检测到的粒重QTL位点TSW5b的峰值处，能解释千粒重变异的7％。TTG2a离检测到的另一个粒重QTL位点TSW5c的QTL峰值处5cM并处在其置信区间内，能解释千粒重变异的7％，TSW5c是相邻于TSW5b并表现出相似的加性效应。因此可以认为MINI3基因即为QTL位点TSW5b的候选基因；TTG2基因为QTL位点TSW5c的候选基因。MINI3a和TTG2a是控制千粒重的基因MINI3和TTG2的基因特异性分子标记；

h)利用TSW7a、TSW7b、TTG2a和MINI3a对DH系的基因型进行分析，同时存在上述四个标记带纹均和甘蓝型油菜甲A254一致的为大粒材料；相反同时存在上述四个标记带纹均和甘蓝型油菜甲A177一致的为小粒材料。

在上述方法中，所用分子标记引物对的核苷酸序列如下所示：

引物对(1)，编号为MINI3F/R：

正向引物5′-ATGAATGCTTTTGATGGAACCTAC-3′，

反向引物5′-CTAAAGGTTGAGACCAAAGTTGAGA-3′。

引物对(2)编号为TTG2F/R：

正向引物5′-ATGGATGTGAAAGAGAGTGAAAGAA-3′，

反向引物5′-TTAAATGGCTTGATTAGAATGTTGTG-3′。

引物对(3)编号为MINI3a：

正向引物5′-AGACCATAACAATCACCGAACC-3′，

反向引物5′-ACACGATCAATCTCTGGTTCATT-3′。

引物对(4)编号为TTG2a：

正向引物5′-CCGCGGGTGATTCATCTAAG-3′，

反向引物5′-GGAAGCTAAAAAATAAAGAGTTAAA-3′。

其中，引物对MINI3F/R扩增序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的核苷酸序列，为甘蓝型油菜甲A177和甲A254的MINI3基因的A基因组核苷酸序列；引物对TTG2F/R扩增序列表中SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的核苷酸序列，为甘蓝型油菜甲A177和甘蓝型油菜甲A254的TTG2基因的A基因组核苷酸序列；MINI3a为CAPs标记，是根据MINI3F/R扩增出的甘蓝型油菜甲A177和甘蓝型油菜甲A254的MINI3基因A基因组的核苷酸序列的差异位点设计的引物，引物对MINI3a扩增序列表中SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的核苷酸序列，用MINI3a引物对进行PCR扩增后，利用Pst I酶进行酶切，如果能够被酶切的判定为与甘蓝型油菜甲A177一致的基因型，如果不能够被酶切的判定为与甘蓝型油菜甲A254一致的基因型(见图1)，即定为MINI3基因A基因组的分子标记；TTG2a为SNP标记，是根据TTG2F/R扩增出的甘蓝型油菜甲A177和甘蓝型油菜甲A254的TTG2基因A基因组的核苷酸序列的差异位点设计的引物，利用引物对TTG2a扩增序列表中SEQ ID NO：7的核苷酸序列，能够进行PCR扩增有带纹出现的为和甲A254一致的基因型，不能够进行PCR扩增的为和甲A177一致的基因型(图1)。即为TTG2基冈A基因组的分子标记。

在上述制备方法中，步骤a)至步骤f)的方法与申请人华中农业大学的在先专利申请(专利申请号为201010120725.6，申请日为2010年3月10日)的制备步骤相同。从步骤g)至h)的方法是本发明的附加特有步骤(即，区别技术特征)。

本发明的积极效果：

本发明成功得到和千粒重性状相关基因TTG2和MINI3的基因特异性分子标记，运用这些标记可分离、鉴别、克隆千粒重相关基因，从而可以克服传统育种中依靠表型进行选择的缺点。利用本发明制备的分子标记可进行油菜粒重性状的分子标记辅助选择，可以明显减少育种工作量，缩短育种年限，加快油菜育种的进程。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2是本发明分离克隆的MINI3基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4是本发明制备的分子标记MINI3a的核苷酸序列。

SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6是本发明分离克隆的TTG2基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO：7是本发明制备的分子标记TTG2a的核苷酸序列。

SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9是扩增MINI3基冈的引物对MINI3F/R的核苷酸序列。

SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11是扩增TTG2基因的引物对TTG2F/R的核苷酸序列。

SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13是扩增MINI3基因的分子标记MINi3a的引物对的核苷酸序列。

SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15是扩增TTG2基因的分子标记TTG2a的引物对的核苷酸序列。

图1：是本发明的技术流程图。

图2：是利用引物对MINI3a、TTG2a在甘蓝型油菜甲A254和甘蓝型油菜甲A177及其F1的基因组DNA中的扩增结果。图中MINI3a引物对的PCR扩增产物的Pst I酶切产物和TTG2a引物对的PCR扩增产物是在2％琼脂糖凝胶(每100ml的TAE buffer中含2g的Agarose)上电泳分离的图片。

图3：是利用引物对MINI3F/R在甘蓝型油菜纯系甲A177和甲A254的基因组DNA中扩增出的核苷酸序列比对结果。图中下划线位置为引物对MINI3a的结合位点，箭头所示的位点为序列的第1751位点的核苷酸突变，从而造成了Pst I酶的酶切位点的突变。利用引物对MINI3a在甘蓝型油菜纯系甲A177和甲A254的基因组DNA中PCR扩增的产物，甲A177的能进行Pst I酶切，而甲A254的不能进行Pst I酶切。

图4：是利用引物对TTG2F/R在甘蓝型油菜纯系甲A177和甲A254的基因组DNA中扩增出的核苷酸序列比对结果。图中下划线位置为引物对TTG2a的结合位点，三角形表示序列的第223位的6个核苷酸的插入突变和第461位的6个核苷酸的插入突变，从而利用这二个插入突变位点设计了TTG2a的引物对。利用引物对TTG2a在甘蓝型油菜纯系甲A177和甲A254的基因组DNA中进行扩增，甲A254能进行PCR扩增，而甲A177不能进行PCR扩增。

图5：是DH群体A5染色体的遗传连锁图和粒重QTLs的定位结果。图中

为检测到的QTLs位点，A5染色体上从上往下依次为：TSW5a、TSW5b和TSW5c。其中

为QTL峰值所在位置；

为QTL的置信区间。

具体实施方式

实施例1：甘蓝型油菜中粒重QTLs的定位

(1)甘蓝型油菜粒重定位群体甲A254/甲A177的DH群体的构建及田间试验和千粒重分析

采用以甘蓝型油菜甲A254(大粒纯系，该材料的种子已于2009年11月20日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO：P200909)为母本、以甘蓝型油菜甲A177(小粒纯系，该材料的种子已于2009年11月20日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO：P200908)为父本进行杂交得到F1，对F1的花蕾进行小孢子培养得到DH分离群体。一共得到238个系的DH系，随机选取190个系用于全基因组的遗传连锁图的构建和粒重QTL的定位。

DH系和其亲本、F1种植于2007-2008年度和2008-2009年度的二个连续的年份，田间试验采取完全随机区组设计，三次重复，每一个系种二行，每行11-12个单株，株距平均24cm左右，行间距30cm。所有材料种植于武汉华中农业大学油菜试验田，为冬油菜种植环境。田间管理按一般育种大田管理。

每年5月份从田间收割回成熟的试验材料，从自由授粉的单株上脱下种子，清理掉杂质和不饱满的种子，至少放置4周以上，在空气中自然干燥。每个单株随机取500粒饱满种子，三次重复，单株内误差不超过0.1g，超过后放回混匀再取，然后算取平均值折算成千粒重(1000粒种子的重量)数值，亲本、F1和DH每个系取10-15个单株，算取平均值为其千粒重值(相关数据见表1)。

