KR20020013461A - 특정 성장인자를 사용한 조류 원시배세포의 연장된 배양법및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 조류 PGC를 조직 배양에서 장기간 유지하는 배양시스템을 제공한다. 이 배양시스템은 LIF, bFGF, IGF-I 및 SCF를 사용한다. 생산된 PGC는 유전자도입 및 키메라 조류, 특히, 닭 또는 칠면조의 생산에 유용하다.

Description

특정 성장인자를 사용한 조류 원시배세포의 연장된 배양법 및 이의 용도{PROLONGED CULTURING OF AVIAN PRIMORDIAL GERM CELLS USING SPECIFIC GROWTH FACTORS AND USE THEREOF}

최근, 키메라성의 클로닝된 유전자도입 동물을 만들기 위하여 많은 연구가 집중되고 있다.

특히, 지난 20년간 가축 종의 게놈을 변형하는 분야가 활발히 연구되어 다양한 성과가 얻어졌다. 예를 들어, 유전자도입 돼지, 소 및 닭을 얻는데 이러한 연구가 집중되었다. 현재까지는 관심있는 유전자를 갖는 DNA 구조물을 단일 세포 배에 직접적으로 미세주입하여 대다수의 이용가능한 유전자도입 동물을 얻어왔다. 그러나, 미세주입 기술이 성공적이었다고는 하나, 그러한 방법은 비용이 많이 들고 효율이 낮은 경우가 종종 있어 불리하다.

최근, "녹아웃(knock-out)" 마우스를 제조하기 위한 ES(embryonic stem) 세포 기술이 성공하여, 가축 종의 ES 세포 및 원시배세포(PGCs)용 조직 배양시스템의 개발에 연구 촛점이 맞춰지게 되었다. 연속 배양에서 ES 미분화 세포를 유지하는 능력은, 이러한 세포의 생체 외 트랜스펙션과, 이상적으로는 키메라 동물을 생성하는 성장 배아의 내부 세포로 전이되기 전에 원하는 유전자를 함유하는 트랜스펙션된 세포를 선택하는 것이 가능하도록 한다. 이상적으로, 얻어진 키메라 동물의 적어도 일부는 배선을 통하여 DNA 구조물을 분리할 수 있고, 따라서 유전자도입 자손을 얻을 수 있을 것이다. 그러나, 현재까지 표적화된(위치특이적) 융합은 마우스에서만 달성되었다. 현재, 다른 동물 종에서의 표적 DNA 융합 능력은 제한되어 있다. 그러나, 이런 방향으로의 연구가 진행중이며, 조만간 실현될 것이다.

특히, 경제적 중요성이 크기 때문에 갈리나세아(Gallinacea) 및 닭의 게놈의 개선에 촛점을 맞추어 많은 연구가 진행중이다. 3년전에 유전자도입 닭의 생산에 대한 연구 상태의 상당히 완전한 재검토가 발표되었다(Sang, Trends in Biotech., 12:415-420(1994)). 이에 언급된 바와 같이, 유전자도입 닭을 생산하기 위한 조사에는 기본적으로 두 가지 경로가 있다. 이들 방법은 게놈 조작을 하는 시기(즉, 배치전또는 배치후)에 기초하여 구별이 가능하다. 배치 후의 방법은 공여자 ES 및 PGC를 수혜자 배로 전이시키는 것을 포함한다. 또한, 두 경로에서, 관심있는 유전자를 갖는 레트로바이러스 벡터로 공여자 세포를 감염시킴으로써 대부분의 작업이 이루어진다.

배치전게놈 조작을 포함하여 이루어지는 첫번째 접근방식은 혼합된 및/또는 비능률적인 효과를 얻는다. 예를 들어, 난소의 난모세포 감염(Shuman, andShoffner,Poultry Sci.,65:1437-1494(1986)) 및 플라스미드 DNA를 사용한 정자의 사전-배양(Gruenbaum et al.,J. Cell. Biochem Supp.,15:194(1991))은 비능률적이었고, 반복되지 않았다. 또한, 리포펙션(lipofection)을 통해 정자 세포가 플라스미드 구조물로 트랜스펙션되는 것이 증명되었다(Squires and Drake,Anim. Biotech.,4:71-78 1993). 그러나, 배선 전달은 보고되지 않았다.

