CN105838809A - 一种与橡胶树乳管数量相关的snp标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与橡胶树乳管数量相关的SNP标记及其应用。其中，该SNP标记为SEQIDNO：1所示核苷酸序列自5’端起第144bp位点处的碱基为C或T。本发明的SNP标记与橡胶树的乳管数量紧密相关，能够有效用于橡胶树的分子标记辅助育种。
Description
技术领域
本发明涉及一种SNP标记及其应用，尤其涉及一种与橡胶树乳管数量相关的SNP标记及其应用。
背景技术
橡胶树是一种在世界经济和军事发展中扮演重要角色的热带树种，其生产的天然橡胶树是一种重要的工业原料和战略物资。目前，中国适宜种植橡胶树的面积有限，实际种植面积已达极限，已经没有扩大种植面积来增加产量的空间，大幅度提高橡胶树单位面积产量是一条适合中国橡胶事业发展和缓解天然橡胶供需矛盾压力的可行性途径。
橡胶树杂交育种一直是产量育种的常规方法，然而常规育种周期长，以及种质资源的匮乏，均制约橡胶树良种培育和产业发展。随着现代分子生物技术的发展，分子标记辅助选择育种能在一定程度上解决上述问题，推动橡胶树育种进程。分子标记辅助选择育种，即分子育种，是传统遗传育种与现代分子生物学有机结合的育种方法，利用DNA分子标记对育种材料进行选择，综合改良选育物种的重要经济性状。近年来，橡胶树分子标记开发和利用工作已取得了一定进展，但远不能满足橡胶树分子育种的需求。
橡胶树树皮中的乳管是天然橡胶合成和贮存的地方，乳管数量是决定天然橡胶产量的一个重要结构因素，因此，现阶段挖掘有效的橡胶树乳管数量性状相关的分子标记，以实现早期产量选种和提高产量育种准确性，从而取得更大产量育种及遗传进展。
发明内容
本发明在于克服现有技术中的不足，提供一种与橡胶树乳管数量相关的，能够有效用于橡胶树选育的SNP标记及其应用等。
其中，SNP(singlenucleotidepolymorphism，SNP，即单核苷酸多态性)是1996年由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心学者Lander提出的一类分子遗传标记，主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP表现出的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现是有转换、颠换、插入和缺失等。
本发明的第一个方面是提供一种与橡胶树乳管数量相关的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记的序列如SEQIDNO：1所示，所述SEQIDNO：1所示序列自5’端起第144bp位点处的碱基是C或T。根据本发明，SEQIDNO：1所示核苷酸序列如下：
CGTTTGTTGTTGTAGGTCTGATTTGAAAGTGTGGTTGTGTACAATAGCTTCTGCTAAGAACTACTGTCTTGCTTTTCAAATAAGAGAAACATCTGAATGGCAATTTGGAAATGCCATCCTTAGTTTATGTTAGCTTTTGACAGXAAAAATGGAATAAGATTTATCTTCATCGCCAAGGAC(SEQIDNO：1)。
发明人发现，该SNP标记的位点处基因型为杂合CT的橡胶树的乳管数量显著多于此处基因型为纯合CC的橡胶树，而纯合TT基因型个体在本发明中尚未发现。进而，根据本发明，通过检测橡胶树的上述SNP，能够有效地确定其乳管数量性状，具体地，如前所述，该SNP位点基因型为杂合CT的橡胶树的乳管数量显著多于此处基因型为纯合CC的橡胶树，例如该SNP位点的基因型为杂合CT时，则能够确定待测橡胶树的属于乳管数量多的个体。由此，发明人确定，本发明的SNP标记与橡胶树的乳管数量性状紧密相关，能够有效用于橡胶树的分子标记辅助育种。进而能够根据实际育种需求对橡胶树育种材料进行早期选择，进一步能够有效提高育种的效率和准确性，提高橡胶树繁殖群体的遗传水平，从而能够准确、高效地选育出橡胶树优良品种。此外，利用本发明的SNP标记进行橡胶树分子标记辅助育种，具有早期筛选、节省时间、成本低廉、准确性高的优点。
