CN109971710B - 建鲤脑细胞系及其建立方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种建鲤脑细胞系及其应用，通过建鲤的脑组织，并采用合适的浓度的胰酶以及设置合理的消化条件，原代分离得到建鲤脑细胞，经传代培养后首次建立了建鲤脑细胞系CCB‑J，其主要表现为上皮样细胞，可以稳定传代超过60代，本发明的建鲤脑细胞系在病毒学、毒理、生理、分子遗传学以及发育生物学领域具有很高的研究及应用价值，例如：在病毒的鉴定与毒株分离中的应用，在制备预防或治疗建鲤病毒的疫苗中的应用，作为用于药物筛选、药物制备、药物评价的生物模型中的应用等。

Description

建鲤脑细胞系及其建立方法与应用
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，特别涉及一种建鲤脑细胞系及其建立方法与应用。
背景技术
建鲤(Cyprinus carpio var.jian)隶属于鲤形目(Cypriniformes)，鲤科(Cyprinidae)，鲤属(Cyprinus)，是以特定的荷包红鲤(C.carpio var.wuyuanensis)和沅江鲤(C.carpio yuankiang)为亲本，经6代定向选育育成的良种。建鲤肉质风味好，适应性和抗病力强，饲料转化率高，适合全国各地多种方式养殖，其特点明显优于国内现有鲤鱼和国外引进品种，是我国最主要的鲤鱼养殖品种之一。
鱼类细胞系是进行病毒学、毒理、生理、分子遗传学以及发育生物学等研究的重要基础材料。目前已经建立起鲤鱼和锦鲤不同组织来源的细胞系，然而即便是同一物种的遗传结构、遗传多样性和遗传差异，也是不容忽视的，不同的物种的生物学特性存在较大的差异，不同的鱼类细胞系更是具有不同的优势或局限性，而目前建鲤(Cyprinus carpiovar.jian)的脑细胞系建立及其应用研究仍处于空白。因此，有必要提供一种建鲤脑细胞系及其应用，以丰富可以用于病毒学、毒理、生理、分子遗传学以及发育生物学等研究的鱼类细胞系种类。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种建鲤脑细胞系及其应用。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种建鲤脑细胞系，保藏编号为：CCTCC NO：C201933。
本发明还提供了上述保藏编号为CCTCC NO：C201933的建鲤脑细胞系的建立方法，具体技术方案如下：
保藏编号为CCTCC NO：C201933的建鲤脑细胞系的建立方法，包括以下步骤：
(1)取建鲤鱼苗的脑组织，洗涤、剪碎，胰酶消化；所述胰酶消化为：向建鲤鱼苗脑组织中加入胰酶，消化后，离心，弃上清，重悬；
(2)将步骤(1)消化得到的细胞采用含胎牛血清的L-15培养基培养，得原代建鲤脑细胞；
(3)将原代建鲤脑细胞，传代至超过60～70代后，得到建鲤脑细胞系CCB-J。
本发明还提供一种上述保藏编号为CCTCC NO：C201933的建鲤脑细胞系的应用，具体技术方案如下：
保藏编号为CCTCC NO：C201933的建鲤脑细胞系在构建毒理学、生理学、分子遗传学或发育生物学的生物研究模型中的应用。
保藏编号为CCTCC NO：C201933的建鲤脑细胞系在病毒的鉴定与毒株分离中的应用。
保藏编号为CCTCC NO：C201933的建鲤脑细胞系在制备预防或治疗疱疹病毒的疫苗中的应用。
保藏编号为CCTCC NO：C201933的建鲤脑细胞系作为用于药物筛选、药物制备、药物评价的生物模型中的应用。
基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
