CN116064900B - 一种与油菜株型角果倾斜角度大小关联的snp分子标记及应用 - Google Patents
一种与油菜株型角果倾斜角度大小关联的snp分子标记及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种与油菜株型角果倾斜角度大小关联的SNP分子标记及应用，属于植物遗传育种技术领域。本发明提供了一种与油菜株型角果倾斜角度大小存在显著相关性的SNP分子标记组合，由四个SNP分子标记组成，分别位于油菜的A2、A5、C2和C5染色体上。在本发明所述的SNP位点，基因型为A/A的角果角度显著小于基因型为G/G的，杂合基因型A/G的超过G/G的。通过对油菜品种SNP位点进行基因型鉴定，即可预测油菜株型角果角度的类型。故利用该标志物可在油菜生育早期鉴定出符合育种目标的油菜种质，对油菜株型角果角度类型的早期和/或快速预测和筛选具有重要意义，利于提高育种效率，加快育种进程，提高经济产量。
Description
技术领域
本发明属于植物遗传育种技术领域技术领域，尤其涉及一种与油菜株型角果倾斜角度大小关联的SNP分子标记及应用。
背景技术
油菜是十字花科作物，是世界第三大油料作物，广泛种植于世界各地，能提供健康、脂肪酸组成合理的食用油和优质的高蛋白饼粕饲料。油菜角果是从茎顶端分生组织状叶衍生而来的一种侧器官。油菜在终花期以后，叶片枯萎脱落，主要靠绿色的角果进行光合作用，籽粒灌浆的干物质有一半以上由角果皮制造提供。因此角果的生长角度对其光能吸收具有重要影响。根据角果和主花序夹角的大小，可以将油菜角果的着生状态分为分为4种类型：直生、斜生、平生和垂生，大多数栽培种都偏向于斜生状态，这种变化有利于促进株型更加紧凑，而且接收阳光后的光合效率更理想，不容易互相遮挡，而调控油菜角果生长角度的遗传机制的研究还未见报道。
其中，植物生长方向是决定作物株型的重要因素。植物生长方向主要受重力调控，植物的重力反应是重力介导的植物生长过程，包括4个步骤，即重力感知、信号转导、生长素的不对称分布和器官的弯曲生长。植物器官相对于重力改变方向的能力称为向重力性(Myers等人，1994)。大多数植物器官，尤其是成熟植物的器官，相对于垂直生长轴保持特定角度，并且与重力矢量不平行。2013年Roychoudhry等人发现植物器官的定向，受向重力机制和依赖生长素的反重力偏移机制的拮抗相互作用控制(Roychoudhryetal.2013)。基于Roychoudhry的动态调控模型下，作物中开展了大量关于株型角度的研究。
株型角度是决定高等植物形态发生的重要组成性状。根和地上部生长方向的动态控制模型已经建立。在Roychoudhry等人模型中，TIR1/AFBAux/IAAARF依赖的生长素信号通路通过调节反重力偏移分量的大小在重力感应中起主导作用。先前的研究分析表明，角果生长过程分为三个阶段，第一阶段与角果的初始伸长和胚胎发育的早期阶段相一致。角果表现出斜向性，但花梗生长角度不随三维斜向生长条件而改变。在第二阶段，随着种子的扩展和分化，角果延长到最大长度，在这一生长期，花梗表现出对三维斜生的特征性生长反应。在最后一个阶段，即胚胎在代谢上变得静止和耐干燥的时期，花梗失去了对重力变化的反应能力。油菜幼苗在微重力实验下，蛋白组变化明显，说明重力因素对基因表达机制产生了重要的影响。但究竟哪些基因产生了影响我们到目前为止并不清楚。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种与油菜株型角果倾斜角度大小关联的SNP分子标记及应用。本发明提供了一种与油菜株型角果倾斜角度大小存在显著相关性的SNP分子标记组合，由四个SNP分子标记组成，分别位于油菜的A2、A5、C2和C5染色体上。在本发明所述的SNP位点，基因型为A/A的角果角度显著小于基因型为G/G的，杂合基因型A/G的超过G/G的。通过对油菜品种SNP位点进行基因型鉴定，即可预测油菜株型角果角度的类型。故利用该标志物可在油菜生育早期鉴定出符合育种目标的油菜种质，对油菜株型角果角度类型的早期和/或快速预测和筛选具有重要意义，利于提高育种效率，加快育种进程，提高经济产量。