本发明的第二个方面是提供一种用于检测本发明第一个方面所述的SNP标记的引物对，所述引物对具有SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示的核苷酸序列。具体地，所述引物对的序列如下所示：
上游引物：CGTTTGTTGTTGTAGGTCTGATTT(SEQIDNO：2)；
下游引物：GTCCTTGGCGATGAAGATAAATCT(SEQIDNO：3)。
根据本发明，利用本发明的引物对能够有效地对待测橡胶树的上述与乳管数量性状相关的SNP标记所在的片段进行PCR扩增，进而通过测序能够有效实现对该SNP标记的检测，确定待测橡胶树该SNP标记位点的基因型，进而能够有效确定待测橡胶树的乳管数量性状。具体地，该SNP标记位点处基因型为杂合CT的橡胶树的乳管数量显著多于此处基因型为纯合CC的橡胶树，尚未发现基因型为纯合TT的橡胶树，例如该SNP位点的基因型为杂合CT时，则能够确定待测橡胶树的属于乳管数量多的个体。由此，用检测前面所述的本发明的SNP标记的引物对，能够有效用于橡胶树的分子标记辅助育种，进而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育橡胶树优良品种。
本发明的第三个方面是提供一种用于检测本发明第一个方面所述的SNP标记的试剂盒，其包含本发明第二个方面所述的引物对。即本发明的试剂盒中包含具有SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示的核苷酸序列的引物对。根据本发明，利用本发明的试剂盒中所包含的引物对，能够有效实现对待测橡胶树的第一个方面所述的与乳管数量性状相关的SNP标记的多态性检测，确定待测橡胶树该SNP标记位点的基因型，进而能够有效确定待测橡胶树的乳管数量性状。具体地，该SNP标记位点处基因型为杂合CT的橡胶树的乳管数量显著多于此处基因型为纯合CC的橡胶树，尚未发现基因型为纯合TT的橡胶树，例如该SNP位点的基因型为杂合CT时，则能够确定待测橡胶树的属于乳管数量多的个体。由此，本发明的用于检测本发明第一个方面所述的SNP标记的试剂盒，能够有效用于橡胶树的分子标记辅助育种，进而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育橡胶树优良品种。
本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的SNP标记、本发明第二个方面所述的引物对或本发明第三个方面所述的试剂盒在橡胶树选育中的用途。
如前所述，通过能够用于检测本发明的与橡胶树乳管数量性状相关的SNP标记的试剂，例如本发明第二个方面所述的引物对或包含该引物对的试剂盒等，能够有效地检测确定待测橡胶树的上述SNP标记的基因型，进而基于获得的基因型能够有效确定待测橡胶树的乳管数量性状，从而能够有效辅助橡胶树选育。
进而，本发明的第五个方面是提供一种检测橡胶树乳管数量性状的方法，通过对待测橡胶树进行本发明第一个方面所述的SNP标记的检测，确定所述待测橡胶树的乳管数量性状。
具体地，可以通过能够用于检测本发明的与橡胶树乳管数量性状相关的SNP标记的试剂，例如本发明第二个方面所述的引物对或包含该引物对的试剂盒等，对待测橡胶树进行PCR扩增、测序，以便检测确定待测橡胶树的上述SNP标记的基因型，进而基于获得的基因型能够有效确定待测橡胶树的乳管数量性状。其中，如前所述，该SNP标记位点处基因型为杂合CT的橡胶树的乳管数量显著多于此处基因型为纯合CC的橡胶树，尚未发现基因型为纯合TT的橡胶树，例如当该SNP位点的基因型为杂合CT时，则待测橡胶树的属于乳管数量多的个体。由此，本发明的检测橡胶树乳管数量性状的方法，能够快速、高效、准确地检测橡胶树乳管数量性状，进而能够有效用于橡胶树的分子标记辅助育种，从而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育橡胶树优良品种。
