CN103966316B - 一种二倍体泥鳅微卫星家系鉴定方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种二倍体泥鳅微卫星家系鉴定方法，该方法包括二倍体泥鳅全同胞家系的获得；二倍体泥鳅亲本和子代的基因组DNA提取；多态性微卫星标记的筛选和引物的合成：采用荧光PCR反应对亲本及子代的DNA样品进行PCR扩增；以及对亲本基因型和子代基因型进行分析等步骤。本发明选择的微卫星位点等位基因数目多，多态性高，PCR产物稳定可靠，利用这些微卫星位点可帮助子代个体从候选亲本中找到其真正父本和母本的概率分别为97.8%和99.6%，总体鉴定成功率高达97.4%，完全能够满足二倍体泥鳅遗传育种中系谱分析和家系管理的要求，从而为实现该物种的分子育种研究提供有力的技术保障。

Description

一种二倍体泥鳅微卫星家系鉴定方法及其应用

技术领域

本发明涉及鱼类遗传育种的分子标记辅助技术，具体涉及一种利用荧光标记微卫星标记鉴定二倍体泥鳅家系的方法。

背景技术

泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)是一种小型淡水经济鱼类，隶属于鲤形目，花鳅亚科，鳅科、泥鳅属，广泛分布于中国、日本、韩国、俄罗斯以及东南亚等国家和地区，在我国除青藏高原外，从南至北均有分布。泥鳅肉质鲜美、营养丰富，又可入药，被誉为“水中人参”。不仅国内市场需求旺盛，也是我国外贸出口的主要淡水鱼类之一。

泥鳅对环境适应性强，可在池塘、稻田、网箱和木箱进行养殖，也采用无土工厂化养殖，是理想的养殖对象。近几年来，泥鳅人工养殖在我国迅速发展，养殖的苗种多是由野生捕捞或未经系统选育的野生亲本人工繁殖而来，苗种质量良莠不齐，其生长速度、抗病能力和其它养殖性能等还未达到良种化的程度，因此，尽快开展泥鳅良种选育工作是促进泥鳅养殖业稳定、健康发展的必要手段。

在鱼类遗传育种研究中，清晰的系谱信息对于家系的选育和亲本的管理至关重要。传统的水产动物选择育种中，为了保持家系信息，需要对不同的家系分养，所需水体大且不便管理，更重要的是，不同的环境因素会使育种相关的遗传参数估计产生偏差，不利于育种计划的制定。在混合养殖群体中保持家系信息，大多数畜牧上的研究以物理标记为手段，而物理标记对于水产动物存在操作繁琐、对生长产生一定影响等局限性，尤其是对幼体伤害较大。而且，即使可以应用物理标记，也需要鱼体长到足够大时才能操作，标记之前的分养仍会带来环境误差。分子标记的出现使得混养亲缘关系的鉴定成为可能，以微卫星分型为基础的亲子鉴定技术是目前水产动物系谱确认中应用最广泛最可靠的手段之一。已应用到凡纳滨对虾、中国对虾、牙鲆、大菱鲆、哲罗鱼等水产经济动物育种中。目前，尚未见到任何将微卫星标记应用于泥鳅家系鉴定研究的报道。

发明内容

本发明的目的是利用荧光标记的多态微卫星标记建立二倍体泥鳅的亲子鉴定平台，用于泥鳅家系的亲子鉴定和家系管理，为泥鳅分子标记辅助育种提供准确的微卫星标记检测技术。

本发明包括以下四个步骤：

1）选择健康发育良好的二倍体泥鳅作为亲本进行人工全同胞家系繁殖，剪取每个亲本的鳍条组织放于无水乙醇内，于-20℃保存备用；

2）利用醋酸铵法提取二倍体泥鳅亲本和子代的基因组DNA；

3）多态性微卫星标记的筛选和引物的合成：选取8对微卫星引物，按照片段大小分为三组，第一组Mac133、Mac429、Mac37，第二组Mac477、Mac605、Mac456，第三组Ma112、Mac449，在正向引物的5’端分别用FAM、ROX、HEX三种不同的荧光基团进行修饰，用于PCR分析；

4）采用荧光PCR反应对亲本及子代的DNA样品进行PCR扩增，扩增产物按照步骤3）中所选微卫星引物分组的方法进行混合，作为上机检测的样品，样品在ABI3730XL基因分析仪上进行分型，用GS-500LIZ作为内参，用GeneMapper3.5软件读取每个样品的基因型；

