CN109207422B

CN109207422B - 一种欧洲鳗鲡肾脏细胞系ek及其应用

Info

Publication number: CN109207422B
Application number: CN201811123213.8A
Authority: CN
Inventors: 郑在予; 陈斌; 龚晖; 杨金先; 池洪树; 刘晓东; 黄河
Original assignee: Institute of Biotechnology of Fujian Academy of Agricultural Science
Current assignee: Institute of Biotechnology of Fujian Academy of Agricultural Science
Priority date: 2018-09-26
Filing date: 2018-09-26
Publication date: 2020-08-21
Anticipated expiration: 2038-09-26
Also published as: CN109207422A

Abstract

本发明提供了一种欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK及其应用，属于动物细胞培养技术领域。欧洲鳗鲡肾脏细胞系的保藏编号为CCTCC NO：C2018160。所述细胞系为成纤维型细胞，以组织块贴壁法进行原代培养，以胰蛋白酶消化法进行传代培养。所述欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK在含有8％胎牛血清的L‑15中，于26℃下培养时呈现最佳状态，可在体外连续传代65次以上仍然保持成纤维型细胞典型细胞形态，核型为异倍体，冻存复苏后细胞存活率可达85％，生长迅速，可提供大量生物学材料。细胞系EK可以应用于外源基因表达模型的构建。细胞系EK也可以作为病毒宿主细胞应用，为病毒病原的分离以及其他病原学、免疫学研究提供材料。

Description

一种欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK及其应用

技术领域

本发明属于动物细胞培养技术领域，具体涉及一种欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK及其应用。

背景技术

自1962年Wolf等人建立了第一个真骨鱼类永久性细胞系——虹鳟鱼性腺细胞系RTG-2以来，国内外已建立了300余株鱼类细胞系；鱼类体细胞系培养技术在病原学、生理学、药理学、环境毒理学、细胞生物学及种质资源保护等多个领域都有广泛的应用，在病毒学研究中地位尤其重要，是病毒性病原分离、鉴定和特性研究的基础。

鳗鲡在亚洲和欧洲沿海地区均是深受欢迎的传统美食，鳗鲡养殖业是我国水产业的重要支柱行业，其年产量约占世界总产量的2/3，单项产品出口值在水产品中位居榜首。欧洲鳗鲡(Anguilla Anguilla)属鳗鲡目(Anguilliformes)、鳗鲡科(Anguillidae)、鳗鲡属(Anguilla)，原产于大西洋，其肉质细嫩，味美，富含蛋白质、多种维生素及不饱和脂肪酸，极具营养价值。欧洲鳗鲡于1993年首次引入我国，同年实现配套饲料国产化，从90年代后期开始，欧洲鳗鲡占据我国鳗鲡养殖业龙头品种的地位达十余年之久。由于欧鳗养殖业发展迅猛，布局不善、密度过高、水流阻滞等问题普遍存在，饵料变质和药物滥用的状况也频繁发生，导致水体污染、鱼体免疫力下降，各类病害频繁爆发，其中不乏病毒性病例，而当前已有的欧洲鳗鲡细胞系模型极少，远不能满足研究需要。

鳗鲡科鱼类具有降河洄游的繁殖习性和复杂多变的生活史，其人工繁殖至今仍是未解的世界级技术难题；而在世界范围内，这一名贵经济鱼类种群正在遭遇全面危机。自上世纪70年代以来，由于过度捕捞、环境污染、病害频发和水文变化等原因，欧洲鳗鲡在其传统捕捞地的产量已经下降了90％；而我国鳗鲡养殖业的另一重要支柱种群日本鳗鲡的情况也同样不容乐观：2017-2018捕捞季日本、我国广东、台湾和浙江等主产地的预计捕捞总量不及上世纪60年代的1％。欧洲鳗鲡和日本鳗鲡分别于2009年和2014年先后被列入IUCN濒危物种名录。

建立更多的欧洲鳗鲡体细胞系模型，对于鳗鲡科鱼类的疾病防控和基因工程研究有着重要的意义，更有益于保护这一名贵鱼种，促进鳗鲡养殖行业的可持续发展。欧鳗胚胎和低龄幼体的难以获取，和被列为濒危物种后的进出口限制，客观上增大了欧洲鳗鲡体细胞系建立的难度，同时建立的鳗鲡体细胞系常常存在传代不稳定的问题，不能长期保持初始建立的鳗鲡体细胞系的优良生物学特性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK及其应用，使研究和开发人员得以长期、稳定地获取大量具备已知生物学特性的欧洲鳗鲡肾脏细胞生物学材料。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK，保藏编号为CCTCC No:C2018160。

