JP2005507234A - 始原生殖細胞ベースの、鳥の生殖細胞系の作製 - Google Patents
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Abstract
本発明は、異種核酸を含む単離された鳥類性腺細胞（例えば、卵巣細胞または精巣細胞）、ならびに雛鳥胚由来の単離された性腺細胞の集団を核酸分子と接触させて、トランスフェクトされた性腺細胞を得ることおよびこのトランスフェクトされた性腺細胞を鳥類受精卵に移入することによる、この核酸分子を鳥類種のゲノムに導入する方法を特徴とする。本発明は、異種核酸を含む、単離された鳥類性腺細胞（例えば、卵巣細胞または精巣細胞）を特徴とする。この細胞は、好ましくは、胚細胞である。用語「鳥類」とは、任意の鳥類種をいい、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ウズラおよびキジが挙げられるが、これらに限定されない。
Description
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００１年２月１６日出願の米国仮出願番号６０／２６９，４４２（この全内容は、本明細書中で参考として援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、鳥類ゲノムを遺伝子操作する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
商業目的および研究目的のためにトランスジェニック動物を作製するための、より良好かつより効果的な方法を開発することに、多くの試みが向けられてきた。この分野における最近の発展は、精子媒介性の遺伝子導入について、細胞質内精子注射（ＩＣＳＩ）の使用を記載する（Ｐｅｒｒｙら、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：１１８０−１１８３）。いく人かの研究者らは、ドナー核質として体細胞を使用する、哺乳動物（例えば、ヒツジ（Ｗｉｌｍｕｔら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３）、ウシ（Ｃｉｂｅｌｌｉら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０：１２５６−１２５８）、マウス（Ｗａｋａｙａｍａら、１９９８ Ｎａｔｕｒｅ ３９４：３６９−３９４）およびヤギ（Ｂａｇｕｉｓｉら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：４５６−４６１））における核移入による、クローン化動物の作製を報告する。しかし、これらの技術は、なお開発の初期段階であり、そして鳥の独自に異なる生殖器官に適合することは困難であり得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、異種核酸を含む、単離された鳥類性腺細胞（例えば、卵巣細胞または精巣細胞）を特徴とする。この細胞は、好ましくは、胚細胞である。用語「鳥類」とは、任意の鳥類種をいい、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ウズラおよびキジが挙げられるが、これらに限定されない。
【０００５】
本発明はまた、鳥類種のゲノムに核酸分子を導入する方法を含み、この方法は、雛鳥胚に由来する単離された性腺細胞の集団をこの核酸分子と接触させて、トランスフェクトされた性腺細胞を得る工程、およびこのトランスフェクトされた性腺細胞を授精した鳥類の卵に移す工程による。この核酸分子は異種である（すなわち、この核酸分子は、性腺細胞が由来する品種または種とは異なる品種または種に由来する）。トランスフェクトされた性腺細胞が使用され、次いでこれを使用してトランスジェニック鳥を作製する。
【０００６】
単離された性腺細胞の集団は、少なくとも０．５％の始原生殖細胞（ＰＧＣ）、より好ましくは少なくとも１％の始原生殖細胞、そしてさらにより好ましくは少なくとも５０％の始原生殖細胞を含む。性腺ＰＧＣは、組織において性腺ＰＧＣと共に天然に存在する他の細胞（例えば、間質性腺細胞）から単離（すなわち、分離）される。好ましくは、この集団は、少なくとも８０％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、そして最も好ましくは９９〜１００％の性腺ＰＧＣである。このＰＧＣは、他の非ＰＧＣ細胞からの精製の前または後のいずれかに、異種ＤＮＡを用いてトランスフェクトされる。性腺鳥類ＰＧＣは、卵母細胞および精子細胞を生じ得る、雛鳥胚中に存在する細胞である。
【０００７】
性腺ＰＧＣが得られる雛鳥胚は、２７より上の胚ステージの発生中の雛鳥胚が好ましい（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ＆Ｈａｍｉｌｔｏｎ、１９５１ Ｊ Ｍｏｒｐｈｏｌ ８８：４９−９２）。例えば、この雛鳥胚は、２９〜３６の発生ステージの胚である。好ましくは、性腺ＰＧＣが得られる雛鳥胚は、回収の時点で、少なくとも６．５日、そしてより好ましくは７．５日（２９〜３６の発生ステージ）孵卵されている胚である。少なくとも６．５日であるが１５日未満の発生齢で雛鳥胚から得られた性腺ＰＧＣは、移動能力を保持する。例えば、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日の性腺ＰＧＣは、レシピエント卵に移され、そして移動能力を保持する。
【０００８】
トランスフェクトされたドナー性腺細胞は、レシピエント卵が得られた品種と比較して、同じかまたは異なる品種の鳥に由来する。同様に、トランスフェクトされたドナー性腺ＰＧＣは、授精したレシピエント鳥類卵が得られた種と比較して、同じかまたは異なる種から単離される。
【０００９】
授精したレシピエント鳥類卵は、ステージ７〜８の間の発生である。すなわち、このレシピエント卵は、少なくとも１２時間孵卵されている。あるいは、授精した鳥類卵は、ステージ１３〜１９の間の発生である。
【００１０】
孵卵されていない卵は、生まれたての卵または３７℃未満の温度で貯卵された卵を含む。例えば、孵卵されていない卵は、約６０°Ｆ、室温または低温（例えば、４℃）の保存温度で、産卵直後の時点から孵卵時間まで貯卵した卵を含む。孵卵は、卵が、発生を導く温度（例えば、３７〜３８℃、または鳥の品種もしくは種の要件に調整された温度）に曝される時間をいう。発生のステージは、経時的に決定されるか、または胚組織の状態（例えば、大きさおよび形態）の視覚的試験によって決定される。
【００１１】
異種配列の発現を調節するための好ましいプロモーターとしては、組織特異的プロモーター（例えば、ニワトリの卵管細胞における導入遺伝子の発現を指向するプロモーター）が挙げられる。卵管細胞における導入遺伝子発現は、卵の卵白における導入遺伝子産物の蓄積を導く。例えば、当該分野で公知のオボアルブミンプロモーターは、卵管細胞における発現を指向するために使用される。あるいは、プロモーターは、肝臓組織における導入遺伝子の発現を指向する。ビテロゲニンプロモーターは、（導入遺伝子によってコードされる）異種ポリペプチドの発現を肝臓に指向し、そして血流への分泌を指向するために使用される。例えば、ビトロゲニンプロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子配列は、疾患への耐性を付与する、抗体の重鎖または軽鎖をコードする。このような構築物の導入は、品種改良において有用である。血液、筋肉、羽毛または他の組織における発現を指向するプロモーターもまた使用される。組織特異的エンハンサーもまた、好ましい標的組織における発現を増強するために使用され得る。あるいは、組織特異的でないプロモーターが、全身的な発現を指向するために使用される。
【００１２】
導入遺伝子構築物は、１以上のプロモーターを含む。例えば、この構築物は、２つのプロモーターを含む。例えば、第一のプロモーターは、一過性のマーカー遺伝子（この遺伝子の発現は、形質転換されたＰＧＣの選択を可能にする）をコードする配列に作動可能に連結され、そして第二のプロモーターは、組織特異的な様式で導入遺伝子の発現を指向する。
【００１３】
好ましい導入遺伝子としては、インスリンおよび抗体分子またはそのフラグメントが挙げられる。例えば、この導入遺伝子は、インタクトなヘテロ二量体モノクローナル抗体、または免疫学的に活性な抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）２フラグメント、操作された単鎖Ｆｖ分子）、またはキメラ分子（例えば、１つの抗体（例えば、マウス起源）の結合特異性を含み、そして残りの部分は、他の抗体（例えば、ヒト起源）である）をコードする。導入遺伝子（例えば、抗体をコードする遺伝子、ヒトまたはブタのインスリン（または別の哺乳動物のインスリン）の遺伝子）は、オボアルブミンプロモーターに作動可能に連結されて、卵の卵白画分におけるインスリンの蓄積を可能にする。ヘテロ二量体抗体分子の産生について、卵管細胞において両方の鎖を発現するために、軽鎖をコードする配列は、オボアルブミンプロモーターに作動可能に連結され、そして重鎖配列は、オボアルブミンプロモーターに作動可能に連結される。次いで、導入遺伝子産物は、当該分野で公知の方法を使用して、この卵から精製される。抗体分子の発現は、好ましくは、（例えば、卵管細胞における発現のためにオボアルブミンプロモーターを使用して）卵の卵白画分における蓄積のために標的化される。
【００１４】
ドナーＰＧＣは、性別の異なる性腺から得られ、従って、性別によって分離される。ドナーＰＧＣストックは、レシピエント卵と性別が一致する。このようなストラテジーは、（トランスフェクトされたかまたはトランスフェクトされていない）ドナーＰＧＣの好ましい授精率および高い生殖細胞系発現を保証する。レシピエント卵の性別は、ホルモンにより制御される（例えば、卵にテストステロンを導入して、雄の雛鳥を作製するか、または卵にエストロゲンもしくは卵胞刺激ホルモンを導入して雌の雛鳥を作製することによる）。１つの種のトランスフェクトされていないＰＧＣを使用して、別の種の鳥を作製する。
【００１５】
遺伝子が破壊されているトランスジェニック（すなわち、「ノックアウト」トランスジェニック）鳥がまた、上記の方法を使用して作製される。ノックアウト鳥を作製するために、内因性遺伝子中の配列に相補的な配列を含む、ノックアウト構築物を作製する。導入遺伝子構築物中の配列は、標的配列との相同組換えを経て、遺伝子の破壊を生じる。遺伝子の破壊は、非機能的遺伝子産物の産生を導くか、または遺伝子産物をほとんど産生しないかもしくは全く産生しない。病理学的状態に関与する遺伝子は、この様式で破壊される。得られたノックアウトトランスジェニック鳥は、疾患状態のモデル動物として使用され得る。このようなノックアウトトランスジェニック鳥は、単離された鳥類性腺細胞（これは、内因性遺伝子の遺伝的破壊（例えば、機能的遺伝子産物の産生を阻害する破壊）を含む）を使用して作製される。
【００１６】
本発明は、異種ＰＧＣ（例えば、性腺ＰＧＣ）を含む鳥類卵を含む。異種によって、ＰＧＣおよび鳥類（レシピエント）卵の種が異なることを意味する。例えば、ニワトリ卵は、エミューまたはニワトリ以外の鳥類種由来のＰＧＣを含む。本発明はまた、別の品種のニワトリ由来の性腺ＰＧＣを含む、１つの品種のニワトリ卵を包含する。単離されたトランスジェニック性腺細胞（例えば、異種ＤＮＡでトランスフェクトされた性腺ＰＧＣ）を含む鳥類卵もまた、本発明の範囲内である。
【００１７】
性決定されたＰＧＣの単離された集団（例えば、雄の性腺ＰＧＣ集団または雌の性腺ＰＧＣ集団）もまた、本発明の範囲内である。好ましくは、雄の性腺ＰＧＣ集団は、２０％未満、好ましくは１０％未満、好ましくは５％未満、そしてより好ましくは１％未満の雌の性腺ＰＧＣを含む。同様に、雌の性腺ＰＧＣ集団は、２０％未満、好ましくは１０％未満、好ましくは５％未満、そしてより好ましくは１％未満の雄の性腺ＰＧＣを含む。
【００１８】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
鳥類性腺細胞を、遺伝学的に操作および使用して、鳥類ゲノムに異種核酸を導入する。この方法を使用して、品種の質を改善し、非鳥類疾患（例えば、ヒト疾患）の鳥類モデルを作成し、鳥類に対して疾患耐性を与え、そして薬学的用途および他の用途のための組換えタンパク質を生成する。ＤＮＡ移入を媒介するのに性腺細胞を使用することによって、「汎用レシピエント（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）」としてニワトリを使用して、絶滅の危機に瀕した種の保全のために、鳥類の異なる品種にわたっておよび鳥類の種の間で鳥類を繁殖させることが、可能となる。
【００２０】
単離された鳥類性腺ＰＧＣを使用して、鳥類種のトランスジェニック動物を繁殖させる。異種核酸をこのＰＧＣに導入して、安定な形質転換生殖細胞を生成する。
【００２１】
本明細書中に記載される方法は、全ての鳥類に適用可能であり、ニワトリ、シチメンチョウ、キジ、アヒルおよびガチョウのみに限定されない。この手順の全体の効率は、以下に依存する：細胞単離のタイミング、移入時間および移入部位、ドナーＰＧＣの事前の雌雄鑑別（ｓｅｘ ｐｒｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）、ならびにレシピエント生殖腺のドナーＰＧＣ集団を最大にするためのレシピエント胚の不妊手術。
【００２２】
標準的な遺伝子操作技術を使用して、トランスジェニック動物を繁殖させる。性腺ＰＧＣのトランスフェクションを数回行い、遺伝子移入効率を増加させ得る。ドナー細胞は、移入前または移入後に精製される。例えば、ＰＧＣは、インビトロでトランスフェクトされ、次いでレシピエントの卵に移入する前に精製される。トランスフェクトされた（またはトランスジェニック）性腺ＰＧＣを使用して、鳥類および卵における医薬品の製造のための、生殖系列のトランスジェニックニワトリを繁殖させる。
【００２３】
この導入遺伝子の配列または構造は、遺伝子移入の成功または有効性に影響を及ぼさない。この導入遺伝子の発現を調節するプロモーターは、良性または組織特異的である。トランスジェニックタンパク質またはトランスジェニックポリペプチドは、主に、卵管細胞における発現について標的化され、その結果、この遺伝子産物は、産卵（卵を産む）後に、卵から単離され得る。組織特異的な、プロモーターおよび／またはエンハンサーの使用は、他の組織（羽毛、皮膚、および筋肉を含む）における発現を可能にする。
【００２４】
さらに、この方法はまた、ニワトリにおいて他の鳥類種を繁殖させるためおよび絶滅の危機に瀕した鳥類種の保全のための、「汎用レシピエント」としてニワトリ／卵を使用して、他の鳥類種を繁殖させるためにも使用され得る。
【００２５】
（遺伝子改変された鳥類ＰＧＣの使用）
本明細書中に記載される細胞および方法は、ドナーＰＧＣから生殖系列鳥類を繁殖させるのに有用である。このドナーＰＧＣは、異種核酸でトランスフェクトされ、そして精製され（逆もまた同様）、その結果、トランスジェニックＰＧＣの単離された集団が、レシピエントの卵に移入される。トランスフェクトされたＰＧＣのさらなる濃縮が、マーカベースのセルソーターを使用して行われる。
【００２６】
農業的用途のために、ドナーＰＧＣは、鳥類の品質またはこの鳥類が生産する肉もしくは卵の品質を改良する導入遺伝子でトランスフェクトされる。例えば、疾患耐性またはグロースアドバンテージ（ｇｒｏｗｔｈ ａｄｖａｎｔａｇｅ）を与える、遺伝子をコードするＤＮＡを移入して、所望の市場的特徴を有する動物を繁殖させる。
【００２７】
治療的または薬学的なタンパク質またはポリペプチドは、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡで性腺ＰＧＣをトランスフェクトすることによって、ＰＧＣをレシピエントの卵に移入することによって、ならびに所望のポリペプチドを生成するための、生殖系列キメラ、およびその後のトランスジェニック鳥類の繁殖に適した条件下における卵の孵卵によって、生成され得る。治療的タンパク質は、卵の卵黄もしくは卵白における発現か、またはその鳥類の肉、羽毛、皮膚、血液および他の部分における発現について標的化される。次いで、所望のポリペプチドが、当該分野で公知の方法を使用して、組織または流体（例えば、卵の卵白）から単離される。
【００２８】
本発明はまた、レシピエントの品種とは異なる（しかし、依然として同じ種（例えば、ニワトリ）の範囲内である）鳥の品種を繁殖させるのに有用である。例えば、ドナーＰＧＣは、ロードアイランドレッド（Ｒｈｏｄｅ Ｉｓｌａｎｄ Ｒｅｄ）種から誘導され、ニワトリの別の品種（例えば、プリマスロック（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｒｏｃｋ））の卵に移入される。一般的なアメリカ産品種のニワトリとしては、プリマスロック、ドミニク（Ｄｏｍｉｎｉｑｕｅ）、ワイアンドット（Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ）、ロードアイランドレッド、ロードアイランドホワイト（Ｒｈｏｄｅ Ｉｓｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ）、バックアイ（Ｂｕｃｋｅｙｅ）、Ｃｈａｎｔｅｃｌｅｒ、ジャージージャイアント（Ｊｅｒｓｅｙ Ｇｉａｎｔ）、Ｌａｍｏｎａ、ニューハンプシャー（Ｎｅｗ Ｈａｍｐｈｉｒｅ）、およびデラウエア（Ｄｅｌａｗａｒｅ）が挙げられる。
