CN111979346A - 一种基于kasp分子标记的良种桃选育方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于KASP分子标记的良种桃选育方法，涉及生物技术领域，包括下列步骤：DNA提取：选取桃自然群体和桃遗传群体，采集幼嫩叶片，液氮速冻后置于‑80℃保存，采用高通量提取桃DNA方法从保存的叶片中，快速提取基因组总DNA；KASP引物合成：基于现有桃品种基因的DNA序列，共获得若干SNP位点，开发出若干对KASP引物；KASP反应：将提取的DNA稀释50‑100ng/ul，分别加入96孔板中，配制反应体系进行PCR扩增反应，反应结束后，根据检测的荧光信号来判断样本分型情况，根据不同的荧光信号获得不同的基因型；基因分析及良种选育：根据基因分型结果进行数据分析，选育出良种。根据基因变异设计有效的KASP分子标记，可为快速鉴定各性状提供依据，大大缩短了育种年限。

Description

一种基于KASP分子标记的良种桃选育方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种基于KASP分子标记的良种桃选育方法。

背景技术

果树童期长，育种中很多表型的观测评价都需要等待开花结果之后，这导致育种周期长，效率低下；同时，杂种实生苗田间定植需占用大量土地，管理成本高企，也限制了育种规模的扩大。现代分子生物学技术的发展使我们可以利用与相关性状紧密连锁的分子标记来进行提前选择，提高育种效率。

桃（Prunus persica）是原产我国的世界性重要落叶果树，属于蔷薇科（Rasaceae）李属（Prunus），因其染色体数目少（2n=16）、基因组较小（约227Mb），童期短，成为蔷薇科果树遗传规律研究的模式植物。桃很多性状的遗传均已有报道，桃果皮有毛/无毛(G/g)性状是受一对等位基因控制，有毛对无毛为显性；桃果实形状扁平形/非扁平形(S/s)是一对等位基因，扁平形的蟠桃对非扁形的圆桃为显性；寿星桃类型Rm3抗蚜(R)对感蚜(r)为显性；红肉性状为显性单基因（DBF）控制，显性遗传；果肉质地硬质性状受单基因（hd）控制，隐性遗传。

近年来，随着桃参考基因组测序的完成，学者们通过深入研究开发出了许多与性状相关的分子标记，甚至已经对关键基因进行了定位。VENDRAMIN等将桃有毛/无毛性状关键位点定位在5号染色体1.1cM（约635 kb）区间内。CAO等对84份桃资源进行全基因组重测序，通过关联分析，将桃果实表皮毛发育关键候选基因鉴定为ppa010316m。冯建灿等开发了IndelG标记应用于桃有毛/无毛性状相关杂交群体，基因型与其表型符合率为100%。Micheletti等利用基因芯片技术，对1580份桃种质资源进行全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS），将果实扁平基因也定位在第6染色体的远端。郭健等在130份桃品种重测序关联分析研究的基础上，对蟠桃关联位点Chr6：25060196 bp进行测序验证，并基于SNP位点开发出1个ASPCR分子标记，在‘大久保’与‘油蟠1-3’杂交群体中进行验证，准确率达到100%。Shen等对中国特色红肉桃品种‘五月鲜’进行红肉性状遗传规律研究时发现，在其杂交后第1代、第2代、第3代和第4代中红肉与白肉单株分离比例均为1∶1，认为红肉性状为显性单基因（DBF）控制，将其定位在第5连锁群的上端，位于2个SSR标记AMPPG157（1.3cM）和AMPPG178（1.3cM）之间。Zhou等将DBF红肉性状定于第5号连锁群顶端一个约200-Kb的区间，结合比较转录组学研究发掘了一个控制血桃的候选基因ppa022238m，该基因属于编码NAC蛋白的转录因子。Pan等通过非硬质桃和硬质桃的对比，筛选出一个生长素合成路径的限速酶基因PpYUCCA11（类黄素单加氧酶基因），对该基因及其启动子区的多态性位点的分析发现，其内含子中的SSR位点可以准确区分品种的基因型是否属于硬质类型。牛良等利用寿星桃及其抗性后代构建遗传分离群体，对其抗性表现及遗传进行了鉴定，最终将寿星桃类型抗蚜性状定位于45.676和45.837Mb之间，物理距离160Kb，受单基因PpRm3显性控制，未开发相关分子标记。

