CN110358854B - 一个甘蓝型油菜主花序角果数性状的主效qtl位点、snp分子标记开发及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种甘蓝型油菜主花序角果数性状的主效QTL位点，位于甘蓝型油菜的A02染色体的第5580417位碱基～第7113686位碱基之间。较佳地，对甘蓝型油菜主花序角果数性状的贡献率为10.6％。与第一SNP分子标记紧密连锁，第一SNP分子标记位于第5580417位碱基，为C或T，该突变导致多态性。与第二SNP分子标记紧密连锁，第二SNP分子标记位于第7113686位碱基，为A或C，该突变导致多态性。与峰值SNP分子标记紧密连锁，峰值SNP分子标记位于第6926697位碱基，为A或C，该突变导致多态性。还提供了相关的SNP分子标记及应用。本发明的甘蓝型油菜主花序角果数性状的主效QTL位点对甘蓝型油菜主花序角果数性状的贡献率高，对甘蓝型油菜主花序角果数的调控起着关键作用，可用作图位克隆和分子标记辅助选择，适于大规模推广应用。

Description

一个甘蓝型油菜主花序角果数性状的主效QTL位点、SNP分子标记开发及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学及油菜育种技术领域，特别涉及甘蓝型油菜主花序角果数性状技 术领域，具体涉及甘蓝型油菜主花序角果数性状的主效QTL位点紧密连锁的SNP分子标记及应用。

背景技术

油菜(Brassica napus)是十字花科芸薹属植物中的一种重要的油料作物，napus)是世界 范围内广泛种植的主要油料作物，也是我国唯一的冬季油料作物。因此国家把发展油菜生产 作为保证食用油安全供应的重点，具有重要的现实意义。我国甘蓝型油菜由于具有抗病、产 量高、适应性广、耐逆行性强等特点，成为主要栽培品种。油菜增产主要通过期高单位面积 菜籽产量、期高菜籽含油量和扩大种植面积三种途径。油菜育种工作者现在的主要目标是努力期高含油量、产量和品质。由于油菜的含油量、产量、品质等性状为复杂的数量性状，受 环境的影响较大，依靠传统的育种方法和技术在现有的基础上很难有较大的突破，因此将数 量遗传学和分子标记技术相结合，为油菜遗传育种的发展期供了新的机会。

基于SNP的分子标记技术被认为是继RFLP和SSR之后出现的第三代分子标记，是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异或只有小的缺失、突变、插入等，通过基于测序或PCR的DNA芯片技术等方法可以实现自动化批量检测，因而在基因定位的研究中有着不可比拟的优越性和潜力。

现有技术中，任义英等(中国农业科学，2018)指出油菜高产是育种工作的主要研究目 标之一。角果密度、主花序有效角果数等性状与产量都有显著或极显著的正相关关系，是油 菜高产育种考查的主要性状。目前，油菜角果密度及其相关性状的QTL研究还停留在初步 定位阶段，后续研究报道较少。近年来，随着一些植物全基因组测序的完成，分子标记的开发和生物信息学的迅速发展，关联分析己成为植物数量性状基因研究的热点之一。尽管已有 油菜角果数及其相关性状的QTL的研究报道，但多数为初步定位阶段。因此，借助分子标 记和数量性状位点(QTL)定位，在分子水平对甘蓝型油菜主花序角果数的数量性状进行进一步 研究，将有助于选育角果数多和高油的油菜品种，同时为揭示油菜角果数量及其相关性状的 遗传机理和分子机制奠定基础。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明的一个目的在于提供一种甘蓝型油菜主花 序角果数性状的主效QTL位点的SNP分子标记，所述的甘蓝型油菜主花序角果数性状的主效QTL位点位于甘蓝型油菜的A02染色体的第5580417位碱基～第7113686位碱基之间，对 甘蓝型油菜主花序角果数性状的贡献率高，对甘蓝型油菜主花序角果数的调控起着关键作用， 可用作图位克隆和分子标记辅助选择，适于大规模推广应用。