本发明通过发明人的大量创造性劳动，通过选用建鲤的脑组织，并采用合适的浓度的胰酶以及设置合理的消化条件，分离得到建鲤脑细胞，并首次建立了建鲤脑细胞系CCB-J，其主要表现为上皮样细胞，可以稳定传代超过60代，该脑细胞系CCB-J可稳定转染表达外源蛋白、染色体数目在68～140之间、基因序列与普通鲤鱼高度一致，该CCB-J细胞于病毒感染后10天即可观察到病变，每106个CCB-J细胞的病毒拷贝数为6.84×108，每106个CCB细胞的病毒拷贝数为1.96×108，可见CCB-J细胞病毒拷贝数为普通CCB细胞的3.5倍，相对于普通CCB细胞，具有对病毒的敏感性更高，在病毒学、毒理、生理、分子遗传学以及发育生物学领域具有很高的研究及应用价值，例如：在病毒的鉴定与毒株分离中的应用，在制备预防或治疗鱼类病毒的疫苗中的应用，作为用于药物筛选、药物制备、药物评价的生物模型中的应用等。
附图说明
图1为原代分离的建鲤脑细胞的细胞形态；
图2显微镜下观察到的第50代建鲤脑细胞系CCB-J的细胞形态；
图3为不同血清浓度的CCB-J细胞的生长曲线；
图4为不同温度条件的CCB-J细胞的生长曲线；
图5为CCB-J细胞转染24h后EGFP蛋白获得表达的倒置荧光显微镜观察结果；
图6为建鲤CCB-J细胞中期分裂相细胞的染色体数目；
图7为建鲤CCB-J细胞被KHV病毒感染后的细胞病变及透射电镜观察结果；
图8为建鲤CCB-J细胞病变细胞的DNA与反转录得到的cDNA的凝胶电泳检测结果对比；
图9为建鲤CCB-J细胞病变细胞的DNA与与反转录得到的cDNA的序列比对结果；
图10为CCB-J和CCB细胞在感染KHV的病变对比；
图11为KHV感染的CCB-J细胞系上筛选板蓝根注射液和穿心莲注射液。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明提供一种建鲤脑细胞系，保藏编号为：CCTCC NO：C201933，已于2019年3月16日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内武汉大学第一附小对面，邮编：430072)。该细胞系呈上皮样细胞形态。
该细胞系的建立包括以下步骤：(1)取建鲤鱼苗的脑组织，洗涤、剪碎，胰酶消化；所述胰酶消化为：向建鲤鱼苗脑组织中加入胰酶，消化后，离心，弃上清，重悬；(2)将步骤(1)消化得到的细胞采用含胎牛血清的L-15培养基培养，得原代建鲤脑细胞；(3)将原代建鲤脑细胞，传代至超过60～70代后，得到建鲤脑细胞系CCB-J。
优选地，所述胰酶为含有EDTA的胰酶。更优选地，胰酶的浓度为0.05％，含有36.5mM的EDTA。其主要是在合适的时间和条件下，用于消化建鲤脑组织，制备得到活力好的建鲤原代细胞，该原代细胞可经传代培养稳定传代，并建立得到呈上皮样的建鲤脑细胞系CCB-J。
具体的，制备得到原代建鲤脑细胞的条件为：胰酶25±2℃消化25～35min后，于25±2℃、250～350g离心5±1min，弃上清，重悬，并采用含15％～20％胎牛血清的L-15培养基，于25±1℃培养，得原代建鲤脑细胞。
优选的，制备得到原代建鲤脑细胞的条件为：胰酶25℃消化30min后，于25℃、300g离心5min，弃上清，重悬，并采用含20％胎牛血清的L-15培养基，于25℃培养，得原代建鲤脑细胞。更优选地，L-15培养基中含有双抗，双抗与培养基的体积比为1:100。
优选地，原代建鲤脑细胞，采用含15％～20％胎牛血清的L-15培养基，于25±1℃培养，每天更换40～60％的培养基，细胞长满后传代，传代至超过60～70代后，得到建鲤脑细胞系CCB-J。更优选地，置于25℃培养，每3天更换50％培养基，细胞长满后胰酶消化，传代培养。所述传代培养为1:(1～3)传代，更优选为1:2。
本发明还提供上述建鲤脑细胞系的应用，包括：(1)在构建毒理学、生理学、分子遗传学或发育生物学的生物研究模型中的应用。(2)在鱼类病毒的分离、繁殖中的应用。优选为在疱疹病毒的分离、繁殖中的应用。(3)在制备预防或治疗鱼类病毒的疫苗中的应用。(4)作为用于药物筛选、药物制备、药物评价的生物模型中的应用。其中，包括药物的药效评价、药物安全性评价、药物代谢分析。该药物可以是用于预防或治疗神经系统相关疾病的药物，或任一种用于预防或治疗疱疹病毒感染所致的疾病的药物。
