CN105886651B - 一种与油菜苗期抗旱性关联的功能标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与油菜苗期抗旱性关联的功能标记及其应用，该功能标记的序列如SEQ ID NO:1所示，分子量为465 bp，其在油菜抗旱育种中的应用步骤是：A、提取油菜单株的DNA；B、PCR扩增：引物序列为F：5′‑TGAGGCTGATAGGATACTGG‑3′，R：5′‑CCACGGGCACCTACATTA‑3′；C、扩增产物经1.5%浓度琼脂糖凝胶电泳分离后，分子量为465 bp的功能标记的特异性条带出现时，预测油菜单株的抗旱性较好，分子量为465 bp的功能标记的特异性条带缺失时，预测油菜单株的抗旱性较差。本发明为油菜苗期抗旱性的遗传改良提供了新的遗传标记，有效解决了常规育种方法中存在的抗旱性鉴定工作量大、周期长、易受环境影响等问题，从而显著提高了油菜抗旱育种的选择效率，加快新品种的选育步伐。

Description

一种与油菜苗期抗旱性关联的功能标记及其应用
技术领域
本发明属于油菜育种和分子生物学领域，更具体地涉及一种与油菜苗期抗旱性关联的功能标记，还涉及该功能标记在油菜抗旱育种中的应用。
背景技术
干旱和水资源缺乏是世界农业生产的最大制约因素，因干旱造成的农作物产量损失超过其它自然灾害的总和。油菜是我国最重要的冬季油料作物，主要种植于长江流域，但近年来该地区季节性干旱频繁发生，严重影响油菜产量。研究表明，油菜苗期是干旱最敏感的时期之一，受旱后可造成41％的产量损失(Hashem et al.Drought stress effects onseed yield,yield attributes,growth,cell membrane stability and gas exchangeof synthesized Brassica napus L.Journal of Agronomy and Crop Science,1998,180,129-136)。因此，提高油菜的抗旱减灾能力，对于保障我国油料供给安全具有重要意义。在长期的进化过程中，作物逐渐形成了避旱、御旱和耐旱等多种干旱胁迫响应机制，其中御旱和耐旱统称为抗旱性。御旱性是植物加强根部水分吸收、减少地上部分的水分蒸发来抵御干旱的能力。耐旱性主要是通过生理和生化调节来实现的，如合成小分子糖类、醇类、醛类来提高提高渗透调节能力，防止细胞水分的散失，以及产生胁迫感应信号、启动体内的防御系统和活性氧清除系统来维持细胞结构的稳定性，从而在一定程度上减轻和缓解干旱造成的影响(景蕊莲.作物抗旱研究的现状与思考.干旱地区农业研究,1999,17:79-85)。
实践证明，培育和应用抗旱性作物品种是应对农业干旱的最经济有效的手段。然而，植物抗旱性属多基因控制的数量性状，而且抗旱性鉴定周期长，易受环境因素影响，因而通过常规育种方法改良作物抗旱性的效果往往不理想。随着分子生物学的发展，利用特定的分离群体对抗旱性开展QTL分析，获得抗旱性相关的分子标记并进行标记辅助选择，则可显著提高抗旱育种的效率。比如，李真等人利用一个DH群体，利用SSR和AFLP标记对油菜苗期的抗旱性和耐渍性进行了QTL分析，共检测到28个有关的QTL(Mapping of QTLassociated with waterlogging tolerance and drought resistance during theseedling stage in oilseed rape.Euphytica,2014,197:341-353)。然而，上述传统的QTL分析和标记辅助选择存在一定的局限性，因为QTL分析的工作量很大，难以实现QTL的精细定位，而且在标记辅助选择过程中有可能因为遗传重组或遗传漂移而丢失目标基因(Collard B C,Mackill D J.Marker-assisted selection:an approach for precisionplant breeding in the twenty-first century.Philosophical Transactions of theRoyal Society of London Series B,Biological Sciences,2008,363:557-572)。
