CN103937790A

CN103937790A - 一种与油菜种子硫苷含量紧密相关的分子标记及应用

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Publication number: CN103937790A
Application number: CN201410199466.9A
Authority: CN
Inventors: 陆光远; 张学昆; 邹锡玲; 赵永国; 徐劲松; 程勇; 瞿桢; 付桂萍
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2014-05-12
Filing date: 2014-05-12
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2034-05-12
Also published as: CN103937790B

Abstract

本发明公开了一种与油菜种子硫苷含量紧密相关的分子标记及应用，该分子标记EX043693-231的正向引物序列为5′-TTGTAATAGAGTTCATATATATCG-3′,反向引物序列为5′-TTCATACATCAAATACCAAAC-3′；以油菜单株的总DNA为模板，利用该引物序列进行PCR扩增，扩增产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳分离后，获得分子量为242-bp或231-bp的特异性条带；出现231-bp特异性条带的油菜单株其种子硫苷含量较低，可进行下一步的育种选择。本发明开发的分子标记可用于油菜种子硫苷含量的鉴定和预测，操作简便，方法易行，解决了常规育种方法中存在的必须到后期才能选择鉴定等问题，加快了油菜品质改良的步伐。

Description

一种与油菜种子硫苷含量紧密相关的分子标记及应用

技术领域

本发明属于油菜育种和分子生物学领域，更具体地涉及一种与油菜种子硫苷含量紧密相关的分子标记，同时还涉及一种与油菜种子硫苷含量紧密相关的分子标记在降低油菜种子硫苷含量育种中的应用。

背景技术

油菜是我国最重要的冬季油料作物，年种植面积约1.1亿亩，面积和总产均居世界首位。油菜籽加工食用植物油后可年产600万吨的菜籽饼粕，饼粕中含有40％左右的蛋白，其氨基酸组成平衡、合理，营养价值和消化率等高于大豆蛋白，是优质蛋白来源，可广泛用于饲料工业，对于提高油菜的商品价值、促进畜牧业发展具有重要意义。

然而，普通油菜籽中含有较多的硫代葡萄糖苷(Glucosinolate，简称硫苷)，它本身无毒，但在芥子酶的作用下，会产生恶唑烷硫酮、异硫氰酸盐、腈等有毒物质，引起畜禽肝肾和甲状腺肿大，造成代谢紊乱，因而是菜饼中主要有害成分。降低硫苷含量一直是国内外油菜育种中品质改良的重要目标。在不同油菜品种的种子饼粕中，所含硫苷的种类和数量是不同的(傅廷栋，油菜品种改良的现状与展望，华中农业大学学报，2004，34：1-8)。硫苷主要受母体基因型控制，而不决定于胚基因型。世界上油菜低硫苷育种开始于20世纪60年代。Krzymanski教授从波兰甘蓝型春油菜品种中发现的Bronowski是世界上唯一的低硫苷种源。这种低硫苷特性和一些不利的生长习性紧密地连锁在一起，采用一般的回交法难以打破这种负向连锁，因而利用传统的育种方法培育低硫苷品种的过程十分漫长，效率低下，直到1974年才育成世界上第一个双低(芥酸<1％，硫苷<30μmol/g)的甘蓝型春性品种Tower，到了1980年之后才基本普及双低油菜。我国1980年前后才开始双低育种，目前双低品种约占总油菜面积的60％，比先进国家落后15年左右，加拿大及欧洲主要油菜生产国，油菜品种硫苷含量已降至20～30μmol/g左右，而我国大多数审定品种的硫苷含量都在30～40μmol/g之间，因此进一步降低硫苷含量是我当前油菜品种改良的重要任务(涂金星和傅廷栋，油菜品质育种现状及展望，植物遗传资源学报，2001，2：53-58)。进一步降低硫苷含量，传统的方法十分困难，必须借助于分子标记辅助选择等现代生物技术手段。

