CN107460246A - 一种快速定位桃目的基因的方法 - Google Patents

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牛良
崔国朝
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潘磊
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Abstract

本发明公开了一种快速定位桃目的基因的方法，涉及生物基因技术领域。本发明方法包括：选取亲本杂交获得F1子代，根据表型并划分出目的性状植株和非目的性状植株，提取桃基因组DNA，设计引物进行扩增得到扩增产物；用Sanger对扩增产物测序并获得SNP标记，并从中选出表型和基因型一致的SNP标记进行目标性状的初步定位；对亲本进行二代测序并从中选出基因型和表型一致的SNP标记，在初步定位区域内开发基因型和表型一致的SNP标记并获得紧密连锁的SNP标记，建立目标性状的分子鉴定体系，获得桃目的基因在桃基因组上的精细定位。本发明方法可快速、准确精细定位桃基因。

Description

一种快速定位桃目的基因的方法
技术领域
本发明涉及生物基因技术领域，尤其涉及一种快速定位桃目的基因的方法。
背景技术
桃[Prunus persica(L.)Batsch]是深受消费者欢迎的水果之一。据联合国粮农组织数据，2014年我国桃栽培面积1190万亩，占世界栽培总面积的50.5％，是我国栽培面积较大的落叶果树之一。
桃作为最重要的果树经济作物之一，属于蔷薇科，李属，桃亚属果树植物，由于其遗传和生物学特征(基因组小、童期短、自交亲和、质量性状多等)，是多年生果树研究的模式植物(Aranzana等，2010)。同时由于栽培品种多为二倍体，更易于遗传规律分析、重要性状定位、遗传多样性分析以及系统进化关系研究(等，2013)。在果树作物中，葡萄率先完成了全基因组测序，随后蔷薇科植物的苹果、草莓、梨等完成了全基因组的序列测定工作(Jaillon等，2007；Velasco等，2010；Shulaev等，2010；Wu等，2012)。2010年在GDR中可查询桃基因组数据，2013年正式发表了研究论文(IPGT等，2013)，桃基因组测序的完成为许多重要经济性状基因的定位和克隆、比较基因组学、起源进化关系研究、遗传多样性分析以及分子辅助选种体系的建立提供了参考框架(Testolin等，2000；Li等，2013；Cao等，2014；Aranzana等，2013)。
桃许多重要农艺性状是由单基因控制的，桃果实性状相关的毛\油、圆\蟠、粘\离核、溶质\不溶质、黄\白肉和花型等；与树型相关的矮化、半矮化、短枝、柱型和垂枝等性状。同时一些抗性基因，如根结线虫、蚜虫、白粉病等也是由单基因控制的，其遗传特征使得基因的定位及开发紧密连锁的标记变得更加容易。通过定位目标性状的基因实现早期的分子鉴定，特别是对于果树的果实性状以及隐性性状具有重要意义。由于果树童期较长，对果实性状的观察需经历从种子到结出果实的漫长阶段，延缓了人工选育的进程，同时浪费大量的人力和物力资源。因此，建立目标性状的快速精细定位是实现分子辅助育种的前提。
发明内容
鉴于此，本发明实施例提供了一种快速定位桃目的基因的方法，主要目的是提供一种快速、准确精细定位桃基因的方法。
为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：
一方面，本发明实施例提供了一种快速定位桃目的基因的方法，所述方法包括：
选取具有目的性状的亲本进行杂交或自交得到桃的F1子代，根据桃目的性状的表型特征将所述F1子代划分为具有目的性状的植株和具有非目的性状的植株；
提取所述具有目的性状的植株的基因组DNA和所述具有非目的性状的植株的基因组DNA；根据桃基因组，设计引物，进行PCR扩增，得到具有目的性状植物的扩增产物和具有非目的性状植株的扩增产物；
采用Sanger操作对两种扩增产物进行DNA测序，获得两种扩增产物的SNP标记位点；根据F1子代中具有目的性状的植株的表型与基因型，根据具有非目的性状的植株的表型与基因型，从两种扩增产物的SNP标记位点中筛选出与桃目的性状对应的SNP标记作为初步定位区域；
在所述初步定位区域的基础上，采用第二代DNA测序对所述具有目的性状的亲本进行测序得到所述亲本的DNA序列，采用IGV软件对二代测序结果的Bam文件分析，采用HRM(高分辨率熔解曲线)技术筛选出与目的基因对应的基因型与表型一致的SNP标记，作为目标性状的精细定位。
作为优选，所述具有目的性状亲本进行杂交是指选取具有抗蚜形状的中蟠1号和中油13号进行杂交；
所述根据桃目的性状的表型特征是指根据蚜虫危害特征；
所述具有目的性状的植株为抗蚜类型的植株，所述具有非目的性状的植株为感蚜类型的植株。
作为优选，所述具有目的性状的亲本进行自交选取具有矮化基因的05-2-144进行自交；
所述根据桃目的性状的表型特征是指根据普通型和矮化型桃的表型特征；
