JP2003510067A - 鳥類胚盤葉細胞系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 未分化鳥類原始生殖細胞／胚盤葉細胞の培養物を本明細書中で開示する。培養物は、鳥類臍の単離物（例えば、シチメンチョウ臍抽出物）の存在下で培養した場合、長期間その未分化特性およびＥＭＡ−１エピトープを発現する能力を維持することができる。また、鳥類臍抽出物を使用したこのような培養物の培養法および鳥類臍抽出物を含む培養培地をも開示する。また、このような培養物由来の組換え鳥類をも開示する。これらの培養物を生殖系列ゲノムの長期保存用に凍結することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （関連出願の相互参照） 適用なし。

【０００２】 （連邦政府により援助を受けた研究に関する記述） 本発明を、以下の機関：ＵＳＤＡ ９６−ＣＲＨＲ−０−６００５から授与さ
れた合衆国政府助成金を使用して行った。合衆国政府は、本発明に一定の権利を
有する。

【０００３】 （発明の背景） 本発明は、不死化胚盤葉鳥類細胞系ならびにこのような系（line）の作製技術
およびこのような方法を使用した物質に関する。このような細胞系は、トランス
ジェニック鳥の作製および生殖系列ゲノムの保存に好ましい。

【０００４】 トランスジェニック技術は、植物の市場価値を高める（例えば、耐病性および
除草剤耐性の向上）ための強力なツールである。しかし、動物の遺伝的特徴の改
良の試みは植物より遅れており、ほとんどは動物をバイオリアクターとして使用
してヒト用合成医薬品を製造することに重要視されていた。現在、トランスジェ
ニック技術を使用した家畜動物の遺伝的特質はほとんど向上していない。

【０００５】 このような努力は、特に典型的に高密集飼育を行い、マレク病および鳥類白血
病などの疾患による感染の危険性が増大する家禽類（例えば、ニワトリ、アヒル
、ガチョウ、シチメンチョウなど）産業に注がれている。したがって、商業上の
飼育者は、耐病性の高い家禽類を（天然の飼育技術を使用して）選択しようとし
ている。

【０００６】 耐病性の向上を目的として家禽類繁殖系への外来遺伝子の導入を試みようと考
えられている。例えば、生殖系列に変異ＡＬＶウイルスを接種して、鳥類白血病
ウイルスの特定のサブグループへの耐性を向上させた。エム．フェデルスピール
ら、65 J. Virol. 313-19 (1991) を参照のこと。言及されたこの刊行物および
他の全ての刊行物の開示は、本明細書中で完全に記載されているように参照して
本明細書中の記載の一部とする。

【０００７】 レトロウイルスベクター（例えば、細網内皮性ウイルスまたは鳥類白血病ウイ
ルス）への外来遺伝子のクローニング、受精卵への組換えウイルスの注入、発生
胚（例えば、原始生殖細胞）へのウイルスの感染によるキメラ生殖腺または卵細
胞の作製、および得られた組換え物を使用した子孫への外来遺伝子の導入によっ
て選択された外来遺伝子の移入も試みた。しかし、ウイルス（その天然の状態）
は病原体であり、変異複製コンピテントウイルスベクターでさえときどき腫瘍を
産生し、複製不全変異体は高投薬量または反復投薬を行う必要があるので、家禽
類産業ではこの技術の商業的な使用は倦厭されている。また、複製欠陥ウイルス
構築物でさえも内因性ウイルスエンベロープでの組換えおよび複製コンピテント
を持つようになるいくらかの危険性があり得る。さらに、現在、これらのベクタ
ーは比較的小さなサイズ（例えば、２キロベース以下）のＤＮＡインサートに制
限されている。

【０００８】 また、雌鳥から外科的に取り出した未発生受精卵への外来ＤＮＡの注入も試み
られている。エム．ペリー、331 Nature (1998) を参照のこと。しかし、このア
プローチは、一連の代理コンテナ中での発生胚のインキュベーションが必要であ
った。さらに、必要な外科的および技術的技量を得るために特別な集団および相
当な訓練が必要であった。

【０００９】 技術をあまり要求されない先行技術のアプローチは、産卵後の胚への外来ＤＮ
Ａの移入であった。一般に、ジェイ．ペティットら、76 Poult. Sci., 1084-92
(1997)；アール．エッチーズら、62 Methods Mol. Biol., 433-50 (1997)；エム
．ナイトウら、113 J. Reprod. Fertil, 137-43 (1998)；エム．ナカムラら、67
Okajimas Folia Anat Jpn., 473-7 (1991)；ジェイ．ペティットら、108 Devel
opment, 185-9 (1990)；およびジェイ．ペティットらに付与された米国特許第5,
340,740号および同第5,656,479号を参照のこと。