(2)DH群体的遗传连锁图构建和粒重QTL分析

选取在二个亲本间具有扩增多态性的SSR引物对190个DH系根据已有方法(Plieske and Struss，2001；Suwabe et al.，2002；Lowe et al.，2004；Chen et al.，2009)进行分析。分离每个DH系的基因组DNA，采用上述筛选得到的有多态性的SSR引物进行PCR扩增，扩增产物在6％(100ml聚丙烯酰胺溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉-双丙烯酰胺)的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，经银染、显影后，获得每个株系基因型和群体的分子标记多态性数据，将获得的群体基因型数据构建甘蓝型油菜遗传连锁图。遗传连锁图的构建采用MAPMAKER 3.0(Lincoln et al.，1992)软件进行，连锁群划分的参数设置为LOD值为9.0，最大距离为30cM，每一个连锁群的确定利用order，try和ripple等命令。作图群体中连锁群中的共同标记和铆定标记来自Parkin et al.(1995)，Lowe et al.(2004)，Piquemal et al.(2005)，Qiu et al.(2006)and Chen et al.(2009)等文章中的信息，二个位点间的遗传距离的计算采用“Kosambi”参数。

将DH群体每个株系的千粒重数据与甘蓝型油菜遗传连锁图中的分子标记进行连锁和QTL分析，QTL的检测采用QTL Cartographer V2.0(Wang et al.，2007)软件中的复合区间作图法(CIM)进行，QTL检测前，其参数设定为：选择“forward-backward stepwise regression”模式，检测间隔的窗口大小选择10cM，参数设定为模式6：Pin＝0.05，Pout＝0.05，检测时，LOD值默认为2.0，QTL的置信区间的确定以在峰值所在的LOD-1所包含的峰值二端所对应在遗传连锁图上的位置。置信区间有重叠部分认为是在不同的环境和群体间有相似位置的QTL。

在二年的试验中，一共在6条染色体上(A1，A2，A5，A7，A10和C4)检测到9个千粒重的QTLs，这些QTLs分别能解释3.66-20.76％的表型变异(表2)。来自甲A254的等位基因对TSW5a，TSW5b，TSW5c，TSW10和TSW14起正向作用，对TSW1和TSW2起负向作用。

实施例2：甘蓝型油菜中千粒重性状的基因特异性分子标记的获得

在拟南芥中，MINI3和TTG2基因已被证明是控制种子大小和粒重的重要基因。为了探究在甘蓝型油菜中利用粒重有关基因MINI3和TTG2的基因特异性标记的可能性，设计了分离甘蓝型油菜中同源序列的实验，通过搜寻NCBI核苷酸数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)，找到了二个分别和拟南芥MINI3和TTG2基因序列高度同源的白菜BAC克隆：AC189531和AC232555，而且这二个BAC克隆均定位在A5染色体上。根据基因序列信息，设计了二对扩增基因全长的引物MINI3F/R和TTG2F/R。从DH群体的二个亲本甲A254和甲A177中扩增出这二个基因的基因组片段，克隆，测序。经过仔细验证后，基于二个亲本基因组核苷酸序列的不同开发了TTG2基因的一个SNP标记和MINI3基因的一个CAPs标记(分别命名为TTG2a和MINI3a)，这二个标记分别定位在了DH群体的A5连锁群上。MINI3a正好定位在了检测到的粒重QTL位点TSW5b的峰值处，能解释千粒重变异的7％。TTG2a离检测到的另一个粒重QTL位点TSW5c的QTL峰值处5cM并在其置信区间内，能解释千粒重变异的7％。TSW5c是相邻于TSW5b并表现出相似的加性效应效应。因此可以认为MINI3基因即为QTL位点TSW5b的候选基因；TTG2基因为QTL位点TSW5c的候选基因。TTG2a和MINI3a是控制千粒重的基因TTG2和MINI3的基因特异性分子标记；

实施例3：甘蓝型油菜中千粒重性状基因特异性分子标记的有效性验证

(1)甘蓝型油菜中千粒重性状基因特异性分子标记的验证

和A7上的二个位点相比，TTG2a和MINI3a位点对表型变异的贡献较小，为了检测TTG2a和MINI3a位点对表型变异的遗传效应，以这二个位点的基因型对DH群体的系进行分组并计算其千粒重的平均值，在DH群体的TTG2a和MINI3a二个位点的每一个的二种基因型上千粒重数值都有明显的不同(表3)。