所述具有目的性状的植株为矮化类型的植株，所述具有非目的性状的植株为普通生长类型的植株。
作为优选，所述提取所述具有目的性状的植株的DNA序列和所述具有非目的性状的植株的DNA序列的方法是采用CTAB方法。
作为优选，与所述桃的抗蚜基因连锁的SNP标记为KyHRM-17-45.71和HRM-KYSNP3且所述抗蚜基因位于两个SNP标记之间，所述抗蚜基因位于所述桃的基因组Scaffold 1的45.71Mb和46.12Mb之间。
作为优选，与所述桃树的矮化基因连锁的SNP标记为LuDw-SNP 6和LuDw-SNP10，所述矮化基因位于所述桃的基因组Scaffold 6的28.995Mb和28.576Mb之间。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明建立了基于Sanger和二代测序技术开发SNP标记进行目标性状快速定位的方法，可为桃其他性状的精细定位和基因克隆提供技术支持，建立桃不同性状的分子标记辅助选种体系，提高桃育种效率。
附图说明
图1是本发明实施例提供的基于Sanger测序与抗蚜基因连锁的SNP标记测序峰图；
图2是本发明实施例提供的基于Sanger测序与矮化基因连锁的SNP标记测序峰图；
图3是本发明实施例提供的中蟠1号二代测序技术的测序深度、SNP、Indel分布等信息图；
图4是本发明实施例提供的中油13号二代测序技术的测序深度、SNP、Indel分布等信息图；
图5是本发明实施例提供的05-2-144的二代测序的测序深度、SNP、Indel分布等信息图；
图6是本发明实施例提供的基于二代测序基因型和表型一致的SNP位点；
图7a-图7c是本发明实施例提供的与抗蚜基因紧密连锁的SNP标记KyHRM-17-45.71的测序峰图；
图8a-图8c是本发明实施例提供的基于HRM基因分型鉴定与桃抗蚜性状紧密连锁的SNP标记测序峰图；
图9是本发明实施例提供的与矮化基因紧密连锁的SNP标记LuDw-SNP 6测序峰图；
图10是本发明实施例提供的与矮化基因紧密连锁的SNP标记LuDw-SNP 10的测序峰图；
图11是本发明实施例提供的基于HRM技术SNP基因分型结果图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。
实施例1
(1)鉴定桃目的性状表型：建立抗蚜杂交群体：以中蟠桃1号(抗蚜)为母本，中油桃13号(感蚜)为父本进行杂交，手工去雄并人工授粉；实生苗后代单株人工接种绿蚜观察表型；采用人工接种并套袋的方法对杂交后代单株抗蚜表型进行鉴定，根据蚜虫危害特征进行表型评价；
建立矮化基因杂交群体：05-2-144(Aa基因型)自交，根据普通型和矮化型桃的表型特征，我们采用肉眼观察的方法进行表型鉴定，以区别普通生长型和矮化型；
(2)鉴定杂交群体分离表型：以中蟠桃1号(抗蚜)为母本，中油桃13号(感蚜)为父本进行杂交，共得到141个实生苗单株；定植后于2014年4月进行人工接种蚜虫进行抗蚜、感蚜评价；通过对后代单株进行表型评价，发现其中抗蚜67株，感蚜74株，二者比例接近1:1(χ2为0.348，P值为0.556)，符合孟德尔遗传规律，抗蚜性状为显性单基因控制；
以05-2-144自交，共得到293株自交后代单株，其中普通型222株，矮化型71株，二者比例接近3:1，P值为0.761，符合孟德尔遗传规律，矮化性状为隐性单基因控制；
(3)提取基因组的DNA：采用CTAB法提取桃叶片亲本(中蟠桃1号；中油桃13号和05-2-144)、杂交F1和自交后代基因组DNA，略作修改，具体如下：取新鲜的叶子，放入2ml离心管中，加入直径3mm的钢珠和液N2在磨样机中进行碾磨(宁波新芝)，直至碾磨细粉状为止；加入配制好的CTAB液1300μL，进行1h长的65℃水浴，其间约每10min轻摇匀；加入氯仿和异戊醇混合液，体积比为24：1，直至2ml的离心管满载线，后缓慢颠倒混匀10分钟。放入冷冻离心机(Eppendorf 5810R)4℃条件下，12000rpm,离心10分钟；吸取约1ml的上清液，重复步骤(3)；抽提后，用200μl的移液器小心吸取上清液600μL于1.5mL管中，加入等体积的无水乙醇，于-20℃冰箱2小时以上；用灭菌后的枪头挑取絮状DNA放入含有70％乙醇的1.5ml灭菌离心管中，4℃条件下，12000rpm，离心10分钟，弃上清液；在带有沉淀的离心管中加入500μL的70％的乙醇，10000rpm瞬时离心，洗涤沉淀2次，加入无水乙醇洗涤沉淀一次，用200μL移液器(Eppendorf)吸除离心管底部剩余无水乙醇，后自然晾干；在室温下自然风干沉淀后，加入100μL体积的0.1×TE溶解沉淀DNA，同时加入0.5μL的RNase，37℃放置1h，祛除RNA污染；采用NanoDrop 1000spectrophotometer(Themo)和1％的琼脂糖胶对提取的桃叶片亲本和杂交后代的DNA进纯度浓度和完整度进行检测。另外，采用上述相同的CTAB方法提取桃杂交和自交组合的亲本DNA进行二代测序。用于二代测序基因组DNA的提取在形成絮状沉淀后(步骤5)，用枪头挑出，进行洗涤、干燥等一系列步骤，样品送北京诺禾致源科技股份有限公司进行二代测序。
