CN104164502B - 一个与大豆抗锈病基因位点紧密连锁的分子标记及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一个与大豆抗锈病基因位点紧密连锁的分子标记及应用。本发明提供的鉴定或辅助鉴定大豆抗锈病的方法，包括如下步骤：分别以待鉴定大豆和SX6907的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1和序列表中序列2所示的两条单链DNA组成的PCR引物对进行PCR扩增，电泳检测扩增产物，按照标准确定所述待鉴定大豆的抗病性，本发明利用高抗锈病大豆SX6907材料与2个非抗锈病大豆材料杂交，构建遗传群体，定位抗锈病基因，开发紧密连锁的分子标记，并进行分子标记辅助选择，可提高选择效率，加快育种进程。

Description

一个与大豆抗锈病基因位点紧密连锁的分子标记及应用
技术领域
本发明属于大豆分子生物学及遗传育种技术领域。更具体涉及一个与大豆抗锈病基因位点紧密连锁的分子标记及应用，同时还涉及该分子标记在大豆抗锈病育种中的应用。
背景技术
大豆起源于中国，在美国、巴西、阿根廷、中国和印度等国家广为种植。大豆种子中约含40％的蛋白质和20％的油分，是具有重要经济价值的油料作物，也是植物蛋白质的主要来源。近年来我国大豆种植面积和产量有所下降，其中大豆锈病是影响大豆产量的因素之一，主要影响我国中部和南方产区，造成的产量损失可达10％-90％不等。世界大豆平均单产没有提高，主要是南美大豆单产提高速度由快速而停滞，其原因也主要是大豆生产受到大豆锈病的影响，每年对巴西、阿根廷大豆生产造成了至少300万吨以上的损失。目前，这种病害还有向北美蔓延的趋势，己引起各大豆主产区的重视。
大豆锈病是一种气传病害、一种多循环病害，是大豆上最具破坏性的病害之一。大豆锈病是由豆薯层锈菌引起的真菌性病害，具有破坏性强、循环式侵染、专性寄生等特点。它的寄主主要是豆类作物，还有野葛、栽培葛等，在南方主要的越冬寄主是野葛，野葛冬天不落叶，一年四季都能被锈菌侵染，冬季最严重，锈菌可寄生在上面成为第2年的初侵染来源。高温高湿气候条件将加快致病真菌的繁殖速度，导致锈病蔓延，如不进行有效控制，可造成大豆40％的减产损失。尽管锈病可以采取措施控制，但成本很高。根据巴西农牧研究院大豆研究所的数据，除了减产损失外，在2009/2010年期间，每个生产季节用于锈病防治的成本高达20亿美元。
中国农业科学油料作物研究所大豆研究室采用离体叶片接种方法对1000余份大豆种质资源进行抗性筛选，获得1份高抗锈病材料SX6907(单志慧等，一个大豆锈病新抗源的筛选与鉴定，中国油料作物学报，2012，34：188-192)，该材料在接种锈菌后20天不产生侵染病斑，在接种高浓度锈菌时，产生少数红褐色病斑，但无孢子堆破裂现象，无孢子产生。组织学观察表明，SX6907在接种部位造成细胞坏死，侵染点无孢子形成，其抗性表现为抗锈菌扩展。
发明内容
本发明一个目的是提供鉴定或辅助鉴定大豆抗锈病的方法及其在育种中的运用。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定大豆抗锈病的方法，包括如下步骤：分别以待鉴定大豆和SX6907的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1和序列表中序列2所示的两条单链DNA组成的PCR引物对进行PCR扩增，通过电泳检测扩增产物，按照如下方法确定所述待鉴定大豆的抗病性：
如果待鉴定大豆的PCR扩增产物电泳条带有与SX6907带型相同的条带，则待鉴定大豆为抗锈病大豆或候选为抗锈病大豆，如果待鉴定大豆的PCR扩增产物电泳条带没有与SX6907带型相同的条带，则待鉴定大豆为非抗锈病大豆为或为候选非抗锈病大豆；所述待鉴定大豆为天隆一号和SX6907的杂交后代，上述方法中，所述待鉴定大豆具体选自天隆一号×SX6907的杂种后代中的F2单株。在本发明的一个实施例中，所述待鉴定大豆具体选自天隆一号×SX6907的F2单株。
