CN103525749B - 三倍体泥鳅鳍细胞系trmf及其建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种三倍体泥鳅鳍细胞系TRMF及其建立方法。所述三倍体泥鳅鳍细胞系TRMF于2013年8月19日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为C2013110。所述三倍体泥鳅鳍细胞系具有对鲤春病毒血症病毒的易感性。所述三倍体泥鳅鳍细胞系的生物学特性包括:细胞为成纤维细胞样、胞浆丰富贴壁生长、具有接触抑制生长特性，细胞倍增时间为36.01小时，特征染色体数目为75条。

Description

三倍体泥鳅鳍细胞系TRMF及其建立方法

技术领域

本发明涉及一种三倍体泥鳅鳍细胞系TRMF及其建立方法。

背景技术

泥鳅(Misgurnus anguilliCaudatus)在分类学中属于鲤形目(Cypriniformes)、鳅科(Cobitidae)、花鳅亚科(Cobitinae)、泥鳅属(Misgurnus)，是亚洲特有的野生小型淡水鱼类，广泛分布于我国辽河以南大部分地区以及越南、朝鲜和日本。我国各淡水水域，如湖泊、池塘、河溪、水沟、稻田等均有分布。泥鳅肉质细嫩、味美，营养丰富，有“水中人参”之称，除了较高的食用价值，它还具有一定的滋补药用功效，是市场上畅销的特种水产品之一。除了具有重要经济价值外，泥鳅还是一种很好的细胞学、遗传学等方面的研究材料。与二倍体泥鳅相比，三倍体泥鳅具有生长快、抗性强的特点，但目前对这些生物学特性的机理尚没有明确的分析。

鱼类细胞系的建立可用于病毒的分离、环境污染物检测以及其他一些生物学特性的研究。三倍体泥鳅鳍细胞系与其他鱼类细胞系一样可以满足生物学研究、病毒的分离与扩增、功能基因研究以及毒理学等应用研究，除此之外，还可用于三倍体鱼类的生长、抗性等的机制分析。然而，迄今为止还没有三倍体泥鳅鳍细胞系的相关报道。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于提供一种三倍体泥鳅的鳍细胞系TRMF及其建立方法。

所述三倍体泥鳅鳍细胞系TRMF于2013年8月19日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为C2013110。

所述三倍体泥鳅鳍细胞系TRMF支持鲤春病毒血症病毒的生长和 复制。

木发明还提供一种建立三倍体泥鳅鳍细胞系TRMF的方法，包括以下步骤:

I、制备细胞培养液

所用培养基为市售的DMEM/F12培养基，加入胎牛血清、人碱性成纤维细胞生长因子、I型胰岛素样生长因子和硫酸软骨素，配制成所述培养液，胎牛血清占培养液总体积的20％，人碱性成纤维细胞生长因子的终浓度为10ng/ml，I型胰岛素样生长因子的终浓度为20ng/ml，硫酸软骨素的终浓度为10μg/ml，所述培养液存放在4℃;

II、原代培养 

在无菌环境下剪取三倍体泥鳅的鳍组织，先用10wt％的碘伏浸泡剪下的所述鳍组织15分钟，再用含有终浓度为500IU/mL的青霉素和终浓度为500μg/mL的链霉素的混合液浸泡30分钟，然后用无菌PBS漂洗，将漂洗后的鳍组织剪成1mm³左右的小块，均匀接种在没有加入培养液的细胞培养瓶中，在25℃的CO₂培养箱中正置干贴24小时，然后往所述培养瓶中补加所述培养液，在25℃的CO₂培养箱中继续培养;

III、传代培养 

待步骤II的细胞长成单层后，移走培养瓶中的培养液，然后往所述培养瓶中加入0.25％的胰蛋白酶溶液对所述细胞进行消化处理，30秒后吸去胰蛋白酶溶液，利用在瓶底形成一层胰蛋白酶膜继续消化1分钟，加入培养液吹打消化后的细胞，制成细胞悬液，将细胞悬液按预定比例转入新的培养瓶中，并补加培养液，在25℃的CO₂培养箱中培养;

IV、按照步骤III的过程传代，30代后所用培养液为含有20vol％胎牛血清的DMEM/F12培养基。

本发明所提供的三倍体泥鳅的鳍细胞系可用于进行病毒学、病理学、毒理学、免疫学、遗传育种和种质保存等理论研究。此外，该细 胞系还可用于病毒疫苗研制等应用研究。

附图说明

图1是示出在显微镜下本发明三倍体泥鳅鳍细胞系形态的图。

图2是图1所示三倍体泥鳅鳍细胞系的染色体分析图。

图3是对图1所示三倍体泥鳅鳍细胞系进行SSR分析的结果图。

图4是示出图1所示三倍体泥鳅鳍细胞系生长曲线的图。

图5是示出接种鲤春病毒血症病毒四天后，三倍体泥鳅鳍细胞系的形态图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明的三倍体泥鳅的鳍细胞系及其建立方法进行说明。