下面结合具体实施例对本发明作详细说明：
实施例1建鲤脑细胞的分离与脑细胞系的建立
无菌条件下，取1尾健康建鲤鱼苗(10-15cm)的脑组织，PBS洗涤3次，剪碎后加入含有36.5mM EDTA的0.05％胰酶(EDTA:胰酶＝1:100)(0.25％胰酶:PBS＝1:4)5mL，25℃消化30min，取消化液1mL，300g 25℃离心5min，弃上清，细胞沉淀用含有20％胎牛血清(Gibco)的L-15(Gibco)培养基(双抗:培养基＝1:100)悬浮，接种6孔板，置于25℃培养。每3天更换孔中50％培养基，培养2周后，原代分离得到的建鲤脑细胞开始生长，如图1所示。待孔中的细胞长满，胰酶消化后转至25cm2细胞培养瓶，待细胞生长至>90％融合度后，0.05％胰酶消化，1:2传代培养。1:2传代后，5～7d可长至>90％融合度。随着传代次数增加，45代后，观察到细胞多呈现上皮样，如图2所示。目前，细胞传代已经超过60代，该细胞系命名为建鲤脑细胞系(CCB-J)。
上述建鲤脑细胞系已于2019年3月16日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内武汉大学第一附小对面，邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：C201933。
传代细胞的冻存与复苏：
传代细胞生长至>90％融合度后，0.05％胰酶消化，加入适量完全L-15培养基(20％胎牛血清，1％双抗)吹打混匀，300g 25℃离心5min，弃上清，用细胞冻存液(DMSO:胎牛血清＝1:9)将细胞沉淀吹打均匀，1mL/管分装，放入Nalgene冻存盒置-80℃过夜，次日转入液氮冻存。细胞在液氮中冻存6个月后复苏，冻存管放入37℃水浴，轻轻晃动冻存管使细胞快速解冻，将细胞悬液加入含有10mL完全L-15培养基的25cm2细胞培养瓶，置于25℃培养，细胞贴壁后次日更换新鲜的完全L-15培养基，继续传代培养。
培养基中不同血清浓度对建鲤脑细胞生长的影响实验：
1×105/mL的细胞按照100μL/孔接种于96孔板，将培养基中的胎牛血清浓度调整为5％、10％、15％、20％，置25℃培养，连续培养8天，每天取样，采用CCK-8(Genview)试剂盒分析细胞增殖情况，结果如图3所示，随着培养基血清浓度的升高，细胞的生长越来越好，其中20％的血清浓度是细胞生长的最佳浓度。
不同温度下培养对建鲤脑细胞生长的影响实验：
1×105/mL的细胞500μL/孔接种于24孔板(20％胎牛血清)，将细胞分别置于20℃、25℃、30℃，连续培养7天，每天取样，采用血球计数板分析细胞增殖情况，结果如图4所示，建鲤脑细胞系在30℃虽然能够生长，但是细胞状态不佳，细胞老化、变形、空泡增多等等，因此选择25℃作为细胞的培养温度。
转染试验：
25μL
Figure BDA0002040459380000061
Medium、1μL p3000TM Reagent试剂与0.5μg pEGFP-N1质粒混匀后加入25μL
Figure BDA0002040459380000062
Medium和0.75μL LipofectamineTM3000 Reagent的混合物，两者混匀后制备成转染复合物。传代细胞胰酶消化后300g 25℃离心5min，细胞沉淀用完全培养基吹散，取500μL与上述转染复合物等体积混合，转入24孔板，置25℃培养。转染24h后荧光倒置显微镜观察。如图5所示，可见，采用LipofectamineTM3000转染试剂可以将pEGFP-N1质粒转入建鲤脑细胞系，转染24h后EGFP蛋白获得表达。
实施例2染色体分析与18S分子鉴定
选择>75％融合度的传代细胞(30代)加入终浓度1μg/mL的秋水仙素，诱导16h后胰酶消化；25℃200g离心5min收集细胞，加入固定液(冰醋酸:甲醇＝1:3)固定5min后200g 25℃离心5min，弃上清；再重复固定2次，每次固定25min；将离心得到的沉淀用300μL固定液悬浮，冷滴片法滴片；室温干燥后吉姆萨染色20min，镜检。