(2)甘蓝型油菜中粒重QTLs位点的组合效应验证

在DH群体中检测粒重QTLs位点的组合效应，DH群体的系以A5和A7上的QTLs的基因型进行分组并比较其粒重的变化(表4)。由于A5上的三个QTLs紧密的连锁在一起，在DH群体中很少获得重组系，则将A5上的三个位点简化为一个位点用于基因型的分类。从而三个位点在DH群体中应有8中基因型的组合(表4)。从表4的数据可以得到一个结论：虽然A5上的QTLs位点效应较小，但其对千粒重的贡献不能被忽视，通过表4的数据可以看出，第一组的千粒重数据(包含所有的三个正向加性等位基因)比其它所有组的数值都要高。

利用TSW7a、TSW7b、TTG2a和MINI3a对DH系的基因型进行分析，同时存在上述四个标记带纹均和甲A254一致的为大粒材料，带有TTG2和MINI3基因的千粒重正向效应；相反同时存在上述四个标记带纹均和甲A177一致的为小粒材料，带有TTG2和MINI3基因的千粒重负向效应。

通过检查DH群体所有千粒重QTLs位点的基因型，第75#系拥有所有正向效应的QTLs位点，其在二年的表型值中都具有最大的千粒重数值(表5)。相反，第87#系拥有所有反向效应的QTLs位点，其在二年中都具有最小的千粒重数值。

以上的结果说明可以利用这些标记的信息用于粒重性状的分子标记辅助选择，并且应用这些标记对粒重的基因型选择也是非常准确的。

表1：DH群体的亲本、F1和分离群体的千粒重数据

备注：¹⁾P1＝母本，P2＝父本；数值后的大写字母和小写字母是指在t测验下亲本间分别在0.01水平和0.05水平下的差异显著性。

²⁾h_B ²：为广义遗传力。

表2：在DH群体中检测到的粒重QTLs位点信息

备注：¹⁾QTL的命名是根据性状名的初始大写字母加上其所在连锁群的数字；如果在一个连锁群上检测到多于1个QTL时，在其后面按顺序加上字母a或者b；

²⁾区间：离峰值最近的二侧标记；峰值：LOD值峰值所在的图谱位置(cM)；标记：离峰值最近的标记；

³⁾A：加性效应；正向效应是指来自母本的等位基因能够增加千粒重的值；

⁴⁾QTL能够解释的表型变异比例。

表3：DH群体中二年的四个粒重位点的基因型和千粒重标记相关信息

备注：¹⁾AA和BB是指分别和甲A254和甲A177相同的基因型。括号里的数值时每一类基因型的系的数目。χ²＝3.84是在0.05水平自由度为l的情况下的值；

²⁾大写字母和小写字母是指分别在0.01和0.05水平下的差异显著性。

表4：DH群体的等位基因标记在A5和A7连锁群上的粒重QTLs位点的组合效应

备注：¹⁾AA和BB是指分别和甲A254和甲A177相同的基因型。A5上紧密连锁的三个QTLs位点被看做是一个基因型位点进行分类；

²⁾N：此基因型种类所包括的样本量；

³⁾小写字母是指在0.05水平下的邓肯测验的差异显著性。

表5：检测到的所有粒重QTLs位点的所有正向效应和负向效应聚合的二个DH系的粒重表现

备注：AA和BB是指分别和甲A254和甲A177相同的基因型。

表6：本发明设计的分子标记引物对的编号及其核苷酸序列

备注：CAPs：酶切扩增序列多态性；SNP：单核苷酸多态性。

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序列表

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<120>甘蓝型油菜粒重相关基因的特异分子标记及应用

<130>

<141>2010-04-25

<160>15

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1890

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221>gene

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<223>

<220>

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<223>

<220>

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<222>(1)..(24)