优选地，所述的甘蓝型油菜主花序角果数性状的主效QTL位点与SNP分子标记紧密连 锁，所述SNP分子标记为第一SNP分子标记、第二SNP分子标记和/或峰值SNP分子标记。

优选地，所述第一SNP分子标记位于甘蓝型油菜的A02染色体的第5580417位碱基，所 述第5580417位碱基为C或T，该突变导致多态性。

优选地，所述第二SNP分子标记位于甘蓝型油菜的A02染色体的第7113686位碱基，所 述第7113686位碱基为A或C，该突变导致多态性。

优选地，所述峰值SNP分子标记位于甘蓝型油菜的A02染色体的第6926697位碱基，所 述第6926697位碱基为A或C，该突变导致多态性。

本发明的另一目的在于提供上述甘蓝型油菜主花序角果数性状的主效QTL位点的SNP 分子标记的应用。

优选地，其用于检测甘蓝型油菜主花序角果数的多少，或用于预测甘蓝型油菜主花序角 果数的多少，或用于对甘蓝型油菜主花序角果数的多少进行有效选择。

优选地，其用于甘蓝型油菜的分子标记辅助育种，或用于加速甘蓝型油菜高产育种的进 程。

本发明的另一目的在于提供上述甘蓝型油菜主花序角果数性状的主效QTL位点的SNP 分子标记的引物或探针。

优选地，所述引物或探针是以包含甘蓝型油菜chrA02_5580417(C/T)的前后各400bp 序列(共801bp)DNA片段为模板设计的，所述DNA片段如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述引物或探针是以包含甘蓝型油菜chrA02_7113686(A/C)的前后各400bp 序列(共801bp)DNA片段为模板设计的，所述DNA片段如SEQ ID NO:2所示。

优选地，所述引物或探针是以包含甘蓝型油菜chrA02_6926697(A/C)的前后各400bp 序列(共801bp)DNA片段为模板设计的，所述DNA片段如SEQ ID NO:3所示。

优选地，所述引物或探针标记有荧光基团，所述荧光基团包括FAM、HEX、VIC、ROX。

本发明的另一目的在于提供上述甘蓝型油菜主花序角果数性状的主效QTL位点的SNP 分子标记的引物或探针在检测和/或预测甘蓝型油菜主花序角果数，或甘蓝型油菜的分子标记 辅助育种中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供一种甘蓝型油菜主花序角果数性状的主效QTL位点，其与SNP分子标 记紧密连锁，其对甘蓝型油菜主花序角果数性状的贡献率高，对甘蓝型油菜主花序角果数的 调控起着关键作用，可用作图位克隆和分子标记辅助选择，适于大规模推广应用。

(2)本发明的甘蓝型油菜主花序角果数性状的主效QTL位点的SNP分子标记，包括位 于甘蓝型油菜的A02染色体的第5580417位碱基的SNP分子标记、位于甘蓝型油菜的A02染色体的第7113686位碱基的SNP分子标记和位于甘蓝型油菜的A02染色体的第6926697 位碱基的峰值SNP分子标记，其可以检测甘蓝型油菜主花序角果数的多少，可以预测甘蓝型油菜主花序角果数的多少，可以对甘蓝型油菜主花序角果数的多少进行有效选择，还可以用 于主花序角果数多的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种，加速甘蓝型油菜高产育种的进程，适 于大规模推广应用。

(3)本发明具体提供了三种甘蓝型油菜主花序角果数性状的SNP分子标记，其中峰值 SNP标记为：chrA02_6926697(A/C)，对应主花序角果数表型分组为：当chrA02_6330026位 置的SNP为A时，材料的平均主花序角果数为54.0个；C时，材料的平均主花序角果数为60.5个；该峰值SNP的贡献率为10.6％；

主花序角果数性状的一个边界SNP标记为：chrA02_5580417(C/T)，对应主花序角果数 表型分组为：当chrA02_5580417位置的SNP为C时，材料的平均主花序角果数为60.5个； T时,材料的平均主花序角果数为54.8个；该边界SNP的贡献率为9.2％；