为达上述目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明提供了一种与油菜株型角果倾斜角度大小关联的SNP分子标记组合，由四个SNP分子标记Bn-A02-p9706613、Bn-scaff_17725_1-p505212、Bn-scaff_17441_3-p165957、Bn-scaff_17441_3-p68051组成，其核苷酸序列如SEQIDNo.1～SEQIDNo.4所示。
本发明还提供了一种检测油菜SNP标记来源的转化KASP引物组合，其核苷酸序列如SEQIDNo.5～SEQIDNo.16所示。
本发明还提供了一种检测油菜株型角果角度类型的试剂盒，所述试剂盒中含有所述转化KASP引物组合。
本发明还提供了一种油菜株型角果角度类型的判断方法，利用所述SNP分子标记组合鉴定油菜基因组的基因型，然后根据基因型判断油菜株型角果角度类型。
优选的，所述油菜株型角果角度类型的具体判断方法为：如果所述四个SNP分子标记位点的基因型同时为A/A，则油菜株型角果角度类型为直生型；如果所述四个SNP分子标记位点的基因型同时为G/G，则油菜株型角果角度类型为平生型；如果所述四个SNP分子标记位点的基因型同时为A/G，则油菜角果倾斜株形为垂生型；如果四个SNP分子标记位点的基因型为A/A、G/G和A/G混合类型，则油菜角果倾斜株形为斜生型。
优选的，所述油菜基因组基因型的检测时期为油菜苗期。
优选的，所述油菜基因组为油菜植株的基因组，具体为油菜根、茎、叶、花、种子及子叶中的任一一种或多种。
本发明还提供了所述SNP分子标记组合、所述转化KASP引物组合、所述试剂盒或所述判断方法在油菜育种中的应用。
优选的，所述应用具体为在油菜株型角果角度类型早期和/或快速预测、筛选中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供了由四个SNP位点组成的油菜株型角果角度类型选育的分子标记组合及其引物组合，可以定向选择角果角度小，倾斜型和直立型的油菜资源或品系。前期油菜育种家比较过直生、斜生、平生和垂生油菜的产量，发现直生和斜生类型比平生和垂生类型油菜，产量显著提升。本发明旨在以果柄角和角果角为测定和衡量指标，为选育斜生型和直生型油菜角果分枝类型的品种或品系提供技术支持，为研究油菜理想株型提供方法，进而最终提高油菜的经济产量。
(2)本发明利用优选标志物可在油菜生育早期鉴定出符合育种目标的油菜种质，对油菜株型角果倾斜角度水平的早期预测和筛选具有重要意义，也有利于提高育种效率，加快育种进程。
附图说明
图1为实施例1中油菜株型角果角度类型示意图；
图2为实施例1中通过Tasselv5.0混合线性模型(MLM)绘制的136份油菜的角度相关性状图，其中：(A)果柄角(APR)果梗至茎部角度的曼哈顿图；(B)果柄角(APR)果梗至茎部角度的Q-Q图；(C)角果角(APP)角果与果梗夹角的曼哈顿图；(D)角果角(APP)角果与果梗夹角的Q-Q图；
图3为实施例1中由芯片peak SNP转化开发的4个KASP标记图；
图4为实施例1中角果角显著关联位点等位变异与表型显著性统计图，其中：(A)果柄角APR关联两个SNP等位变异与果柄角差异的散点图，有显著性统计；(B)角果角APP关联两个SNP等位变异与角果角差异的散点图，有显著性统计(*:P<0.05；**:P<0.01)。
具体实施方式
下列实例将进一步说明发明的具体步骤以及特征，该等实例仅为示例而用，并非对本发明的限制。本发明中所使用的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。本发明中涉及到的试剂和材料非特殊说明均为市售。
实施例1
1.角果倾斜角度测定
