CN105969852B - 一种与油菜分枝角度性状qtl位点紧密连锁的分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与油菜分枝角度性状QTL位点紧密连锁的分子标记及应用，本发明以甘蓝型油菜品种沪油19为母本与Purler为父本杂交，杂种F1自交构建F2分离群体进行分析，获得分枝角度位点qBA1.A06；利用与该位点边界的Indel标记设计引物检测两亲本及F2群体，获得与分枝角度位点紧密连锁的分子标记BAIndel76和BAIdenl79；利用该标记引物可对两亲本杂交后的油菜基因型鉴定，利用该标记进行辅助选择可以大大提高选择效率，本发明为油菜株型的分子育种提供了一种新的遗传标记，也为甘蓝型油菜的分枝角度性状位点的精细定位和相关基因的图位克隆提供了有用信息。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，更具体涉及一种与油菜分枝角度性状QTL位点紧密连锁的分子标记及应用。
背景技术
油菜是我国第一大油料作物，种植面积和产量均居于世界前列。油菜的产油量占整个国产油料作物的55％之多，在国产植物油供给中占据主要地位，因此增加油菜的种植面积及提高油菜的产量对保障我国食用植物油供给安全意义重大(王汉中等，2014)。然而，随着劳动力价格和生产成本的不断上升，油菜的生产效益显著降低，并因此导致最近几年油菜的种植面积停滞不前甚至逐年下降。油菜机械化普及程度差和油菜单产低下是限制油菜产业发展的关键制约因素。传统油菜生产采用手工操作每公顷需要180～225个用工，占总成本的60％～70％；而加拿大等国家采用全程机械化操作，每公顷仅需15个用工，生产成本远低于我国，直接提高了油菜生产效益和国际竞争力(吴崇友等，2009)。虽然我国市场已经可以批量生产油菜机械化装备，但能满足机械化生产并保持高产的油菜品种仍然十分匮乏，致使我国油菜的机械化生产难以大面积推广，影响油菜种植面积的稳定。同时我国油菜产量相比加拿大等发达国家仍然差距较大。因此大力提高油菜机械化普及率和提高油菜产量，是保证油菜产量的平稳增长及实现油菜现代化生产的关键因素，也是保障我国植物用油供给安全的重要途径。
理想株型是提高作物产量的关键因素。水稻产量在经历两次飞跃之后出现了瓶颈，而对水稻株型结构的改良有望获得第三次飞跃(Xing and Zhang,2010)。选育形态与机能兼顾的理想株型材料，打破作物单产徘徊不前的局面一直是育种的主要目标之一。通过改良株型结构增加种植密度是近年来美国玉米能够实现大面积高产的关键因素，并成为今后美国玉米生产的发展趋势(Foley et al.,2011；Drewry et al.,2014)。单子叶作物(如水稻、玉米和小麦等)栽培中，叶倾角小及叶直立是植物冠层重要参数，可以使太阳光从上到下辐射，从而提高光合效率，增加种植密度(Murchie et al.2009；Zhu et al.2010；Murchie and Rey nolds 2012；Drewry et al.2014；Mansfield and Mumm 2014)。随着油菜直播技术的大力推广，通过株型改良提高种植密度对提高产量及实施机械化收割同样有重要意义。紧凑型油菜苗期叶片上挺，成株期分枝夹角小，使单个植株占用较少空间，适宜高密度的种植，有利于提高群体光能利用率，增加生物学产量、提高经济系数，从而获得较高产量(Cai et al.,2016)。同时，紧凑型油菜在密植条件下分枝部位适当提高，有效分枝数及分枝长度都有部分降低，使油菜成熟期相对集中，植株间不相互交叉，更有利于开展油菜的机械化收割，降低收获造成的损失。因此，改良油菜株型，不仅能提高油菜产量，也可以推动机械化生产的实施，符合我国油菜生产发展的长远目标。
