CN111269998B - 甘蓝型油菜有限花序基因Bnsdt2连锁的分子标记及应用 - Google Patents

甘蓝型油菜有限花序基因Bnsdt2连锁的分子标记及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了甘蓝型油菜有限花序基因Bnsdt2连锁的分子标记及应用，涉及油菜育种及分子遗传学技术领域，本发明的分子标记序列为8对SSR引物序列中的任一所示，基于以上SSR标记的优点，本发明利用甘蓝型油菜基因组数据库，开发并成功筛选出与甘蓝型油菜有限花序基因Bnsdt2紧密连锁的SSR分子标记，构建了Bnsdt2基因的分子遗传图谱，为克隆该基因及利用该分子标记进行甘蓝型油菜有限花序分子辅助育种，加快育种进程奠定了基础，本发明具有检测方便，扩增稳定，重复性和准确率高等优点。

Description

甘蓝型油菜有限花序基因Bnsdt2连锁的分子标记及应用
技术领域
本发明属于油菜育种及分子遗传学技术领域，具体涉及甘蓝型油菜有限花序基因Bnsdt2连锁的分子标记及应用。
背景技术
油菜是全世界非常重要的油料作物，栽培种有甘蓝型油菜(B.napus，AACC，2n＝38)、芥菜型油菜(B.juncea，AABB，2n＝36)和白菜型油菜(Brassica rapa，AA，2n＝20)。目前，我国甘蓝型油菜在三个油菜栽培种中种植面积最大。天然甘蓝型油菜是无限花序，由于具有无限生长习性，其在生产上存在一些缺陷，如：植株较高、易倒伏；整齐度不好；生育期过长，熟期不一致。随着农作物机械化的实现，克服无限花序生长习性的不足，是育种家必须面临的问题，而实现植物从无限花序向有限花序转变为育种家提供了新思路。目前有研究表明，甘蓝型油菜有限花序突变体具有降低株高、抗倒伏、生育期提前、对产量无负面影响等特性(李开祥，2017；杜德志等，2018)，基本克服了甘蓝型油菜无限花序生长习性的不足。近年来，随着甘蓝型油菜有限花序性状相关研究的开展，现有研究结果表明：油菜有限花序性状是由两对隐性基因(分别为Bnsdt1，Bnsdt2)控制的质量性状。
目前选育有限花序品系的方法如下：将具有有限花序性状的品系作为供体亲本，通过杂交和回交，经多代表型鉴定后转育到其他性状优良的品系中。但是传统转育有限花序性状过程中每杂交或回交一次，需要自交产生有限花序性状植株，避免有限花序基因丢失；这会造成费时费力，极大的延缓了育种进程。因此为了加快甘蓝型油菜有限花序品系的育种速度，利用现代的分子生物技术，进行分子标记辅助育种十分必要。
随着分子生物学技术的快速发展，多种基于DNA多态性的分子技术应运而生，并广泛应用于遗传育种研究的各个领域。简单序列重复(simple sequence repeats，SSR)，又称为微卫星DNA(microsatellite，DNA)，是一类由1-6个核苷酸串联重复组成的DNA序列如(CA)n，(ATG)n，(TAGG)n等重复，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置，由于重复次数的不同和重复程度的不完全造成了每个位点的多态性，包括SSR标记和EST-SSR标记两种类型。其中，SSR标记具有共显性、重复性好、多态性丰富、易于检测等优点，已广泛应用于植物遗传多样性分析、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等研究领域(
Figure BDA0002371000100000011
1994；Powell et al.，1996)。