其中，对待测橡胶树进行SNP标记检测的方法不受特别限制。测序、单链构象多态性聚合酶链式反应PCRsinglestrandconformationpolymorphism，PCR-SSCP)、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应(PCR-restriTCionfragmentlength polymorphism，PCR-RFLP)及飞行时间质谱等技术均可以实现SNP的检测。其中，测序是一种准确性最高、灵活性强，通量大、检测周期短的检测技术。只需在SNP位点的两侧设计一对引物，扩增200-1000bp的产物，再通过测序即可直接检测SNP位点的基因型。因而，本发明采用测序的方法进行SNP标记检测。根据本发明，通过对待测橡胶树进行前面所述的SNP标记的检测，确定所述待测橡胶树的乳管数量性状，进一步包括：提取待测橡胶树的基因组DNA；利用本发明第二个方面所述的引物对，将所述待测橡胶树的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；基于所述测序结果，确定所述待测橡胶树的所述SNP标记的基因型；以及基于所述待测橡胶树的所述SNP标记的基因型，确定所述待测橡胶树的乳管数量性状。由此，能够有效提高检测橡胶树乳管数量性状的效率。
本发明中，提取待测橡胶树的基因组DNA的方法不受特别限制，可以采用任何已知的基因组DNA提取方法或试剂盒进行。根据本发明的一些具体示例，采用CTAB法提取待测橡胶树的基因组DNA。由此，能够有效获得质量好、纯度高的基因组DNA，便于后续步骤进行。
本发明中，将所述待测橡胶树的基因组DNA进行PCR扩增的条件不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，该PCR扩增的扩增体系以25μl计为：100-200ng/μl模版DNA 1μl，10μM的SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示的正向引物和反向引物各1μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，2.5mM dNTP 2.0μl，5U/μl的TapDNA聚合酶0.2μl，水余量。该PCR反应条件为：95℃预变性5min后，94℃30s，60℃30s，72℃1min共30个循环，72℃延伸5min。由此，能够快速、高效、准确地扩增本发明的SNP标记所在的片段，获得目标扩增产物，便于后续步骤的进行。
本发明中，对所述PCR扩增产物进行测序的方法不受特别限制，只要能够有效获得PCR扩增产物即SNP标记所在的片段的序列即可。根据本发明的一些具体示例，可以采用选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子等测序方法的至少一种对所述PCR扩增产物进行测序。由此，能够高通量、快速、高效、准确地获得测序结果。
本发明基于测序结果，通过比对橡胶树参考基因组序列，能够有效确定待测橡胶树的所述SNP标记的基因型为CT还是CC(尚未发现基因型为TT)。
本发明中，所述SNP标记的CT基因型个体的乳管数量显著多于CC基因型个体。即本发明前面所述的SNP标记与橡胶树的乳管数量性状紧密相关。由此，基于确定的待测橡胶树的该SNP标记的基因型，能够准确有效地确定待测橡胶树的乳管数量性状，例如该SNP位点的基因型为CT时，则待测橡胶树的属于乳管数量多的个体。进而本发明的方法能够有效用于橡胶树的分子标记辅助育种，从而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育橡胶树优良品种。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供的SNP标记不受橡胶树的年龄等限制，可用于橡胶树的早期选育，可显著促进橡胶树的育种进程；
(2)检测橡胶树如SEQIDNO.1所示自5’端起第144bp的SNP位点的方法，准确可靠，操作方便；
(3)橡胶树如SEQIDNO.1所示自5’端起第144bp的SNP位点的检出，为橡胶树乳管数量性状的标记辅助选择提供了科学依据。
发明内容
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。
实施例1：与橡胶树乳管数量相关的SNP标记的获得
1.1橡胶树种质材料获得
所采用的群体为橡胶树1981'IRRDB种质，种植于中国热带农业科学院橡胶研究所国家橡胶树种质资源圃，其遗传背景主要来源于巴西亚马逊河流区域阿克里州(Acre)，马托格罗索州(Mato Grosso)和朗多尼亚州三个州。2014年6月，采集34份种质幼嫩叶片液氮冻存带回实验室备用。