【００１０】 これには、原始生殖細胞が性腺アナラゲンに移行し始めた場合、産卵直後また
は４８時間後のいずれかで胚盤葉に遺伝子改変胚細胞または原始生殖系列への注
入が含まれていた。このアプローチでは、発生胚に組み込まれた場合に機能的卵
子または精子産生細胞の分化能力が維持される胚盤葉細胞培養物を作製した。

【００１１】 このタイプの胚盤葉細胞培養物を遺伝子改変して、レシピエント胚に注入する
ことができる。典型的には、レシピエント胚をγ線放射によって内因性原始生殖
細胞を弱らせるように予め改変し、注入細胞に性腺アナラゲンへの帰巣における
選択上の利点を与える。次いで、改変細胞は成熟して、導入遺伝子を少なくとも
次世代（好ましくは、他のさらなる世代）に伝達可能な精子または卵子を産生す
る。

【００１２】 この技術の成功の鍵は、胚の胚盤葉細胞を拡大しながらその分化を阻害する能
力である。したがって、いくつかの群では、種々のクローン化因子および短期間
（数日間〜約２週間）で胚細胞を拡大させるがその原始生殖細胞表現型を維持す
る支持細胞の添加に基づく培養技術が開発されている。これらの培養細胞により
生殖系列キメラの産生が成功しているが、この系を使用した導入遺伝子としての
トランスフェクトＤＮＡを発現させる試みのほとんどが不成功に終わっている。

【００１３】 別のアプローチは、毒素を含む培養培地の使用に基づいていた。

【００１４】 従って、鳥類胚盤葉細胞培養物用の培養条件の改良が必要であることが認めら
れる。

【００１５】 （発明の要約） １つの態様では、本発明は、ＥＭＡ−１エピトープを発現する未分化鳥類（好
ましくは、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、およびニワトリなどの家禽類）
胚盤葉細胞の培養物を提供し、前記培養物は、鳥類臍の単離物（例えば、胚鳥類
臍由来の単離物）の存在下で培養した場合、長期間（好ましくは、６ヶ月を超え
る期間）その未分化特性およびＥＭＡ−１エピトープを発現する能力を維持する
ことができる。

【００１６】 別の態様では、本発明は、ＥＭＡ−１エピトープを発現することができる未分
化胚盤葉細胞の維持培養物の産生方法を提供する。原始線条の形成前に鳥類胚盤
葉から鳥類細胞を回収する。次いで、シチメンチョウ臍抽出物などの鳥類臍単離
物の存在下で鳥類細胞を培養する。

【００１７】 さらに別の態様では、本発明は、鳥類臍単離物を含む鳥類（例えば、家禽類）
胚盤葉細胞の培養培地を提供する。培養培地はまた、標準的な胚盤葉培養物に存
在する他の成分を含むことが好ましい。

【００１８】 さらに別の態様では、本発明は、鳥類生殖系列ゲノムの保存方法を提供する。
これは、上記の培養物の１つの凍結によって達成される。

【００１９】 本発明の別の態様は、このような培養物由来の組換え鳥を提供する。

【００２０】 鳥類臍単離物を含む培養培地との胚盤葉細胞の培養によって、未分化原始生殖
細胞を含む維持培養物を得ることができる。これにより、組換え細胞作製用の有
効な培養物が得られる。

【００２１】 得られた組換え生殖細胞は、組換え鳥の産生および生殖系列ゲノムの保存に有
用である。さらに、おそらくこのような組換え鳥はこれらの外来特性を子孫に伝
達することができると考えられる。

【００２２】 従って、本発明の目的は、 （ａ）支持層または毒素を必要とすることなく長期間未分化を維持することがで
きる維持鳥類原始生殖細胞培養物、 （ｂ）このような細胞培養物由来の組換え鳥、 （ｃ）このような培養物の作製方法、 （ｄ）このような培養物の凍結によるゲノムの保存方法、および （ｅ）このような方法の実施に有用な培養培地 を提供することを含む。

【００２３】 本発明のこれらの及びさらに他の目的および利点は以下の好ましい実施態様の
記載から明らかとなるであろう。しかし、本発明の全範囲を判断するためには、
特許請求の範囲に留意しなければならない。