竞争性等位基因PCR (kompetitive allele specific PCR，KASP)标记技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNPs(Single Nucleotide Polymorphisms，单核苷酸多态性）和InDels（Insertions and Deletions，插入和缺失)进行高通量基因分型方法，是由LGC(Laboratory of the Government Chemist)公司设计和创制，具有通量高、成本低、准确度高等优点。KASP分子标记已经成为新一代的SNP分型标记，在水稻、小麦、油菜等作物的基因精细定位、MAS育种、种质资源鉴定等方面被广泛应用。但迄今，KASP标记在桃果实性状的研究上鲜有报道，也没有成熟的KASP标记技术选育良种桃。

发明内容

本发明为了解决上述技术问题，而提供一种基于KASP分子标记的良种桃选育方法，本发明KASP分子标记，高效、精确进行基因分型，加快了桃育种选择进程，为MAS育种提供技术支撑。

本发明通过下述技术方案实现：

一种基于KASP分子标记的良种桃选育方法，包括下列步骤：

DNA提取：选取桃自然群体和桃遗传群体，采集幼嫩叶片，液氮速冻后置于-80℃保存，采用高通量提取桃DNA方法从保存的叶片中，快速提取基因组总DNA；

KASP引物合成：基于现有桃品种基因的DNA序列，共获得若干SNP位点，开发出若干对KASP引物；

KASP反应：将提取的DNA稀释50-100ng/ul，分别加入96孔板中，配制反应体系进行PCR扩增反应，反应结束后，根据检测的荧光信号来判断样本分型情况，根据不同的荧光信号获得不同的基因型；

基因分析及良种选育：根据基因分型结果进行数据分析，选育出良种。

进一步，所述KASP反应步骤中，将提取的DNA稀释50ng/ul。

进一步，所述KASP反应步骤中，将提取的DNA稀释方法为：使用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度，微量紫外分光光度计检测DNA浓度，最后DNA稀释至预定浓度并放置在-20℃环境中贮存备用。

进一步，所述KASP引物合成步骤中，所述SNP位点包括果皮毛/油位点、果形圆/蟠位点、果肉硬质/非硬质位点、DBF型果肉颜色红色/非红色位点和寿星桃Rm3类型的抗蚜/感蚜位点，所述SNP位点对应的KASP引物序列为：

果皮毛/油位点对应FAM：5′-GATACTGACTTTCACAGCAACTTCGT-3′，HEX：5′-ATACTGACTTTCACAGCAACTTCGC-3′，Common：5′-CTTACGACAACAAGAGTGTATGATCTGAT-3′；

果形圆/蟠位点对应FAM：5′-GTTTTACATTTGAGGAATTAAATTATAAGCATT-3′，HEX：5′-GTTTTACATTTGAGGAATTAAATTATAAGCATA-3′，Common：5′-CCTCACTAAGAACAGGCAAGGACTT-3′；

果肉硬质/非硬质位点对应FAM：5′-ACTCTAGAAAGCATGTATTCACGACT-3′，HEX：5′-CTCTAGAAAGCATGTATTCACGACG-3′，Common：5′-CCACTGAAGGTAATAAAGCCCCACTA-3′；DBF型果肉颜色红色/非红色位点对应FAM：5′-GAGAAGGTGAACACAAGAAAGCCT-3′，HEX：5′-AGAAGGTGAACACAAGAAAGCCC-3′，Common：5′-GAGGTGGGATAAGATACAGCTTCCAA-3′；寿星桃Rm3类型的抗蚜/感蚜位点：FAM：5′-GGCTTTCCCAGGTAAAGTCCCT-3′，HEX：5′-GGCTTTCCCAGGTAAAGTCCCA-3′，Common：5′-CAGCATGCCGTTGGCGCTTCTT-3′。

