CN104805080A - 一种油菜角果数主效qtl的分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种油菜角果数主效QTL的分子标记及应用，该标记可用于角果数性状改良中的分子标记辅助选择以及该QTL位点的精细定位和图位克隆。该分子标记的引物为CNU400F:5’-CGAGTTTTTGTGTGTACGTATAGTAAT-3’和CNU400R：5’-CCAAAGTGCGTAAAGGAAGG-3’。利用该标记对油菜中双11号和73290F₃代进行选择，筛选出的F₃单株角果数高于中双11的比例高达92.3%。因此，利用该标记进行辅助选择可大大提高高产育种的选择效率。

Description

一种油菜角果数主效QTL的分子标记及应用

技术领域

本发明属于油菜分子育种和生物技术领域，具体涉及一种与甘蓝型油菜角果数主效QTL位点紧密连锁的分子标记及其应用。

背景技术

油菜是我国最重要的油料作物之一，种植面积和总产量都占全世界的三分之一左右(傅廷栋，2010)。菜籽油占我国国产油料作物产油量的55％以上，是国产食用植物油的第一大来源，在国家食用油供给安全战略中地位十分重要(王汉中2006)。近年来，我国国产植物油年产量仅维持在900-1000万吨左右，自给率不足40％且有进一步下降的趋势，这对我国食用植物油供给安全造成了重大威胁(王汉中，2004)。在城镇化规模持续扩大耕地面积进一步缩小的形势下，持续提高单位面积产油量(＝单产×含油量)是主要出路。近年来，我国油菜品种含油量提高较快而单产增加十分缓慢，这严重影响了农民种植油菜的经济效益和积极性。因此，提高油菜单产已经成为目前我国油菜生产最为迫切的任务之一，是事关我国油菜产业持续与发展的根本问题(殷艳，2011)。

在同一种植密度条件下，油菜单产取决于单株产量，而单株产量直接决定于全株角果数、每角粒数和粒重三个产量构成因子。其中，角果数和单株产量的相关性最高(俞琦英等，2010)，对其贡献最大。虽然油菜单株产量的三个构成因子(单株角果数、每角粒数和粒重)之间表现不同程度的负相关，但其相关系数往往不大(Shi et al.2009)，这表明可以通过提高单个产量构成因子(如角果数)来增加产量(Zhang et al.2007)。研究表明，我国2001-2010年国家审定冬油菜品种产量构成因子的平均值(如单株角果数仅有395个)跟油菜种质资源的最高水平(700个左右)相比还有相当差距(张芳等，2012)，这表明油菜产量的提高还有很大潜力。

随着分子生物学和分子遗传学的发展,育种家们对性状的选择正在逐渐实现由表型选择向基因型选择的过渡(Xu et al.2010)。分子标记辅助育种是将分子遗传学与传统的表型选择有效结合的一种新的育种手段,其基本原理是在油菜育种过程中直接利用与目标性状基因紧密连锁或共分离的分子标记对选择个体进行目标区域以及全基因组筛选,以达到提高目标性状选择效率、缩短育种年限的目的。分子标记辅助选择育种技术的关键是鉴定与重要农艺性状紧密连锁的DNA分子标记。近年来，美国等发达国家都投入巨资开展这方面的研究工作。伴随着水稻、玉米、小麦等重要作物农艺性状分子标记的开发，利用筛选到的分子标记进行辅助选择育种已渐趋成熟，目标性状也从简单的单基因质量性状扩展到复杂的多基因数量性状。与发达国家相比，我国油菜分子育种研究起步较晚还有较大差距，主要体现在：不能有效地发掘和利用种质资源中的有利基因，缺乏有自主知识产权及育种价值的基因和标记等(王汉中等，2010)。