本发明提供了欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK在构建外源基因表达模型中的应用。

优选的，所述构建外源基因表达模型的方法包括以下步骤：

(1)将所述欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK接种至细胞培养板上，在26℃条件下培养48h，得到单层细胞；

(2)将携带外源基因的表达载体转染至所述单层细胞中，在28℃孵育8h，弃去上清后添加完全培养基，在26℃下继续培养18h，得到外源基因表达模型。

优选的，所述步骤(1)中欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK的接种浓度为1～2×10⁵个/孔。

优选的，所述携带外源基因的表达载体的转染浓度为5μg/12μl。

优选的，所述外源基因为质粒pEGFP-N1。

本发明提供了欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK在作为病毒宿主细胞中的应用。

优选的，所述病毒包括蛙虹彩病毒。

优选的，所述病毒宿主细胞培养的温度为26～28℃。

本发明提供了一种欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK，保藏编号为CCTCC No:C2018160。本发明提供的EK是一株异倍体细胞系，为成纤维样细胞，具有形态均一、稳定的特点，在体外传代的过程中始终保持其生长旺盛、增殖能力强的特点，能在短期提供大量的活性细胞材料；在26℃达到最佳生长状态，传代间隔短而均匀，传到第50～60代时传代周期稳定为48h，并且传代60次后仍可保持典型的成纤维细胞的形态；在液氮中保存一个月的细胞复苏后其贴壁率可达85％以上，更换培养基后成活率超过75％。同时所述EK的培养方法简便易行，除血清外无需添加特殊营养因子，成本适中；在病毒学、遗传学、免疫学、毒理学等领域都可得到良好的应用。

本发明提供了欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK在构建外源基因表达模型方面的应用。所建立的欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK可稳定表达外源性基因，自转染后24h起可实现表达，持续时间可长达4天，测得转染率约为10％，在鱼类细胞系中表现优秀,说明该细胞系在基因工程领域深具潜力。

本发明提供了欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK在作为病毒宿主细胞方面的应用。实验表明，接种病毒24h后，即可观察到接毒样品中出现CPE(细胞病变)现象，48h后病变率可达75％，光镜下可见细胞大面积皱缩脱壁，被感染细胞显著膨大，内部空泡化，而对照样品细胞生长良好，贴壁紧密，细胞密度有显著增加现象；荧光定量PCR分析结果显示，在接毒后6～48h内，细胞内RGV衣壳蛋白基因的拷贝数出现了极显著的增长。以上结果充分显示了所述欧鳗肾脏细胞系作为病毒研究模型的潜力。

生物材料保藏信息

欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK，AnguillaAnguilla EK，保藏于中国典型培养物保藏中心，单位简称为CCTCC，地址为中国武汉，武汉大学，保藏时间为2018年8月10日。保藏编号为CCTCC No:C2018160。

附图说明

图1是显微镜下观察本发明欧洲鳗鲡肾脏细胞的原代培养图；

图2是显微镜下观察本发明欧洲鳗鲡肾脏细胞的传代培养图；

图3是欧洲鳗鲡肾脏细胞在不同温度下的生长曲线图；

图4是欧洲鳗鲡肾脏细胞的染色体组型分析图，图4-右为二倍体欧洲鳗鲡肾脏细胞的中期分裂相核型，图4-左为100个中期分裂相样本中含有不同染色体数的细胞样本数的柱形分布图；

图5是质粒pEGFP-N1在欧洲鳗鲡肾脏细胞中表达显示的荧光图；

图6是接种蛙虹彩病毒后，欧洲鳗鲡肾脏细胞的形态图；

图7是以荧光定量PCR方法测定的蛙虹彩病毒衣壳蛋白基因在欧洲鳗鲡肾脏细胞中的表达曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK，保藏编号为CCTCC No:C2018160。欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK为成纤维样细胞，具有形态均一、稳定的特点，在体外传代的过程中始终保持其生长旺盛、增殖能力强的特点；传到第50～60代时仍然保持较典型的成纤维样细胞的形态，且传代周期稳定为48h。

