CN102471802B - 用于鉴定甘蔗属植物品种/品系的标记物及其用途 - Google Patents
用于鉴定甘蔗属植物品种/品系的标记物及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102471802B CN102471802B CN201080030513.7A CN201080030513A CN102471802B CN 102471802 B CN102471802 B CN 102471802B CN 201080030513 A CN201080030513 A CN 201080030513A CN 102471802 B CN102471802 B CN 102471802B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- strain
- seq
- dna sequence
- saccharum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000209051 Saccharum Species 0.000 title claims abstract description 52
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 title claims abstract description 14
- 239000003550 marker Substances 0.000 title description 49
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 46
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 23
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 23
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 claims description 22
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 claims description 21
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 10
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 claims description 9
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 claims description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 7
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- RAHZWNYVWXNFOC-UHFFFAOYSA-N Sulphur dioxide Chemical group O=S=O RAHZWNYVWXNFOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- ZFKJVJIDPQDDFY-UHFFFAOYSA-N fluorescamine Chemical compound C12=CC=CC=C2C(=O)OC1(C1=O)OC=C1C1=CC=CC=C1 ZFKJVJIDPQDDFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000020584 Polyploidy Diseases 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000826915 Saccharum officinarum complex Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000013334 alcoholic beverage Nutrition 0.000 description 1
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- HSQLWDFHNPKAME-UHFFFAOYSA-J nickel tetrafluoride Chemical compound F[Ni](F)(F)F HSQLWDFHNPKAME-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000004304 visual acuity Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明的一个目的是提供用于以允许高精度鉴定广泛类型甘蔗属植物品种/品系的新DNA标记物来鉴定甘蔗属植物品种/品系的方法。提供了用于鉴定甘蔗属植物品种/品系的方法，包括使用选自SEQ ID NOs：1至12的至少一个DNA序列中的简单序列重复多态性。
Description
技术领域
本发明涉及含有从甘蔗属基因组开发的SSR序列的特征性DNA序列和以该序列鉴定甘蔗属植物品种/品系的方法。
背景技术
已经栽培甘蔗作为用于糖原料或酒精饮料的原料。此外，甘蔗已经用于多种产业领域中，包括用作生物燃料的原料。在这类情况下，需要开发用于以便利方式鉴定甘蔗品种/品系以繁育具有所希望特征(例如，含糖量、增强的生长能力、萌发能力、抗病性、抗虫性、和抗寒性)的甘蔗品种的方法。