上述方法中，所述电泳为聚丙烯酰胺凝胶电泳，在所述聚丙烯酰胺凝胶电泳中，所述聚丙烯酰胺凝胶的浓度6％。
上述方法中，所述PCR扩增中先进行10个第一个循环后再进行25个第二个循环，所述第一个循环的引物退火条件为55℃30s，所述第二个循环的引物退火条件为53℃30s。
其中，所述第一个循环的温度程序是：先94℃30s，然后55℃30s，最后72℃1min；所述第二个循环的温度程序是：先94℃30s，然后53℃30s，最后72℃1min。
上述方法中，所述抗锈病(R)大豆是指接种后2周仅在接种部位有少量红褐色病斑，病斑周围组织不发生黄化，无黄褐色病斑；若无孢子堆形成为高抗，若有孢子堆形成，并有少量孢子释放为中抗锈病(M)；非抗锈病(S)大豆是指接种后3-5天出现侵染病斑，为典型黄褐色病斑，5-7天后侵染点周围变黄，侵染点逐步变大，叶片上相邻的黄色部分连成片，10天后，侵染点病斑破裂，有大量孢子释放。
上述方法可用于大豆育种、大豆抗锈病的早期预测或筛选抗锈病大豆。
在大豆育种中，可利用上述方法鉴定出抗锈病大豆进行育种。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供鉴定或辅助鉴定大豆抗锈病的引物对。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定大豆抗锈病的引物对，名称为GmSSR18-22，由序列表中序列1和序列表中序列2所示的两条单链DNA组成。
其中，序列表中序列1由20个脱氧核苷酸组成，序列表中序列2由20个脱氧核苷酸组成。
含有上述引物对GmSSR18-22的鉴定或辅助鉴定大豆抗锈病的试剂或试剂盒也属于本发明的保护范围。
上述引物对GmSSR18-22、含有上述引物对GmSSR18-22的试剂或试剂盒的下述a)、b)或c)用途也属于本发明的保护范围：
a)在大豆育种中的应用；
b)在大豆抗锈病的早期预测中的应用；
c)在筛选抗锈病大豆中的应用。
本发明中所定位的大豆抗锈病基因位点是rpp.18-1，该基因位点对大豆抗锈病起着关键作用，可用作图位克隆和分子标记辅助选择。
本发明的引物对GmSSR18-22，是与基因位点rpp.18-1紧密连锁的标记，是基于PCR技术的共显性SSR标记，因而可靠且使用方便。
实验证明，利用引物对GmSSR18-22对大豆育种材料辅助鉴定的结果与抗病鉴定结果完全一致，这表明引物对GmSSR18-22用于大豆抗锈病育种的分子标记辅助选择是切实有效的。
本发明通过对大豆抗锈病基因的定位，并开发与其紧密连锁的分子标记GmSSR18-22，该抗锈病基因位点rpp.18-1可用于图位克隆和分子标记辅助选择。在常规育种方法中，大豆的对锈病的抗性鉴定比较繁琐，对鉴定技术要求比较高，选择效率低下。通过检测抗锈病基因位点来预测大豆对锈病的抗性，可以在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率，从而加快育种进程。本发明中抗锈病基因位点位置明确，基因位点的检测方法方便快速，不受环境影响。通过检测与抗锈病基因位点紧密连锁的分子标记，即可确定大豆对锈病的抗性，进而准确快速筛选高抗锈病的材料。
本发明利用高抗锈病大豆SX6907材料与2个非抗锈病大豆材料杂交，构建遗传群体，定位抗锈病基因，开发紧密连锁的分子标记，并进行分子标记辅助选择，可提高选择效率，加快育种进程。
附图说明
图1为利用GmSSR18-22对1-30的F2代单株、母本和父本的基因组DNA进行PCR得到的PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图
其中，1-30为材料编号，Pl和P2分别代表母本天隆一号和父本SX6907
