CN104805179B

CN104805179B - 一种与甘蓝型油菜粒重关联的分子标记及制备方法和应用

Info

Publication number: CN104805179B
Application number: CN201410538031.2A
Authority: CN
Inventors: 王汉中; 师家勤; 李娜; 刘贵华; 王新发; 杨庆
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2014-10-13
Filing date: 2014-10-13
Publication date: 2017-07-07
Anticipated expiration: 2034-10-13
Also published as: CN104805179A

Abstract

本发明公开了一种与甘蓝型油菜粒重关联的分子标记及制备方法和应用，分子标记的制备步骤包括：1) 利用在油菜遗传图谱上均匀分布的91个单位点SSR标记对576份来自世界各地的油菜品种进行基因型和群体结构分析并结合千粒重性状数据进行关联分析。2)利用白菜和油菜全基因组序列信息在标记BrSF7‑181附近开发了14个高质量的SSR标记再次进行关联分析，其中BrSF6‑2025的显著性水平最高；3)利用该分子标记对种质资源群体中粒重极端的品系进行了验证。本发明为油菜粒重的分子育种提供了一种新的遗传标记，也为甘蓝型油菜粒重基因位点的图位克隆提供了有用信息。

Description

一种与甘蓝型油菜粒重关联的分子标记及制备方法和应用

技术领域

本发明属于油菜分子育种和生物技术领域，更具体涉及一种与甘蓝型油菜粒重关联的分子标记，还涉及一种与甘蓝型油菜粒重关联的分子标记的制备方法，还涉及一种与甘蓝型油菜粒重关联的分子标记在油菜高产育种中的应用。

背景技术

油菜是最重要的油菜和能源作物之一，其脂肪酸碳链长度和结构接近化石柴油，是一种适宜于生产生物柴油的植物油。在当前和今后相当长的时间内，全世界都将要面临食用植物油和化石能源短缺的严峻局面，因此大幅度增加菜籽油供应总量，是保障全球食物和能源安全的重大需求。在城市化规模持续扩大耕地面积进一步缩小的形式下，持续提高单位面积产油量(＝单产×含油量)是唯一出路。近年来，高含油量品种选育已取得了重大突破，某些代表性品种(如中双11号等)的含油量已接近甚至超过50％，这已越来越接近油菜种质资源的最高含油量，这预示着高含油量育种即将遭遇瓶颈。与此相反，油菜单产提高的潜力还很大，这具体表现在各国参加油菜品种产量构成因子的平均值跟油菜种质资源的最高水平相比还有相当差距。例如，我国2000-2009年冬油菜四大区参试油菜品种平均千粒重在4克以下(俞琦英et al.2010)，而油菜种质资源中的最高千粒重超过了8克，并且参试油菜品种千粒重与单株产量的相关性很高，达0.5303。虽然油菜单株产量的三个构成因子之间表现不同程度的负相关，但其相关系数往往不大(SHI et al.2009)，这表明可以通过提高单个产量构成因子(如粒重)来增加产量。

油菜粒重是典型的数量性状，其遗传力很高(SHI et al.2009；ZHANG and ZHOU2006)。随着分子标记技术的发展，利用连锁分析的方法目前已定位了一些油菜粒重的数量性状位点(BASUNANDA et al.2010；FAN et al.2010；QUIJADA et al.2006；RADOEV etal.2008；S HI et al.2009；UDALL et al.2006；YANG et al.2012；ZHANG et al.2011)，然而传统的连锁分析基于双亲本杂交构建的群体，遗传差异和遗传重组都很有限，因而QTL定位区间往往较大(10-20cM)难以找到紧密连锁的分子标记。

近年来，随着各物种基因组信息的不断丰富，生物统计学和生物信息学的发展完善，关联分析逐渐成为植物数量性状基因定位和优良等位基因发掘的重要手段。关联分析能找到与目标性状紧密连锁的分子标记，并在具有广泛变异的自然群体中发掘对育种有利的等位基因，开发出优良等位基因的功能标记(YAN et al.2009)。本研究通过关联分析制备到与油菜粒重性状高度连锁的分子标记，同时也加快了相关基因位点图位克隆的进程。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种与甘蓝型油菜粒重关联的分子标记，与甘蓝型油菜粒重高度关联的分子标记及用于甘蓝型油菜粒重性状的选育。本发明为油菜粒重育种提供新手段，加速油菜粒重性状改良进程，提高育种的准确性和选择效率。