<223>

<400>1

atgaatgctt ttgatggaac ctacagaggt gtgaggacgt gttgggctgc accgtctagt 60

cctagcccta gatcgctact agcaatgctg aatcaaggcg acaacaatga tgttgtggat 120

cagatcaacg agatcttccc tcaagctaac catcagcctg aacaaagatc cagtctccgc 180

gagagagtag ccgcacgagt tgaattcaat cttccaccgc tcgagacaca gaacaaccgt 240

ccatttgctg ctttcttcag gaacacgtcg accaccgttc cttctcctct cgtcctaatc 300

tctccaggat tcagcccatc tgctatgttg caatttccaa acacgttcat tgatccttca 360

cacgtaagta acaatgttta tgattctttc ataatacgat atataatcat atgataaaca 420

gtcgaacaaa aatgtggttg gacaacatac aacggaatat tattatgtat gatattttaa 480

acaattaggc gtaaaaagtg agtattattt atcgtgtttt ttaacgaata ttatttaaca 540

atatagaatc tatcatttcc tttttgttca cgtttgaata catactctat ttgcgtttac 600

aattttcaat tcgataacaa tttaatacaa agtttatgta tgaaccataa aactatactt 660

tgttatattt aacgtgtcgc tctttaaaca tatttcagat gatccttccg tctccagtcg 720

ccaatggcgg gcctccagag gcggttgaaa gttctggtgc cgaccatgca acgatgatga 780

tatccaacaa cgatccgatg cacgttgctc tgcctcctca acaaggtaat agagttgctt 840

ctgtctctag tttgcttcca ttttggattc tcctagtatt tttttaacat gctctgatga 900

tattccaaag actccgttta tatcccatct catgttgatt ccattgatgc tcctatagtc 960

gctgcttttg aatctggtcc agcccttaac gaaaccgacc tcatcaacat ggaaatcgat 1020

aggaagaacg aggacgaaga ggaatacaag gaagatgaag acgaagaaca caacattgtt 1080

gatgagctag atgctgagcc ttcatctcca aagagaaggt cccaagataa catcagtatt 1140

taataacaat aaacttaata tatttgatta aattaaccta aactacataa ttcttttgca 1200

ggaagtttgg ggaatcaacc atgattggag cgacaagatc atgtaagagc caaagagtta 1260

tccttcaaat ggaaactgaa gaaaacaatc ctgacgatgg ttttcgctgg aggaaatacg 1320

gtcagaaagt tgtcaaaggg aacccaaatc caaggtttgt ttctttcatt atgctcttaa 1380

tttttttttt ttatcttaga ttttatatta tgttagattt ttatattttt attttggtgc 1440

agaagctact acaaatgcac atacacagcg tgtgatgtga agaagcatgt ggagagagga 1500

gcagaagatg tcaagtttct attggttaca tacgatggga tacacgagca cgatccacca 1560

gctgcacgtg gtagcagttc ttccggtcta aagggccagt acagttcatc agtgtctcaa 1620

gaccataaca atcaccgaac cgtgccgcct tcttcctctt cggcctctga agcccttagg 1680

tttttccctt cttcgttgga cccaccagtg gatatgacac agttctatat gactggactc 1740

gctaagctgc agagtttacc ggtttaccag aaccatggtt tgatgaactg gaataatgaa 1800

ccagagattg atcgtgtgat accggacggt acagaggtat tcaaagggat cagggatcga 1860

cttaatctca actttggtct caacctttag 1890

<210>2

<211>1890

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

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<223>

<220>

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<222>(1865)..(1890)

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<220>

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<222>(1)..(24)

<223>

<400>2

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aattttcaat tcgataacaa tttaatacaa agtttatgta tgaaccataa tactatactt 660

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ctgcttttga atctggtcca gcccttaacg aaaccgacct catcaacatg gaaatcgata 1020

ggaagggcga ggacgaagag gaatacaagg aagatgaaga cgaagaacac aacattgttg 1080

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aataacaata aacttaatat atttgattaa attaacctaa actacataat tcttttgcag 1200

gaagtttggg gaatcaacca tgattggagc gacaagatca tgtaagagcc aaagagttat 1260

ccttcaaatg gaaactgaag aaaacaatcc tgacgatggt tttcgctgga ggaaatacgg 1320

tcagaaagtt gtcaaaggga acccaaatcc aaggtttgtt tctttcatta tgctcttaat 1380

tttttttttt ttatcttaga ttttatatta tgttagattt ttatattttt attttggtgc 1440

agaagctact acaaatgcac atacacagcg tgtgatgtga agaagcatgt ggagagagga 1500

gcagaagatg tcaagtttct attggttaca tacgatggga tacacgagca cgatccacca 1560

gctgcacgtg gtagcagttc ttccggtcta aagggccagt acagttcatc agtgtctcaa 1620

gaccataaca atcaccgaac cgtgccgcct tcttcctctt cggcctctga agcccttagg 1680

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gctaagctgc cgagtttacc ggtttaccag aaccatggtt tgatgaactg gaataatgaa 1800