在模式植物拟南芥中，随着全基因组测序和功能解析的完成，硫苷的生物合成途径已经研究清楚，大致可分为三个阶段：氨基酸侧链的延长、硫苷核心结构的形成和葡萄糖配基侧链的二次修饰。目前在硫苷合成代谢途径中的主要合成和调节基因已经被分离和克隆( 等,Biosynthesis of glucosinolates-gene discovery and beyond,Trends Plant Sci.,2010,15:283-290.)。在油菜(Brassica napus L.)中，种子硫苷含量主要受到多个数量性状位点(QTL)的控制，虽然目前的研究已经鉴定了一批主效QTL位点及其所在的染色体位置(Feng等,Characterization of metabolite quantitative trait loci and metabolic networks that control glucosinolate concentration in the seeds and leaves of Brassica napus,New Phytol.,2011,193:96-108.)，但尚缺乏在育种中具有实际应用价值的分子标记。经文献查新，国内未见有关油菜种子硫苷含量的功能分子标记及其应用的研究报道，也未见相关的专利技术公开或使用。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种油菜硫苷含量紧密相关的分子标记EX043693-231，其引物正向序列为5′-TTGTAATAGAGTTCATATATATCG-3′，引物反向序列为：5′-TTCATACATCAAATACCAAAC-3′。该分子标记的发现，解决了常规育种方法中存在的种子硫苷含量只能后期鉴定选择、周期长、易受环境影响、选择效率低下等问题，提高了油菜品质的遗传改良步伐。

本发明的另一个目的是在于提供一种油菜硫苷含量紧密相关的分子标记EX043693-231在降低油菜种子硫苷含量育种中的应用。通过硫苷含量相关分子标记的早期鉴定和辅助选择，可显著降低油菜种子的硫苷含量，极大减轻了田间材料的种植规模和后期鉴定工作量，有效提高了选择的效率和准确性。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种油菜硫苷含量紧密相关的分子标记EX043693-231，通过以下方法获得：

(1)以101份遗传来源不同、硫苷含量变异较大的油菜品种资源为研究材料，在温室下生长至1～2片真叶。

(2)用Trizol法抽取油菜幼嫩单株叶片的RNA，送到华大基因公司(http://www.genomics.cn/index)进行商业化mRNA-Seq测序，并进行生物信息学分析，开发获得单核苷酸多态性(SNP)标记和基因表达(GEM)标记；

(3)自然群体大田种植，成熟期收获种子利用近红外光谱法(NIRS)测定每份品种资源的种子硫苷含量，根据硫苷含量将其分为低(≤30.0μmol/g)、中(30.1～90.0μmol/g)、高(≥90.1μmol/g)三类；

(4)运用统计软件中的混合线性模型将SNP和GEM标记数据分别与硫苷含量进行关联分析，以显著性P<10^-5为标准，筛选获得1个显著关联的GEM标记C_EX043693。该标记对表型方差的贡献率达到16.8％。

(5)从公共数据库(http://brassica.nbi.ac.uk/)查询获得候选基因EX043693的核苷酸序列，设计引物并以品种的DNA为模板进行PCR扩增、序列测定和比对，在序列变异位点重新设计PCR引物将其转化为功能标记EX043693-231，其引物正向序列为：5′-TTGTAATAGAGTTCATATATATCG-3′，引物反向序列为：5′-TTCATACATCAAATACCAAAC-3′。

一种油菜硫苷含量紧密相关的分子标记在油菜品质育种中的应用，其步骤是：

(1)以油菜单株的总DNA为模板；

(2)采用功能标记EX043693-231进行PCR扩增：

(3)扩增产物经2.5％琼脂糖凝胶电泳分离后，获得分子量为242-bp或231-bp的特异性条带；

(4)242-bp特异性条带出现时，预测油菜的种子硫苷含量较高；231-bp特异性条带出现时，预测油菜的种子硫苷含量显著下降，可用于油菜种子硫苷含量的早期辅助选择。

与现有技术相比，本发明具备以下优点：

本发明的积极效果是有效解决了常规育种方法中存在的硫苷含量必须到后期种子成熟后才能鉴定、群体鉴定工作量大、周期长、易受环境影响等缺点，从而显著提高了油菜低硫苷育种的选择效率，加快品质改良的步伐。在油菜育种群体中，采用分子标记EX043693-231进行鉴定和选择，可将群体的种子硫苷含量降低39％，后期测试鉴定的工作量减少33％以上。