大多数重要的农艺性状(如产量、品质、抗性等)均表现数量性状的遗传特点，表型连续分布且易受环境条件的影响，因此基于表型选择的常规育种方法对复杂数量性状的选择效果不好，致使育种效率低下，育种周期延长。由于分子标记技术和数量遗传学的发展和结合，人们已可将复杂的数量性状分解为单个的数量性状基因位点(quantitative trait loci,QTL)，然后像研究质量性状一样对控制数量性状的多个基因进行研究(Paterson et al.1988)。QTL定位就是在遗传分离群体的基础上，借助分子标记和遗传图谱，利用QTL作图软件对分离群体的数量性状表型数据进行分析，从而确定数量性状基因在染色体上的位置和效应。

目前对油菜角果数的QTL定位研究也有一些报道(沈金雄等，2003；张书芬等，2006；易斌等，2006；高必军等，2007；Radoev et al.2008；Shi et al.2009；王峰等，2010；吴建忠等，2010；孙美玉等，2013)，但通常检测出的QTL效应值较小且重复性不好，较难在油菜育种中应用。本研究利用在角果数性状上有极显著差异的油菜品种(系)构建的分离群体进行通过多年QTL定位，旨在分离对油菜角果数具有稳定和较大效应的主效QTL位点，并开发出与其紧密连锁的分子标记用于油菜角果数性状的辅助选择。

发明内容

本发明目的是在于提供了一种与甘蓝型油菜角果数主效QTL位点紧密连锁的分子标记CNU400，该分子标记通过引物CNU400F:5’-CGAGTTTTTGTGTGTACGTATAGTAAT-3’和CNU400R：5’-CCAAAGTGCGTAAAGGAAGG-3’扩增得到。

本发明的另一个目的在于提供了一种与甘蓝型油菜角果数主效QTL位点紧密连锁的分子标记的应用。可用于分子标记辅助选择、以及该主效QTL的精细定位和图位克隆。本发明为油菜育种提供了新手段，可加速油菜角果数性状的改良进程，提高育种的准确性和选择效率。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种油菜角果数性状主效QTL位点的筛选方法，它包括如下步骤：

(1)利用油菜中双11号和73290杂交，杂种F₁代自交产生F₂和F_2:3代分离群体。

(2)采用CTAB法(Doyle et al.1987)提取亲本中双11和73290及F₂分离群体的叶片总DNA，过程中所用到的试剂包括提取液(1.4M NaCl，100mM Tris,pH 8.0，20mM EDTA,pH 8.0，2％CTAB)、氯仿、异戊醇、无水乙醇；

(3)合成油菜公开(http://www.ukcrop.net/Brassica DB)和自主开发的SSR、和STS引物(Wang et al.2012；Huang et al.2013；Shi et al.2014,)，并对亲本DNA进行PCR扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色和显影后对条带的大小进行判别，筛选多态性引物。过程中所用到的主要软件包括SSRPrimer，BWA和samtools；主要试剂包括Taq酶、dNTP、丙烯酰胺、尿素、冰醋酸、硝酸银等，

(4)利用多态性引物对F₂分离群体进行分子标记分析,获得基因型数据。过程中用到的主要试剂同上；

(5)把F₂分离群体的基因型数据输入Joinmap4.0软件，进行遗传连锁图谱的构建；

(6)F₂群体的基因型数据(仅限于定位到遗传图谱上的标记)以及F₂和F_2:3群体的角果数性状数据输入WinQTLcart2.5软件进行QTL定位，总共检测到了十来个控制角果数的QTL。其中，位于A6连锁群上的QTL在两个群体和三个年份中能重复检测到，而且效应值和贡献率最大。

利用上述技术措施，申请人最终获得了油菜角果数性状的主效QTL位点qPN.A6，该主效QTL位点位于油菜A6染色体，与SSR标记CNU400紧密连锁，其引物序列为CNU400F:5’-CGAGTTTTTGTGTGTACGTATAGTAAT-3’和CNU400R：5’-CCAAAGTGCGTAAAGGAAGG-3’。在中双11号和73290中分别可扩增出229和260bp大小的条带。利用WinQTLCart2.5软件分析测得其对油菜角果数的平均贡献率为18.5％,加性效应为-6.5，显性效应为-3.1。