利用对性状具有决定作用的、具有明确功能的基因序列开发出来的多态性标记，即功能标记进行分子标记辅助育种，则可以保证选择的准确性和选择效率，因为选择的就是基因本身(Andersen J R,Lübberstedt T.Functional markers in plants.Trends inPlant Science,2003,8:554-560)。根据已知功能基因序列开发功能分子标记是最直接有效的方法，但是可供利用的油菜抗旱候选基因序列十分有限，尚无法满足油菜抗旱育种的技术需求。张静利用SNP标记进行全基因组关联分析，检测到16个显著关联的位点，但无法开发出功能标记供育种应用(华中农业大学博士论文，2015，武汉)。
本研究通过转录组关联分析技术制备到与油菜苗期抗旱性高度关联的功能标记，并验证了该标记在育种中的应用价值。经文献查新，国内未见有关油菜苗期抗旱性的功能标记的制备及其应用的研究报道，也未见相关的专利技术公开或使用。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种油菜苗期抗旱性关联的功能标记，其序列为SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列，该标记为油菜抗旱育种提供新手段，加速油菜抗旱性遗传改良进程，提高育种的选择效率和准确性。
本发明的另一个目的是在于提供了一种油菜抗旱性高度关联的功能标记在油菜抗旱育种中的应用，通过该方法有效解决了常规育种方法中存在的抗旱性鉴定工作量大、周期长、易受环境影响等问题，准确率高达92.5％。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种与油菜苗期抗旱性关联的功能标记的制备方法，其步骤是：
(1)以101份遗传来源不同的油菜品种资源为研究材料(已公开，具体参见文献：陆光远等.Associative transcriptomics study dissects the genetic architecture ofseed glucosin olate content in Brassica napus.DNA Research，2014，21:613-625)，在温室下生长至2片真叶。
(2)用Trizol法抽取油菜幼嫩单株叶片的RNA，进行商业化mRNA-Seq测序，并进行生物信息学分析，开发获得基因表达标记(Gene Expression Marker,GEM)；
(3)自然群体在干旱棚种植，苗期利用二次干旱存活法鉴定每份品种资源的抗旱性表现，根据存活率高低将抗旱性划分为5个等级(见表1)；
表1油菜苗期抗旱性评价标准
(4)运用统计软件R(http://www.R-project.org/)中的混合线性模型将GEM标记数据与干旱存活率进行关联分析，以显著性P<10-5(-Log10P＝5)为标准，筛选获得79个显著关联的GEM标记，其中A_EE476451标记的显著水平最高(P＝1.5E-10)。该标记对表型方差的贡献率达到23.8％。
(5)从公共数据库(http://brassica.nbi.ac.uk/)查询获得候选基因EE476451的核苷酸序列，blastn搜索(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)发现该核苷酸序列与甘蓝型油菜中的一个RNA解旋酶(DEAD-box ATP-dependent RNA helicase 27-like，NCBI序列号：XM_013786005)的同源性为100％。针对EE476451的核苷酸序列设计引物并以油菜品种的DNA为模板进行PCR扩增、序列测定和比对，在序列变异位点重新设计PCR引物将其转化为特异性的功能标记EE476451-465，该标记的序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，其引物正向序列EE476451-89F为5′-TGAGGCTGATAGGATACTGG-3′，引物反向序列EE476451-554R为5′-CCACGGGCACCTACATTA-3′。
一种油菜苗期抗旱性关联的功能分子标记在油菜育种中的应用，其步骤是：
(1)提取油菜单株的DNA；