附图说明

图1为油菜种子硫苷含量在C9染色体上的关联分析结果示意图。

横坐标为染色体物理距离，纵坐标为取对数后的概率值，黑点代表SNP标记，红点代表GEM标记，箭头指示显著关联分子标记的位置。

图2为功能标记EX043693-231在不同硫苷含量品种中的检测情况示意图。

M为分子量标准物100-bp DNA ladder；中双11、阳光2009、湘油15和沪油17为低硫苷品种；中油821、甘油5号、宁油7号和华油8号为高硫苷品种，特异性条带的分子量分别为231-bp和242-bp。

具体实施方式

本发明实施例的举例并不构成对本发明的任何限制。在下面的实验步骤中，除非特别说明，否则所有操作均按照《分子克隆实验指南》(第三版)(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002)所提供的方法进行。

实施例1：

本实施例以101份遗传来源不同、种子硫苷含量变异交大的油菜品种为例，构建了一个自然群体，详细说明获得与种子硫苷含量相关分子标记的方法，具体如下：

(一)群体构建：

以101份遗传来源不同、种子硫苷含量差异较大(0.8～219.2μmol/g)的油菜品种为研究材料(市场购买或国家油料作物种质中期库)，在温室(温度20℃；光照周期16h，光照强度15000lx)下生长至1～2片真叶。

(二)种子硫苷含量的测定：

采用近红外光谱法，对自然群体101份材料的种子硫苷含量进行测定，获取群体的表型数据，具体步骤是：

(1)植物材料在田间种植，设置3个重复，每个重复3行(共30株)，随机区组设计；长江流域的播种期为10月初，常规方法进行大田管理，直至种子成熟(次年五月初)；

(2)收获所有小区的种子，利用近红外光谱法(Foss，NIRsystem5000)测定其种子的硫苷总含量，测试室温为20～25℃，空气湿度60％以下(具体参见文献：张锦芳等，四川生态区甘蓝型油菜自交种和自然种品质测试的比较研究，中国农学通报，2008，24：143-146)；

(3)求算3个重复小区的平均值来代表各个品种的种子硫苷含量。

(4)种子硫苷含量的鉴定标准：根据种子硫苷含量的高低，将其划分为高、中、低三个等级，具体见表1。

表1油菜种子硫苷含量的范围与等级划分

硫苷含量(μmol/g)	等级划分
		≥90.1	高
30.1～90.0	中
		≤30.0	低

(三)DNA提取：

对于所有植物研究材料，在苗期采集幼嫩叶片，用CTAB法(Doyle J.DNA protocolsfor plants—CTAB total DNA isolation.In:Hewitt G M,Johnston A.Molecular Techniques in Taxonomy.Berlin:Springer-Verlag,1991.P283-293)提取总DNA，具体提取步骤如下：

(1)将新鲜或-20℃冰冻保存的叶片0.5g放入1.5ml离心管中，用玻璃棒磨为匀浆，加入800μl CTAB提取液(50mmol/L Tris-HCl,pH8.0；20mmol/L EDTA,pH8.0；50mmol/LNaCl,1g/L CTAB)并摇匀，65℃水浴30min；

(2)取出离心管，加入400μl的纯氯仿溶液，在振荡仪上(2000rpm)震荡30秒，然后室温(20～25℃，以下相同)下12000rpm离心6min，取上清液(约400μl)；

(3)在上清液中加入两倍体积的无水乙醇(约800μl)，冰上静置30min后，然后12000rpm离心8min收集DNA沉淀；

(4)DNA沉淀自然风干后，加入双蒸水200μl溶解即可使用。

(四)RNA提取：

对于所有植物研究材料，在苗期采集幼嫩叶片，用TRIZol法(裴东和谷瑞升,几种提取木本植物中RNA方法的比较和改进,植物生理学通讯,2002,38:362-365.)提取总DNA，具体提取步骤如下：

(1)匀浆处理:将200mg叶片组织在液氮中磨碎，加入2mL TRIzol(购自Invitrogene公司)，用匀浆仪进行匀浆处理。

(2)将匀浆样品在室温(15～30℃)放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。

(3)加入0.4mL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min。

(4)在2～8℃条件下10000g离心15min，RNA主要在上层无色水相中。

(5)把水相转移到新管中，加入1.0mL异丙醇沉淀水相中的RNA，室温放置10min。

(6)在2～8℃条件下10000g离心10min，移去上清。

(7)用2ml75℅乙醇洗涤RNA沉淀。2～8℃不超过7500g离心5min，弃上清。

(8)室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5～10min即可。加入25～200μl双蒸水，用枪头吸打几次使RNA溶解，-70℃保存。

