CN109825639B - 与小麦穗粒数主效qtl紧密连锁的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的分子标记。以小麦基因组DNA为模板，采用PCR引物对进行PCR扩增，扩增产物通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离获得分子标记2A‑654918338；且公开了所述分子标记2A‑654918338在检测小麦品种或品系中是否含有增加小麦穗粒数的QTL位点及小麦分子育种方面的应用。本发明加快了小麦穗粒数的遗传改良进程，大大提高了小麦品种或品系的选择效率和质量，直接实现了目标基因在小麦种质资源以及育种后代中的鉴定，为小麦育种开拓更多新的穗粒数遗传资源。

Description

与小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于小麦分子生物技术与育种技术领域，具体涉及一种与小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的分子标记及其获取方式和应用。

背景技术

小麦是世界上播种面积最大、产量最多、分布最广泛的粮食作物，也是我国重要的粮食作物。决定小麦产量的三个主要因素为：单位面积穗数、穗粒数和千粒重组成，其中穗粒数对产量的影响尤为突出，因此挖掘新的提高穗粒数的相关基因，开发功能性分子标记，对加快小麦优异品种的选育进程，具有重要的理论意义和实践应用价值。

小麦穗粒数是受到多基因调控的数量性状，这些性状的变异是连续的，而且受环境影响较大，遗传基础复杂，单个基因效应小，因此对穗粒数的遗传研究比较困难。应用传统的数量遗传学的方法，无法有效地阐明控制性状表达的基因的数目、基因在染色体上的位置、基因的效应及其作用方式。随着分子生物学和分子标记技术的发展，出现了以分子标记遗传图谱和各种统计模型为基础的数量性状位点(quantitative trait loci，QTL）作图技术。利用QTL可检测出目标性状在染色体上的位置和效应以及与其它基因的关系。因此，不断丰富小麦的穗粒数基因，通过分子标记技术，研究和开发与小麦穗粒数相关的优异等位基因，可促进加快小麦遗传育种的选育进程。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种与小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用。利用与小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的分子标记，来检测小麦品种或品系中是否具有增加小麦穗粒数主效QTL，进而选育出在穗粒数方面表现优异的小麦品种或品系，加快选育进程，提高选育效率和准确性。

一种与小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的分子标记，以小麦基因组DNA为模板，采用PCR引物对进行PCR扩增得到扩增产物，之后对所述扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，获得分子标记2A-654918338；

PCR引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物为单链DNA分子，且序列为5’-attggattataggtccttgcg-3’；所述下游引物为单链DNA分子，且序列为5’-actcgaagtcacgtcggtct-3’。

作为一种优选的方案，所述分子标记2A-654918338的分子量为278 bp。

更为优选的是，所述小麦基因组DNA来源于科农9204品系植株叶片分离提取获得的DNA。

更为优选的是，所述PCR扩增的反应体系包括：1μl的所述上游引物，1μL的所述下游引物，1μL的小麦基因组DNA模板，5μL的2×Taq PCR StarMix，加ddH2O至总量10μL；所述PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；之后95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸展1min，循环34次；最后 72℃再延伸5min，结束扩增，12℃保存。

更为优选的是，所述非变性聚丙烯酰胺凝胶的浓度为6.0%，且所述6.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶是指每100mL聚丙烯酰胺凝胶溶液中含有5.85 g丙烯酰胺和0.15 g甲叉丙烯酰胺。

将前述任意一种与小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的分子标记应用于检测小麦品种或品系中是否含有增加小麦穗粒数的QTL位点。

将前述任意一种与小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的分子标记应用于小麦分子育种。

作为一种优选的方案，前述小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的分子标记应用于检测小麦品种或品系中是否含有增加小麦穗粒数的QTL位点的具体使用方法为：