传统育种方法曾经为生产提供了许多优良油菜品种，但是由于育种周期长、选择效率低，已经无法完全满足当前油菜生产的需要。随着分子生物学和分子遗传学的发展，对性状的选择正在逐渐由表型选择向基因型选择过渡。分子标记辅助育种是将分子遗传学与传统的表型选择有效结合的一种新的手段，直接利用与目标性状基因紧密连锁或共分离的分子标记对个体进行目标区域以及全基因组筛选，以达到提高目标性状选择效率、缩短育种年限的目的。分子标记辅助选择育种技术的关键是鉴定与重要农艺性状紧密连锁的DNA分子标记。近年来，美国等发达国家都投入巨资开展这方面的研究工作。随着水稻、玉米、小麦等重要作物农艺性状分子标记的开发，利用分子标记进行辅助选择已渐趋成熟，目标性状也从简单的单基因扩展到复杂的多基因数量性状。随着基因组学和测序技术的发展，油菜分子标记研究日渐受到关注，研究领域涉及种质遗传多样性分析、遗传图谱构建、基因标记和定位、品种纯度鉴定、配合力预测、标记辅助选择等多方面，并取得了重要进展。但与发达国家相比，我国油菜分子育种研究还有较大差距，主要体现在：不能有效地发掘和利用种质资源中的有利基因，缺乏有自主知识产权及育种价值的基因和标记等。
大多数重要的农艺性状(如产量、品质、抗性等)均表现数量性状的遗传特点，表型连续分布且易受环境条件的影响，因此基于表型选择的常规育种方法对复杂数量性状的选择效果不好，致使育种效率低下，育种周期延长。分子标记技术和数量遗传学结合，可以将复杂的数量性状分解为单个的数量性状基因位点(quantitative trait loci,QTL)，然后像研究质量性状一样对控制数量性状的多个基因进行研究。QTL定位就是在遗传分离群体的基础上，借助分子标记和遗传图谱，利用QTL作图软件对分离群体的数量性状表型数据进行分析，从而确定数量性状基因在染色体上的位置和效应。然而，传统的QTL定位方法需要依赖作图群体的构建以及分子标记的发展，过程周期长且工作量巨大，严重制约了QTL定位的进展。高通量测序是传统测序技术的革命性改进，可以一次测定几十万到几百万条DNA分子序列。该项技术结合混合群体分离分析法(Bulked Segregant Analysis,BSA)，在QTL定位中得到快速发展(Takagi et al.,2013；Yang et al.,2013)。通过高通量测序技术结合混合群体分离分析法，研究人员对控制水稻叶色和矮生的QTL位点进行了定位，并且发展出了Mutmap的方法(Abe et al.,2012)。水稻中六个苗期抗冷的QTL位点也利用该项技术鉴定获得(Yang et al.,2013)。以上结果说明，使用混合群体分离分析法结合高通量测序技术可以对数量性状进行快速定位。
发明内容
本发明的目的是提供一种与油菜分枝角度性状QTL位点紧密连锁的分子标记，该Indel分子标记的引物为：BAIndel76F：TCAATGCCTCTCTCTTGTCT，BAIndel76R：ATTCGCTGAGAACAAATCAT，BAIndel79F：TACCTAATTTCTGTAATTCGG，BAIndel79R：TGAGTAACAACATGGACAGC。
本发明的另一个目的是提供了一种与油菜分枝角度性状QTL位点紧密连锁的分子标记在油菜育种中的应用。该分子标记，或是基于其分子标记设计的引物，可用于培育株型紧凑的甘蓝型油菜品种及控制分枝角度基因的图位克隆。本发明为油菜株型遗传改良提供了新手段，加速了油菜株型改良的进程，提高了育种的准确性和选择效率。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种与油菜分枝角度性状QTL位点紧密连锁的分子标记，通过下述方式获得：
(1)利用分枝角度大的油菜品种沪油19和分枝角度小的Purler(Harsh Garg,Linda M.Kohn,M.Andrew,Hua Li,Krishnapillai Sivasithamparam,M.J.Barbetti.,Pathogenicity of morphologically different isolates of Sclerotiniasclerotiorum with Brassica napus and B.juncea genotypes.Eur J Plant PatholDOI 10.1007/s10658-009-9547-7)杂交，杂种F1代自交产生F2代分离群体。
(2)对F2代分离群体的每一个单株及两个亲本材料进行分枝角度测定。具体方法：对分离F2群体每个单株和两个亲本材料采用图像采集系统测量分枝角度(汪文祥等，2015)，取5个上部分枝进行角度测量，取平均值后，获得每个单株的分枝角度；