1.2橡胶树种质材料DNA提取
取冷冻保存的橡胶树叶片，采用CTAB法提取基因组DNA：(1)称取1g橡胶树嫩叶，液氮速冻后研磨成细粉末，转移到50ml离心管中。(2)加入10ml65℃预热的2×CTAB提取缓冲液(已提前加入2％的β-巯基乙醇)，轻轻转动离心管使植物组织在抽提缓冲液中分散均匀，65℃温育1h，并不时轻轻转动离心管。(3)混合物冷至室温加入等体积的Tris-酚︰氯仿︰异戊醇(25︰24︰1)，然后颠倒离心管使其混匀，注意：不要振荡，防止打断DNA。(4)室温，12000rpm离心10min使其分相。(5)吸取水相至另一离心管中，加人等体积的氯仿：异戊醇(24︰1)，颠倒混匀。室温，12000rpm离心10min。(6)吸取水相至另一离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置20min。(7)室温，14000rpm离心20min。弃上清，沉淀用1ml冰预冷的75％乙醇漂洗2次。(每次漂洗时，室温，14000rpm离心10min)。(8)弃上清，超净工作台上晾干DNA沉淀。然后溶于200μl TE(pH 8.0)缓冲液或ddH2O中。加人1μl RnaseA(10mg/m1)，37℃水浴30min，-20℃保存备用。
1.3采用Sanger法测序获得橡胶树乳管数量相关的SNP标记
基于Sanger法测序平台，对上述群体中9个样本进行产量相关基因测序，分析其核苷酸多态性位点，采用Tassel 3.0_standalone软件分析SNP位点与已知农艺性状的相关性，找到一个与橡胶树乳管数量相关的SNP位点。该位点位于SEQ ID NO：1所示序列的144bp位点处，在SEQ ID NO：1序列中用X表示该处位点，且此处位点的碱基为C或T。该位点处基因型为杂合CT的橡胶树的乳管数量显著多于此处基因型为纯合CC的橡胶树,在所测个体(9个材料)中尚未发现基因型为纯合TT的橡胶树。
实施例2：与橡胶树乳管数量相关的SNP标记的测序验证与应用
2.1扩增含SNP位点的核苷酸片段
以前述提取获得的各待测橡胶树的基因组DNA为模版，利用正向引物F：5'-CGTTTGTTGTTGTAGGTCTGATTT-3'(SEQ ID NO:2)和反向引物R：5'-GTCCTTGGCGATGAAGATAAATCT-3'(SEQ ID NO:3)，扩增出待测SNP所在的核苷酸片段。其中，PCR反应体系为25μl：100-200ng/μl模版DNA 1μl，10μM引物F和R各1μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，2.5mM dNTP 2.0μl，5U/μl的Tap DNA聚合酶0.2μl，水余量；PCR反应条件为：95℃预变性5min后，94℃30s，60℃30s，72℃1min共30个循环，72℃延伸5min。
2.2测序识别SNP位点基因型
将上述步骤中获得的PCR产物经琼脂糖电泳检测、回收并将其插入pMD18-T载体中，每个样品选择6个单克隆进行测序(生工生物工程上海有限公司)，识别SEQ ID NO:1序列中144bp处(即本发明的SNP标记)的基因型。34个待测橡胶树个体该SNP位点的基因型及其乳管数量如下表1所示。
表1 34个待测橡胶树个体该SNP位点的基因型及其乳管数量
| 种质编号 | 基因型 | 乳管个数(个) | 种质编号 | 基因型 | 乳管个数(个) |
| XJA00276 | CC | 95 | XJA03765 | CC | 159 |
| XJA00323 | CC | 37 | XJA03788 | CC | 104 |
| XJA00445 | CC | 83 | XJA04002 | CC | 88 |
| XJA01197 | CC | 184 | XJA04075 | CC | 238 |
| XJA01198 | CC | 146 | XJA04210 | CC | 154 |
| XJA01663 | CC | 89 | XJA04314 | CC | 86 |
| XJA01840 | CC | 227 | XJA04397 | CC | 118 |
| XJA02534 | CC | 177 | XJA04634 | CC | 85 |