（1）以待测小麦的基因组DNA为模板，采用PCR引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

其中PCR引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物均为单链DNA分子，且所述上游引物序列为：5’-attggattataggtccttgcg-3’，所述下游引物序列为：5’-actcgaagtcacgtcggtct-3’；PCR扩增的反应体系包括：1μl所述上游引物，1μL所述下游引物，1μL小麦基因组DNA模板，5μL2×Taq PCR StarMix，加ddH₂O至总量10μL；PCR扩增的程序为：95℃预变性5min，之后(95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸展1min ) 循环34次，最后72℃再延伸5min，结束扩增，12℃保存；

（2）将步骤（1）获得的所述PCR扩增产物在6.0 %的非变性聚丙烯酰胺凝胶上稳压147V电泳分离，并根据电泳的带型结果判定待测小麦品种或品系中是否含有增加小麦穗粒数的QTL位点：如果能够获得分子量为278 bp扩增片段，且与所述分子标记2A-654918338的序列相同，则表明所述待测小麦品种或品系中存在含有增加小麦穗粒数的QTL位点；如果未能分子量为278 bp扩增片段，则表明所述待测小麦品种或品系中不含有增加小麦穗粒数的QTL位点。

本发明的一种与小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用具有以下优势：

①本发明公开的小麦穗粒数紧密连锁的分子标记2A-654918338充分体现了小麦品种或品系的穗粒数主效QTL，通过分子标记对小麦品种或品系PCR扩增，可以快捷地对小麦品种或品系是否具有穗粒数的QTL进行判断，以便快速筛选出具有增加小麦穗粒数的QTL的小麦品种或品系用于育种，可大大加快小麦优异品种的选育进程，为小麦产量性状分子育种提供优异基因资源和选择工具。

②将本发明提供的与小麦穗粒数紧密连锁的分子标记方法应用于小麦育种，只需检测这些标记的扩增条带特性，就可以判断穗粒数主效基因位点的增效变异存在与否，进而预测小麦的穗粒数，指导小麦数量性状改良的育种工作。不仅筛选快速精准，不受环境影响，选择目标明确，而且节约生产成本，大大提高了小麦品种或品系的选择效率和质量，直接实现了目标基因在小麦种质资源以及育种后代中的鉴定，为小麦育种开拓了新的穗粒数遗传资源。

附图说明

图1是本发明小麦品种科农9204的穗粒数主效QTL在染色体2A上的作图区间；

图2是本发明制备的部分待测小麦的基因组DNA为模板进行PCR扩增得到的PCR产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳检测结果图；

图3是本发明制备的RIL群体在10组田间种植实验获得的穗粒数QTL定位分析中利用IciMapping 4.1检测到的LOD峰值；

图4是本发明中RIL群体在10组田间种植实验中的穗粒数、穗粒重、粒长和千粒重的单标记分析图。

图中附图标记的含义：图2中M表示50 bp DNA Ladder，K表示小麦品种科农9204的DNA扩增条带，J为小麦品种京411的DNA扩增条带，1- 40表示部分RIL群体扩增结果；图4中AA表示等位基因来自科农9204，BB表示等位基因来自京411，**为P<0.01表示差异极显著，*为P<0.05表示差异显著。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实验材料：

科农9204：审定品种，于2002年通过河北省农作物品种审定委员会审定；2003年通过全国品种审定，品种审定编号为国审麦2003037。

京411：审定品种，于1991年通过北京市品种审定；1992年通过天津市、山西省和全国品种审定；京411可以从国家农作物种质资源库索取，全国统一编号为ZM020984。

PCR引物对：包括上游引物和下游引物，上游引物和下游引物均为单链DNA分子，上游引物序列为：5’-attggattataggtccttgcg-3’，下游引物序列为：5’-actcgaagtcacgtcggtct-3’。

2×Taq PCR StarMix：为预混的含有优化浓度的高纯度Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg²⁺、反应缓冲液和优化剂成分的即用型2倍浓度的PCR溶液，本产品品牌为TIANGEN，由天根生化科技（北京）有限公司提供。