本研究中所用的亲本材料为中双11号和73290，均由中国农科院油料所生物技术育种课题组技术人员在王汉中研究员带领下育成。中双11号是由中双9号与高油、长角和大粒品系2F10和26102经复合杂交、小孢子培养和加倍选育而来73290由93275(中油杂4号恢复系)作母本和中双2号选株杂交的杂种F1代进行小孢子培养与套袋自交选育而成的多角果数品系。

一种油菜角果数性状主效QTL位点紧密连锁的分子标记在油菜高产育种中的应用，其步骤是：

(1)田间种植中选F₂代单株自交所产生的F₃种子，在定苗前取样，用CTAB法抽提叶片总DNA,过程中所用到的试剂(提取液、氯仿、异戊醇、无水乙醇)如上所述；

(2)利用qPN.A6位点连锁的分子标记CNU400对两亲本(中双11号和73290)的F3代进行辅助选择，仅保留带型和73290相同的单株，保留植株角果数超过中双11的比例高达92.3％。通过鉴定上述角果数主效QTL位点来预测油菜角果数，可提高油菜高产育种的选择效率，从而加快育种进程。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

本发明首次定位到油菜多角果品系73290号中控制角果数的主效QTL位点，可解释18.5％的表型方差。在常规育种方法中，角果数性状表型鉴定要等到成熟期考种，费时费力且选择效率低下(角果数表型受环境影响很大)。通过检测角果数性状主效QTL位点，可以在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率。本发明中角果数主效QTL点位置明确，检测方法方便快速，不受环境影响。通过检测与角果数性状紧密连锁的分子标记，即可预测角果数的多少，进而准确快速筛选多角果单株。

附图说明

图1为一种油菜品种中双11和多角果品系73290构建的F₂和F_2:3群体在武汉种植时2009-2011年主序角果数的频率分布图。

结果表明角果数表型呈正态分布，且变异范围很宽，证明角果数属于数量性状。

图2为一种油菜中双11×73290_F₂群体A6连锁群分子标记遗传连锁图谱。

右半部分指示该连锁群上的标记名称，左半部分指示每个标记对应的遗传图据。

图3为一种位于A6连锁群上的角果数主效QTL位点LOD曲线示意图。

图中横坐标代表连锁群，纵坐标代表LOD值。

图4为利用分子标记CNU400对F₃单株进行基因型分析和筛选的带型示意图。

图中1-46为F₃单株编号，最后两个P1和P2分别代表亲本中双11和73290。A、B、H和-分别代表中双11、73290、杂合以及缺失基因型。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为常规技术。本发明实施例中使用的是油菜中双11号和油菜品种73290杂交构建的群体。

实施例1：

油菜角果数分离群体的构建及性状测定：

本发明实施例中使用油菜品种中双11(主序角果数60个左右)和多角果品系73290(主序角果数100个左右)杂交构建F₂和F_2:3分离群体。两亲本和两群体的角果数表型在成熟期收获后经考种鉴定。角果数考种数据表明：两群体角果数均呈正态分布，证明角果数性状的数量遗传特征(图1)。

实施例2：

叶片总DNA的提取：

利用CTAB法提取叶片总DNA，具体步骤如下：

(1)取0.1克新鲜叶片放入研磨，加700微升提取液研磨，随即转入1.5毫升离心管中置于65℃恒温水浴60分钟，其间混合2-3次；

(2)加等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1，V/V/V)，轻轻颠倒使其充分混匀，在12000rpm离心10分钟，轻轻吸取上清液转入另一1.5毫升离心管；加等体积的氯仿：异戊醇(24：1，V/V)重新抽提一次；

(3)加入1毫升-20℃预冷无水乙醇，置于-20℃冷冻不超过30分钟让DNA析出；12000rpm离心10分钟让DNA沉淀，倒掉离心管中乙醇溶液；用75％(V/V)乙醇清洗2－3次，倒掉浸泡液，打开离心管盖置于通风橱内吹干；