主花序角果数性状的另一个边界SNP标记为：chrA02_7113686(A/C)，对应主花序角果 数表型分组为：当chrA02_7113686位置的SNP为A时，材料的平均主花序角果数为53.8个； C时,材料的平均主花序角果数为60.5个；该边界SNP的贡献率为10.6％。

附图说明

图1是本发明的甘蓝型油菜主花序角果数性状的分布结果的示意图，即关联群体主花序 角果数表型频率分布图。

图2是本发明的甘蓝型油菜主花序角果数性状的主效QTL位点定位示意图，即关联群 体主花序角果数性状关联分析曼哈顿图。

图3是本发明中利用甘蓝型油菜主花序角果数性状的主效QTL位点的峰值SNP分子标 记进行等位分析的示意图，即主效QTL位点的峰值SNP(chr02_6926697)分子标记等位分析图。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步详细说明，以使本领域技术人员能够更好地理解 本发明并予以实施，但实施例并不作为本发明的限定。

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等， 如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1甘蓝型油菜主花序角果数性状的表型的测定

1.关联群体的主花序角果数表型的测定

(1)对324份来源世界各地的甘蓝型油菜高世代品系构成自然群体，在武汉市阳逻试验 基地和扬州市农科院试验基地完成3年2点的主花序角果数性状调查。

(2)采用直播定苗,行距33cm,株距15cm，每个小区4行，随机设计三个重复。试验材料田块四周种植保护行。

(3)主花序角果数：每个小区取10株，统计每株主花序上含有一粒以上饱满或欠饱满 种子的角果数。

(4)用BLUP方法(http://www.extension.org/pages/61006)对多年多点表型数据进行整合， 得到主花序角果数育种值做为主花序角果数表型。

将324份材料的所有环境的表型值平均，结果汇总如下：

表1 324份材料的所有环境的主花序角果数表型值(个)

关联群体的主花序角果数分布结果表明主花序角果数性状表现分布呈连续性分布，呈正 态分布，证明主花序角果数性状属于数量性状且存在主效基因位点，如附图1所示。

2.关联群体高质量SNP数据集的获得

采用CTAB方法提取叶片总DNA，提取关联群体的每份材料的叶片总DNA，具体方法为：

将幼嫩叶片置10％乙醇中漂洗；然后剪取0.1-0.2g叶片放入碾钵中，利用液氮快速碾磨 至粉末状，装入2mL离心管中；加入预热DNA提取液700μL；混匀后置65℃水浴锅中1h，每10-15min混匀1次；加入700μL混合液(苯酚：氯仿:异戊醇＝25∶24∶1)，轻轻颠 倒混匀10min；室温下，10 000×g离心15min；吸取上清液至新的2mL离心管中；加入等 体积混合液(氯仿∶异戊醇＝24∶1)，颠倒混匀，静置5min，10000×g，离心15min，用枪 吸取上清液到新的离心管中；加入2倍体积无水乙醇，混匀后在–20℃静置1h，10 000×g，离心10min，弃上清液；再加入500μL预冷的75％乙醇洗涤沉淀，去上清液；经过连续2 次洗涤沉淀后，晾干；加入含有2％RNase A溶液100μL，在37℃静置1h后4℃过夜；用 等体积混合液(氯仿∶异戊醇＝24∶1)再次抽提DNA溶液，颠倒混匀，静置10min，10 000 ×g，离心15或20min，去除RNase A，吸取上清液(约60μL)，再次离心，1min；利用 琼脂糖凝胶电泳(0.8％)和紫外分光光度计检测DNA浓度、质量及完整性；确定所有DNA 样品的吸光度260/280比值在1.8-2.0之间。然后将DNA样品干冰运输至测序公司(华大基 因科技有限公司)，每个材料测序深度大约为7×。

