CN102286492A - 一种油菜千粒重性状主效基因位点及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种油菜种子重量性状主效基因位点及应用，步骤包括：1）利用油菜测序品种杂交，杂种F1自交构建分离群体；2）利用公共和已开发的SSR和SNP引物对亲本DNA进行多态性筛选，通过对F2代分离群体进行分子标记基因型分析构建遗传连锁图谱；3）通过对F2和F2:3分离群体进行田间实验和考种获得种子重量的表型数据；4）结合分离群体的基因型和表型数据，进行QTL检测。获得了A9连锁群上控制油菜千粒重的主效基因位点qTSW.A9和分子标记BrSF7-181a。通过该标记对两亲本衍生的F3代进行基因型分析，保留携带有利标记的单株，考种结果表明千粒重高于F2:3家系均值的F3单株比例高达89.5%，因此利用该标记进行辅助选择可大大提高高产育种的选择效率。

Description

一种油菜千粒重性状主效基因位点及应用

技术领域

本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，更具体涉及一种甘蓝型油菜千粒重性状主效基因位点的分子标记，同时还涉及该分子标记在油菜高产育种中的应用。

背景技术

油菜是最重要的油料和能源作物之一，其脂肪酸碳链长度和结构接近化石柴油，是一种适宜于生产生物柴油的植物油。在当前和今后相当长的时间内，全世界都将面临食用植物油和化石能源短缺的严峻局面，因此大幅度增加菜籽油供应总量，是保障全球食物和能源安全的重大需求。在城市化规模持续扩大耕地面积进一步缩小的形式下，持续提高单位面积产油量(＝单产×含油量)是唯一出路。近年来，高含油量品种选育已取得了重大突破，某些代表性品种(如中双11号等)的含油量已接近甚至超过50％，这已越来越接近油菜种质资源的最高含油量，这预示着高含油量育种即将遭遇瓶颈。与此相反，油菜单产提高的潜力还很大，这具体表现在各国参试油菜品种产量构成因子的平均值跟油菜种质资源的最高水平相比还有相当差距。例如，我国2000-2009年冬油菜四大区参试油菜品种平均千粒重在4克以下(俞琦英等，2010)，而油菜种质资源中的最高千粒重超过了8克。并且，参试油菜品种千粒重和单株产量的相关性很高，达0.5303。虽然油菜单株产量的三个构成因子之间表现不同程度的负相关，但其相关系数往往不大(Shi et al.2009)，这表明可以通过提高单个产量构成因子(如千粒重)来增加产量(Zhang et al.2007)。

虽然传统育种方法曾经为生产提供了许多优良油菜品种，但由于育种周期长、选择效率低，已经无法完全满足当前油菜生产的需要。随着分子生物学和分子遗传学的发展，育种家们对性状的选择正在逐渐实现由表型选择向基因型选择的过渡。分子标记辅助育种是将分子遗传学与传统的表型选择有效结合的一种新的育种手段，其基本原理是在油菜育种过程中直接利用与目标性状基因紧密连锁和共分离的分子标记对选择个体进行目标区域以及全基因组筛选，以达到提高目标性状选择效率、缩短育种年限的目的。分子标记辅助选择育种技术的关键是鉴定与重要农艺性状紧密连锁的DNA分子标记。近年来，美国等发达国家都投入巨资开展这方面的研究工作。伴随着水稻、玉米、小麦等重要作物农艺性状分子标记的开发，利用筛选到的分子标记进行辅助选择育种已渐趋成熟，目标性状也从简单的单基因质量性状扩展到复杂的多基因数量性状。随着基因组学和测序技术的高速发展，油菜分子标记研究日渐受到关注，研究的领域涉及种质遗传多样性分析、遗传图谱的构建、基因标记和定位、品种纯度鉴定、配合力预测、标记辅助选择等多方面，并取得了重要进展。但与发达国家相比，我国油菜分子育种研究还有较大差距，主要体现在：不能有效地发掘和利用种质资源中的有利基因，缺乏有自主知识产权及育种价值的基因和标记等。