【００２９】
（非トランスジェニック用途における、単離された鳥類性腺ＰＧＣの使用）
単離されているがトランスフェクトされていない性腺ＰＧＣを使用して、雑種の鳥類を繁殖させる。例えば、ウズラは、ニワトリによって作られる卵から産まれる。従って、本発明の方法は、絶滅の危機に瀕した種を保全するために雑種の鳥類を繁殖させるための、「汎用レシピエント」としてのニワトリまたは他の家禽の鳥類の使用を提供する。このような繁殖アプローチの利点は、ニワトリが非季節性の高生産家禽の鳥類であるので、絶滅の危機に瀕した鳥は、絶滅に瀕した種に関連する、季節的な制限も地理的な制限もなしに、確実に繁殖されることである。例えば、この方法を使用して、アラビア半島に生息する絶滅の危機に瀕したＨｏｕｂａｒｒａ Ｂｕｓｔａｒｄのような、希少性の鳥類または絶滅の危機に瀕する鳥を繁殖させる。他の絶滅の危機に瀕する鳥としては、キジ、ウズラ、オウムおよびコンゴインコが挙げられ、これらの全てが、ハンターおよび密猟者によって生息地を失い、開拓されて絶滅の危機に直面している。この方法は、特に、天然で季節により繁殖する鳥（例えば、キジまたはシチメンチョウ）または飼育においては繁殖しない鳥類を繁殖させるために有用である。アホウドリおよびウミツバメ（これらは、小さな大洋島で天然に繁殖する）はまた、性腺ＰＧＣをニワトリのレシピエントに移入することによって生殖され得る。クイナ、ツルおよびカグー（ｋａｇｕｓ）の多くの種もまた、高い危険性である。なぜなら、これらは、非常に繁殖の遅い動物であり、営巣地および越冬地帯の妨害に、非常に脆弱性であるからである。鳴禽（これは、全ての鳥類種の大半の６０％を占める）は、わずかに平均より低い絶滅の危険性を有するが、数種（アメリカの草原に生息する鳥を含む）は、深刻に減少している。しかしながら、この方法は、他の任意の鳥類種（すなわち、ニワトリの卵ではない卵をレシピエントとして使用して、鳥類の種間の繁殖を可能にする）に適用可能である。性腺の雌雄の差が生じる発育期は、各鳥類種の目視による観察によって決定される。
【００３０】
（実施例１：ドナーＰＧＣ）
新たに産卵された（または孵卵されていない）受精卵を、卵の発育を導く３７〜３８℃または室温にて、１０日間まで、加湿孵卵機内で孵卵する。種々の種の鳥に必要とされる卵の孵卵を、表１に示す。
【００３１】
（表１：鳥類種に必要とされる卵の孵卵）
【００３２】
【表１】
６〜１０日の間に、性腺を卵から収集した（ステージ２９〜３６、Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ ＆ Ｈａｍｉｌｔｏｎ，１９５１ Ｊ Ｍｏｒｐｈｏｌ ８８：４９〜９２）。あるいは、この性腺を、７〜８日の間に収集した（ステージ３１〜３４）。このデータは、孵卵の７日後から、雌雄の間の形態学的差異が同定可能であり、雌雄の選択が可能になることを示している（雌は、より大きい左性腺を有し、一方雄は、類似の大きさの性腺対を有する）。鳥類の胚は、雌雄の差異に対して、神経栄養シグナルを受け、かつ卵巣の発育と精巣の発育との間に差異を示す。ＰＧＣは、移動能力を維持し、そして化学誘引物質因子（この因子は、例えば、レシピエントの卵の中で発育中の胚の性腺への、ＰＧＣの移動を可能にする）に対する応答性を維持する。この性腺を、雌雄によって集団化し、そして標準的なトリプシン処理手順によって分散し、そしてそれらが付着するまで、組織培養プレート中で培養した。雌雄の選択は、レシピエント卵にこの細胞を移入する前に、性腺ＰＧＣを収集時点で実施される。
【００３３】
このＰＧＣは、他の性腺間質細胞と共にトランスフェクトされ得るか、またはフィコール密度勾配を使用してトランスフェクションの前に単離され得る（Ｙａｓｕｄａら、１９９２，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．９６：５２１−５２８）。さらなる精製は、単離された細胞の短期培養（１５〜３０分）によって達成される。この性腺間質細胞は、ＰＧＣよりも迅速にプラスチック（例えば、組織培養プレート）に付着し、従って、約９０％以上までの性腺ＰＧＣの精製を可能にする。この性腺ＰＧＣを、脂質（１〜２μｇ／ｍｌのＤＮＡ）を使用して３〜４時間トランスフェクトするか、または２０〜５０ｍｇ／ｍｌのＤＮＡを用いて２５０ボルトおよび７５０〜９５０マイクロファラッドの間でのエレクトロポレーションによってトランスフェクトする。あるいは、このＰＧＣを、リン酸カルシウムおよび核酸配列を導入するための当該分野で公知の他の方法を使用してトランスフェクトする。必要に応じて、これらの細胞を、トランスフェクションの割合を増加するために、１回より多くトランスフェクトする。ＰＧＣを必要に応じて、遊走能力の損失もなくかつ分化することなく、４日までの短期間インビトロで培養し、数回のトランスフェクション反復および選択を可能にする。短期間培養の後、このＰＧＣを、標準的な方法を使用して、間質細胞から分離する。トランスフェクトされたＰＧＣを、例えば、導入遺伝子構築物が抗生物質耐性をコードするマーカーを有する場合、抗生物質選択によってさらに単離する。他の細胞精製方法としては、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）単離または磁気細胞選別が挙げられる。これらの方法は、ＰＧＣの単離された導入遺伝子集団を生じ、この集団を、次いで、レシピエント卵に移す。
【００３４】
ドナー性腺ＰＧＣは、レシピエント卵由来の同じ品種のトリまたは異なる品種のトリに由来する。後者の場合、ドナーＰＧＣ産生生殖細胞系雛鳥の同定は、この品種の顕著な特徴（例えば、色）の差異によって容易になる。
【００３５】
（実施例２：レシピエント卵）
産みたての受精卵を、レシピエント卵として使用する。レシピエント卵を、産卵の直後もしくは産卵後すぐに孵卵するか、または産卵後だが移す前に冷却保存（孵卵しない）する。孵卵を、胚のさらなる発生を導く暖温（例えば、３７〜３８℃）にこの卵を曝露して始める。「０時間」の卵は、産まれているがまだ孵卵されていない卵である。同様に、「１２時間」の卵は、１２時間孵卵された卵であり、以下同様である。レシピエント用の受精卵を、孵卵の開始から１２時間目、２４時間目、４８時間目およびさらに９６時間目で使用する。
【００３６】
レシピエント卵の発生ステージを、暦年齢もしくは孵卵後の時間によって（例えば、ＨａｍｂｕｒｇｅｒおよびＨａｍｉｌｔｏｎ，１９５１ Ｊ Ｍｏｒｐｈｏｌ ８８：４９−９２を参照のこと）、または胚組織の発生ステージの目視検査によって決定する。ＰＧＣを、２〜２０マイクロリットルの容量で、レシピエント卵に移す。約５０〜１０００のＰＧＣを移す。例えば、ＰＧＣを、約５０〜４００細胞／マイクロリットルの細胞密度で移す。移動部位は、卵の発生ステージに依存する。孵卵の０〜１２時間目において、この移動部位は、胚葉盤または胞胚腔になる。ドナーＰＧＣが移される容量は、一般に、５マイクロリットル未満の培地である。２４時間目において（ステージ７〜８、ＨａｍｂｕｒｇｅｒおよびＨａｍｉｌｔｏｎ、１９５１ Ｊ Ｍｏｒｐｈｏｌ ８８：４９−９２）、この部位は、発生中の雛鳥に物理的に影響を与えないように、中心から外れる（明域と暗域との間の縁部）。４８時間目（ステージ１１〜１３）において、移動部位は、ＰＧＣが血管構造への侵入および性腺への移動の前に通常集合する胚頂部領域においてかまたはこの胚頂部領域付近に存在する。あるいは、ＰＧＣを、孵卵から約５０〜６０時間またはステージ１３〜１７で血管構造に直接注入する（Ｙａｓｕｄａら、１９９２ Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ ａｎｄ Ｆｅｒｔ ９６：５２１−５２８，Ｎａｉｔｏら、１９９８，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ ａｎｄ Ｆｅｒｔ １１３：１３７−１４３）。
【００３７】
例えば、ＰＧＣを、卵の６〜１２時間の短期孵卵後に胞胚腔が形成された発生ステージ７〜１２のレシピエント卵に移す。この場合において、ＰＧＣを、胞胚腔に注入する。このレシピエント卵が発生ステージ１３〜１６の間（２４〜２８時間の孵卵時間）にある場合、ＰＧＣを、透明部と混濁部との間の領域に移す。このレシピエント細胞が、３６〜４８時間の孵卵に対応する発生ステージにある場合、ＰＧＣを、胚頂部領域に直接注入し、ここでは内因性ＰＧＣは通常、雛鳥血管構造に侵入する前に集まる。レシピエント卵が、５０〜７２時間に対応する発生ステージ（ステージ１６〜１９）にある場合、ＰＧＣを、血管構造（例えば、血管）に直接移す。
【００３８】
ドナーＰＧＣの生殖細胞系伝播速度を増加するために、内因性ＰＧＣを、血流から物理的に除去する（Ｎａｉｔｏら、１９９８，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ ａｎｄ Ｆｅｒｔ １１３）。あるいは、この卵を、孵卵の０〜２４時間の間に照射して、内因性ＰＧＣを排除する（Ｃａｒｓｉｅｎｃｅら，１９９３，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１７：６６９−６７５）。ブスルファンを使用する化学的不妊もまた、内因性ＰＧＣを排除するために有効である（Ａｉｇｅ−ＧｉｌおよびＳｉｍｋｉｓｓ １９９１，Ｒｅｓｅｒｃｈ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｗｓｃｉｅｎｃｅ ５０：１３９−１４４；Ｖｉｃｋら、１９９３，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ ａｎｄ Ｆｅｒｔ ９８：６３７−６４１）。孵卵後２０〜２４時間の間に卵黄に注入した、ジメチルホルムアミド（２０〜５０マイクロリットル）またはジメチルホルムアミド中に溶解し、そしてキャリアとしてのゴマ油と混合したブスルファン（１００ｍｇ／ｍｌ）の組み合わせ（５０マイクロリットルの胡麻油中卵あたり７５〜１００μｇのブスルファン）もまた、内因性ＰＧＣの殺傷に有効である。あるいは、１０〜２０マイクロリットルの培地中の５０μｇのブスルファンを、胚頂部領域（ここで、ＰＧＣは、血管構造への侵入の前に蓄積する）に注入する。不妊の２４時間後、ドナーＰＧＣを、孵卵の４８時間において、胚頂部領域に移すか、または後に（５５〜７２時間の間）血管構造に移す。
【００３９】
移した後、この卵を、加湿孵卵器中３７〜３８℃で孵卵して、雛が産まれるまで加湿孵卵器で３７〜３８℃で孵卵し、そして性的に成熟するまで成長させる。トリの品種がドナーとレシピエントの間で異なる場合、得られるトリ（異種ＤＮＡを含む）を、ドナーＰＧＣが由来する品種と同じ品種と交配する。このアプローチにより、（サイズ、色などのような顕著な特徴に基づいて）内因性ＰＧＣ由来のトリをドナーＰＧＣ由来のトリと区別し得る。
【００４０】
（実施例３：性腺ＰＧＣを使用する改善された鳥類導入遺伝子）
導入された異種核酸配列の生殖細胞系伝播について、（ｉ）胚分化の前の発生ステージを標的化するか、または（ｉｉ）生殖細胞集団への組込み現象を標的化することによって、分化後の遺伝子操作を指向する、２つのシナリオが存在する。後者のアプローチを使用して、始原状態にある生殖細胞の移入から誘導された高割合の生殖細胞系伝播で生殖系キメラ親ストックを生成するための手順を設計した。この鳥類アプローチは、生物薬学産業に、他の導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）系と比較して、大きなスケールの生産能力のためにより効果的なプラットフォームを与える。
【００４１】
性腺ＰＧＣを、卵形成の間にトランスジェニックニワトリにおける発現のために設計された遺伝子構築物の生殖細胞系伝播について標的化する。培養ＰＧＣのトランスフェクションを、インビトロで標的化し、続いて、発生中の雛鳥胚中の標的領域に移した。
【００４２】
以下の材料および試薬を、記載される方法において使用した：孵卵器、ＣＯ２孵卵器、ステレオミクロスコープ（１〜５×）、複合顕微鏡（１０×、２０×）、遠心機、ピペットホルダーを備えるカリパー制御インジェクターシステム、マイクロマニピュレーターシステム、２＃５ウオッチメイカーの鉗子、調節可能ピペット（１０、２００、１０００マイクロリットル）、卵殻カッター（すなわち、Ｄｒｅｍｅｌ Ｍｕｌｔｉｐｒｏ Ｋｉｔ ＃３９５６）、ペトリ皿（３５、１００ｍｍ）、４ウェルＮｕｎｃｌｏｎプレート、微小遠心管（１．５ｍｌ）、パラフィルム（１インチ幅）、ブスルファン（Ｓｉｇｍａ）、ゴマ油（Ｓｉｇｍａ）、ジメチルホルムアミド（Ｓｉｇｍａ）、リン酸緩衝生理食塩水、ＤＭＥＭハイグルコース（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、トリプシン／ＥＤＴＡ、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、フィコール（Ｓｉｇｍａ）、ウシ胎仔血清、ニワトリ血清、増殖因子（ＩＧＦ−１、ｂＦＧＦ，ｍＬＩＦ、ＳＣＦ）、抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン）、受精したＳＰＦ卵（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。
【００４３】
（ドナー始原生殖細胞の調製）
性腺を以下のように単離した。新鮮な産みたてのニワトリの受精卵を、３７〜３８℃、８５〜８８％の間の相対湿度で、加湿卵孵卵器中で８日までの間、孵卵した。性腺を、４〜８日の間（ステージ２９〜３６）の発生中の雛鳥胚から収集した。好ましくは、性腺を、７〜８日の間（ステージ３１〜３６）で収集し、それにより、レシピエント雛鳥に戻される場合に遊走能の最小損失を伴って回収されるＰＧＣの数を最大にする。胚の腹腔から中腎領域を除去し、そして低出力で先の細い鉗子を使用して中腎由来の性腺を解剖することによって、性腺を回収する。孵卵の７〜７．５日目において、分化中の雌性腺と雄性腺との間の発生の差異を同定して、性別の選択が可能になり得る。発生中の雌性腺の対は、右性腺の萎縮および生殖細胞の差次的コロニー形成パターンから左性腺の拡大を示す。分化中の雄性腺のサイズは類似しており、そして雌性腺とは異なる。この性腺は、雄性腺と雌性腺との間のより顕著な差異を伴って、発生の後期ステージにおいて単離され得るが、単離されたＰＧＣが遊走する能力は、レシピエント雛鳥胚に移された場合に減少する。
【００４４】
ドナーＰＧＣは、レシピエント卵と同じ品種のトリまたはレシピエント卵とは異なる品種のトリ由来であり得る。後者の場合、ドナーＰＧＣ産生生殖細胞系雛鳥の同定は、品種の顕著な特徴における差異（例えば、羽毛の色、サイズおよび皮膚の色素沈着）によって容易になる。ＰＧＣの供給源が、レシピエント雛鳥胚とは異なる羽毛の色を表現型として発現することが好ましい。このことは、移されたＰＧＣ由来の雛鳥のより容易な選択を容易にする。
【００４５】
（生殖細胞の単離および培養）
単離された性腺を、性別に分類し、そして標準的なトリプシン処理手順によって分散させた。ＰＧＣを、性腺間質細胞と比較して大きいサイズ（１２〜２０ミクロン）によって識別し得た。明視野の顕微鏡下で、ＰＧＣは、その細胞質全体にわたって多数の脂質液滴を含み、大きな核が、離心性の位置を占めた。ニワトリＰＧＣは、高いグリコーゲン含量を有し、従って、過ヨウ素酸Ｓｃｈｉｆｆ染色によって同定可能である。ＰＧＣは、性腺間質細胞と共に共培養し得たか、４日間までの間５％ ＣＯ２を含む加湿孵卵機中で３７℃にてプレート上で培養する前に分離させ得た。いくつかの場合、長期培養によって自発的な分化、移動能力の損失および生殖細胞能力の低下を生じ得る。ＰＧＣを、高グルコース含量を有し、かつ１０％ ＦＢＳ、５％ニワトリ血清および増殖因子（塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン増殖因子−１、および幹細胞因子を１０ηｇ／ｍｌ、ならびにマウス白血病阻害因子を１０単位／ｍｌ）を補充したＤＭＥＭ中で培養し、その生殖細胞状態を維持した。ＰＧＣを、フィコール密度勾配を用いて性腺間質細胞から分離した。勾配については、１．５ｍｌの遠心管を、ＰＧＣ培地中の１６％フィコールおよび７％フィコールの各０．５ｍｌで連続的に層にし、そして０．２ｍｌの性腺細胞懸濁液で覆った。この勾配を、８００×ｇで３０分間遠心分離した。１６％勾配と７％勾配との間に位置するＰＧＣに富む画分を吸引し、ＰＧＣ培地で洗浄し、そして５００×ｇ、５分間でペレットにした。さらなる精製を、その単離された細胞の短期培養（１５〜３０分）によって達成し、ＰＧＣを懸濁液中に維持しながら、性腺間質細胞の組織培養プレートへの差次的な接着を可能にした。
【００４６】
（トランスジェニックＰＧＣの形質転換および選択）