또한, DNA를 배 디스크로 직접 미세주입한 후 배를 배양하는 방법은, 0.1%의 살아있는 유전자도입 키메라 새를 얻으며(Sang,W., Trends in Biotech.,12:415-42(1994)), 한마리의 새가 자손 중 3.4%에 트랜스유전자를 전달하는 것으로 보고되었다(Love et al.,Bio/Technology,12:60-63(1994)). 나이토(Naito) 등(J. Reprod. Fertil., 102:321-325(1994))이 동일한 접근 방식을 취하였다. 그러나, 이와 유사하게 트랜스유전자의 배선 전달은 보고되지 않았다.

배치후게놈 조작을 포함하여 이루어지는 두번째 접근방식은 더 나은 결과를 얻었다. 복제 가능한 레트로바이러스 벡터를 놓은 알에 주입하여 생성시킨 키메라 새는 이들 자손 중 1% 내지 11%에 배선을 전달하는 것으로 나타났다(Salter et al.,In Manipulation of the Avian Genome,Etches, RJ et al., eds. pp 138-150 CRC Press(1993)). 복제-결함 레트로바이러스 벡터 및 놓은 알로의 주입을 사용하여, 더욱 고무적인 결과로, 이들의 자손에게 2 내지 8%의 빈도로 벡터를 전달하는 8%의 키메라 새 숫놈을 얻었다(Bosselman et al., Science, 243:535-535(1989)).

그러나, 트랜스펙션을 촉진하기 위하여 공지된 시약의 존재 하에 플라스미드구조물을 놓인 알에 주입하면, 안정된 융합체, 구조물 또는 유전자도입 새를 얻지 못하였다(Rosenblum and Cheng, J.,Cell Biochem Supp.,15E 208(1991)). 일반적으로, 유전자도입 닭을 얻기 위하여 레트로바이러스 벡터를 사용하는 방법은, 이와 관련된 큰 단점으로 인해 널리 보급되어 있지 않다. 이러한 단점에는, 그 속에 안정하게 도입될 수 있는 클로닝 삽입물의 크기에 대한 제한과, 내생 바이러스 또는 다른 조류 백혈증 바이러스와의 재조합을 유도할 가능성이 있다는 더욱 심각한 잠재적 단점이 포함된다.

이들 방법 모두의 큰 문제점은, 닭 ES 및 PGC용 장기간 배양시스템은 상대적으로 만들기가 어렵다는 점이다. 본 발명자가 아는 바로는, 키메라 새를 성공적으로 얻기 위한 조류 PGCs 최장 배양 기간은 5일 미만이었다.

이전의 PGC 배양 방법은 성장인자, 특히 LIF 또는 IGF-I의 사용하였다. 그러나, 주목되는 바와 같이, 이러한 방법은 유전자도입 PGCs의 생성을 용이하게 하므로 우세한 관계, 연장된 배양 기간을 제공할 수 없다.

장기간 배양을 이루는데 있어서의 문제점에도 불구하고, ES 및 PGC 세포는, 이러한 세포를 복제 가능 및 무능 레트로바이러스 벡터로 감염시켜 키메라를 만들기 위하여 성공적으로 사용되었다. 또한, 상기한 바와 같이, 새롭게 얻은 포배엽 세포를 수혜자 배에 주입하여, 키메라 생식선을 갖는 새를 얻었다(Carsience et al., Devel., 117:669-675(1993)). 포배엽 세포는 리포펙션을 통하여 효과적으로 트랜스펙션시킬 수 있으며, 이어서 수혜자 배로 전이시킬 수 있다. 그러나, 트랜스펙션된 세포의 배선 전달은 보고되지 않았다.

또한, 문헌(Pain et al.,Devel.,122:2329-2398(1996))은 포배엽 세포로부터 얻어진 추정되는 닭 ES 세포가 존재함을 최근 증명하였다. 이들은 또한, 이들 세포가 배양에서 35 계대배양동안 마우스 ES 세포에 대한 모노클로날 항체로 정의된 바에 따른 ES 표현형의 손실 없이 확실히 유지됨을 보고하였다(Id.) 이러한 세포는 틀림없이 조류 배로 전이시 PGC's로 발달하여 생식선 내에서 콜로니화된다. 그러나, 이들은, 이들 세포가 사실상 ES 세포임을 결정적으로 확정하지는 않았다.