目前常用的分子标记技术大致可分为两种：一种是基于分子杂交技术，另一种则以PCR技术为核心。Grodzicker等(1974)创立了限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)标记技术。Botstein等(1980)首先提出用限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，简称RFLP)作为遗传标记构建遗传图谱的设想，从而开创了利用分子标记作为遗传标记的新时代。随后几十种基于分子杂交(如RFLP和微阵列技术等)或PCR(如RAPD，SSR，AFLP，SRAP等)的DNA分子标记技术陆续建立，并广泛应用于植物科学的研究中。

大多数重要的农艺性状(如产量、品质、抗性等)均表现数量性状的遗传特点，表型连续分布且易受环境条件的影响，因此基于表型选择的常规育种方法对复杂数量性状的选择效果不好，致使育种效率低下，育种周期延长。由于分子标记技术和数量遗传学的发展和结合，人们已可将复杂的数量性状分解为单个的数量性状基因位点(quantitative trait loci，QTL)，然后像研究质量性状一样对控制数量性状的多个基因进行研究。QTL定位就是在遗传分离群体的基础上，借助分子标记和遗传图谱，利用QTL作图软件对分离群体的数量性状表型数据进行分析，从而确定数量性状基因在染色体上的位置和效应。目前对油菜千粒重的QTL定位研究也有一些报道，但通常检测出的QTL效应值较小且重复性不好，较难在油菜育种中应用。本研究通过QTL定位，旨在筛选到对油菜千粒重具有正向效应的QTL，用于油菜产量性状的标记辅助选择。

发明内容

本发明目的是在于提供了一种油菜千粒重性状的主效基因位点。该主效基因位点的效应值和贡献率都超过已往的报导，对油菜千粒重的调控起着关键作用，可用作图位克隆和分子标记辅助选择。

本发明的另一个目的是在于提供了一种油菜千粒重性状主效基因位点紧密连锁的分子标记。该标记离主效基因位点的遗传距离很近(＜2cM)且是基于PCR技术的共显性SSR标记，因而可靠且使用方便，这给今后中双11号衍生品系的选育提供了极大的便利。

本发明的再一个目的是在于提供了一种油菜千粒重性状主效基因位点紧密连锁的分子标记在油菜高产育种中的应用。申请人利用该标记对育种群体F3代进行了辅助选择，结果表明携带有利标记的单株80％以上其千粒重超过群体均值，这表明该标记用于辅助选择是切实有效的。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种油菜千粒重性状主效基因位点的分离方法，它包括如下步骤：

(1)利用油菜测序品种中双11号和73290杂交，杂种F1代自交产生F2和F2:3代分离群体。本发明用到的研究材料由中国农科院油料所油菜生物技术育种课题组提供。

(2)采用CTAB法(Doyle et al.1987)提取亲本中双11和73290及F2分离群体的叶片总DNA，过程中所用到的试剂包括提取液(1.4M NaCl，100mM Tris，pH 8.0，20mM EDTA，pH 8.0，2％CTAB)、氯仿、异戊醇和无水乙醇；

(3)合成油菜公开(http://www.ukcrop.net/Brassica DB)和自主开发的简单序列重复(simple sequence repeat，SSR)和单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)引物，并对亲本DNA进行PCR扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色和显影后对条带的大小进行判别，筛选多态性引物。过程中所用到的主要软件包括MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)， BWA(http://bio-bwa.sourceforge.net/)，SAMtools(http://samtools.sourceforge.net/)和primer3(http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3-www.cgi)等，都是免费公开的；主要试剂包括Taq酶、dNTP、丙烯酰胺、尿素、冰醋酸、硝酸银和碳酸钠。

(4)利用多态性引物对F2分离群体进行分子标记分析，获得基因型数据。过程中用到的试剂(Taq酶、dNTP、丙烯酰胺、尿素、冰醋酸、硝酸银和碳酸钠)如上所述；

(5)把F2分离群体的基因型数据输入Joinmap3.0软件(http://www.kyazma.nl/index.php/mc.JoinMap)，进行遗传连锁图谱的构建；

