CN113846177B - 一种橡胶树次生乳管列数的snp分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与橡胶树次生乳管列数相关的SNP标记,所述SNP标记为SEQ ID No.1所示核苷酸序列自5'端起第238位点出的碱基是G或者A。本发明首次从大数据层面,鉴定到位于SEQ ID NO.1核苷酸序列第238位的SNP与次生乳管列数的多/少密切关联,利于检测,准确可靠,操作方便;利用本发明提供的所述SNP标记对杂交组合群体次生乳管列数性状进行鉴定,准确度达91%以上;本发明提供的SNP标记及其检测方法不受橡胶树树龄影响,可以在幼苗期进行选择,极大地减少了育种工作量,显著缩短了橡胶树产量育种选择周期,提高了育种效率,可以在实践中用于橡胶树产量分子标记辅助育种。

Description

一种橡胶树次生乳管列数的SNP分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及一种SNP标记及其应用,尤其涉及一种橡胶树次生乳管列数的 SNP分子标记及其应用。
背景技术
橡胶树高度杂合,但可通过芽接的方式繁育种苗,使得优良的杂交后代得以稳定地保存下来。这就是目前橡胶树杂交育种程序的基础。一直以来,橡胶树的一个主要的育种目标是培育高产品种,在此基础上再评价其他副性状。这就导致目前生产上应用的高产品种,其抗逆性不理想。而抗逆性理想的品种,产量又较低。研发产量与抗逆性状相关的分子标记,辅助杂交亲本和杂交后代选择,是高效培育高产抗逆新品种的必由之路。
随着技术的进步,分子标记的研发已经实现了从原来的对某个综合性状的粗放型模式到现在的对其构成性状的精细型模式的转变。如人们将水稻产量剖析为分蘖数、穗粒数、千粒重等多个构成性状,并开发了相应的分子标记用于辅助育种。近些年国内外在橡胶树分子标记研发方面已有报道。如印度学者开发了一个 RAPD分子标记,可以用于鉴定橡胶树矮化性状;我国学者根据高密度连锁图谱对产量性状进行定位,鉴定到多个相关的QTL位点。但是这些标记大多还停留在对综合性状的描述上,尚未涉及具体的构成性状。
位于橡胶树树干树皮中的次生乳管是天然橡胶合成和储存的场所。在生产上,人们通过有规律地重复切割橡胶树树干树皮,多次收集从乳管伤口处流出的乳汁状的胶乳,用于天然橡胶的加工。因此,橡胶树树干树皮中的次生乳管是天然橡胶产量的结构基础,其数量与橡胶产量显著正相关,是决定天然橡胶产量的主效性状之一。经过一百多年的驯化,目前生产上栽培品种的产量得到了极大提高,其树皮内层的次生乳管列数也远远高于野生品种。虽然唐朝荣等报道了一个与橡胶树乳管相关的SNP(唐朝荣,龙翔宇,戚继艳,阳江华,何斌.一种与橡胶树乳管数量相关的SNP标记及其应用.中国发明专利,CN 105838809 A),但其分析样本只是基于34份野生种质,并未涉及目前生产上产量和乳管列数均优的栽培品种。我们通过对93份栽培种和115份野生种质的深度重测序分析,鉴定到一个与次生乳管列相关的SNP标记,能够早期筛选次生乳管列数多的种质,将推进高产抗逆橡胶树新品种的选育进程。
发明内容
本发明在于克服现有技术中的不足,提供一种与橡胶树次生乳管列数性状相关的SNP标记,能够早期筛选次生乳管列数多的种质,将推进高产抗逆橡胶树新品种的选育进程。
本发明的第一个方面是提供一种与橡胶树次生乳管列数相关的SNP标记,所述SNP标记的序列如SEQ ID No.1所示,所述SEQ ID No.1所示序列自5'端起第238位点处的碱基是G或者A(应当理解的是,在序列表中SEQ ID No.1自 5'端起第238位点用“g”表示,只是为了正常提交核苷酸序列表,并不影响本发明权利要求1和说明书的相关限定)。
发明人发现,该SNP标记的位点处基因型为GG基因型橡胶树次生乳管列数要显著多于AA基因型橡胶树。
基于所述SNP分子标记,可以开发橡胶树次生乳管列数的基因型鉴定方法,通过对所述SNP位点碱基序列分析,所述SNP位点的基因型为GG鉴定橡胶树次生乳管列数多,所述SNP位点的基因型为AA鉴定橡胶树次生乳管列数少,准确度可达91%以上。
为进行所述SNP标记检测,本发明的第二个方面是提供一种用于检测本发明第一个方面所述的SNP标记的引物对,所述引物对的核苷酸序列如SEQIDNO: 2和SEQIDNO:3所示。
本发明的第三个方面是提供一种用于检测本发明第一个方面所述的SNP标记的试剂盒,其包含本发明第二个方面所述的引物对。
本发明的第四个方面是提供一种幼苗期检测橡胶树次生乳管列数性状的方法:提取待测橡胶树的基因组DNA,以待测橡胶树基因组DNA为模板,采用本发明第二个方面所述引物对进行PCR扩增,分析PCR扩增产物的序列,进行本发明第一个方面所述的SNP标记的检测,确定待测橡胶树的基因型,从而确定待测橡胶树的次生乳管列数性状。
所述SNP位点的基因型为GG时鉴定橡胶树次生乳管列数多,所述SNP位点的基因型为AA时橡胶树鉴定次生乳管列数少。
本发明的第五个方面是提供一种橡胶树的选育方法:提取待选橡胶树的基因组DNA,以所得基因组DNA为模板,采用本发明第二个方面所述引物对进行 PCR扩增,分析PCR扩增产物的序列,进行本发明第一个方面所述的SNP标记的检测,确定各个待选橡胶树的基因型,对橡胶树进行选育。
因为SNP位点的基因型为GG时橡胶树次生乳管列数多,而亲本组合如GA ×AA、AA×GA、AA×AA不能产生GG型,在筛选次生乳管列数多的GG型橡胶树苗时,可以直接排除GA×AA、AA×GA、AA×AA组合的杂交后代,提高筛选效率。因此,优选地,待选橡胶树杂交组合的亲本基因型为GG×GA、GA ×GG、GA×GA、或GG×GG组合的杂交后代适用于本发明,亲本组合如GA× AA、AA×GA、AA×AA直接排除。