ccagagattg atcgtgtgat accggacggt acagaggtat tcaaagggat cagggatcga 1860

cttaatctca actttggtct caacctttag 1890

<210>3

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<212>DNA

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

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<220>

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<222>(176)..(198)

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<220>

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<222>(1)..(22)

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agaccataac aatcaccgaa ccgtgccgcc ttcttcctct tcggcctctg aagcccttag 60

gtttttccct tcttcgttgg acccaccagt ggatatgaca cagttctata tgactggact 120

cgctaagctg cagagtttac cggtttacca gaaccatggt ttgatgaact ggaataatga 180

accagagatt gatcgtgt 198

<210>4

<211>198

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

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<221>mutation

<222>(132)

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<220>

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<222>(176)..(198)

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<220>

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<222>(1)..(22)

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<400>4

agaccataac aatcaccgaa ccgtgccgcc ttcttcctct tcggcctctg aagcccttag 60

gtttttccct tcttcgttgg acccaccagt ggatatgaca cagttctata tgactggact 120

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accagagatt gatcgtgt 198

<210>5

<211>1465

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221>gene

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<222>(1440)..(1465)

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<400>5

atggatgtga aagagagtga aagaaatgta gtagcaaaac cagtggcttc aaggccttca 60

tgctctagcg tcaggacatt cactgacctt ctggctgatt cagttactgt ctctccacaa 120

tcgaactgtc acgagactgt agacgcttct ataataccaa agactgagag gtttaaacag 180

ccagcttcag cttctgtctc atctccacgg gtgattcatc taactggacg tgttatcttc 240

tttctgaatc ttccgcattg ggtccttgac acttttcagt ctatatgata atcttaggtg 300

gaaggaagtg gcgatgtaaa gtcttgtgat gattcagaga gcaaaagtta cgtcatttat 360

aaacctaaag caaagcttgt ctcccaagca accgtctctg cgttggctaa tatggtaagt 420

tgctttctca agcctacaac gacagttttt cgaacctcat cctctttgtt tgttagcttc 480

cgggaaattg tcaacagact tggataaaaa gagaagcagt agcgtacggg aagcgtgtga 540

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cagagacatc cattggggat agatcttacg tggacggata caactggagg aaatacggac 660

agaagcaagt caaaggaagt gactctccaa ggggttacta caaatgcaca caccccaaat 720

gtcctgttaa gaagagagta gagagatcat caatgggagg tcatgtttca gagattgtgt 780

atcaaggtga gcataatcac tctaaaccct cttgtcctct tccacggcgg gcttcatctt 840

catcctcttc agggtttcag acaccatctg aagaatcaat ggggcaagaa cctaaccctc 900

tttggagtga tcaagagaag atgaatgaag ggtgtgttat aacaccattc gagttcgctg 960

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gtgatgaaag agagcttgat gatccaagca gaagcaagac taggtaaaaa attattatta 1080

gggttttgga ttgttttcaa acaccagttt ctgcatctac agttaaacat ttgagtttgt 1140

tgataatagc atgaagaacg agacgcaatc aagtgaagct ggagtatcgc aaagctcagg 1200

ggaatcagac agtctcgaag atggattcaa gtggagaaag tacggacaga aagcagttgg 1260

agggaatgcg tatccgagaa gttattacag gtgcacgagc gtgaattgta gagcaaggaa 1320

acgcgtggag agagcgagtg atgattcaag agctttcatt acaacctacg aaggtaaaca 1380

caatcatcac catttgcaac tgaggcctcc aacttcttct actctttctt ttagctcccc 1440

acaacattct aatcaagcca tttaa 1465

<210>6

<211>1469

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

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<221>gene

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<221>mutation

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<223>

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<221>mutation

<222>(468)..(474)

