CN108753703A

CN108753703A - 一种牙鲆胚胎肌卫星细胞系建立方法

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Publication number: CN108753703A
Application number: CN201810595380.6A
Authority: CN
Inventors: 聂苗苗; 谭训刚; 尤锋; 吴志昊; 焦爽; 肖鹏; 娄雅楠; 梁冬冬
Original assignee: Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2018-06-11
Filing date: 2018-06-11
Publication date: 2018-11-06
Anticipated expiration: 2038-06-11
Also published as: CN108753703B

Abstract

本发明涉及海水鱼类胚胎细胞培养技术，具体说是一种牙鲆胚胎期肌卫星细胞系的建立方法。将牙鲆克氏囊形成期的胚胎经过体外分离，去除卵膜，分散细胞，经原代培养和传代培养，继而建立胚胎期肌卫星细胞系。本发明建立的牙鲆胚胎肌卫星细胞系形态为梭形或者纺锤形单核细胞。单代内如培养超过5天或者进行外源因子(马血清)诱导均能够分化形成肌纤维。该细胞系能提供大量肌卫星细胞，经GFP转染及半滑舌鳎脾肾坏死病毒攻毒实验检测，都可以正常转染或被感染。故其不仅可以直接用于鱼类肌肉生长发育相关功能基因的研究，为探索其肌肉细胞的诱导、增殖及分化的分子机制提供研究材料，而且为牙鲆育种中肌肉性状的改良研究及应用提供平台。

Description

一种牙鲆胚胎肌卫星细胞系建立方法

技术领域

本发明涉及海水鱼类胚胎细胞培养技术，具体说是一种牙鲆胚胎期肌卫星细胞系的建立方法。

背景技术

动物细胞系及细胞培养已经成为生理学、免疫学、病毒学、发育生物学、基因功能以及毒理学等研究必不可少的工具和载体。鱼类养殖业的不断发展，需要对鱼类生长发育、疾病爆发等及其机制开展研究，同时也提出了更前沿生物技术育种技术开发的需求，日益增长的海洋等水环境保护需求也延伸了有关鱼类毒理研究的发展，而这些都将离不开鱼类细胞系平台，故其培养备受重视。自1962年第一个鱼类细胞系建立起，越来越多的鱼类细胞系建立成功并得到应用。胚胎的细胞有别于成体组织，其分化程度低，分裂能力强，多样性高，其应用范围更广，故成为细胞培养的首选。而鱼类胚胎细胞原代细胞培养多数采用饲养层细胞、添加鱼类血清进行培养，以增加细胞生存能力。而鱼类胚体期胚胎细胞系的建立尚未见到报道。有关肌肉肌卫星细胞系，已有报道也都是从幼鱼或者成体肌肉组织分离的，如虹鳟(Jean et al.，2010)、牙鲆(Peng et al.，2016)，即从鱼类胚胎中分离出肌卫星细胞未见到报道。我们首次从牙鲆胚体期胚胎中分离出肌卫星细胞，并进行体外培养，经过GFP转染及病毒攻毒检测，细胞均能正常转染或感染，故将为研究牙鲆等鱼类肌肉生长、相关性状改良及毒理等研究提供平台。

发明内容

本发明在于提供一种操作简单、稳定的牙鲆胚胎期肌卫星细胞系的构建方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种牙鲆胚胎肌卫星细胞系，将牙鲆克氏囊形成期的胚胎经过体外分离，去除卵膜，分散细胞，经原代培养和传代培养，继而建立胚胎期肌卫星细胞系。

经体视镜下取发育到克氏囊形成期的受精卵，用灭菌海水清洗，再经含双抗的PBS清洗，清洗后去除PBS，用灭菌研杵轻轻压破胚胎外膜，使胚胎破膜而出，并轻轻垂直压迫胚胎，使细胞尽量分离，分散后于DF12完全培养基中进行原代培养。

所述分散的细胞转移到DF12完全培养基中培养，于25℃下正置培养，待细胞团完成贴壁后补加DF12完全培养基，实现原代培养。

待上述经原代培养的细胞团周围细胞迁出并增殖铺满时，吸弃培养基，经PBS冲洗，加入0.25％的胰蛋白酶消化液消化；待细胞70％变圆，吸弃胰酶，终止消化后加入DF12完全培养基形成悬浮细胞液；而后利用细胞培养基按1:1-1:3(V/V)的比例分瓶传代培养，之后根据细胞汇合度(80％以上)7-10天传代一次，15代后每2-3天传代一次；在25-30代后，通过稀释法克隆培养，选择优势细胞逐渐分离出单一细胞并不断地传代，进而细胞系构建成功。