在本发明中，所述欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK的建立方法，优选包括以下列步骤：

a.原代培养：体重约2g的健康欧洲鳗幼苗从25～28℃的洁净海水移入超净工作台内，麻醉处死后以体积浓度2％碘酊和体积浓度75％医用酒精溶液分别消毒体表3次，侧向剪开体壁后将肾脏组织完整剥离，用含抗生素的PBS溶液充分漂洗，然后将其剪碎成约1mm³大小的块状，贴附于洁净的50mL细胞培养瓶底部，并用1mLL-15溶液浸润，组织块排列间距为0.5cm；贴附完毕的培养瓶底面向上倒置，于20℃生化培养箱中密闭静置6～8h后取出，每瓶滴入2mL第一种完全培养基后缓慢翻转为正置，继续于20℃下静置培养，并每隔24h追加1mL第一种完全培养基，直至培养基总体积达到5mL；将所有培养瓶移入26℃生化培养箱，每72h行半换液一次，得到原代培养物；

b.传代培养：当所述原代培养物中有环形生长晕围绕组织植块形成后，用质量/体积浓度为0.25％胰蛋白酶溶液于26℃下充分消化培养物，消化产物中加入5ml所述第一种完全培养基中止反应后，以1000rpm离心3min，收集细胞并以5ml第一种完全培养基重悬，将此细胞悬液接种至新的25mL细胞培养瓶中，置于26℃密闭培养，至形成密闭的细胞单层；

c.细胞系建立与冻存：用质量/体积浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液于26℃下消化所述细胞单层15s，移去消化液后，加入5mL/瓶所述第一种完全培养基，以弯头玻璃滴管充分吹打分散细胞后，将细胞悬液以1:2的扩增比率接种至新培养瓶中，并添加完全培养基至总体积为5mL/瓶；重复上述步骤5次后，自第6次细胞传代起将使用的培养介质替换为所述第二种完全培养基，传代60次后得到欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK。所述EK细胞系的常规保藏方式为液氮冻存：传代细胞在体外生长72h后，按步骤b的方法进行消化和离心，收集细胞用细胞冻存液重悬，稀释至细胞密度为10⁶个/mL，分装至1.2mL细胞冻存管中，按4℃静置30min，-75℃静置过夜，液氮(-196℃)长期保存的流程进行逐级降温保藏，冻藏30天后，取冻存管于37℃恒温水浴锅中复苏2min，将细胞重悬后接种至预先加有5mL/瓶所述第二种完全培养基的50mL细胞培养瓶中，12h后需完全换液一次。

在本发明中，所述第一种完全培养基为含抗生素的完全培养基，以Leibovitz'sL-15溶液为基液，所述基液中还包含胎牛血清、青霉素和链霉素；所述基液中含胎牛血清(FBS)的体积百分数为10％，所述基液中含有的青霉素的终浓度为200IU/ml，链霉素的终浓度为200μg/ml。所述第一种完全培养基用于原代培养和第1-5代传代培养。所述第二种完全培养基为常规的完全培养基。所述常规培养基以Leibovitz's L-15溶液为基液，所述基液中还含有胎牛血清。所述基液中含有的胎牛血清的体积百分数为8％，不含其它添加物。所述第二种完全培养基用于第6代之后包括第6代传代培养。所述第一种完全培养基和第二种完全培养基的配制方法参照标准配方制备浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)储备液，并以此为基础配置含有上述浓度抗生素的0.01mol/L的PBS工作液，预冷至0℃备用。

在本发明中，所述细胞冻存液包括体积浓度为70％的Leibovitz's L-15，体积浓度20％的胎牛血清和体积浓度10％的二甲亚砜。

在本发明中，所述构建外源基因表达模型的方法优选包括以下步骤：

在本发明中，所述步骤(1)中欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK的接种浓度优选为1～2×10⁵个/孔。所述细胞培养板优选为6孔细胞培养板。

本发明对外源基因的种类不做具体限定，采用本领域技术人员所熟知的外源基因即可。为了说明EK在构建外源基因表达模型应用，以质粒pEGFP-N1作为外源基因的表达载体为例进行具体说明。在本发明中，所述携带外源基因的表达载体的转染浓度优选为5μg/12μl。携带外源基因的表达载体以溶液形式存在，溶剂为转染剂。