其中，统计100个中期分裂相细胞的染色体数目，结果显示，CCB-J染色体数目在68～140之间，其众数为100，结果如图6所示。
采用基因组提取试剂盒(Tiangen)，提取建鲤脑细胞基因组DNA，参照NCBI中GenBank的序列(登录号：JN628435.1)，设计引物J18S-F(5’-GCCTGAGAAACGGCTACCACATC-3’，SEQ ID NO.1)和J18S-R(5’-TTATCGGAATGAACCAGACAAATCG-3’，SEQ ID NO.2)扩增建鲤脑细胞18S的部分片段，扩增片段测序后采用blast分析。本发明扩增的建鲤脑细胞18SrDNA部分序列，与GenBank中的普通鲤鱼一致性达到100％。
实施例3建鲤CCB-J脑细胞系在KHV病毒学研究中的应用
取实验室分离的疱疹病毒KHV感染建鲤传代细胞(病毒:L-15完全培养基＝1:10)，待细胞病变达到90％后制成电镜样品。收集细胞瓶中的培养基，加500μL胰酶消化贴壁细胞并用收集的培养基终止消化。将细胞悬液300g 25℃离心5min，弃上清；用2mL PBS重复悬浮两次，弃上清；用2.5％戊二醛溶液(pH7.4)在4℃固定沉淀3h后，缓冲液反复冲洗样品3次，每次15-30min；再用1％锇酸固定3h，缓冲液反复冲洗3次，每次15-30min；用酒精梯度脱水并用环氧丙烷置换出酒精；最后将浸透好的样品包埋于环氧树脂。超薄切片机对样品进行切片，经醋酸铀酰和柠檬酸铅染色后，透射电子显微镜观察。传代细胞感染KHV 10天后，出现明显的病变。透射电镜表明，细胞中病毒颗粒的核衣壳直径在110nm左右，结果如图7所示，箭头示部分病毒核衣壳。
取实验室分离的疱疹病毒感染建鲤传代细胞，25℃培养10天，每天观察细胞病变(CPE)情况，待细胞病变达到75％后取样进行RT-PCR。
用RNAiso plus(TaKaRa)分别处理病变细胞和不感染KHV的细胞，按照说明书提取细胞RNA。采用cDNA的合成步骤对RNA进行反转录(Vazyme)。用DNA提取试剂盒(Tiangen)并按照说明书提取病变细胞的DNA。采用根据ORF131序列(KP004905.1)设计的引物131RTF(5’-TTTCTGGTTTGGAGCTTTACT-3’，SEQ ID NO.3)、131RTR(5’-GCCCTGGATGCTGCTAAT-3’，SEQID NO.4)对合成的cDNA和提取的DNA进行PCR检测，扩增到的序列经1％琼脂糖凝胶电泳显示出对应的条带；再将扩增到的序列纯化后转入pClone007载体，得到的菌液测序后经blast在线与已知的序列进行比对。RT-PCR结果显示，用设计的131引物可以扩增689bp的cDNA和918bp的DNA，RT-PCR的1％凝胶电泳结果如图8。序列Clustal X比对的结果证明，cDNA和DNA序列有相似之处，不同之处在于DNA跨过的部分正是ORF131第二个内含子的碱基，如图9所示。以上这些都证明了病毒在传代细胞上有复制。
实施例4 CCB-J细胞与CCB细胞的病毒敏感性对比
CCB细胞为：普通鲤鱼脑细胞。
CCB和CCB-J生长至>90％融合度后，0.05％胰酶消化，加入适量完全培养基，吹打均匀后，按照每板3个孔，每孔500μL的规格，将细胞分别分装到24孔板。待细胞生长至>80％融合度，用KHV毒株分别感染这两种细胞并在25℃培养。每天用倒置显微镜观察细胞病变。根据感染的时间，取CCB和CCB-J感染0天至16天的细胞板，并在-80℃进行反复冻融3次。所有的样品分别取100μL，根据天根DNA提取试剂盒的说明书提取DNA。参照Gilad等(2004)的方法，利用TaqMan技术用于扩增KHV基因和葡萄糖激酶基因，用GraphPad Prism软件分析不同感染天数每106个宿主细胞中病毒拷贝数的变化。