因此，基于以上SSR标记的优点，申请人利用甘蓝型油菜基因组数据库，开发并成功筛选出与甘蓝型油菜有限花序基因Bnsdt2紧密连锁的SSR分子标记，并构建了Bnsdt2基因的分子遗传图谱，为克隆该基因及利用该分子标记进行甘蓝型油菜有限花序分子辅助育种，加快育种进程奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于：由于甘蓝型油菜有限花序性状在油菜育种中具有重要作用，因此结合现阶段油菜育种中实际问题：
1、表型鉴定工作量较大：传统转育过程中需要较大的分离群体；
2、选择效率较低：在转育有限花序性状过程中每杂交或回交一次，需要自交产生有限花序性状植株，避免有限花序基因丢失；这会造成费时费力，极大的延缓了育种进程。
本发明的目的是利用现代的分子生物技术，对甘蓝型油菜有限花序性状进行分子标记辅助选择，加快育种速度。本发明拟解决的技术问题如下：
1、提供与甘蓝型油菜有限花序基因Bnsdt2紧密连锁的SSR分子标记
目前，关于甘蓝型油菜有限花序基因Bnsdt1紧密连锁的SSR分子标记已经公布，本发明通过提供与甘蓝型油菜有限花序基因Bnsdt2紧密连锁的SSR分子标记，再结合与有限花序基因Bnsdt1紧密连锁的SSR分子标记用于甘蓝型油菜有限花序性状转育，对甘蓝型油菜有限花序性状进行分子标记辅助选择，加快育种速度。
2、提高选育过程中的选择效率
本发明在转育过程中用与有限花序基因紧密连锁的两侧共显性标记对回交后代分离群体单株进行目的基因追踪选择，避免目的基因的丢失，提高选择效率，提供与甘蓝型油菜有限花序基因Bnsdt2连锁的分子标记及应用。
本发明采用的技术方案如下：
甘蓝型油菜有限花序基因Bnsdt2连锁的分子标记，所述分子标记的序列为8对SSR引物序列中的任一所示。
作为优选，所述8对SSR引物的序列为：
引物对SSR-SDT2-1：
SSR-SDT2-1F：5’－GCAAcGACGGAGAAGAAGAA－3’；
SSR-SDT2-1R：5’－CAAGAACAACACCCCGGTTA－3’；
引物对SSR-SDT2-2：
SSR-SDT2-2F：5’－GACGTTATCTTTGCTGGTAGGC－3’；
SSR-SDT2-2R：5’－GACGGGCTTTTCGATTATTACA－3’；
引物对SSR-SDT2-3：
SSR-SDT2-3F：5’－CCTACGCACCACCACAAGTAT－3’；
SSR-SDT2-3R：5’－CACCAGAAATAACTCCTCTGCC－3’；
引物对SSR-SDT2-4：
SSR-SDT2-4F：5’－CTAATCAAGACAACAGCGCAAC－3’；
SSR-SDT2-4R：5’－AGAAGACAAAAGCCCAGAAACA－3’；
引物对SSR-SDT2-5：
SSR-SDT2-5F：5’－AACAGAGCATACCAAGAGGCG－3’；
SSR-SDT2-5R：5’－TCTTCTTTGTTTGTGGGTTCGT－3’；
引物对SSR-SDT2-6：
SSR-SDT2-6F：5’－ATCATATCGAGCTTCATGCGT－3’；
SSR-SDT2-6R：5’－TGGAACTGAAACTCCCCCTC－3’；
引物对SSR-SDT2-7：
SSR-SDT2-7F：5’－CTGTGTTTGGCCTTGGTGTG－3’；
SSR-SDT2-7R：5’－ATCGAAGAAGCCACACGTCC－3’；
引物对SSR-SDT2-8：
SSR-SDT2-8F：5’－AGATTACGTGGGGGACCCAT－3’；
SSR-SDT2-8R：5’－AGCCACCGTGGATTCATCTTT－3’。
作为优选，所述分子标记的序列为如SSR-SDT2-4或SSR-SDT2-5所示。
作为优选，所述SSR-SDT2-4和SSR-SDT2-5的序列为:
SSR-SDT2-4F：5’－CTAATCAAGACAACAGCGCAAC－3’；