本发明提供了欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK在作为病毒宿主细胞方面的应用。

在本发明中，本发明对病毒的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的病毒种类即可。本发明实施例是以蛙虹彩病毒为例说明EK在作为病毒宿主细胞中具体应用。

在本发明中，所述病毒宿主细胞培养的温度优选为26℃。病毒对宿主细胞的侵染的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的侵染方法即可。

下面结合实施例对本发明提供的一种欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

欧洲鳗鲡肾脏细胞的原代和早期传代培养

1、实验动物：

体重2g左右的健康欧洲鳗鲡幼鱼。

2、试剂:

L-15(购自Hyclone)；1000000U/10mg青-链霉素混合液、无水乙醇、碘酊(购自上海生工)；NaCl、Na₂HPO₄、KCl、KH₂PO₄、NaHCO₃、胰蛋白酶(Trypsin)(购自Sigma)；胎牛血清(Fetalbovine serum,FBS)(购自Gibco)。

3、仪器:

超净工作台(AirTech)；倒置荧光显微镜(Nikon)；生化培养箱(博迅)；超纯水机(Millipore)。

4、耗材:

解剖用眼科剪、眼科镊、维纳斯剪(六六眼科)；50mL细胞培养瓶(Corning)；15mL离心管(BD Falcon)；5mL弯头玻璃滴管。

5、步骤:

1)试前准备：从鳗场到实验室的运输途中，须将欧洲鳗鲡幼鱼全程置于25～28℃的洁净海水中。

2)缓冲液和消化液配制：按标准配方配置0.1mol/L的PBS储备液，以此为基础配置含有终浓度为200U/mL的青霉素，以及终浓度为200μg/mL的链霉素的0.01mol/L工作缓冲液和含0.25％胰蛋白酶的Trypsin消化液。

3)原代及1～5代传代培养用完全培养液配制：制备以L-15培养基为基础，含终体积浓度为10％的胎牛血清，终浓度为200U/mL的青霉素，以及终浓度为200μg/mL的链霉素的完全培养液。

4)组织取材：将上述欧鳗幼鱼置于碎冰中行冰冻麻醉，待鱼体对物理刺激的应激行为消失后；以体积浓度2％碘酊棉球和体积浓度75％酒精棉球分别消毒鱼体表面3次，除尽黏液；由侧面剪开体壁，取出肾脏组织，用0℃预冷的如步骤2)所述的PBS溶液清洗5次。

5)原代培养：将上述欧洲鳗鲡肾脏组织剪碎成1mm³大小的组织块，以上述PBS液漂洗，尽量去除血细胞、脂肪组织及结缔组织；用1mL不含血清的L-15培养基润湿培养瓶底面，将上述小组织块移入50mL培养瓶中，以0.5cm的间距均匀排列；倒置瓶身于20℃密闭培养6～8h使组织块贴壁后，在培养瓶中注入2mL步骤3)所述培养液后，缓慢翻正瓶身，使培养液浸润组织块，于20℃恒温启动原代培养；启动培养后每隔24h缓慢添加完全培养液1mL至终体积为5mL左右，将培养物平稳转移至26℃培养环境，其后每72h进行一次完全换液。

6)1～5传代培养：收集生长良好，形成较大面积生长晕的原代培养物进行传代，传代前弃去培养液和脱落的组织块，用少量质量/体积浓度0.25％胰酶润洗细胞层，弃去，再加入足量胰酶消化细胞，待细胞呈收缩分离态势时弃去胰酶，加入如步骤1)所述完全培养液中止消化，以弯头滴管吹打培养物至细胞和组织块大部分分散脱落，收集细胞/组织悬浮液，1000rpm离心3min，去除上清后，用完全培养液重悬沉淀，以1：2的分离比例进行传代扩增，当培养瓶重复以上程序5次。

结果:原代培养第24～48h，可见有细胞从组织块中迁出，一周左右可见细胞在组织块周围形成较清晰的放射状生长晕(图1)，于此时按照步骤6)进行了首次传代，之后当培养物覆盖培养瓶底面积超过80％时即行传代。传代5次后，残余组织块已在传代过程中完全排出，获得纯粹的培养细胞，细胞传代成活率高，生长旺盛，可稳定形成汇合单层，并能按1:2比例扩大培养，同时细胞所需的血清比例分数有所下降。