所述构建的细胞系能够分化，并表达肌球蛋白。

所述通过稀释法克隆培养，即以极低密度(10-10²个/mL)的细胞接种于多个T25细胞瓶中进行培养，选择优势细胞逐渐分离出单一形态的细胞并不断地传代，进而细胞系建立成功。

所述细胞培养基为在DF12培养基中加入占培养基总体积20％的胎牛血清，10ng/mL人碱性成纤维生长因子，15ng/mL表皮生长因子，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，100μmol/L NEAA(非必需氨基酸)，27.5nmol/Lβ-巯基乙醇，2nmol/mL L-谷氨酰胺，pH值为7.2-7.4。

具体构建为：

(1)原代培养，将牙鲆第1天胚体期胚胎，清洗后，无菌下去除卵膜并压迫分散细胞，然后将分散的细胞转移到含有1mL细胞完全培养基的细胞瓶中，于25℃下正置培养，待细胞团完成贴壁后补加1mL完全培养基。

(2)传代培养，待上述经原代培养的细胞团周围细胞迁出并增殖铺满细胞瓶时，吸弃完全培养基，PBS冲洗1次，加入0.25％的胰蛋白酶消化液消化；待细胞70％变圆，吸弃胰酶，加2mL完全培养基终止消化，并悬浮细胞。而后利用细胞完全培养基按1:1-1:3(V/V)的比例分瓶传代培养，之后根据细胞汇合度(80％以上)7-10天传代一次，15代后每2-3天传代一次。

在步骤(1)中，体视镜下观察牙鲆受精卵，取上浮的正常发育的克氏囊形成期的胚胎(约50粒)置于无菌培养皿中，用灭菌海水洗5遍，每次2min。然后，将胚胎转移到另一新的无菌培养皿中，先用灭菌海水冲洗3次，再用含双抗(400U/mL青霉素，400μg/mL链霉素)的PBS洗3遍，吸弃液体。用灭菌研杵轻轻压破胚胎外膜，使胚胎破膜而出，并轻轻垂直压迫胚胎，使细胞尽量分离。加2mL DF12完全培养基，轻轻晃动，充分混匀。将80目灭菌筛绢置于培养皿上，倾斜培养皿，用移液器吸取过滤的上清液约1mL，转移至T25培养瓶中，25℃培养箱中培养。24h后补加1mL新的DF12完全培养基培养。

在步骤(2)中，在第10代后，通过常规稀释法克隆培养，即以极低密度(10-10²个/mL)的细胞接种于多个T25细胞瓶中进行培养，选择优势细胞逐渐分离出单一形态细胞并不断地传代，进而细胞系构建成功。

所述建立的牙鲆胚胎期肌卫星细胞系的构建方法同样适用于其它海水鱼类，即本发明使用的牙鲆胚胎可以用其它海水鱼类的胚胎代替，比如半滑舌鳎、真鲷或者星斑川鲽等。

本发明的优点

1.本发明细胞系的构建方式涉及鱼类胚胎期细胞培养及分离方法。通过压迫法分散胚胎细胞，不仅克服了酶法消化引起的细胞完整性破坏而导致细胞功能紊乱的问题，同时也避免了卵膜剥除等操作带来的污染可能性；且操作简单，更适宜于鲆鲽类甚至于其它鱼类的胚胎肌卫星细胞的培养。