(2)PCR扩增：引物序列为F：5′-TGAGGCTGATAGGATACTGG-3′，R：5′-CCACGGGCACCTACATTA-3′；PCR反应体系：DNA模板1μL,引物(50ng/μL)各0.5μL，10×PCRBuffer 1μL，dNTPs(10mmol/L)0.2μL，MgCl2(25mmol/L)0.8μL，Taq(5U/μL)0.5μL，ddH2O 5.5μL；PCR反应程序：95℃预变性3min；94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸45s，共40个循环；72℃延伸10min；
(3)扩增产物经1.5％浓度(w/v)琼脂糖凝胶电泳分离后，分子量为465-bp的功能标记的特异性条带出现时(阳性)，预测油菜单株的抗旱性较好，继续用于育种选择；分子量为465-bp的功能标记的特异性条带缺失时(阴性)，预测油菜单株的抗旱性较差，予以淘汰。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
(1)与常规育种方法相比，本发明提供的与油菜苗期抗旱性关联的分子标记可极大提高育种效率，有效克服了抗旱性鉴定工作量大、周期长、易受环境影响等技术难题；
(2)与现有的分子标记相比，本发明提供的分子标记为功能标记，无需经过QTL的初级定位、精细定位、目标基因克隆、标记开发等耗时长、费用高的研发过程，而是直接通过转录组关联分析获得大量的候选基因并进一步开发为功能标记，用时短，效率高，是功能标记开发的一个重大技术创新；
(3)本发明中分子标记的准确率高达92.5％，操作十分方便，仅需要常规的PCR反应和电泳检测即可完成检测，成本低廉，便于在育种工作者中推广应用，前景十分广阔。
附图说明
图1为一种油菜苗期抗旱性关联的功能标记的技术流程图。
图2为一种油菜苗期抗旱性的关联分析结果示意图。
横坐标为染色体物理距离，纵坐标为取对数后的概率值，每个散点代表一个GEM标记，箭头指示显著关联分子标记的位置，横虚线为显著性阀值。
图3为一种功能标记EE476451-465在育种群体中部分单株的检测结果图。
M为分子量标准物100-bp DNA ladder；泳道1、5、6、7、13为阴性；泳道2、3、4、8、9、10、11、12为阳性，特异性条带的分子量为465-bp。
具体实施方式
本发明实施例的举例并不构成对本发明的任何限制。在下面的实验步骤中，除非特别说明，否则所有操作均按照《分子克隆实验指南》(第三版)(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002)所提供的方法进行。
实施例1：
一种油菜苗期抗旱关联的功能标记EE476451-465的制备方法(陆光远等，Associative trans criptomics study dissects the genetic architecture of seedglucosinolate content in Brassica napus，DNA Research，2014，21:613-625)，其步骤是：
本实施例以101份遗传来源不同、抗旱性差异较大的油菜品种为例，构建了一个自然群体，详细说明获得与抗旱性关联的分子标记的方法，具体如下：
(一)群体构建：
以101份遗传来源不同的油菜品种为研究材料(已公开，具体参见文献：陆光远等，A ssociative transcriptomics study dissects the genetic architecture of seedglucosinolate conte nt in Brassica napus，DNA Research，2014，21(6):613-625)，在温室(温度20℃；光照周期16h，光照强度15000lx)下生长至1～2片真叶。上述材料用于DNA和RNA的提取。
(二)油菜苗期抗旱性鉴定：
采用二次反复干旱处理法(李德全,邹琦,程炳高.土壤干旱下不同抗旱性小麦品种的渗透调节和渗透调节物质.植物生理学报,1992,18:37-44)，对自然群体101份材料的苗期抗旱性进行测定，获取群体的表型数据，具体步骤是：
(1)植物材料在干旱棚内种植，干旱棚内的培养池(长30m，宽2m，高0.8m)填充有0.6m厚的沙壤土，中等肥力，底部有排水孔。设置3个重复，每个重复小区种植2行(共60株)，随机区组设计；长江流域的播种期为9月底至10月初，播种后立即用微喷灌系统定时定量供水，使土壤含水量达到20～25％(水分充足)，使油菜正常发芽、生长；