实施例2

欧洲鳗鲡肾脏细胞系的建立:

1、试剂:

L-15(购自Hyclone)；NaCl、Na₂HPO₄、KCl、KH₂PO₄、NaHCO₃、胰蛋白酶(Trypsin)(购自Sigma)；胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)(购自Gibco)

2、仪器:

超净工作台(AirTech)；倒置荧光显微镜(Nikon)；生化培养箱(博迅)；超纯水机(Millipore)

液氮罐(Locator)，离心机(Beckman)

3、耗材:

50mL细胞培养瓶(Corning)，250mL细胞培养瓶(Corning)；15mL离心管(BDFalcon)；5mL弯头玻璃滴管

4、步骤:

1)常规传代培养完全培养液配制：制备以L-15培养基为基础，含终浓度为体积浓度8％的胎牛血清，不含抗生素及其他营养添加物的常规传代培养用完全培养液。

2)常规传代培养：细胞能稳定形成单层后对其进行常规传代培养，以显微镜法对培养细胞进行连续观察，当细胞形成均匀的闭合单层时即行传代，用少量体积浓度0.25％胰酶润洗细胞层，弃去，再加入足量胰酶(2mL/50mL细胞培养瓶)消化细胞10～15s，不弃去消化液，直接加入如步骤1)所述的完全培养液5mL以中止消化反应，用弯头滴管将全部细胞吹下，1000rpm离心3min，弃去上清，再加入5mL如步骤1)所述的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液以1:2-1:3的扩增比例接种到新瓶，并追加完全培养基至终体积为5mL/50mL细胞培养瓶，于26℃静置培养。

3)细胞的冻存及复苏：当细胞进入常规传代培养阶段后，对其分批进行液氮冷冻保存，冻存液组成为70％L-15、20％胎牛血清以及10％DMSO；取处于对数生长期的细胞，依步骤2)所述消化方法获得细胞悬液后，1500rpm离心3min，弃去上清后以冻存液重悬细胞，按每管5×10⁵～1×10⁶细胞数分装于细胞冻存管内，置于内盛异丙醇的程序降温盒中，在4℃冷却30min后移入-70℃冰箱，过夜后移入液氮长期保存；复苏细胞时，以37℃水浴迅速解冻样品，吸出细胞悬液后与步骤1)所述的完全培养基混匀接种于培养瓶内，6h后更换培养基，去除未成活细胞和DMSO成分后继续培养。

结果：建立了一株欧洲鳗鲡肾脏细胞株，该细胞株由成纤维样细胞构成，形态均一、稳定(图2)，在体外传代的过程中始终保持其生长旺盛的特点，传代间隔短而均匀，到第50～60代时传代周期稳定为48h，在液氮中保存一个月的细胞复苏后其贴壁率可达85％以上，更换培养基后成活率超过75％，此时，细胞系建立成功，命名为EK，上述EK细胞系已经连续传代超过70代，并于2018年8月10日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:C2018160。

实施例3

对自建的欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK进行生长特性测定

1、试剂:

L-15(购自Hyclone)；胰蛋白酶(Trypsin)(购自Sigma)；胎牛血清(Fetal bovineserum,FBS)(购自Gibco)

2、仪器:

超净工作台(Air Tech)；倒置荧光显微镜(Nikon)；生化培养箱(博迅)；超纯水机(Millipore)，液氮罐(Locator)，离心机(Beckman)，流式细胞仪(Bio-rad)

3、耗材:

50mL细胞培养瓶(Corning)；15mL离心管、2.5mL离心管(BD Falcon)；5mL弯头玻璃滴管

4、步骤:

第63代EK细胞以2×10⁵个/瓶的密度接种至50mL细胞培养瓶中，分为7组，分别于10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，37℃和40℃下培养。

每隔1天，从每组细胞中各取3瓶，用0.25％胰酶消化收获细胞后，以流式细胞仪计数，重复上述步骤至接种后第9天，收集数据绘制生长曲线，根据公式I计算细胞倍增时间(PDT)：