进一步，所述基因分析及良种选育步骤中，采用LC480softwarev1.5.1分析基因分型结果，所述基因分型结果为：聚合在X轴附近的显示第一颜色的基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因型，聚合在Y轴附近的显示绿第二颜色的基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因型，中间显示第三颜色的基因型为两种等位基因的杂合型。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：本发明一种基于KASP分子标记的良种桃选育方法，利用根据基因变异设计有效的KASP分子标记，可为快速鉴定各性状提供依据，极大地促进了桃遗传改良研究，大大缩短了育种年限；便宜、高效且准确的基因分型方法一直是遗传学家和育种家追求的技术手段。KASP技术仅需PCR和荧光检测两个步骤，且能实现只需加样一次，即可完成基因分型过程，无需繁琐的琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测就能轻松地将分型结果在软件中可视化。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步描述。以下实施例仅为本发明的几个具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述的实施例中的百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。

在一个实施例中，一种基于KASP分子标记的良种桃选育方法，包括下列步骤：

DNA提取：选取1个桃自然群体（28份桃种质资源）和2个桃遗传群体，均来源于中国农业科学院郑州果树研究所桃育种圃，种质资源名称及表型详见表1，采集幼嫩叶片，液氮速冻后置于-80℃保存，采用高通量提取桃DNA方法从保存的叶片中，快速提取基因组总DNA；

中油20号：果皮无茸毛（油桃），果形圆，肉色白，肉质硬质；

01-77-4：果皮被茸毛，果形扁圆（蟠桃），肉色白；

10新25-8：果皮被茸毛（毛桃），果形圆，肉色红；

KASP引物合成：基于现有桃品种基因的DNA序列，共获得若干SNP位点，开发出若干对KASP引物，KASP引物序列基于SNP突变位点设计，基于已有油桃品种‘中油13号’、‘ 中油16号’，蟠桃品种‘中蟠桃1号’、‘中蟠桃2号’，DBF型红肉单株‘10新25-8’等50倍基因组重测序数据，结合基因组序列比对，分别从phytozome v12.1上下载；SNP位点数量根据控制基因位点来决定，可选取多个控制基因位点，本实施方式选取了桃果皮茸毛有/无、果形扁/圆、果肉硬质/非硬质、红肉/非红肉、Rm3抗蚜/感蚜等5对重要农艺性状控制基因位点的SNP变异，设计开发KASP标记；

KASP反应：KASP反应在LightCycler480(LC480)上进行，将提取的DNA稀释50-100ng/ul之间任一点，本实施例以将提取的DNA稀释50ng/ul为例，分别加入96孔板中，配制反应体系进行PCR扩增反应，每个孔的PCR反应体系总体积为10.14ul，包括2×KASPMastermix5ul，KASPPrimermix0.14μl，模板DNA5ul。反应结束后，根据检测的荧光信号来判断样本分型情况，根据不同的荧光信号获得不同的基因型；在LightCycler480(LC480)上的PCR反应程序为：（1）KASP热循环：94℃预变性15min；94℃变性20s；61～55℃退火延伸60s，10个循环(每个循环降低0．6℃)；94℃变性20s；55℃退火延伸60s，26个循环；37℃读取1min；（2）KASP回收：94℃20s；57℃60s；重复步骤1-2两次（共3次）；37℃读取1min；反应结束后，根据检测的2种荧光信号来判断样本分型情况，根据不同的荧光信号获得不同的基因型；