SSR-SDT2-4R：5’－AGAAGACAAAAGCCC AGAAACA－3’；
SR-SDT2-5F：5’－AACAGAGCATACCAAGAGGCG－3’；
SSR-SDT2-5R：5’－TCTTCTTTGTTTGTGGGTTCGT－3’。
所述分子标记引物在选育甘蓝型油菜有限花序品系中的应用。
一种获取所述SSR分子标记引物的方法，包括如下步骤：
以甘蓝型油菜无限花序品系为父本，甘蓝型油菜有限花序品系为母本杂交产生的F1，再以有限花序品系作为轮回亲本回交得到BC1F1，对BC1F1单株使用与Bnsdt1紧密连锁的标记进行扫描，选取表型无限带型有限的单株与轮回亲本回交得到BC2F1，开花期调查每株系群体BC2F1分离比，获取Bnsdt2的定位群体，再继续回交获得Bnsdt2的BC3F1定位群体，作为群体准备材料；
将所述群体准备材料采用CTAB法提取DNA；
对所述提取的DNA进行SSR序列定位获取；
根据所述SSR差异位点两端的序列进行分子标记引物设计；
对所述的分子标记引物进行多态性引物筛选和SSR分子标记分析。
作为优选，所述CTAB法提取DNA的步骤为：
编写离心管编号，加入适量所述群体准备材料的叶片，加入钢珠；
把离心管装入组织破碎仪的适配器上并置于液氮中；
在所述液氮中静置40s后，再将所述离心管置于组织破碎仪进行破碎1min；
破碎完成后，向所述离心管加入500μL质量分数2％CTAB溶液，经过30min的65℃水浴，中途反复振荡摇匀；
向所述离心管中加入等体积的以氯仿为主24:1溶液，上下轻轻翻转；
在eppendorf的高速离心机里12000rpm离心8min，转移离心所得的上清液，加入-20℃冰乙醇1000μL；
保持上述步骤中的转速离心5min，去上清，加入质量分数76％乙醇1000μL漂洗，将离心管在室温下晾干；
向所述离心管中加入200～300μL含有RNase的TE Buffer溶液，-20℃冷藏备用。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明首次获得了与甘蓝型油菜有限花序基因Bnsdt2紧密连锁的分子标记引物，具有检测方便，扩增稳定，重复性和准确率高等优点。其具体有益效果表现在：
(1)获得了甘蓝型油菜有限花序基因Bnsdt2的分子遗传图谱，且首次获得与Bnsdt2基因紧密连锁的分子标记SSR-SDT2-4和SSR-SDT2-5，可在甘蓝型油菜有限花序性状分子标记辅助育种及Bnsdt2基因克隆中发挥重要的作用。
(2)鉴定方便。这2个标记均为共显性标记，具有扩增稳定、检测方便、快速等优点。用这2个分子标记检测Bnsdt2基因，可以确定Bnsdt2的存在与否及存在的状态，进而快速筛选携有Bnsdt2基因的植株，并用于有限花序品种的选育。同时利用分子标记进行检测时还可以避免环境对品种的影响，提高选择的准确性。
(3)提高甘蓝型有限花序性状的选择效率。在传统的甘蓝型有限花序性状转育过程中，必须每杂交或回交一次，需要自交产生有限花序性状植株，避免有限花序基因丢失；而且需要等到现蕾期或初花期对花序性状进行观察统计。因此甘蓝型有限花序性状的选育不仅费时费力，而且难度大，成本高，育种周期长。用本发明的分子标记引物，通过检查与甘蓝型有限花序基因Bnsdt2紧密连锁的分子标记，可将表型鉴定的工作大大减少，在苗期即可区分含有有限花序基因的植株(若转育亲本基因型为Bnsdt1Bnsdt1BnSDT2SDT2只需与甘蓝型有限花序基因Bnsdt2紧密连锁的分子标记即可；若转育亲本基因型为BnSDT1BnSDT1BnSDT2SDT2同时需要甘蓝型有限花序基因Bnsdt1和Bnsdt2紧密连锁的分子标记)，从而淘汰非目标植株，因此，利用本发明的与Bnsdt2基因紧密连锁的分子标记，不仅节约成本，而且大大的提高了育种效率，加快了育种进程。