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<220>

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<222>(1444)..(1469)

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<222>(470)..(494)

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<222>(206)..(225)

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<220>

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<222>(1)..(26)

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<400>6

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atgctctagc gtcaggacat tcactgacct tctggctgat tcagttaccg tctctccaca 120

atcgaactgt cacgagactg tagacgcttc tataatacca aagactgaga ggtttaaaca 180

gccagcttca gcttctgtct catctccgcg ggtgattcat ctaagtctaa ctggtcgtgt 240

tatcttcttt ctgaatcttc cgcattgggt ccttgacact tttcagtcga tatgataatc 300

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cgggcttcat cttcatcctc ttcagggttt cagacaccat ctgaaggatc aatgggggaa 900

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agaagtggcc agtgtgatga aagagagctt gatgatccaa gcagaagcaa gacaaggtaa 1080

aaaattatta ttagggtttt ggattgtttt caaacaccag tttctgcatc tacagttacg 1140

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acagaaagcg gttggaggga atgcgtatcc gagaagttat tacaggtgca cgagcgtgaa 1320

ttgtagagca aggaaacgcg tggagagagc gagtgatgat tcaagagctt tcattacaac 1380

ctacgtaggt aaacacaatc accaccattt gctcttgaga cctccaagtt cgtctactct 1440

tcccacaaca ttctaatcaa gccatttaa 1469

<210>7

<211>289

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

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<222>(265)..(289)

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<222>(1)..(20)

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<400>7

ccgcgggtga ttcatctaag tctaactggt cgtgttatct tctttctgaa tcttccgcat 60

tgggtccttg acacttttca gtcgatatga taatcttagg tggaaggaag tggcgatgta 120

aagtcttgtg atgattcaga gagcaaaagt tacgtcattt ataaacctaa agcaaagctt 180

gtttcccaag caaccgtctc tgcgttggct aatatggtaa gttgctttct caagcctaca 240

acgacagttt ttcgaacctc atcttttaac tctttatttt ttagcttcc 289

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

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<221>gene

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<400>8

atgaatgctt ttgatggaac ctac 24

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<212>DNA

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

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ctaaaggttg agaccaaagt tgaga 25

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<212>DNA

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

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<221>gene

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<400>10

atggatgtga aagagagtga aagaa 25

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<212>DNA

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

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<221>gene

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<400>11

ttaaatggct tgattagaat gttgtg 26

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<211>22

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(22)

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<400>12

agaccataac aatcaccgaa cc 22

<210>13

<211>23

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(23)

<223>

<400>13

acacgatcaa tctctggttc att 23

<210>14

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<212>DNA

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

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<223>

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ccgcgggtga ttcatctaag 20

<210>15

<211>25

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(25)

<223>

<400>15

ggaagctaaa aaataaagag ttaaa 25

Claims

1.一种与甘蓝型油菜粒重相关的MINI3和TTG2的基因的特异性分子标记MINI3a和TTG2a，其特征在于，所述分子标记MINI3a的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；所述分子标记TTG2a的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

2.一种分离的与甘蓝型油菜粒重相关的基因MINI3，它是通过如下方法获得的：用甘蓝型油菜叶片分离的DNA，采用引物对MINI3F/R：5′-ATGAATGCTTTTGATGGAACCTAC-3′和5′-CTAAAGGTTGAGACCAAAGTTGAGA-3′，从甘蓝型油菜甲A177和甘蓝型油菜甲A254中分别扩增出这二个材料的基因组片段，克隆，测序，分别得到甘蓝型油菜甲A177和甘蓝型油菜甲A254的MINI3基因序列，所述的MINI3基因的核苷酸序列分别如序列表SEQID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

3.如权利要求2所述的基因，其中扩增MINI3基因的引物对MINI3F/R的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示。

4.一种分离的与甘蓝型油菜粒重相关的基因TTG2，它是通过如下方法获得的：用甘蓝型油菜叶片分离的DNA，采用引物对TTG2F/R：5′-ATGGATGTGAAAGAGAGTGAAAGAA-3′和5′-TTAAATGGCTTGATTAGAATGTTGTG-3′，从甘蓝型油菜甲A177和甘蓝型油菜甲A254中分别扩增出这二个材料的基因组片段，克隆，测序，分别得到甘蓝型油菜甲A177和甘蓝型油菜甲A254的TTG2基因序列，所述TTG2基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