基因分析及良种选育：根据基因分型结果进行数据分析，选育出良种，在果实成熟期随取树冠中部外围10个果实，参照王力荣等编著的《桃种质资源描述规范和数据标准》调查桃果实表皮有无毛、果形蟠/圆形、果肉红肉/非红肉等性状，桃果实成熟期及采后均不变软，能正常着色的为硬质桃，在果实成熟后连续每3d调查一次果实硬度，果实2周不会变软的为硬质桃，抗蚜性状于定植后第二年蚜虫发生盛期开展，对每个单株蚜虫为害卷叶程度单独进行评价。

在一个实施例中，所述KASP反应步骤中，将提取的DNA稀释方法为：使用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度，微量紫外分光光度计检测DNA浓度，最后DNA稀释至预定浓度并放置在-20℃环境中贮存备用。

在一个实施例中，所述基因分析及良种选育步骤中，采用LC480softwarev1.5.1分析基因分型结果，所述基因分型结果为：聚合在X轴附近的显示第一颜色的基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因型，聚合在Y轴附近的显示绿第二颜色的基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因型，中间显示第三颜色的基因型为两种等位基因的杂合型，第一颜色、第二颜色、第三颜色可以任意选取三种不同的颜色进行区分，本实施例分别选取蓝、绿、红三种颜色进行说明。

结果分析：

桃果实有无毛等位变异的KASP鉴定结果：利用标记检测F1遗传群体中随机取60株、自然群体30株，利用KASP分子标记对子代群体基因进行检测，KASP分型结果见表3，共呈现3种基因型，等位基因X、以及杂合型为毛桃，等位基因Y为油桃。遗传群体中后代毛/油分离比例为1：1（χ2c=0＜χ20.05=3.84），群体毛/油性状分离符合孟德尔遗传，且标记验证符合率为100%。

桃果实扁平/圆形等位变异的KASP鉴定结果：对90份已知果实形状的遗传群体和自然群体材料进行KASP标记应用发现，共呈现2种基因型，等位基因X为圆桃，等位基因Y为蟠桃，基因分型结果见表4，标记符合率为100%。发现59份遗传群体后代蟠桃：圆桃分离比例为1:1（χ2c=0.0667＜χ20.05=3.84），符合孟德尔遗传规律。

桃果肉硬质/非硬质等位变异的KASP鉴定结果：利用硬质性状KASP标记检测杂交遗传F1群体和自然群体基因型。标记检测效果良好，呈现3种基因型(表5)。其中遗传群体1共分析53个单株，有27个单株为硬质桃的纯合基因型，26个单株为非硬质桃的杂合基因型，2种基因型符合1﹕1 (χ2c=0.0189＜χ20.05=3.84)。遗传群体2共分析17个单株，全部为非硬质桃的纯合基因型。两个群体均符合单基因遗传分离规律，标记检测结果与果实成熟期肉质鉴定表型完全一致，即KASP标记与硬质表型完全共分离，同时能检测到杂合基因型，表明标记可用于硬质桃育种的MAS选择。

桃果实DBF型色泽变异的KASP鉴定结果：利用开发的DBF红肉KASP标记分析90份种质体基因型，如表6所示，结果表明，样品基因型分型准确，且标记与表型符合率达100%。其中遗传分离群体后代符合1对等位基因的分离比例，红肉：非红=1:1（χ2c=2.283＜χ20.05=3.84）。

寿星桃Rm3类型的抗蚜/感蚜的KASP鉴定结果：对遗传群体95份种质进行KASP标记验证，结果表明，样品基因分型准确（表7），且标记与表型完全吻合。杂交后代抗蚜：感蚜分离比例1:1（χ2c=0.095＜χ20.05=3.84），符合孟德尔遗传规律。

表7 抗蚜/感蚜杂交群体中的KASP验证

综上所述，基于KASP技术对5对桃果实重要农艺性状进行基因分型，表明5对KASP标记基因分型结果与表型完全吻合，5对性状的KASP标记适用于在桃育种中进行早期选择、品种鉴定等。