(4)可用于甘蓝型油菜有限花序基因Bnsdt2的研究。图位克隆甘蓝型油菜有限花序基因Bnsdt2的前提在于获得与Bnsdt2紧密连锁的分子标记。SSR-SDT2-4和SSR-SDT2-5在所有已知的C09分子标记中是首次报道与Bnsdt2连锁最为紧密的共显性标记(见图1，目前没有关于基因Bnsdt2的研究报道，我们是首次研究基因Bnsdt2)，这为克隆该基因提供了分子生物学基础和遗传学依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明的基因Bnsdt2的遗传连锁图；
图2是本发明的引物SSR-SDT2-4的扩增结果图；
图3是本发明的引物SSR5-17的扩增结果图；
图4是本发明的引物SSR-SDT2-5的扩增结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应注意到：的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，或者是该发明产品使用时惯常摆放的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明的简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
此外，术语“水平”、“竖直”等术语并不表示要求部件绝对水平或悬垂，而是可以稍微倾斜。如“水平”仅仅是指其方向相对“竖直”而言更加水平，并不是表示该结构一定要完全水平，而是可以稍微倾斜。
在本发明的描述中，还需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“设置”、“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个原件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
本发明的与甘蓝型油菜有限花序基因Bnsdt2紧密连锁的SSR分子标记引物是通过以下步骤获得的：
(1)群体材料准备
以甘蓝型油菜无限花序品系2982为父本(基因型为BnSDT1BnSDT1BnSDT2BnSDT2)，甘蓝型油菜有限花序品系4769为母本(基因型为Bnsdt1Bnsdt1Bnsdt2Bnsdt2)杂交产生的F1，然后以有限花序品系4769作为轮回亲本回交得到BC1F1，对BC1F1单株使用与Bnsdt1紧密连锁的标记(已公布，由本人开发)进行扫描，选取表型无限带型有限的单株(基因型为Bnsdt1Bnsdt1BnSDT2Bnsdt2)与轮回亲本回交得到BC2F1，开花期调查每株系群体BC2F1分离比，如分离比为1:1的株系群体即为Bnsdt2的定位群体，再继续回交获得Bnsdt2的BC3F1定位群体，用于Bnsdt2紧密连锁的分子标记筛选。
与Bnsdt1紧密连锁的SSR标记
标记名称 Forward Reverse
SSR24 CTTCTTCATCTTCAGCTGTTTG CTAGTGTTCTTTGCGAGTGTTA
SSR40 TTCCCTCCAAATCATGAAAGAG GGAGTGGGTTTAAGATCTGAT
SSR5-17 ATGAGGTATGTAGGTCCAGT CCCGTCAACTAATCTCCTTC
SSR5-21 GTTTTCTGGTCCTAGTAGCA GCTATGGTTTGTTTGTGGTT
(2)DNA的提取