ＰＧＣを、２０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌのＤＮＡを用いて、３〜４時間脂質（すなわち、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、供給業者の指示書に従う）を用いてか、または２００〜２５０ボルトおよび７５０マイクロファラド〜９５０マイクロファラドの間のマイクロファラドのエレクトロポレーションによって、トランスフェクトした。
【００４７】
２つの試験導入遺伝子をトランスフェクトした。これらの方法を用いて、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下にあるβガラクトシダーゼを試験導入遺伝子として使用して、ドナーＰＧＣの性腺集落形成パターンを追跡した。さらに、ヒトラクトフェリンプロモーター配列を使用した。中腎−性腺領域中に試験導入遺伝子のβガラクトシダーゼの発現を示すレシピエントの雛鳥胚を、１０日間の孵卵で回収した。ドナーＰＧＣを、卵の孵卵前に直接的な胚葉盤の注射を用いてインビボでトランスフェクトするか、または脂質を用いてインビトロでトランスフェクトした。ＰＧＣを、７５μｇのブスルファンを用いてＰＧＣ移入の２４時間前に部分的に不妊した、４８時間孵卵した卵の胚頂部領域に移入させた。
【００４８】
これらの方法を用いて、中腎−性腺領域中に試験導入遺伝子のβガラクトシダーゼの発現を示すレシピエントの雛鳥胚を、１０日間の孵卵で回収した（図４）。ドナーＰＧＣを、インビトロで脂質を用いてトランスフェクトし、７５μｇのブスルファンを用いてＰＧＣ移入の２４時間前に部分的に不妊、４８時間孵卵した卵の胚頂部領域に移入させた。βガラクトシダーゼ発現は、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下にあった。
【００４９】
上記の方法を用いて、１０〜２０％の範囲の初期トランスフェクション率を得た。複数回のトランスフェクションおよび複数回の選択の組み合わせを、トランスフェクション率を上昇するために必要に応じて取り入れる。トランスフェクトしたＰＧＣを分離し、そしてその導入遺伝子構築物が抗生物質耐性をコードするマーカーを保有する場合、抗生物質選択によって精製した。蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）（蛍光マーカーが選択のために使用される場合）を含む他の細胞精製の方法を、使用し得る。
【００５０】
（レシピエントの調製）
産卵後７日までの受精可能な卵を、レシピエント卵として使用した。孵卵前および孵卵７２時間まで（ステージ１９まで）のレシピエント卵を、ＰＧＣレシピエントとして利用した。この期間は、ＰＧＣが活発に移動するヒヨコ発生段階、および始原性腺中に局在する期間までを含む。１００〜２００／μｌの濃度のＰＧＣを、マイクロメータープランジャの制御下でハミルトンシリンジに連結したガラスマイクロピペット（２５〜４０ミクロン）を用いて注射した。培養培地中に懸濁した５μｌ容量のＰＧＣを、注射した。ＰＧＣを、以下のように、雛鳥胚の発生段階に依存して異なる標的化領域に移入し得る：（ａ）受精可能な孵卵していない卵の胚盤葉板の胚芽下腔へ、（ｂ）６〜１２時間孵卵した発生胚の原外胚葉と内胚芽とを分離する胞胚腔へ（ステージ３〜４）、（ｃ）２４〜２８時間孵卵した発生胚に隣接する透明な領域（ａｒｅａ ｐｅｌｌｕｃｉｄａ）（ステージ７〜８）、（ｄ）４０〜４８時間の間孵卵した発生雛鳥胚の頭突起の先端の胚頂部領域へ（ステージ１１〜１３）、（ｅ）培地中の２〜３μｌの４００〜６００ＰＧＣを、マイクロマニピュレーターに連結したガラスマイクロピペット（外径４０ミクロン）を用いて、５５〜７２時間の孵卵で脈管構造に注射する（ステージ１４〜１９）。好ましくは、ＰＧＣを、背側大動脈に注射するが、より大きな周縁静脈および周縁動脈を、注射部位として使用し得る。この段階で、ＰＧＣは、通常、性腺原基に移動する前に脈管系内で循環する。
【００５１】
ドナーＰＧＣの生殖細胞系伝達の速度を上げるために、循環している内因性ＰＧＣを、ＰＧＣが脈管構造内にあるときに血液を吸引することによって血流から物理的に取り出し、ゆえに部分的な不妊を可能にするか、または卵を０〜２４時間の孵卵の間照射して内因性ＰＧＣを排除する。ブスルファンを用いた化学的な不妊もまた、使用し得る。ブスルファンをジメチルホルムアミド中に溶解し、そして５０μｌのゴマ油中の７５μｇを、孵卵開始の２０〜２４時間後にレシピエント卵の黄身に注射して、内因性ＰＧＣの関与を低下させる。不妊の２４時間後、孵卵開始から４８時間でドナーＰＧＣを胚頂部領域に移すか、または孵卵開始から５５〜７２時間で脈管構造に移した。移入させた後、卵を、孵化するまで加湿孵卵機中で３７〜３８℃で孵卵した。
【００５２】
（トランスジェニック生殖細胞系キメラ胚の作製）
中腎−性腺領域中に試験導入遺伝子のβガラクトシダーゼの発現を示すレシピエントの雛鳥胚を、１０日間の孵卵で回収した。１４日のレシピエント胚から単離した性腺からのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の結果は、ドナーＰＧＣを単離し、次いでインビトロでトランスフェクトした場合、ヒトラクトフェリンプロモーター配列の介入について強力なポジティブシグナルを示した。弱いポジティブシグナルを、ドナーＰＧＣをインビボでトランスフェクトした場合のレシピエントの性腺から得た。
【００５３】
（ドナーＰＧＣからのヒヨコの作製）
鳥類の血統がドナーＰＧＣとレシピエント胚との間で異なる場合、得られる生殖細胞系キメラ鳥類を、ドナーＰＧＣが由来する品種と同じ品種と交配させる。このアプローチは、内因性ＰＧＣが由来する鳥類をドナーＰＧＣが由来する鳥類と識別することを可能にする。特定の血統に特徴があり得る表現型特徴（例えば、羽の色）を識別することは、ドナーＰＧＣに由来するヒヨコの簡単な同定を可能にする。例えば、ヒヨコの羽の色の同定は、それらがドナー由来のＰＧＣから産生されたか（黒い羽）または内因性ＰＧＣから産生されたか（白い羽）を示す。性別に関連する性質を加えることは、雌性からの雄性（例えば、頭部の白い斑点）の選択をさらに可能にする。
【００５４】
図４は、試験導入遺伝子のβガラクトシダーゼの発現を示す。表２は、第２の導入遺伝子であるヒトラクトフェリンのＰＧＣ媒介移入の結果を示す。ＰＧＣのトランスフェクションを、上記のようにインビトロで実行するか、または孵卵の０日目にインビボで実行した（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／５８７，１２８；本明細書中に参考として援用される）。インビボトランスフェクションを、孵卵の日に第１の卵の胚盤中に直接ＤＮＡを導入することによって実行した。次いで、この卵を、７．５日孵卵し、そしてＰＧＣを取り除き、培養し、そして第２（レシピエント）卵に移す。ＰＧＣを、培養物中で導入遺伝子ＤＮＡを用いて再度トランスフェクトし得る。次いで、トランスフェクトしたＰＧＣを、レシピエント卵の胚頂部領域（ＧＣＲ）に移した。このレシピエント卵を孵卵し、１４日目の雛鳥胚組織を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって導入遺伝子の存在について試験した。
【００５５】
（表２：１４日のヒヨコにおけるヒトラクトフェリンＤＮＡの検出）
【００５６】
【表２】
（鳥類系の利点）
鳥類系は、卵のアルブミン画分もしくは黄身画分での遺伝子産物の発現、またはトリの他の組織での遺伝子産物の発現を可能にする。鳥類種（特に、ニワトリ）は、標的産生系として現在利用可能な家畜種の全てではないがほとんどのものよりも、固有の利点を提供する。この生殖能力および短い発生（ｇｅｓｔａｔｉｏｎ）時間は、トランスジェニック産生のために現在利用される他の種と比較して、潜在的に有利である。
【００５７】
本明細書中に記載される方法は、ニワトリに対して標的化された生殖技術を補助する代替物を提供し、ここで、遺伝子改変は、生殖細胞集団に対して直接的に標的化される。このアプローチを使用して、鳥類の生殖細胞系における外来遺伝子介入のための方法は、安定な介入事象の頻度を改善する技術を介して促進される。これらとしては、標的化された発現のための効率的なベクターおよびプロモーターを有する適切な核酸配列の構築、およびレシピエントニワトリ胚に移入する前に安定な成分を同定および単離する方法と組合わせた、生殖細胞の複数回のインビトロトランスフェクションによる遺伝子送達効率の改善を含む。
【００５８】
この方法は、部分不妊後にドナーＰＧＣまたは内因性ＰＧＣ由来の雛鳥を産生し、そして雛鳥間で区別するための系を提供する。この技術は、２５〜７８％の範囲にわたる高い比率の生殖細胞系列伝達を伴ってドナーＰＧＣ由来のトリを産生し、この場合、産生された雛鳥のうち平均してほとんど半分（４９％）が、ドナー由来であった。視覚的マーカーとして、羽の色を組み込むことは、内因性雛鳥からドナーを同定して区別するための機構をさらに提供し、産生系を単純化する。さらに、この手順は、育種後に産生される全ての雛鳥に対してＤＮＡ分析を行う必要性を排除する。これにより、時間と資材が抑えられ、それにより生殖細胞系列トランスジェニックニワトリを産生する費用を低減する。さらに、特定の羽着色が性関連形質に付随する場合、その雛鳥は、潜在的な２つの性に基づき、産生効率を最大にするために、容易に性別を同定され、分離され、そして成長させられる。例えば、所望の形質または遺伝子産物が、発現について特異的に、卵産生に対して標的化される場合、性関連の羽形質は、雛鳥が数日齢の場合に、産生鳥の早期選択および不要な雛鳥の排除を可能にする。さらに、発現プロフィールは、孵化の１月以内に個々の雌性トリから確立され、実際的な産生予測を提供する。上記の因子の全てが、管理効率の増加を促進し、これは、本質的に低い産生費用の動物に対する全体の産生費用の低減と同等である。
【００５９】
（実施例４：遺伝子導入（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ）および保存のための鳥類ＰＧＣ）
ＰＧＣは、精子および卵原細胞の前駆細胞である。鳥類種において、ＰＧＣは、起源が胚外であり、移動は、受動ステージへと続く胚半月（ｇｅｒｍｉｎａｌ ｃｒｅｓｃｅｎｔ）領域への能動移動の組合せであり、この受動ステージにおいて、ＰＧＣは、脈管系において一時的に循環し、性腺原基へ能動移動し、ＰＧＣ増殖および性腺性分化を生じる。
【００６０】
ニワトリにおいて、性分化は、胚発生から７〜９日目の間に形態学的に明らかとなる。他の鳥類種の性分化点は、性腺の視覚検査により決定される。ニワトリにおける性腺発生のこのステージは：ａ）回収されるＰＧＣの数を最大化するため、ｂ）性腺性発生における形態学的差異が明白であるこのステージにおいて、移動能力（ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｃａｐａｃｉｔｙ）をＰＧＣがまだ保持しているか否かを決定するため、ｃ）生殖細胞系列伝達における品種優性の効果を決定するため、そしてｄ）ＰＧＣドナー由来のニワトリの生殖細胞系列伝達における反対の性への移行の効果を研究するために標的化される。この手順のフローチャートは、図１に示される。６．５〜８．５日目の胚からの性腺を、単離し、そして形態学的に性別により分離した。ＰＧＣを、標準のトリプシン処理（ｔｒｉｐｓｉｎｉｚａｔｉｏｎ）手順および機械的破壊により単離した。ＰＧＣを、その性腺間質細胞と共に、３７℃で５％ＣＯ２中にて２日間、１０％ＦＢＳ、抗生物質および増殖因子（ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、１０ηｇ／ｍｌのＳＣＦ、および１０Ｕ／ｍｌのｍＬＩＦ）を補充した５％ニワトリ血清の存在下で高グルコースＤＭＥＭ中で共培養した。このＰＧＣを、１．５ｍｌの遠心分離チューブ中で、連続して、０．５ｍｌずつの１６％および７％のフィコールを重層して、０．２ｍｌの細胞懸濁液を上に載せたフィコール勾配を使用して、そして３０分間８００×ｇで回転させて単離した。生殖細胞系列キメラを作製するために、約２０００のＰＧＣを、４４〜４８時間で透明部内に移し、そしてレシピエント卵の胚半月部領域を、７５μｇのブスルファンで２４時間インキュベーションで処理した。ドナーＰＧＣ由来の雛鳥を、ＰＧＣドナーとして使用された品種と胚レシピエントとの間の羽の色の差異により区別した。
【００６１】
ドナー由来の雛鳥の生殖細胞系列伝達は、親ストックが一緒に育種された場合に平均伝達率４９％（９７／１９８）で、実験群の間で３１〜７８％の範囲に及んだ。このうち、９２％の雛鳥は、交雑しており、８％が純粋なドナー由来の雛鳥であった。ＰＧＣが白色レグホーン胚に由来し、そして着色した品種に移入される場合、生殖細胞系列伝達率は、４７％であり、比較として、ロードアイランドレッドまたは横斑プリマスロックのいずれか由来のドナーＰＧＣが白色レグホーン胚に移入される場合は１７％であった。レシピエントが反対の性別（７％）と比較して同じ性別のＰＧＣ（４０％）を受容した場合には、より高い比率の伝達もあった。
【００６２】
安定な組込み体の効率的選択と組み合わせて、異種核酸配列をＰＧＣに導入する能力を組み込むことにより、生物薬剤の産生のための基本的な技術が提供される。さらに、この生殖技術は、品種の産生を改善するため、疾患抵抗性を付与するため、そして鳥類農業における生産効率を増大するために有用である。さらに、ＰＧＣ移入は、鳥類保存プログラムに有用である。保存目的のために、ニワトリ（季節に関係なく高度な生産性の鳥）は、「汎用レシピエント」として使用され、１年中、保存のための魅力的な繁殖プログラムを増強する代替のシステムを提供する。
【００６３】
哺乳動物ＰＧＣと異なり、鳥類ＰＧＣは、起源が胚外である。ニワトリにおける産卵時において、産卵された受精卵の胚葉板を含む４万〜６万個の細胞内に、概算で約５０のＰＧＣが存在する。それらの移動パターンは、能動移動期と受動移動期の組合せを含む遠回りの経路に従う。最初の２４時間の孵卵の間、胚葉板の透明部における約５００個の細胞は、発生胚の後部端を樹立するために集まる。この集合から、集合領域に対して反対の（ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）方向で前方端に向かって原始線条が発達する。またこの時点で、ＰＧＣは、発生する胚から独立して、能動的に、この集中から離れて前方端に向かって移動し、そして孵卵から約２〜２．５日で脈管に入る前に、頭褶上の胚半月部領域に集まる。その後、ＰＧＣは生殖隆起に達するまで循環系内を受動的に移動し、この生殖隆起にて脈管系を離れ、そして能動的に移動して発生する性腺に転移増殖（ｃｏｌｏｎｉｚｅ）する。
【００６４】
その移動期の間または性腺原基の転移増殖後に空間−時間的局在化に基づいて、インビボでのトランスジェニック操作のためにＰＧＣを直接標的化するいくつかの方法が記載されている。いくつかのアプローチは、脂質でカプセル化した異種核酸配列を、受動的移動期の間に胚半月部領域または胚の脈管系中に直接注入することを包含する。あるいは、この胚半月部領域、脈管系、および性分化の前の性腺からＰＧＣを回収する方法もまた開発されている。本明細書中に記載される方法は、性腺ＰＧＣを、以前に記載したプロトコルと比較して、より胚発生後期でかつ性分化後に直接標的化することを包含する。本明細書中に記載される結果は、驚くべきものである。なぜなら、哺乳動物における知見と同様に、より以前の報告は、ＰＧＣが、性腺局在化の直後にその移動能を失うということを示していたからである。このデータは、精製されて性選択されたＰＧＣが、レシピエント卵の胚半月部領域への移入後に移動することを示していた。胚発生後期におけるＰＧＣが、特に性の遺伝的分化が確立された後に移動能力をなお保持していることは期待できない。
【００６５】
操作を、ニワトリにおける胚発生の特定のステージにおいて標的化し、ここで雄性腺と雌性腺との間の初期の形態学的差異が明白になった。この研究は、（ａ）ＰＧＣが性腺性分化のこのステージにおいて移動能をなお保持するか否かを決定するように；（ｂ）移動能の損失なしに回収され得るＰＧＣの数を最大にするように、（ｃ）ドナーＰＧＣがレシピエント胚の品種と異なる場合に、異なる品種が、生殖細胞系列伝達に対して品種優性を示すか否かを決定するように；そして（ｄ）ＰＧＣを同様の性別または反対の性別のレシピエントに移入することが、生殖細胞系列伝達の比率に影響を及ぼすか否かを決定するように設計される。
【００６６】
（ドナー原基生殖細胞の調製）
ロードアイランドレッド、横斑プリマスロックおよび白色レグホーン由来のニワトリ受精卵を、加湿孵卵機で３７〜３８℃にて、そして８５〜８８％の相対湿度で８日まで孵卵した。性腺を、生殖隆起から中腎を採取し、そして低出力倍率下で微小先端鉗子を使用してその中腎から性腺を切り出すことにより単離した。７〜７．５日の孵卵の間に、雌において発生している性腺は、右に比べてわずかに大きい左の性腺を示す。一方、分化している雄性性腺は、同様のサイズであり、２つの性間の形態学的識別を提供する。
【００６７】