(6)F2群体的基因型数据(仅限于定位到遗传图谱上的标记)以及F2和F2:3群体的千粒重性状数据输入WinQTLcart2.5软件(http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm)进行数量性状位点(quantitativetrait loci，QTL)定位，总共检测到了8个控制千粒重的QTL。其中，位于A9连锁群(对应白菜第9染色体)上的QTL在两个群体中能重复检测到，而且效应值和贡献率最大。

利用上述技术措施，申请人最终获得了油菜千粒重性状的主效基因位点qTSW.A9，该主效基因位点位于油菜A9染色体，与申请人自主开发的SSR标记BrSF7-181a紧密连锁，其引物序列为BrSF7-181-F：TCGCGAGGAATAGAACGAAT；BrSF7-181-R：GGAACCTTCTCGATGGTTTTT。利用WinQTLCart2.5软件分析测得其对油菜千粒重的平均贡献率为33.5％，加性效应为0.31，显性效应为0.26，近似显性遗传。

本研究中所用的亲本材料为中双11号和73290，均由中国农科院油料所生物技术育种课题组技术人员在王汉中研究员带领下育成。中双11号是由中双9号与高油、长角和大粒品系2F10和26102经复合杂交、小孢子培养和加倍选育而来；73290由93275(中油杂4号恢复系)作母本和中双2号选株杂交的杂种F1代进行小孢子培养与套袋自交选育而成(所有权归本课题组所有)。

一种油菜千粒重性状主效基因位点紧密连锁的分子标记在油菜高产育种中的应用，其步骤是：

(1)田间种植中选F2代单株自交所产生的F3种子，在定苗前取样，用CTAB法抽提叶片总DNA，过程中所用到的试剂(提取液、氯仿、异戊醇和无水乙醇)如上所述；

(2)利用qTSW.A9位点的分子标记BrSF7-181a对两亲本的F3代进行基因型鉴定，并在收获后进行千粒重的考种。结果表明，通过分子标记辅助选择得到的植株千粒重超过F2:3家系均值(4.9克)的占87.5％，在保留下来的植株中再筛选果多和粒多的单株。通过鉴定上述千粒重主效基因位点来预测油菜千粒重，可提高油菜高产育种的选择效率，从而加快育种进程。

本发明的优点在于：

本发明首次定位了油菜大粒品种中双11号中控制千粒重的主效基因位点，可解释33.5％的表型方差。在常规育种方法中，千粒重性状表型鉴定要等到成熟期考种，费时费力且选择效率低下(千粒重表型受环境影响较大)。通过检测千粒重性状主效基因位点，可以在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率。本发明中千粒重主效基因位点位置明确，主效基因位点的检测方法方便快速，不受环境影响。通过检测与千粒重性状相关的分子标记，即可预测千粒重的多少，进而准确快速筛选大粒单株。

附图说明

图1为一种中双11×73290组合F2和F2:3群体在武汉种植时的千粒重分布图。

结果表明千粒重表型呈正态分布，且变异范围很宽，证明千粒重属于数量性状。

图2为一种油菜A9连锁群示意图。

右半部分指示该连锁群上的标记名称，左半部分指示每个标记对应的遗传图据。

图3为一种位于A9连锁群上的千粒重主效基因位点LOD曲线示意图。

图中横坐标代表连锁群，纵坐标代表LOD值。

图4为一种利用分子标记BrSF7-181a对F3单株进行基因型分析和筛选示意图。

图中1-46为F3单株编号，最后两个P1和P2分别代表亲本中双11和73290。

具体实施方式

实施例1：

油菜千粒重分离群体的构建及性状测定：

本实施例中使用油菜测序品种中双11和另一个遗传差异大的油菜品种73290杂交构建F2和F2:3分离群体。两亲本和两群体的千粒重表型在成熟期收获后经考种鉴定。千粒重考种数据表明：两群体千粒重均呈正态分布，证明千粒重性状的数量遗传特征；两群体的千粒重均呈超亲分离，表明大粒基因在双亲中都有分布(图1)。

实施例2：

叶片总DNA的提取：

利用CTAB法提取叶片总DNA，具体步骤如下：

(1)取0.1克新鲜叶片放入研磨，加700微升提取液研磨，随即转入1.5毫升离心管中置于65℃恒温水浴60分钟，其间混合2-3次；

(2)加等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，V/V/V)，轻轻颠倒使其充分混匀，在12000rpm离心10分钟，轻轻吸取上清液转入另一1.5毫升离心管；加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1，V/V)重新抽提一次；