2.本发明用80目筛绢去除卵膜等杂质，仅将胚胎细胞进行原代培养和传代培养，同时胚胎内的液体内容物有利于原代细胞的存活和增殖。

3.本发明细胞系所需的完全培养基均是商业化产品，不需要特殊的添加剂(如鱼类血清等)，避免了不必要的污染源，增加了实验的可重复性。

4.采用本方法构建的肌卫星细胞系可以连续传代，目前已传至70代，细胞生长温度为25±0.2℃。能提供大量的肌卫星细胞，细胞形态为梭形或者纺锤形。

5.本发明构建的细胞系，通过肌卫星细胞标志基因检测确定为肌卫星细胞。同时可以通过长时间培养或者诱导分化后，形成肌纤维，表达肌球蛋白。

6.本发明构建细胞系的细胞传代成活率高达99％以上，其GFP转染效率(25％以上)较牙鲆成体来源的肌卫星细胞系的细胞(15％)高。

附图说明

图1为本发明专利实施例提供的牙鲆胚胎期肌卫星细胞系图，A为牙鲆胚胎原代培养图(100×)，B为牙鲆肌卫星细胞49代图(100×)。

图2为本发明专利实施例提供的牙鲆肌卫星细胞系COI物种鉴定电泳图及序列。

图3为本发明专利实施例提供的牙鲆肌卫星细胞系的生长曲线图。

图4为本发明专利实施例提供的牙鲆肌卫星细胞系的染色体中期分裂相。

图5为本发明专利实施例提供的牙鲆肌卫星细胞系标志基因(pax7)鉴定图片。

图6为本发明专利实施例提供的牙鲆肌卫星细胞分化表达肌球蛋白的图片。

图7为本发明专利实施例提供的牙鲆肌卫星细胞转染EGFP图片。

图8为本发明专利实施例提供的牙鲆肌卫星细胞半滑舌鳎脾肾坏死病毒感染8天图，A为对照细胞，B为病毒感染细胞。

具体实施方式

本发明建立了鱼类胚胎期肌卫星细胞的分离及培养体系，操作方法简单，易重复，分离及培养方法更容易掌握和操作，应用前景广阔，为进一步的实验研究提供了材料和技术支持。

本发明是将牙鲆第一天胚体期(克氏囊形成期)的胚胎经原代和传代培养，继而构建细胞系，细胞系构建后还进行了冷冻保存、复苏、鉴定和应用。其中，胚胎细胞分离时采用筛绢过滤方式，培养方法是通过稀释法克隆，并选择优势细胞经多次传代获得了单一形态的细胞系，而本发明使用的完全培养基中添加了非必需氨基酸等营养物。建立的牙鲆胚胎肌卫星细胞系形态为梭形或者纺锤形单核细胞。单代内如培养超过5天或者进行外源因子(马血清)诱导均能够分化形成肌纤维。该细胞系能提供大量肌卫星细胞，经GFP转染及半滑舌鳎脾肾坏死病毒攻毒实验检测，都可以正常转染或被感染。故其不仅可以直接用于鱼类肌肉生长发育相关功能基因的研究，为探索其肌肉细胞的诱导、增殖及分化的分子机制提供研究材料，而且为牙鲆育种中肌肉性状的改良研究及应用提供平台。本发明所述的牙鲆胚胎肌卫星细胞系的构建方法也可以应用于其他鱼类胚胎细胞离体培养。

下面结合实施例详述本发明的实验步骤。

实施例1

牙鲆胚胎期肌卫星细胞系的建立方法，步骤如下:

1)配制细胞完全培养基

DF12完全培养基含有20％的胎牛血清，10ng/mL人碱性成纤维生长因子，15ng/mL表皮生长因子，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，100μmol/L NEAA(非必需氨基酸)，pH值为7.2-7.4，于4℃下保存，备用。

2)原代培养

体视镜下观察牙鲆受精卵，取约50粒上浮的正常发育的克氏囊形成期的胚体置于培养皿中，用灭菌海水洗5遍，每次2min。然后转移到另一新的灭菌培养皿中，先用灭菌海水冲洗3次，再用含双抗(400U/mL青霉素，400μg/mL链霉素)的PBS洗3遍。用灭菌研杵轻轻压破胚胎外膜，使胚胎破膜而出，并轻轻垂直压迫胚胎，使细胞尽量分离。加2mL DF12完全培养基，轻轻晃动，充分混匀。将80目灭菌筛绢置于培养皿上，倾斜培养皿，用移液器吸取过滤的上清液约1mL，转移至T25培养瓶中，25℃培养箱中培养。24h后补加1mL新的DF12完全培养基培养。