以下三种方式可以用于植物品种/品系的鉴定：用于比较特性数据的特性比较法”、用于比较相同条件下栽培的植物的“栽培比较法”和用于DNA分析的“DNA分析法”。用特性比较法或栽培比较法鉴定品系存在许多问题，包括因栽培条件不同所致的精确度降低、要求众多步骤的田地研究的漫长持续期等。特别地，因为甘蔗植物比其他禾本科作物如稻和玉米大得多，已经难以基于田地研究实施品系鉴定。
同时，在甘蔗的情况下，遗传标记物技术的开发已经因为基因组复杂性而延迟。虽然USDA报道了采用SSR标记物的基因分型法(非专利文献1)，但是基因分型法的精确性因为标记物数目少和每种标记物中的多态性而降低。此外，上文的基因分型法仅可用于美国/澳洲品种并且因此不能用于鉴定在日本、台湾、印度和其他国家/地区栽培的主要品种和鉴定有用遗传资源。
引用文献列表
非专利文献
非专利文献1：Maydica 48(2003)319-329“用微卫星DNA标记物对甘蔗克隆的分子基因分型(Molecular genotyping of sugarcane clones withmicrosatellite DNA markers)”
发明概述
技术问题
本发明的一个目的是提供用于以允许高精度鉴定广泛类型甘蔗属植物品种/品系的新DNA标记物鉴定甘蔗属植物品种/品系的方法。
技术问题的解决方案
作为深入研究以实现上文目的的结果，本发明人已经从衍生自甘蔗属基因组的众多DNA片段中发现特征性DNA序列，此类DNA序列能够鉴定广泛类型的甘蔗属植物品种/品系。这已经导致本发明的完成。
具体而言，本发明包括以下特征。
(1)用于鉴定甘蔗属(Saccharum)植物品种/品系的方法，包括使用选自SEQ ID NOS：1至12的至少一个DNA序列中的简单序列重复多态性。
(2)根据(1)所述的鉴定方法，包括使用选自SEQ ID NOS：1、2和6的三种DNA序列中的简单序列重复。
(3)根据(1)所述的鉴定方法，包括使用选自SEQ ID NOS：2、6和12的三种DNA序列中的简单序列重复。
(4)根据(1)所述的鉴定方法，包括使用SEQ ID NOS：1、2、3、4、5、6、7、8、10和12的任一个DNA序列中的简单序列重复多态性，其中待鉴定的甘蔗属植物是品种NiF8或Ni9。
(5)根据(1)所述的鉴定方法，包括使用SEQ ID NOS：1、2、3、4、5、6、7、8、11和12的任一个DNA序列中的简单序列重复多态性，其中待鉴定的甘蔗属植物是品种F177或Nco310。
(6)根据(1)所述的鉴定方法，包括使用由SEQ ID NO：12代表的DNA序列中的简单序列重复多态性，其中待鉴定的甘蔗属植物是在日本育成的品种。
(7)根据(1)所述的鉴定方法，还包括使用由SEQ ID NO：13和/或14代表的DNA序列中的简单序列重复多态性。
(8)根据(1)至(7)任一项所述的方法，其中鉴定通过以下步骤实施：
(a)使用从待鉴定的甘蔗提取的DNA作为模板和下述引物组实施PCR扩增，所述的引物组由特异性扩增在所选择的DNA序列中含有简单序列重复的区域的正向引物和反向引物组成；
(b)确定所扩增DNA片段的分子量；和
(c)基于分子量分布，进行含有简单序列重复的区域的基因分型。
(9)根据(8)所述的方法，其中步骤(b)中所扩增DNA片段的分子量的测定通过毛细管电泳进行。
(10)根据(8)所述的方法，步骤(c)还包括将所确定的基因型与获自已知甘蔗品种/品系的基因型比较。
(11)用于实施根据(1)至(10)任一项的方法的试剂盒，包含由特异性扩增在所选择的DNA序列中含有简单序列重复的区域的正向引物和反向引物组成的引物组。
(12)根据(11)所述的试剂盒，还包含对应的表，所述对应的表是关于从已知甘蔗品种/品系获得的、在所选择的DNA序列中含有简单序列重复的区域的基因型。
发明的有利效果
本发明提供用于以允许高精度鉴定广泛类型甘蔗属植物品种/品系的新DNA标记物鉴定甘蔗属植物品种/品系的方法。可以通过使用(根据需要，组合地使用)本发明的DNA标记物实现以改善的精确性鉴定更广泛类型的甘蔗品种。此外，该方法的再现性高。
此外，本发明提供用于实施本发明方法的试剂盒。
附图简述
图1是作为PCR扩增SSR标记物STY126的结果所获得的毛细管电泳图。
图2显示SSR标记物STY120和STY162的电泳图因不同DNA含量所致的变化：泳道1至5：SSR标记物STY120(DNA含量：从左起，3-倍、2-倍、标准(24ng)、1/2和1/3)；并且泳道6至10：SSR标记物STY162(DNA含量：从左起，3-倍、2-倍、标准(24ng)、1/2和1/3)。
图3-1显示使用SSR标记物STY133情况下两个甘蔗品系(NiF8和Ni9)的多态性检测结果图的一部分。
图3-2显示使用SSR标记物STY133情况下两个甘蔗品系(NCO310和F177)的多态性检测结果图的一部分。
图4显示使用SSR标记物STY133情况下多态性检测的再现性的一部分图。
实施方案描述
下文描述用于鉴定本发明的甘蔗属植物品种/品系的方法(下文简称作本发明方法)。
本发明中所使用的术语“品种/品系”指可以因基于其基因型的全部或一些形态学/生态学特征与其他组的植物相区别的一组植物。
根据本发明，鉴定甘蔗属植物的品种/品系意图包括鉴定就品种/品系而言未知的甘蔗属植物的品种/品系、和确定就品种/品系而言未知的甘蔗属植物的品种/品系是否与特定的品种/品系对应。例如，它包括鉴定就品种/品系而言完全未知的甘蔗属植物与哪种品种/品系对应，确定该植物是否为在日本育成的品种，和确定已知作为日本国内品种的甘蔗属植物是否为在日本的主要品种。
根据本发明，甘蔗属植物品种/品系的鉴定还包括确定待检验甘蔗属植物与给定品种/品系之间的亲缘程度。