(3)加入1毫升-20℃预冷无水乙醇，置于-20℃冷冻不超过30分钟让DNA析出；12000rpm离心10分钟让DNA沉淀，倒掉离心管中乙醇溶液；用75％(V/V)乙醇清洗2-3次，倒掉浸泡液，打开离心管盖置于通风橱内吹干；

(4)加入TE(10mM Tris，pH 8.0；1mM EDTA，pH 8.0)溶解DNA；用紫外分光光度计测定DNA的浓度，于-20℃冰箱中保存备用；

实施例3：

引物的开发和合成：

申请人利用的SSR引物包括两类：一类是已发表文章和芸苔属数据库中公开的引物序列(http://www.brassica.info/resource/markers/ssr-exchange.php)；另一类是申请人根据白菜和甘蓝scaffold序列(自行测序所得)开发的，分别命名为BrSF和BoSF系列，具体的开发方法是先利用MISA软件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa)在每个scaffold搜索SSR，然后用Primer3.0软件(http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3-www.cgi)设计SSR引物。自主开发的SNP引物则是通过比对73290的重测序序列和中双11的参考基因组序列而来，首先，利用BWA软件(http://bio-bwa.sourceforge.net/)把73290的重测序序列定位到中双11的全基因组参考序列上，然后利用samtools软件(http://samtools.sourceforge.net/)查找SNP。SNP检测采用的是SNAP(singlenucleotide amplified polymorphism)方法，即在引物设计时在SNP位点处引入一个错配，在一个亲本中导致PCR扩增的失败。申请人已经通过生物公司合成了公共和新开发的SSR引物各6652对，SNP引物517对。

实施例4：

引物多态性的筛选，其流程如下：

(1)从亲本中各随机选择10株DNA等量混合，作为筛选引物的模板。

(2)利用溶解后的引物对亲本DNA进行PCR扩增，

反应体系：

PCR反应程序：

(3)凝胶电泳

试剂配制：

A.5×TBE

Tris-base     53.9克

EDTA          3.72克

硼酸          27.5克

用超纯水定容至1升。

B.6％变性聚丙烯酰胺凝胶

尿素          420克

5×TBE        100毫升

丙烯酰胺      57克

亚甲双丙烯酰胺   3克

用超纯水定容至1升。

C.粘剂

无水乙醇          500毫升

冰醋酸            5毫升

反硅化剂(Me-T)    5毫升

D.不粘剂

无水乙醇          500毫升

硅化剂(Dichlordiemthylsilan)14毫升

E.50×上样缓冲液

甲酰胺            100毫升

二甲苯箐          1.25克

溴酚蓝            1.25克

F.固定液

冰醋酸150毫升，用纯水稀释到1.5升

G.染色液

硝酸银  1.5克

甲醛    2.0毫升

用纯水稀释到1.5升。

H.显影液

碳酸钠                45克

硫代硫酸钠(10mg/ml)   200微升

甲醛(37％)            2.0毫升

用纯水稀释到1.5升。

凝胶制备：

玻璃板用10％(质量比)氢氧化钠溶液浸泡24小时，洗净，凉干。粘板和不粘板分别用滤纸均匀涂抹粘剂和不粘剂。把封条齐平的放在粘板边缘，然后将不粘板放在粘板上面，并在靠近玻璃板底部三分之一处夹上两个卡夹起到固定的作用。在烧杯中倒入50毫升变性聚丙烯酰胺，再分别加入350微升过硫酸胺(10％)和25微升TEMED，快速搅拌均匀；将配制好的凝胶溶液到入注射器中，沿点样口缓缓注入，凝胶注入后，在凝胶顶面插上有齿的梳子(背部插入)，在离灌胶口三分之一的玻璃板两侧对称处分别夹上卡夹固定，以保证凝胶聚合后玻璃板、封条以及梳子间紧密接触。