性腺を、品種（白色種または着色種）に基づいて、そして性別によりグループ分けし、そして標準のトリプシン処理手順により分散させた。ＰＧＣを、性腺間質細胞と、組織培養プレートにおいて３７℃にて５％ＣＯ２加湿孵卵機中で４日間まで共培養した。ＰＧＣを、上記の実施例３に記載されるようにＤＭＥＭ中で培養した。
【００６８】
ＰＧＣ（他の性腺間質細胞と比較して大きい（１４〜２０ミクロン））を、上記の実施例３に記載されるように、フィコール密度勾配を使用して分離した。
【００６９】
（過ヨウ素酸−Ｓｃｈｉｆｆ染色）
性腺細胞を、４ウェルプレートで培養して、３．７％ホルムアルデヒドで１５分間固定し、そしてＰＢＳで２回洗浄した。ニワトリＰＧＣは、高レベルのグリコゲンを示し、そして過ヨウ素酸−Ｓｃｈｉｆｆ染色を使用して容易に同定される。キットとして供給される過ヨウ素酸−Ｓｃｈｉｆｆ染色システム（Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、残余の性腺を含む間質細胞からＰＧＣを区別する。
【００７０】
（レシピエントの調製）
ＰＧＣ採取の日に、白色レグホーンまたはロードアイランドレッド由来の受精卵を、レシピエントとして機能させるために孵卵した。内因性ＰＧＣの含有を減らすために、化学的不妊剤ブスルファンを、必要に応じて使用して、そのレシピエントを部分的に不妊する。ブスルファンをジメチルホルムアミドに溶解し、孵卵の開始２４時間後に、５０μｌのゴマ油中の７５μｇのブスルファンを、レシピエント卵の卵黄中に注入した。不妊後２４〜３０時間の間に、ドナーＰＧＣを、発生しているレシピエント胚の頭部突起に対して先端の胚半月部領域に注入した。５〜１０μｌ容量のＰＧＣ（１μｌあたり１００〜２００のＰＧＣ）懸濁液を、各卵に、マイクロメーター制御のＨａｍｉｌｔｏｎシリンジに取り付けられた５０ミクロン（ＯＤ）のガラスマイクロピペットを使用して注入した。
【００７１】
移した後、卵を、パラフィンでシールし、加湿孵卵機中にて３７〜３８℃でさらに１８日間孵卵し、そして孵化するように孵卵機に移した。
【００７２】
（ドナーＰＧＣからのニワトリ（ｃｈｉｃｋ）の生成）
６つの実験複製の各々から無作為に選択された繁殖対を、キメラ親ストックとして使用した。ロードアイランドレッドを有する白色レグホーンレシピエントとＢａｒｒｅｄ ＲｏｃｋドナーＰＧＣとを、互いに交配させ、そして白色レグホーンドナーＰＧＣを有するロードアイランドレッドレシピエントを、一緒に交配させた。これらのトリを、囲って交配させ（ｐｅｎ ｍａｔｅｄ）、そして各繁殖複製由来の卵を、週ベースで孵化させた。第１世代のニワトリを、これらのトリ、またはこれらのトリ由来の交雑種の交配に帰する特徴的な特性に基づいて、ドナー由来または内因性ＰＧＣ由来と同定した。
【００７３】
（結果および統計学的分析）
χ２法を使用して、＜０．０５の有意なレベルでのデータを分析した。
【００７４】
レシピエント卵の平均孵化速度は、９〜６７％の範囲で３７％であった。
【００７５】
特性マーキングによってドナーＰＧＣ由来であると同定された第１世代のニワトリは、４９％（９７／１９８）の平均伝播速度を有する交配群の中で１７〜７１％の範囲にわたる。さらなる孵化からのデータを、表３に示す。
【００７６】
（表３：ＰＧＣレシピエントの対から産生されるニワトリ）
【００７７】
【表３】
雄性レシピエントおよび雌性レシピエントの両方を繁殖対として使用する交配系は、伝播速度を増加させ、そしてまた純粋なドナーＰＧＣ由来ニワトリを生じた。ドナー由来であると同定されたニワトリのうち８５％が、ドナーと内因性生殖細胞との間の交雑由来であり、そして１５％が、純粋なドナー由来ニワトリであった（図２Ａ、２Ｂ）。ロードアイランドレッドおよびＢａｒｒｅｄ Ｒｏｃｋ ＰＧＣを受けた白色レグホーンレシピエント対繁殖対は、３羽の交雑種および３羽の純粋種系統を産生した。さらに、純粋なドナー由来のニワトリが、ロードアイランドレッドおよび横斑ロック（Ｂａｒｒｅｄ Ｒｏｃｋ）由来のＰＧＣの繁殖組合わせから得られた場合に、性関連特性を観察した。
【００７８】
ＰＧＣが白色レグホーン胚由来であり、有色レシピエントに移された場合、生殖細胞伝播速度は、有色のＰＧＣが白色レグホーンに移された場合の１７％と比較して、４７％であった。
【００７９】
レシピエントおよびＰＧＣの両方が同じような性であった場合、生殖細胞伝播速度は、レシピエントが逆の性のＰＧＣを受けた場合の７％と比較して、４０％であった。
【００８０】
雄生殖腺と雌生殖腺との間の形態学的な差異が明白である場合のニワトリ胚発達の特定の段階での操作の標的化は、レシピエントニワトリ胚の胚半月領域に移された場合、ＰＧＣは、性に関係なく、なお移動能を残すことを示した。以前の報告を考慮すると、この結果は、驚きである。この手順のさらなる利点は、発生の初期段階で得られ得るＰＧＣより多くのＰＧＣが生殖腺から取り出されるということである。
【００８１】
本研究で得られた結果は、白色レグホーン由来のＰＧＣが、ロードアイランドおよび横斑ロックの両方の生殖細胞の改善と比較して、より高い（＜０．０５）伝播性を有することを示唆し得る。このことは、品種の優性に帰し得るが、他の因子（例えば、品種の優性以外の発達の差異（ロードアイランドおよび横斑ロックは、白色レグホーンと比較して早く成熟する））が関与し得る。さらに、ＰＧＣの性がレシピエントに類似する場合、伝播速度はより高い（＜０．０５）ようである。
【００８２】
このデータは、本明細書中に記載される方法が、産生品種を改善し、疾患耐性および産生効率を付与するための効率的な生殖細胞操作を提供する、トリ農業についての代替的な補助再生技術を示す、ということを示した。トランスジェニック動物は、適切な調節性プロモーターの制御下で、異種核酸配列を生殖細胞集団に直接導入し、そして、トランスジェニックＰＧＣをレシピエント卵に移す前に安定な成分を選択することによって産生される。この系の有意な利点は、操作された生殖細胞由来のニワトリを同定するための羽色を組み込み、そして性関連羽色特性を使用して後にそれらを選択することによって、群の管理を増強しかつ全体的な産生費用を減少させることが使用され得るということである。
【００８３】
上記で議論されるように、ＰＧＣ法はまた、鳥類保存プログラムを増強するための代替的な補助再生技術を提供する。なぜなら、非周期的な高度生産性であるトリであるニワトリは、１年中鳥類保存についての係留繁殖プログラムを増強するための代替系を提供する「普遍的なレシピエント」として使用されるからである。
【００８４】
（実施例５：体組織生成のための幹細胞としてのトリＰＧＣ）
幹細胞は、胚生成および成体再生の基本単位である。外因性シグナルに応答する内因性能力が、それらの直系発生を調節する。哺乳動物において、始原生殖細胞（ＰＧＣ）は、培養物中において未分化で連続的な増殖であり続ける能力を有し、そして３つの胚性生殖層の形成に関与する多能性な能力を示す。
【００８５】
本明細書中に記載されるデータは、哺乳動物ＰＧＣと鳥類ＰＧＣとの間の類似性を示し、そして、生殖腺の性分化の初期段階におけるニワトリＰＧＣがなお幹細胞潜在性を保持し、インビトロで自発的に分化し得、そして胚系統分化が達成された後、インビボで発達する胚の種々の組織に寄与することを示す。
【００８６】
ＰＧＣは、神経および間葉の系統に分化する傾向を示した。明白なタグを提供する蛍光導入遺伝子マーカー（ＤｓＲｅｄ）を使用して、インビボでの観察可能な局在パターンならびに多能性および可塑性の程度を、発達する胚子において達成した。このデータは、性的に分化する６．５〜８．５ｄのニワトリ生殖腺から単離したＰＧＣが、不可逆な体性系統に付されず、そしてインビボでの生殖細胞層全てになお寄与し得る、ということを示す。さらに、ニワトリにおける脈管構造は、限定されないが、発達する胚子の種々の組織でのＰＧＣの広範な局在、および引き続く多系統関連を容易にする。本明細書中に記載される生殖腺ＰＧＣは、多系統分化についての外因性シグナル調節因子に応答する内因性の能力を保持する。
【００８７】
以下のために、実験を設計した：（ａ）生殖腺性分化の初期段階におけるニワトリＰＧＣが、すでにその体性系統に付されているか否か、またはこのニワトリＰＧＣが、幹細胞潜在性をなお保持しインビボで他の体性系統に分化しかつインビボで発達する胚の種々の組織に分化するか否かを決定するため；（ｂ）ＰＧＣの性がその系統関連をもたらすか否かを決定するため；そして、（ｃ）ニワトリ胚における脈管系が組織コロニー化に受容可能な経路を提供するか否かを決定するため。
【００８８】
（生殖腺の単離）
新たに産まれた横斑ロック受精卵を、加湿孵卵機中にて、３７〜３８℃および８５〜８８％の間の相対湿度で８．５日目まで孵卵した。生殖腺を、孵卵の７〜８日（ステージ３１〜３４）の間の発達するニワトリ胚から回収した。中腎を生殖隆起から回収し、そして低倍率下で鋭い先端のピンセットを使用して中腎から生殖腺を切り裂くことによって、生殖腺を回収した。生殖腺を、性に従って分類した。雌性は、右の生殖腺に比べて大きな左の生殖腺を有したが、雄性は、同様のサイズを示した。
【００８９】
（生殖細胞の培養）
ＰＧＣを、標準的なトリプシン処理手順に従って単離し、そして５％ ＣＯ２を有する加湿孵卵機中で３７℃で、性腺間質細胞と共に、または性腺間質細胞を伴わずに、組織培養プレート中で培養した。ＰＧＣを培養し、そして上記の通りにｆｉｃｏｌｌ密度勾配を用いて単離した。過ヨウ素酸シッフ染色を、上記の通りに実施した。
【００９０】
（ＰＧＣのトランスフェクション）
インビボでの局在パターンおよび系列の関与を評価するための明白なタグを提供するために、ＰＧＣをＤｓ Ｒｅｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でトランスフェクトして、細胞質の赤色蛍光を発現させた。１５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ １（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）中に１０μｌの最終容量になるように希釈し、そして１μｇの直鎖化ＤＮＡ（Ｄｓ Ｒｅｄ）をまた、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ １（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）中に同じ最終容量になるように希釈した。この調製物を合わせ、そして３０分間にわたって室温でインキュベートし、そしてウェル中に滴下した。培養培地を４時間後に添加して毒性を阻害した。連続した何回かのトランスフェクションを用いて、トランスフェクション率を改善した。
【００９１】
（インビトロ分化）
インビトロで多能性能力を確立するために、ＰＧＣを性腺間質共存培養から取り出し、そして増殖因子補充物の非存在下での自然分化を誘導した。
【００９２】
（体細胞キメラの産生）
インビボでの多能性（ｍｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）および柔軟性を、２．５日齢〜３．５日齢の白色レグホーン胚をレシピエントとして用いて決定した。移入の前に、発生中の雛鳥胚を可視化するために、鈍角の端部において卵に窓を開けた。２μｌ〜３μｌの培地中の約４００ＰＧＣ〜６００ＰＧＣを、マイクロマニピュレータに取り付けたガラスマイクロピペット（４０ミクロンＯＤ）を用いて孵卵６０時間〜８４時間の間に血管系に注入した。ＰＧＣ懸濁物を、発生中の胚の血管系に、例えば、背側大動脈または周縁部静脈および周縁部動脈に注入した。卵の窓をシールし、そして卵を加湿孵卵機中で３７℃で孵卵した。ＰＧＣの局在および複数系列関与を、蛍光Ｄｓ Ｒｅｄマーカーを用いて胚子（ｆｅｔａｌ）発生の７日目〜９日目の間および孵化１日後に決定して、羽色への影響もまた決定した。
【００９３】
（ニワトリ生殖細胞の培養特徴）
コロニーは、反復継代培養において、有糸分裂的に活性な性腺間質細胞の存在下で、３ヶ月間にわたって増殖した。多能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）生殖細胞は、一様に丸く、そして間質層にも他のＰＧＣにも強固には付着しなかった。コロニーは多層であり、そして間質層からよく遊離した。単層の支持の喪失によって、阻害因子補充物および増殖因子補充物の両方の存在下でさえ、何らかのレベルの自然分化がもたらされた。長期培養物はまた、過ヨウ素酸シッフ染色強度における減少を示した。
【００９４】
（インビトロでの多能性）
性腺間質支持ならびに増殖因子および阻害因子の影響の非存在下では、ＰＧＣは、いくつかの細胞系列に自然に分化した。ＰＧＣ培養物の大多数は、線維芽細胞様細胞および間葉型細胞へと分化した。その後、これらの細胞の長期培養は、骨、軟骨、筋肉および未成熟脂肪細胞に形態学的に類似した種々の結合組織細胞型をもたらした。ＰＧＣが増殖して、単層への結合が最少であるかまたはない、小さな緻密な細胞クラスターになった場合、これらはしばしば、神経細胞へと分化して、広範囲のネットワークをこれらの間に形成した。ＰＧＣはまた、コンフルエント時に、上皮単層へと時々分化した。
【００９５】
（インビボでの多能性および柔軟性）
血管系を移入経路として用いて、発生中のニワトリ胚子におけるＰＧＣの広範囲の局在および系列関与を促進した。これらは、心臓、肺および血液において一貫して観察され；そしてこれらは、Ｄｓ Ｒｅｄ発現に基づいて、それぞれ、心臓、肺および血液の２０％まで、５％までおよび４０％までに寄与を有すると評価された。これらはまた、中脳、眼、骨髄、筋肉、性腺、中腎および皮膚に局在することが観察された。系列関与は、筋肉、皮膚、骨髄、性腺、中腎および中脳における蛍光によって異なるレベルで明らかであった。孵化したニワトリの羽色パターンによってまた、生殖細胞からの何らかの寄与が示された。性腺間質単層の支持の非存在下で継代培養した生殖細胞は、インビボでの複数系列関与の低減、特に性腺関与に取り込まれるそれらの能力を失うことを示した。
【００９６】
このデータは、性分化中の７〜８．５日のニワトリ性腺由来の単離されたＰＧＣが、精子形成および卵子形成へと向かう不可逆的な体細胞系列には付されていないことを示す。これらの細胞は、インビトロで分化する多能性能力を依然として保持し、そしてインビボで全ての生殖層へと寄与する柔軟性を示す。
【００９７】
初代培養および継代培養の両方の生殖細胞は非常に優勢に、インビトロで間葉系列および神経系列へと、続いてそれらの最終的な体細胞状態へと分化した。ドナーＰＧＣの性別がレシピエント胚とは異なっていた場合に、増殖および系列の関与が影響されたという明らかな証拠は存在しない。
【００９８】
ニワトリにおける血管系は、制限しないが、ＰＧＣの広範な局在を促進して、ＰＧＣが、発生中の胚子における組織生成および器官形成に寄与するのを可能にする。これらの細胞は、それらの系列分化を決定する環境を制御する外因性の調節因子によって利用および再プログラムされ得る。ヒトは、鳥類とも、幹細胞研究のために使用される他の動物モデルとも、類似の基本的身体プランを共有しないが、同じ生化学的機構から生じたようである相同な部分を共有している。従って、ニワトリのＰＧＣモデルは、組織操作、胚の作製、成体再生および遺伝子治療における幹細胞の適用の開発のための他の動物モデルに対する有用な代替物である。
【００９９】
他の実施形態は、添付の特許請求の範囲の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】図１は、ドナーＰＧＣを単離し、このドナーＰＧＣの移入用のレシピエントの卵を調製するための手順を示すフローチャートである。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、ドナーＰＧＣを受けた２対の品種のレシピエントから産まれた雛鳥の写真である。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、ロードアイランドレッドおよび横斑ロックＰＧＣの両方の、白色レグホーンレシピエントへの移入から産まれた雛鳥の写真である。図３Ａは、ロードアイランドレッドの雄と横斑ホワイトロック（Ｂａｒｒｅｄ Ｗｈｉｔｅ Ｒｏｃｋ）の雌（Ｒｅｄｉ−Ｌｉｎｋ Ｃｒｏｓｓとして市販されている）から産まれた、純粋なドナーにより誘導される雛鳥を示す。雌は、黒色であり、雄は、横しま色模様である。図３Ｂは、純粋なドナーから誘導された雛鳥を示す。ロードアイランドレッドの雄と横斑ロックの雌の交配から、伴性の雛鳥が産まれた。この交配は、頭部に白い斑点を有する雄の雛鳥を生じたが、雌はそうではなかった（Ｒｅｄ−Ｒｏｃｋ Ｃｒｏｓｓから世間一般に市販されている）。白い雛鳥は、白色レグホーンレシピエントの内因性生殖細胞から誘導された。
【図４】図４は、試験導入遺伝子βガラクトシダーゼの発現を示す、トランスジェニック雛鳥胚の写真である。ＰＧＣは、この導入遺伝子でトランスフェクトされ、レシピエントの卵に移入された。このレシピエントの雛鳥は、孵卵の１０日目に、導入遺伝子の発現について試験するために回収された。βガラクトシダーゼの発現は、中腎性腺領域において検出された。ドナーＰＧＣは、脂質を使用してインビトロでトランスフェクトされ、４８時間孵卵した卵の性腺の半月領域（これは、７５μｇのブスルファンで、ＰＧＣ移入の２４時間前に部分的に不妊処理された）に移入された。βガラクトシダーゼの発現は、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下であった。