6.0%非变性聚丙烯酰胺凝胶：每100mL聚丙烯酰胺凝胶溶液中含有5.85 g丙烯酰胺和0.15 g甲叉丙烯酰胺。

实验方法：

1. 一种与小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的分子标记的制备：以科农9204品系植株叶片分离提取获得的DNA为DNA模板，采用PCR引物对进行PCR扩增，扩增产物在6.0 %的非变性聚丙烯酰胺凝胶上稳压147 V电泳分离，采用银染法，获得分子标记2A-654918338。

PCR扩增的反应体系为10μL，包括1μL上游引物，1μL下游引物，1μLDNA模板，5μL2×Taq PCR StarMix，加ddH₂O至总量10μL；PCR扩增的程序为：95℃预变性5min，之后(95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸展1min ) 循环34次，最后 72℃再延伸5min，结束扩增，12℃保存。

2. 一种与小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的分子标记应用于检测小麦品种或品系中是否含有增加小麦穗粒数的QTL位点及小麦分子育种，具体使用方法包括以下步骤：

（1）以待测小麦样本的基因组DNA为模板，采用PCR引物对进行PCR扩增，得到待测小麦样本PCR扩增产物：

①待测小麦样本：以2A染色体上等位基因表现为多穗粒数的小麦品种科农9204为母本、以2A染色体上等位基因表现为少穗粒数的小麦品种京411为父本进行杂交得到杂种F1，F1自交获得F2，F2逐代自交形成含有188个家系的F6代RIL群体，即获得188个待测小麦样本。

②待测小麦样本的基因组DNA制备：采用改良的CTAB法分别提取188个待测小麦样本的植株叶片DNA。具体方法为取钢珠和0.2g新鲜叶片放入2.0mL离心管中，快速放在液氮中，摇晃磨成细粉；之后加入CTAB提取液0.8mL，摇匀，65℃水浴30~60min，其间不时反转2-4次摇匀；之后室温冷却，再加入等体积的24:1的氯仿-异戊醇混合液或加入等体积的25:24:1酚-氯仿-异戊醇混合液，剧烈摇晃1min混匀；之后8000rpm离心10min，吸上清600uL至另一个1.5mL离心管中；之后在离心管中加入0.8倍体积-20°预冷的异丙醇，用于沉淀DNA；之后12000rpm离心6min，倒掉上清，加入适量70%乙醇洗涤DNA沉淀1-2次；之后将离心管倾斜放置于通风橱吹干，待无酒精味，加400uL的TE溶解，即获得待测小麦样本的基因组DNA，可放置于-20℃冰箱长期保存。

③PCR扩增：分别以前述步骤获得的188个待测小麦的基因组DNA为DNA模板，采用PCR引物对进行PCR扩增，得到188个待测小麦样本PCR扩增产物；其中PCR扩增的反应体系为10μL，包括1μL上游引物，1μL下游引物，1μL待测小麦的基因组DNA，5μL2×Taq PCRStarMix，加ddH₂O至总量10μL；PCR扩增的程序为：95℃预变性5min，之后(95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸展1min ) 循环34次，最后 72℃再延伸5min，结束扩增，12℃保存。

（2）将步骤（1）获得的所述188个待测小麦样本PCR扩增产物在6.0 %的非变性聚丙烯酰胺凝胶上稳压147V电泳分离，并根据电泳的带型结果判定待测小麦样本中是否含有增加小麦穗粒数的QTL位点：

①非变性聚丙烯酰胺凝胶凝胶制备及电泳过程：将玻璃板水平放置，平板放下边，凹板放上面，中间放上封条，试插梳子是否合适；每个玻璃板需加入50mL的6%非变性聚丙烯酰胺凝胶，加入20uL的TEMED和200uL的10% 过硫酸铵，搅拌均匀，之后用玻璃棒引流灌胶，若有气泡，及时敲打玻璃板将其赶出，完成灌胶后插上梳子，保持10分钟，待凝胶完全凝固后拔下梳子，用去离子水冲洗胶孔，若胶孔中有残胶，用注射器将其吸出；之后将凝固好的玻璃板放置于电泳槽，凹槽朝里，用夹子夹住，上下各加满1×TBE，点样，之后147V恒压电泳2小时；