(3)在F2群体中选取分枝角度极端大和极端小的单株各30株，采用CTAB法提取亲本Purler和沪油19及F2分离群体的叶片总DNA，过程中所用到的试剂包括提取液(1.4MNaCl，100mM Tris，PH 8.0，20mM EDTA，pH 8.0，2％CTAB)、氯仿、异戊醇和无水乙醇；
(4)将30份分枝角度极端大单株的DNA等量混合组成大角度池，30份分枝角度极端小单株的DNA等量混合组成小角度池，采用Illumina公司的HiSeq 2500对两个混池和两个亲本进行全基因组测序，每个池均构建350bp文库，两个DNA混池测序深度为40×，两个亲本的测序深度为16×；
(5)将小角度池和大角度池获得的序列使用BWA软件与甘蓝型油菜Darmor基因组进行比对，然后使用SAMtools软件(Li&Durbin，2009)进行SNP分析，参考Takagi等(2013)中的SNP-index计算方法，计算小角度池和大角度池中检测出的全部SNP的SNP-index，之间相减的差值为Δ(SNP-index)；
(6)以1Mb为单位窗口，10kb为滑动窗口计算每个窗口的平均SNP-index。以每条染色体的物理位置为横坐标，Δ(SNP-index)为纵坐标绘制小角度池和大角度池的SNP-index图，根据无效假设原理，假设基因组上没有QTL位点，计算每个Δ(SNP-index)在95％置信水平下的阈值；
(7)由于与分枝角度相关的QTL位点在小角度池中的SNP-index大于0.5，在大角度池中的SNP-index会小于0.5，因此Δ(SNP-index)大于此处的阈值，根据这些分析，选定A06染色体上的区间为候选QTL区间；
(8)通过bwa/samtools软件对两亲本进行比对(Li&Durbin2009)，找到两者之间的插入和缺失的位置，使用Primer5设计的A06染色体上Indel标记，利用特异性的Indel标记分析F2群体中每个单株的基因型，QTL检测采用改良的复合区间作图法(Li et al.,2007)，以2.0为LOD阈值，大于2.0说明存在一个QTL位点，从而验证了A06染色体上分枝角度QTL，确定了与其紧密连锁的分子标记BAIndel76(本发明或称为BAInd76或A6Ind76或BnIndel76)和BAIndel79(本发明或称为BAInd79或A6Ind79或BnIndel79)，其引物序列为BAIndel76F：TCAATGCCTCTCTCTTGTCT，BAIndel76R：ATTCGCTGAGAACAAATCAT，BAIndel79F：TACCTAATTTCTGTAATTCGG，BAIndel79R：TGAGTAACAACATGGACAGC；
(9)利用上述的技术措施，申请人最终获得了油菜分枝角度的QTL位点qBA1.A06，该位点位于油菜A06染色体上，与基于该位点开发的Indel标记BAIndel76和BAIndel79紧密连锁，利用改良的复合区间作图法分析出其对油菜分枝角度的贡献率为17.17％，LOD值为11.14，加性效应为-2.65，显性效应为-0.59。
一种与油菜分枝角度性状QTL位点紧密连锁的分子标记在油菜育种中的应用，基于该QTL开发的Indel标记BAIndel76和BAIndel79的引物分别为：BAIndel76F：TCAATGCCTCTCTCTTGTCT，BAIndel76R：ATTCGCTGAGAACAAATCAT，BAIndel79F：TACCTAATTTCTGTAATTCGG，BAIndel79R：TGAGTAACAACATGGACAGC；利用该引物对待检测株系的DNA进行扩增，通过分子标记多态性，可快速对不同分枝角度的油菜进行筛选。
本发明的积极效果：
本发明首次定位了油菜小角度品种Purler中控制分枝角度的主效QTL位点，可解释17.17％的表型方差。在常规育种方法中，分枝角度表型鉴定要等到成熟期，费时费力且选择效率低下(分枝角度受种植密度等影响较大)。通过检测分枝角度主效基因位点，可以在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率。本发明中分枝角度主效基因位点位置明确，主效基因位点的检测方法方便快捷，不受环境影响。通过检测与分枝角度性状相关的分子标记，即可预测分枝角度的大小，进而准确快速筛选小角度优良单株。