【００２４】 （詳細な説明） 概説 本発明者らは、支持層または毒素を必要とせず、６ヶ月を超えて生存可能な鳥
類胚盤葉細胞（「ＢＤＣ」）を維持することができる安定なＢＤＣ培養系を提供
する。培養ＢＤＣは、原始生殖細胞のマーカーであるＥＭＡ−１エピトープを発
現する。エイ．ハーネルら、15 Gamete Research 25-34 (1986) およびエル．ウ
ーベンら、103 Develop. 299-304 (1988) を参照のこと。この技術によって産生
された培養細胞は、トランスフェクトされてレシピエントニワトリ胚に挿入され
た場合に造血細胞および種々の他の細胞型に寄与することができた。

【００２５】 材料 ドナー胚盤葉細胞およびレシピエント受精卵の供給源は、共に鳥類疾病および
腫瘍学研究所（ＡＤＯＬ）であった。本発明者らは、株（line）０（ＭＨＣ＝Ｂ ²¹ Ｂ²¹）、Ｃ（ＭＨＣ＝Ｂ¹²Ｂ¹²）、７₁（ＭＨＣ＝Ｂ²Ｂ²）、１５Ｉ₅×７₁（
ＭＨＣ＝Ｂ²Ｂ¹⁵）、Ｎ（ＭＨＣ＝Ｂ²¹Ｂ²¹）、Ｐ（ＭＨＣ＝Ｂ¹⁹Ｂ¹⁹）を一部
使用したが、これらの株が共通の病原ウイルスを含まないで維持されていること
が知られているからである。

【００２６】 本発明者らの培養培地を以下に示した。無血清且つ無タンパク質ハイブリドー
マ培地（ＳＦＰＦ、＃Ｓ２８９７）を使用して、０ ＢＤＣ株を培養した。

【００２７】 Ｌ−１５リーボビッツ培地／マッコイ５Ａ改変培地（Ｌ／Ｍ、＃Ｌ４３８６と
＃Ｍ４８９２を１：１）を使用して、０株、７株、および１５Ｉ₅×７₁株を培養
した。

【００２８】 ダルベッコ改変イーグル培地／ハム栄養混合物（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、＃Ｄ０
５４７）を、Ｃ株に使用した。

【００２９】 イーグル最小基本培地（ＭＥＭ、＃Ｍ０６４４）を、Ｐ株に使用した。

【００３０】 より一般的には、このような培地は、典型的には、水、無機塩類、ビタミン類
、アミノ酸類、緩衝液、グルコース、ヌクレオチド前駆体類／ヌクレオチド類、
脂質類、ＴＣＡ回路中間体類、および種々の微量添加物類を含む。

【００３１】 細菌細胞増殖を阻害するためにすべての培地でも１，０００Ｕ／ｍｌの最終濃
度でのペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）を使用した
。

【００３２】 Ｃ株のＢＤＣ増殖を促進するために、フォルスコリン（＃Ｆ６８８６または＃
Ｆ３９１７）（最終濃度２０μｇ／１００ｍｌ）も添加した。

【００３３】 上記のすべての培養培地試薬を、シグマケミカル社（セントルイス、ミズーリ
州）（Sigma Chemical Co.，St Louis，MO.）から購入し、ウシ（仔牛）胎児血
清（FBS、ジブコＢＲＬライフテクノロジーズ（グランドアイランド、ニューヨ
ーク州）（Gibco BRL Life Technologies，Grand Island，NY））を、２０％の
最終濃度で全ての培地に添加した。

【００３４】 シチメンチョウ臍を筒状の胚から得た。各臍を、臍帯付属物周囲の腹部領域か
ら切り出した（直径０．７〜１ｃｍ）。任意の残りの臍帯を取り出した。臍を、
血清を含まない氷冷培地中にプールし（２ｍｌの培地あたり１つの臍）、組織粉
砕機によって冷浴中でホモジナイズし、凍結融解を３回行い、４℃で３０分間２
５，０００×ｇで遠心分離した。この目的で使用した氷冷培地は、例えば、無血
清且つ無タンパク質のハイブリドーマ培地（ＳＦＰＦ、＃Ｓ２８９７）であった
。鍵となる特徴は、関連単離物としての水を含む抽出液体は水溶性であることで
ある。

【００３５】 上清を保持し、０．２２μｍ膜で濾過滅菌し（このサイズより大きな粒子を除
去するため）、バイアルあたり１ｍｌに等分し、−２０℃で保存した。この滅菌
濾過シチメンチョウ臍抽出物（「ＴＮＥ」）を、４００μｌのＴＮＥ／１０ｍｌ
培地で細胞培養物に新たに添加した（１００ｍｌの培地あたり２つの臍に相当）
。

【００３６】 鳥類胚は孵化しそうな場合、卵黄嚢は腹部領域（従来、臍として知られている
）の小さな開口部を介して胚の体腔に退縮し始める。この開口は卵黄嚢退縮後数
分以内に治癒する。エイ．ロマノフら、「鳥類胚：構造および機能の発達」、10
51-1079, マクラミン社、ニューヨーク（The Macmillan Company, New York） (
1960) を参照のこと。