DNA提取使用CTAB法，参考Doyle的方法并进行了修改，使之更符合油菜DNA提取。操作流程如下：1.编写离心管编号，加入适量的叶片，然后加入钢珠；2.把离心管装入组织破碎仪的适配器上并置于液氮中；3.液氮中40s后，置于组织破碎仪进行破碎1min；4.离心管加入500μL质量分数2％CTAB溶液然后经过30min的65℃水浴，并且中途反复振荡摇匀；5.加入等体积(500μL)的以氯仿为主24:1溶液，上下轻轻翻转；6.在eppendorf的高速离心机里12000rpm离心8min，转移离心所得的上清液，加入-20℃冰乙醇1000μL；7.跟步骤6的转速一样离心5min，去上清，加入质量分数76％乙醇1000μL漂洗，然后将离心管在室温下晾干；8.加入200～300μL含有RNase的TE Buffer溶液，-20℃冷藏备用。
(3)SSR序列的获得
根据甘蓝型油菜有限花序基因Bnsdt2初定位结果，我们把有限花序基因Bnsdt2定位在甘蓝型油菜染色体C09上，在甘蓝型油菜宁油7号全基因组网站上(http://www.brassica.bbsrc.ac.uk/)下载有限花序基因Bnsdt2被定位区间序列。利用SSRHunter软件对该区间序列内的SSR位点进行检索，检索标准为：含2-4核苷酸类型的SSR基序(motif)的最小重复数为4次。将检索得到的含SSR位点的序列进行SSR分子标记引物设计。
(4)SSR分子标记引物设计
根据SSR差异位点两端的序列，采用Primer3.0在线软件对SSR位点设计引物。设计引物参数原则：退火温度为50℃～60℃，最佳温度为55℃；引物长度17bp～23bp；产物大小为100bp～300bp；引物(G+C)含量为30％～60％，引物不出现二级结构、发夹结构和二聚体。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，设计合成了SSR引物30对(这些引物是否与基因Bnsdt2连锁还未知，所以需要后面引物筛选和验证)。
(5)多态性引物筛选和SSR分子标记分析
选用所设计的30引物在BC3F1群体中12株无限和12株有限个体间进行多态性验证，如果扩增结果与在两亲本间扩增结果一致，则将有多态性的引物用于BC3F1代单株的SSR分析。最后根据连锁交换规律，结合单株基因型及田间花序性状调查统计结果，利用JoinMap4.0软件构建了甘蓝型油菜有限花序基因Bnsdt2的分子遗传连锁图1，获得了与Bnsdt2紧密连锁的8个SSR标记，图1是甘蓝型油菜有限花序基因Bnsdt2的遗传连锁图，右侧为遗传连锁图的标记，左侧数据为标记间的遗传距离(cM)。
8对SSR引物对的脱氧核糖核苷酸引物序列如下：
1、引物对SSR-SDT2-1：
SSR-SDT2-1F：5’－GCAAcGACGGAGAAGAAGAA－3’；
SSR-SDT2-1R：5’－CAAGAACAACACCCCGGTTA－3’；
2、引物对SSR-SDT2-2：
SSR-SDT2-2F：5’－GACGTTATCTTTGCTGGTAGGC－3’；
SSR-SDT2-2R：5’－GACGGGCTTTTCGATTATTACA－3’；
3、引物对SSR-SDT2-3：
SSR-SDT2-3F：5’－CCTACGCACCACCACAAGTAT－3’；
SSR-SDT2-3R：5’－CACCAGAAATAACTCCTCTGCC－3’；
4、引物对SSR-SDT2-4：
SSR-SDT2-4F：5’－CTAATCAAGACAACAGCGCAAC－3’；
SSR-SDT2-4R：5’－AGAAGACAAAAGCCCAGAAACA－3’；
5、引物对SSR-SDT2-5：
SSR-SDT2-5F：5’－AACAGAGCATACCAAGAGGCG－3’；
SSR-SDT2-5R：5’－TCTTCTTTGTTTGTGGGTTCGT－3’；
6、引物对SSR-SDT2-6：
SSR-SDT2-6F：5’－ATCATATCGAGCTTCATGCGT－3’；