3)传代培养

待培养细胞不断从细胞团周围迁出并迅速增殖，当细胞团周围细胞停止生长后，吸弃完全培养基，用PBS冲洗，吸弃PBS后，加入1mL 0.25％的胰蛋白酶消化液消化。在倒置显微镜下观察到细胞收缩，立即吸弃胰蛋白酶消化液，继续观察，待70％的细胞变圆，在原瓶中加入上述完全培养基使细胞悬浮，而后将悬液进行传代。传代后，当细胞长满瓶底时，将其用0.25％的胰蛋白酶消化液消化悬起后，细胞悬液与新鲜上述完全培养基按1:2(V/V)的比例分瓶传代，分瓶传代时细胞浓度达到10⁵个细胞/mL；以后根据细胞汇合度(80％以上)每7天传代一次，15代后，进行1:4分瓶传代，每2-3天传代一次；待25代后通过常规稀释法克隆培养，即以极低密度(10-10²个/mL)的细胞接种于多个T25细胞瓶中进行培养，此时要根据培养瓶中的密度延长传代时间。选择优势细胞逐渐分离出单一形态细胞并不断地传代，进而细胞系建立成功。目前，该细胞已经传至80代，细胞稳定增殖，可定为细胞系，该细胞系主要细胞类型为体积小的单核梭形细胞(如图1A、B所示)。

实施例2

牙鲆肌卫星细胞系的鉴定：本实施例中按照细胞系鉴定的要求对其来源种属、细胞谱系、生长及遗传稳定性进行了鉴定。

1)细胞的冻存与复苏

细胞的冻存：

选取上述实施例处于指数生长期、细胞汇合度到80％以上的传代培养的细胞，按照常规方法消化。倒置显微镜下观察，待细胞收缩、70％左右变圆时，吸弃胰酶，加入2mL完全培养基终止消化，用枪头将细胞从瓶底吹打下来，使细胞成单个分布于细胞悬液；将细胞悬液转移到冻存管中，2200rpm离心2min；吸弃培养基，加入2mL预冷冻存液(含有10％二甲基亚砜的血清)悬浮细胞，放入梯度降温盒中，置于4℃冰箱30min，然后转移到-20℃冰箱中2h，再置于-80℃超低温冰箱中过夜，最后转移到液氮中长期保存，并做好记录。

细胞的复苏：

从液氮中取出细胞，迅速放入到42℃的水浴锅中，轻轻摇晃使受热均匀，直至完全融化；2200rpm离心2min，吸弃冻存液(注意不要吸走细胞)，加入2mL完全培养基，轻轻吹打混匀，并将细胞悬液转移到细胞瓶中，于25℃培养箱中培养；次日待细胞贴壁后更换2mL新的完全培养基。复苏的细胞存活率为80-90％，形态、生长速度无明显差异。

2)细胞系物种鉴定

用线粒体细胞色素氧化酶亚基I(COI)基因部分片段扩增和测序实验来验证该细胞系的物种来源。利用海洋动物基因组DNA提取试剂盒提取该细胞系第59代细胞的DNA，作为模板，FishF1和FishR1引物序列分别为：正向TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC、反向TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA。PCR扩增体系为2×PCR Mix 12.5μL，正反向引物(10μM)1μL，基因组DNA 0.1μg，加无菌水至25μL。PCR条件是95℃5min，35个循环(95℃30s，55℃1min，72℃2min，)，72℃再延伸10min。采用1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，获得了单一扩增产物，将其纯化，并进行测序，其为预期的740bp片段，将其在NCBI网站上进行序列比对分析，结果显示该序列与已知牙鲆线粒体COI基因相应序列(GenBank No.AB028664)相似性达到99％(图2)，说明该细胞系的确来源于牙鲆。

3)细胞生长曲线绘制

为了分析牙鲆胚胎期肌卫星细胞系的生长情况，取该细胞系第60代细胞，按照1.68×10⁵/孔的密度接种到5个6孔板中，置于25℃培养箱中培养。分别在接种后的第1-10天，按照常规方法消化，收集3孔细胞，用Countess^TM自动细胞计数仪计数。以培养时间为横坐标，以每孔平均细胞数量为纵坐标，绘制生长曲线，生长曲线基本正常，如图3所示。