本发明利用根据基因变异设计有效的KASP分子标记，可为快速鉴定各性状提供依据，极大地促进了桃遗传改良研究，大大缩短了育种年限。

便宜、高效且准确的基因分型方法一直是遗传学家和育种家追求的技术手段。KASP技术仅需PCR和荧光检测两个步骤，且能实现只需加样一次，即可完成基因分型过程，无需繁琐的琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测就能轻松地将分型结果在软件中可视化。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种基于KASP分子标记的良种桃选育方法，其特征在于，包括下列步骤：

DNA提取：选取桃自然群体和桃遗传群体，采集幼嫩叶片，液氮速冻后置于-80℃保存，采用高通量提取桃DNA方法从保存的叶片中，快速提取基因组总DNA；

KASP引物合成：基于现有桃品种基因的DNA序列，共获得若干SNP位点，开发出若干对KASP引物；

KASP反应：将提取的DNA稀释50-100ng/ul，分别加入96孔板中，配制反应体系进行PCR扩增反应，反应结束后，根据检测的荧光信号来判断样本分型情况，根据不同的荧光信号获得不同的基因型；

基因分析及良种选育：根据基因分型结果进行数据分析，选育出良种。

2.根据权利要求1所述基于KASP分子标记的良种桃选育方法，其特征在于，所述KASP反应步骤中，将提取的DNA稀释50ng/ul。

3.根据权利要求1或2所述基于KASP分子标记的良种桃选育方法，其特征在于，所述KASP反应步骤中，将提取的DNA稀释方法为：使用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度，微量紫外分光光度计检测DNA浓度，最后DNA稀释至预定浓度并放置在-20℃环境中贮存备用。

4.根据权利要求1所述基于KASP分子标记的良种桃选育方法，其特征在于，所述KASP引物合成步骤中，所述SNP位点包括果皮毛/油位点、果形圆/蟠位点、果肉硬质/非硬质位点、DBF型果肉颜色红色/非红色位点和寿星桃Rm3类型的抗蚜/感蚜位点，所述SNP位点对应的KASP引物序列为：

果皮毛/油位点对应FAM：5′-GATACTGACTTTCACAGCAACTTCGT-3′，HEX：5′-ATACTGACTTTCACAGCAACTTCGC-3′，Common：5′-CTTACGACAACAAGAGTGTATGATCTGAT-3′；

果形圆/蟠位点对应FAM：5′-GTTTTACATTTGAGGAATTAAATTATAAGCATT-3′，HEX：5′-GTTTTACATTTGAGGAATTAAATTATAAGCATA-3′，Common：5′-CCTCACTAAGAACAGGCAAGGACTT-3′；

果肉硬质/非硬质位点对应FAM：5′-ACTCTAGAAAGCATGTATTCACGACT-3′，HEX：5′-CTCTAGAAAGCATGTATTCACGACG-3′，Common：5′-CCACTGAAGGTAATAAAGCCCCACTA-3′；DBF型果肉颜色红色/非红色位点对应FAM：5′-GAGAAGGTGAACACAAGAAAGCCT-3′，HEX：5′-AGAAGGTGAACACAAGAAAGCCC-3′，Common：5′-GAGGTGGGATAAGATACAGCTTCCAA-3′；寿星桃Rm3类型的抗蚜/感蚜位点：FAM：5′-GGCTTTCCCAGGTAAAGTCCCT-3′，HEX：5′-GGCTTTCCCAGGTAAAGTCCCA-3′，Common：5′-CAGCATGCCGTTGGCGCTTCTT-3′。

5.根据权利要求1所述基于KASP分子标记的良种桃选育方法，其特征在于，所述基因分析及良种选育步骤中，采用LC480softwarev1.5.1分析基因分型结果，所述基因分型结果为：聚合在X轴附近的显示第一颜色的基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因型，聚合在Y轴附近的显示绿第二颜色的基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因型，中间显示第三颜色的基因型为两种等位基因的杂合型。