SSR-SDT2-6R：5’－TGGAACTGAAACTCCCCCTC－3’；
7、引物对SSR-SDT2-7：
SSR-SDT2-7F：5’－CTGTGTTTGGCCTTGGTGTG－3’；
SSR-SDT2-7R：5’－ATCGAAGAAGCCACACGTCC－3’；
8、引物对SSR-SDT2-8：
SSR-SDT2-8F：5’－AGATTACGTGGGGGACCCAT－3’；
SSR-SDT2-8R：5’－AGCCACCGTGGATTCATCTTT－3’；
所述SSR分子标记的扩增体系为：
DNA模板2μL，10×Buffer(Mg2+)1μL，dNTPs(2.5mM each)0.8μL，Taq E(5u/μL)0.2μL，Primer-F/Primer-R 0.5μL，ddH2O 5μL，总体积为10μL。
SSR分子标记的扩增程序为：94℃变性3min；
94℃变性30s，59℃退火45s，72℃延伸45s，每次循环退火温度降低0.5℃，10个循环；94℃变性30s，54℃退火45s，72℃延伸45s，20个循环；前10个循环每循环退火温度降低0.5℃，降到54℃后，再进行后面的20个循环；
72℃延伸5min；4℃保存。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
SSR-SDT2-4引物的应用
(一)DNA提取
DNA提取使用CTAB法，参考Doyle的方法并进行了修改，使之更符合油菜DNA提取。
操作流程如下：
1.编写离心管编号，加入适量的叶片，然后加入钢珠；2.把离心管装入组织破碎仪的适配器上并置于液氮中；3.液氮中40s后，置于组织破碎仪进行破碎1min；4.离心管加入500μL质量分数2％CTAB溶液然后经过30min的65℃水浴，并且中途反复振荡摇匀；5.加入等体积(500μL)的以氯仿为主24:1溶液，上下轻轻翻转；6.在eppendorf的高速离心机里12000rpm离心8min，转移离心所得的上清液，加入-20℃冰乙醇1000μL；7.跟步骤6的转速一样离心5min，去上清，加入质量分数76％乙醇1000μL漂洗，然后将离心管在室温下晾干；8.加入200～300μL含有RNase的TE Buffer溶液，-20℃冷藏备用。
(二)PCR扩增
所述SSR分子标记的扩增体系为：
DNA模板2μL，10×Buffer(Mg2+)1μL，dNTPs(2.5mM each)0.8μL，Taq E(5u/μL)0.2μL，Primer-F/Primer-R 0.5μL，ddH2O 5μL，总体积为10μL。
SSR分子标记的扩增程序为：94℃变性3min；
94℃变性30s，59℃退火45s，72℃延伸45s，每次循环退火温度降低0.5℃，10个循环；94℃变性30s，54℃退火45s，72℃延伸45s，20个循环；前10个循环每循环退火温度降低0.5℃，降到54℃后，再进行后面的20个循环；
72℃延伸5min；4℃保存。
(三)6％聚丙烯酰胺凝胶电泳
(1)6％聚丙烯酰胺凝胶的制备
将长玻璃板用清水清洗干净后晾干，水平放置，首先用干净的吸水纸和无水乙醇擦洗2遍，待酒精挥发完全后，涂粘合剂，晾干，两侧放置封条，备用；将短玻璃板同样用无水乙醇清洗两遍，乙醇挥发后涂硅化剂，晾干。将短玻璃板倒扣于长玻璃板上，用夹子固定两侧。配置凝胶：60ml 6％聚丙烯酰胺凝胶+300μL 10％过硫酸铵+30μL TEMED，搅拌均匀后，灌入两玻璃板之间，插上梳子以配置点样胶槽，用夹子固定，上压重物，2h后胶板凝固，即可进行电泳。
(2)电泳