4)染色体分析

取该细胞系31代细胞，用2mL完全培养基悬浮，0.25％胰蛋白酶消化后的细胞，接种于25cm²的培养瓶中。25℃培养箱中培养24h，加入终浓度为1μg/mL的秋水仙素4h后，按照常规胰蛋白酶消化法消化。消化后以2200rpm离心2min收集细胞，细胞沉淀加入3mL0.075mol/L KCl溶液，37℃水浴低渗处理30min。加入1mL新配制的预冷卡诺氏固定液(甲醇:乙酸＝3:1，V/V)4℃预固定10min，1000rpm离心5min后弃上清，细胞沉淀用5mL卡诺氏固定液重新悬浮，45min后，以1000rpm离心10min收集细胞，重复操作3次。然后将细胞重悬于0.5mL卡诺氏固定液中，将细胞悬液以冷滴法滴片，风干，10％吉母萨染色10min。用Leica显微镜观察，拍照。结果显示该细胞系细胞的染色体众数为48条(图4)，均为端部着丝粒染色，染色体核型为2n＝48t。

5)肌卫星细胞的鉴定

为验证所得到的细胞系为肌卫星细胞系，进行了肌卫星细胞标志基因(pax7)的免疫荧光分析。取该细胞系31代细胞，0.25％胰蛋白酶消化后用2mL细胞完全培养基悬浮，接种于25cm²培养瓶中培养。25℃培养箱中培养48h，转接种于12孔板中，培养箱中培养48h；吸出培养基，PBS冲洗2次，用预冷的4％多聚甲醛(1×PBS)PFA固定10min；PBS洗3次，用PBST(1×PBS+0.2％TritonX-100，V/V)处理5min，然后PBS洗3次，每次5min。用20％的山羊血清(1×PBS+0.1％Tween20，V/V)处理1h，加入Pax7抗体(1:20，2％的山羊血清，1×PBS+0.1％Tween20)过夜；用PBST(1×PBS+0.1％Tween20)洗3次，每次5min；加入Alexa488-conjugated anti-rabbit抗体(1:1000，2％的山羊血清，1×PBS+0.1％Tween20)暗处放置2h，再用PBS洗涤3次。在蔡司倒置荧光显微镜下观察，结果显示该细胞系细胞为肌卫星细胞(图5)。

由上述鉴定可见实施例1构建的细胞系细胞为肌卫星细胞。

实施例3

牙鲆肌卫星细胞系的应用：本实施例中首次对该细胞系细胞的诱导分化情况进行了分析鉴定，以明确其肌卫星细胞的特征。同时，还进行了海水鱼类半滑舌鳎组织脾肾坏死病毒感染实验，为该细胞系在鱼类病毒分离、鉴定及其疫苗制备研究与应用方面提供材料和基础参数。

1)肌卫星细胞分化的鉴定

为验证所得到的细胞系为肌卫星细胞系，进行了肌卫星细胞分化表达的标志蛋白(肌球蛋白)分析。取该细胞系第31代细胞，0.25％胰蛋白酶消化后用2mL细胞完全培养基悬浮，接种于25cm²培养瓶中，于25℃培养箱中培养48h，再转接种于12孔板中；培养箱中培养48h；吸出培养基，PBS冲洗2次，用预冷的4％多聚甲醛(1×PBS)PFA固定10min，PBS洗3次；用PBST(1×PBS+0.2％TritonX-100，V/V)处理5min，PBS洗3次，每次5min。用20％的山羊血清(1×PBS+0.1％Tween20，V/V)处理1h，加入肌球蛋白的抗体(MF20，1:20，2％的山羊血清，1×PBS+0.1％Tween20)过夜；PBST(1×PBS+0.1％Tween20)洗3次，每次5min；然后加入Cy3-conjugated anti-rabbit抗体(1:500，2％的山羊血清，1×PBS+0.1％Tween20)暗处放置2h，PBST(1×PBS+0.1％Tween20)洗3次；再用PBS洗涤3次，加入DAPI(1:1000)，暗处放置30min，用PBS洗涤3次。在蔡司倒置荧光显微镜下观察到分化的肌纤维细胞(图6)。

2)GFP报告基因在肌卫星细胞中的表达

把该细胞系第38代肌卫星细胞，以5×10⁶个细胞/mL的密度接种在24孔板内，25℃培养24h。当细胞密度超过80％，按照说明书用脂质体2000(0.4μg/μL)转染pEGFP-N3(0.8μg/μL)质粒到肌卫星细胞，25℃处理4.5h，吸出培养液，加入500μL的DF12完全培养基(不含抗生素)，24h后，用荧光显微镜观察到荧光的表达，发现约有25％的细胞表达较强荧光(图7)。