5）采用CERVUS3.0软件对亲本基因型和子代基因型进行分析，判定子代个体的父母本。

步骤3）所述的8对微卫星引物的核苷酸序列如下所示：

Mac133  F:CTGCATGCTCTTGCATAGGA R:CATTCATATTCCACCCTCTCG

Mac429  F:TATGTGAGGAAGATAAGCAG R:GAATCCAGATCAAAGCAATC

Mac37   F:GCAAGTACATGCTCATCCTT R:CACCTGCATTCCTTACATCT

Mac605  F:ATTCTGAAGGTCACCGTTGT R:GCAGCCGTTAATACACTGTC

Mac477  F:CTGAGACTCTTTATGTCTCAC R:CTATCAAGGGAACTGAATGG

Mac456  F:TCTCCTCTGACACCATCAGG R:GTACGGACACGAGTCTGGAA

Ma112   F:AGATGTACTGCACTTTCTTTA R:GAATAGCCTATATGTAAATGT

Mac449  F:CCCTCCACTTCAACCCTACA R:GACCCTGCTGTCATCTCACA。

本发明的有益效果是：

1）本发明选择的微卫星位点等位基因数目多，多态性高，PCR产物稳定可靠，利用这些微卫星位点帮助子代个体从候选亲本中找到其真正父本和母本的概率分别为97.8%和99.6%，总体鉴定成功率高达97.4%，完全能够满足二倍体泥鳅遗传育种中系谱分析和家系管理的要求，从而为实现该物种的分子育种研究提供有力的技术保障。

2）本发明首次公开了一种泥鳅微卫星家系鉴定方法（即一种泥鳅亲子鉴定方法），它将极大地推动泥鳅分子育种研究的开展，从而加速泥鳅优良品种的获得。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

1）泥鳅倍性检测及家系的建立

从湖南、湖北和河南三省收集野生泥鳅亲本，利用流式细胞仪进行倍性测定，选择二倍体泥鳅雌雄各20尾，进行人工催产繁殖，雌雄配比1:1，建立20个全同胞家系。剪取每个家系亲本的鳍条组织放于无水乙醇内，并做好家系信息记录，于-20℃保存备用。将20个家系分别放于20个塑料水箱中分养，待鱼苗孵出20天后，从每个家系中随机选取25-30尾鱼，用无水乙醇固定，作为家系鉴定的样本。

2）泥鳅亲本和子代基因组DNA提取；

将每个亲本的鳍条组织和每个子代全鱼（去头和内脏）放于2ml的离心管中，用剪刀将组织剪碎，加入600μL的细胞裂解液(Tris-HCl100mM，pH8.0；EDTA50mm/L，pH8.0；SDS1％，pH8.0；NaCl125mM)，在每个管中加入浓度为20mg/L的蛋白酶K8μL，放入65℃水浴锅中水浴2-4h，每隔半小时摇动下离心管，直到组织充分裂解。将离心管冷却至室温，加入200μL7.5M的醋酸铵，充分摇匀，放置于4℃冰箱内冷却10min，12,000rpm4℃离心10min，取上清液至新离心管。加入与上清液等量的异丙醇，充分混匀，室温下沉淀1-2min，12,000rpm4℃离心10min，弃去异丙醇。加入70％的酒精洗涤DNA，12,000rpm4℃离心10min，弃去70％的酒精。加入无水乙醇，12,000rpm4℃离心10min，弃去无水乙醇，室温干燥约20min，加入50μL双蒸水溶解DNA。用NanoDrop ND-1000紫外分光光度计检测DNA浓度和质量，将各DNA样品稀释至100ng/μL。

3）多态性微卫星标记筛选和反应体系：

对已发表的泥鳅微卫星引物进行筛选，最终选择8对条带清晰，多态性高的引物作为家系鉴定的引物。在每对微卫星引物的正向引物5’端分别用FAM、ROX、HEX三种不同的荧光基团进行修饰(见表1)，引物在上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反应体系为15μL：含有11.3μL双蒸水，1.5μL10×PCR缓冲液，正、反引物各0.2μl（10μm/L），dNTP0.15μL（10mm/L），0.15μL Taq酶（5U/μL），1.5μL DNA模板。扩增反应在C1000DNA EngineThermal Cycler上完成，PCR程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，Ta退火45s，72℃延伸1min，反应进行33个循环；最后72℃再延伸10min。Ta值见表1。

表1用于泥鳅家系鉴定的微卫星引物序列信息和反应条件

其中：F正向引物，R反向引物。

4）微卫星位点基因分型及亲子鉴定分析

扩增产物在ABI3730XL基因分析仪上进行分型，用GS-500LIZ作为内参，用GeneMapper3.5软件读取个体的基因型。采用软件CERVUS3.0计算亲本和子代在各微卫星座位上等位基因频率、杂合度、期望杂合度、多态信息含量、平均排除概率、Hardy-Weinberg平衡及无效等位基因频率，并跟据LOD值鉴定每个家系个体的父母本（见表2）。

5）家系鉴定结果

在模拟分析中（使用CERVUS3.0），用20对亲本模拟产生10000个子代，在80%和95%的置信区间范围内亲子鉴定成功率均可达到100%。在实际鉴定的20个家系540个个体中，有12例没有找到真正的母本，2例没有找到真正的父本，其中1例父母本均发生错配。从候选亲本中找到真正父母亲的概率分别为97.8%和99.6%，总体鉴定成功率为97.4%，能够满足遗传育种中系谱分析和家系管理的要求。

表28个微卫星位点的遗传多样性统计及排除概率

Primer名称	k	HO	HE	PIC	Excl1	Excl2	HW	F(Null)
									Mac37	13	0.681	0.690	0.669	0.313	0.504	***	-0.0115
Mac133	17	0.761	0.870	0.858	0.597	0.748	***	+0.0685
									Mac429	11	0.707	0.770	0.747	0.406	0.589	***	+0.0499
Mac477	12	0.766	0.852	0.835	0.546	0.709	***	+0.0540
									Mac605	14	0.762	0.858	0.843	0.565	0.724	***	+0.0616
Mac456	26	0.713	0.954	0.951	0.825	0.904	ND	+0.1443
									Ma112	23	0.726	0.805	0.783	0.468	0.640	***	+0.0536
Mac449	22	0.661	0.818	0.808	0.514	0.684	***	+0.1158
									平均值	17	0.722	0.827	0.811	0.529	0.688	-	-
累计排除概率					0.9985	0.9999

注：k为等位基因数目，Ho为观察杂合度，HE为期望杂合度，PIC为多态含量，Excl1为双亲未知时排除率，Excl2为已知单亲时排除率，HW为哈迪温伯格平衡检验，ND表示未做检验，***表示偏离极显著，F(Null)表示无效等位基因频率。

Claims (2)

1.一种二倍体泥鳅微卫星家系鉴定方法，其特征在于包括如下步骤：

1)选择健康发育良好的二倍体泥鳅作为亲本进行全同胞家系繁殖，剪取每个亲本的鳍条组织放于无水乙醇内，于-20℃保存备用；

2)利用醋酸铵法提取二倍体泥鳅亲本和子代的基因组DNA，具体方法如下：

将每个亲本的鳍条组织和每个子代全鱼去头和内脏放于2ml的离心管中，用剪刀将组织剪碎，加入600μL的细胞裂解液，在每个管中加入浓度为20mg/L的蛋白酶K 8μL，放入65℃水浴锅中水浴2-4h，每隔半小时摇动下离心管，直到组织充分裂解；将离心管冷却至室温，加入200μL 7.5M的醋酸铵，充分摇匀，放置于4℃冰箱内冷却10min，12,000rpm 4℃离心10min，取上清液至新离心管；加入与上清液等量的异丙醇，充分混匀，室温下沉淀1-2min，12,000rpm 4℃离心10min，弃去异丙醇；加入70％的酒精洗涤DNA，12,000rpm 4℃离心10min，弃去70％的酒精；加入无水乙醇，12,000rpm 4℃离心10min，弃去无水乙醇，室温干燥20min，加入50μL双蒸水溶解DNA；用NanoDropND-1000紫外分光光度计检测DNA浓度和质量，将各DNA样品稀释至100ng/μL；

3)多态性微卫星标记的筛选和引物的合成：选取8对微卫星引物，按照片段大小分为三组，第一组Mac133、Mac429、Mac37，第二组Mac477、Mac605、Mac456，第三组Ma112、Mac449，在正向引物的5’端分别用FAM、ROX、HEX三种不同的荧光基团进行修饰，用于PCR分析；

4)采用荧光PCR反应对亲本及子代的DNA样品进行PCR扩增，扩增产物按照步骤3)中所选微卫星引物分组的方法进行混合，作为上机检测的样品，样品在ABI3730XL基因分析仪上进行分型，用GS-500LIZ作为内参，用GeneMapper 3.5软件读取每个样品的基因型；

5)采用CERVUS 3.0软件对亲本基因型和子代基因型进行分析，判定子代个体的父母本，

步骤3)所述的8对微卫星引物的核苷酸序列如下所示：

Mac133   F:CTGCATGCTCTTGCATAGGA  R:CATTCATATTCCACCCTCTCG

Mac429   F:TATGTGAGGAAGATAAGCAG  R:GAATCCAGATCAAAGCAATC

Mac37    F:GCAAGTACATGCTCATCCTT  R:CACCTGCATTCCTTACATCT

Mac605   F:ATTCTGAAGGTCACCGTTGT  R:GCAGCCGTTAATACACTGTC

Mac477   F:CTGAGACTCTTTATGTCTCAC  R:CTATCAAGGGAACTGAATGG

Mac456   F:TCTCCTCTGACACCATCAGG   R:GTACGGACACGAGTCTGGAA

Ma112    F:AGATGTACTGCACTTTCTTTA  R:GAATAGCCTATATGTAAATGT

Mac449   F:CCCTCCACTTCAACCCTACA   R:GACCCTGCTGTCATCTCACA。

2.权利要求1所述的方法在二倍体泥鳅家系鉴定中的应用。