本发明的另一个目的在于提供了一种与甘蓝型油菜粒重关联的分子标记的制备方法。

本发明还有一个目的在于提供了一种与甘蓝型油菜粒重关联的分子标记在油菜高产育种中的应用，以及该引物在甘蓝型油菜粒重基因图位克隆中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种与甘蓝型油菜粒重关联的分子标记，其筛选过程如下：

(1)搜集576份来自世界各个国家的甘蓝型油菜品种(LI et al.2014)作为油菜种质资源群体，并考察了两年的千粒重性状数据。

(2)本实验室利用油菜测序品种中双11号和73290为亲本获得F2分离群体，构建了高密度的油菜遗传连锁图谱。在每条染色体上均匀的挑选单位点的SSR标记共91个，平均每条染色体上4.8个SSR标记。

(3)采用CTAB法提取种质资源群体的叶片总DNA，过程中所用到的试剂包括提取液(1.4M NaCl，100mM Tris,pH 8.0，20mM EDTA,pH 8.0，2％CTAB)、氯仿、异戊醇、无水乙醇。

(4)利用(2)中91个SSR标记对种质资源群体进行PCR扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色和显影后对条带的大小进行判别，筛选多态性引物。

(5)把(4)获得关联分析群体的基因型数据导入Structure2.3(http://pritch.bsd.uchicag o.edu/structure.html)软件进行群体结构分析。

(6)结合种质资源群体的千粒重表型数据、基因型数据和群体结构进行利用Tassel2.1(w ww.maizegenetics.net/tassel)软件进行关联分析。在p＝7.5E-4水平检测到1个与千粒重显著关联的标记位点BrSF7-181(此标记位于粒重QTL的峰值附近)，解释5.5％的表型变异。

(7)据白菜(http://brassicadb.org/brad/)基因组序列在BrSF7-181附近开发SSR引物在种质资源群体中进行基因型分析。

(8)再次利用Tassel2.1软件进行关联分析。在BrSF7-181附近又检测到4个与千粒重量极显著关联的标记位点(BrSF6-1572,BrSF6-2025,BnSF400-67,BrSF6-2389)，其中BrSF6-2025的显著水平最高(p＝1.5E-10)，解释9.4％的表型变异。

利用上述技术措施，申请人最终获得了与油菜粒重性状关联标记BrSF6-2025。其引物序列是BrSF6-2025F:TTGTTCCTAACAAACGGAAAA,BrSF6-2025R:AAAAGAAACAGCCCAGCTCA。标记位点qBrSF6-2025的P值为1.5E^-10，解释9.4％的表型变异。

一种与油菜粒重性状高度关联的分子标记在油菜高产育种中的应用，其步骤如下：

(1)挑选出576份品种资源中经多代自交已纯合的大粒和小粒材料，分析分子标记Br SF6-2025的基因型及其千粒重。

(2)利用上述(1)分析结果根据分子标记BrSF6-2025的基因型对种质资源材料进行分类，并利用千粒重表型数据和公布的区试千粒重数据进行验证。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明的优点在于：本发明的与油菜粒重关联标记的制备方法与现有技术报道的不同。结合连锁定位和关联分析，最终制备了一个与粒重主效QTL更为高度紧密连锁的分子标记，提高了油菜高产育种的选择效率和准确率，从而加快育种进程。另外还可用于甘蓝型油菜粒重基因位点的图位克隆。

附图说明

图1本发明的技术流程图。

图2利用分子标记BrSF6-2025的引物在部分种质资源中的基因组DNA中的扩增结果。

具体实施方式

实施例1：

利用CTAB法提取叶片总DNA

具体步骤如下：

A.取0.1克新鲜叶片放入研磨，加700微升提取液研磨，随即转入1.5毫升离心管中置于65℃恒温水浴60分钟，其间混合2-3次；

B.加等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1，V/V/V)，轻轻颠倒使其充分混匀，在12000rpm离心10分钟，轻轻吸取上清液转入另一1.5毫升离心管；加等体积的氯仿：异戊醇(24：1，V/V)重新抽提一次；