本发明方法的特征在于使用从甘蔗属植物的基因组中开发的特征性DNA序列中的简单序列重复(下文也称作“SSR”)。SSR是具有2个至几个碱基对(bp)的特定核苷酸序列的重复，其以散在方式存在于生物的基因组DNA中。取决于组成重复的核苷酸的类型，SSR可以由(AC)n或(GT)n(其中“A”指腺嘌呤、“C”指胞嘧啶、“G”指鸟嘌呤、“T”指胸腺嘧啶，并且“n”指2或更大的整数)代表。诸品种/品系之间重复数“n”的差异形成多态性。通常，SSR可以用与该SSR相邻的高度保守序列区鉴定。因此，本文中所述的每个特征性DNA序列含有形成多态性的SSR和与该SSR邻接的序列。
下文提供可以用于本发明的特征性DNA序列。本文中，每个加下划线的部分代表特征性DNA序列中的SSR。
STY099
ctcacgaaacgatcaagagatgtacgtcctgaatcctctcccatcctccaaaaggaaaatcattTCTCTCTCTCTCTCTCTC TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCatcaaaagtaaacaagagaattctattcgtggcctacacaaaacccttccttttctatctcccacggaaagaatggttttttcctcaaaggaaaaaaaagggaaaagataaatattttctcctgacgcacaaataaagccatgtagtag(SEQ ID NO：1)
STY117
acatcaaaactctcaatcgattaaaatatagatcatgaacaatgtaactagaaaaatacctgctcagtcatctgttgatacattccaggacctatttgtcgatggtaaacttcgttcctgcaggttggcagcgcctctttcctggtgctggctttatgacgttttT CTCTCTCcaaacctatgacacattgaaaattgaaaagtaaataaCAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACA Acatagccttttgtcccaagcaagttggggtaggctagagatgaaaagtaaatacaaatactatacttttcccttgtgatcaacacagt(SEQ ID NO：2)
STY120
cctagcaacataagagggcttatctatcTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTtcgcttatgtccaaaacttgtggtagaaacttagagggactccgttgtgttcatgttggtttggggggctggagtccactctacaccccctaaatccgcctctcattgtaggcaaagttatacacctaccccaaacaagtgactccatgttgcttctattaagatttgaatttactataaacgtaatgacatcataaaaaaaggatcgagctaaaatgtaattcgaatg(SEQ ID NO：3)
STY123
actatcgtcaagattccttaaatctcctccatacatgagaggtgatttagccattgaccaaagtgccatctgtaaggtcatgtcaaagaaaaaagagttcattactacagaaaaatagataCAACAACAACAACAACAACAACAACAACAAcatagccttttgtcccaagcaagttggggtaggctacagaaaaaatagatacagaacacttaaatttgaagtgatcacCAACAACAAcctgtgctttctgttcatcaagagtaaggttacatttcctgtgaggaccctgatttacacctgcattaacagaagaaaaagggtctgtttctgatacagctgcatgtatattatttcattcaagatattcttggaaaaagaataagggaagggaatggttatgaatttttacgtgttataagtaatttatcgcggatagatatttactctaTGTGTGTGctttactcgatctgatctgaatatcaacagaacagactaaaattaagt(SEQ ID NO：4)
STY133
CccttagcctctaggtgaagtgatgaagcgtgaagttgatgctggtagcaacagttctttTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTcctcctcttttgaccaacctacggcaagcaatcgccgggttaatatccgtagaatgtgtttacgtgcatgttttagccaatattcaatctgtctgttccttctcttgt (SEQ ID NO：5)
STY137
ctacccattttgctgccatcatccccttcttattctcatgctatatctcttccattcaggttcctaacgacgagagtgtctaattcgaaaaaagaattatatccatcctccagaaatcctcctcCCACCACCACCACCAcccagtctgtttttagcctgctag(SEQ ID NO：6)
STY144
acctgtctatattgatccctggaaaaaccttccgcTCTCTCTCttaCTCTCTttctccCTCTCTggatttgtgaactaccactgtttataccaaataaacaagaacttaccgactgatctacacctagaacggtcctaaggatctaacattggt (SEQ ID NO：7)
STY145