根据上文描述获得高质量DNA后，测序公司(华大基因科技有限公司)进行7×覆盖深 度的测序后返回的数据，先使用FastQC软件进行测序质量评估，然后对测序序列进行adapter 和低质量reads过滤。得到每个材料的双端测序的clean data，然后使用bwa软件进行mapping 以及GATK软件进行变异检测，得到关联群体总的SNP数据集后，根据最小等位基因频率≥ 0.05，缺失率≤0.1和杂合率≤0.1进行SNP数据集质量过滤，最终得到高质量的群体SNP数 据集用于后续分析。

3.全基因组关联分析

使用plink软件对上一步产生的高质量SNP数据集的VCF文件进行格式转换，然后使用 EMMAX软件将得到的主花序角果数表型和SNP数据集进行全基因关联分析，得到主花序角 果数性状每个位点的P值，当P值小于7.2×10-7的SNP即为显著SNP，P值最小的SNP即为峰值SNP，将峰值SNP在群体中的不同等位基因类型将材料进行分组，进行方差分析，组间方差与总方差的比值的百分比，即为该峰值SNP的贡献率。

通过分析，将甘蓝型油菜主花序角果数性状的主效QTL位点的区间限定在甘蓝型油菜的 A02染色体的第5580417位碱基～第7113686位碱基之间，对应的SNP为chrA02_5580417 (C/T)，chrA02_7113686(A/C)，峰值SNP为：chrA02_6926697(A/C)，该QTL对甘蓝型油 菜主花序角果数性状的贡献率为10.6％(根据峰值SNP的不同等位基因类型将材料分组，进 行单因素方差分析，组间方差除以总方差的百分比即为贡献率)。

主花序角果数性状的峰值SNP为：chrA02_6926697(A/C)，对应主花序角果数表型分组 为：当chrA02_6926697位置的SNP为A时，材料的平均主花序角果数为54.0个；C时， 材料的平均主花序角果数为60.5个，如附图2所示，该峰值SNP的贡献率为10.6％。

主花序角果数性状的其中一个边界SNP为：chrA02_5580417(C/T)，对应主花序角果数 表型分组为：当chrA02_5580417位置的SNP为C时，材料的平均主花序角果数为60.5个； T时,材料的平均主花序角果数为54.8个；该边界SNP的贡献率为9.2％。

主花序角果数性状的另一个边界SNP为：chrA02_7113686(A/C)，对应主花序角果数表 型分组为：当chrA02_7113686位置的SNP为A时，材料的平均主花序角果数为53.8个；C时,材料的平均主花序角果数为60.5个；该边界SNP的贡献率为10.6％。

甘蓝型油菜的全基因组序列已经公布，包含chrA02_5580417(C/T)的前后各400bp序 列(共801bp)如SEQ ID NO:1所示，包含chrA02_7113686(A/C)的前后各400bp序列(共801bp)如SEQ ID NO:2所示，包含chrA02_6926697(A/C)的前后各400bp序列(共801bp) 如SEQ ID NO:3所示。本领域技术人员可以采用常规方法根据已知序列设计检测SNP位点 的特异性引物或探针，所述引物或探针还可通过本领的常规技术标记有荧光基团，如FAM、HEX、VIC、ROX等，以及淬灭基团如BHQ1或TAMRA，从而可以通过本领域的常规方法 如测序或PCR等方法检测上述SNP位点的基因型，由此可以检测甘蓝型油菜主花序角果数的多少，预测甘蓝型油菜主花序角果数的多少，进而对甘蓝型油菜主花序角果数的多少进行 有效选择，用于主花序角果数多的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种，加速甘蓝型油菜高产育 种的进程。