附图说明
图1为本发明的技术流程图。
图2为两亲本之间分枝角度图。
上部为上分枝图，下部为下部分枝图。
图3为沪油19和Purler组合F2群体在武汉种植时的分枝角度分布图。
横坐标表示分枝频数分布，纵坐标表示单株数目。结果表明分枝角度表型呈正态分布，且变异范围较宽，证明分枝角度属于数量性状。
图4为DNA混池加全基因组获得的分枝角度A06染色体上候选区间QTL图。
横坐标表示染色体物理位置，纵坐标为Δ(SNP-index)值。
图5为一种位于A06染色体上的分枝角度基因位点LOD曲线示意图。
图中横坐标表示连锁群，纵坐标表示LOD值。
图6为利用分子标记BAIndel76和BAIndel79对F3单株进行基因型分析和筛选示意图。
图7为利用分子标记BAIndel76和BAIndel79对自然群体进行筛选的结果。
A代表亲本沪油19带型，B代表亲本Purler带型。
具体实施方式
实施例1：
油菜分枝角度分离群体的构建及性状测定：
本实施例中使用油菜大分枝角度材料沪油19和小分枝角度材料Purler杂交构建F2分离群体。在油菜成熟期从F2群体中随机选取277个系及两亲本取分枝角进行测量，具体取样及测量方法见汪文祥等(2015)方法。
实施例2：
亲本及F2群体叶片总DNA的提取：
利用CTAB法对叶片提取总DNA，具体步骤如下：
(1)取0.5克新鲜叶片放入2毫升离心管中，加入200微升2倍的CTAB提取液，再加入钢珠置于自动研磨仪上进行研磨，研磨完成后再往离心管中加入500微升2倍的CTAB提取液置于65℃恒温水浴30分钟，其间混合2-3次；
(2)加等体积的氯仿：异戊醇(24:1，V/V)，轻轻颠倒使其充分混匀，在10000rpm离心10分钟，轻轻吸取400微升上清液转入另一1.5毫升离心管；
(3)向上清液中加入1/10体积(40微升)的醋酸钠，再加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，置于-20℃冷冻半小时让DNA析出，然后8000rpm离心5分钟让DNA沉淀，倒掉离心管中乙醇溶液，用75％(V/V)乙醇清洗2次，最后倒掉乙醇，打开离心管盖置于通风橱内吹干；
(4)待离心管中乙醇彻底风干后，加入200微升TE溶解DNA，用紫外分光光度计测定DNA的浓度，于-20℃冰箱中保存备用。
实施例3：
甘蓝型油菜分枝角度QTL鉴定：
(1)在F2群体中，选取30份分枝角度极端大单株的DNA等量混合组成大角度池，30份分枝角度极端小单株的DNA等量混合组成小角度池，采用Illumina公司的HiSeq 2500对两个混池和两个亲本进行全基因组测序，每个池均构建350bp文库，两个DNA混池测序深度为40×，两个亲本的测序深度为16×；
(2)将小角度池和大角度池获得的序列使用BWA软件与甘蓝型油菜Darmor基因组进行比对，然后使用SAMtools软件(Li&Durbin，2009)进行SNP分析，参考Takagi等(2013)中的SNP-index计算方法，计算小角度池和大角度池中检测出的全部SNP的SNP-index，之间相减的差值为Δ(SNP-index)；
(3)以1Mb为单位窗口，10kb为滑动窗口计算每个窗口的平均SNP-index。以每条染色体的物理位置为横坐标，Δ(SNP-index)为纵坐标绘制小角度池和大角度池的SNP-index图，根据无效假设原理，假设基因组上没有QTL位点，计算每个Δ(SNP-index)在95％置信水平下的阈值；
(4)由于与分枝角度相关的QTL位点在小角度池中的SNP-index大于0.5，在大角度池中的SNP-index会小于0.5，因此Δ(SNP-index)大于此处的阈值，根据这些分析，选定A06染色体上的区间选定为候选QTL区间；
实施例4：
引物的开发和合成：
(1)对两亲本采用Illumina公司的HiSeq 2500进行重测序，对测序数据及质量评估合格后，采用GATK3.3软件的UnifiedGenotyper模块进行InDel的检测，使用VariantFiltratio n软件进行过滤，过滤参数为--filterExpression"QD<4.0||FS>200.0"，经检测和过滤，在两亲本中共发现658751个InDel；