【０００１】
本願は、２００１年２月１６日出願の米国仮出願番号６０／２６９，４４２（この全内容は、本明細書中で参考として援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、鳥類ゲノムを遺伝子操作する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
商業目的および研究目的のためにトランスジェニック動物を作製するための、より良好かつより効果的な方法を開発することに、多くの試みが向けられてきた。この分野における最近の発展は、精子媒介性の遺伝子導入について、細胞質内精子注射（ＩＣＳＩ）の使用を記載する（Ｐｅｒｒｙら、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：１１８０−１１８３）。いく人かの研究者らは、ドナー核質として体細胞を使用する、哺乳動物（例えば、ヒツジ（Ｗｉｌｍｕｔら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３）、ウシ（Ｃｉｂｅｌｌｉら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０：１２５６−１２５８）、マウス（Ｗａｋａｙａｍａら、１９９８ Ｎａｔｕｒｅ ３９４：３６９−３９４）およびヤギ（Ｂａｇｕｉｓｉら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：４５６−４６１））における核移入による、クローン化動物の作製を報告する。しかし、これらの技術は、なお開発の初期段階であり、そして鳥の独自に異なる生殖器官に適合することは困難であり得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、異種核酸を含む、単離された鳥類性腺細胞（例えば、卵巣細胞または精巣細胞）を特徴とする。この細胞は、好ましくは、胚細胞である。用語「鳥類」とは、任意の鳥類種をいい、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ウズラおよびキジが挙げられるが、これらに限定されない。
【０００５】
本発明はまた、鳥類種のゲノムに核酸分子を導入する方法を含み、この方法は、雛鳥胚に由来する単離された性腺細胞の集団をこの核酸分子と接触させて、トランスフェクトされた性腺細胞を得る工程、およびこのトランスフェクトされた性腺細胞を授精した鳥類の卵に移す工程による。この核酸分子は異種である（すなわち、この核酸分子は、性腺細胞が由来する品種または種とは異なる品種または種に由来する）。トランスフェクトされた性腺細胞が使用され、次いでこれを使用してトランスジェニック鳥を作製する。
【０００６】
単離された性腺細胞の集団は、少なくとも０．５％の始原生殖細胞（ＰＧＣ）、より好ましくは少なくとも１％の始原生殖細胞、そしてさらにより好ましくは少なくとも５０％の始原生殖細胞を含む。性腺ＰＧＣは、組織において性腺ＰＧＣと共に天然に存在する他の細胞（例えば、間質性腺細胞）から単離（すなわち、分離）される。好ましくは、この集団は、少なくとも８０％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、そして最も好ましくは９９〜１００％の性腺ＰＧＣである。このＰＧＣは、他の非ＰＧＣ細胞からの精製の前または後のいずれかに、異種ＤＮＡを用いてトランスフェクトされる。性腺鳥類ＰＧＣは、卵母細胞および精子細胞を生じ得る、雛鳥胚中に存在する細胞である。
【０００７】
性腺ＰＧＣが得られる雛鳥胚は、２７より上の胚ステージの発生中の雛鳥胚が好ましい（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ＆Ｈａｍｉｌｔｏｎ、１９５１ Ｊ Ｍｏｒｐｈｏｌ ８８：４９−９２）。例えば、この雛鳥胚は、２９〜３６の発生ステージの胚である。好ましくは、性腺ＰＧＣが得られる雛鳥胚は、回収の時点で、少なくとも６．５日、そしてより好ましくは７．５日（２９〜３６の発生ステージ）孵卵されている胚である。少なくとも６．５日であるが１５日未満の発生齢で雛鳥胚から得られた性腺ＰＧＣは、移動能力を保持する。例えば、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日の性腺ＰＧＣは、レシピエント卵に移され、そして移動能力を保持する。
【０００８】
トランスフェクトされたドナー性腺細胞は、レシピエント卵が得られた品種と比較して、同じかまたは異なる品種の鳥に由来する。同様に、トランスフェクトされたドナー性腺ＰＧＣは、授精したレシピエント鳥類卵が得られた種と比較して、同じかまたは異なる種から単離される。
【０００９】
授精したレシピエント鳥類卵は、ステージ７〜８の間の発生である。すなわち、このレシピエント卵は、少なくとも１２時間孵卵されている。あるいは、授精した鳥類卵は、ステージ１３〜１９の間の発生である。
【００１０】
孵卵されていない卵は、生まれたての卵または３７℃未満の温度で貯卵された卵を含む。例えば、孵卵されていない卵は、約６０°Ｆ、室温または低温（例えば、４℃）の保存温度で、産卵直後の時点から孵卵時間まで貯卵した卵を含む。孵卵は、卵が、発生を導く温度（例えば、３７〜３８℃、または鳥の品種もしくは種の要件に調整された温度）に曝される時間をいう。発生のステージは、経時的に決定されるか、または胚組織の状態（例えば、大きさおよび形態）の視覚的試験によって決定される。
【００１１】
異種配列の発現を調節するための好ましいプロモーターとしては、組織特異的プロモーター（例えば、ニワトリの卵管細胞における導入遺伝子の発現を指向するプロモーター）が挙げられる。卵管細胞における導入遺伝子発現は、卵の卵白における導入遺伝子産物の蓄積を導く。例えば、当該分野で公知のオボアルブミンプロモーターは、卵管細胞における発現を指向するために使用される。あるいは、プロモーターは、肝臓組織における導入遺伝子の発現を指向する。ビテロゲニンプロモーターは、（導入遺伝子によってコードされる）異種ポリペプチドの発現を肝臓に指向し、そして血流への分泌を指向するために使用される。例えば、ビトロゲニンプロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子配列は、疾患への耐性を付与する、抗体の重鎖または軽鎖をコードする。このような構築物の導入は、品種改良において有用である。血液、筋肉、羽毛または他の組織における発現を指向するプロモーターもまた使用される。組織特異的エンハンサーもまた、好ましい標的組織における発現を増強するために使用され得る。あるいは、組織特異的でないプロモーターが、全身的な発現を指向するために使用される。
【００１２】
導入遺伝子構築物は、１以上のプロモーターを含む。例えば、この構築物は、２つのプロモーターを含む。例えば、第一のプロモーターは、一過性のマーカー遺伝子（この遺伝子の発現は、形質転換されたＰＧＣの選択を可能にする）をコードする配列に作動可能に連結され、そして第二のプロモーターは、組織特異的な様式で導入遺伝子の発現を指向する。
【００１３】
好ましい導入遺伝子としては、インスリンおよび抗体分子またはそのフラグメントが挙げられる。例えば、この導入遺伝子は、インタクトなヘテロ二量体モノクローナル抗体、または免疫学的に活性な抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）２フラグメント、操作された単鎖Ｆｖ分子）、またはキメラ分子（例えば、１つの抗体（例えば、マウス起源）の結合特異性を含み、そして残りの部分は、他の抗体（例えば、ヒト起源）である）をコードする。導入遺伝子（例えば、抗体をコードする遺伝子、ヒトまたはブタのインスリン（または別の哺乳動物のインスリン）の遺伝子）は、オボアルブミンプロモーターに作動可能に連結されて、卵の卵白画分におけるインスリンの蓄積を可能にする。ヘテロ二量体抗体分子の産生について、卵管細胞において両方の鎖を発現するために、軽鎖をコードする配列は、オボアルブミンプロモーターに作動可能に連結され、そして重鎖配列は、オボアルブミンプロモーターに作動可能に連結される。次いで、導入遺伝子産物は、当該分野で公知の方法を使用して、この卵から精製される。抗体分子の発現は、好ましくは、（例えば、卵管細胞における発現のためにオボアルブミンプロモーターを使用して）卵の卵白画分における蓄積のために標的化される。
【００１４】
ドナーＰＧＣは、性別の異なる性腺から得られ、従って、性別によって分離される。ドナーＰＧＣストックは、レシピエント卵と性別が一致する。このようなストラテジーは、（トランスフェクトされたかまたはトランスフェクトされていない）ドナーＰＧＣの好ましい授精率および高い生殖細胞系発現を保証する。レシピエント卵の性別は、ホルモンにより制御される（例えば、卵にテストステロンを導入して、雄の雛鳥を作製するか、または卵にエストロゲンもしくは卵胞刺激ホルモンを導入して雌の雛鳥を作製することによる）。１つの種のトランスフェクトされていないＰＧＣを使用して、別の種の鳥を作製する。
【００１５】
遺伝子が破壊されているトランスジェニック（すなわち、「ノックアウト」トランスジェニック）鳥がまた、上記の方法を使用して作製される。ノックアウト鳥を作製するために、内因性遺伝子中の配列に相補的な配列を含む、ノックアウト構築物を作製する。導入遺伝子構築物中の配列は、標的配列との相同組換えを経て、遺伝子の破壊を生じる。遺伝子の破壊は、非機能的遺伝子産物の産生を導くか、または遺伝子産物をほとんど産生しないかもしくは全く産生しない。病理学的状態に関与する遺伝子は、この様式で破壊される。得られたノックアウトトランスジェニック鳥は、疾患状態のモデル動物として使用され得る。このようなノックアウトトランスジェニック鳥は、単離された鳥類性腺細胞（これは、内因性遺伝子の遺伝的破壊（例えば、機能的遺伝子産物の産生を阻害する破壊）を含む）を使用して作製される。
【００１６】
本発明は、異種ＰＧＣ（例えば、性腺ＰＧＣ）を含む鳥類卵を含む。異種によって、ＰＧＣおよび鳥類（レシピエント）卵の種が異なることを意味する。例えば、ニワトリ卵は、エミューまたはニワトリ以外の鳥類種由来のＰＧＣを含む。本発明はまた、別の品種のニワトリ由来の性腺ＰＧＣを含む、１つの品種のニワトリ卵を包含する。単離されたトランスジェニック性腺細胞（例えば、異種ＤＮＡでトランスフェクトされた性腺ＰＧＣ）を含む鳥類卵もまた、本発明の範囲内である。
【００１７】
性決定されたＰＧＣの単離された集団（例えば、雄の性腺ＰＧＣ集団または雌の性腺ＰＧＣ集団）もまた、本発明の範囲内である。好ましくは、雄の性腺ＰＧＣ集団は、２０％未満、好ましくは１０％未満、好ましくは５％未満、そしてより好ましくは１％未満の雌の性腺ＰＧＣを含む。同様に、雌の性腺ＰＧＣ集団は、２０％未満、好ましくは１０％未満、好ましくは５％未満、そしてより好ましくは１％未満の雄の性腺ＰＧＣを含む。
【００１８】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
鳥類性腺細胞を、遺伝学的に操作および使用して、鳥類ゲノムに異種核酸を導入する。この方法を使用して、品種の質を改善し、非鳥類疾患（例えば、ヒト疾患）の鳥類モデルを作成し、鳥類に対して疾患耐性を与え、そして薬学的用途および他の用途のための組換えタンパク質を生成する。ＤＮＡ移入を媒介するのに性腺細胞を使用することによって、「汎用レシピエント（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）」としてニワトリを使用して、絶滅の危機に瀕した種の保全のために、鳥類の異なる品種にわたっておよび鳥類の種の間で鳥類を繁殖させることが、可能となる。
【００２０】
単離された鳥類性腺ＰＧＣを使用して、鳥類種のトランスジェニック動物を繁殖させる。異種核酸をこのＰＧＣに導入して、安定な形質転換生殖細胞を生成する。
【００２１】
本明細書中に記載される方法は、全ての鳥類に適用可能であり、ニワトリ、シチメンチョウ、キジ、アヒルおよびガチョウのみに限定されない。この手順の全体の効率は、以下に依存する：細胞単離のタイミング、移入時間および移入部位、ドナーＰＧＣの事前の雌雄鑑別（ｓｅｘ ｐｒｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）、ならびにレシピエント生殖腺のドナーＰＧＣ集団を最大にするためのレシピエント胚の不妊手術。
【００２２】
標準的な遺伝子操作技術を使用して、トランスジェニック動物を繁殖させる。性腺ＰＧＣのトランスフェクションを数回行い、遺伝子移入効率を増加させ得る。ドナー細胞は、移入前または移入後に精製される。例えば、ＰＧＣは、インビトロでトランスフェクトされ、次いでレシピエントの卵に移入する前に精製される。トランスフェクトされた（またはトランスジェニック）性腺ＰＧＣを使用して、鳥類および卵における医薬品の製造のための、生殖系列のトランスジェニックニワトリを繁殖させる。
【００２３】
この導入遺伝子の配列または構造は、遺伝子移入の成功または有効性に影響を及ぼさない。この導入遺伝子の発現を調節するプロモーターは、良性または組織特異的である。トランスジェニックタンパク質またはトランスジェニックポリペプチドは、主に、卵管細胞における発現について標的化され、その結果、この遺伝子産物は、産卵（卵を産む）後に、卵から単離され得る。組織特異的な、プロモーターおよび／またはエンハンサーの使用は、他の組織（羽毛、皮膚、および筋肉を含む）における発現を可能にする。
【００２４】
さらに、この方法はまた、ニワトリにおいて他の鳥類種を繁殖させるためおよび絶滅の危機に瀕した鳥類種の保全のための、「汎用レシピエント」としてニワトリ／卵を使用して、他の鳥類種を繁殖させるためにも使用され得る。
【００２５】
（遺伝子改変された鳥類ＰＧＣの使用）
本明細書中に記載される細胞および方法は、ドナーＰＧＣから生殖系列鳥類を繁殖させるのに有用である。このドナーＰＧＣは、異種核酸でトランスフェクトされ、そして精製され（逆もまた同様）、その結果、トランスジェニックＰＧＣの単離された集団が、レシピエントの卵に移入される。トランスフェクトされたＰＧＣのさらなる濃縮が、マーカベースのセルソーターを使用して行われる。
【００２６】
農業的用途のために、ドナーＰＧＣは、鳥類の品質またはこの鳥類が生産する肉もしくは卵の品質を改良する導入遺伝子でトランスフェクトされる。例えば、疾患耐性またはグロースアドバンテージ（ｇｒｏｗｔｈ ａｄｖａｎｔａｇｅ）を与える、遺伝子をコードするＤＮＡを移入して、所望の市場的特徴を有する動物を繁殖させる。
【００２７】
治療的または薬学的なタンパク質またはポリペプチドは、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡで性腺ＰＧＣをトランスフェクトすることによって、ＰＧＣをレシピエントの卵に移入することによって、ならびに所望のポリペプチドを生成するための、生殖系列キメラ、およびその後のトランスジェニック鳥類の繁殖に適した条件下における卵の孵卵によって、生成され得る。治療的タンパク質は、卵の卵黄もしくは卵白における発現か、またはその鳥類の肉、羽毛、皮膚、血液および他の部分における発現について標的化される。次いで、所望のポリペプチドが、当該分野で公知の方法を使用して、組織または流体（例えば、卵の卵白）から単離される。
【００２８】
本発明はまた、レシピエントの品種とは異なる（しかし、依然として同じ種（例えば、ニワトリ）の範囲内である）鳥の品種を繁殖させるのに有用である。例えば、ドナーＰＧＣは、ロードアイランドレッド（Ｒｈｏｄｅ Ｉｓｌａｎｄ Ｒｅｄ）種から誘導され、ニワトリの別の品種（例えば、プリマスロック（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｒｏｃｋ））の卵に移入される。一般的なアメリカ産品種のニワトリとしては、プリマスロック、ドミニク（Ｄｏｍｉｎｉｑｕｅ）、ワイアンドット（Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ）、ロードアイランドレッド、ロードアイランドホワイト（Ｒｈｏｄｅ Ｉｓｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ）、バックアイ（Ｂｕｃｋｅｙｅ）、Ｃｈａｎｔｅｃｌｅｒ、ジャージージャイアント（Ｊｅｒｓｅｙ Ｇｉａｎｔ）、Ｌａｍｏｎａ、ニューハンプシャー（Ｎｅｗ Ｈａｍｐｈｉｒｅ）、およびデラウエア（Ｄｅｌａｗａｒｅ）が挙げられる。
【００２９】
（非トランスジェニック用途における、単離された鳥類性腺ＰＧＣの使用）