(4)引物设计：参考桃基因组(Genome Database for Rosaceae)序列，采用primer3Web Version 4.0(http://primer3.ut.ee/)设计引物，引物参数为：退火温度在60-63℃之间，引物长度20-23bp，开发基于Sanger测序的SNP标记，选择每1Mb或2Mb设计1对引物，扩增片段长度约为1600bp或750bp)，具体详见SEQ.ID.NO.1-SEQ.ID.NO.41。
(5)PCR扩增过程：PCR扩增体系总体积为40μL，具体组分如下：
表1.PCR扩增体系
表2.初步获得连锁标记的引物序列表
表3.与目标性状紧密连锁标记的引物序列表
混匀后，在离心机(5810R，Eppendorf)离心，并在PCR仪(Eppendorf)上进行扩增。PCR扩增程序为95℃3min；94℃30s，54.3℃30s，72℃90s，34个循环；72℃10min。
如表1和表2所示，对父母本(自交亲本)以及选取后代(自交的两种F1子代)的各4个单株分别进行PCR扩增，得到7种扩增产物，PCR产物扩增后，送上海生工进行序列测定，测定的基因序列如SEQ.ID.NO.1-SEQ.ID.NO.29所示，根据测定序列信息在Contig软件中打开，序列对齐后寻找多态性SNP标记。
(6)基于亲本二代测序筛选SNP标记：将分析合格的DNA样品(05-2-144)通过Covaris破碎机随机打断成长度约为350bp的片段。采用TruSeq DNA LibraryConstruction Kit(Illumina，CA)进行建库，严格使用说明书推荐的试剂和耗材。DNA片段经末端修复、加ployA尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。
文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，将文库稀释至1ng/μL，后用Agilent 2100对文库的插入片段长度进行检测，符合预期后使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量。构建好的文库通过HiSeq 4000(Illumina，CA)进行测序。
有效测序数据通过BWA(Li等，2009)软件比对到参考基因组，比对结果经SAMTOOLS(Li等，2009)去除重复。采用SAMTOOLS(Li等，2009)进行个体SNP和Indel等的检测。
在精细定位区域内采用Integrative Genomics Viewer 2.3(IGV)对Bam格式数据进行分析，确定目标区域内基因型与表型一致的SNP；这个过程是二代测序的过程，测序后，从二代DNA序列表中确定亲本DNA中的SNP标记。
(7)基于亲本二代测序的SNP基因分型：在获得亲本基因型和表型一直的SNP后，采用HRM(高分辨率熔解曲线)技术或Sanger测序技术对杂交组合后代群体单株进行SNP基因分型。HRM master mix试剂购自Roche，在LightCycler 480II定量PCR仪(Roche)上进行SNP基因分型，HRM分析参考说明书进行。
(8)确定与桃目标形状连锁的SNP标记：基于Sanger测序结果，分析并初步可能获得与目标性状连锁的SNP标记。表现为抗蚜型母本基因型为Aa、感蚜父本基因型为aa，矮化型亲本的基因型为Aa，子代表型与基因型基本一致或一致。首先在各4个子代中获得紧密连锁的SNP标记后，扩大至子代的各20个单株，验证是否连锁，进而扩大至全部后代单株样品，初步确定目标性状的定位区域。采用二代测序在定位区间内继续开发基因型和表型一致的SNP标记；(即先测子代DNA，获得子代SNP标记，在子代DNA序列中获得了一个与目标性状连锁的SNP标记位点的一个大概范围，这个大概范围就是SNP的初始定位区域)。
上述初始定位区域也同样存在于亲本的DNA序列中；再二代测亲本DNA得到亲本DNA序列，在亲本的DNA序列中选定与所述子代的SNP初始定位区域相同的一段DNA序列，并将这段DNA序列作为再一次确定SNP标记的范围，在亲本的这个新范围内，挑选基因性和表型一致的SNP，如此，便缩小了亲本的DNA上的SNP标记范围，此时实现了精细定位，最终确定紧密连锁的SNP标记。
如图1-图10所示，与桃的抗蚜基因连锁的SNP标记为KyHRM-17-45.71和HRM-KYSNP3且抗蚜基因位于两个SNP标记之间，桃抗蚜基因位于桃基因组Scaffold 1的45.71Mb和46.12Mb之间。
与桃的矮化基因连锁的SNP标记为LuDw-SNP 6和LuDw-SNP10且矮化基因位于两个SNP标记之间，矮化基因位于桃基因组Scaffold 6的28.995Mb和28.576Mb之间。