(2)当幼苗长至3叶期时停止浇水，开始干旱处理。每天利用快速土壤水分测定仪(浙江拓普顿仪器TZS-1W型)测定每盆土壤含水量，当土壤含水量降至10％左右(中度干旱)时，进行复水；然后再次干旱处理，当土壤含水量降至10％时再次复水，72h后观察幼苗存活数(以心叶转绿为标准)，记录每个品种的干旱存活率(干旱处理后存活苗数/处理前总苗数×100％)；
(3)求算3个重复小区的干旱存活率平均值，用平均值评价各个品种的苗期抗旱性；
(4)油菜苗期抗旱性的鉴定标准：根据油菜苗期干旱存活率的高低，将油菜的抗旱性从高到低划分为5个等级，具体见表1。
(三)DNA提取：
对于所有植物研究材料，在苗期采集幼嫩叶片，用CTAB法(Doyle J.DNAprotocols for plants-CTAB total DNA isolation.In:Hewitt G M,JohnstonA.Molecular Technique s in Taxonomy.Berlin:Springer-Verlag,1991.P283-293)提取总DNA，具体提取步骤如下：
(1)将新鲜或-20℃冰冻保存的叶片0.5g放入1.5mL离心管中，用玻璃棒磨为匀浆，加入800μL CTAB提取液(50mmol/L Tris-HCl,pH8.0；20mmol/L EDTA,pH8.0；50mmol/LNaCl；1g/L CTAB)并摇匀，65℃水浴30min；
(2)取出离心管，加入400μL的纯氯仿溶液，在振荡仪上(2000rpm)震荡30秒，然后室温(20～25℃)下12000rpm离心6min，取上清液(约400μL)；
(3)在上清液中加入两倍体积的无水乙醇(约800μL)，冰上静置30min后，然后12000rpm离心8min收集DNA沉淀；
(4)DNA沉淀自然风干后，加入双蒸水200μL溶解即可使用。
(四)RNA提取：
对于所有植物研究材料，在苗期采集幼嫩叶片，用TRIZol法(裴东和谷瑞升,几种提取木本植物中RNA方法的比较和改进,植物生理学通讯,2002,38:362-365.)提取总RNA，具体提取步骤如下：
(1)匀浆处理:将200mg叶片组织在液氮中磨碎，加入2mL TRIzol(购自Invitrogene公司)，用匀浆仪进行匀浆处理；
(2)将匀浆样品在室温(15～30℃)放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离；
(3)加入0.4mL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min；
(4)在2～8℃条件下10000g离心15min，RNA主要在上层无色水相中；
(5)把水相转移到新管中，加入1.0mL异丙醇沉淀水相中的RNA，室温放置10min；
(6)在2～8℃条件下10000g离心10min，移去上清；
(7)用2mL 75℅乙醇洗涤RNA沉淀，在2～8℃条件下不超过7500g离心5min，弃上清；
(8)室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5～10min即可，加入25～200μL双蒸水，用枪头吸打几次使RNA溶解，-70℃保存。
(五)RNA-Seq测序与标记开发：
参照文献(陆光远等.Associative transcriptomics study dissects thegenetic architecture of seed glucosinolate content in Brassica napus.DNAResearch，2014，21:613-625)报道的方法，将检测合格的RNA样品送到深圳华大基因股份有限公司(http://www.genomics.cn)利用HiSeq4000平台进行商业化测序，获得大量的120-bp的测序数据，经过筛选后保留质量较好的序列数据进行拼接以及与油菜参考序列(由94558个油菜Unigene组成)进行比对。然后，利用该套RNA-Seq测序数据开发出189116个GEM标记(用RPKM值表示)，RPKM的计算方法是将匹配到Unigene的测序读数(read)除以匹配到基因组的所有测序读数(以百万为单位)与Unigene的长度(以kb为单位)。
(六)关联分析：