②硝酸银染色：电泳完毕，取下胶块在固定液中固定3 min，用去离子水快速冲洗2-3次，每次30-40 s；之后置于银染液中染色5-7 min，用水快速冲洗10-20 s；之后放入显影液中显影至扩增带出现，放入去离子水中停影，拍照，记录带型，得到非变性聚丙烯酰胺凝胶图片。

3. 一种与小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的分子标记应用于检测小麦品种或品系中是否含有增加小麦穗粒数的QTL位点及小麦分子育种的可靠性验证，具体包括以下步骤：

（1）小麦分子标记遗传连锁图谱制作：利用JOINMAP 2.0作图软件，以LOD≥2.5为标准，将RIL群体的基因型资料构建具有119566个标记位点的小麦分子标记遗传连锁图谱；119566个标记位点中包含119001个SNP 标记，287个DArTs标记、153个g-SSR标记、50个e-SSR标记、17个STS标记、45个SRAPs标记、5个ISSRs标记、7个功能性PCR标记和1个形态标记。

（2）田间种植及表型鉴定：将RIL群体进行10组田间种植实验及表型鉴定，分别考察不同年份、不同地点及不同氮水平处理条件下的各个株系的株高及穗下节间长；其中小麦种植方法：每个系种植2行，每行播40粒；行长3m，株距7.5 cm，行距25 cm，正常生长及收获；穗粒数测定方法：收获后每个株系随机选择5棵，分出主茎，数出主茎穗粒数。

表1 10组田间种植实验条件

注：其中LN代表，全年不施肥；而HN代表，每年播种前施300 kg•hm^-2磷酸二胺和225kg•hm^-2尿素作为底肥，拔节期施150 kg•hm^-2尿素追肥；

（3）构建连锁图谱确定LOD阈值：利用JOINMAP 2.0软件构建连锁图谱，将10组中直接调查得到的穗粒数表型值，按照IciMapping v4.1的BIP模块格式要求整理，进行加性QTL定位，之后以1cm为步进区间，进行1000次置换检验，确定LOD阈值。

（4）利用2A-654918338作为与qKnps-2A紧密连锁的分子标记，进行188个RIL群体的基因型分型，分析qKnps-2A对产量相关性状的遗传效应：利用SPSS 13.0对188个RIL群体的的穗部性状值进行差异显著性分析，利用Microsoft Excel对188个RIL群体的的穗部性状值进行描述性统计。

实验结果

1. 一种与小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的分子标记的制备实验结果：获得分子标记2A-654918338，其分子量为278 bp。

2. 非变性聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳检测结果，188个家系的F6代RIL群体的待测小麦样本PCR扩增产物的电泳结果为，分子量为278 bp扩增片段，且与所述分子标记2A-654918338的序列相同的样本有95个，表明这95个样本对应的小麦品种或品系中存在含有增加小麦穗粒数的QTL位点；未能分子量为278 bp扩增片段的样本有93个，表明这93个样本对应的小麦品种或品系中不含有增加小麦穗粒数的QTL位点。具体结果见图2。

3. 检测小麦品种或品系中是否含有增加小麦穗粒数的QTL位点及小麦分子育种的可靠性验证实验结果，包括以下几个方面：

（1）小麦分子标记遗传连锁图谱制作：119566个标记位点中包含119001个SNP 标记，287个DArTs标记、153个g-SSR标记、50个e-SSR标记、17个STS标记、45个SRAPs标记、5个ISSRs标记、7个功能性PCR标记和1个形态标记。具体见图1。