T＝t[lg2(lgN_t-lgN₀)^-1] 公式I

结果：EK细胞系在15℃-37℃的温度区间内均可形成汇合单层，而在10℃和40℃下仅能形成少数小型细胞聚落，细胞量低于计数所需最低标准；接种后第2～6天为EK细胞的对数生长期，在此区间于30℃观察到最高生长率(图3)，但该温度下细胞生长迅速，48h内即出现过度生长现象，细胞单层因局部堆积而收缩破坏，不利于常规病原学和生理、药理学实验操作；因此，经多次对比试验，选择26℃为EK细胞系的常规培养温度，在此温度下该细胞系能于36h内形成单层，并维持该状态超过72h，测得该温度下EK细胞的倍增时间为PDT＝50.27h，适用于常规病原分离、毒价分析等实验。

实施例4

对自建的欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK进行染色体型分析

1、试剂:

L-15(购自Hyclone)；甘油、甲醇、冰醋酸、Giemsa粉剂(购自上海生工)；NaCl、Na₂HPO₄、KCl、KH₂PO₄、NaHCO₃、胰蛋白酶(Trypsin)(购自Sigma)；胎牛血清(Fetal bovineserum,FBS)(购自Gibco)；秋水仙素(Colchicine)(购自Sigma)

2、仪器:

液氮罐(Locator)，离心机(Beckman)

3、耗材:

250mL细胞培养瓶(Corning)；15mL离心管(BD Falcon)；载玻片；5mL弯头玻璃滴管；标准玻璃脱色皿

4、步骤:

当EK细胞在体外连续培养超过12个月，且传代次数超过50代后，选择对数生长期的细胞，以秋水仙素法处理后进行染色体型分析：

维持性培养基的配制：制备以L-15培养基为基础，含有终浓度为2％的胎牛血清，不含抗生素及其他营养添加物的维持性培养基，该配方适用于多种生理学、药理学和病原学分析试验。

将所选代次的细胞接种至250mL细胞培养瓶中，于26℃下培养36h后，将培养基完全替换为如步骤1)所述的维持性培养基，并加入终浓度为0.5μg/ml的秋水仙素，孵育5h。

用体积浓度0.25％胰酶消化细胞30s后，加入如前文所述的常规传代用完全培养基终止反应，以弯头滴管吹打收集细胞后，1000rpm离心3min，弃去上清，沉淀用5mL的质量浓度0.3％KCl溶液重悬，低渗处理25min；向细胞悬液中滴加1mL卡诺氏固定液(甲醇:冰醋酸＝3:1，预冷至0℃)预固定5min，1500rpm离心5min后，弃去上清，沉淀加入2mL卡诺氏固定液，静置固定10min；固定后的细胞再次1500rpm离心5min去除杂质，以2mL卡诺氏固定液重悬，4℃静置过夜。

将固定细胞的悬液垂直滴落于预冷至0℃的洁净载玻片上，轻敲玻片使样本细胞均匀分散；滴片风干后以10％Giemsa染色液(pH＝6.8)染色1h，漂洗1次后再度风干，于显微镜下选取100个典型的中期分裂相细胞，拍照并进行染色体数目统计分析。

结果：对第58代EK细胞进行染色体型分析实验，在100个中期分裂相样本中，38％的样本细胞染色体众数符合2n＝38，另有32％的样本染色体众数为36或37(图4-左)，符合2n＝38的细胞样本，其染色体型为2n＝6m+3sm+10t，与欧洲鳗鲡染色体型研究的既往报道相符(图4-右)；证明EK是一株异倍体细胞系。

实施例5

对自建的欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK进行作为外源基因表达模型的应用方法研究

1、试剂:

L-15(购自Hyclone)；NaCl、Na₂HPO₄、KCl、KH₂PO₄、NaHCO₃、胰蛋白酶(Trypsin)(购自Sigma)；胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)(购自Gibco)，lipofectamine^TM2000脂质体转染试剂盒(购自Takara)，pEGFP-N1质粒(购自Takara)。

2、仪器:

超净工作台(Air Tech)；倒置荧光显微镜(Nikon)；生化培养箱(博迅)；超纯水机(Millipore)，离心机(Beckman)

3、耗材:

50mL细胞培养瓶(Corning)，6孔细胞培养板(BD Falcon)；15mL离心管(BDFalcon)；5mL弯头玻璃滴管。

4、步骤:

1)第60代欧鳗肾脏细胞以1×10⁵个/孔的密度接种至标准6孔细胞培养板内，于26℃培养48h至其形成单层。

2)使用pEGFP-N1质粒对步骤1)所述的培养细胞进行转染，质粒/转染剂质量体积比浓度为5μg/12μl，转染后细胞置于28℃孵育8h，弃去上清后，加入常规传代用完全培养基，于26℃继续培养18h。