acacaaccatccctagattatactccaacccctcatcttcagactctacctccccattgcCCTCCTCCTcttcctcatctTC ATCATCActttcatccctttcttgttcctcctcatcctcgtcgctctcatcaCCACCACCAcctccAGAAGAAGAcaaagactatgaagtcaaactcgaggatggtggcaaagatgaaggctcatgatgacatttctatgaggttgactgatggcttattggagcatttaaggcattcttgaacctcctcttgt (SEQ ID NO：8)
STY166
ccaccttttttgtttttctctttcttcttttccccatttcacctttttaccacaaatgtaacccgagccctccccatggaaactataaaaggggaggcagggtccacatctaggacaagacataaagacgcataagatttcacaatgaccaatcgaaACACACA CctcACACACaaatcccctgaagagacctgggatccgcacccTCTCTCgaaagcttgtaacccctactatgagt (SEQ IDNO：9)
STY168
acggacccgactaacctgtgctgttagtgtTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTATATATATATATATATATATATAccttgcaggagaagaggattattgtaacatctgatcccatcccatgg (SEQ ID NO：10)
STY173
acatcattggacgctgttacctTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGaacaaaggcagTGTGTGttttcttgcagttccagtcttgtatgtctgactgcaatttattttcgg(SEQID NO：11)
STY200
acaagcctactcccatactccatagacacccTCTCTCTCTCtagaTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT CTCTCTCTCccaaccctcttcaactttgtgcatttccttccctagttgggacacctaattctgacatTCTCTCgttcaagtgagaatctacctaggtgaagcaccttctatgagctcgtctgt(SEQ ID NO：12)
在本发明的方法中，根据待检验的甘蔗属植物，以上的特征性DNA序列可以单独或组合地使用。
例如，如果待检验甘蔗属植物的品种/品系是完全未知的，则可以通过选择三种不同的特征性DNA序列STY099、STY117和STY137并且组合地使用这些DNA序列中的SSR多态性鉴定在日本和外国育成的广泛类型的品种/品系。
如果待检验甘蔗属植物的品种/品系极可能是在日本育成的品种，则可以通过选择三种不同的特征性DNA序列STY117、STY137和STY200并且组合地使用这些DNA序列中的SSR多态性鉴定该品种/品系。
如果已知待检验甘蔗属植物的品种/品系是作为日本主要品种的NiF8或Ni9，则可以通过从STY099、STY117、STY120、STY123、STY133、STY137、STY144、STY145、STY168和STY200组成的组中选择一个特征性DNA序列并且使用该DNA序列中的SSR多态性，将该品种/品系鉴定为NiF8或Ni9。
如果已知待检验甘蔗属植物的品种/品系是已经引入日本的主要品种的F177或Nco310，则可以通过从STY099、STY117、STY120、STY123、STY133、STY137、STY144、STY145、STY173和STY200组成的组中选择一个特征性DNA序列并且使用该DNA序列中的SSR多态性，将该品种/品系鉴定为F177或Nco310。
如果已知待检验甘蔗属植物的品种/品系是在日本育成的品种，则可以通过选择STY200作为特征性DNA序列并且使用该DNA序列中的SSR多态性鉴定特定的品种/品系。
本文中所述的在日本育成的品种的实例包括但不限于Ni1、NiN2、NiF3、NiF4、NiF5、Ni6、NiN7、NiF8、Ni9、NiTn10、Ni11、Ni12、Ni14、Ni15、Ni16、Ni17、NiTn19、NiTn20、Ni22和Ni23。本文中所述的在日本的主要品种的实例包括但不限于NiF8、Ni9、NiTn10和Ni15。本文中所述的已经引入日本的主要品种的实例包括但不限于F177、Nco310和F172。
本领域技术人员可以清楚地理解，通过参考本文以下所示的表4，根据待检验的甘蔗属植物而应当选择哪种特征性DNA序列。
进一步，在本发明的方法中，也可以使用下文给出的特征性DNA序列STY127和STY162中的一个或两个序列。
STY127
actccggacaaggtttatgagtttgataagagccctactatagcaaacaaactaatttcTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTC TTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTtccttccttccttccttctttcctagccagagccccacacctctttgagtgattaccatgatatgggcttgtttcattaaaaactctatccaaaaacctagtgaaaaaaattaaaatgattgttagagaaaagATATATcacatttat(SEQ ID NO：13)
STY162
ctgaaatattgaaaatactcctaaaaatttcttcataggaaacatgacagtggtaataaaacatctcaatgaacagaACA CACctttctactgtggtacttgaattgaaagcacctatccaattgaatgcaagaaacaatagatttgtcatattcatagttgcaagacatagataaacagagtgctgaacagccaacatgaatatacgattgctctccagtctggcagttctgaaacacaagccagtttcagaaa(SEQ ID NO：14)