以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。
SEQ.ID.NO.1为亲本中蟠桃1号的实际核苷酸序列；SEQ.ID.NO.2为亲本中油13号的核苷酸序列，SEQ.ID.NO.3为中蟠1号和中油13号杂交子代1抗蚜型的序列，SEQ.ID.NO.4中蟠1号和中油13号杂交子代2抗蚜型的序列，SEQ.ID.NO.5为中蟠1号和中油13号杂交子代3抗蚜型的序列，SEQ.ID.NO.6为中蟠1号和中油13号杂交子代4抗蚜型的序列，SEQ.ID.NO.7为中蟠1号和中油13号杂交子代1感蚜型的序列，SEQ.ID.NO.8为中蟠1号和中油13号杂交子代2感蚜型的序列，SEQ.ID.NO.9中蟠1号和中油13号杂交子代3感蚜型序列，SEQ.ID.NO.10中蟠1号和中油13号杂交子代4感蚜型，SEQ.ID.NO.11自交亲本05-2-144序列，SEQ.ID.NO.12自交亲本05-2-144子代1普通生长型序列，SEQ.ID.NO.13自交亲本05-2-144子代2普通生长型，SEQ.ID.NO.14自交亲本05-2-144子代3普通生长型，SEQ.ID.NO.15自交亲本05-2-144子代4普通生长型，SEQ.ID.NO.16自交亲本05-2-144子代1矮化型，SEQ.ID.NO.17自交亲本05-2-144子代2矮化型序列，SEQ.ID.NO.18自交亲本05-2-144子代3矮化型序列，SEQ.ID.NO.19自交亲本05-2-144子代4矮化型序列，SEQ.ID.NO.20与抗蚜基因紧密连锁的SNP标记，抗蚜型，Aa基因型序列，SEQ.ID.NO.21与抗蚜基因紧密连锁的SNP标记，感蚜型，aa基因型序列，SEQ.ID.NO.22与抗蚜基因紧密连锁的SNP标记，抗蚜型，Aa基因型序列，SEQ.ID.NO.23与抗蚜基因紧密连锁的SNP标记，感蚜型，aa基因型序列，SEQ.ID.NO.24与矮化基因紧密连锁的SNP标记，普通生长型，AA基因型序列，SEQ.ID.NO.25与矮化基因紧密连锁的SNP标记，普通生长型，Aa基因型序列，SEQ.ID.NO.26与矮化基因紧密连锁的SNP标记，矮化型，aa基因型序列，SEQ.ID.NO.27与矮化基因紧密连锁的SNP标记，普通生长型，AA基因型序列，SEQ.ID.NO.28与矮化基因紧密连锁的SNP标记，普通生长型，Aa基因型序列，SEQ.ID.NO.29与矮化基因紧密连锁的SNP标记，矮化型，aa基因型序列。其中，带“/”表示杂交位点带“/”的实际核苷酸序列如下：
SEQ.ID.NO.1gaaactgtcctgtctgcacgtgggctaactttacttgtaatactctaccaattggcttgg/atat/gaaaattctacaaaatcacagattgaacttcaagatgttagctttcatctccaattggccttgcactaaaattcctct/a gaaaagtta/gattttcccttaaaaaccttctaagagcgcagaaaagc/ttgaa aatcagaaaagtaaagtcat aagccctttttaaatcc/taattatcctacaaaacctaagtaaaaagagtacataaatgagtatatttatggacttatcaaatttctggcgtgtaagg/ac/tact tcccatacat ggcgttggaa tttccggctt atgggaagat tatgtgatta ttaggtctcacacgtggcgt tagaatttccggtgtgtgag acacttccta taggtggcgt tggaatttt/ct cggcatatgggaagattatg tgattattat gtctcacac/tgtggagttggaattttcggcgtgtgagacacttcc/tcatacgtggt/cgttggaatttccggcgtatgggaagagaataa/gggagaggaaaaaataattattttactatatcggg/agaaagattgatgcttaaaagaataatgtcttgtgtgttgtgatttaaggaaaaggaataattc/atataatttactattttattttgctgtaatggattgtatgttattggaatcgagattcttgtag/caaagaactacatgtggcttgatccctcagtaagga/gtacgtaggtagct/ctagggtctcacccaggtgcagcc/tgcgaaataactatatatataaaaggtttaaccggttttgaatg tgtg/aaatgaa ttttgaggtggttgcggg