C.加入1毫升-20℃预冷无水乙醇，置于-20℃冷冻不超过30分钟让DNA析出，12000rpm离心10分钟让DNA沉淀，倒掉离心管中乙醇溶液；用75％乙醇清洗2－3次，倒掉浸泡液，打开离心管盖置于通风橱内吹干；

D.加入TE(10mM Tris,pH 8.0；1mM EDTA,pH 8.0)溶解DNA；用紫外分光光度计测定DNA的浓度，于-20℃冰箱中保存备用；

实施例2：

油菜种质资源群体的分子标记分析

步骤如下：

(1)采用实施例1提取576份油菜种质资源的DNA；

(2)576份材料中包含了本实验室构建的高密度遗传连锁图谱的作图亲本中双11号(测序)和73290(重测序)，以确定所用SSR标记的遗传位置。选择在所有染色体上均匀分布的单位点遗传模式(CHEN et al.2008)的91个SSR标记在576份材料中进行PCR扩增。

反应体系：

PCR反应程序：

(3)对PCR产物进行聚丙烯凝胶电泳、显影、染色和带型判读。

试剂配制：

A.5×TBE

Tris-base 53.9克

EDTA 3.72克

硼酸 27.5克

用超纯水定容至1升。

B.6％变性聚丙烯酰胺凝胶

用超纯水定容至1升。

C.粘剂

无水乙醇 500毫升

冰醋酸 5毫升

反硅化剂(Me-T) 5毫升

D.不粘剂

无水乙醇 500毫升

硅化剂(Dichlordiemthylsilan) 14毫升

E.50×上样缓冲液

甲酰胺 100毫升

二甲苯箐 1.25克

溴酚蓝 1.25克

1×上样缓冲液(用于加到扩增产物中)：2毫升的50×上样缓冲液加上

2毫升的0.5摩尔/升的EDTA，再用甲酰胺稀释到100毫升。

F.固定液

冰醋酸 150毫升，用纯水稀释到1.5升

G.染色液

硝酸银 1.5克

甲醛 2.0毫升

用纯水稀释到 1.5升。

H.显影液

碳酸钠 45克

硫代硫酸钠(10mg/ml) 200微升

甲醛(37％) 2.0毫升

用纯水稀释到 1.5升。

凝胶胶制备：

玻璃板用10％(质量比)氢氧化钠溶液浸泡24小时，洗净，凉干。粘板和不粘板分别用滤纸均匀涂抹粘剂和不粘剂。把封条齐平的放在粘板边缘，然后将不粘板放在粘板上面，并在靠近玻璃板底部三分之一处夹上两个卡夹起到固定的作用。在烧杯中倒入50毫升变性聚丙烯酰胺，再分别加入350微升过硫酸胺(10％)和25微升TEMED，快速搅拌均匀；将配制好的凝胶溶液到入注射器中，沿点样口缓缓注入，凝胶注入后，在凝胶顶面插上有齿的梳子(背部插入)，在离灌胶口三分之一的玻璃板两侧对称处分别夹上卡夹固定，以保证凝胶聚合后玻璃板、封条以及梳子间紧密接触。

电泳：

移去卡夹和梳子，将玻璃板擦净后固定在电泳槽上，上下槽各加500毫升0.5×TBE缓冲液，接通电源1500伏60瓦预热30分钟。在PCR产物中加入等体积的1×上样缓冲液，95℃变性5分钟，冰浴冷却，上样2.5微升，2000伏60瓦电泳。当二甲苯青达到可视面最底端时即可停止电泳。

染色和显影：

取出粘板面向上放入固定液盆中固定30分钟左右至胶板无色，在蒸馏水盆中漂洗两次，每次2-3分钟。取出粘板面向上放入染色液盆中染色30分钟。取出粘板，在蒸馏水盆中漂洗10秒钟。取出粘板面向上放入预冷(4℃)的显影液盆中，轻轻摇动至条带清晰可见。取出粘板面向上放入固定液盆中，以终止显影。在蒸馏水盆中漂洗3分钟，室温(20－25℃以下相同)下自然凉干，拍照保存。

带型判读：

将显影后自然干燥好的玻璃板置于阅片台上，肉眼观察两亲本条带的位置差异。

有差异的分子标记表现在位置上(即扩增产物大小)，根据产物的大小(带型位置越靠近点样空产物片段越大)分别命名为A、B、C、D，依次类推，如果不同位置均有扩增，则命名不同位置的命名叠加，大片段在前，小片段在后。通过对染色后获得的分子标记带型进行判读，获得分子标记基因型数据。