在本发明的方法中，使用上文特征性DNA序列中的SSR多态性鉴定甘蔗属植物可以通过以下步骤(a)至(c)进行：
(a)使用从待鉴定的目标甘蔗提取的DNA作为模板和下述引物组实施PCR扩增，所述的引物组由特异性扩增含有上文所选择的特征性DNA序列中SSR(下文也称作“SSR标记物”)的区域的正向引物和反向引物组成；
(b)确定所扩增DNA片段的分子量；和
(c)基于分子量分布，针对SSR标记物进行基因分型。
在本发明中使用的待检验甘蔗属植的DNA样品可以通过从植物的组织如种子、叶、根和茎提取获得。DNA提取可以根据本领域技术人员通常已知的方法实施。例如，将植物的组织切碎并且在适宜的缓冲液中匀化，随后通过已知的DNA提取方法如酚提取法提取总DNA。用于此目的的DNA提取试剂盒可以是市售DNA提取试剂盒。例如，可以使用植物基因组DNA Mini试剂盒(BioGene)。
可以基于上文特征性DNA序列设计步骤(a)中所用的引物组，从而特异性扩增含有作为多态性检测的靶的SSR的区域。此外，如果上文的特征性DNA序列含有几个SSR，则可以如此设计引物组，从而扩增含有单个SSR或几个SSR的区域。不特别地限制本发明中所用的正向引物和反向引物的长度，只要可以特异性扩增靶区域。例如，该长度可以落在15至50个核苷酸并且优选地17至25个核苷酸的范围内。
在下文所示的表5中提供可以特异性扩增上文特征性DNA序列中SSR标记物的引物组的实例。
本发明中所用的引物组优选地在5′端标记以便利后续确定所扩增DNA片段的分子量。标记可以通过本领域技术人员已知的手段实施，包括但不限于FITC、32P、碱性磷酸酶、罗丹明、荧光胺、丹磺酰及其衍生物。
不限制步骤(a)的PCR条件，只要可以特异性扩增靶区域。例如，此类条件可以包括20至50个以下循环，94℃至95℃变性10秒至1分钟，50℃至65℃复性10秒至1分钟并且72℃延伸30秒至10分钟。
进行如上所述PCR扩增的DNA片段包括多个DNA片段，它们仅就靶SSR的重复数而言彼此不同，这归因于以下事实：甘蔗栽培品种是非整倍多元体。
下一步，在步骤(b)中，测定步骤(a)中所扩增DNA片段的分子量。对于分子量测定，可以使用本领域技术人员已知的技术如电泳法、质谱法和测序法，但不限于此。在本发明的方法中，优选地使用电泳法。
电泳法的实例包括琼脂糖凝胶电泳法、变性或非变性丙烯酰胺凝胶电泳法、毛细管电泳法等。如上所述，在本发明中，用于分子量测定的靶DNA片段包括仅就SSR重复数目而言具有不同分子量的多个DNA片段。因此，例如，需要精确地检测从2个核苷酸的极短核苷酸序列差异衍生的微小分子量差异。因而，在本发明的方法中，优选使用高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳，并且特别优选使用毛细管电泳。
接着，在步骤(c)中，基于DNA片段的所测定分子量的分布实施靶SSR标记物的基因分型。如此确定的基因型任选地与已经事先知晓或已经如上文那样获得的已知品种/品系的相关SSR标记物的基因型比较，以判定所确定的基因型属于什么类型的品种/品系或判定所确定的基因型是否与已知的品种/品系均不对应或确定与已知的特定品种/品系的亲缘程度。
本发明的方法是有利的，因为与例如非专利文件1中公开的甘蔗SSR标记物相比，基于可以使用的特征性DNA序列的数目和该序列中的SSR多样性，可以鉴定更广泛类型的品种/品系并且再现性更高。
此外，本发明包括用于实施本发明方法的试剂盒。本发明的试剂盒包含至少一个引物组，所述的引物组由特异性扩增上文特征性DNA序列中SSR标记物的正向引物和反向引物组成。
不特别地限制本发明试剂盒中所包含的正向引物和反向引物的长度，只要可以特异性扩增靶区域即可。例如，该长度可以落在15至50个核苷酸并且优选地17至25个核苷酸的范围内。
在下文所示的表5中提供这种引物组的实例。
本发明试剂盒中所包含的引物组优选地在5′端标记以便利后续确定所扩增DNA片段的分子量。标记可以借助本领域技术人员已知的手段实施，所述的手段包括但不限于FITC、32P、碱性磷酸酶、罗丹明、荧光胺、丹磺酰及其衍生物。
优选地，本发明的试剂盒还包含对应的表，所述对应的表是关于从已知甘蔗品种/品系获得的、上文特征性DNA序列中SSR标记物的基因型。基于使用该试剂盒从待检验甘蔗属植物获得的基因分型结果，可以轻易地判定待检验的甘蔗属植物属于哪种类型的品种/品系或者待检验的甘蔗属植物是否不属于已知的品种/品系或与已知的特定品种/品系的亲缘程度。
在下文参考以下实施例更详细地描述本发明，不过本发明的技术范围不限于此。
实施例
实施例1
初步选择用于品种/品系鉴定的SSR标记物。
使用96个甘蔗属品系评价扩增SSR标记物中SSR区的程度。作为PCR反应和毛细管电泳的结果，对全部受检SSR标记物证实了SSR区的扩增片段(条带)。在全部受检SSR标记物当中，从14个SSR标记物获得清晰的带型。然而，从4个SSR标记物(STY050、STY126、STY149和STY167)获得不清晰的带型(图1，表1)。不清晰带型的存在导致难以分析多份样品。因此，通过初步选择选出14个SSR标记物，不包括4个这样的SSR标记物。
表1
初步选择用于开发品系鉴定技术而受试的SSR标记物的结果
实施例2
用于品种/品系鉴定的SSR标记物的稳定性试验
使用B3439DNA，就PCR反应时与DNA含量变化相对应的稳定性评价通过初步选择选出的14个SSR标记物。结果，在12ng(用于常规PCR反应的一半量)或更多DNA含量的PCR反应情况下，未对任何受检SSR标记物观察到与DNA含量变化相对应的带型变化。然而，在8ng(用于常规PCR反应的三分之一量)DNA含量的PCR反应情况下，与12ng(用于常规PCR反应的一半量)DNA含量时获得的带型相比，发现2个SSR标记物的条带消失。