SEQ.ID.NO.3gaaactgtcctgtctgcacgtgggctaactttacttgtaatactctaccaattggcttgg/atat/gaaaattctacaaaatcacagattgaacttcaagatgttagctttcatctccaattggccttgcactaaaattcctct/agaaaagtta/gattttcccttaaaaaccttctaagagcgcagaaaagc/ttgaaaatcagaaaagtaaagtcataagccctttttaaatcc/taattatcctacaaaacctaagtaaaaagagtacataaatgagtatatttatggacttatcaaatttctggcgtgtaagg/ac/tacttcccatacatggcgttggaatttccggcttatgggaagattatgtgattattaggtctcacacgtggcgttagaatttccggtgtgtgagacacttcctataggtggcgttggaatttt/ctcggcatatgggaagattatgtgattattatgtctcacac/tgtggagttggaattttcggcgtgtgagacacttcc/tcatacgtggt/cgttggaatttccggcgtatgggaagagaataa/gggagaggaaaaaataattattttactatatcggg/agaaagattgatgcttaaaagaataatgtcttgtgtgttgtgatttaaggaaaaggaataattc/atataatttactattttattttgctgtaatggattgtatgttattggaatcgagattcttgtag/caaagaactacatgtggcttgatccctcagtaagga/gtacgtaggtagct/ctagggtctcacccaggtgcagcc/tgcgaaataactatatatataaaaggtttaaccggttttgaatgtgtg/aaatgaattttgaggtggttgcggg
SEQ.ID.NO.4gaaactgtcctgtctgcacgtgggctaactttacttgtaatactctaccaattggcttgg/atat/gaaaattctacaaaatcacagattgaacttcaagatgttagctttcatctccaattggccttgcactaaaattcctct/agaaaagtta/gattttcccttaaaaaccttctaagagcgcagaaaagc/ttgaaaatcagaaaagtaaagtcataagccctttttaaatcc/taattatcctacaaaacctaagtaaaaagagtacataaatgagtatatttatggacttatcaaatttctggcgtgtaagg/ac/tacttcccatacatggcgttggaatttccggcttatgggaagattatgtgattattaggtctcacacgtggcgttagaatttccggtgtgtgagacacttcctataggtggcgttggaatttt/ctcggcatatgggaagattatgtgattattatgtctcacac/tgtggagttggaattttcggcgtgtgagacacttcc/tcatacgtggt/cgttggaatttccggcgtatgggaagagaataa/gggagaggaaaaaataattattttactatatcggg/agaaagattgatgcttaaaagaataatgtcttgtgtgttgtgatttaaggaaaaggaataattc/atataatttactattttattttgctgtaatggattgtatgttattggaatcgagattcttgtag/caaagaactacatgtggcttgatccctcagtaagga/gtacgtaggtagct/ctagggtctcacccaggtgcagcc/tgcgaaataactatatatataaaaggtttaaccggttttgaatgtgtg/aaatgaattttgaggtggttgcggg
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序列表
<110> 中国农业科学院郑州果树研究所
<120> 一种快速定位桃目的基因的方法
<160> 29
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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gaaactgtcc tgtctgcacg tgggctaact ttacttgtaa tactctacca attggcttgg 60
tataaaattc tacaaaatca cagattgaac ttcaagatgt tagctttcat ctccaattgg 120
ccttgcacta aaattcctct gaaaagttaa ttttccctta aaaaccttct aagagcgcag 180
aaaagctgaa aatcagaaaa gtaaagtcat aagccctttt taaatccaat tatcctacaa 240