単離されているがトランスフェクトされていない性腺ＰＧＣを使用して、雑種の鳥類を繁殖させる。例えば、ウズラは、ニワトリによって作られる卵から産まれる。従って、本発明の方法は、絶滅の危機に瀕した種を保全するために雑種の鳥類を繁殖させるための、「汎用レシピエント」としてのニワトリまたは他の家禽の鳥類の使用を提供する。このような繁殖アプローチの利点は、ニワトリが非季節性の高生産家禽の鳥類であるので、絶滅の危機に瀕した鳥は、絶滅に瀕した種に関連する、季節的な制限も地理的な制限もなしに、確実に繁殖されることである。例えば、この方法を使用して、アラビア半島に生息する絶滅の危機に瀕したＨｏｕｂａｒｒａ Ｂｕｓｔａｒｄのような、希少性の鳥類または絶滅の危機に瀕する鳥を繁殖させる。他の絶滅の危機に瀕する鳥としては、キジ、ウズラ、オウムおよびコンゴインコが挙げられ、これらの全てが、ハンターおよび密猟者によって生息地を失い、開拓されて絶滅の危機に直面している。この方法は、特に、天然で季節により繁殖する鳥（例えば、キジまたはシチメンチョウ）または飼育においては繁殖しない鳥類を繁殖させるために有用である。アホウドリおよびウミツバメ（これらは、小さな大洋島で天然に繁殖する）はまた、性腺ＰＧＣをニワトリのレシピエントに移入することによって生殖され得る。クイナ、ツルおよびカグー（ｋａｇｕｓ）の多くの種もまた、高い危険性である。なぜなら、これらは、非常に繁殖の遅い動物であり、営巣地および越冬地帯の妨害に、非常に脆弱性であるからである。鳴禽（これは、全ての鳥類種の大半の６０％を占める）は、わずかに平均より低い絶滅の危険性を有するが、数種（アメリカの草原に生息する鳥を含む）は、深刻に減少している。しかしながら、この方法は、他の任意の鳥類種（すなわち、ニワトリの卵ではない卵をレシピエントとして使用して、鳥類の種間の繁殖を可能にする）に適用可能である。性腺の雌雄の差が生じる発育期は、各鳥類種の目視による観察によって決定される。
【００３０】
（実施例１：ドナーＰＧＣ）
新たに産卵された（または孵卵されていない）受精卵を、卵の発育を導く３７〜３８℃または室温にて、１０日間まで、加湿孵卵機内で孵卵する。種々の種の鳥に必要とされる卵の孵卵を、表１に示す。
【００３１】
（表１：鳥類種に必要とされる卵の孵卵）
【００３２】
【表１】
【００３３】
このＰＧＣは、他の性腺間質細胞と共にトランスフェクトされ得るか、またはフィコール密度勾配を使用してトランスフェクションの前に単離され得る（Ｙａｓｕｄａら、１９９２，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．９６：５２１−５２８）。さらなる精製は、単離された細胞の短期培養（１５〜３０分）によって達成される。この性腺間質細胞は、ＰＧＣよりも迅速にプラスチック（例えば、組織培養プレート）に付着し、従って、約９０％以上までの性腺ＰＧＣの精製を可能にする。この性腺ＰＧＣを、脂質（１〜２μｇ／ｍｌのＤＮＡ）を使用して３〜４時間トランスフェクトするか、または２０〜５０ｍｇ／ｍｌのＤＮＡを用いて２５０ボルトおよび７５０〜９５０マイクロファラッドの間でのエレクトロポレーションによってトランスフェクトする。あるいは、このＰＧＣを、リン酸カルシウムおよび核酸配列を導入するための当該分野で公知の他の方法を使用してトランスフェクトする。必要に応じて、これらの細胞を、トランスフェクションの割合を増加するために、１回より多くトランスフェクトする。ＰＧＣを必要に応じて、遊走能力の損失もなくかつ分化することなく、４日までの短期間インビトロで培養し、数回のトランスフェクション反復および選択を可能にする。短期間培養の後、このＰＧＣを、標準的な方法を使用して、間質細胞から分離する。トランスフェクトされたＰＧＣを、例えば、導入遺伝子構築物が抗生物質耐性をコードするマーカーを有する場合、抗生物質選択によってさらに単離する。他の細胞精製方法としては、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）単離または磁気細胞選別が挙げられる。これらの方法は、ＰＧＣの単離された導入遺伝子集団を生じ、この集団を、次いで、レシピエント卵に移す。
【００３４】
ドナー性腺ＰＧＣは、レシピエント卵由来の同じ品種のトリまたは異なる品種のトリに由来する。後者の場合、ドナーＰＧＣ産生生殖細胞系雛鳥の同定は、この品種の顕著な特徴（例えば、色）の差異によって容易になる。
【００３５】
（実施例２：レシピエント卵）
産みたての受精卵を、レシピエント卵として使用する。レシピエント卵を、産卵の直後もしくは産卵後すぐに孵卵するか、または産卵後だが移す前に冷却保存（孵卵しない）する。孵卵を、胚のさらなる発生を導く暖温（例えば、３７〜３８℃）にこの卵を曝露して始める。「０時間」の卵は、産まれているがまだ孵卵されていない卵である。同様に、「１２時間」の卵は、１２時間孵卵された卵であり、以下同様である。レシピエント用の受精卵を、孵卵の開始から１２時間目、２４時間目、４８時間目およびさらに９６時間目で使用する。
【００３６】
レシピエント卵の発生ステージを、暦年齢もしくは孵卵後の時間によって（例えば、ＨａｍｂｕｒｇｅｒおよびＨａｍｉｌｔｏｎ，１９５１ Ｊ Ｍｏｒｐｈｏｌ ８８：４９−９２を参照のこと）、または胚組織の発生ステージの目視検査によって決定する。ＰＧＣを、２〜２０マイクロリットルの容量で、レシピエント卵に移す。約５０〜１０００のＰＧＣを移す。例えば、ＰＧＣを、約５０〜４００細胞／マイクロリットルの細胞密度で移す。移動部位は、卵の発生ステージに依存する。孵卵の０〜１２時間目において、この移動部位は、胚葉盤または胞胚腔になる。ドナーＰＧＣが移される容量は、一般に、５マイクロリットル未満の培地である。２４時間目において（ステージ７〜８、ＨａｍｂｕｒｇｅｒおよびＨａｍｉｌｔｏｎ、１９５１ Ｊ Ｍｏｒｐｈｏｌ ８８：４９−９２）、この部位は、発生中の雛鳥に物理的に影響を与えないように、中心から外れる（明域と暗域との間の縁部）。４８時間目（ステージ１１〜１３）において、移動部位は、ＰＧＣが血管構造への侵入および性腺への移動の前に通常集合する胚頂部領域においてかまたはこの胚頂部領域付近に存在する。あるいは、ＰＧＣを、孵卵から約５０〜６０時間またはステージ１３〜１７で血管構造に直接注入する（Ｙａｓｕｄａら、１９９２ Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ ａｎｄ Ｆｅｒｔ ９６：５２１−５２８，Ｎａｉｔｏら、１９９８，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ ａｎｄ Ｆｅｒｔ １１３：１３７−１４３）。
【００３７】
例えば、ＰＧＣを、卵の６〜１２時間の短期孵卵後に胞胚腔が形成された発生ステージ７〜１２のレシピエント卵に移す。この場合において、ＰＧＣを、胞胚腔に注入する。このレシピエント卵が発生ステージ１３〜１６の間（２４〜２８時間の孵卵時間）にある場合、ＰＧＣを、透明部と混濁部との間の領域に移す。このレシピエント細胞が、３６〜４８時間の孵卵に対応する発生ステージにある場合、ＰＧＣを、胚頂部領域に直接注入し、ここでは内因性ＰＧＣは通常、雛鳥血管構造に侵入する前に集まる。レシピエント卵が、５０〜７２時間に対応する発生ステージ（ステージ１６〜１９）にある場合、ＰＧＣを、血管構造（例えば、血管）に直接移す。
【００３８】
ドナーＰＧＣの生殖細胞系伝播速度を増加するために、内因性ＰＧＣを、血流から物理的に除去する（Ｎａｉｔｏら、１９９８，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ ａｎｄ Ｆｅｒｔ １１３）。あるいは、この卵を、孵卵の０〜２４時間の間に照射して、内因性ＰＧＣを排除する（Ｃａｒｓｉｅｎｃｅら，１９９３，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１７：６６９−６７５）。ブスルファンを使用する化学的不妊もまた、内因性ＰＧＣを排除するために有効である（Ａｉｇｅ−ＧｉｌおよびＳｉｍｋｉｓｓ １９９１，Ｒｅｓｅｒｃｈ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｗｓｃｉｅｎｃｅ ５０：１３９−１４４；Ｖｉｃｋら、１９９３，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ ａｎｄ Ｆｅｒｔ ９８：６３７−６４１）。孵卵後２０〜２４時間の間に卵黄に注入した、ジメチルホルムアミド（２０〜５０マイクロリットル）またはジメチルホルムアミド中に溶解し、そしてキャリアとしてのゴマ油と混合したブスルファン（１００ｍｇ／ｍｌ）の組み合わせ（５０マイクロリットルの胡麻油中卵あたり７５〜１００μｇのブスルファン）もまた、内因性ＰＧＣの殺傷に有効である。あるいは、１０〜２０マイクロリットルの培地中の５０μｇのブスルファンを、胚頂部領域（ここで、ＰＧＣは、血管構造への侵入の前に蓄積する）に注入する。不妊の２４時間後、ドナーＰＧＣを、孵卵の４８時間において、胚頂部領域に移すか、または後に（５５〜７２時間の間）血管構造に移す。
【００３９】
移した後、この卵を、加湿孵卵器中３７〜３８℃で孵卵して、雛が産まれるまで加湿孵卵器で３７〜３８℃で孵卵し、そして性的に成熟するまで成長させる。トリの品種がドナーとレシピエントの間で異なる場合、得られるトリ（異種ＤＮＡを含む）を、ドナーＰＧＣが由来する品種と同じ品種と交配する。このアプローチにより、（サイズ、色などのような顕著な特徴に基づいて）内因性ＰＧＣ由来のトリをドナーＰＧＣ由来のトリと区別し得る。
【００４０】
（実施例３：性腺ＰＧＣを使用する改善された鳥類導入遺伝子）
導入された異種核酸配列の生殖細胞系伝播について、（ｉ）胚分化の前の発生ステージを標的化するか、または（ｉｉ）生殖細胞集団への組込み現象を標的化することによって、分化後の遺伝子操作を指向する、２つのシナリオが存在する。後者のアプローチを使用して、始原状態にある生殖細胞の移入から誘導された高割合の生殖細胞系伝播で生殖系キメラ親ストックを生成するための手順を設計した。この鳥類アプローチは、生物薬学産業に、他の導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）系と比較して、大きなスケールの生産能力のためにより効果的なプラットフォームを与える。
【００４１】
性腺ＰＧＣを、卵形成の間にトランスジェニックニワトリにおける発現のために設計された遺伝子構築物の生殖細胞系伝播について標的化する。培養ＰＧＣのトランスフェクションを、インビトロで標的化し、続いて、発生中の雛鳥胚中の標的領域に移した。
【００４２】
以下の材料および試薬を、記載される方法において使用した：孵卵器、ＣＯ２孵卵器、ステレオミクロスコープ（１〜５×）、複合顕微鏡（１０×、２０×）、遠心機、ピペットホルダーを備えるカリパー制御インジェクターシステム、マイクロマニピュレーターシステム、２＃５ウオッチメイカーの鉗子、調節可能ピペット（１０、２００、１０００マイクロリットル）、卵殻カッター（すなわち、Ｄｒｅｍｅｌ Ｍｕｌｔｉｐｒｏ Ｋｉｔ ＃３９５６）、ペトリ皿（３５、１００ｍｍ）、４ウェルＮｕｎｃｌｏｎプレート、微小遠心管（１．５ｍｌ）、パラフィルム（１インチ幅）、ブスルファン（Ｓｉｇｍａ）、ゴマ油（Ｓｉｇｍａ）、ジメチルホルムアミド（Ｓｉｇｍａ）、リン酸緩衝生理食塩水、ＤＭＥＭハイグルコース（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、トリプシン／ＥＤＴＡ、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、フィコール（Ｓｉｇｍａ）、ウシ胎仔血清、ニワトリ血清、増殖因子（ＩＧＦ−１、ｂＦＧＦ，ｍＬＩＦ、ＳＣＦ）、抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン）、受精したＳＰＦ卵（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。
【００４３】
（ドナー始原生殖細胞の調製）
性腺を以下のように単離した。新鮮な産みたてのニワトリの受精卵を、３７〜３８℃、８５〜８８％の間の相対湿度で、加湿卵孵卵器中で８日までの間、孵卵した。性腺を、４〜８日の間（ステージ２９〜３６）の発生中の雛鳥胚から収集した。好ましくは、性腺を、７〜８日の間（ステージ３１〜３６）で収集し、それにより、レシピエント雛鳥に戻される場合に遊走能の最小損失を伴って回収されるＰＧＣの数を最大にする。胚の腹腔から中腎領域を除去し、そして低出力で先の細い鉗子を使用して中腎由来の性腺を解剖することによって、性腺を回収する。孵卵の７〜７．５日目において、分化中の雌性腺と雄性腺との間の発生の差異を同定して、性別の選択が可能になり得る。発生中の雌性腺の対は、右性腺の萎縮および生殖細胞の差次的コロニー形成パターンから左性腺の拡大を示す。分化中の雄性腺のサイズは類似しており、そして雌性腺とは異なる。この性腺は、雄性腺と雌性腺との間のより顕著な差異を伴って、発生の後期ステージにおいて単離され得るが、単離されたＰＧＣが遊走する能力は、レシピエント雛鳥胚に移された場合に減少する。
【００４４】
ドナーＰＧＣは、レシピエント卵と同じ品種のトリまたはレシピエント卵とは異なる品種のトリ由来であり得る。後者の場合、ドナーＰＧＣ産生生殖細胞系雛鳥の同定は、品種の顕著な特徴における差異（例えば、羽毛の色、サイズおよび皮膚の色素沈着）によって容易になる。ＰＧＣの供給源が、レシピエント雛鳥胚とは異なる羽毛の色を表現型として発現することが好ましい。このことは、移されたＰＧＣ由来の雛鳥のより容易な選択を容易にする。
【００４５】
（生殖細胞の単離および培養）
単離された性腺を、性別に分類し、そして標準的なトリプシン処理手順によって分散させた。ＰＧＣを、性腺間質細胞と比較して大きいサイズ（１２〜２０ミクロン）によって識別し得た。明視野の顕微鏡下で、ＰＧＣは、その細胞質全体にわたって多数の脂質液滴を含み、大きな核が、離心性の位置を占めた。ニワトリＰＧＣは、高いグリコーゲン含量を有し、従って、過ヨウ素酸Ｓｃｈｉｆｆ染色によって同定可能である。ＰＧＣは、性腺間質細胞と共に共培養し得たか、４日間までの間５％ ＣＯ２を含む加湿孵卵機中で３７℃にてプレート上で培養する前に分離させ得た。いくつかの場合、長期培養によって自発的な分化、移動能力の損失および生殖細胞能力の低下を生じ得る。ＰＧＣを、高グルコース含量を有し、かつ１０％ ＦＢＳ、５％ニワトリ血清および増殖因子（塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン増殖因子−１、および幹細胞因子を１０ηｇ／ｍｌ、ならびにマウス白血病阻害因子を１０単位／ｍｌ）を補充したＤＭＥＭ中で培養し、その生殖細胞状態を維持した。ＰＧＣを、フィコール密度勾配を用いて性腺間質細胞から分離した。勾配については、１．５ｍｌの遠心管を、ＰＧＣ培地中の１６％フィコールおよび７％フィコールの各０．５ｍｌで連続的に層にし、そして０．２ｍｌの性腺細胞懸濁液で覆った。この勾配を、８００×ｇで３０分間遠心分離した。１６％勾配と７％勾配との間に位置するＰＧＣに富む画分を吸引し、ＰＧＣ培地で洗浄し、そして５００×ｇ、５分間でペレットにした。さらなる精製を、その単離された細胞の短期培養（１５〜３０分）によって達成し、ＰＧＣを懸濁液中に維持しながら、性腺間質細胞の組織培養プレートへの差次的な接着を可能にした。
【００４６】
（トランスジェニックＰＧＣの形質転換および選択）
ＰＧＣを、２０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌのＤＮＡを用いて、３〜４時間脂質（すなわち、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、供給業者の指示書に従う）を用いてか、または２００〜２５０ボルトおよび７５０マイクロファラド〜９５０マイクロファラドの間のマイクロファラドのエレクトロポレーションによって、トランスフェクトした。
【００４７】
２つの試験導入遺伝子をトランスフェクトした。これらの方法を用いて、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下にあるβガラクトシダーゼを試験導入遺伝子として使用して、ドナーＰＧＣの性腺集落形成パターンを追跡した。さらに、ヒトラクトフェリンプロモーター配列を使用した。中腎−性腺領域中に試験導入遺伝子のβガラクトシダーゼの発現を示すレシピエントの雛鳥胚を、１０日間の孵卵で回収した。ドナーＰＧＣを、卵の孵卵前に直接的な胚葉盤の注射を用いてインビボでトランスフェクトするか、または脂質を用いてインビトロでトランスフェクトした。ＰＧＣを、７５μｇのブスルファンを用いてＰＧＣ移入の２４時間前に部分的に不妊した、４８時間孵卵した卵の胚頂部領域に移入させた。
【００４８】
これらの方法を用いて、中腎−性腺領域中に試験導入遺伝子のβガラクトシダーゼの発現を示すレシピエントの雛鳥胚を、１０日間の孵卵で回収した（図４）。ドナーＰＧＣを、インビトロで脂質を用いてトランスフェクトし、７５μｇのブスルファンを用いてＰＧＣ移入の２４時間前に部分的に不妊、４８時間孵卵した卵の胚頂部領域に移入させた。βガラクトシダーゼ発現は、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下にあった。
【００４９】