图2为大豆抗锈病LOD值分布曲线
其中，横坐标代表连锁群，纵坐标代表LOD值
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
大豆天隆一号(陈李淼等，利用农杆菌介导法转化大豆子叶节的影响因素研究，大豆科学，2012，1：17-23)和SX6907(单志慧等，一个大豆锈病新抗源的筛选与鉴定，中国油料作物学报，2012，34：188-192)公众可从商业途径获得，也可从中国农业科学院油料作物研究所获得，以重复本发明实验。
在以下的实施方案中，除非特别说明，否则所有操作均按照《分子克隆实验指南》(第三版)(黄培堂等译，北京:科学出版社，2002)所提供的方法进行。
实施例1、利用引物对GmSSR18-22鉴定天隆一号×SX6907的F2单株对锈病的抗性
一、鉴定或辅助鉴定大豆抗锈病的PCR试剂
本实施例的鉴定或辅助鉴定大豆抗锈病的PCR试剂由PCR引物对GmSSR18-22、10×Taq缓冲液，dNTP混合物，MgC12溶液、Taq DNA聚合酶和ddH2O组成。
其中，PCR引物对GmSSR18-22由正向引物和反向引物这两条单链DNA组成，其序列如下：
正向引物:5’-ACCAAACCCGATGATGATGT-3’(序列表中序列1)，
反向引物:5’-CCAGATTCCAAACCCCTTCT-3’(序列表中序列2)。
二、待鉴定大豆
天隆一号×SX6907的F2分离群体是按照如下方法获得：天隆一号和SX6907杂交，杂交后代自交，即为F2分离群体。
三、田间实验和利用引物对GmSSR18-22鉴定待鉴定大豆对锈病的抗性
天隆一号×SX6907的杂种后代中的F2单株种植于中国农业科学院油料作物研究所试验农场。
在本发明的一个实施例中，待鉴定大豆具体选自天隆一号×SX6907的F2单株。
上述方法中，抗锈病(R)大豆是指接种后2周仅在接种部位有少量红褐色病斑，病斑周围组织不发生黄化，无黄褐色病斑；若无孢子堆形成为高抗，若有孢子堆形成，并有少量孢子释放为中抗锈病(M)；非抗锈病(S)大豆是指接种后3-5天出现侵染病斑，为典型黄褐色病斑，5-7天后侵染点周围变黄，侵染点逐步变大，叶片上相邻的黄色部分连成片，10天后，侵染点病斑破裂，有大量孢子释放。
(二)利用引物对GmSSR18-22鉴定大豆的对锈病的抗性
在步骤(一)编号为1-30的家系的F2单株、母本天隆一号(P1)和父本SX6907(P2)的3叶期分别采集大豆叶片提取其基因组DNA，利用引物对GmSSR18-22进行PCR扩增，对得到的PCR扩增产物进行60g/L变性聚丙烯酰胺凝胶(交联度为5％)电泳，检测电泳条带大小。
具体的实验方法如下：
1、用CTAB法(Keim P.A rapid protocol for isolating soybean DNA.Soybeangenet newslett,1988,15:147-148)提取叶片基因组DNA
(1)取0.5g新鲜叶片放入1.5m1离心管中，用玻璃棒磨为匀浆，加入700μl经65℃预热30min的CTAB溶液和20μlβ-巯基乙醇摇匀，放入65℃的水浴锅中水浴30min。
(2)取出离心管，加入700μl氯仿-异戊醇(24：1/v：v)轻摇几次，静置30min后12000rpm，离心10min。
(3)吸取上清液，加入2倍体积的冰冻无水乙醇，置于-20℃冰箱30min。12000rpm离心10分钟让DNA沉淀，倒掉离心管中乙醇溶液。
(4)用75％(V/V)乙醇清洗2-3次，倒乙醇溶液，打开离心管盖置于通风橱内吹干。
(5)加入200μl双蒸水溶解DNA，用紫外分光光度计测定DNA的浓度，并稀释成25ng/μl，于-20℃冰箱中保存备用。
2、分别以步骤1提取的天隆一号和SX6907的F2单株1-30及亲本的基因组DNA为模板，利用引物对GmSSR18-22进行PCR扩增，反应体系如表1:
表1.