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gtaaggcact tcccatacat ggcgttggaa tttccggctt atgggaagat tatgtgatta 360
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<400> 15
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
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tatattaagg agacggagaa tgaaagatct tatatttagg aaaataagtt ttccaaaaaa 360
atcaaaatat tcattaaagt catattatga gtagaaagtg actgccttaa tatgtacctt 420
tgatcacttg aggcactggg aatttcagga atttttcacc atccgttcgg aaaagttcct 480
tgatcgtctc tgcaggga 498
<210> 26
<211> 496
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tccccatata tgttttggtc tagcttgcta gcaggtggaa attcctgcag tttatttaga 60
agtaatgacg attaggatgt ataatcagag taaatataat tcaaatgtaa cttctcttct 120
gttccatttt cttcaaaaac aactgtagac aacagataat gaaagcttag gattacttgg 180
agacgacgta tgacgacagg atttattcca gccagcattt ctcttgcaaa ttcttcatca 240
gttttccatg ctgacttatc cactaacaca atacaaatca ttagaaaccc agtaagcagt 300
atattaaggg acggagaatg aaagatctta tatttaggaa aataagtttt ccaaaaaaat 360
caaaatattc attaaagtca tattatgagt agaaagtgac tgccttaata tgtacctttg 420
atcacttgag gcactgggaa tttcaggaat ttttcaccat ccgttcggaa aagttccttg 480
atcgtctctg caggga 496
<210> 27
<211> 486
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gcaaacgtga gagaagtagt attgtcaaaa tagatcttgc gagataaaat acaagacatc 60
ttcataaaca taggtgctcg gaaaagtatg agaaacttac atcaatggct gcaccatctc 120
gaactgatat gcaattgaaa ctttctctat ccatacagga ttcaaactat tcagtattac 180
ttcagttctc cctaattcct ctagcttacc atcacttttt ttggcataga caatcaccat 240
gggatcactc tgaaatatga ttaaacaagt taataactat ttcaggatat actatattaa 300
gataagtccc catgatgaca cagtaagtct ttagccttga ttttaaacag tagtggtcat 360
atgacattgc tacaatatct tcttcttctt ttttgggtca agcattgtta caatatctta 420
gttactatga taaacaggta aaaagccatg gcagagtaaa aaatgctgat aacacttggc 480
taatgt 486
<210> 28
<211> 487
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gcaaacgtga gagaagtagt attgtcaaaa tagatcttgc gagataaaat acaagacatc 60
ttcataaaca taggtgctcg gaaaagtatg agaaacttac atcaatggct gcaccatctc 120
gaactgatat gcaattgaaa ctttctctat ccatacagga ttcaaactat tcagtattac 180