3)使用倒置荧光显微镜观察转染后细胞的荧光信号，随机选取10个不同视野，计算视野内绿色荧光蛋白(GFP)表达阳性的细胞数占总细胞数的比率，取均值得出转染率。

结果：所建立的欧洲鳗鲡肾脏细胞系可稳定表达外源性绿色荧光蛋白，自转染后24h起可在显微镜下观察到绿色荧光，持续时间可长达4天(图5)，测得转染率约为10％，在鱼类细胞系中表现优秀(参考文献[1]～[3]；[1]T.R.Swaminathan,Raj Kumar,P.M.E.Jency,R.Charan,M.U.Syamkrishnan,V.S.Basheer,N.Sood and J.K.Jena,A newfish cell line derived from the caudal fin of freshwater angelfishPterophyllum scalare:development and characterization.Journal of FishBiology,2016,89(3):1769-1781.[2]N.Wang,X.L.Wang,Z.X.Sha,Y.S.Tian,S.L.Chen,Development and characterization of a new marine fish cell line from turbot(Scophthalmus maximus).Fish Physiol Biochem,2010,36:1227–1234.[3]X.Fu,N.Li,Y.Lai,X.Luo,Y.Wang,C.Shi,Z.Huang,S.Wu and J.Su.A novel fish cell line derivedfrom the brain of Chinese perch Siniperca chuatsi:evelopment andcharacterization.Journal of Fish Biology,2015,86,32–45.),说明该细胞系在基因工程领域深具潜力。

实施例6

对自建的欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK进行作为蛙虹彩病毒宿主细胞的应用方法研究

1、试剂:

L-15(购自Hyclone)；胎牛血清购自Gibco)；感染蛙虹彩病毒(RGV)的鲤鱼表皮瘤细胞(EPC)裂解上清冷冻样品(本实验室保藏)；LB肉汤培养基(sigma)。

2、仪器:

超净工作台(AirTech)；倒置荧光显微镜(Nikon)；生化培养箱(博迅)；液氮罐(Locator)；NanoDrop 2000凝胶成像仪(Thermo)；ABI 7500荧光定量PCR仪(Thermo)。

3、耗材:

250mL细胞培养瓶(Corning)；5mL弯头玻璃滴管；Gene JET DNA提取试剂盒(Thermo)；；

Premix Ex Taq^TMII荧光定量PCR反应试剂盒(Takara)；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(Sangon)；pMD-19T克隆载体试剂盒(Takara)；Amp/IPTG/X-Gal LB平板培养基。

4、步骤:

1)将第60代EK细胞以1×10⁶细胞数接种于250mL细胞培养瓶，24～36h可长成新鲜闭合单层。

2)将完全培养基更换为如实施例4中所述的维持性培养基，26℃恒温孵育4h。

3)取感染蛙虹彩病毒(RGV)的鲤鱼表皮瘤细胞(EPC)裂解上清(来源为现有技术中报道，具体参考文件如下：刘晓东等，《一株牛蛙源虹彩病毒的分离及鉴定》,中国动物传染病学报,2012,20(1):16-21.)冷冻样品，解冻后吹打均匀备用。该病毒株系由本实验室从福建省某美洲牛蛙养殖场分离得到并鉴定，见参考文献(刘晓东等,《一株牛蛙源虹彩病毒的分离及鉴定》,中国动物传染病学报,2012,20(1):16-21.)。

4)取上述步骤2)中制备的实验用EK细胞，将培养瓶中大部分维持性培养基弃去，仅留少许保持瓶底呈完全润湿状态，取上述步骤3)中制备的病毒样品液，以300μL/瓶的用量接种，26℃静置吸附2h后移除，然后添加维持性培养基至体积为20mL/瓶，并以仅进行步骤2)的未接毒细胞作为对照。

5)以24h为间隔对接毒后的EK细胞进行显微镜观察，并和对照细胞进行比较。

6)于病毒接种后第0、6、12、24、48h，分别取一组细胞用Gene JET DNA提取试剂盒(Thermo)提取总DNA，保存于-40℃，作为RGV外膜蛋白荧光定量PCR检测的模板。