运用R语言(http://www.R-project.org/)中的混合线性模型对GEM标记数据和抗旱性表现数据进行关联分析(具体方法请参见文献：陆光远等，Associativetranscriptomics study dissects the genetic architecture of seed glucosinolatecontent in Brassica napus，DNA Res earch，2014，21(6):613-625)。以显著性P<10-5为标准，筛选获得79个显著关联的GEM标记，其中标记A_EE476451的显著性最高(P＝1.5E-10)。该标记对表型方差的贡献率达到23.8％。
(七)功能标记转化与检测：
从公共数据库(http://brassica.nbi.ac.uk/)查询获得候选基因EE476451的核苷酸序列，blastn搜索(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)发现该核苷酸序列与甘蓝型油菜中的一个RNA解旋酶(DEAD-box ATP-dependent RNA helicase 27-like，NCBI序列号：XM_013786005)的同源性为100％，针对EE476451的核苷酸序列设计特异性PCR引物(正向引物EE476451-11F：5′-TACCCCTGGCAGACTTCTCG-3′；反向引物EE476451-554R：5′-CCACGGGCACCTACATTA-3′)，并以2个高度抗旱油菜品种(Apex和Baltia)和2个干旱敏感油菜品种(Temple和Rafal)的DNA为模板进行PCR扩增、序列测定和比对，发现干旱敏感品种中缺失了4bp的一段序列。针对这段缺失序列重新设计特异性的正向PCR引物EE476451-89F(目的是使抗旱品种可正常进行PCR反应，而不抗旱品种无法进行PCR反应)，成功将其转化为功能标记EE476451-465，该标记的序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，其引物正向序列EE476451-89F为5′-TGAGGCTGATAGGATACTGG-3′，引物反向序列EE476451-554R为5′-CCACGGGCACCTACATTA-3′。
实施例2：
一种油菜苗期抗旱性高度关联的功能分子标记在抗旱育种中的应用，其步骤是：
从实施例1中的101份品种资源中挑选出抗旱的品种材料20份(干旱存活率平均为93％)，以及干旱敏感的材料20份(干旱存活率平均为30％)，利用特异性PCR标记EE476451-465进行鉴定，步骤如下：
(1)提取油菜单株的DNA；
(2)采用功能标记EE476451-465进行PCR扩增，引物序列是：
正向引物EE476451-89F：5′-TGAGGCTGATAGGATACTGG-3′
反向引物EE476451-554R：5′-CCACGGGCACCTACATTA-3′；
(3)PCR反应体系：总体积为10μL，具体成分如下：
DNA模板(25ng/μl) 1.0μL
正向引物(50ng/μl) 0.5μL
反向引物(50ng/μl) 0.5μL
10×PCR Buffer 1.0μL
dNTPs(10mmol/L) 0.2μL
MgCl<sub>2</sub>(25mmol/L) 0.8μL
Taq(5U/μl) 0.5μL
ddH<sub>2</sub>O 5.5μL
Taq酶购自Fermentas公司，产品提供的PCR Buffer溶液包含的成分是：750mmol/LTris-HCl,pH8.8；200mmol/L(NH4)2SO4,0.1％(v/v)Tween 20。PCR反应在美国Bio-Rad公司生产的PTC-200型PCR仪上进行。
(4)PCR扩增程序：95.0℃预变性3min；94.0℃变性30s，58.0℃复性30s，72.0℃延伸45s，共40个循环；72.0℃延伸10min，4℃保存；
(5)PCR扩增产物经1.5％浓度琼脂糖凝胶电泳分离后，检测是否获得分子量为465bp的功能标记(序列如SEQ ID NO:1所示)的特异性条带；
在40个测试品种中，出现分子量为465-bp的特异性带型(即阳性)的品种共19个，其平均干旱存活率为91％，总体上抗旱性较高；其中的18个被表型鉴定为抗旱品种，1个鉴定为不抗旱品种，准确率为94.7％(见表2)；
缺失分子量为465-bp的功能标记带型(即阴性)的品种共21个，其平均干旱存活率为35.0％，总体上抗旱性较差(见表2)；其中被表型鉴定为不抗旱的品种19个，抗旱的品种2个，准确率为90.5％。