ttcagttctc cctaattcct ctagcttacc atcagctttt tttggcatag acaatcacca 240
tgggatcact ctgaaatatg attaaacaag ttaataacta tttcaggata tactatatta 300
agataagtcc ccatgatgac acagtaagtc tttagccttg attttaaaca gtagtggtca 360
tatgacattg ctacaatatc ttcttcttct tttttgggtc aagcattgtt acaatatctt 420
agttactatg ataaacaggt aaaaagccat ggcagagtaa aaaatgctga taacacttgg 480
ctaatgt 487
<210> 29
<211> 486
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gcaaacgtga gagaagtagt attgtcaaaa tagatcttgc gagataaaat acaagacatc 60
ttcataaaca taggtgctcg gaaaagtatg agaaacttac atcaatggct gcaccatctc 120
gaactgatat gcaattgaaa ctttctctat ccatacagga ttcaaactat tcagtattac 180
ttcagttctc cctaattcct ctagcttacc atcgcttttt ttggcataga caatcaccat 240
gggatcactc tgaaatatga ttaaacaagt taataactat ttcaggatat actatattaa 300
gataagtccc catgatgaca cagtaagtct ttagccttga ttttaaacag tagtggtcat 360
atgacattgc tacaatatct tcttcttctt ttttgggtca agcattgtta caatatctta 420
gttactatga taaacaggta aaaagccatg gcagagtaaa aaatgctgat aacacttggc 480
taatgt 486

Claims (6)

1.一种快速定位桃目的基因的方法，其特征在于，所述方法包括：
选取具有目的性状的亲本进行杂交或自交得到桃的F1子代，根据桃目的性状的表型特征将所述F1子代划分为具有目的性状的植株和具有非目的性状的植株；
提取所述具有目的性状的植株的基因组DNA和所述具有非目的性状的植株的基因组DNA；根据桃基因组，设计引物，进行PCR扩增，得到具有目的性状植物的扩增产物和具有非目的性状植株的扩增产物；
采用Sanger操作对两种扩增产物进行DNA测序，获得两种扩增产物的SNP标记位点；根据F1子代中具有目的性状的植株的表型与基因型，根据具有非目的性状的植株的表型与基因型，从两种扩增产物的SNP标记位点中筛选出与桃目的性状对应的SNP标记作为初步定位区域；
在所述初步定位区域的基础上，采用第二代DNA测序对所述具有目的性状的亲本进行测序得到所述亲本的DNA序列，采用IGV软件对二代测序结果的Bam文件分析，筛选出与目的基因对应的基因型与表型一致的SNP标记，作为目标性状精细定位的标记。
2.根据权利要求1所述的一种快速定位桃目的基因的方法，其特征在于，所述具有目的性状的亲本进行杂交是指选取具有抗蚜形状的中蟠1号为母本和感蚜的中油13号为父本进行杂交；
所述根据桃目的性状的表型特征是指根据蚜虫危害特征；
所述具有目的性状的植株为抗蚜类型的植株，所述具有非目的性状的植株为感蚜类型的植株。
3.根据权利要求1所述的一种快速定位桃目的基因的方法，其特征在于，所述具有目的性状的亲本进行自交选取具有矮化基因的05-2-144进行自交；
所述根据桃目的性状的表型特征是指根据普通型和矮化型桃的表型特征；
所述具有目的性状的植株为矮化类型的植株，所述具有非目的性状的植株为普通生长类型的植株。
4.根据权利要求1所述的一种快速定位桃目的基因的方法，其特征在于，所述提取所述具有目的性状的植株的DNA序列和所述具有非目的性状的植株的DNA序列的方法是采用CTAB方法。
5.根据权利要求2所述的一种快速定位桃目的基因的方法，其特征在于，与所述桃的抗蚜基因连锁的SNP标记为KyHRM-17-45.71和HRM-KYSNP3且所述抗蚜基因位于两个SNP标记之间，所述抗蚜基因位于所述桃的基因组Scaffold 1的45.71Mb和46.12Mb之间。
6.根据权利要求3所述的一种快速定位桃目的基因的方法，其特征在于，与所述桃树的矮化基因连锁的SNP标记为LuDw-SNP 6和LuDw-SNP10，所述矮化基因位于所述桃的基因组Scaffold 6的28.995Mb和28.576Mb之间。
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