7)合成引物如下：Ranavirus-MCP F、Ranavirus-MCP R用于扩增蛙虹彩病毒衣壳蛋白基因659bp片段；MCP153F、MCP215R用于荧光定量PCR标准曲线绘制和样品扩增检测(表1)。

表1引物信息

引物名称	序列(5'-3')
		Ranavirus-MCP F	AGGCCGACGGTCATGTAG(SEQ ID No.1)
Ranavirus-MCP R	TTTGTCAAGGAGCACTACCC(SEQ ID No.2)
		MCP153F	TCACCAAGCTGCCGTCTCT(SEQ ID No.3)
MCP215R	AAAACTGCTGCCCGAAAGC(SEQ ID No.4)

8)依照如下条件进行虹彩病毒衣壳蛋白基因片段的扩增与克隆：

表2 RGV-MCP扩增反应体系构成

PCR反应条件为：95℃预变性3min；94℃30s,55℃30s,72℃35s,共30个循环；最后72℃5min，PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，通过凝胶成像系统记录结果。将目的带切下，用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行回收纯化。

9)将上述回收片段连接至pMD19-T克隆载体，转化至E.coli菌株DH5-α感受态细胞中，并涂至Amp/IPTG/X-Gal LB平板培养基中37℃培养12h；挑取单个白色菌落，接至LB肉汤(含100μg/mL氨苄青霉素)培养基中，37℃210rpm扩大培养12h后，取得阳性克隆菌，对其进行测序鉴定和blast比对以确认基因序列。

10)将如步骤9)所述的阳性克隆菌株扩大培养后提取质粒，用凝胶成像仪进行浓度测定，依照公式：拷贝数＝(质量÷分子量)×6.02×10²³，由浓度换算得质粒拷贝数；将质粒样品稀释成10¹⁰～10¹拷贝的标准梯度，作为荧光定量PCR模板。

11)依照如下条件进行荧光定量PCR标准曲线的制作与细胞样品检测：

表3荧光定量PCR反应体系构成

以标准品各2μL为模板，每个标准品重复3孔。扩增标准程序为：95℃预变性30s；95℃5s，60℃34s，40个循环。熔解曲线反应条件为：95℃15s,60℃60s,95℃15s，测定各标准梯度扩增产物的CT值，以其常用对数lg值作为横坐标，对应CT值为纵坐标作散点图，作线性回归分析，绘制标准曲线并得出相应公式。依照上述方法对如步骤6)所述的不同时间段的总DNA样品模板进行扩增和CT值测定，对照标准曲线计算病毒拷贝数，并绘制表达曲线。

结果：于接毒24h后，即可观察到接毒样品中出现CPE(细胞病变)现象，48h后病变率可达75％，光镜下可见细胞大面积皱缩脱壁，被感染细胞显著膨大，内部空泡化(图6)，而对照样品细胞生长良好，贴壁紧密，细胞密度有显著增加现象；荧光定量PCR分析结果显示，在接毒后6～48h内，细胞内RGV衣壳蛋白基因的拷贝数出现了极显著的增长。以上结果充分显示了所述欧鳗肾脏细胞系作为虹彩病毒研究模型的潜力(图7)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 福建省农业科学院生物技术研究所

<120> 一种欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aggccgacgg tcatgtag 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tttgtcaagg agcactaccc 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcaccaagct gccgtctct 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaaactgctg cccgaaagc 19

Claims

1.一种欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK，保藏编号为CCTCC No:C2018160。

2.权利要求1所述的欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK在构建外源基因表达模型中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述构建外源基因表达模型的方法包括以下步骤：

(1)将所述欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK接种至细胞培养板上，在26°C条件下培养48h，得到单层细胞；

(2)将携带外源基因的表达载体转染至所述单层细胞中，在28°C孵育8h，弃去上清后添加完全培养基，在26°C下继续培养18h，得到外源基因表达模型。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK的接种浓度为1～2×10⁵个/孔。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述携带外源基因的表达载体的转染浓度为5μg/12μl。

6.根据权利要求3～5任意一项所述的应用，其特征在于，所述携带外源基因的表达载体为质粒pEGFP-N1。

7.权利要求1所述的欧洲鳗鲡肾脏细胞系EK在作为病毒宿主细胞中应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述病毒是蛙虹彩病毒。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述病毒宿主细胞培养的温度为26℃。