成份 体积 终浓度
DNA模板(25ng/μl) 2μl 2.5ng/μl
正向引物(50ng/μl) 1μl 2.5ng/μl
反向引物(50ng/μl) 1μl 2.5ng/μl
10×Taq缓冲液 1μl
MgC12(25mM) 1μl 1.25mM/μl
dNTPs混合物(10mM) 0.2μl 0.1mM/μl
Taq DNA聚合酶(5U/μl) 0.1μl 0.025U/μl
ddH20 13.7μl
总体积 20μl
PCR反应温度程序:先94℃5min(预变性)；然后进行10个如下循环：先94℃30s(变性)，然后60℃30s(引物退火)，最后72℃1min(引物延伸)；然后进行25个如下循环：先94℃30s(变性)，然后53℃30s(引物退火)，最后72℃1min(引物延伸)；最后72℃10min。
PCR反应完成后，在扩增产物中加入等体积的上样缓冲液进行下述步骤3的60g/L变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
3、60g/L变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
试剂配制:
试剂1：5×TBE
Tris-base   53.9克
EDTA        3.72克硼酸             27.5克
用超纯水定容至1升。
试剂2：60g/L变性聚丙烯酰胺凝胶
用超纯水定容至1升。
试剂3：粘剂
无水乙醇         500毫升
冰醋酸           5毫升
反硅化剂(Me-T)   5毫升
试剂4：不粘剂
无水乙醇         500毫升
硅化剂           14毫升
试剂5：50×上样缓冲液
甲酰胺           200毫升
二甲苯青         2.5克
溴酚蓝           2.5克
试剂6：固定液
冰醋酸           150毫升
纯水             1.35升
试剂7：染色液
硝酸银           1.5克
甲醛             2.0毫升
用纯水定容至1.5升。
试剂8：显影液
碳酸钠                45克
硫代硫酸钠(lOmg/ml)   200微升
甲醛(37％)             2.0毫升
用纯水定容至1.5升。
胶板制备：
短胶板在下，放置胶条，再放上长胶板。然后用夹子对称地夹好两块胶板。取70ml的60g/L变性聚丙烯酰胺凝胶，加入200μl过硫酸铵和40μl TEMED迅速搅拌混匀。缓慢把胶液灌入胶板中，待胶液灌满整个胶板时，将齿状梳子平端插入胶板中适当距离。
电泳：
待胶液凝固后，将齿状梳子取出，用自来水冲洗凝胶顶部。然后将胶板置入电泳槽中，并在上下槽中注入适量的1×TBE电泳缓冲液。打开电源，2000伏特预热20分钟。在PCR产物中加入上样缓冲液10μl，在95℃下加热变性5分钟，然后迅速置于冰上。用吸管吹打凝胶顶部以吹出杂物。将梳子齿端插入凝胶适当位置。吸取样品2.5μl，依次加入加样孔。2000伏特，80瓦，电泳70-80min。电泳完毕后，切开电源，把胶板从电泳槽中取出。
染色:
浆胶板面向上放入固定液盆中固定30分钟左右至胶板无色，在蒸馏水盆中漂洗两次，每次2-3分钟。取出胶板面向上放入染色液盆中染色30分钟。取出胶板，在蒸馏水盆中漂洗10秒左右。取出胶板面向上放入预冷(4℃)的显影液中，轻轻摇动至条带清晰可见。取出胶板面向上放入固定液盆中，以终止显影。在蒸馏水盆中漂洗3分钟，室温下自然凉干，拍照保存。
5、带型判读
将显影后自然干燥好的玻璃板置于灯箱上，肉眼观察各个单株与两亲本条带的位置差异。天隆一号的PCR产物是一个条带，命名为条带A；SX6907的PCR产物是一个条带，命名为条带B；条带A的大小明显小于条带B。各个单株带型与天隆一号相同读作A，带型与SX6907相同读作B，两条带型分别与天隆一号和SX6907相同读作H，缺失和其它带型读作－。结果如图1所示，表明单株1、6、11、20、23、27、30这7个单株与天隆一号带型相同，PCR产物均是大小相同的条带A。单株3、4、5、7、9、12、13、15、16、19、21、22、24、25、26、29这16个单株与天隆一号和SX6907带型相同，PCR产物均是大小相同的条带A和条带B组成，即H型条带。单株2、8、10，14，17，18，28这7个单株与SX6907带型相同，PCR产物均是大小相同的条带B。