显微镜观察发现，CCB-J细胞在感染KHV的第10天出现明显的病变并且细胞从培养瓶中裂解和脱落(图10-B)，而CCB细胞未见病变(图10-A)。TaqMan PCR方法检测到对应细胞系的病毒拷贝数和细胞数，在感染后的第10天，每106个CCB-J细胞的病毒拷贝数为6.84×108，每106个CCB细胞的病毒拷贝数为1.96×108，两者有显著性差异(P<0.05)；在0天和16天，两个细胞系均有相似的病毒拷贝数，两者没有显著性差异(P>0.05)(图10-C)。
实施例5建鲤CCB-J脑细胞系在抗病毒药物筛选的应用
参照李俊超(锦鲤疱疹病毒诱导的细胞凋亡与抗病毒药物筛选[D]，2014)的方法，药物筛选按照先给药后感染的方案进行，实验分为3组，分别为病毒感染无药物组、30mg/mL板蓝根+病毒感染组和30mg/mL穿心莲+病毒感染组在96孔板上，每组4个重复孔，采用细胞病变(CPE)记录先给药后感染的方式下药物抗病毒的效果。按照实施例1所述的方法，将生长至>90％融合度的CCB-J细胞分装至96孔板。待孔中的细胞生长至>80％融合度，将稀释的药物按照每孔100μL的剂量在25℃吸附4h，再用疱疹病毒KHV感染CCB-J细胞2h，最后保持每孔100μL完全培养基。每天观察CPE情况，CPE的记录方法：-为无细胞病变；+为低于25％的细胞病变；++为25％～50％的细胞病变；+++为50％～75％的细胞病变；++++为75％～100％的细胞病变。
显微镜观察发现，KHV对照组的CCB-J细胞在感染后第5天出现细胞拉丝、脱落等病变现象(图11-A)；当CPE达到++++时，浓度为30mg/mL板蓝根注射液组的细胞生长状态良好(图11-B)，在实验中产生的CPE为+，板蓝根能够抑制KHV在CCB-J细胞中的增殖；浓度为30mg/mL穿心莲注射液组的细胞发生拉丝和溶解，死亡细胞增多(图11-C)，在实验中产生的CPE为++++，穿心莲对KHV的复制无抑制作用。说明建鲤CCB-J脑细胞系可以作为筛选抗病毒药物的体外细胞模型。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所
<120> 建鲤脑细胞系及其建立方法与应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcctgagaaa cggctaccac atc 23
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttatcggaat gaaccagaca aatcg 25
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttctggttt ggagctttac t 21
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gccctggatg ctgctaat 18

Claims (6)

1.一种建鲤脑细胞系，其特征在于，保藏编号为：CCTCC NO：C201933。
2.如权利要求1所述的建鲤脑细胞系在构建毒理学、生理学、分子遗传学或发育生物学的生物研究模型中的应用。
3.如权利要求1所述的建鲤脑细胞系在鱼类病毒的分离、繁殖中的应用，所述鱼类病毒为疱疹病毒，所述疱疹病毒为KHV。
4.如权利要求1所述的建鲤脑细胞系在制备预防或治疗鱼类病毒的疫苗中的应用，所述鱼类病毒为疱疹病毒，所述疱疹病毒为KHV。
5.如权利要求1所述的建鲤脑细胞系作为用于药物筛选、药物制备、药物评价的生物模型中的应用，所述药物为用于预防或治疗疱疹病毒感染所致的疾病的药物，所述疱疹病毒为KHV。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物评价包括：药物的药效评价、药物安全性评价、药物代谢分析。
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