(4)加入TE(10mM Tris,pH 8.0；1mM EDTA,pH 8.0)溶解DNA；用紫外分光光度计测定DNA的浓度，于-20℃冰箱中保存备用；

实施例3：

引物的开发和合成：

申请人利用的SSR引物包括两类：合成油菜公开(http://www.ukcrop.net/Brassica DB)和自主开发的SSR、和STS引物(Wang et al.2012；Huang et al.2013；Shi et al.2014,)并对亲本DNA进行PCR扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色和显影后对条带的大小进行判别，筛选多态性引物。过程中所用到的主要软件包括SSRPrimer，BWA和samtools；主要试剂包括Taq酶、dNTP、丙烯酰胺、尿素、冰醋酸、硝酸银等。

实施例4：

引物多态性的筛选，其流程如下：

(1)从亲本中各随机选择10株DNA等量混合，作为筛选引物的模板。

(2)利用溶解后的引物对亲本DNA进行PCR扩增，

反应体系：

PCR反应程序：

(3)凝胶电泳

试剂配制：

A.5×TBE

B.6％变性聚丙烯酰胺凝胶

C.粘剂

无水乙醇        500毫升

冰醋酸          5毫升

反硅化剂(Me-T)  5毫升

D.不粘剂

无水乙醇     500毫升

硅化剂(Dichlordiemthylsilan)  14毫升

E.50×上样缓冲液

甲酰胺      100毫升

二甲苯箐    1.25克

溴酚蓝      1.25克

F.固定液

冰醋酸150毫升，用纯水稀释到1.5升

G.染色液

硝酸银  1.5克

甲醛    2.0毫升

用纯水稀释到  1.5升。

H.显影液

凝胶制备：

玻璃板用10％(质量比)氢氧化钠溶液浸泡24小时，洗净，凉干。粘板和不粘板分别用滤纸均匀涂抹粘剂和不粘剂。把封条齐平的放在粘板边缘，然后将不粘板放在粘板上面，并在靠近玻璃板底部三分之一处夹上两个卡夹起到固定的作用。在烧杯中倒入50毫升变性聚丙烯酰胺，再分别加入350微升过硫酸胺(10％)和25微升TEMED，快速搅拌均匀；将配制好的凝胶溶液到入注射器中，沿点样口缓缓注入，凝胶注入后，在凝胶顶面插上有齿的梳子(背部插入)，在离灌胶口三分之一的玻璃板两侧对称处分别夹上卡夹固定，以保证凝胶聚合后玻璃板、封条以及梳子间紧密接触。

电泳：

移去卡夹和梳子，将玻璃板擦净后固定在电泳槽上，上下槽各加500毫升0.5×TBE缓冲液，接通电源1500伏60瓦预热30分钟。在PCR产物中加入等体积的1×上样缓冲液，95℃变性5分钟，冰浴冷却，上样2.5微升，2000伏60瓦电泳。当二甲苯青达到可视面最底端时即可停止电泳。

染色和显影：

取出粘板面向上放入固定液盆中固定30分钟左右至胶板无色，在蒸馏水盆中漂洗两次，每次2-3分钟。取出粘板面向上放入染色液盆中染色30分钟。取出粘板，在蒸馏水盆中漂洗10秒钟。取出粘板面向上放入预冷(4℃)的显影液盆中，轻轻摇动至条带清晰可见。取出粘板面向上放入固定液盆中，以终止显影。在蒸馏水盆中漂洗3分钟，室温(20-25℃以下相同)下自然凉干，拍照保存。