(五)mRNA-Seq测序与标记开发：

参照文献(Harper等,Associative transcriptomics of traits in the polyploid crop speciesBrassica napus,Nature Biotechnology,2012,30:798-802)报道的方法，将检测合格的mRNA样品送到华大基因公司进行商业化测序，获得大量的80-bp的测序数据，经过筛选后保留质量较好的序列数据进行拼接以及与油菜参考序列(由94558个油菜Unigene组成)进行比对，存在单碱基差异的地方则记录为SNP标记。同样一套mRNA-Seq测序数据也可以开发出GEM标记(用RPKM值表示)，RPKM的计算方法是将匹配到Unigene的测序读数(read)除以匹配到基因组的所有测序读数(以百万为单位)与Unigene的长度(以kb为单位)。

(六)关联分析：

运用软件TASSEL3.0(http://www.maizegenetics.net/)对SNP标记数据和硫苷含量进行关联分析(具体过程请参见文献：Bradbury等,TASSEL:Software for association mappingof complex traits in diverse samples,Bioinformatics,2007,23:2633-2635)；运用R语言(http://www.R-project.org/)中的混合线性模型对GEM标记数据和硫苷含量进行关联分析(具体方法请参见文献：Harper等,Associative transcriptomics of traits in the polyploid crop species Brassica napus,Nature Biotechnology,2012,30:798-802)。以回归显著性P<10^-5为标准，筛选获得1个显著关联的GEM标记C_EX043693。该标记对表型方差的贡献率达到16.8％。其余标记的贡献率均较小(<4％)，或对应的基因功能未知(或与硫苷代谢无关)。

(七)功能标记转化与检测：

从公共数据库(http://brassica.nbi.ac.uk/)查询获得候选基因EX043693的核苷酸序列，设计特异性PCR引物(正向引物：5′-TGGAGTGTACGAGAAAAAC-3′；反向引物：5′-TTCATACATCAAATACCAAAC-3′)，并以4个高硫苷(中油821、甘油5号、宁油7号和华油8号)和4个低硫苷(阳光2009、中双11、湘油15和沪油17)油菜品种的DNA为模板进行PCR扩增、序列测定和比对，发现低硫苷品种中缺失了11bp的一段序列。在这段缺失序列的两端重新设计特异性PCR引物，成功将其转化为功能标记EX043693-231，其引物正向序列为：5′-TTGTAATAGAGTTCATATATATCG-3′引物反向序列为：5′-TTCATACATCAAATACCAAAC-3′。

实施例2：

一种油菜硫苷含量紧密相关的功能分子标记在油菜品质育种中的应用，其步骤是：

以用于关联分析的实施例1中的101份品种资源为研究材料，该群体的种子硫苷含量平均值为65.3μmol/g。利用特异性PCR标记进行鉴定，步骤如下：

(1)以油菜总DNA为模板；

(2)采用功能标记EX043693-231进行PCR扩增，引物序列是：

正向引物：5′-TTGTAATAGAGTTCATATATATCG-3′

反向引物：5′-TTCATACATCAAATACCAAAC-3′；

(3)PCR反应体系：总体积为10μl，具体成分如下：

DNA模板(25ng/μl)	1.0μl
		正向引物(50ng/μl)	0.5μl
反向引物(50ng/μl)	0.5μl
		10×PCR Buffer	1.0μl
dNTPs(10mmol/L)	0.2μl
		MgCl₂(25mmol/L)	0.8μl
Taq(5U/μl)	0.5μl
		ddH₂O	5.5μl

Taq酶购自Fermentas公司，产品提供的PCR Buffer溶液包含的成分是：750mmol/L Tris-HCl,pH8.8；200mmol/L(NH₄)₂SO₄,0.1％(v/v)Tween20。PCR反应在美国Bio-Rad公司生产的PTC-200型PCR仪上进行。

(4)PCR扩增程序：95.0℃预变性3min；94.0℃变性30s，54.0℃复性30s，72.0℃延伸45s，共40个循环；72.0℃延伸10min，4℃保存；