根据PCR扩增产物凝胶电泳条带与母本天隆一号、父本SX6907的异同鉴定预测F2单株1-30对锈病的抗性：如果待鉴定大豆PCR扩增产物凝胶电泳条带有与SX6907带型相同的条带，则待鉴定大豆为抗锈病大豆或为候选抗锈病大豆，如果PCR扩增产物凝胶电泳条带没有与SX6907带型相同的条带，则待鉴定大豆为非抗锈病大豆或为候选非抗锈病大豆。
本发明利用引物对GmSSR18-22鉴定大豆抗锈病的方法鉴定的结果是单株1、6、11、20、23、27、30这7个单株以及天隆一号均为非抗锈病大豆或候选非抗锈病大豆，单株3、4、5、7、9、12、13、15、16、19、21、22、24、25、26、29这16个单株为中抗锈病大豆或候选中抗锈病大豆(也属于抗锈病大豆)，单株2、8、10，14，17，18，28这7个单株以及SX6907均为抗锈病大豆或候选抗锈病大豆。
人工接种鉴定的方法见实施例2中的抗锈病鉴定，结果见表2。
表2.天隆一号、SX6907及天隆一号×SX6907的F2单株1-30的抗锈病鉴定及利用引物对GmSSR18-22得到的PCR产物带型
家系编号 带型 抗锈病鉴定 家系编号 带型 抗锈病鉴定
1 A S 16 H M
2 B R 17 B R
3 H M 18 B R
4 H M 19 H M
5 H M 20 A S
6 A S 21 H M
7 H M 22 H M
8 B R 23 A S
9 H M 24 H M
10 B R 25 H M
11 A S 26 H M
12 H M 27 A S
13 H M 28 B R
14 B R 29 H M
15 H M 30 A S
天隆一号 A S SX6907 B R
表2中，带型A表示引物对GmSSR18-22 PCR扩增产物凝胶电泳条带与天隆一号相同，带型B表示引物对GmSSR18-22 PCR扩增产物凝胶电泳条带与SX6907相同，带型H表示引物对GmSSR18-22 PCR扩增产物凝胶电泳条带分别与天隆一号和SX6907相同。抗锈病鉴定S表示该单株为非抗锈病大豆，M表示该单株为中抗锈病大豆，R表示该单株为抗锈病大豆。
以上实验结果说明利用引物对GmSSR18-22鉴定大豆对锈病的抗性与人工接种鉴定的结果一致，说明本发明利用引物对GmSSR18-22鉴定大豆对锈病的抗性的方法准确性高。
实施例2、引物对GmSSR18-22的获得
使用的分离群体为非抗锈病大豆品种中豆40(张诚，介绍6个国审大豆品种，农家顾问，2012，4：35-37)与抗锈病大豆SX6907(单志慧等，一个大豆锈病新抗源的筛选与鉴定，中国油料作物学报，2012，34：188-192)杂交，杂交后代自交，即为F2分离群体，共116个单株。
对F2的116个单株进行SSR分子标记分析，获得基因型数据，利用Joinmap 3.0构建遗传图谱，结合抗锈病接种鉴定数据，利用WinQTL cartographer 2.5进行抗锈病基因定位，在大豆18号染色体上定位到大豆抗锈病基因位点rpp.18-1，属于完全显性遗传。
其中，DNA提取、PCR扩增、电泳同上述实施例1。
抗锈病鉴定：
锈菌悬浮液制备：大豆锈菌(单志慧等，一个大豆锈病新抗源的筛选与鉴定，中国油料作物学报，2012，34：188-192)从新鲜感病叶片上收集，置于1ml0.1％Tween-20溶液中混匀，除去孢子表面张力，而后10000r/min离心2min，去上清液，孢子沉淀用清水悬浮制成105/ml孢子悬浮液，菌悬液于接种前1h内配制，即配即用。
锈菌接种：将配好的锈菌孢子悬浮液接种于叶片背面，每个接种点接种1μl，每个叶片接种2-6个点，接种点分布于主叶脉两侧，接种后的叶片于26℃下保持黑暗24h，之后转入26℃、12h光周期、RH100％及光强80-100μmol/m2·s条件下培养，14天后记录病斑类型大小、颜色、孢子堆的形成及破裂等。