【００３７】 本発明者らは、鳥類臍組織中の細胞が、臍の閉鎖速度を高めるための成長／治
癒因子を分泌すると考える。臍が完全に治癒していない場合、孵化したヒヨコは
孵化日から早い時期は感染に感受性を示す。本発明者らは、これらの因子は本発
明者らの培養培地に有用であることを発見した。

【００３８】 任意選択的な添加物として、ニワトリ胚抽出物を使用した。７日齢のニワトリ
胚を、無血清且つ無タンパク質ハイブリドーマ培地（ＳＦＰＦ、＃Ｓ２８９７）
に入れ、氷浴でホモジナイズし、３回凍結融解し、４℃で３０分間２５，０００
×ｇで遠心分離した。上清を、０．２２μｍ膜によって濾過滅菌した。滅菌ニワ
トリ胚抽出物を、バイアルあたり約１つの胚に相当するように等分し（得られた
抽出物の体積に依存する）、−２０℃で保存した。任意選択的に、１００ｍｌの
培養培地あたり１つの胚に相当するように抽出物を添加した。この添加物は、細
胞増殖を高めると信じられている。

【００３９】 ＥＭＡ−１モノクローナル抗体は、エイ．ハーネルら、15 Gamete Research 2
5-34 (1986) に記載されている。これは、原始生殖細胞と反応する。ＥＭＡ−１
エピトープは、鳥類原始生殖細胞のマーカーとみなされる。ＥＭＡ−１抗体を、
アイオワ州立大学発生研究ハイブリドーマバンク（アイオワシティ、アイオワ州
（Iowa City，IA））から得た。

【００４０】 トランスフェクション溶液として、２．５％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ス
トレプトマイシン、ヘペス（hepes）緩衝化生理食塩水２ｘ（ＨＢＳ ２ｘ）溶
液：１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、５０ｍＭ ヘペス（hepes
）（＃Ｈ９１３６、シグマ（Sigma））（ｐＨ ７．０５）、２Ｍ ＣａＣｌ₂の脱
イオン水（ｄＨ₂Ｏ）を含む培地１９９（Ｍ１９９、＃Ｍ７６６７）を使用した
。

【００４１】 ベクターの例として、マーカータンパク質「緑色蛍光タンパク質」（ｐＥＧＦ
Ｐ、クローンテクラボトリーズ株式会社、パロアルト、カリフォルニア州（CLON
ETECH laboratories, Inc.，Palo Alto，CA））を含むプラスミドを使用した。
また、目的の他の外来遺伝子を含む他のベクターも使用した。例えば、ジェイ．
フルトンら、25 Eur. J. Immunol. 2069-2076 (1995) に記載のppZeoBFIVprom/F
LAG/B21を参照のこと。

【００４２】 培養の種々の段階における細胞解離を促進するために、コラゲナーゼ（＃１７
１０３、ジブコＢＲＬライフテクノロジーズ（GibcoBRL Life Technologies））
を、血清を含まないＬ／Ｍ培地中で０．２ｍｇ／ｍｌに希釈した。細胞スクレイ
パー−ラバーポリスマン（＃１４−１０５Ｂ、フィッシャーサイエンティフィッ
ク、ピッツバーグ、ペンシルバニア州（Fisher Scientific，Pittsburgh，PA）
）を使用して、培養インサートから細胞を取り出した。

【００４３】 胚を組換えるために、最近（１８時間）産卵された卵殻の内側に卵を近づける
が必要であった。これには卵殻を開けることに関連するので、利用可能な卵殻膜
のパッチ切片を有することが必要であった。この目的のために、卵を割り開けて
、内容物を捨てた。卵殻膜を卵殻から剥ぎ取り、１％ペニシリン／ストレプトマ
イシンのリン酸緩衝食塩水を含む滅菌した１５０×２０ｍｍ培養プレートに置い
た。卵殻膜を、約２ｃｍ²のサイズに切り刻んだ。

【００４４】 方法 Ａ．原始生殖細胞系の作製 本発明にしたがって胚盤葉細胞の培養物を作製した。インキュベートしていな
い受精卵のIX〜XIV期の胚盤葉の中心部（明域）（エイチ．アイアル−ギラジら
、49 Develop．Bio．321−337（1976））を微小解剖鋏（＃１１−１０２０、バ
イオメディカルリサーチインストラメンツ社、ロックビル、メリーランド州（Bi
omedical Research Instruments, Inc.，Rockville，MD））で切断し、微小解剖
ピンセット（＃１０−１６０５、ＢＲＩ）で取り出し、５ｍｌの培養培地に設置
した。約３０個の胚盤葉を一緒にプールし、３ｍｌのシリンジに取り付けた２２
Ｇニードルに穏やかに数回通過させて細胞を分散させた。