因此，本发明通过主花序角果数性状的表型分析和全基因组重测序，然后进行全基因组 关联分析，在甘蓝型油菜第A02号染色体上检测到一个甘蓝型油菜主花序角果数性状的主效 QTL位点，对甘蓝型油菜主花序角果数的贡献率为10.6％。该甘蓝型油菜主花序角果数性状的主效QTL位点位于甘蓝型油菜的A02染色体的第5580417位碱基～第7113686位碱基之间， 边界显著SNP为chrA02_5580417(C/T)，chrA02_7113686(A/C)，峰值SNP为chrA02_6926697 (A/C)，根据该与主效QTL位点紧密连锁的SNP分子标记，可以用于检测甘蓝型油菜主花序 角果数的多少，可以用于预测甘蓝型油菜主花序角果数的多少，可以用于对甘蓝型油菜主花 序角果数的多少进行有效选择，还可以用于主花序角果数多的甘蓝型油菜的分子标记辅助育 种，加速甘蓝型油菜高产育种的进程。

通过本发明公布的SNP分子标记进行分子标记辅助选择，鉴定方法简单，选择效率高， 可预测甘蓝型油菜主花序角果数。选择目标明确，不受环境的影响。可在甘蓝型油菜生育早 期鉴定出主花序角果数多的甘蓝型油菜单株，淘汰其它单株。综上，本发明的甘蓝型油菜主花序角果数性状的主效QTL位点对甘蓝型油菜主花序角果数性状的贡献率高，对甘蓝型油菜 主花序角果数的调控起着关键作用，可用作图位克隆和分子标记辅助选择，适于大规模推广 应用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之 内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 一个甘蓝型油菜主花序角果数性状的主效QTL位点、SNP分子标记开发及应用