实施例3：

种质资源群体的结构分析

利用Structure2.3软件对关联分析群体进行群体结构分析，蒙特卡罗模拟(k从2到20；迭代次数为4，重复次数为10000)结果表明该群体最适合分为两个组，分别对应冬性和半冬性/春性油菜品种，而在分为3个群时，半冬性和春性品种又分开了。

实施例4：

千粒重性状的关联分析

对576份油菜种质进行了两年的田间实验(2010-2011；2011-2012)和千粒重考种鉴定。将576份油菜种质的分子标记基因型数据、千粒重性状的标型数据和群体结构数据导入Tas sel2.1软件(BRADBURY et al.2007)进行粒重关联标记的检测。在p＝7.5E-4水平检测到一个显著关联的标记位点BrSF7-181，解释5.5％的表型变异。

实施例5：

粒重关联分子标记附近单位点SSR标记的开发

据白菜(http://brassicadb.org/brad/)基因组序列在A9主效QTL区间开发单拷贝SSR引物。SSR引物具体的开发方法是先利用SSRHunter软件在每个scaffold搜索SSR，然后用P rimer3.0软件设计SSR引物，命名分别以BrSF和BnSF开头。每对SSR引物对应的位点(拷贝)数通过在白菜和甘蓝基因组数据库中做电子PCR(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/e-pcr/)的方法来确定。

实施例6：

粒重高度关联分子标记的开发

利用在粒重关联标记BrSF7-181附近新开发的单位点SSR标记对576份种质资源群体进行基因型分析。结合新的基因型数据再次对千粒重性状进行关联分析检测到4个与千粒重量极显著关联的标记位点(BrSF6-1572,BrSF6-2025,BnSF400-67,BrSF6-2389)，其中BrS F6-2025的关联度最高(p＝1.5E-10)，解释9.4％的表型变异，针对其设计引物，引物序列为BrSF6-2025F:TTGTTCCTAACAAACGGAAAA,BrSF6-2025R:AAAAGAAACAGCCCAGCTCA。

实施例7：

一种与油菜粒重性状高度关联的分子标记在油菜高产育种中的应用，其应用过程如下：

挑选出576份品种资源中经多代自交已纯合的大粒和小粒材料，分析分子标记BrSF6-2025的基因型及其千粒重。

检查了粒重高度关联分子标记BrSF6-2025的两种基因型(A、B)在29份极端小粒(<3.1克)和30份极端大粒(>5.5克)品种资源中的分布情况(表1)。

结果表明，分子标记BrSF6-2025的基因型在29份小粒材料中18份为A(226bp)，2份为AB，9份为B(220bp)，而在30份大粒材料中27份都为B仅有3份为A。

分子标记BrSF6-2025的基因型为A的21份材料中18份为小粒，3份为大粒品种，而其基因型为B的36份材料中，27份为大粒，9份为小粒品种。

另外，T测验结果表明分子标记BrSF6-2025检测出的A和B两类基因型在油菜千粒重性状上存在极其显著的差异(表2)。

以上的结果足以说明我们制备的分子标记BrSF6-2025与油菜品种的粒重是高度关联的，因而可用于粒重的分子标记辅助选择。

表1 粒重关联分子标记qBrSF6-2025在粒重极端材料中的基因型分布

(以上材料已经公开，详见(LI et al.2014))

表2 粒重关联分子标记BrSF6-2025两种基因型对应千粒重的差异显著性T检验

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 一种与甘蓝型油菜粒重关联的分子标记及制备方法和应用

<130> 一种与甘蓝型油菜粒重关联的分子标记及制备方法和应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgttcctaa caaacggaaa a 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaaagaaaca gcccagctca 20

Claims

1.一种与甘蓝型油菜粒重关联的分子标记的引物，引物序列为：BrSF6-2025F:TTGTTCCTAACAAACGGAAAA, BrSF6-2025R: AAAAGAAACAGCCCAGCTCA。

2.权利要求1所述的分子标记的引物在甘蓝型油菜粒重分子标记辅助选择中的应用。

3.权利要求1所述的分子标记的引物在甘蓝型油菜粒重基因图位克隆中的应用。

4.权利要求1所述分子标记的引物在油菜高产育种中的应用。