CN115044532A - 一种脉红螺胚胎细胞系的构建与鉴定方法 - Google Patents

一种脉红螺胚胎细胞系的构建与鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于海洋贝类的细胞培养技术领域，具体涉及到一种脉红螺胚胎细胞系的构建与鉴定方法。将脉红螺胚胎细胞于细胞完全培养基中原代培养，再将原代培养后细胞每7‑10天以一分为二的比例进行传代培养，直至细胞性状稳定，进而建立脉红螺胚胎细胞系。本发明构建的脉红螺胚胎细胞系为国内外首个可连续传代的海水螺类细胞系，在生理、分子遗传学以及发育生物学领域具有广泛的研究及应用价值。

Description

一种脉红螺胚胎细胞系的构建与鉴定方法
技术领域
本发明属于海洋贝类的细胞培养技术领域，具体涉及到一种脉红螺胚胎细胞系的构建与鉴定方法。
背景技术
细胞培养是细胞工程技术的重要内容，已发展成为生物、医学研究与应用中广泛采用的技术方法。水生动物细胞培养的研究晚于哺乳动物，且主要集中在鱼类，全世界范围内已建立超过700多种鱼类细胞系。然而在水生无脊椎动物中，除唯一一个淡水水生无脊椎动物细胞系――光滑双脐螺(Bromphalaria glabrata)担轮幼虫细胞系(Bge)建立的报道外，未见其他永生性细胞系成功建立的报道。许多学者尝试优化培养基，选取不同发育阶段、组织材料来建立海洋贝类细胞系，但效果并不明显。建立海洋贝类细胞系依然是一项充满挑战性和困难性的工作。
脉红螺Rapana venosa，隶属于软体动物门(Mollusca)、腹足纲(Gastropoda)、前鳃亚纲(Prosobranchia)、新腹足目(Neogastropoda)、骨螺科(Muricidae)、红螺属(Rapana)，是典型的肉食性螺类，在我国渤海、黄海和东海以及日本、朝鲜、俄罗斯沿海等地均有分布，具有很高的经济价值和药用价值，畅销国内外市场。
发明内容
对于现有技术中所存在的问题，本发明的目的是提供一种脉红螺胚胎细胞系的构建与鉴定方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种脉红螺胚胎细胞系的构建方法，其特征在于：将脉红螺胚胎细胞于细胞完全培养基中原代培养，再将原代培养后细胞每7-10天以一分为二的比例进行传代培养，直至细胞性状稳定(大致20代左右)，进而建立脉红螺胚胎细胞系。
所述细胞完全培养基为以L15为基础培养基，向基础培养基中添加其体积10％的胎牛血清，其体积5％的青链霉素混合液，其体积40％的一螺层卵袋提取液。
所述卵袋提取液为从脉红螺一螺层卵袋中抽取营养液，提取后进行离心、过滤，待用，置于-80℃保存。
其中，脉红螺一螺层卵袋为脉红螺幼虫发育到一螺层幼虫时期的卵袋。
所述原代培养为将脉红螺胚胎细胞按50,000-100,000个/ml接种量于细胞完全培养基中于25℃细胞培养箱，进行原代培养直至细胞密度为100,000-200,000个/ml；其中，脉红螺胚胎细胞为将消毒后脉红螺产卵1天的卵袋，收集其胚胎研磨，待用。
所述脉红螺胚胎细胞为取脉红螺产卵1天的卵袋浸泡在超纯水浸泡5-10min；再于体积百分含量为70％的酒精水溶液浸泡5-10min。将消毒好的卵袋剪开，胚胎经无菌PBS缓冲溶液洗涤，洗涤后收集其胚胎，磨碎胚胎过滤得到细胞滤液(在过滤网上研磨，所述过滤网孔径为40μm)，待用。
所述传代培养为待原代培养的细胞密度达到100,000-200,000个/ml时,以一分为二的比例进行传代，每7-10天传代一次，按原代培养条件进行传代培养，直至培养至细胞性状稳定。
一种构建获得脉红螺胚胎细胞系的鉴定方法，以脉红螺胚胎细胞系DNA为模板，分别采用贝类18S和COI引物，进行PCR扩增，分别扩增的脉红螺胚胎细胞的18S基因片段和COI基因片段，待扩增的18S基因片段产物中带有970bp条带，扩增的COI基因片段产物中带有721bp条带，同时存在这两个片段即为脉红螺胚胎细胞。
所述18S引物序列为：18S-1F：TACCTGGTTGATCCTGCCAGTAG，18S-5R：CTTGGCAAATGCTTTCGC；所述COI引物序列为：LCO1490：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG，HCO2198：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA。
所述PCR扩增反应条件均为94℃预变性5min，然后94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环后，72℃延伸10min。
本发明的有益效果：