【００４５】 次いで、細胞を、細胞培養インサートに沈着させた（エフ．ヴィラーら、12 C
ell Biol. Toxicol. (1996)）。この目的のために、トランスウェル（Transwell
）多孔質細胞培養インサート（直径７５ｍｍ、孔径０．４μｍ、ポリカーボネー
ト膜、＃３４１９、コーニング株式会社、コーニング、ニューヨーク州（Cornin
g Incorporated，Corning，NY））を使用した。

【００４６】 新鮮なシチメンチョウ臍抽出物（任意選択的にニワトリ胚抽出物を含む）を含
むさらに１５ｍｌの培養培地を培地に添加して、３７℃でインキュベートした。
ＢＤＣを２日間インサート膜に結合させ、１週間で密集（コンフルエント（conf
luency））に達した。

【００４７】 適切な培養培地の例は、８２％ハイブリドーマ培地、１５％ウシ胎児血清、１
％ペニシリン／ストレプトマイシン、２つのシチメンチョウ臍由来の抽出物、お
よび１つのニワトリ胚由来の抽出物を含んだ。

【００４８】 密集の際、ＢＤＣを細胞スクレイパーで培養インサートから擦り取り、５〜７
日毎に新鮮な培地で１：２〜１：３の比に希釈した。種々の継代で、トリプシン
またはコラゲナーゼ処理感受性が存在するので、少なくとも初代および初期継代
培養の間は酵素分離を避けた。

【００４９】 次いで、種々の培養時間でのＥＭＡ−１エピトープの発現についてこれらの細
胞を試験した。種々の標準的な技術によってこのような試験を行った。一例とし
て、培養物から培地を取り除くことができる（プレート中に培養物を残す）。次
いで、培養物を、ＰＢＳで３回洗浄することができる。次いで、プレートにＥＭ
Ａ−１抗体溶液を添加することができる。次いで、系を室温で１５分間（または
４℃で３０分間）インキュベートすることができる。

【００５０】 次いで、ＥＭＡ−１溶液をプレートから除去し、ＰＢＳでさらに３回洗浄する
。ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体を添加し、室温で１５分間インキュベー
トする。ＰＢＳでさらに３回洗浄後、ＵＶフィルターを具備した顕微鏡でプレー
トを観察する。結合した抗体が認められ、これはＥＭＡ−１発現を示す。

【００５１】 Ｂ．凍結 得られた胚盤葉細胞系を、細胞中の脂質か粒の含有率を高めるために培養の初
期段階で首尾よく凍結させることができた。しかし、２ヶ月の培養後、首尾よく
凍結保存後、再培養することができた。

【００５２】 これに関して、胚盤葉細胞を、コラゲナーゼ分離を用いて培養インサートから
取り出し、クリオバイアル中の凍結培地に再懸濁した。バイアルを−７０℃の発
泡スチロールの箱中で一晩凍結させ、−７０℃で短期間保存した。より長い保存
のために、本発明者らは、細胞を液体窒素中で保持すべきだと考える。

【００５３】 細胞凍結培地として、５０％ハイブリドーマ培養培地（ニワトリ胚抽出物また
はシチメンチョウ臍抽出物を含まない）、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳ
Ｏ、＃Ｄ２６５０、シグマケミカル（Sigma Chemical））、および４０％ウシ胎
児血清を使用した。凍結融解実験から、本発明者らは、ＢＤＣを培養から２ヵ月
後に首尾よく凍結保存することができると確定した。

【００５４】 Ｃ．トランスフェクション 次いで、本発明者らの培養細胞を組換えるために、ベクター類を使用した。改
変リン酸カルシウム沈殿法を使用してトランスフェクションを開始した。トラン
スフェクションのために使用する胚盤葉細胞を、２〜６ヶ月培養した。２０μｇ
の試験プラスミド／ベクターの２０μｌのｄＨ₂Ｏ、１２０μｌの２Ｍ ＣａＣｌ ₂ 、８６０μｌのｄＨ₂Ｏ、および１ｍｌのＨＢＳ ２ｘ溶液を、ファルコン（Fal
con）の１２×７５ｍｍ滅菌ポリスチレン丸底試験管（＃２０５８、ベクトンデ
ィッキンソンラブウェア、リンカーンパーク、ニュージャージー州（Becton Dic
kinson Labware，Lincoln Park，NJ））に添加した。