（2）穗粒数QTL检测结果：将利用RIL群体的基因型资料构建的小麦分子标记遗传连锁图谱和10组田间种植实验获得的穗粒数表型数据进行QTL定位分析，在2A的AX-108731034–AX-111462383，即物理位置2A:619778623–2A:674495843区段检测到控制穗粒数主效QTL-qKnps-2A，具体结果见表2。从结果中可以看出10组中有7组均稳定表达，穗粒数表型变异为5.87–10.27%，来自科农9204的等位基因增加主茎穗粒数2.54-5.47粒。

表2 基于188个KJ-RIL群体7个环境穗粒数QTL检测结果

RIL群体在10组田间种植实验获得的穗粒数QTL定位分析结果显示，IciMapping4.1及QTLNetwork 2.0均在2A染色体区段检测到穗粒数的多环境稳定表达的主效QTL-qKnps-2A，具体结果图3，且LOD峰值出现在2A染色体的AX-108731034–AX-111462383的80.21-89.49 cm遗传距离范围内，物理位置为2A:619778623–2A:674495843区段，LOD值为2.81–6.80；

（3） qKnps-2A对产量相关性状的遗传效应：结果表明来自科农9204的等位基因相对于京411等位基因可以增加穗粒数和穗粒重，通过降低粒长对千粒重具有负效应，具体结果见图4。来自科农9204的等位基因相对于来自京411等位基因可以增加穗粒数和穗粒重，通过降低粒长对千粒重具有负效应。说明2A-654918338标记引物在小麦品种科农9204的DNA中获得的扩增产物分子量为278bp，即为与小麦穗粒数QTL紧密连锁的分子标记。

应当理解，以上所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。由本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

序列表

<110> 鲁东大学

<120> 与小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用

<130> 2019

<141> 2019-04-24

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(ordo artificialis)

<400> 1

attggattat aggtccttgc g 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(ordo artificialis)

<400> 2

actcgaagtc acgtcggtct 20

<210> 3

<211> 278

<212> DNA

<213> 人工序列(ordo artificialis)

<400> 3

attggattat aggtccttgc ggaatttaaa ctgtcaagaa actattttgt gttggaaatc 60

tcattgggta gaggtattaa acttctatga cattgtctaa acttacatta ttcgcaaaaa 120

aaaaacttac attgtcgtgc ggggaagaag ttaacaacct ttgggtccat tagaaatcaa 180

attattaata attgggtctg gatgagtcac atgtttttcg ccgttgtctg ttcttttgat 240

gtttcactcc atcttagaag accgacgtga cttcgagt 278

Claims (6)

1.一种与小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的分子标记，其特征在于：以小麦基因组DNA为模板，采用PCR引物对进行PCR扩增得到扩增产物，之后对所述扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，获得分子标记2A-654918338；所述分子标记2A-654918338的分子量为278 bp，具体序列如序列表中的序列3所示；

所述PCR引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物为单链DNA分子，且序列为5’-attggattataggtccttgcg-3’；所述下游引物为单链DNA分子，且序列为5’-actcgaagtcacgtcggtct-3’。

2.根据权利要求1所述的一种与小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述小麦基因组DNA来源于科农9204品系植株叶片分离提取获得的DNA。

3.根据权利要求1所述的一种与小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系包括：1μl的所述上游引物，1μL的所述下游引物，1μL的小麦基因组DNA模板，5μL的2×Taq PCR StarMix，加ddH₂O至总量10μL；所述PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；之后95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸展1min，循环34次；最后 72℃再延伸5min，结束扩增，12℃保存。

4.根据权利要求1所述的一种与小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述非变性聚丙烯酰胺凝胶的浓度为6.0%，且所述6.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶是指每100mL聚丙烯酰胺凝胶溶液中含有5.85 g丙烯酰胺和0.15 g甲叉丙烯酰胺。

5.一种与小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的分子标记的应用，其特征在于，将权利要求1-4所述的任意一种与小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的分子标记应用于检测小麦品种或品系中是否含有增加小麦穗粒数的QTL位点。

6.一种与小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的分子标记的应用，其特征在于，将权利要求1-4所述的任意一种与小麦穗粒数主效QTL紧密连锁的分子标记应用于小麦分子育种。