电泳：

移去卡夹和梳子，将玻璃板擦净后固定在电泳槽上，上下槽各加500毫升0.5×TBE缓冲液，接通电源1500伏60瓦预热30分钟。在PCR产物中加入等体积的1×上样缓冲液，95℃变性5分钟，冰浴冷却，上样2.5微升，2000伏60瓦电泳。当二甲苯青达到可视面最底端时即可停止电泳。

染色和显影：

取出粘板面向上放入固定液盆中固定30分钟左右至胶板无色，在蒸馏水盆中漂洗两次，每次2-3分钟。取出粘板面向上放入染色液盆中染色30分钟。取出粘板，在蒸馏水盆中漂洗10秒钟。取出粘板面向上放入预冷(4℃)的显影液盆中，轻轻摇动至条带清晰可见。取出粘板面向上放入固定液盆中，以终止显影。在蒸馏水盆中漂洗3分钟，室温(20-25℃以下相同)下自然凉干，拍照保存。

带型判读：

将显影后自然干燥好的玻璃板置于阅片台上，肉眼观察两亲本条带的位置差异。

实施例5：

F2群体基因型分析、遗传连锁图谱构建和QTL定位，其步骤如下：

(1)采用CTAB法提取F2群体184个单株的DNA(见实施例2)；

(2)挑选出多态性引物对F2群体184个单株的DNA进行PCR扩增，然后对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读(见实施例4)。有差异的分子标记可分为两类：一类为共显性标记，即差异条带表现为位置上(既扩增产物大小)的变异，分离群体的带型依情况分别读作A、B和H，分别表示来源于中双11号、73290和杂合带型；另一类为显性标记，即差异条带表现为有无变异，读作A、C(在该位点上73290有带，分离群体中无带读A，有带读C)和B、D(在该位点上中双11号有带，分离群体中无带读B，有带读D)。

(3)通过对染色后获得的分子标记带型进行判读，获得分子标记基因型数据。

(4)利用Joinmap3.0软件对F2群体的分子标记基因型数据进行连锁分析以构建分子标记遗传连锁图谱，获得19个连锁群(含792个分子标记)，恰好对应甘蓝型油菜的19条染色体(图2)。

(5)基于该遗传图谱、F2群体的基因型数据以及两群体的千粒重表型数据，利用QTLCart2.5软件进行QTL检测，在A9染色体SSR标记BrSF7-181附近(表1)检测到了一个重复性很好的主效QTL位点(图3)，其LOD值和贡献率都较大(表2)。

表1 A9连锁群千粒重主效QTL连锁标记BrSF50-18的引物序列

表2 A9连锁群千粒重主效QTL的基本信息

实施例6：

分子标记BrSF7-181在油菜高产育种中的应用，其步骤是：

(1)田间种植中选F2单株的F3代种子。

(2)在定苗前对F3单株挂牌取样，并提取叶片总DNA(见实施例2)，利用分子标记BrSF7-181a对其进行千粒重主效QTL基因型的分析(见实施例5)，根据带型判读结果，拔掉带型和73290相同的单株。

(3)在成熟期收获保留下来的F3单株，并对其进行千粒重的考种。结果表明，分子标记辅助选择挑选出来的单株其每角果粒数超过F2:3家系均值(4.9克)的占87.5％(表3)。可见在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率，进而可以快速筛选出多粒株系用于油菜高产育种。

表3 利用SSR标记BrSF7-181a辅助选择得到的F3单株的千粒重考种数据

注：1-34为F2单株编号；P1和P2分别代表亲本中双11和73290；A、B、H分别代表来源于P1、P2和杂合的分子标记带型；/代表在苗期通过分子标记辅助筛选拔掉的单株，因此没有千粒重的性状数据。

Claims (3)

1.一种油菜千粒重性状主效基因位点，其特征在于：所述的主效基因位点为qTSW.A9。

2.一种油菜千粒重性状主效基因位点紧密连锁的分子标记，其特征在于：所述的SSR分子标记BrSF7-181a紧密连锁，其引物为BrSF7－181F：TCGCGAGGAATAGAACGAAT，BrSF7－181R：GGAACCTTCTCGATGGTTTTT。

3.权利要求2所述的一种油菜千粒重性状主效基因位点紧密连锁的分子标记在油菜育种中的应用。

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