将凝固后的胶板取下，去掉夹子和梳子，固定于电泳槽上，倒入电泳缓冲液5×TBE溶液，设置电泳参数为电压U＝2000v，电流I＝100mA，功率P＝80w，电泳预热20min，插入点样梳子，准备点样。点样前在选扩体系中加入10μL上样缓冲液，上样缓冲液中包含甲酰胺、二甲苯青和溴酚蓝，然后沸水浴5min变性，变性后迅速放入冰盒，冷却后即可点样。在点样槽两侧点入100bp DNA ladder Marker，将样品迅速依次点入后开始电泳，70min后电泳完成。
(3)银染和显影
①冲洗：将电泳完毕的凝胶从玻璃板上剥离下来后，放入盛有蒸馏水的盘子里，轻晃5-6s，倒掉，以洗去凝胶表面的残余电泳液；
②染色：将胶转入0.1％的硝酸银溶液中震荡染色8-10min；
③水洗：将染完色的凝胶转入蒸馏水中漂洗2-3次，洗去凝胶表面的硝酸银残余；
④显色：将冲洗完毕的凝胶转入显色液(1.5％NaOH，0.4％甲醛)中显色至条带清楚显示；
⑤冲洗：将显色液倒掉，用自来水冲洗胶片2-3次；
⑥保存：将冲洗后的凝胶放在胶片观察灯上统计分析、照相。
(四)结果判断
图2是SSR-SDT2-4(基因Bnsdt2连锁标记)在无限花序107(轮回亲本)和有限花序4769亲本及BC3F2代单株中的扩增结果；泳道信息：P1是无限花序亲本107；P2是有限花序亲本4769；其余为BC3F2代单株(共有11个纯合无限花序单株，16个杂合无限花序单株，6个纯合有限花序单株。)。图3是SSR5-17(基因Bnsdt1连锁标记)在无限花序107(轮回亲本)和有限花序4769亲本及BC3F2代单株中的扩增结果；泳道信息：P1是无限花序亲本107；P2是有限花序亲本4769；其余为BC3F2代单株(除有两个单株没有扩增出带型外，其余所有单株表现为有限花序带型)。结果说明无限花序107基因型为Bnsdt1Bnsdt1BnSDT2BnSDT2；后期对BC3F2代单株进行表型鉴定，结果显示具有有限花序带型(基因Bnsdt2的带型)的单株都表现为有限花序性状，检出率为100％。
实施例2
SSR-SDT2-5引物的应用
(二)DNA提取
DNA提取使用CTAB法，参考Doyle的方法并进行了修改，使之更符合油菜DNA提取。
操作流程如下：
1.编写离心管编号，加入适量的叶片，然后加入钢珠；2.把离心管装入组织破碎仪的适配器上并置于液氮中；3.液氮中40s后，置于组织破碎仪进行破碎1min；4.离心管加入500μL质量分数2％CTAB溶液然后经过30min的65℃水浴，并且中途反复振荡摇匀；5.加入等体积(500μL)的以氯仿为主24:1溶液，上下轻轻翻转；6.在eppendorf的高速离心机里12000rpm离心8min，转移离心所得的上清液，加入-20℃冰乙醇1000μL；7.跟步骤6的转速一样离心5min，去上清，加入质量分数76％乙醇1000μL漂洗，然后将离心管在室温下晾干；8.加入200～300μL含有RNase的TE Buffer溶液，-20℃冷藏备用。
(二)PCR扩增
所述SSR分子标记的扩增体系为：
DNA模板2μL，10×Buffer(Mg2+)1μL，dNTPs(2.5mM each)0.8μL，Taq E(5u/μL)0.2μL，Primer-F/Primer-R 0.5μL，ddH2O 5μL，总体积为10μL。
SSR分子标记的扩增程序为：94℃变性3min；
94℃变性30s，59℃退火45s，72℃延伸45s，每次循环退火温度降低0.5℃，10个循环；94℃变性30s，54℃退火45s，72℃延伸45s，20个循环；前10个循环每循环退火温度降低0.5℃，降到54℃后，再进行后面的20个循环；
72℃延伸5min；4℃保存。
(三)6％聚丙烯酰胺凝胶电泳
(1)6％聚丙烯酰胺凝胶的制备