本发明方法构建的脉红螺胚胎细胞系可以进行连续传代，目前已成功传代超过20代。该细胞系主要特点是：细胞系为悬浮细胞，可以连续传代，生长速度快。细胞系经分子标记鉴定比对后，确定为脉红螺胚胎细胞。所获细胞系为贝类生理、分子遗传学以及发育生物学提供宝贵的实验材料，具有广泛的研究及应用价值。
附图说明
图1为本发明所述脉红螺胚胎细胞原代培养第1天的形态图。
图2为本发明所述脉红螺第20代胚胎细胞的形态图。
图3为脉红螺胚胎细胞系18S基因核苷酸序列比对图。
图4为脉红螺胚胎细胞系COI基因核苷酸序列比对图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步详述。
实施例1：配置细胞完全培养基
使用无菌注射器从脉红螺一螺层卵袋中抽取营养液，将营养液置于无菌离心管中，4000g离心20min，收集上清液经0.22μm孔径的滤膜过滤，得卵袋提取液，于-20℃备用。
将市售Solarbio标准L15培养基作为基础培养基，在基础培养基中加入占总体积10％的胎牛血清，5％的青链霉素混合液和40％的卵袋提取液，配置成完全培养基。
实施例2：
1)脉红螺胚胎细胞原代培养
选取产卵一天的脉红螺卵袋，使用超纯水浸泡5min，去除表面寄生虫，使用70％酒精水溶液浸泡5min消毒。将消毒好的卵袋置于直径为3.5cm的一次性无菌培养皿中。使用无菌剪刀剪开脉红螺卵袋，将脉红螺胚胎置于40μm筛网上，使用无菌PBS冲洗两次，使用无菌研磨棒将胚胎磨碎。将细胞滤液接种到完全培养基中，接种密度为80,000个/ml，静置培养，培养温度为25℃。原代培养1天后，对胚胎细胞进行观察，其形态如图1所示。由图1可见细胞呈油滴状，局部有少量细胞团。
2)传代培养
原代细胞开始增殖后，细胞数目增多，悬浮在培养基中。根据细胞密度待密度达到160,000个/ml，进行传代培养，约8天传代一次，以一分为二的比例进行传代。传代时更换新鲜上述配制的细胞完全培养基，传代培养条件与上述步骤1)记载原代培养条件一致。脉红螺胚胎细胞第20代形态如图2所示，细胞形态呈油滴状，即可认为获得脉红螺胚胎细胞系。
实施例3：细胞种属的分子鉴定
取第6代脉红螺胚胎细胞，使用基因组DNA提取试剂盒提取DNA。以胚胎细胞DNA为模板，分别利用18S和COI通用引物进行PCR扩增。18S引物序列为：18S-1F：TACCTGGTTGATCCTGCCAGTAG，18S-5R：CTTGGCAAATGCTTTCGC；COI引物序列为：LCO1490：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG，HCO2198：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA。PCR反应条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环后，72℃延伸10min。PCR产物送北京擎科生物科技有限公司进行一代测序。
扩增的脉红螺胚胎细胞18S基因片段长度为970bp，利用Blast在NCBI数据库中进行比对，与数据库中脉红螺的18S基因(基因ID：HQ834011.1)一致性为99.68％。扩增的脉红螺胚胎细胞COI基因片段长度为721bp，利用Blast在NCBI数据库中进行比对，与数据库中脉红螺的COI基因(基因ID：KM213962.1)一致性为99.00％。18S和COI核苷酸比对结果分别如图3和4所示，证明该细胞为脉红螺细胞。
综上可见，本发明创新的通过在细胞培养基中添加脉红螺一螺层卵袋提取液，成功进行脉红螺胚胎细胞的原代和传代培养，建立脉红螺胚胎细胞系。并通过分子鉴定证明该细胞系为脉红螺细胞。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不改变本发明基本原理的前提下，可以进行适当的改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院海洋研究所
<120> 一种脉红螺胚胎细胞系的构建与鉴定方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tacctggttg atcctgccag tag 23
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cttggcaaat gctttcgc 18
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtcaacaaa tcataaagat attgg 25
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
taaacttcag ggtgaccaaa aaatca 26