中国农业科学院油料作物研究所油菜杂交育种课题组，2013年从我国油菜主产区和澳大利亚，加拿大等地收集油菜常规品种(系)，共收集136份油菜种质材料，详情如表1所示，所有材料信息以论文形式已公开公布，详见Liu et al.,2016。于2014年将这些种质材料种植于贵州遵义，湖北武汉阳逻和安徽六安试验地，材料分为两个重复，采用随机区组实验排列小区。标准大田实验种植，每小区3行，行长1.8米，行间距0.33米，每行定植15株。2015年分别对关联分析群体和验证群体进行性状测定。鉴定方法参考专利“一种基于图像处理的高通量测定植物株型的方法”(ZL201410225181.8)。
表1 136份油菜种质材料的详细信息
注：所有材料信息以论文形式已公开公布，详见Liu et al.,2016。
Liu et al.,2016相关信息：
Liu J#,Wang J#,Wang H,Wang WX,Mei DS,Zhou RJ,Cheng HT,Yang J,Raman H*,Hu Q*.Multigenic control of pod shattering resistance in Chinese rapeseedgermplasm revealed by genome-wide association and linkage analyses.Frontiersin Plant Science,2016,7:1058。
油菜角果生长发育及角果倾斜类型如图1示意图所示，由图1可知，关联群体角果倾斜角度有两个定量指标，分别是果柄角(Angle of pedicel to raceme,APR)和角果角(Angle of pod to pedicel,APP)。
两个定量指标果柄角和角果角在三个环境下统计分析结果如表2所示。
表2关联分析群体角果倾斜角度两个指标在三个环境下统计分析结果
*:P<0.05；**:P<0.01
由表2可知，果柄角的变异范围为59°～109°，三个环境都为正态分布，主要受基因型控制，受一定环境效应影响；角果角的变异范为142.59°～178.75°之间，三个环境下都为正态分布，主要受基因型控制，受环境效应影响显著。
2.SNP的获得
在芯片检测结果质量控制后获得用于后续GWAS分析的SNPs(次要等位基因频率>0.05，缺失数据<20％)，共得到21426个SNPs(单核苷酸多态性)。获取高质量SNP位点用于GWAS分析，主成分分析采用Tassel5.0软件处理。
3.油菜株型角果倾斜角度关联
采用TASSEL5.0(BRADBURYetal.,2007)软件中的MLM-Qmatirx模型(MLM为混合线性模型，Qmatrix代表以群体结构作为协变量进行校正)，对核心种质的角果倾斜角度性状进行全基因组关联分析，获得四个显著关联SNP位点，具体信息见图2、表3和表4。
表3油菜株型角果倾斜角度显著相关SNP位点
表4四个SNP位点的核苷酸序列
4.关联芯片SNP转化成KASP标记
因为角果倾斜角度关联标记1Bn-A02-p9706613、角果倾斜角度关联标记2Bn-scaff_17725_1-p505212、角果倾斜角度关联标记3Bn-scaff_17441_3-p165957和角果倾斜角度关联标记4Bn-scaff_17441_3-p68051因为来源于油菜基因组芯片，很难直接大批量检测筛选育种材料，所以我们将其转化成对应的KASP标记，可以降低这些位点的检测难度，提高检测的便携性。具体过程如下：
样本处理
(1)每份油菜品种(系)取长宽约1cm的幼嫩叶片放入深孔板中(96孔1.2ml)；
(2)加入100μL的0.3M氢氧化钠，使用海净信组织研磨仪50HZ磨样2min，至样品完全磨碎；
(3)研磨后3000rpm离心1min，沸水浴2min；
(4)加入200μL0.2MTris-HCl(pH6.8-7.0)后混匀，再次沸水浴2min；
(5)水浴完成后3000rpm离心1min，取上清液稀释20倍，-20℃冻存，作为后续PCR扩增的模板。
PCR扩增
使用双头384PCR仪ABIGeneAmp9700进行PCR扩增，其反应体系和反应条件如表5和表6所示。
表5 PCR扩增反应体系
表6 PCR扩增反应条件
基因分型