上述鉴定结果表明，在育种中通过功能标记鉴定筛选，保留出现465-bp的功能标记的特异带型的材料，淘汰缺失465-bp带型的材料，即可显著提高种质资源群体的抗旱性，平均准确率在92.5％以上，从而大大提高选择效率，减少后期筛选鉴定的工作量，加速育种进程。
表2功能标记EE476451-465在40个油菜品种中的鉴定效果
注：+表示分子标记检测阳性，-表示检测结果阴性。
实施例3：
一种油菜苗期抗旱性高度关联的功能标记在油菜抗旱育种中的应用，其步骤是：
(1)利用抗旱油菜品种‘Apex’(来源于实施例1和2)和抗旱性较差的油菜品种‘中双5号’(中国农业科学院油料作物研究所选育，种子市场可购买)构建的F2群体分离群体为研究材料，在苗期取样，利用功能标记EE476451-465进一步扩大检测范围，检测方法同实施例2。
(2)预测凡是出现465-bp特异带型(阳性)的单株其抗旱性将显著提高，而缺失465-bp特异片段(阴性)的单株其抗旱性显著降低。
(3)在F2分离群体中利用功能标记检测，随机选取10株检测结果为阳性(编号为15Y-01～15Y-10)和10株检测结果为阴性(编号为15X-01～15X-10)的单株，花期套袋自交留种。
(4)利用实施例1相同的方法，对自交留种的20个单株进行抗旱性鉴定，结果表明，阳性单株的干旱存活率在74～100％之间，抗旱性较好(见表3)，通过选择这种类型的单株，可进一步快速培育抗旱油菜新品种；阴性单株的干旱存活率在0～42％之间，抗旱性较差(见表3)，可提前淘汰，从而大大减轻后期的育种工作量。
以上结果充分说明，该功能标记确实可以用于油菜苗期抗旱性的预测、鉴定和筛选。
表3功能标记EE476451-465在育种群体中的应用效果
注：+表示分子标记检测阳性，-表示检测结果阴性。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院油料作物研究所
<120> 一种与油菜苗期抗旱性关联的功能标记及其应用
<130> 一种与油菜苗期抗旱性关联的功能标记及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 465
<212> DNA
<213> 油菜
<400> 1
tgaggctgat aggatactgg aacagaactt tgaagaagac atgaagaaga tcattaagct 60
tctaccaaag acaaggcaga cgtcactgtt ttccgccaca cagacatcca aggttgagga 120
tcttgctagg gtgtcactta catcacctgt ttatattgat gtggacgaag gacgaaaaga 180
ggttacaaat gaaggcttgg agcaaggtta ctgtgttgtg ccaagtgcaa agcggttact 240
ctttttactc accttcttga agacgtttca cgggaagaag aagatcatgg tatttttctc 300
cacttgcaaa tcgacaaagt ttcacacgga actctttcgg tacatcaaaa tagattgcct 360
cgccatccat ggagggatgg agcagagcaa aaggacttca acgtttttcc agttcgtaaa 420
gttggaaact ggtgtcttat tgtgtactaa tgtaggtgcc cgtgg 465

Claims (2)

1.与油菜苗期抗旱性关联的功能标记的扩增引物在油菜抗旱育种中的应用，其特征在于，所述的功能标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述扩增引物的正向引物序列为5′-TGAGGCTGATAGGATACTGG-3′，反向引物序列为5-CCACGGGCACCTACATTA-3′。
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甘蓝型油菜耐旱性鉴定和耐旱相关性状QTL分析;杨玉恒;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20111015(第10期);摘要，第3-4章，结论，表11-13 *

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