【００５５】 １ｍｌピペットを使用して、１分間試験管を曝気した。試験管を、室温で３０
分間インキュベートした。次いで、このプラスミド溶液（２ｍｌ）を培養プレー
トに添加し、培養培地を２．５％ＦＢＳを含むＭ１９９に置換し、３７℃で８時
間インキュベーションを継続した。次いで、Ｍ１９９培地を捨て、プレートをＭ
１９９培地で洗浄し、元の培養培地を培養プレートに戻した。このプロトコルの
重要な局面は、化学的選択を行わずに胚盤葉細胞培養物のトランスフェクション
を反復することである。これらの脆弱な細胞の生存度が向上する一方で、トラン
スフェクション効率が３０％に増加する。

【００５６】 Ｄ．外来宿主胚の注入 新規に産卵した受精卵の卵殻を、７０％アルコールで消毒し、気室を定義し、
エッグキャンドラー（egg candler）を利用して追跡した。１８時間のインキュ
ベーション後、卵を孵卵器（ジャムズウェイ（Jamsway）、強制空気型）から室
温に取り出した。ベルトサンダ（３型、＃７４５１、ベルトサイズ３"×２４"、
アンプ５．２、ベルトのフィート／分は１２００、ブラック＆デッカー株式会社
、タウソン、メリーランド州 21210（Black＆Decker In.，Towson，MD 21210）
）を使用して気室領域中の卵殻に直径１ｃｍの穴をあけた。先の平たいピンセッ
トで卵殻膜を取り除いた。

【００５７】 １０，０００ＤｉＩの飽和またはトランスフェクトＢＤＣを含む２０μｌの培
地を、孔径約４０μｍのマイクロキャピラリーニードルピペットを介してヒヨコ
胚の生殖三日月環領域に注入した。ＤｉＩ（ＤＩＩ：１，１'−ジオクタデシル
−３，３，３，３'−テトラ−メチルインド−カルボシアニン過塩素酸；ｄｉＩ
−Ｃ₁₈−（３））（モレキュラープローブス、ユージン、オレゴン州（Molecula
r Probes，Eugene，OR））を１００％ＤＭＳＯに溶解した。２．５ｍｇ／ｍｌの
ストック溶液を調製し、２．５μｇ／ｍｌの最終濃度に培養培地で希釈して、３
７℃でのインキュベーション中８時間培養プレートで胚盤葉細胞を着色した。Ｄ
ｉＩ含有培地の除去後、培養プレートをＰＢＳで５回洗浄した。

【００５８】 組織中のＤｉＩ染色細胞の検出法が存在することに留意のこと。例えば、７日
齢の胚生殖腺を胚から取り出し、４％パラホルムアルデヒド中４℃で８時間固定
し、次いで、５％スクロースのＰＢＳ溶液中４℃で一晩維持し、３０％スクロー
スのＰＢＳ溶液中４℃で８時間維持し、その後−７０℃で凍結した。５μｍの凍
結切片を蛍光顕微鏡で観察した。ＤｉＩを、ローダミンフィルターまたは狭帯域
フィルターを使用して視覚化することができる（アール．ペンザら、13 Biotech
niques 580-587 (1992)）。

【００５９】 注入後、卵殻膜パッチ（上述）を、気室の上に置いた。卵殻膜を乾燥後オプサ
イトテープ（OpSite tape）（高ＭＶＰ透明包帯剤、＃４００８、スミス＋ネフ
ュー（Smith+Nephew）、地方の薬局で購入）を使用して卵殻膜上を包帯をし、卵
をジェイムズウェイ（Jamesway）孵卵器に戻して、インキュベーションを継続し
た。１９日目に胚を孵化バスケットに移し、孵化したヒヨコを縛り、鶏冠を切り
取り、ＳＢ−１／ＨＶＴマレク病ワクチンを注射した（製造者の説明に従う）。

【００６０】 結果 フローサイトメトリー（ＦＣ）分析により、約３５〜４５％の胚盤葉細胞が２
週間の培養後にＥＭＡ−１エピトープを発現することが示された。ＥＭＡ−１陽
性細胞のサイズは、１５〜３０μｍの範囲であった。

【００６１】 胚盤葉細胞の約３０％が２ヶ月の培養後ＥＭＡ−１陽性のままであった。この
細胞は、胚幹細胞様コロニーを形成することができ、さらにＥＭＡ−１エピトー
プを示した。これらのコロニーを緊密にし、形態を均一にした。これにより原始
生殖細胞が安定化するようである（下記の培養条件下）。