1、细胞系的建立

所用的三倍体泥鳅是由二倍体泥鳅和四倍体泥鳅杂交获得的。

该三倍体泥鳅的鳍细胞系TRMF的建立过程包括下述三个阶段。

(1)制备细胞培养液

所用培养基为市售的DMEM/F12培养基，加入胎牛血清(FBS)、人碱性成纤维细胞生长因子、I型胰岛素样生长因子和硫酸软骨素，配制成细胞培养液。其中，胎牛血清占培养液总体积的20％，人碱性成纤维细胞生长因子的终浓度为10ng/mL，I型胰岛素样生长因子的终浓度为20ng/mL，硫酸软骨素的终浓度为10μg/mL。配制好的细胞培养液存放在4℃。

(2)原代培养

在无菌环境下剪取三倍体泥鳅的鳍组织。接下来，先用10wt％的碘伏浸泡剪下的鳍组织15分钟，再用青霉素和链霉素的混合液(青霉素终浓度为500IU/mL，链霉素终浓度为500μg/mL)浸泡30分钟。浸泡结束之后，再用无菌PBS(配方:8gNaCl、0.2gKCl、3.639 Na₂HPO₄·12H₂O和0.24_gKH₂PO₄，溶于蒸馏水并定容至1L)漂洗两遍。然后，将漂洗后的鳍组织剪成1mm³左右的小块，均匀接种在没有加入培养液的25cm²细胞培养瓶中，在25℃的CO₂培养箱中正置干贴24小时。然后往细胞培养瓶中补加细胞培养液至5mL/瓶，在25℃的CO₂培养箱中继续培养。

(3)传代培养

待原代培养的细胞长成单层后，将细胞培养瓶中的培养液转移到干净容器中备用。接着往细胞培养瓶中加入1mL0.25％的胰蛋白酶溶液，用于对细胞进行消化处理，30秒后吸去胰蛋白酶溶液，使得瓶底形成一层胰蛋白酶膜，继续消化1分钟，轻柔地磕碰细胞培养瓶。然后将前述转移到干净容器中备用的培养液重新转移入细胞培养瓶中，用吸管吹打细胞，制成细胞悬液。按体积比1：1将细胞悬液转移到两个新的培养瓶中，并分别补加培养液至5mL。在25℃的CO₂培养箱中培养。待细胞再次长成单层后，按照上述方法进行传代。30代后所用培养液为含20vol％FBS的DMEM/F12培养基。

2、细胞系的保存

所用的细胞冻存液配方如下:20％FBS，60％DMEM/F12和20％二甲基亚砜。保存于4℃冰箱中备用。

取生长旺盛的细胞，用0.25％的胰蛋白酶溶液消化。消化结束后，加入细胞培养液重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清，然后用1mL细胞冻存液重悬沉淀。调整细胞浓度至1.0×10⁶个/mL，然后将细胞转入冻存管中。

对细胞悬液逐渐降温，具体降温程序如下:首先在4℃冰箱中放置30min，然后转入-20℃冰箱中放置2h，接着转入-80℃冰箱中放置24h，最后放入液氮中(-196℃)长期保存。

取在液氮中保存的细胞，在40℃水中解冻，待细胞悬液融化后转入25℃水浴中3min。然后将细胞悬液转入离心管，加入等量的DMEM/F12培养基，1500rpm离心5min，弃上清，用含20vol％FBS 的DMEM/F12培养基重悬细胞，转入到25cm²细胞培养瓶中，补加细胞培养液至5mL，在25℃的CO₂培养箱中培养24h。然后更换新鲜的细胞培养液，继续培养。

同时，取少量解冻过程中重悬的细胞液，加入台盼蓝(Trypan Blue)染色，用血球计数板计数，计算细胞的存活率，存活率＝(活细胞数/细胞总数)×100％。

冻存的三倍体泥鳅鳍细胞系TRMF存活率为(84.48±1.13)％。

3、染色体分析 

向培养有三倍体泥鳅鳍细胞的培养瓶中加入终浓度为1μg/mL的秋水仙素，将培养瓶置于25℃的CO2培养箱中继续培养3～5h。然后用0.25％的胰蛋白酶溶液消化，将消化后的细胞转入离心管中，1500rpm离心5min，收集细胞。用0.075mol/L的KCl溶液低渗40min，然后Carnoy固定液固定15min，固定三次后滴片，干燥后用Giemsa染液染色。

显微镜下观察拍照。计数染色体数目，并进行核型分析，根据染色体的长度、着丝点位置、臂长等特征，对染色体进行分组、配对。

本发明所建立的三倍体泥鳅鳍细胞系的染色体核型如图2所示。

4、SSR分析

通过SSR(Simple Sequence Repeats)技术来鉴定所建立的三倍体泥鳅鳍细胞系TRMF是否与泥鳅具有相同的遗传特征。

采用常规的苯酚-氯仿抽提法提取泥鳅肌肉组织(用作阳性对照)和斑马鱼肌肉组织(用作阴性对照)的基因组DNA。

按如下步骤提取三倍体泥鳅鳍细胞系TRMF的基因组DNA：①取出冷冻在-20℃的传代细胞，在4℃解冻后放入1.5mL离心管中，离心后去除上清液;②加入250μL的DNA裂解液(含有10mmol/L Tris-Cl、50mmol/LKCl和0.5％Tween-20，pH8.0)，再加入5μL蛋白酶K(浓度为0.5mg/mL)，于55℃水浴恒温裂解3h;③参照苯酚-氯仿抽提法，用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次。

接下来，进行PCR(Polymerase Chain Reaction)扩增。

根据已报道的泥鳅微卫星标记位点，合成Mac9、Mac50两对引物(具体序列见表1)。

表1

PCR反应体系总体积为25μL，包括

PCR反应条件为:94℃预变性，4min;循环反应35次，循环条件为94℃变性30s，退火30s(退火温度见表1)，72℃延伸30s;72℃末轮延伸10min。

扩增反应结束后，取8μLPCR产物在2％琼脂糖凝胶中进行电泳检测。结果如图3所示，表明本发明所建立的传代细胞系TRMF具有与泥鳅相同的遗传特征。

5、细胞生长曲线

取第50代的三倍体泥鳅鳍细胞，用0.25％的胰蛋白酶溶液消化，然后重悬细胞，按接种密度为3.0×10⁴～5.0×10⁴个/mL、每孔500μL接种细胞于24孔细胞板中，置于25℃的CO₂培养箱中培养。每24h取3孔细胞用血球计数板计数，连续进行7d。

以培养时间(d)为横坐标，细胞浓度(个/mL)为纵坐标，绘制 细胞的生长曲线，如图4所示。根据公式T＝t×Lg2/Lg(N_t/N₀)可计算出细胞的群体倍增时间，其中，N_t为时间t后的细胞数，N₀为接种细胞数。

本发明所建立的三倍体泥鳅鳍细胞系的群体倍增时间为36.01h。

6、细胞及细胞核大小

对细胞的大小进行测定，具体方法如下:取传代的三倍体泥鳅的鳍细胞，用0.25％的胰酶溶液消化，重悬细胞;取200μL细胞悬液，加入等体积的台盼蓝，混匀后加入到血球计数板中。在显微镜下测算细胞直径并进行统计。

细胞直径为12.49±0.07μm，细胞面积是122.51±1.34μm²，细胞体积为1020.31±16.30μm³。

对细胞核的大小进行测定，具体方法如下:在倒置显微镜下观察贴壁细胞，随机选取100个圆形细胞核，在显微镜下测算细胞核的直径并进行统计。

细胞核直径是11.52±0.12μm，细胞核面积为104.17±2.33μm²，细胞核体积是800.11±27.91μm³。

7、病毒敏感性 

取传代48小时后的三倍体细胞，吸去培养液，用PBS漂洗两遍后，加入0.1mL鲤春病毒血症病毒(Spring Viremia of Carp Virus，简称SVCV)的病毒液，轻轻晃动培养瓶使病毒液均匀覆盖在细胞上，然后置于25℃的CO₂培养箱中继续培养。待病毒吸附2h后，吸去病毒液，加入5mL含20vol％FBS的DMEM/F12培养液，在25℃、5％CO₂的条件下继续培养。

同时，设置对照组，以0.1mLDMEM/F12培养基代替病毒液，其他步骤与上述相同。

逐日观察细胞形态的变化，并拍照记录细胞病变效应(CPE)。接种病毒96h后即可观察到部分细胞开始出现明显皱缩，变圆漂浮，出 现明显CPE。随着CPE的加深，细胞裂解死亡加重，7天后大量细胞脱落或解体死亡，贴壁细胞仅剩30％左右。对照组无任何病变反应。

由此证明，三倍体泥鳅鳍细胞系TRMF具有对鲤春病毒血症病毒的易感性。

综合上述，本发明所建立的三倍体泥鳅的鳍细胞系TRMF具有以下生物学特性:细胞为成纤维细胞样、胞浆丰富贴壁生长、具接触抑制生长特性，细胞倍增时间为36.01小时，特征染色体数目为75条。该三倍体泥鳅的鳍细胞系具有对鲤春病毒血症病毒的易感性。

Claims (1)

1.一种三倍体泥鳅鳍细胞系TRMF，于2013年8月19日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为C2013110，所述三倍体泥鳅鳍细胞系支持鲤春病毒血症病毒的生长和复制。