닭 ES 세포와 마우스 ES 모노클로날 항체의 교차-반응성은, 종을 교차하여 ES 세포 수혜자를 보존하기 위하여 유망한 것으로 논의되었다. 또한, 이들 연구자들이 7일된 포배엽 세포 배양액 주입으로 두 마리의 키메라 닭을 생성할 수도 있었다는 사실은, 이들의 시스템에 ES 세포가 거의 틀림없이 존재함을 제시하였다. 그러나, 이들 연구자들은, 이들의 복합 배양시스템에 PGCs가 존재한다는 가능성을 배제하지는 않았다. 따라서, 이러한 장기간 ES 배양시스템은 다능성 및 배선 전달에 대하여 더욱 시험되어야 한다.(Id.)

ES 세포를 생성시키는 다른 경로에는 PGCs가 포함된다. 공여자로부터 수혜자 배로의 PGCs 분리 및 전이 방법은 발전되어, 공여자 유전형이 배선 전달로 키메라 닭을 성공적으로 얻었다(Vick et al.,London Ser. B,251:179-182(1993), Tajima et al.,Theriogenology,40:509-519(1993)). 또한, PGCs는 냉동보존되었으며, 후에 녹여 키메라 새가 생산하였다(Naito et al., J Reprod. Fertil., 102:321-325(1994)). 그러나, 이러한 시스템은 상당히 노동 집약적이고, 배 당 겨우 평균 50 내지 80PGCs의 수율만이 얻어진다. 레트로바이러스 벡터로 PGCs를 감염시키는 것도 보고되었다. 그러나, 트랜스펙션된 PGCs 선택을 용이하도록 하기 위하여 연장된 기간동안 배양에서 PGCs를 성장시키는 것은 현재까지 달성되지 않았다. 따라서, 상기한 바에 기초하여, 개선된 PGCs 배양 방법은 당해 기술 분야에서 상당히 필요하다.

본 발명은 조류 원시배세포(PGCs), 특히 닭 PGCs를 조직 배양에서 연장된 기간동안 유지하는 신규한 방법을 제공한다. 이러한 PGCs는 원하는 DNA 서열, 예를 들어 인간 유전자를 삽입하는데 사용될 수 있다. 이러한 배양된 PGCs 및 이로부터 유래한 유전자도입 PGCs를 사용하여 키메라 새, 특히 키메라 닭을 만들 수 있다.

본 발명의 목적은 종래 기술의 문제점을 해결하는 것이다.

본 발명의 더욱 구체적인 목적은 조류 원시배세포(PGCs)를 연장된 기간동안 조직 배양액 중에서 배양하는 신규한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 더욱 구체적인 목적은 또한 갈리나세아, 특히 닭의 원시배세포(PGCs)를 연장된 기간동안 조직 배양에서 배양하는 신규한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 연장된 기간동안 조직 배양에서 배양된 조류 원시배세포를, 바람직하기는 가금, 더욱 바람직하기는 닭 또는 칠면조와 같은 키메라 조류를 얻기 위하여 사용하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 원하는 핵산 서열을 연장된 기간동안 조직 배양에서 배양된 조류 원시배세포에 도입하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 배양에서 연장된 기간동안 유지되어 원하는 핵산 서열이 도입된 조류 원시배세포를, 바람직하기는 유전자도입 키메라 닭 또는 칠면조의 유전자도입 키메라 조류를 얻기 위하여 사용하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은, 바람직하기는 갈리나세아 및 더욱 바람직하기는닭인 이러한 유전자도입 키메라 조류를, 이에 도입된 세포에 함유된 핵산 서열에 의해, 바람직하기는 이러한 단백질을 이러한 유전자도입 키메라 조류, 특히 유전자도입 키메라 닭의 알로부터 회수함으로써 암호화된 이종 단백질(들)을 생산하기 위하여 사용하는 것이다. 선택적으로, 키메라 새로부터 직접적으로, 예를 들어 혈액 또는 다른 조직으로부터 분리하여 이러한 단백질을 얻을 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명은 조류(닭) 원시배세포(PGCs)를 조직 배양에서 연장된 기간동안, 즉 14일 이상, 더욱 바람직하기는 25일 이상, 이상적으로는 무한히 유지하기 위한 신규한 방법을 제공한다.