PCR完成后，使用TECANinfiniteM1000酶标仪读取荧光信号，然后利用在线软件snpdecoder(http://www.snpway.com/snpdecoder/)解析转换荧光信号，得到清晰直观的分型图，并根据颜色不同，输出基因型结果，具体检查结果如图3所示。根据4个关联芯片SNP转化的KASP标记详情如表7所示。
表7根据4个关联芯片Peak SNP转化的KASP标记
结果可知，使用本发明的方法可以清晰分析出AA、GG和AG基因型。
5.KASP标记的验证
构建了由表1中R1和R2作为亲本的96份油菜遗传分离验证群体，测定其株型角果倾斜角度，发现其果柄角APR变异范围为60.05％～92.20％，极差为32.15％。群体角果角变异范围为141.45％～175.87％，极差为33.42％。98份系在Bn-A02-p9706613、Bn-scaff_17725_1-p505212、Bn-scaff_17441_3-p165957和Bn-scaff_17441_3-p68051位点的基因分型及角果倾斜角度见图4。
结果显示，该四个SNP位点与油菜株型角果倾斜角度显著相关。A/A基因型株型角果倾斜角度最低，G/G基因型株型角果倾斜角度最高，A/G杂合基因型株型角果倾斜角度较G/G基因型更大。使用该四个SNP位点，如果所述四个SNP分子标记位点的基因型同时为A/A，则油菜株型角果角度类型为直生型；如果所述四个SNP分子标记位点的基因型同时为G/G，则油菜株型角果角度类型为平生型；如果所述四个SNP分子标记位点的基因型同时为A/G，则油菜角果倾斜株形为垂生型；如果四个SNP分子标记位点的基因型为A/A、G/G和A/G混合类型，则油菜角果倾斜株形为斜生型。
由图4也可知，验证群体中该位点不同等位基因间角果倾斜角度存在差异，说明该位点真实有效，可用于角果倾斜角度的分子标记辅助选择。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.一种检测油菜SNP标记来源的转化KASP引物组合，其特征在于，所述SNP标记为一种SNP分子标记组合，所述SNP分子标记组合由四个SNP分子标记Bn-A02-p9706613、Bn-scaff_17725_1-p505212、Bn-scaff_17441_3-p165957、Bn-scaff_17441_3-p68051组成，其核苷酸序列如SEQIDNo.1~SEQIDNo.4所示；所述转化KASP引物组合的核苷酸序列如SEQIDNo.5~SEQIDNo.16所示。
2.一种检测油菜株型角果角度类型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1所述的转化KASP引物组合。
3.一种油菜株型角果角度类型的判断方法，其特征在于，利用权利要求1所述的转化KASP引物组合中的SNP分子标记组合鉴定油菜基因组的基因型，然后根据基因型判断油菜株型角果角度类型；所述油菜为甘蓝型油菜。
4.根据权利要求3所述的判断方法，其特征在于，所述油菜株型角果角度类型的具体判断方法为：如果所述四个SNP分子标记位点的基因型同时为A/A，则油菜株型角果角度类型为直生型；如果所述四个SNP分子标记位点的基因型同时为G/G，则油菜株型角果角度类型为平生型；如果所述四个SNP分子标记位点的基因型同时为A/G，则油菜角果倾斜株形为垂生型；如果四个SNP分子标记位点的基因型为A/A、G/G和A/G混合类型，则油菜角果倾斜株形为斜生型。
5.根据权利要求4所述的判断方法，其特征在于，所述油菜基因组基因型的检测时期为油菜苗期。
6.根据权利要求5所述的判断方法，其特征在于，所述油菜基因组为油菜植株的基因组，具体为油菜根、茎、叶、花、种子及子叶中的任一一种或多种。
7.权利要求1所述的转化KASP引物组合、权利要求2所述的试剂盒或权利要求3~6任一所述的判断方法在油菜育种中的应用，其特征在于，所述应用中所述油菜为甘蓝型油菜。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用具体为在油菜株型角果角度类型早期和/或快速预测、筛选中的应用。
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