5.如权利要求4所述的基因，其中扩增TTG2基因的引物对TTG2F/R的核苷酸序列如SEQID NO：10和SEQ ID NO：11所示。

6.扩增与甘蓝型油菜粒重相关的MINI3基因的特异性分子标记MINI3a的引物对，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示。

7.扩增与甘蓝型油菜粒重相关的TTG2的基因特异性分子标记TTG2a的引物对，它的核苷酸序列如SEQ IDNO：14和SEQ IDNO：15所示。

8.一种与甘蓝型油菜粒重相关的MINI3和TTG2的基因特异性分子标记的制备方法，其步骤包括：

a)用甘蓝型油菜甲A254为母本与甘蓝型油菜甲A177为父本杂交，得到F1；

b)种植步骤a)的F1，从所述的F1植株的花蕾中通过小孢子培养获得分离的双单倍体(DH)群体；

c)对步骤b)的DH群体中的每一个株系进行分子标记分析，分离DH群体每一个株系的基因组DNA，采用SSR引物进行PCR扩增，扩增产物用体积为6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，经银染、显影后，获得每个株系的基因型；

d)用步骤c)中获得基因型构建甘蓝型油菜遗传连锁图；

e)测定步骤b)中的DH群体的每个株系的成熟种子的千粒重数值；

f)将步骤e)中所述的千粒重数值与步骤d)中所述的甘蓝型油菜遗传连锁图中的分子标记进行连锁和QTL分析，得到与粒重的QTL位点；

其特征在于，步骤如下：

a)搜寻NCBI核苷酸数据库，找到二个分别和拟南芥控制种子大小的相关基因MINI3和TTG2基因序列高度同源的白菜BAC克隆：AC189531和AC232555，根据AC189531和AC232555的序列信息，设计二对扩增MINI3和TTG2基因全长的引物对MINI3F/R和TTG2F/R，其中：MINI3F/R的核苷酸序列如SEQ ID NO：12和13所示；TTG2F/R的核苷酸序列如SEQ ID NO：14和15所示；从甘蓝型油菜甲A177和甲A254中分别扩增出MINI3和TTG2基因的基因组片段，克隆和测序；

b)根据步骤g)中甘蓝型油菜甲A177和甲A254基因组核苷酸序列的差异，分别设计MINI3基因的CAPs标记MINI3a和TTG2基因的SNP标记TTG2a，其中：所述的MINI3a的核苷酸序列如SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示；所述的TTG2a的核苷酸序列如SEQID NO：14和SEQ ID NO：15所示；利用所述的分子标记MINI3a和TTG2a，重复步骤c)的方法，获得每一个株系的基因型；重复步骤f)的连锁分析方法，将所述的分子标记MINI3a和TTG2a分别定位在步骤b)的DH群体的A5连锁群上；

c)根据SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的引物对进行PCR扩增，得到能够区分甘蓝型油菜大粒种子与小粒种子的MINI3基因的特异性分子标记MINI3a，所述的分子标记MINI3a的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；其中能够被Pst I酶切的判定为小粒材料，不能被Pst I酶切的判定为大粒材料；根据SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示的引物对进行PCR扩增，得到能够区分甘蓝型油菜大粒种子与小粒种子的TTG2基因的特异性分子标记TTG2a，所述分子标记TTG2a的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；其中能够进行PCR扩增的判定为大粒材料，不能进行PCR扩增的判定为小粒材料。

9.权利要求1所述的分子标记在甘蓝型油菜粒重性状标记辅助选择中的应用。

10.权利要求2或4所述的基因在甘蓝型油菜粒重性状的遗传改良中的应用。

11.权利要求3或5所述的基因的引物对在甘蓝型油菜粒重性状标记辅助选择中的应用。

12.权利要求6或7所述的引物对在甘蓝型油菜粒重性状标记辅助选择中的应用。