上記の方法を用いて、１０〜２０％の範囲の初期トランスフェクション率を得た。複数回のトランスフェクションおよび複数回の選択の組み合わせを、トランスフェクション率を上昇するために必要に応じて取り入れる。トランスフェクトしたＰＧＣを分離し、そしてその導入遺伝子構築物が抗生物質耐性をコードするマーカーを保有する場合、抗生物質選択によって精製した。蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）（蛍光マーカーが選択のために使用される場合）を含む他の細胞精製の方法を、使用し得る。
【００５０】
（レシピエントの調製）
産卵後７日までの受精可能な卵を、レシピエント卵として使用した。孵卵前および孵卵７２時間まで（ステージ１９まで）のレシピエント卵を、ＰＧＣレシピエントとして利用した。この期間は、ＰＧＣが活発に移動するヒヨコ発生段階、および始原性腺中に局在する期間までを含む。１００〜２００／μｌの濃度のＰＧＣを、マイクロメータープランジャの制御下でハミルトンシリンジに連結したガラスマイクロピペット（２５〜４０ミクロン）を用いて注射した。培養培地中に懸濁した５μｌ容量のＰＧＣを、注射した。ＰＧＣを、以下のように、雛鳥胚の発生段階に依存して異なる標的化領域に移入し得る：（ａ）受精可能な孵卵していない卵の胚盤葉板の胚芽下腔へ、（ｂ）６〜１２時間孵卵した発生胚の原外胚葉と内胚芽とを分離する胞胚腔へ（ステージ３〜４）、（ｃ）２４〜２８時間孵卵した発生胚に隣接する透明な領域（ａｒｅａ ｐｅｌｌｕｃｉｄａ）（ステージ７〜８）、（ｄ）４０〜４８時間の間孵卵した発生雛鳥胚の頭突起の先端の胚頂部領域へ（ステージ１１〜１３）、（ｅ）培地中の２〜３μｌの４００〜６００ＰＧＣを、マイクロマニピュレーターに連結したガラスマイクロピペット（外径４０ミクロン）を用いて、５５〜７２時間の孵卵で脈管構造に注射する（ステージ１４〜１９）。好ましくは、ＰＧＣを、背側大動脈に注射するが、より大きな周縁静脈および周縁動脈を、注射部位として使用し得る。この段階で、ＰＧＣは、通常、性腺原基に移動する前に脈管系内で循環する。
【００５１】
ドナーＰＧＣの生殖細胞系伝達の速度を上げるために、循環している内因性ＰＧＣを、ＰＧＣが脈管構造内にあるときに血液を吸引することによって血流から物理的に取り出し、ゆえに部分的な不妊を可能にするか、または卵を０〜２４時間の孵卵の間照射して内因性ＰＧＣを排除する。ブスルファンを用いた化学的な不妊もまた、使用し得る。ブスルファンをジメチルホルムアミド中に溶解し、そして５０μｌのゴマ油中の７５μｇを、孵卵開始の２０〜２４時間後にレシピエント卵の黄身に注射して、内因性ＰＧＣの関与を低下させる。不妊の２４時間後、孵卵開始から４８時間でドナーＰＧＣを胚頂部領域に移すか、または孵卵開始から５５〜７２時間で脈管構造に移した。移入させた後、卵を、孵化するまで加湿孵卵機中で３７〜３８℃で孵卵した。
【００５２】
（トランスジェニック生殖細胞系キメラ胚の作製）
中腎−性腺領域中に試験導入遺伝子のβガラクトシダーゼの発現を示すレシピエントの雛鳥胚を、１０日間の孵卵で回収した。１４日のレシピエント胚から単離した性腺からのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の結果は、ドナーＰＧＣを単離し、次いでインビトロでトランスフェクトした場合、ヒトラクトフェリンプロモーター配列の介入について強力なポジティブシグナルを示した。弱いポジティブシグナルを、ドナーＰＧＣをインビボでトランスフェクトした場合のレシピエントの性腺から得た。
【００５３】
（ドナーＰＧＣからのヒヨコの作製）
鳥類の血統がドナーＰＧＣとレシピエント胚との間で異なる場合、得られる生殖細胞系キメラ鳥類を、ドナーＰＧＣが由来する品種と同じ品種と交配させる。このアプローチは、内因性ＰＧＣが由来する鳥類をドナーＰＧＣが由来する鳥類と識別することを可能にする。特定の血統に特徴があり得る表現型特徴（例えば、羽の色）を識別することは、ドナーＰＧＣに由来するヒヨコの簡単な同定を可能にする。例えば、ヒヨコの羽の色の同定は、それらがドナー由来のＰＧＣから産生されたか（黒い羽）または内因性ＰＧＣから産生されたか（白い羽）を示す。性別に関連する性質を加えることは、雌性からの雄性（例えば、頭部の白い斑点）の選択をさらに可能にする。
【００５４】
図４は、試験導入遺伝子のβガラクトシダーゼの発現を示す。表２は、第２の導入遺伝子であるヒトラクトフェリンのＰＧＣ媒介移入の結果を示す。ＰＧＣのトランスフェクションを、上記のようにインビトロで実行するか、または孵卵の０日目にインビボで実行した（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／５８７，１２８；本明細書中に参考として援用される）。インビボトランスフェクションを、孵卵の日に第１の卵の胚盤中に直接ＤＮＡを導入することによって実行した。次いで、この卵を、７．５日孵卵し、そしてＰＧＣを取り除き、培養し、そして第２（レシピエント）卵に移す。ＰＧＣを、培養物中で導入遺伝子ＤＮＡを用いて再度トランスフェクトし得る。次いで、トランスフェクトしたＰＧＣを、レシピエント卵の胚頂部領域（ＧＣＲ）に移した。このレシピエント卵を孵卵し、１４日目の雛鳥胚組織を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって導入遺伝子の存在について試験した。
【００５５】
（表２：１４日のヒヨコにおけるヒトラクトフェリンＤＮＡの検出）
【００５６】
【表２】
鳥類系は、卵のアルブミン画分もしくは黄身画分での遺伝子産物の発現、またはトリの他の組織での遺伝子産物の発現を可能にする。鳥類種（特に、ニワトリ）は、標的産生系として現在利用可能な家畜種の全てではないがほとんどのものよりも、固有の利点を提供する。この生殖能力および短い発生（ｇｅｓｔａｔｉｏｎ）時間は、トランスジェニック産生のために現在利用される他の種と比較して、潜在的に有利である。
【００５７】
本明細書中に記載される方法は、ニワトリに対して標的化された生殖技術を補助する代替物を提供し、ここで、遺伝子改変は、生殖細胞集団に対して直接的に標的化される。このアプローチを使用して、鳥類の生殖細胞系における外来遺伝子介入のための方法は、安定な介入事象の頻度を改善する技術を介して促進される。これらとしては、標的化された発現のための効率的なベクターおよびプロモーターを有する適切な核酸配列の構築、およびレシピエントニワトリ胚に移入する前に安定な成分を同定および単離する方法と組合わせた、生殖細胞の複数回のインビトロトランスフェクションによる遺伝子送達効率の改善を含む。
【００５８】
この方法は、部分不妊後にドナーＰＧＣまたは内因性ＰＧＣ由来の雛鳥を産生し、そして雛鳥間で区別するための系を提供する。この技術は、２５〜７８％の範囲にわたる高い比率の生殖細胞系列伝達を伴ってドナーＰＧＣ由来のトリを産生し、この場合、産生された雛鳥のうち平均してほとんど半分（４９％）が、ドナー由来であった。視覚的マーカーとして、羽の色を組み込むことは、内因性雛鳥からドナーを同定して区別するための機構をさらに提供し、産生系を単純化する。さらに、この手順は、育種後に産生される全ての雛鳥に対してＤＮＡ分析を行う必要性を排除する。これにより、時間と資材が抑えられ、それにより生殖細胞系列トランスジェニックニワトリを産生する費用を低減する。さらに、特定の羽着色が性関連形質に付随する場合、その雛鳥は、潜在的な２つの性に基づき、産生効率を最大にするために、容易に性別を同定され、分離され、そして成長させられる。例えば、所望の形質または遺伝子産物が、発現について特異的に、卵産生に対して標的化される場合、性関連の羽形質は、雛鳥が数日齢の場合に、産生鳥の早期選択および不要な雛鳥の排除を可能にする。さらに、発現プロフィールは、孵化の１月以内に個々の雌性トリから確立され、実際的な産生予測を提供する。上記の因子の全てが、管理効率の増加を促進し、これは、本質的に低い産生費用の動物に対する全体の産生費用の低減と同等である。
【００５９】
（実施例４：遺伝子導入（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ）および保存のための鳥類ＰＧＣ）
ＰＧＣは、精子および卵原細胞の前駆細胞である。鳥類種において、ＰＧＣは、起源が胚外であり、移動は、受動ステージへと続く胚半月（ｇｅｒｍｉｎａｌ ｃｒｅｓｃｅｎｔ）領域への能動移動の組合せであり、この受動ステージにおいて、ＰＧＣは、脈管系において一時的に循環し、性腺原基へ能動移動し、ＰＧＣ増殖および性腺性分化を生じる。
【００６０】
ニワトリにおいて、性分化は、胚発生から７〜９日目の間に形態学的に明らかとなる。他の鳥類種の性分化点は、性腺の視覚検査により決定される。ニワトリにおける性腺発生のこのステージは：ａ）回収されるＰＧＣの数を最大化するため、ｂ）性腺性発生における形態学的差異が明白であるこのステージにおいて、移動能力（ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｃａｐａｃｉｔｙ）をＰＧＣがまだ保持しているか否かを決定するため、ｃ）生殖細胞系列伝達における品種優性の効果を決定するため、そしてｄ）ＰＧＣドナー由来のニワトリの生殖細胞系列伝達における反対の性への移行の効果を研究するために標的化される。この手順のフローチャートは、図１に示される。６．５〜８．５日目の胚からの性腺を、単離し、そして形態学的に性別により分離した。ＰＧＣを、標準のトリプシン処理（ｔｒｉｐｓｉｎｉｚａｔｉｏｎ）手順および機械的破壊により単離した。ＰＧＣを、その性腺間質細胞と共に、３７℃で５％ＣＯ２中にて２日間、１０％ＦＢＳ、抗生物質および増殖因子（ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、１０ηｇ／ｍｌのＳＣＦ、および１０Ｕ／ｍｌのｍＬＩＦ）を補充した５％ニワトリ血清の存在下で高グルコースＤＭＥＭ中で共培養した。このＰＧＣを、１．５ｍｌの遠心分離チューブ中で、連続して、０．５ｍｌずつの１６％および７％のフィコールを重層して、０．２ｍｌの細胞懸濁液を上に載せたフィコール勾配を使用して、そして３０分間８００×ｇで回転させて単離した。生殖細胞系列キメラを作製するために、約２０００のＰＧＣを、４４〜４８時間で透明部内に移し、そしてレシピエント卵の胚半月部領域を、７５μｇのブスルファンで２４時間インキュベーションで処理した。ドナーＰＧＣ由来の雛鳥を、ＰＧＣドナーとして使用された品種と胚レシピエントとの間の羽の色の差異により区別した。
【００６１】
ドナー由来の雛鳥の生殖細胞系列伝達は、親ストックが一緒に育種された場合に平均伝達率４９％（９７／１９８）で、実験群の間で３１〜７８％の範囲に及んだ。このうち、９２％の雛鳥は、交雑しており、８％が純粋なドナー由来の雛鳥であった。ＰＧＣが白色レグホーン胚に由来し、そして着色した品種に移入される場合、生殖細胞系列伝達率は、４７％であり、比較として、ロードアイランドレッドまたは横斑プリマスロックのいずれか由来のドナーＰＧＣが白色レグホーン胚に移入される場合は１７％であった。レシピエントが反対の性別（７％）と比較して同じ性別のＰＧＣ（４０％）を受容した場合には、より高い比率の伝達もあった。
【００６２】
安定な組込み体の効率的選択と組み合わせて、異種核酸配列をＰＧＣに導入する能力を組み込むことにより、生物薬剤の産生のための基本的な技術が提供される。さらに、この生殖技術は、品種の産生を改善するため、疾患抵抗性を付与するため、そして鳥類農業における生産効率を増大するために有用である。さらに、ＰＧＣ移入は、鳥類保存プログラムに有用である。保存目的のために、ニワトリ（季節に関係なく高度な生産性の鳥）は、「汎用レシピエント」として使用され、１年中、保存のための魅力的な繁殖プログラムを増強する代替のシステムを提供する。
【００６３】
哺乳動物ＰＧＣと異なり、鳥類ＰＧＣは、起源が胚外である。ニワトリにおける産卵時において、産卵された受精卵の胚葉板を含む４万〜６万個の細胞内に、概算で約５０のＰＧＣが存在する。それらの移動パターンは、能動移動期と受動移動期の組合せを含む遠回りの経路に従う。最初の２４時間の孵卵の間、胚葉板の透明部における約５００個の細胞は、発生胚の後部端を樹立するために集まる。この集合から、集合領域に対して反対の（ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）方向で前方端に向かって原始線条が発達する。またこの時点で、ＰＧＣは、発生する胚から独立して、能動的に、この集中から離れて前方端に向かって移動し、そして孵卵から約２〜２．５日で脈管に入る前に、頭褶上の胚半月部領域に集まる。その後、ＰＧＣは生殖隆起に達するまで循環系内を受動的に移動し、この生殖隆起にて脈管系を離れ、そして能動的に移動して発生する性腺に転移増殖（ｃｏｌｏｎｉｚｅ）する。
【００６４】
その移動期の間または性腺原基の転移増殖後に空間−時間的局在化に基づいて、インビボでのトランスジェニック操作のためにＰＧＣを直接標的化するいくつかの方法が記載されている。いくつかのアプローチは、脂質でカプセル化した異種核酸配列を、受動的移動期の間に胚半月部領域または胚の脈管系中に直接注入することを包含する。あるいは、この胚半月部領域、脈管系、および性分化の前の性腺からＰＧＣを回収する方法もまた開発されている。本明細書中に記載される方法は、性腺ＰＧＣを、以前に記載したプロトコルと比較して、より胚発生後期でかつ性分化後に直接標的化することを包含する。本明細書中に記載される結果は、驚くべきものである。なぜなら、哺乳動物における知見と同様に、より以前の報告は、ＰＧＣが、性腺局在化の直後にその移動能を失うということを示していたからである。このデータは、精製されて性選択されたＰＧＣが、レシピエント卵の胚半月部領域への移入後に移動することを示していた。胚発生後期におけるＰＧＣが、特に性の遺伝的分化が確立された後に移動能力をなお保持していることは期待できない。
【００６５】
操作を、ニワトリにおける胚発生の特定のステージにおいて標的化し、ここで雄性腺と雌性腺との間の初期の形態学的差異が明白になった。この研究は、（ａ）ＰＧＣが性腺性分化のこのステージにおいて移動能をなお保持するか否かを決定するように；（ｂ）移動能の損失なしに回収され得るＰＧＣの数を最大にするように、（ｃ）ドナーＰＧＣがレシピエント胚の品種と異なる場合に、異なる品種が、生殖細胞系列伝達に対して品種優性を示すか否かを決定するように；そして（ｄ）ＰＧＣを同様の性別または反対の性別のレシピエントに移入することが、生殖細胞系列伝達の比率に影響を及ぼすか否かを決定するように設計される。
【００６６】
（ドナー原基生殖細胞の調製）
ロードアイランドレッド、横斑プリマスロックおよび白色レグホーン由来のニワトリ受精卵を、加湿孵卵機で３７〜３８℃にて、そして８５〜８８％の相対湿度で８日まで孵卵した。性腺を、生殖隆起から中腎を採取し、そして低出力倍率下で微小先端鉗子を使用してその中腎から性腺を切り出すことにより単離した。７〜７．５日の孵卵の間に、雌において発生している性腺は、右に比べてわずかに大きい左の性腺を示す。一方、分化している雄性性腺は、同様のサイズであり、２つの性間の形態学的識別を提供する。
【００６７】
性腺を、品種（白色種または着色種）に基づいて、そして性別によりグループ分けし、そして標準のトリプシン処理手順により分散させた。ＰＧＣを、性腺間質細胞と、組織培養プレートにおいて３７℃にて５％ＣＯ２加湿孵卵機中で４日間まで共培養した。ＰＧＣを、上記の実施例３に記載されるようにＤＭＥＭ中で培養した。
【００６８】
ＰＧＣ（他の性腺間質細胞と比較して大きい（１４〜２０ミクロン））を、上記の実施例３に記載されるように、フィコール密度勾配を使用して分離した。
【００６９】
（過ヨウ素酸−Ｓｃｈｉｆｆ染色）
性腺細胞を、４ウェルプレートで培養して、３．７％ホルムアルデヒドで１５分間固定し、そしてＰＢＳで２回洗浄した。ニワトリＰＧＣは、高レベルのグリコゲンを示し、そして過ヨウ素酸−Ｓｃｈｉｆｆ染色を使用して容易に同定される。キットとして供給される過ヨウ素酸−Ｓｃｈｉｆｆ染色システム（Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、残余の性腺を含む間質細胞からＰＧＣを区別する。
【００７０】
（レシピエントの調製）
ＰＧＣ採取の日に、白色レグホーンまたはロードアイランドレッド由来の受精卵を、レシピエントとして機能させるために孵卵した。内因性ＰＧＣの含有を減らすために、化学的不妊剤ブスルファンを、必要に応じて使用して、そのレシピエントを部分的に不妊する。ブスルファンをジメチルホルムアミドに溶解し、孵卵の開始２４時間後に、５０μｌのゴマ油中の７５μｇのブスルファンを、レシピエント卵の卵黄中に注入した。不妊後２４〜３０時間の間に、ドナーＰＧＣを、発生しているレシピエント胚の頭部突起に対して先端の胚半月部領域に注入した。５〜１０μｌ容量のＰＧＣ（１μｌあたり１００〜２００のＰＧＣ）懸濁液を、各卵に、マイクロメーター制御のＨａｍｉｌｔｏｎシリンジに取り付けられた５０ミクロン（ＯＤ）のガラスマイクロピペットを使用して注入した。
【００７１】
移した後、卵を、パラフィンでシールし、加湿孵卵機中にて３７〜３８℃でさらに１８日間孵卵し、そして孵化するように孵卵機に移した。
【００７２】
（ドナーＰＧＣからのニワトリ（ｃｈｉｃｋ）の生成）