将长玻璃板用清水清洗干净后晾干，水平放置，首先用干净的吸水纸和无水乙醇擦洗2遍，待酒精挥发完全后，涂粘合剂，晾干，两侧放置封条，备用；将短玻璃板同样用无水乙醇清洗两遍，乙醇挥发后涂硅化剂，晾干。将短玻璃板倒扣于长玻璃板上，用夹子固定两侧。配置凝胶：60ml 6％聚丙烯酰胺凝胶+300μL 10％过硫酸铵+30μL TEMED，搅拌均匀后，灌入两玻璃板之间，插上梳子以配置点样胶槽，用夹子固定，上压重物，2h后胶板凝固，即可进行电泳。
(2)电泳
将凝固后的胶板取下，去掉夹子和梳子，固定于电泳槽上，倒入电泳缓冲液5×TBE溶液，设置电泳参数为电压U＝2000v，电流I＝100mA，功率P＝80w，电泳预热20min，插入点样梳子，准备点样。点样前在选扩体系中加入10μL上样缓冲液，上样缓冲液中包含甲酰胺、二甲苯青和溴酚蓝，然后沸水浴5min变性，变性后迅速放入冰盒，冷却后即可点样。将样品迅速依次点入后开始电泳，70min后电泳完成。
(3)银染和显影
①冲洗：将电泳完毕的凝胶从玻璃板上剥离下来后，放入盛有蒸馏水的盘子里，轻晃5-6s，倒掉，以洗去凝胶表面的残余电泳液；
②染色：将胶转入0.1％的硝酸银溶液中震荡染色8-10min；
③水洗：将染完色的凝胶转入蒸馏水中漂洗2-3次，洗去凝胶表面的硝酸银残余；
④显色：将冲洗完毕的凝胶转入显色液(1.5％NaOH，0.4％甲醛)中显色至条带清楚显示；
⑤冲洗：将显色液倒掉，用自来水冲洗胶片2-3次；
⑥保存：将冲洗后的凝胶放在胶片观察灯上统计分析、照相。
(四)结果判断
图4是SSR-SDT2-5(基因Bnsdt2连锁标记)在无限花序107(轮回亲本)和有限花序4769亲本及BC3F2代单株中的扩增结果；泳道信息：P1是无限花序亲本107；P2是有限花序亲本4769；其余为BC3F2代单株(共有11个纯合无限花序单株，16个杂合无限花序单株，6个纯合有限花序单株。)。图3是SSR5-17(基因Bnsdt1连锁标记)在无限花序107(轮回亲本)和有限花序4769亲本及BC3F2代单株中的扩增结果；泳道信息：P1是无限花序亲本107；P2是有限花序亲本4769；其余为BC3F2代单株(除有两个单株没有扩增出带型外，其余所有单株表现为有限花序带型)。结果说明SSR-SDT2-5与SSR-SDT2-4检出结果一致，无限花序107基因型为Bnsdt1Bnsdt1BnSDT2BnSDT2；后期对BC3F2代单株进行表型鉴定，结果显示具有有限花序带型(基因Bnsdt2的带型)的单株都表现为有限花序性状，检出率为100％。
如上所述即为本发明的实施例。前文所述为本发明的各个优选实施例，各个优选实施例中的优选实施方式如果不是明显自相矛盾或以某一优选实施方式为前提，各个优选实施方式都可以任意叠加组合使用，所述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明人的发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.甘蓝型油菜有限花序基因Bnsdt2连锁的分子标记，其特征在于：所述分子标记的序列为如SSR-SDT2-4或SSR-SDT2-5所示；
所述SSR-SDT2-4的序列为:
SSR-SDT2-4F：5’－CTAATCAAGACAACAGCGCAAC－3’；
SSR-SDT2-4R：5’－AGAAGACAAAAGCCC AGAAACA－3’；
所述SSR-SDT2-5的序列为:
SR-SDT2-5F：5’－AACAGAGCATACCAAGAGGCG－3’；
SSR-SDT2-5R：5’－TCTTCTTTGTTTGTGGGTTCGT－3’。
2.如权利要求1所述的分子标记在选育甘蓝型油菜有限花序品系中的应用，甘蓝型油菜有限花序品系为4769。
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