(5)扩增产物经2.5％琼脂糖凝胶电泳分离后，获得分子量为242bp和231bp的特异性条带；

101份检测材料中，出现特异性242-bp(其序列为SEQ ID NO.3所示)带型的材料，共33份，其种子硫苷含量平均值为97.5μmol/g(硫苷含量范围：36.8～219.2μmol/g)(见表2)，显著高于群体平均值65.3μmol/g(P<0.01)；

出现231-bp(其序列为SEQ ID NO.4所示)带型的单株，共68份，其硫苷含量平均值为39.8μmol/g(见表2)(硫苷含量范围：0.8～98.4μmol/g)，显著低于群体平均值65.3μmol/g(P<0.01)。

上述鉴定结果表明，在育种中通过功能分子标记鉴定筛选，保留出现231-bp特异带型的材料，淘汰出现242-bp带型的材料，即可显著降低群体的种子硫苷含量(比未加选择前降低39％)，提高选择效率，减少后期筛选鉴定的工作量(减少33％)，加速育种进程。

表2功能标记EX043693-231在自然群体中的鉴定效果

特异性片段	材料份数	种子硫苷含量(μmol/g)	等级划分
				242-bp	33	97.5	高
231-bp	68	39.8	中
				合计	101	65.3	中

实施例3：

(1)利用高硫苷品种‘中油821’(中国农业科学院油料作物研究所选育，种子市场可购买，种子硫苷含量为121.3μmol/g)和低硫苷品种‘阳光2009’(中国农业科学院油料作物研究所选育，种子市场可购买，种子硫苷含量为22.5μmol/g)构建的F₂群体分离群体为研究材料，利用标记EX043693-231进一步扩大检测范围，检测方法同实施例2。

(2)预测凡是出现242-bp特异带型的单株其种子硫苷含量将显著提高，而出现231-bp特异片段的单株其种子硫苷含量显著降低。

(3)总共分析检测了F₂群体的362个单株，结果表明，F₂群体中仅出现231-bp带型的单株为115株，其种子硫苷含量的平均值为43.1μmol/g(硫苷含量范围：2.7～96.4μmol/g)，显著低于整个群体的平均值78.5μmol/g(P<0.001)，通过选择这种类型的单株，可进一步快速培育低硫苷油菜品种。

以上结果充分说明，该标记确实可以用于种子硫苷含量的预测、鉴定和筛选。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 一种与油菜种子硫苷含量紧密相关的分子标记及应用

<130> 一种与油菜种子硫苷含量紧密相关的分子标记及应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgtaataga gttcatatat atcg 24

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttcatacatc aaataccaaa c 21

<210> 3

<211> 242

<212> DNA

<213> 油菜

<400> 3

ttgtaataga gttcatatat atcgaaaatg tcaagaaagc catgttgtgt cggagaaggg 60

ctgaagaaag gggcatggac caccgaagaa gacaagaaac tcatctctta catccatgaa 120

catggagaag ggggatggcg cgacattcct caaaaagctg gttaatatct attaaaatat 180

attataattt ttttggtaaa agtttaaaac atatatgttt tgtttggtat ttgatgtatg 240

aa 242

<210> 4

<211> 231

<212> DNA

<213> 油菜

<400> 4

ttgtaataga gttcatatat atcgaaaatg tcaagaaagc catgttgtgt cggagaaggg 60

ctgaagaaag gggcatggac caccgaagaa gacaagaaac tcatctctta catccatgaa 120

catggagaag ggggatggcg cgacattcct caaaaagctg gttaatatct attaaaatat 180

attggtaaaa gtttaaaaca tatatgtttt gtttggtatt tgatgtatga a 231

Claims

1.一种与油菜种子硫苷含量紧密相关的分子标记引物，其特征在于：其正向引物序列为5′-TTGTAATAGAGTTCATATATATCG-3′, 反向引物序列为5′-TTCATACATCAAATACCAAAC-3′。

2.权利要求1所述的引物在降低油菜种子硫苷含量育种中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其应用过程如下：

1）以油菜单株总DNA为模板；

2）利用下述引物进行PCR扩增：

引物正向序列为：5′-TTGTAATAGAGTTCATATATATCG-3′

引物反向序列为：5′-TTCATACATCAAATACCAAAC-3′；

3）扩增产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳分离后，获得分子量为242-bp或231-bp的特异性条带；保留具有231-bp特异性条带的油菜植株，供进一步育种选择，培育为低硫苷品种。