６つの実験複製の各々から無作為に選択された繁殖対を、キメラ親ストックとして使用した。ロードアイランドレッドを有する白色レグホーンレシピエントとＢａｒｒｅｄ ＲｏｃｋドナーＰＧＣとを、互いに交配させ、そして白色レグホーンドナーＰＧＣを有するロードアイランドレッドレシピエントを、一緒に交配させた。これらのトリを、囲って交配させ（ｐｅｎ ｍａｔｅｄ）、そして各繁殖複製由来の卵を、週ベースで孵化させた。第１世代のニワトリを、これらのトリ、またはこれらのトリ由来の交雑種の交配に帰する特徴的な特性に基づいて、ドナー由来または内因性ＰＧＣ由来と同定した。
【００７３】
（結果および統計学的分析）
χ２法を使用して、＜０．０５の有意なレベルでのデータを分析した。
【００７４】
レシピエント卵の平均孵化速度は、９〜６７％の範囲で３７％であった。
【００７５】
特性マーキングによってドナーＰＧＣ由来であると同定された第１世代のニワトリは、４９％（９７／１９８）の平均伝播速度を有する交配群の中で１７〜７１％の範囲にわたる。さらなる孵化からのデータを、表３に示す。
【００７６】
（表３：ＰＧＣレシピエントの対から産生されるニワトリ）
【００７７】
【表３】
【００７８】
ＰＧＣが白色レグホーン胚由来であり、有色レシピエントに移された場合、生殖細胞伝播速度は、有色のＰＧＣが白色レグホーンに移された場合の１７％と比較して、４７％であった。
【００７９】
レシピエントおよびＰＧＣの両方が同じような性であった場合、生殖細胞伝播速度は、レシピエントが逆の性のＰＧＣを受けた場合の７％と比較して、４０％であった。
【００８０】
雄生殖腺と雌生殖腺との間の形態学的な差異が明白である場合のニワトリ胚発達の特定の段階での操作の標的化は、レシピエントニワトリ胚の胚半月領域に移された場合、ＰＧＣは、性に関係なく、なお移動能を残すことを示した。以前の報告を考慮すると、この結果は、驚きである。この手順のさらなる利点は、発生の初期段階で得られ得るＰＧＣより多くのＰＧＣが生殖腺から取り出されるということである。
【００８１】
本研究で得られた結果は、白色レグホーン由来のＰＧＣが、ロードアイランドおよび横斑ロックの両方の生殖細胞の改善と比較して、より高い（＜０．０５）伝播性を有することを示唆し得る。このことは、品種の優性に帰し得るが、他の因子（例えば、品種の優性以外の発達の差異（ロードアイランドおよび横斑ロックは、白色レグホーンと比較して早く成熟する））が関与し得る。さらに、ＰＧＣの性がレシピエントに類似する場合、伝播速度はより高い（＜０．０５）ようである。
【００８２】
このデータは、本明細書中に記載される方法が、産生品種を改善し、疾患耐性および産生効率を付与するための効率的な生殖細胞操作を提供する、トリ農業についての代替的な補助再生技術を示す、ということを示した。トランスジェニック動物は、適切な調節性プロモーターの制御下で、異種核酸配列を生殖細胞集団に直接導入し、そして、トランスジェニックＰＧＣをレシピエント卵に移す前に安定な成分を選択することによって産生される。この系の有意な利点は、操作された生殖細胞由来のニワトリを同定するための羽色を組み込み、そして性関連羽色特性を使用して後にそれらを選択することによって、群の管理を増強しかつ全体的な産生費用を減少させることが使用され得るということである。
【００８３】
上記で議論されるように、ＰＧＣ法はまた、鳥類保存プログラムを増強するための代替的な補助再生技術を提供する。なぜなら、非周期的な高度生産性であるトリであるニワトリは、１年中鳥類保存についての係留繁殖プログラムを増強するための代替系を提供する「普遍的なレシピエント」として使用されるからである。
【００８４】
（実施例５：体組織生成のための幹細胞としてのトリＰＧＣ）
幹細胞は、胚生成および成体再生の基本単位である。外因性シグナルに応答する内因性能力が、それらの直系発生を調節する。哺乳動物において、始原生殖細胞（ＰＧＣ）は、培養物中において未分化で連続的な増殖であり続ける能力を有し、そして３つの胚性生殖層の形成に関与する多能性な能力を示す。
【００８５】
本明細書中に記載されるデータは、哺乳動物ＰＧＣと鳥類ＰＧＣとの間の類似性を示し、そして、生殖腺の性分化の初期段階におけるニワトリＰＧＣがなお幹細胞潜在性を保持し、インビトロで自発的に分化し得、そして胚系統分化が達成された後、インビボで発達する胚の種々の組織に寄与することを示す。
【００８６】
ＰＧＣは、神経および間葉の系統に分化する傾向を示した。明白なタグを提供する蛍光導入遺伝子マーカー（ＤｓＲｅｄ）を使用して、インビボでの観察可能な局在パターンならびに多能性および可塑性の程度を、発達する胚子において達成した。このデータは、性的に分化する６．５〜８．５ｄのニワトリ生殖腺から単離したＰＧＣが、不可逆な体性系統に付されず、そしてインビボでの生殖細胞層全てになお寄与し得る、ということを示す。さらに、ニワトリにおける脈管構造は、限定されないが、発達する胚子の種々の組織でのＰＧＣの広範な局在、および引き続く多系統関連を容易にする。本明細書中に記載される生殖腺ＰＧＣは、多系統分化についての外因性シグナル調節因子に応答する内因性の能力を保持する。
【００８７】
以下のために、実験を設計した：（ａ）生殖腺性分化の初期段階におけるニワトリＰＧＣが、すでにその体性系統に付されているか否か、またはこのニワトリＰＧＣが、幹細胞潜在性をなお保持しインビボで他の体性系統に分化しかつインビボで発達する胚の種々の組織に分化するか否かを決定するため；（ｂ）ＰＧＣの性がその系統関連をもたらすか否かを決定するため；そして、（ｃ）ニワトリ胚における脈管系が組織コロニー化に受容可能な経路を提供するか否かを決定するため。
【００８８】
（生殖腺の単離）
新たに産まれた横斑ロック受精卵を、加湿孵卵機中にて、３７〜３８℃および８５〜８８％の間の相対湿度で８．５日目まで孵卵した。生殖腺を、孵卵の７〜８日（ステージ３１〜３４）の間の発達するニワトリ胚から回収した。中腎を生殖隆起から回収し、そして低倍率下で鋭い先端のピンセットを使用して中腎から生殖腺を切り裂くことによって、生殖腺を回収した。生殖腺を、性に従って分類した。雌性は、右の生殖腺に比べて大きな左の生殖腺を有したが、雄性は、同様のサイズを示した。
【００８９】
（生殖細胞の培養）
ＰＧＣを、標準的なトリプシン処理手順に従って単離し、そして５％ ＣＯ２を有する加湿孵卵機中で３７℃で、性腺間質細胞と共に、または性腺間質細胞を伴わずに、組織培養プレート中で培養した。ＰＧＣを培養し、そして上記の通りにｆｉｃｏｌｌ密度勾配を用いて単離した。過ヨウ素酸シッフ染色を、上記の通りに実施した。
【００９０】
（ＰＧＣのトランスフェクション）
インビボでの局在パターンおよび系列の関与を評価するための明白なタグを提供するために、ＰＧＣをＤｓ Ｒｅｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でトランスフェクトして、細胞質の赤色蛍光を発現させた。１５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ １（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）中に１０μｌの最終容量になるように希釈し、そして１μｇの直鎖化ＤＮＡ（Ｄｓ Ｒｅｄ）をまた、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ １（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）中に同じ最終容量になるように希釈した。この調製物を合わせ、そして３０分間にわたって室温でインキュベートし、そしてウェル中に滴下した。培養培地を４時間後に添加して毒性を阻害した。連続した何回かのトランスフェクションを用いて、トランスフェクション率を改善した。
【００９１】
（インビトロ分化）
インビトロで多能性能力を確立するために、ＰＧＣを性腺間質共存培養から取り出し、そして増殖因子補充物の非存在下での自然分化を誘導した。
【００９２】
（体細胞キメラの産生）
インビボでの多能性（ｍｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）および柔軟性を、２．５日齢〜３．５日齢の白色レグホーン胚をレシピエントとして用いて決定した。移入の前に、発生中の雛鳥胚を可視化するために、鈍角の端部において卵に窓を開けた。２μｌ〜３μｌの培地中の約４００ＰＧＣ〜６００ＰＧＣを、マイクロマニピュレータに取り付けたガラスマイクロピペット（４０ミクロンＯＤ）を用いて孵卵６０時間〜８４時間の間に血管系に注入した。ＰＧＣ懸濁物を、発生中の胚の血管系に、例えば、背側大動脈または周縁部静脈および周縁部動脈に注入した。卵の窓をシールし、そして卵を加湿孵卵機中で３７℃で孵卵した。ＰＧＣの局在および複数系列関与を、蛍光Ｄｓ Ｒｅｄマーカーを用いて胚子（ｆｅｔａｌ）発生の７日目〜９日目の間および孵化１日後に決定して、羽色への影響もまた決定した。
【００９３】
（ニワトリ生殖細胞の培養特徴）
コロニーは、反復継代培養において、有糸分裂的に活性な性腺間質細胞の存在下で、３ヶ月間にわたって増殖した。多能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）生殖細胞は、一様に丸く、そして間質層にも他のＰＧＣにも強固には付着しなかった。コロニーは多層であり、そして間質層からよく遊離した。単層の支持の喪失によって、阻害因子補充物および増殖因子補充物の両方の存在下でさえ、何らかのレベルの自然分化がもたらされた。長期培養物はまた、過ヨウ素酸シッフ染色強度における減少を示した。
【００９４】
（インビトロでの多能性）
性腺間質支持ならびに増殖因子および阻害因子の影響の非存在下では、ＰＧＣは、いくつかの細胞系列に自然に分化した。ＰＧＣ培養物の大多数は、線維芽細胞様細胞および間葉型細胞へと分化した。その後、これらの細胞の長期培養は、骨、軟骨、筋肉および未成熟脂肪細胞に形態学的に類似した種々の結合組織細胞型をもたらした。ＰＧＣが増殖して、単層への結合が最少であるかまたはない、小さな緻密な細胞クラスターになった場合、これらはしばしば、神経細胞へと分化して、広範囲のネットワークをこれらの間に形成した。ＰＧＣはまた、コンフルエント時に、上皮単層へと時々分化した。
【００９５】
（インビボでの多能性および柔軟性）
血管系を移入経路として用いて、発生中のニワトリ胚子におけるＰＧＣの広範囲の局在および系列関与を促進した。これらは、心臓、肺および血液において一貫して観察され；そしてこれらは、Ｄｓ Ｒｅｄ発現に基づいて、それぞれ、心臓、肺および血液の２０％まで、５％までおよび４０％までに寄与を有すると評価された。これらはまた、中脳、眼、骨髄、筋肉、性腺、中腎および皮膚に局在することが観察された。系列関与は、筋肉、皮膚、骨髄、性腺、中腎および中脳における蛍光によって異なるレベルで明らかであった。孵化したニワトリの羽色パターンによってまた、生殖細胞からの何らかの寄与が示された。性腺間質単層の支持の非存在下で継代培養した生殖細胞は、インビボでの複数系列関与の低減、特に性腺関与に取り込まれるそれらの能力を失うことを示した。
【００９６】
このデータは、性分化中の７〜８．５日のニワトリ性腺由来の単離されたＰＧＣが、精子形成および卵子形成へと向かう不可逆的な体細胞系列には付されていないことを示す。これらの細胞は、インビトロで分化する多能性能力を依然として保持し、そしてインビボで全ての生殖層へと寄与する柔軟性を示す。
【００９７】
初代培養および継代培養の両方の生殖細胞は非常に優勢に、インビトロで間葉系列および神経系列へと、続いてそれらの最終的な体細胞状態へと分化した。ドナーＰＧＣの性別がレシピエント胚とは異なっていた場合に、増殖および系列の関与が影響されたという明らかな証拠は存在しない。
【００９８】
ニワトリにおける血管系は、制限しないが、ＰＧＣの広範な局在を促進して、ＰＧＣが、発生中の胚子における組織生成および器官形成に寄与するのを可能にする。これらの細胞は、それらの系列分化を決定する環境を制御する外因性の調節因子によって利用および再プログラムされ得る。ヒトは、鳥類とも、幹細胞研究のために使用される他の動物モデルとも、類似の基本的身体プランを共有しないが、同じ生化学的機構から生じたようである相同な部分を共有している。従って、ニワトリのＰＧＣモデルは、組織操作、胚の作製、成体再生および遺伝子治療における幹細胞の適用の開発のための他の動物モデルに対する有用な代替物である。
【００９９】
他の実施形態は、添付の特許請求の範囲の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】図１は、ドナーＰＧＣを単離し、このドナーＰＧＣの移入用のレシピエントの卵を調製するための手順を示すフローチャートである。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、ドナーＰＧＣを受けた２対の品種のレシピエントから産まれた雛鳥の写真である。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、ロードアイランドレッドおよび横斑ロックＰＧＣの両方の、白色レグホーンレシピエントへの移入から産まれた雛鳥の写真である。図３Ａは、ロードアイランドレッドの雄と横斑ホワイトロック（Ｂａｒｒｅｄ Ｗｈｉｔｅ Ｒｏｃｋ）の雌（Ｒｅｄｉ−Ｌｉｎｋ Ｃｒｏｓｓとして市販されている）から産まれた、純粋なドナーにより誘導される雛鳥を示す。雌は、黒色であり、雄は、横しま色模様である。図３Ｂは、純粋なドナーから誘導された雛鳥を示す。ロードアイランドレッドの雄と横斑ロックの雌の交配から、伴性の雛鳥が産まれた。この交配は、頭部に白い斑点を有する雄の雛鳥を生じたが、雌はそうではなかった（Ｒｅｄ−Ｒｏｃｋ Ｃｒｏｓｓから世間一般に市販されている）。白い雛鳥は、白色レグホーンレシピエントの内因性生殖細胞から誘導された。
【図４】図４は、試験導入遺伝子βガラクトシダーゼの発現を示す、トランスジェニック雛鳥胚の写真である。ＰＧＣは、この導入遺伝子でトランスフェクトされ、レシピエントの卵に移入された。このレシピエントの雛鳥は、孵卵の１０日目に、導入遺伝子の発現について試験するために回収された。βガラクトシダーゼの発現は、中腎性腺領域において検出された。ドナーＰＧＣは、脂質を使用してインビトロでトランスフェクトされ、４８時間孵卵した卵の性腺の半月領域（これは、７５μｇのブスルファンで、ＰＧＣ移入の２４時間前に部分的に不妊処理された）に移入された。βガラクトシダーゼの発現は、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下であった。
Claims (25)
- 異種核酸を含む、単離された鳥類性腺細胞。
- 前記細胞が、胚細胞である、請求項１に記載の性腺細胞。
- 前記細胞が、性腺始原生殖細胞である、請求項１に記載の性腺細胞。
- 前記細胞が、卵巣細胞である、請求項１に記載の性腺細胞。
- 前記細胞が、精巣細胞である、請求項１に記載の性腺細胞。
- 核酸分子を鳥類種のゲノムに導入する方法であって、雛鳥胚から得られた単離された性腺細胞の集団を該核酸分子と接触させて、トランスフェクトされた性腺細胞を得る工程および該トランスフェクトされた性腺細胞を、レシピエント鳥類受精卵に移入する工程を包含する、方法。
- 前記集団が、少なくとも０．５％の始原生殖細胞を含む、請求項６に記載の方法。
- 前記集団が、少なくとも１％の始原生殖細胞を含む、請求項６に記載の方法。
- 前記集団が、少なくとも５０％の始原生殖細胞を含む、請求項６に記載の方法。
- 前記集団が、少なくとも９０％の始原生殖細胞を含む、請求項６に記載の方法。
- 前記雛鳥胚が、２７を超える胚ステージにある、請求項６に記載の方法。
- 前記雛鳥胚が、発生２９〜３６の胚ステージにある、請求項６に記載の方法。
- 前記トランスフェクトされた性腺細胞および前記鳥類受精卵が、同じ種から誘導される、請求項６に記載の方法。
- 前記トランスフェクトされた性腺細胞および前記鳥類受精卵が、異なる種から誘導される、請求項６に記載の方法。
- 前記鳥類受精卵が、ステージ７〜８の間にある、請求項６に記載の方法。
- 前記鳥類受精卵が、ステージ１３〜１９の間にある、請求項６に記載の方法。
- 前記雛鳥胚の品種が、白色レグホーンである、請求項６に記載の方法。
- 前記雛鳥胚の品種と前記レシピエント受精卵の品種とが異なる、請求項６に記載の方法。
- 前記鳥類受精卵が、前記トランスフェクトした性腺細胞を移入される前に部分不妊される、請求項６に記載の方法。
- 前記鳥類受精卵を、前記トランスフェクトされた性腺細胞を移入する前にブスルファンと接触させる、請求項６に記載の方法。
- 前記トランスフェクトされた性腺細胞を、前記レシピエント鳥類受精卵の胚頂部に直接移入する、請求項６に記載の方法。
- 前記性腺細胞の性別と、前記レシピエント鳥類受精卵中の胚の性別とが同じである、請求項６に記載の方法。
- 単離された鳥類性腺細胞であって、内因性遺伝子の遺伝子破壊を含み、ここで、該破壊は、機能的遺伝子産物の産生を阻害する、鳥類性腺細胞。
- 異種始原生殖細胞を含む、鳥類卵。
- 請求項１に記載の細胞を含む、鳥類卵。
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