3)半滑舌鳎病变组织提取液感染牙鲆胚胎肌卫星细胞

收集约500mg半滑舌鳎脾肾坏死病毒攻毒后的病变脾脏组织，研磨匀浆，14000rmp离心15min，取上清。将上清液用0.22μm滤器过滤除菌，取100μL滤液加入到含有1.5ml完全培养基、培养48h的该细胞系第59代细胞中，轻轻混匀，20℃培养，病毒感染3天时观察到病变效应，第8天出现明显的病变效应(图8A、B)。

上述实施例表明，用本发明方法建立的牙鲆胚胎肌卫星细胞系，生长曲线相对正常，染色体为正常的48条端部着丝点染色体，可以进行连续传代，也可以对其进行冷冻保存。以pEGFP-N3进行基因转染实验，也观察到较强的绿色荧光，并且可以进行病毒感染实验，证实牙鲆胚胎肌卫星细胞系可以直接应用于外源基因功能及病毒学研究。

本发明牙鲆胚胎肌卫星细胞系的建立方法重复性强，经染色体、线粒体DNA的条形码等鉴定结果可信，取材的胚胎期牙鲆容易获得，操作方法简便，也可以适用于构建其他鱼类肌卫星细胞系。

Claims

1.一种牙鲆胚胎肌卫星细胞系，其特征在于：将牙鲆克氏囊形成期的胚胎经过体外分离，去除卵膜，分散细胞，经原代培养和传代培养，继而建立胚胎期肌卫星细胞系。

2.如权利要求1所述的牙鲆胚胎期肌卫星细胞系，其特征在于，经体视镜下取发育到克氏囊形成期的受精卵，用灭菌海水清洗，再经含双抗的PBS清洗，清洗后去除PBS,用灭菌研杵轻轻压破胚胎外膜，使胚胎破膜而出，并轻轻垂直压迫胚胎，使细胞尽量分离，细胞分散后于DF12完全培养基中进行原代培养。

3.如权利要求1或2所述的牙鲆胚胎期肌卫星细胞系，其特征在于，所述分散的细胞转移到DF12完全培养基中培养，于25℃下正置培养，待细胞团完成贴壁后补加DF12完全培养基，实现原代培养。

4.如权利要求1所述的牙鲆胚胎期肌卫星细胞系，其特征在于，待上述经原代培养的细胞团周围细胞迁出并增殖铺满时，吸弃培养基，经PBS冲洗，加入0.25％的胰蛋白酶消化液消化；待细胞70％变圆，吸弃胰酶，终止消化后加入DF12完全培养基形成悬浮细胞液；而后利用细胞培养基按1:1-1:3(V/V)的比例分瓶传代培养，之后根据细胞汇合度7-10天传代一次，15代后每2-3天传代一次；在25-30代后，通过稀释法克隆培养，选择优势细胞逐渐分离出单一细胞并不断地传代，进而细胞系构建成功。

5.如权利要求4所述的牙鲆胚胎期肌卫星细胞系，其特征在于，所述构建的细胞系能够分化形成肌纤维，并表达肌球蛋白。

6.如权利要求4所述的牙鲆胚胎期肌卫星细胞系，其特征在于，所述通过稀释法克隆培养，即以极低密度(10-10²个/mL)的细胞接种于多个T25细胞瓶中进行培养，选择优势细胞逐渐分离出单一形态的细胞并不断地传代，进而细胞系建立成功。

7.如权利要求4所述的牙鲆胚胎期肌卫星细胞系，其特征在于，所述细胞培养基为在DF12培养基中加入占培养基总体积20％的胎牛血清，10ng/mL人碱性成纤维生长因子，15ng/mL表皮生长因子，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，100μmol/L NEAA(非必需氨基酸)，27.5nmol/L β-巯基乙醇，2nmol/mL L-谷氨酰胺，pH值为7.2-7.4。

8.如权利要求1所述的牙鲆胚胎期肌卫星细胞系，其特征在于，所述胚胎为海水或淡水鱼类的相应胚胎。