(2)将两个亲本中的InDel进行基因分型，去掉在两个亲本中的同一个位置上发生相同插入或者缺失的InDel位点作为两个样本的差异InDel；
(3)根据亲本的InDel信息，提取InDel上下游各100bp的序列，并根据上下游序列设计引物，引物的TM值在55度左右，长度为18-22bp，共设计出385443条InDel引物；
(4)挑选A06染色体上目标区段附近100来对InDel引物通过生物公司合成。
实施例5：
引物多态性的筛选：
(1)利用溶解后的引物对亲本DNA进行PCR扩增，
反应体系：
PCR反应程序：
(2)凝胶电泳
试剂配制：
A.5×TBE
Tris-base 53.9克
EDTA 3.72克
硼酸 27.5克
用超纯水定容至1升。
B.6％变性聚丙烯酰胺凝胶
C.粘剂
无水乙醇 500毫升
冰醋酸 5毫升
反硅化剂(Me-T) 5毫升
D.不粘剂
无水乙醇 500毫升
硅化剂 14毫升
E.50×上样缓冲液
甲酰胺 100毫升
二甲苯青 1.25克
溴酚蓝 1.25克
F.银染液
硝酸银 1克
用纯水稀释到1升。
G.显影液
氢氧化钠 10克
甲醛 4.0毫升
用纯水稀释到1升。
凝胶制备：
玻璃板用10％(质量比)氢氧化钠溶液浸泡24小时，洗净，晾干。粘板和不粘板先用酒精擦拭干净，再分别用滤纸均匀涂抹粘剂和不粘剂。把封条齐平的放在粘板边缘，然后将不粘板放在粘板上面，并在靠近玻璃板底部三分之一处夹上两个卡夹起到固定作用。在烧杯中倒入50毫升变性聚丙烯酰胺，再分别加入400微升过硫酸胺(10％)和40微升TEMED，快速搅拌均匀；将配好的凝胶溶液沿点样口缓缓注入，凝胶注入后，在凝胶顶面插上有齿的梳子(背面插入)，在离灌胶口三分之一的玻璃板两侧对称处分别夹上卡夹固定，以保证凝胶聚合后玻璃板、封条以及梳子间紧密接触。
电泳：
移去卡夹和梳子，将玻璃板擦净后固定在电泳槽上，上下槽各加500毫升0.5×TBE缓冲液，接通电源1500伏60瓦预热30分钟。在PCR产物中加入等体积的1×上样缓冲液，95℃变性5分钟。冰浴冷却，上样2.5微升，2000伏60瓦电泳。当二甲苯青达到可视面最低端时即可停止电泳。
染色和显影：
取出粘板面向上在蒸馏水盆中漂洗，然后粘板面向上放入染色液盆中染色30分钟。取出粘板，在蒸馏水盆中漂洗，再面向上放入显影液盆中，轻轻摇动至条带清晰可见。在蒸馏水盆中漂洗，室温下自然晾干，拍照保存。
带型判读：
将先影后自然干燥好的玻璃板置于阅片台上，肉眼观察两亲本条带的位置差异。
实施例6：
F2群体基因型分析、遗传连锁图谱构建和QTL定位，其步骤如下：
(1)采用CTAB法提取F2群体277个单株的DNA(见实施例2)；
(2)挑选出为共显性的多态性InDel引物对F2群体277个单株的DNA进行PCR扩增，然后对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读(见实施例4)。F2分离群体的带型依情况分别读作A、B和H，分别表示来源于沪油19、Purler和杂合带型。
(3)通过对染色后获得的分子标记带型进行判读，获得分子标记基因型数据。
(4)利用QTL IciMapping 4.0软件对F2群体的分子标记基因型数据进行连锁分析以构建A06染色体上目标位点附近分子标记遗传连锁图谱，获得13个InDel引物A06染色体上目标位点附近分子标记遗传连锁图谱。
(5)基于该遗传图谱、F2群体的基因型数据以及分枝角度表行数据，利用QTLIciMapping 4.0软件进行QTL检测，在标记BAInd76附近检测到了一个LOD值和贡献率均较大的主效QTL位点(表1)。
表1A06染色体上分枝角度主效QTL位点基本信息
Indel标记BAIndel76和BAIndel79的引物分别为：BAIndel76F：TCAATGCCTCTCTCTTGTCT，BAIndel76R：ATTCGCTGAGAACAAATCAT；BAIndel79F：TACCTAATTTCTGTAATTCGG，BAIndel79R：TGAGTAACAACATGGACAGC。
实施例7：
一种与油菜分枝角度性状QTL位点紧密连锁的分子标记在油菜育种中的应用，其步骤是：