认为上述这2个SSR标记物具有与DNA含量变化对应的低稳定性。在品系鉴定分析中，就DNA含量而言的误差更可能在样品间而非通过装置、试剂等引起。因此，认为难以使用这2个SSR标记物用于品系鉴定。基于以上结果，为SSR标记物组选择具有与DNA含量变化相对应的优异稳定性的12个SSR标记物用于品系鉴定。同时，在降低的DNA含量下，观察到产生小于60bp的条带的SSR标记物(图2)。本文中所用的SSR标记物设计用于扩增60bp区域或更大的区域。因此，认为这种小于60bp的条带并非衍生自SSR区域的扩增片段，并且因而它是非特异性条带。
表2
基于基因组DNA量的SSR标记物扩增结果
*：″×″：条带消失
实施例3
用于品种/品系鉴定的SSR标记物的鉴定能力
为了评价用于品种/品系鉴定的SSR标记物STY133的鉴定能力，就条带差异而言检验了4个品系(NiF8、Ni9、NCO310和F177)。所获得条带的数目分别是43个条带、35个条带、39个条带和45个条带。共同条带的平均数目对于全部品系是27.2。同时，非共同条带的平均数目是26.7。因而，可以分别鉴定各个品系(图3)。
此外，作为用4个品系(NiF8、Ni14、F160和NCO310)评价STY133条带的再现性，对每个品系证实了再现性(图4)。
另外，基于125个甘蔗属品系的条带数目和出现率(appearancerate)，评价用于品系鉴定的SSR标记物组的鉴定能力。作为分析结果，每个SSR标记物的最大、最小和平均条带数分别是51、15和29。总计，获得348个条带(表3)。各条带的最大、最小和平均出现率分别是96.9％、1.0％和10.8％。对于用SSR标记物组检测的每个品系而言，最大、最小和平均条带数分别是52、24和39。发现对两个品系间而言全部条带偶然符合的概率极低(6.0E-6或更低)，其中所述的概率从各条带出现率和各品系的条带数获得。
表3
SSR标记物中的多态性数目
实施例4
对125个甘蔗属品种/品系，以用于品种/品系鉴定的SSR标记物确定每个SSR标记物的基因型。
下文所示的表4列出每个SSR标记物的基因分型结果，其中所述的SSR标记物从该实施例中受检的125个甘蔗属植物品种/品系中获得。
表4
甘蔗主要品种/品系的SSR标记物带型
在该表中，各SSR标记物由字母“A”至“L”代表，数字代表其等位基因型。例如，“STY099”表示在125个受检品种/品系当中存在103个类型的基因型。
如从表4显而易见，可以使用(根据需要，组合地使用)上文的SSR标记物鉴定全部125个受检甘蔗品种/品系。
下文所示的表5列出在上文实施例中所用的用于SSR标记物扩增的PCR引物序列。
表5
SSR标记物引物序列
产业应用性
根据本发明的方法和试剂盒，可以轻易地以高精确性和高度再现性鉴定广泛类型的甘蔗属植物品种/品系。
就上文而言，期望例如可以获得下文所述的产业优势。
(1)可以证实原始的甘蔗属植物品系/品种和生产期间或在销售或配送渠道范围内发生或未发生品种/品系的混种或取错。
(2)可以明确地鉴定具有优异特征的甘蔗属植物，并且因而可以明显促进下一代能源作物的改良。
(3)可以促进开发具有优异杂种优势的品种。
(4)可以获得甘蔗属品种/品系之间的亲缘程度，并且因而可以提供亲缘相关的信息。
Claims (10)
1.用于鉴定甘蔗属(Saccharum)植物品种/品系的方法，包括对SEQID NOs:1至12的任一DNA序列中的所有简单序列重复多态性进行基因分型的步骤。
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，还包括对由SEQ ID NO:13和/或14代表的任一DNA序列中的所有简单序列重复多态性进行基因分型的步骤。
3.根据权利要求1所述的鉴定方法，包括使用SEQ ID NOS:1、2、3、4、5、6、7、8、10和12的至少一个DNA序列中的所有简单序列重复多态性，其中待鉴定的甘蔗属植物是品种NiF8或Ni9。
4.根据权利要求1所述的鉴定方法，包括使用SEQ ID NOS:1、2、3、4、5、6、7、8、11和12的至少一个DNA序列中的所有简单序列重复多态性，其中待鉴定的甘蔗属植物是品种F177或Nco310。
5.根据权利要求1所述的鉴定方法，包括使用由SEQ ID NO:12代表的DNA序列中的所有简单序列重复多态性，其中待鉴定的甘蔗属植物是在日本育成的品种。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中基因分型的步骤通过以下步骤实施：
(a)使用从待鉴定的甘蔗提取的DNA作为模板和下述引物组实施PCR扩增，所述的引物组由特异性扩增在所选择的DNA序列中含有简单序列重复的区域的正向引物和反向引物组成，其中所述所选择的DNA序列是SEQ ID NOs:1至14中的任一DNA序列；
(b)确定所扩增DNA片段的分子量；和
(c)基于分子量分布，进行含有简单序列重复的区域的基因分型。
7.根据权利要求6所述的方法，其中步骤(b)中所扩增DNA片段的分子量的测定通过毛细管电泳进行。
8.根据权利要求6所述的方法，步骤(c)还包括将所确定的基因型与获自已知甘蔗品种/品系的基因型比较。
9.用于实施根据权利要求1、2至8任一项的方法的试剂盒，包含用于扩增SEQ ID NOs:1至12的DNA序列的引物组，其中每个组由扩增在所选择的DNA序列中含有简单序列重复的区域的正向引物和反向引物组成，其中所述所选择的DNA序列是SEQ ID NOs:1至12中的任一DNA序列。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，还含有对应的表，所述对应的表是关于从已知甘蔗品种/品系获得的、在所选择的DNA序列中含有简单序列重复的区域的基因型的表4。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009160620A JP5428596B2 (ja) | 2009-07-07 | 2009-07-07 | サトウキビ属植物の品種・系統識別マーカーとその利用 |