带型判读：

将显影后自然干燥好的玻璃板置于阅片台上，肉眼观察两亲本条带的位置差异。

实施例5：

F₂群体基因型分析、遗传连锁图谱构建和QTL定位，其步骤如下：

(1)采用CTAB法提取F₂群体184个单株的DNA(见实施例2)；

(2)挑选出多态性引物对F₂群体184个单株的DNA进行PCR扩增，然后对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读(见实施例4)。有差异的分子标记可分为两类：一类为共显性标记，即差异条带表现为位置上(既扩增产物大小)的变异，分离群体的带型依情况分别读作A、B和H，分别表示来源于中双11号、73290和杂合带型；另一类为显性标记，即差异条带表现为有无变异，读作A、C(在该位点上73290有带，分离群体中无带读A，有带读C)和B、D(在该位点上中双11号有带，分离群体中无带读B，有带读D)。

(3)通过对染色后获得的分子标记带型进行判读，获得分子标记基因型数据。

(4)利用Joinmap4.0软件对F₂群体的分子标记基因型数据进行连锁分析以构建分子标记遗传连锁图谱，获得19个连锁群(含792个分子标记)，恰好对应甘蓝型油菜的19条染色体。

(5)基于该遗传图谱、F₂群体的基因型数据以及两群体的角果数表型数据，利用QTLCart2.5软件进行QTL检测，在A6连锁群(图2)SSR标记CNU400附近(表1)检测到了一个重复性很好的主效QTL位点(图3)，其LOD值和贡献率都较大，而且增效等位基因来源于亲本73290(表2)。

表1、A6连锁群角果数主效QTL连锁标记CNU400的引物序列

表2、A6连锁群主序角果数主效QTL的基本信息

群体

年份

置信区间

LOD值

贡献率

加性效应

显性效应

F2

2009

85.4-93.4

4.6

13.1％

－5.3

－4.0

F2:3

2010

89.5-95.1

9.8

23.9％

－7.4

－2.7

F2:3

2011

85.1-93.2

6.7

18.5％

－6.7

－2.5

均值

86.7-93.9

7.0

18.5％

－6.5

－3.1

实施例6：

分子标记CNU400在油菜角果数性状辅助选择中的应用，其步骤是：

(1)田间种植中选中双11×73290F₂单株套袋自交获得的F₃代种子。

(2)在定苗前对F₃单株挂牌取样，并提取叶片总DNA(见实施例2)，利用分子标记CNU400对其进行qPN.A6基因型的判断(见实施例5)，仅保留带型和73290相同的单株，其余带型和中双11相同以及杂合的单株全部拔掉(因为CNU400是共显性标记，所以保留带型为B拔掉带型为A和H的单株)。

(3)在成熟期收获F₃单株，并对其进行角果数的考种。结果表明，分子标记CNU400基因型和73290相同的单株其主序角果数超过中双11的比例高达92.3％(表3)。可见在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率，进而可以快速筛选出多角果株系用于提高油菜产量。

表3 利用CNU400辅助选择得到的F₃单株的角果数考种数据

A、B、H分别代表来源于中双11号、73290和杂合带型。其中A型的条带大小是229bp，B型的条带大小是260bp，H型的条带大小是229和260bp。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  中国农业科学院油料作物研究所

 

<120>  一种油菜角果数主效QTL的分子标记及应用

 

<130>  一种油菜角果数主效QTL的分子标记及应用

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

cgagtttttg tgtgtacgta tagtaat                                         27

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

ccaaagtgcg taaaggaagg                                                 20

 

 

Claims (5)

1.一种与甘蓝型油菜角果数性状主效QTL位点紧密连锁的分子标记的引物， CNU400F: 5’- CGAGTTTTTGTGTGTACGTATAGTAAT-3’和CNU400R：5’- CCAAAGTGCGTAAAGGAAGG-3’。

2.权利要求1所述引物在甘蓝型油菜角果数性状标记辅助选择中的应用。

3.权利要求1所述引物在甘蓝型油菜角果数性状QTL位点精细定位中的应用。

4.权利要求1所述引物在甘蓝型油菜角果数性状QTL位点图位克隆中的应用。

5.权利要求1所述的引物在加速油菜角果数性状改良进程中的应用。