【００６２】 培養培地中に鳥類臍抽出物を添加しないで、１回複製した胚盤葉抽出物は２週
間より長く生存することができなかった。培地中にシチメンチョウ臍抽出物を補
うと、細胞は２〜３回複製した（卵供給源の株に依存する）。成長速度は低下し
、細胞は約４週間休眠（dormancy）したままであった。シチメンチョウ臍抽出物
を毎日培養物に添加すると、休眠期間を２週間に短縮することができた。

【００６３】 ４週間の休眠後、細胞は複製を再開し、継代した。コラゲナーゼ溶液を使用し
て、休止からの回復後の分離を促進させた。２〜６ヶ月の培養後、ドナー細胞を
細胞注入／移植に使用した。

【００６４】 長期間培養したＢＤＣを培養インサートから従来の組織培養プレートに低細胞
密度（１０^３細胞／ｃｍ²）で移した場合、ＢＤＣは、形態学的に同定すること
ができる線維芽細胞様、メラニン形成細胞様、神経細胞様、および筋肉細胞様分
解細胞に分化し始める（データ示さず）。これは、多分化能を示す。本明細書中
に記載の培養培地条件下での細胞培養インサートにより、ＢＤＣは多孔質膜の上
下から栄養素を吸収し、これにより、自発的分化過程を防止するようである。

【００６５】 休眠期および再成長期からＢＤＣを回復後、ＢＤＣを３回を超える回数で継代
し、ＤｉＩ−Ｃ１８赤色色素とインキュベートし、１８時間の胚に注入した。１
つの実験では、注入から６日後、胚組織を取り出し、５μｍの厚さに凍結切断し
た。蛍光顕微鏡を使用して、生殖腺および他の組織中に赤色色素を有する細胞を
検出した。これは、培養ＢＤＣが、生殖腺および種々の他の胚組織に成熟または
分化することができることを示していた。

【００６６】 別の実験では、培養ＢＤＣ（２ヶ月以上）を、薬物選択を行わないリン酸カル
シウム沈殿法を使用して３つのプラスミド／ベクター（ｐＧＦＰ、ｐＨＣｌ、ま
たはＢＦＩＶ−クラスＩ）で３回（１０日に１回）トランスフェクトした。最後
のトランスフェクションから３日後、トランスフェクトＢＤＣを培養インサート
から取り出し、コラゲナーゼ溶液で処理して、単一の細胞懸濁液を得た。ＢＤＣ
懸濁物を１％ニワトリ血清を含むＰＢＳ中に再懸濁し、生殖三日月環領域中の１
８時間の胚に注入した。

【００６７】 この注入後の孵化率は、９．２％であった（ドナー細胞は０株ＭＨＣ＝Ｂ²¹Ｂ ²¹ 由来であり、レシピエント卵は１５Ｉ₅×７₁ ＭＨＣ＝Ｂ²Ｂ¹⁵であった）。
血液を４週齢の子孫ニワトリから採取し、フローサイトメトリーで分析した。レ
シピエントＢ２Ｂ１５血液中にドナーキメラＢ２１Ｂ２１細胞が検出された。い
くつかのニワトリでは、ドナー細胞の割合は２５％〜３３％もあった。

【００６８】 さらに、４９羽の推定キメラニワトリのうち７羽は、血液中にドナー型の細胞
のＭＨＣ抗原を有した。トランスフェクトレシピエント中のクラスＩ抗原の発現
はニワトリの末梢血で検出されなかった。５羽のトランスフェクトニワトリのう
ち１羽は、血液細胞中にｐＨｃ１を約４％発現した。このトランスフェクトニワ
トリの１羽は、緑色蛍光タンパク質を１２％発現した。したがって、外来の性質
は、組換え細胞培養物から生きている（living）子孫家禽類に伝達することがで
きた。

【００６９】 本発明はすべての型の鳥類の使用に適切であることが認識されるが、商用の家
禽類（ニワトリ、シチメンチョウ、キジ、アヒル、ガチョウなど）の使用に最も
商業的に価値があるのは明らかである。

【００７０】 抽出物は、好ましくは胚鳥類（特に、胚シチメンチョウ）臍由来の水溶解物フ
ラクション抽出物である。しかし、他の鳥類種由来の同様の抽出物もまた作用す
るはずである。本明細書中で特定した性質の付与を担うと考えられる抽出物中の
物質の型はたんぱく質である（例えば、サイトカイン類などの成長因子類のよう
である）。

【００７１】 細胞培養物は、原始生殖細胞を含むと考えられる。しかし、これらを、ＥＭＡ
−１抗体の発現によって最良に特徴付けられる。

【００７２】 好ましい実施態様を記載してきたが、本発明の範囲内で他の修正態様を行うこ
とができることが当業者に認識される。したがって、本発明の全範囲を判断する
ためには、特許請求の範囲を留意しなければならない。