抗锈病(R)大豆是指接种后2周仅在接种部位有少量红褐色病斑，病斑周围组织不发生黄化，无黄褐色病斑，若无孢子堆形成为高抗，若有孢子堆形成，并有少量孢子释放为中抗锈病(M)；非抗锈病(S)大豆是指接种后3-5天出现侵染病斑，为典型黄褐色病斑，5-7天后侵染点周围变黄，侵染点逐步变大，叶片上相邻的黄色部分连成片，10天后，侵染点病斑破裂，有大量孢子释放。
SSR分析：
引物序列参照Song等(2004)公布的大豆SSR引物。同时根据大豆基因组序列，利用SSRHunter软件搜索SSR(搜索条件为2-5个motif且重复数在5个以上)，再根据Primer 5软件设计SSR引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成。其中，抗锈病基因位点rpp.18-1紧密连锁的分子标记为申请人自主开发的SSR标记GmSSR18-22，引物序列为:GmSSR18-22-F：5’-ACCAAACCCGATGATGATGT-3’(序列表中序列1)，GmSSR18-22-R：5’-CCAGATTCCAAACCCCTTCT-3’(序列表中序列2)。
遗传连锁图谱构建和抗锈病基因定位:
运用Joinmap3.0软件进行连锁图谱的构建。以LOD>3.0进行标记间连锁分组。Joinmap参数设置为:Rec＝0.40,LOD＝2.0,Jump＝5,用以决定多态性标记在连锁群中的顺序。采用Kosambi函数将重组率转换成图距单位(cM)。利用Windows QTLCartographer Version 2.5软件对数据进行分析，采用复合区间作图法(CIM)进行QTL定位。以排列测验法确定每个性状LOD值的阈值，重复抽样1000次，显著水平定为0.01。在大豆18号染色体上定位到大豆抗锈病基因rpp.18-1(图2)。

Claims (8)

1.鉴定或辅助鉴定大豆锈病抗性的方法，包括如下步骤：分别以待鉴定大豆、SX6907的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1和序列表中序列2所示的两条单链DNA组成的PCR引物对进行PCR扩增，通过电泳检测扩增产物，按照如下方法确定所述待鉴定大豆对锈病的抗性：
如果待鉴定大豆的PCR扩增产物电泳条带有与SX6907带型相同的条带，则待鉴定大豆为抗锈病大豆或候选为抗锈病大豆，如果待鉴定大豆的PCR扩增产物电泳条带没有与SX6907带型相同的条带，则待鉴定大豆为非抗锈病大豆或候选为非抗锈病大豆；所述待鉴定大豆为天隆一号和SX6907的杂交后代。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述电泳为聚丙烯酰胺凝胶电泳。
3.权利要求1或2所述方法的用途，所述用途为1)、2)或3)：
1)权利要求1或2所述方法在大豆育种中的应用；
2)权利要求1或2所述方法在大豆抗锈病早期预测中的应用；
3)权利要求1或2所述方法在筛选抗锈病大豆中的应用。
4.鉴定或辅助鉴定大豆抗锈病的引物对，由序列表中序列1和序列表中序列2所示的两条单链DNA组成。
5.含有权利要求4所述的引物对的鉴定或辅助鉴定大豆抗锈病的试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂，其特征在于：所述试剂为试剂盒。
7.根据权利要求5或6所述的试剂，其特征在于：所述引物对中的各条引物在所述试剂中的终浓度为2.5ng/μl。
8.权利要求4所述的引物对、权利要求5或6所述的试剂的用途，所述用途为a)、b)或c)：
a)权利要求4所述的引物对、权利要求5或6所述的试剂在大豆育种中的应用；
b)权利要求4所述的引物对、权利要求5或6所述的试剂在大豆抗锈病早期预测中的应用；
c)权利要求4所述的引物对、权利要求5或6所述的试剂在筛选抗锈病大豆中的应用。
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