| JP160620/2009 | 2009-07-07 | ||
| PCT/JP2010/004425 WO2011004594A1 (en) | 2009-07-07 | 2010-07-07 | Marker for identifying variety/line of plant of the genus saccharum and the use thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102471802A CN102471802A (zh) | 2012-05-23 |
| CN102471802B true CN102471802B (zh) | 2014-10-29 |
Family
ID=42712505
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201080030513.7A Active CN102471802B (zh) | 2009-07-07 | 2010-07-07 | 用于鉴定甘蔗属植物品种/品系的标记物及其用途 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8877444B2 (zh) |
| JP (1) | JP5428596B2 (zh) |
| CN (1) | CN102471802B (zh) |
| AU (1) | AU2010269749B2 (zh) |
| BR (1) | BR112012000489B1 (zh) |
| WO (1) | WO2011004594A1 (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103540678A (zh) * | 2013-11-05 | 2014-01-29 | 广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所 | 甘蔗毛细管电泳dna指纹图谱的构建及甘蔗品种资源鉴定的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101248753A (zh) * | 2008-03-27 | 2008-08-27 | 华中农业大学 | 利用小孢子培养和ssr标记辅助选育低芥酸、低硫甙甘蓝型油菜自交不亲和系的方法 |
| CN101354348A (zh) * | 2008-08-28 | 2009-01-28 | 云南省农业科学院甘蔗研究所 | 一种甘蔗分子标记page凝胶超快速银染检测方法 |
| CN101469347A (zh) * | 2007-12-28 | 2009-07-01 | 北京金色农华种业科技有限公司 | 一种玉米品种真伪快捷鉴定方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101617047A (zh) * | 2007-01-12 | 2009-12-30 | 卡纳维亚利斯有限公司 | 用于甘蔗属复合组的基于微卫星的指纹分析系统 |
-
2009
- 2009-07-07 JP JP2009160620A patent/JP5428596B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-07-07 US US13/378,295 patent/US8877444B2/en active Active
- 2010-07-07 CN CN201080030513.7A patent/CN102471802B/zh active Active
- 2010-07-07 WO PCT/JP2010/004425 patent/WO2011004594A1/en active Application Filing
- 2010-07-07 BR BR112012000489A patent/BR112012000489B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2010-07-07 AU AU2010269749A patent/AU2010269749B2/en not_active Ceased
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101469347A (zh) * | 2007-12-28 | 2009-07-01 | 北京金色农华种业科技有限公司 | 一种玉米品种真伪快捷鉴定方法 |
| CN101248753A (zh) * | 2008-03-27 | 2008-08-27 | 华中农业大学 | 利用小孢子培养和ssr标记辅助选育低芥酸、低硫甙甘蓝型油菜自交不亲和系的方法 |
| CN101354348A (zh) * | 2008-08-28 | 2009-01-28 | 云南省农业科学院甘蔗研究所 | 一种甘蔗分子标记page凝胶超快速银染检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20120094302A1 (en) | 2012-04-19 |
| BR112012000489A2 (pt) | 2016-11-22 |
| WO2011004594A1 (en) | 2011-01-13 |