【００７３】 産業上の利用可能性 本発明は、長期培養が可能な鳥類原始生殖細胞系ならびにこれらの系の維持お
よび凍結方法、このような方法に有用な物質、およびこれらの物質を使用して作
製した鳥類を提供する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ツァイ， ハーン アメリカ合衆国 48823 ミシガン イー スト ランシング チェリー レーン ＃301 701 (72)発明者 フント， ヘンリー ディ． アメリカ合衆国 48864 ミシガン オケ モス ロクスバリー アベニュー 3865 (72)発明者 ベーコン， ラリー ディ． アメリカ合衆国 48895 ミシガン ウィ リアムストン ロッキー ヒル 4610 (72)発明者 ウェントワース， バーナード シー． アメリカ合衆国 53717 ウイスコンシン マディソン ガモン ロード 301 エ ヌ． (72)発明者 ウェントワース， アリス エル． アメリカ合衆国 53717 ウイスコンシン マディソン ガモン ロード 301 エ ヌ． Ｆターム(参考） 4B065 AA90X AC20 BB23 BB34 BD45 CA60

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＥＭＡ−１エピトープを発現する未分化鳥類胚盤葉細胞の培
   養物であって、鳥類臍由来の単離物の存在下で培養した場合、前記培養物が２ヶ
   月を超える期間その未分化特性およびＥＭＡ−１エピトープを発現する能力を共
   に維持することができることを特徴とする培養物。
2. 【請求項２】 前記鳥類臍が胚の鳥類臍であることを特徴とする請求項１に
   記載の培養物。
3. 【請求項３】 前記鳥類胚盤葉細胞が、シチメンチョウ細胞、アヒル細胞、
   キジ細胞、ガチョウ細胞、およびニワトリ細胞からなる群から選択されることを
   特徴とする請求項１に記載の培養物。
4. 【請求項４】 胚鳥類臍由来の単離物の存在下で培養した場合、前記培養物
   が６ヶ月を超える期間その未分化特性およびＥＭＡ−１エピトープを発現する能
   力を共に維持することができることを特徴とする請求項２に記載の培養物。
5. 【請求項５】 シチメンチョウ臍由来の単離物の存在下で培養した場合、前
   記培養物が２ヶ月を超える期間その未分化特性およびＥＭＡ−１エピトープを発
   現する能力を共に維持することができることを特徴とする請求項２に記載の培養
   物。
6. 【請求項６】 原始線条の形成前に鳥類胚盤葉から鳥類細胞を収集する工程
   、および、 鳥類臍由来の単離物の存在下で鳥類細胞を培養する工程 とを包含することを特徴とするＥＭＡ−１エピトープを発現することができる未
   分化胚盤葉細胞の維持培養物の産生方法。
7. 【請求項７】 前記鳥類臍が胚鳥類臍であることを特徴とする請求項６に記
   載の維持培養物の産生方法。
8. 【請求項８】 前記単離物がシチメンチョウ臍抽出物であることを特徴とす
   る請求項６に記載の維持培養物の産生方法。
9. 【請求項９】 鳥類臍由来の単離物、無機塩類、ビタミン類、アミノ酸類、
   および水を含む鳥類胚盤葉細胞培養用の培養培地。
10. 【請求項１０】 前記鳥類臍がシチメンチョウ臍であることを特徴とする請
    求項９に記載の培養培地。
11. 【請求項１１】 請求項１に記載の培養物を凍結する工程を包含することを
    特徴とする鳥類生殖系列ゲノムの保存方法。
12. 【請求項１２】 ＥＭＡ−１エピトープを発現する未分化鳥類胚盤葉細胞の
    培養物に由来し、前記培養物が鳥類臍由来の単離物を含むことを特徴とする組換
    え鳥。
13. 【請求項１３】 前記培養物が２ヶ月を超える期間その未分化特性を維持し
    、且つＥＭＡ−１エピトープを発現することができることを特徴とする請求項１
    ２に記載の組換え鳥。
14. 【請求項１４】 前記鳥類臍が胚鳥類臍であり、前記組換え鳥が請求項１２
    に記載の培養物に由来することを特徴とする請求項１２に記載の組換え鳥。
15. 【請求項１５】 前記鳥類胚盤葉細胞が、シチメンチョウ細胞、アヒル細胞
    、キジ細胞、ガチョウ細胞、およびニワトリ細胞からなる群から選択されること
    を特徴とする請求項１２に記載の組換え鳥。
16. 【請求項１６】 前記鳥類臍がシチメンチョウ臍であることを特徴とする請
    求項１２に記載の組換え鳥。