| XJA02682 | CC | 120 | XJA04971 | CC | 85 |
| XJA02702 | CC | 120 | XJA04975 | CC | 74 |
| XJA02967 | CC | 121 | XJA05006 | CC | 212 |
| XJA02968 | CC | 157 | XJA05190 | CC | 62 |
| XJA02974 | CC | 61 | XJA05255 | CC | 167 |
| XJA03000 | CC | 74 | XJA05381 | CC | 195 |
| XJA03015 | CC | 99 | XJA05539 | CC | 94 |
| XJA03019 | CC | 89 | XJA05728 | CC | 174 |
| XJA03642 | CC | 116 | XJA05787 | CT | 292 |
2.3SNP位点基因型与乳管数量的关联分析
基于表1的结果，利用Tassel 3.0_standalone软件的一般线性模型分析SNP位点的基因型与乳管数量的关联性，发现该SNP位点的基因型与乳管数量的相关性达到了极显著水平(R2＝0.25222239，p＝0.00399647)。采用DPS软件分析SNP位点基因型频率及乳管数量之间的差异关系如表2，其中杂合CT基因型个体乳管数量均值最高，纯合CC基因型个体乳管数量均值最低，且CT基因型个体乳管数量均值与CC基因型个体乳管数量均值的差异达极显著水平(P<0.01)，纯合TT基因型个体在本群体(34个材料)中尚未发现。进而，证明SEQ ID NO：1所示核苷酸序列自5’端起第144位碱基C或T与橡胶树乳管个数性状显著相关，为橡胶树乳管个数性状相关的SNP标记，该SNP标记的CT基因型个体的乳管数量显著多于CC基因型个体。
表2 本发明SNP位点基因型频率及乳管数量之间的差异关系
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (8)
1.一种与橡胶树乳管数量相关的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记的序列如SEQIDNO：1所示，所述SEQIDNO：1所示序列自5’端起第144bp位点处的碱基是C或T。
2.根据权利要求1所述的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记的杂合CT基因型橡胶树的乳管数量显著多于纯合CC基因型橡胶树。
3.一种用于检测权利要求1或2所述的SNP标记的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示。
4.一种用于检测权利要求1或2所述的SNP标记的试剂盒，其特征在于，其包含权利要求3所述的引物对。
5.如权利要求1或2所述的SNP标记、权利要求3所述的引物对或权利要求4所述的试剂盒在橡胶树选育中的用途。
6.一种检测橡胶树乳管数量性状的方法，其特征在于，通过对待测橡胶树进行权利要求1或2所述的SNP标记的检测，确定所述待测橡胶树的乳管数量性状。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，通过对待测橡胶树进行权利要求1或2所述的SNP标记的检测，确定所述待测橡胶树的乳管数量性状，进一步包括：
提取待测橡胶树的基因组DNA；
利用权利要求3所述的引物对，将所述待测橡胶树的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；
对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；
基于所述测序结果，确定所述待测橡胶树的所述SNP标记的基因型；以及
基于所述待测橡胶树的所述SNP标记的基因型，确定所述待测橡胶树的乳管数量性状。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述SNP标记的杂合CT基因型橡胶树的乳管数量显著多于纯合CC基因型橡胶树。
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