本发明的第六个方面是提供如本发明第一个方面所述的SNP标记、或者本发明第二个方面所述的引物对、或者本发明第三个方面所述的试剂盒、或者本发明第四个方面所述的方法、或者本发明第五个方面所述的选育方法在橡胶树选育中的用途。
本发明的有益效果在于:
(1)本发明首次从大数据层面,鉴定到位于SEQ ID NO.1核苷酸序列第238 位的SNP与次生乳管列数的多/少密切关联,利于检测,准确可靠,操作方便。
(2)利用本发明提供的所述SNP标记对杂交组合群体次生乳管列数性状进行鉴定,准确度达91%以上。
(3)本发明提供的SNP标记及其检测方法不受橡胶树树龄影响,可以在幼苗期进行选择,极大地减少了育种工作量,显著缩短了橡胶树产量育种选择周期,提高了育种效率,可以在实践中用于橡胶树产量分子标记辅助育种。
附图说明
图1为本发明SNP位点的三种基因型与次生乳管列数关联性分析。
图2所述SNP位点的三种基因型在杂交组合群体乳管极多子代间的分布。
图3所述SNP位点的三种基因型在杂交组合群体乳管极少子代间的分布。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明,以更好地理解本发明。
实施例1:与次生乳管列数相关的SNP标记的获得
橡胶树栽培种的次生乳管数量要显著多于野生种。本研究所采用的材料为保存于国家橡胶树种质资源圃(海南儋州)中的208份橡胶树种质资源,包括93 份栽培种和115份野生种。获取新鲜叶片,采用CTAB法提取基因组DNA并进行全基因组重测序。利用GATK软件获取所有材料的变异数据,并分析野生种和栽培种之间的SNP差异性,鉴定到一个与橡胶树次生乳管列数相关的SNP位点。
该位点位于SEQ ID NO:1所示序列自5'端起第238bp位点处,在SEQ ID NO:1序列中用“g”表示该处位点,且此处位点的碱基为G或者A(应当理解的是,在序列表中SEQ IDNo.1自5'端起第238位点用“g”表示,只是为了正常提交核苷酸序列表,并不影响本发明权利要求1和说明书的相关限定)。在208 份种质中有22份种质为GG基因型,有50份种质为GA基因型,有136份种质为AA基因型。并且GG基因型类群的平均次生乳管列数为13.67,而AA基因型类群的平均次生乳管列数为4.87,两者间有极显著差异(p<0.0001)(图1)。证明该SNP标记与橡胶树次生乳管列数密切相关,含有GG基因型的种质次生乳管列数要显著多余含有AA基因型的种质。
实施例2:GG基因型和AA基因型对乳管列数量多的种质漏选率和误选率评价
1、实验材料
对定植于中国热带农业科学院橡胶研究所九队的286份谱系未知的杂交子代进行乳管分化能力评价,选取次生乳管列数极多(大于12列)的子代25份,获取新鲜叶片,根据植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)说明书进行基因组DNA提取,所提取的DNA经1.5%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000检测合格后备用。
2、PCR扩增
以所提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增,所用的正向引物序列为SEQ ID NO.2,反向引物序列为SEQ ID NO.3。PCR扩增体系为20ul:2x PCR buffer 10 μL,正、反向引物(10μmol·L-1)各1μL,DNA模板1μL,ddH2O为7μL。PCR 扩增程序为:96℃预变性10min;96℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸 1min 30s,共设置35个循环;72℃延伸10min。
3、PCR目的片段回收与测序
将PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离并回收目的条带。将目的条带连入pMD18-T克隆载体,转化大肠杆菌,挑选阳性克隆进行测序(广州天一生物工程有限公司)。
4、目标SNP位点基因型分析
根据测序峰图识别目标SNP位点的基因型,结果显示25个乳管极多的子代中,基因型为GG的有11个,基因型为GA的有12个,基因型为AA的有2个 (图2)。因此,GG基因型对次生乳管列数多的种质漏选率为:14/25*100%=56%; AA基因型对次生乳管列数多的种质误选率为:2/25*100%=8%。
实施例3:AA基因型和GG基因型对乳管列数少的种质漏选率和误选率评价
1、实验材料
对7个杂交组合群体的286份子代进行乳管分化能力评价(同实施例2),选取次生乳管列数极少(小于3列)的子代24份,获取新鲜叶片,根据植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)说明书进行基因组DNA提取,所提取的DNA经1.5%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000检测合格后备用。
2、PCR扩增
以所提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增,所用的正向引物序列为SEQ ID NO.2,反向引物序列为SEQ ID NO.3。PCR扩增体系为20ul:2x PCR buffer 10 μL,正、反向引物(10μmol·L-1)各1μL,DNA模板1μL,ddH2O为7μL。PCR 扩增程序为:96℃预变性10min;96℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸 1min 30s,共设置35个循环;72℃延伸10min。
3、PCR目的片段回收与测序
将PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离并回收目的条带。将目的条带连入pMD18-T克隆载体,转化大肠杆菌,挑选阳性克隆进行测序(广州天一生物工程有限公司)。
4、目标SNP位点基因型分析
根据测序峰图识别目标SNP位点的基因型,结果显示24个乳管极少的子代中,基因型为GG的有2个,基因型为GA的有7个,基因型为AA的有15个 (图3)。因此,AA基因型对次生乳管列数少的种质漏选率为: 14/25*100%=37.5%;GG基因型对次生乳管列数少的种质误选率为: 2/24*100%=8.33%。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述,但其只是作为范例,本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言,任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此,在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改,都应涵盖在本发明的范围内。
                         序列表
<110>  中国热带农业科学院橡胶研究所
<120>  一种橡胶树次生乳管列数的SNP分子标记及其应用
<160>  3
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  3
<211>  460
<212>  DNA
<213>  Artificial
<400>  3
ttctcgtgaa agggtttcgt ttggttgata ggaagcaaac aaaggaggac attgtcggat  60
attttgccgt gaaggtgttt tgtttggttg ataggaaccc aacaaaggag gaaaccaaaa 120
ttttttttga aatgagacga attcccccat tgttatacat cattttcctt tcctttcctc 180
ctttcaatga gttgatgaca acgatgatgc atcatatttt gtatttggat ttgtctggga 240
gcagacataa acgttcaaca aacaaatgtt ccaattccat tctctaggga gttagattgt 300
acaagaaaga taaaccttca aggaattcaa acccaccaaa tggctatctt ttgtgaaggt 360
ttttttaatc ttatagaatg aagttgaaga ttcatatctt caaaaagaga agcataatct 420
acaatttcat tttaaaattt gaaagatcac ccattggaat                       460
<210>  2
<211>  16
<212>  DNA
<213>  Artificial
<400>  2
ttctcgtgaa agggtt                                                  16
<210>  3
<211>  16
<212>  DNA
<213>  Artificial
<400>  3
attccaatgg gtgatc                                                  16

Claims (9)

1.一种与橡胶树次生乳管列数相关的SNP标记,其特征在于,所述SNP标记的序列如SEQID No.1所示,所述SEQ ID No.1所示序列自5'端起第238位点出的碱基是G或者A。
2.根据权利要求1所述的SNP标记,其特征在于,所述SNP标记的GG基因型橡胶树次生乳管列数要显著多于AA基因型橡胶树。
3.一种用于检测权利要求1或2所述的SNP标记的引物对,其特征在于,所述引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示。
4.一种用于检测权利要求1或2所述的SNP标记的试剂盒,其特征在于,其包含权利要求3所述的引物对。
5.一种幼苗期检测橡胶树次生乳管列数性状的方法,其特征在于,提取待测橡胶树的基因组DNA,以待测橡胶树基因组DNA为模板,采用权利要求3所述引物对进行PCR扩增,分析PCR扩增产物的序列,进行权利要求1或2所述的SNP标记的检测,确定待测橡胶树的基因型,从而确定待测橡胶树的次生乳管列数性状。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,SNP位点的基因型为GG时鉴定橡胶树次生乳管列数多,SNP位点的基因型为AA时橡胶树鉴定次生乳管列数少。
7.一种橡胶树的选育方法,其特征在于,提取待选橡胶树群体中各个待选橡胶树的基因组DNA,以所得基因组DNA为模板,采用权利要求3所述引物对进行PCR扩增,分析PCR扩增产物的序列,进行权利要求1或2所述的SNP标记的检测,确定各个待选橡胶树的基因型,从而确定各个待选橡胶树的次生乳管列数性状,对橡胶树进行选育。
8.根据权利要求7所述的选育方法,其特征在于,待选橡胶树群体均是亲本为GG×GA、GA×GG、GA×GA或GG×GG组合的杂交后代。
9.如权利要求1或2所述的SNP标记、或者权利要求3所述的引物对、或者权利要求4所述的试剂盒、或者权利要求5或6所述的方法、或者权利要求7或8所述的选育方法在橡胶树选育中的用途。
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