(1)以具有优良产量、抗性好但分枝角度大的沪油19做亲本与分枝角度小的Purler杂交，经自交获得后代群体F3家系。
(2)利用F3家系的种子发芽，提取幼芽总DNA，利用分子标记BAInd76和BAInd79进行分枝角度QTL基因型分析，BAInd76在沪油19(P1)中扩增带型为153bp的单一条带，在Purler(P2)中扩增带型为137bp的单一条带，在F1中扩增带型为137bp和153bp的两个条带；BAInd79在沪油19(P1)中扩增带型为89bp的单一条带，在Purler(P2)中扩增带型为102bp的单一条带，在F1中扩增带型为89bp和102bp的两个条带；用A，B，H分别代表来源于P1、P2和杂合的分子标记带型(图6)。根据带型判读结果，保留含有Purler带型的家系播种。
(3)成熟期对保留的每个家系系5株进行拷种，测量平均分枝角度，56个选系的平均分枝角度为38.89°，变幅为28.6-51.6°，明显低于沪油19(68.5°)及其与Purler(24.7°)的平均值46.6°，说明通过分子标记辅助选择小分枝角度的位点，可以明显降低选系的分枝角度，提高选择效率。
实施例8：
分子标记BAIndel76和BAIndel79的引物在油菜分支角度性状育种筛选中的普适性：
选择以下22个材料进行分析：杨J6711，繁168，R2，6098B，浙双8号，华双5号，镇油5号，P10，Trigold，RR001，AV-SAPPHIRE，RR002，Monty，Skipton，0331-1，9905.4，皖油12号，皖油20号，westar，NY7，Nilla，Apomix。利用种子发芽，提取幼芽总DNA，利用分子标记BAInd76和BAInd79进行基因型分析，BAInd76和BAInd79在22个材料中都能扩增出目的条带；BAInd76和BAInd79两个标记在其中15个材料中的带型与Purler一致，在3个材料中的带型与沪油19一致，仅在4个材料中发生了交换，表明本发明的引物产生的分子标记在油菜自然群体中具有一定的普适性(图7)。
因此本发明提供的分子标记在已有的油菜品系中具有普适性，适用于分枝角度小的紧凑型油菜筛选。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院油料作物研究所
<120> 一种与油菜分枝角度性状QTL位点紧密连锁的分子标记及应用
<130> 一种与油菜分枝角度性状QTL位点紧密连锁的分子标记及应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
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<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tacctaattt ctgtaattcg g 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
tgagtaacaa catggacagc 20
Claims (2)
1.一种与油菜分枝角度性状QTL位点紧密连锁的分子标记引物：BAIndel76F：TCAATGCCTCTCTCTTGTCT，BAIndel76R：ATTCGCTGAGAACAAATCAT，BAIndel79F：TACCTAATTTCTGTAATTCGG，BAIndel79R：TGAGTAACAACATGGACAGC。
2.权利要求1所述的分子标记引物在甘蓝型油菜分枝角度性状育种中的应用。
Priority Applications (1)
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| Identification of BnaYUCCA6 as a candidate gene for branch angle in Brassica napus by QTL-seq;Hui Wang等;《Scientific Reports》;20161206;第6卷;第1-10页 * |
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