Claims (9)

1.一种脉红螺胚胎细胞系的构建方法，其特征在于：将脉红螺胚胎细胞于细胞完全培养基中原代培养，再将原代培养后细胞每7-10天以一分为二的比例进行传代培养，直至细胞性状稳定，进而建立脉红螺胚胎细胞系。
2.按权利要求1所述的脉红螺胚胎细胞系的构建方法，其特征在于：所述细胞完全培养基为以L15为基础培养基，向基础培养基中添加其体积10％的胎牛血清，其体积5％的青链霉素混合液，其体积40％的一螺层卵袋提取液。
3.按权利要求2所述的脉红螺胚胎细胞系的构建方法，其特征在于：所述卵袋提取液为从脉红螺一螺层卵袋中抽取营养液，提取后进行离心、过滤，待用，置于-80℃保存。
4.按权利要求2所述的脉红螺胚胎细胞系的构建方法，其特征在于：所述原代培养为将脉红螺胚胎细胞按50,000-100,000个/ml接种量于细胞完全培养基中于25℃细胞培养箱，进行原代培养直至细胞密度为100,000-200,000个/ml；其中，脉红螺胚胎细胞为将消毒后脉红螺产卵1天的卵袋，收集其胚胎研磨，待用。
5.按权利要求4所述的脉红螺胚胎细胞系的构建方法，其特征在于：所述脉红螺胚胎细胞为取脉红螺产卵1天的卵袋浸泡在超纯水浸泡5-10min；再于体积百分含量为70％的酒精水溶液浸泡5-10min；将消毒好的卵袋剪开，胚胎经无菌PBS缓冲溶液洗涤，洗涤后收集其胚胎，磨碎胚胎过滤得到细胞滤液，待用。
6.按权利要求1所述的脉红螺胚胎细胞系的构建方法，其特征在于：所述传代培养为待原代培养的细胞密度达到100,000-200,000个/ml时,以一分为二的比例进行传代，每7-10天传代一次，按原代培养条件进行传代培养，直至培养至细胞性状稳定。
7.一种权利要求1构建获得脉红螺胚胎细胞系的鉴定方法，其特征在于：以脉红螺胚胎细胞系DNA为模板，分别采用贝类18S和COI引物，进行PCR扩增，分别扩增的脉红螺胚胎细胞的18S基因片段和COI基因片段，待扩增的18S基因片段产物中带有970bp条带，扩增的COI基因片段产物中带有721bp条带，同时存在这两个片段即为脉红螺胚胎细胞。
8.按权利要求7所述的鉴定方法，其特征在于：所述18S引物序列为：18S-1F：TACCTGGTTGATCCTGCCAGTAG，18S-5R：CTTGGCAAATGCTTTCGC；所述COI引物序列为：LCO1490：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG，HCO2198：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA。
9.按权利要求7所述的鉴定方法，其特征在于：所述PCR扩增反应条件均为94℃预变性5min，然后94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环后，72℃延伸10min。
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CN108114001B (zh) * 2017-12-23 2023-05-30 中国科学院海洋研究所 一种诱导海产双壳贝类产卵的诱导剂及其应用方法

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