<130> 201910521682.3

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 801

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus, L.）

<400> 1

ctagtgccga tgagagcact tggtccggat agttggaaga ttgcagctgc tctcatgggg 60

aggcatatcg gtggaggtag cttagctcca tttgtatctt ctactttctc gaggatgctg 120

attttgtttc atttctctct tatagttttg gattgtgcat tttgattgtt gttgttttgt 180

ccagctgtca actatgttgc catagccaat gctcttgaag tttctccatc agtgttagct 240

gctggactcg ctgctgataa cgttatttgc gctgtttatt tcacgtcttt gttcgctatt 300

ggctccaaaa tacctgctga aactctacct ccaccaacta gtggtaaagt ctgaatgtta 360

gctgtgatgt ttggatagac tcagtttttg aactctctaa cttagatgtt gcgctcccgt 420

gtacagatgc agagacgagc aaaggttctg aaactgaaaa caaaatccct gtgctactga 480

tagctactgg aatcgctgtg tcattagcta tatgcaaggt tggggctttg ctaacaaagc 540

atttcggggt ttcgggtggt agcttgccag ctataaccgc cgtggttgtt gttttagcga 600

ctgtcttccc ctcccagttt ggtcgtcttg ctccatctgg agaagccatg gctctgattc 660

ttatgcaggt acgtgtgaga gagaatctta cacactttca ttttcaagaa cagagcaaag 720

tttctgaaaa atttatatat caaactactt tttttcgttc aggtgttctt cactgtgata 780

ggtgcgagcg gaaacatatg g 801

<210> 2

<211> 801

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus, L.）

<400> 2

cagtcattaa caaccataat gaacatatct aaagctgcaa gaaagactgc aataatctta 60

accactagca aagtaacatc taagagcttg aagataagca tccctaaaac aaccttaagt 120

cgttcgtgag cttcagcaat agctctacca tccttctttc tgcgccattg atgaccatct 180

ttacggaaga acttaagaac ccttctattg aaaagataca aagacccacc tgagacaaca 240

aagttgcaac cttttgtatc aaaacctaaa tctcaaaact agtaaagaaa gagtaaaagt 300

caaacttact gggagggttt tgaggtggcg tatgtgctag ctgatagcgt tcatgattct 360

gcaaaatgaa gtgcacctca gggggtttca accaacgagt ctgagcttca tggtacagat 420

tactaatctc gtattctata caaacaaaca aacgaaaggt ttagccttta gtcatcggaa 480

gacagaagaa acgaaaggtt taacctttag cccttctgtg ttgagaaact caccagactg 540

cataatgatc tatggattga ggaatcaatc tactatgctc tcgacacaaa caagaggatc 600

agagtttggt ctgcgttcct aggatgttcg caaatgattg attaagataa ggatcgtaac 660

taagagagag aggagtcggt aaagagtatt taacgataaa gaagatgatt tttaagaaag 720

aaaggagtaa ggtgttaaaa attgactatg agactgacca agtttctctg ggaacagcag 780

aggacgcttc cgacagatag c 801

<210> 3

<211> 801

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus, L.）

<400> 3

gtctgcatag aaacaaacaa aacatgtgtt atgagaaaca tgttttagac ttttgattaa 60

aaaccaaaac ctgaaaattg caacaatacc tagcagcaaa aagatcaata acaagaagat 120

gaatccaagc agaagcaaga gtcatttcac ttgagaacat tttcgctatt ccagacaact 180

gcaaataacc aaaaaagaga gagagagaga ggaaaacatt tagtagctac tatgaaacat 240

tgttatagag tttgtattga aaacaaacct ctggcaacaa gtatttactg gaaaacatgt 300

atttgagcgt ttcaggtgtc caagaaaggt acaacaaata cgcgtataat acgcctaaga 360

cgacatacgg tatgctactc tccatacact tcttggtctg cacagaaaga gaaaacacat 420

atattcaatt tcagatgaaa acctctcata gttctgcaca ggaagttgta agactgtaac 480

aaagaaaagg actcacaatt tcagctttag gagctacaac catcagagtg taaaaaggaa 540

gaaccgcggt tgttccgaca gcaaatacac tgcttgcgat ttgagacgta gccatccctg 600

aacatcaaca tgtttttagt ctgaaatcac tagaatctct cgacaaagtt taaggcctca 660

atgttttcag ttaaaaagag acattacatg aagctcgtac gcaggagcgt ttcttgtgaa 720

caagggagga cgaattggat gggaaaagaa cgattcttga tcctccgttg aagctccaac 780

gattatggaa tcgaatcttt a 801

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctggactcgc tgctgataac 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tctgcatctg tacacgggag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttttgaggtg gcgtatgtgc 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

caacacagaa gggctaaagg t 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gagcgtttca ggtgtccaag 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

acaacttcct gtgcagaact 20

Claims (2)

1.一种甘蓝型油菜主花序角果数性状的主效QTL位点的SNP分子标记的引物或探针在检测和/或预测甘蓝型油菜主花序角果数，或甘蓝型油菜的分子标记辅助育种中的应用；

所述甘蓝型油菜主花序角果数性状的主效QTL位点的SNP分子标记为以下中的任意一种或多种：

第一SNP分子标记位于SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的第401位碱基，所述第401位碱基为C或T；当这个位点为C时，相较于为T时具有更高的主花序角果数；

第二SNP分子标记位于SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的第401位碱基，所述第401位碱基为A或C；当这个位点为C时，相较于为A时具有更高的主花序角果数；

第三SNP分子标记位于SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的第401位碱基，所述第401位碱基为A或C；当这个位点为C时，相较于为A时具有更高的主花序角果数。

2.一种油菜育种方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待检测的油菜的基因组，对甘蓝型油菜主花序角果数性状的主效QTL位点的SNP分子标记进行检测，筛选出主花序角果数多的品种继续进行繁育；

所述甘蓝型油菜主花序角果数性状的主效QTL位点的SNP分子标记为以下中的任意一种或多种：

第一SNP分子标记位于SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的第401位碱基，所述第401位碱基为C或T；当这个位点为C时，相较于为T时具有更高的主花序角果数；

第二SNP分子标记位于SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的第401位碱基，所述第401位碱基为A或C；当这个位点为C时，相较于为A时具有更高的主花序角果数；

第三SNP分子标记位于SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的第401位碱基，所述第401位碱基为A或C；当这个位点为C时，相较于为A时具有更高的主花序角果数。

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