| JP5428596B2 (ja) | 2014-02-26 |
| JP2011015615A (ja) | 2011-01-27 |
| AU2010269749B2 (en) | 2013-10-03 |
| US8877444B2 (en) | 2014-11-04 |
| CN102471802A (zh) | 2012-05-23 |
| AU2010269749A1 (en) | 2012-01-12 |
| BR112012000489B1 (pt) | 2019-10-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Smýkal et al. | Genetic diversity of cultivated flax (Linum usitatissimum L.) germplasm assessed by retrotransposon-based markers | |
| CN106480228B (zh) | 水稻镉低积累基因OsHMA3的SNP分子标记及其应用 | |
| Heidari et al. | Genomic variation studies in durum wheat (Triticum turgidum ssp. durum) using CBDP, SCoT and ISSR markers | |
| Kalendar et al. | Retrotransposable elements: DNA fingerprinting and the assessment of genetic diversity | |
| CN110872633B (zh) | 一种基于snp标记鉴定京科968玉米杂交种纯度的方法 | |
| Zulkifli et al. | Evaluation of MPOB oil palm germplasm (Elaeis guineensis) populations using EST-SSR | |
| Shakhatreh et al. | Assessment of genetic diversity among Jordanian wild barley (Hordeum spontaneum) genotypes revealed by SSR markers | |
| CN106244681A (zh) | 一种利用基因组ssr和est‑ssr指纹图谱鉴别绿豆品种的方法及应用 | |
| Das et al. | ISSR markers for gender identification and genetic diagnosis of Hippophae rhamnoides ssp. turkestanica growing at high altitudes in Ladakh region (Jammu and Kashmir) | |
| Santos et al. | Molecular diversity and genetic relationships in Secale | |
| CN111471790B (zh) | 与小麦籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-7D.1紧密连锁的分子标记及应用 | |
| BΟUSBA et al. | Genotypic diversity assessment of some durum wheat (Triticum durum) genotypes using RAPD analysis | |
| CN102471802B (zh) | 用于鉴定甘蔗属植物品种/品系的标记物及其用途 | |
| Halász et al. | Preliminary characterization of the self-incompatibility genotypes of European plum (Prunus domestica L.) cultivars | |
| CN106676176B (zh) | 一种利用多重pcr对四倍体紫花苜蓿进行ssr分析的方法 | |
| KR101219546B1 (ko) | 녹두에서 바구미 저항성 연관 분자표지 개발 및 이의 용도 | |
| CN111647677B (zh) | 与小麦籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-6D紧密连锁的分子标记及应用 | |
| CN110453007B (zh) | 一种用于红三叶遗传多样性分析的ssr引物组及其应用 | |
| KR20100079527A (ko) | 팥에서 분리된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도 | |
| CN111485032A (zh) | 一种鉴定黄瓜雌性系的方法及其使用的snp引物组合 | |
| KR101878539B1 (ko) | 콩의 싸리수염진딧물 저항성 염기다형성 마커 및 이의 용도 | |
| CN112760399B (zh) | 一种控制小麦籽粒粒长的主效qtl位点及紧密连锁的kasp引物和应用 | |
| CN112593006B (zh) | 一种小麦延绿性状主效qtl位点及紧密连锁的kasp引物和应用 | |
| CN116769961B (zh) | 利用多-筛-混-定四步法开发的小麦每穗小穗数qtl连锁分子标记及应用 | |
| CN117286287B (zh) | 大豆耐荫基因GmYUC2的KASP标记及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |