CN105483075B - 一种培养单环刺螠担轮幼虫细胞系的培养基及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种培养单环刺螠担轮幼虫细胞系的培养基及方法，该培养基由L‑15培养基干粉添加20.2g/l NaCl、0.54g/l KCl、0.60g/l CaCl2、1g/l MgSO4、3.9g/l MgCl2、2.92g/l L‑谷氨酰胺，以及总体积5％的胎牛血清、2％的单环刺螠体腔液、1％的单环刺螠卵黄提取液，终浓度100IU/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素制成。所述的培养方法为利用所述培养基进行担轮幼虫的单细胞原代培养，实现早期传代并进行传代培养。本发明培养基成分特异性强，能够对该细胞系的细胞生长增殖提供全面的营养需求，对于构建其它海洋无脊椎动物的担轮幼虫细胞系极具参考价值。
Description
技术领域
本发明属于海洋无脊椎动物细胞培养技术领域，具体涉及一种培养单环刺螠担轮幼虫细胞系的培养基及方法。
背景技术
细胞培养是生物工程中的重要手段和常用方法之一，已广泛应用于染色体分析、细胞代谢、基因表达、免疫、癌变机制、病毒培养、分离、鉴定和药物筛选等研究领域。作为生物学领域中的一项重要技术，动物组织和细胞培养已广泛应用于哺乳动物和鱼类的研究中，并取得了丰硕成果。但由于海洋无脊椎动物细胞在形态、结构和功能以及营养需求等方面的特殊性，自20世纪70年代以来，虽然经过了近半个世纪的努力，仍没有建立起海洋无脊椎动物的永生性细胞系，其细胞培养多停留在原代培养和有限细胞系水平上。海洋无脊椎动物细胞在体外培养环境下难以存活和增殖是当前人们所面临的主要问题，为此研究者们在改进培养条件如优化培养基成分以及探索新的培养方法等方面做出了诸多努力。下面我们将对海洋无脊椎动物细胞培养6大主要生物类群的研究进展做简要叙述。
多孔动物又称海绵动物，具有高度的细胞全能性和再生能力，但由于其特殊的合胞体结构以及常与微生物共生的生理特点，使得海绵细胞培养仍然面临很大的困难，目前仍旧停留在原代培养的水平上。Custodio等(1998)建立的海绵细胞团培养法成为一种有效的海绵细胞体外培养方法。孙黎明等(2006)以繁茂膜海绵(Hymeniacicon perleve)为材料进行了原代培养，应用BrdU摄取法和PCNA检测法，显示了以原细胞为基础建立传代细胞系的可能。
腔肠动物门包括珊瑚、海葵和水螅等。在培养时，多数腔肠动物细胞都只有与细胞外基质相接触时才能存活，而且它们只有附着于由中胶层残片构成的基质上，才能很好地贴壁、铺展和迁移，目前未有培养成功的报道。
环节动物分为3个纲：多毛纲、寡毛纲和蛭纲。其中，只有多毛纲的沙蚕属海产，目前尚未见有沙蚕细胞培养的成功报道。
节肢动物中属海产的种类是甲壳纲动物如虾类。虽然虾类的细胞培养目前仍停留在原代和传代培养阶段上，还没有一个永生性细胞系建立起来，但是在培养方法和技术上已积累了许多经验。研究表明，海产虾类培养最好使用虾的专用培养基(MPS),并添加15％～20％的胎牛血清，有时也可添加20％的虾肌提取液或淋巴液等；比较容易培养的组织主要为心脏、卵巢和血淋巴等。Fraser和Hall(1999)体外培养的卵巢组织细胞中上皮样细胞在Grace培养基中存活不到2个月；成纤维样细胞在2x L-15培养基中形成了连续性细胞单层，成功传代3次，存活了17个月。Owens和Smith(1999)体外培养的心脏组织细胞在体外存活了10个月，细胞的分裂能力在体外维持了40d。Fan等(2002)培养中国对虾(Penaeuschinensis)传代10次以上。Hsu等(1995)利用碱性成纤维细胞生长因子等，使斑节对虾(Penaeus monodon)淋巴器官的细胞在L-15培养基中传了90代。2007年王丹将携带SV40LT转化基因的重组病毒处理原代培养的中国对虾(Penaeus chinensis)淋巴细胞传至12代。2008年Hu等将SV40T基因导入中国对虾淋巴细胞，培养至21代。
软体动物是细胞培养研究开展得最多的一类，培养的对象主要是一些养殖的双壳类和腹足类，培养的组织细胞主要来源于胚胎、鳃、外套膜、神经细胞、血细胞、消化腺和心肌等。Hansen等(1976)建立起了第一个也是迄今为止唯一一个软体动物细胞系：淡水蜗牛胚胎细胞系BGE，但是在建立海洋软体动物细胞系方面，目前尚无类似的成功报道。Odintsova等(2010)将油黑壳菜蛤(Mytilus trossulus)的幼体细胞原代培养近80d；Odintsova等(1991)将虾夷扇贝(Mizuchopecten yessoensis)幼体细胞在体外原代培养了4个月；Plotnikov等(2003)将紫贻贝(Mytilus trossulus)幼体细胞体外培养了6d。
棘皮动物某些类型的细胞在培养过程中易聚集形成细胞团，或相互融合形成单层的合胞体，它们的细胞培养研究开展得很少，虽然棘皮动物具有无与伦比的再生能力，但是其细胞培养还是难获成功，目前仍然停留在原代培养的水平上。
现在研究者们已经充分认识到海洋无脊椎动物细胞的营养需求和生存条件与脊椎动物细胞是有着很大差异的。海洋无脊椎动物细胞培养所使用的培养基除虾的专用培养基(MPS)外，多借鉴脊椎动物或昆虫的培养基，再添加不同成分的生长因子以求细胞能够在体外长期存活并增殖。目前培养基中普遍添加的是胎牛血清，除此外，也有使用其它动物血清或类似物的研究。如Chen等在培养草虾的生殖腺细胞时配合使用15％的小牛血清和5％的马血清也能较好地促进细胞的贴壁和生长；而童裳亮、苗宏志则对小牛血清、对虾肌提取液、虾蛄血淋巴做了对比研究，结果20％的小牛血清和20％的对虾肌提取液配合使用取得了最好的培养效果，但肌提取液不能完全取代小牛血清；虾蛄虽然和对虾种缘关系相近，但添加之后会抑制对虾的细胞生长。因此，从目前的研究结果来看，胎牛血清仍是海洋无脊椎动物细胞培养不可缺少的成分，而另外添加自身来源的成分如相关组织提取液或血淋巴液能更好地促进细胞的生长和分裂。
尽管研究者们做出了诸多努力，但海洋无脊椎动物细胞培养工作进展依然缓慢，始终没有适于海洋无脊椎动物细胞生长和增殖的细胞培养基，没有相对普遍适用的细胞培养方法，没有建立永生化细胞系的报道。单环刺螠(Urechis unicinctus)，隶属螠虫动物门(Echiuroidea)，螠纲(Echiurida)，无管螠目(Xenopneusta)，刺螠科(Urechidae)，刺螠属(Urechis)，是我国黄渤海沿岸的一种经济类海洋无脊椎动物，除较高的食用价值外，还具有潜在的药用价值和底质质量改良作用，并且在生物进化中具有重要的意义。目前，在螠虫动物中尚未见细胞培养的相关研究报道，由此开展体外培养单环刺螠细胞和建立其细胞系将为阐述螠虫动物相关的生物机制、药物筛选、功能基因和病害防治等研究提供便捷的研究工具和平台。
发明内容
本发明的目的在于提供一种培养单环刺螠担轮幼虫细胞系的培养基及方法，旨在解决现有技术无法实现单环刺螠细胞传代培养的问题。
本发明具体通过以下技术方案实现：
一种培养单环刺螠担轮幼虫细胞系的培养基，以1L计量由以下组分组成：13.7gL-15培养基干粉，20.2g/l NaCl、0.54g/l KCl、0.60g/l CaCl2、1g/l MgSO4、3.9g/l MgCl2、2.92g/l L-谷氨酰胺，以及总体积5％的胎牛血清、2％的单环刺螠体腔液、1％的单环刺螠卵黄提取液，终浓度100IU/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素。
所述培养基的pH值为7.2-7.4。
所述的单环刺螠体腔液通过以下方法制备：使用20ml的注射器收集体腔液于灭菌的15ml离心管中，4℃，2500g，离心10min，收集上清液于血清瓶中，经0.45μm、0.22μm微孔过滤除菌，分装到灭菌的1.5ml EP管中，每管1ml，封膜冻存备用。
所述的单环刺螠卵黄提取液通过以下方法制备：解剖发育成熟的虫体获得雌性肾管，剪破肾管收集卵细胞于血清瓶中，置于冰上；在超净台中每次分装1ml卵细胞到15ml离心管中，加入10ml无钙水；冰上超声破碎3min(超15s停10s)，结束后静置5min，再4℃，8000g，离心1h；收集上清液到血清瓶中，0.45μm、0.22μm微孔过滤除菌后分装到1.5ml离心管中，每管1ml，封膜，冻存备用。
本发明还提供了一种培养单环刺螠担轮幼虫细胞系的方法，利用所述培养基进行担轮幼虫的单细胞原代培养，实现早期传代并进行传代培养，具体包括以下步骤：
1)单细胞的获取
挑选活力好、性成熟的雌、雄虫体进行解剖获得肾管，收集其中的精子和卵细胞，进行人工授精，培养受精卵至担轮幼虫，用无菌海水清洗幼虫后，加入无钙水解离幼虫细胞并使用细胞筛收集单细胞；
2)原代培养
将收集的细胞接种到事先添加有培养基的培养皿中，封口，置于23℃生化培养箱中启动原代培养，24h后进行初次换液，将旧培养液基本除净，再加入新鲜培养基；
3)传代培养
待原代培养体系中出现肉眼可见的细胞克隆时，挑取克隆并接种到新的培养皿中继续培养，待细胞覆盖皿底80％时，使用移液管将细胞吹打均匀成细胞悬液，按照1:2的比例进行传代并补充新鲜的培养基。
进一步，步骤(1)中人工授精的条件为：以10:1的精卵比进行人工授精。
进一步，步骤(2)原代培养期间每隔4d换液一次，每次换液1/2，并去除上层漂浮的细胞。
进一步，步骤(3)根据细胞的生长状态，5d传代一次。
本发明的有益效果为：
本发明培养基成分特异性强，能够对该细胞系的细胞生长增殖提供全面的营养需求。该方法对于构建其它海洋无脊椎动物的担轮幼虫细胞系极具参考价值。本发明方法获得的单环刺螠担轮幼虫细胞系已传至65代以上。该细胞系的主要特点是：细胞圆形，核质比大，集落状生长，增殖速度快，传代频率高，可连续稳定的传代，可以进行冷冻保存，能提供大量的单环刺螠担轮幼虫细胞；该细胞系经分子水平的DNA条形码鉴定后，确定其来源于单环刺螠。该细胞系对于单环刺螠功能基因的研究和发育与分化方面的研究等都具有很好的应用价值。
附图说明
图1是本发明倒置显微镜下单环刺螠担轮幼虫原代细胞；
图2是本发明开始继代培养后的细胞克隆；
图3是本发明倒置显微镜下培养的单环刺螠担轮幼虫第20代细胞；
图4是本发明倒置显微镜下培养的单环刺螠担轮幼虫第50代细胞；
图5是本发明单环刺螠担轮幼虫第50代细胞的吉姆萨染色；
图6是本发明单环刺螠担轮幼虫第50代细胞COI基因种属鉴定；其中，M是marker，C是单环刺螠担轮幼虫细胞系的细胞，T是作为对照的体壁组织；
图7是本发明单环刺螠担轮幼虫第47代细胞的生长曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1单环刺螠担轮幼虫细胞系的构建
1)配置培养基
1L完全培养基中，溶有13.7g L-15培养基粉末，添有20.2g/l NaCl、0.54g/l KCl、0.60g/l CaCl2、1g/l MgSO4、3.9g/l MgCl2、2.92g/l L-谷氨酰胺，以及总体积5％的胎牛血清、2％的单环刺螠体腔液、1％的单环刺螠卵黄提取液，和终浓度100IU/ml的青霉素和终浓度100μg/ml的链霉素，pH值为7.2-7.4。
其中，单环刺螠体腔液：使用20ml的注射器收集体腔液于灭菌的15ml离心管中，4℃，2500g，离心10min，收集上清液于血清瓶中，经0.45μm、0.22μm微孔过滤除菌，分装到灭菌的1.5ml EP管中，每管1ml，封膜冻存备用。
其中，单环刺螠卵黄提取液：解剖发育成熟的虫体获得雌性肾管，剪破肾管收集卵细胞于血清瓶中，置于冰上；在超净台中每次分装1ml卵细胞到15ml离心管中，加入10ml无钙水；冰上超声破碎3min(超15s停10s)，结束后静置5min，再4℃，8000g，离心1h；收集上清液到血清瓶中，0.45μm、0.22μm微孔过滤除菌后分装到1.5ml离心管中，每管1ml，封膜，冻存备用。
2)单环刺螠担轮幼虫细胞系的培养
①原代培养
挑选活力好、性成熟的雌、雄虫体进行解剖获得肾管，收集其中的精子和卵细胞，以约10:1的精卵比进行人工授精，继续培养受精卵至担轮幼虫。用无菌海水(0.22μm微孔滤膜过滤)清洗幼虫后，加入无钙水解离幼虫细胞并使用细胞筛收集单细胞。将收集的细胞接种到事先加入1ml完全培养基的培养皿中，封口，置于23℃生化培养箱中启动原代培养。24h后进行初次换液，将旧培养液基本除净，再加入2ml新鲜完全培养基。原代培养期间每隔4d换液一次，每次换液1/2，并去除上层漂浮的细胞。单环刺螠早期担轮幼虫原代细胞如图1所示。
②传代培养
待原代培养体系中出现肉眼可见的细胞克隆(图2)时，即可挑克隆并接种到新的培养皿中继续培养。待细胞覆盖皿底80％左右时，使用移液管将细胞吹打均匀成细胞悬液，按照1:2的比例进行传代并补充新鲜的完全培养基。根据细胞的生长状态，5d传代一次。
如图3和4所示单环刺螠早期担轮幼虫第20代细胞和第50代细胞，细胞形态为圆形，单环刺螠早期担轮幼虫细胞50代的吉姆萨染色如图5所示，显示核质比大，集落状生长。
3)冻存与复苏
细胞的冻存方法：在细胞稳定传代时期，取处于指数生长期、密度80％以上的细胞进行冻存。超净台中收集约107cells/ml的细胞，用1ml含10％二甲亚砜的完全培养基重悬，转移到做好标记的细胞冻存管中封膜，然后放入程序降温盒中，-80℃超低温冰箱中过夜，次日放置到液氮中长期保存。
细胞的复苏：自液氮中取出冻存管迅速置于37℃水浴中快速融化，1500rpm离心5min，沉淀加入完全培养基离心洗涤一次，弃上清后用完全培养基再次重悬并接种培养。24h后换液，尽量除去旧培养基并加入新鲜完全培养基，避免残留的冻存保护液对细胞的慢性伤害。
实施例2分子水平种属鉴定
设计单环刺螠线粒体细胞色素c氧化酶I(COI)基因特异性引物序列COI-F 5’—3’CTCAACAAACCACAAAGACATTGG和COI-R5’—3’TGTAGACCTCTGGATGGCC，PCR扩增该细胞系第50代细胞及作为对照的体壁细胞COI基因，目的片段大小710bp。
反应体系为10μl，包括10x buffer 1μl、2.5μM dNTP 0.8μl、2μM引物各1μl、模板0.2μl、rTaq酶0.05μl。反应程序设置为94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸5min。
产物用1.2％琼脂糖进行凝胶电泳，如图6所示，扩增出的目的条带大小与预期一致，初步判定该细胞系来源于单环刺螠。随后用60μl体系再次进行PCR扩增，反应体系和条件设置同上；将产物进行电泳，并利用生工柱式DNA胶回收试剂盒进行目的条带的回收，再进行连接和转化，挑单菌落培养后送生物公司测序，测序结果显示该细胞系的COI序列与体壁组织细胞的一致，并且二者都与NCBI数据库中的序列高度一致，说明该细胞系来源于单环刺螠。
实施例3细胞生长曲线测定
取单环刺螠担轮幼虫第47代细胞，调整细胞密度105cells/ml，以1ml/well的量接种到24孔板中培养，每隔24h计数一次，每次计数3个孔。以培养时间(d)为横坐标，细胞浓度(cells/ml)为纵坐标，绘制细胞生长曲线。同时根据公式T＝t*lg2/lg(Nt/N0)，计算细胞的群体倍增时间(T)，其中N0为起始接种的细胞数，Nt为培养t时间后的细胞数。
结果如图7所示，细胞在1d内即恢复生长进入对数增殖期，第5d即进入第一平台期，后又继续增长；第8d时进入第二平台期，第9d开始出现衰退。按照公式T＝t*lg2/lg(Nt/N0)计算，单环刺螠早期担轮幼虫细胞的群体倍增时间为38.4h。
Claims (9)
1.一种培养单环刺螠担轮幼虫细胞系的培养基，其特征在于，以1L计量由以下组分组成：13.7g的L-15培养基干粉，20.2g/L NaCl、0.54g/L KCl、0.60g/L CaCl2、1g/L MgSO4、3.9g/L MgCl2、2.92g/L L-谷氨酰胺，以及总体积5％的胎牛血清、2％的单环刺螠体腔液、1％的单环刺螠卵黄提取液，终浓度100IU/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素。
2.根据权利要求1所述的一种培养单环刺螠担轮幼虫细胞系的培养基，其特征在于，所述培养基的pH值为7.2-7.4。
3.根据权利要求1所述的一种培养单环刺螠担轮幼虫细胞系的培养基，其特征在于，所述的单环刺螠体腔液通过以下方法制备：使用20ml的注射器收集体腔液于灭菌的15ml离心管中，4℃，2500g，离心10min，收集上清液于血清瓶中，经0.45μm、0.22μm微孔过滤除菌，分装到灭菌的1.5ml EP管中，每管1ml，封膜冻存备用。
4.根据权利要求1所述的一种培养单环刺螠担轮幼虫细胞系的培养基，其特征在于，所述的单环刺螠卵黄提取液通过以下方法制备：解剖发育成熟的虫体获得雌性肾管，剪破肾管收集卵细胞于血清瓶中，置于冰上；在超净台中每次分装1ml卵细胞到15ml离心管中，加入10ml无钙水；冰上超声破碎3min，超15s停10s，结束后静置5min，再4℃，8000g，离心1h；收集上清液到血清瓶中，依次经过0.45μm和0.22μm微孔过滤除菌后分装到1.5ml离心管中，每管1ml，封膜，冻存备用。
5.一种培养单环刺螠担轮幼虫细胞系的方法，其特征在于，利用权利要求1～4任意一项所述培养基进行担轮幼虫的单细胞原代培养，实现早期传代并进行传代培养。
6.根据权利要求5所述的一种培养单环刺螠担轮幼虫细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)单细胞的获取
挑选活力好、性成熟的雌、雄虫体进行解剖获得肾管，收集其中的精子和卵细胞，进行人工授精，继续培养受精卵至担轮幼虫，用无菌海水清洗幼虫后，加入无钙水解离幼虫细胞并使用细胞筛收集单细胞；
2)原代培养
将收集的细胞接种到事先添加有培养基的培养皿中，封口，置于23℃生化培养箱中启动原代培养，24h后进行初次换液，将旧培养液基本除净，再加入新鲜培养基；
3)传代培养
待原代培养体系中出现肉眼可见的细胞克隆时，挑取克隆并接种到新的培养皿中继续培养，待细胞覆盖皿底80％时，使用移液管将细胞吹打均匀成细胞悬液，按照1:2的比例进行传代并补充新鲜的培养基。
7.根据权利要求6所述的一种培养单环刺螠担轮幼虫细胞系的方法，其特征在于，步骤(1)中人工授精的条件为：以10:1的精卵比进行人工授精。
8.根据权利要求6所述的一种培养单环刺螠担轮幼虫细胞系的方法，其特征在于，步骤(2)原代培养期间每隔4d换液一次，每次换液1/2，并去除上层漂浮的细胞。
9.根据权利要求6所述的一种培养单环刺螠担轮幼虫细胞系的方法，其特征在于，步骤(3)根据细胞的生长状态，5d传代一次。
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