본 발명 이전에는 키메라 조류를 얻기 위한 이들의 능력으로 증명된 바와 같이 약 5일 이상 이들의 유지를 제공하는, 조직 배양에서 조류 PGCs를 유지하는 방법은 보고된 바 없었다. 본 발명의 발명자들은, 분별있는 실험을 통하여 놀랍게도, 적어도 다음 성장인자: 백혈병 저해 인자(LIF), 기본 섬유아세포 성장인자(bFGF), 간 세포 인자(stem cell factor; SCF) 및 인슐린-유사 성장인자(IGF-I)를 함유하는 배양 배지를 사용하면, 조류 원시배세포, 특히 닭 원시배세포를 연장된 기간동안, 즉 적어도 14일, 실질적으로 그 이상동안 조직 배양에서 유지 및 증식시킬 수 있다는 것을 알아내었다. 또한, 이러한 PGCs는 키메라 닭의 생성에 유용한 것으로 증명되었다.

또한, 이러한 PGC는 유전자도입 조류 PGC의 생성에 유용해야 하며, 유전자도입 키메라 조류를 얻기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 유전자도입 키메라 조류는 이종 단백질 회수에 유용하며, 바람직하기는 이는 이러한 키메라 유전자도입 조류의 알로부터 바로 회수될 수 있는 것으로 기대된다. 예를 들어, 이러한 조류는 치료 단백질 및 다른 폴리펩티드의 생성 및 회수에 사용가능하다.

따라서 본 발명은 그러한 PGC가 약 5일 이상의 기간동안 조직배양에서 유지되도록 할 수 없었던 이전의 조류 PGC 배양방법과 관련된 문제점을 제거한다. 특히, 본 발명자는 놀랍게도 조류 PGC, 바람직하게는 갈리나세아 PGC, 가장 바람직하게는 닭 PGC가 적어도 4가지 성장인자, 즉 백혈병 저해 인자(LIF), 간세포 인자(SCF), 인슐린-유사 성장인자(IGF-I) 및 기본 섬유아세포 성장인자(bFGF)를 포함하는 배지를 사용함으로써, 적어도 14일, 보다 바람직하게는 적어도 25일, 및 바람직하게는 더 길게 연장된 기간동안 조직배양에서 유지될 수 있다는 것을 발견했다.

일반적으로, 본 배양방법은 (i) 공여자 조류의 배(embryo)로부터 PGC를 분리하는 단계; 및 (ii) 상기 분리된 조류의 PGC를 조직배양에서 연장된 시간, 즉 적어도 14일 동안, 그들의 증식을 촉진시키는데 유효한 상대량의 LIF, bFGF, SCF 및 IGF-I를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함한다. 상기에서 정의된 바와 같은 연장된 기간은 14일 또는 그보다 긴 배양기간을 말한다.

공여자 조류의 배로부터 원시배세포를 분리하는 방법은 문헌에서 보고되어 있고 당해 기술분야에서의 숙련자들에 의해 수행될 수 있다(예를 들면, 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 삽입된, 1993년 9월 7일 공개번호 제05-227947호로 공개된 JP 924997; Chang et al., Cell Biol. Int., 19(2): 143-149(1992); Naito et al., Mol. Reprod. Devel., 39:153-161(1994); Yasuda et al., J. Reprod. Fert.,96:521-528(1992); 및 Chang et al., Cell Biol. Int. Reporter, 16(9):853-857(1992) 참조).

본 발명자는 약 53시간(배발달 단계 12-14)동안 배양하여, 배를 제거하고, 등쪽대동맥으로부터 미발달혈액을 수집하여, 적절한 세포배지(M199 배지)로 옮긴 달걀로부터 조류 PGC를 분리하기로 선택하였다. 그 다음에 이들 PGC를 피콜(ficoll)밀도원심분리에 의해 정제하여, 본 발명의 성장인자함유 배지 10㎕에 재현탁시켰다. 그러나 상기에서 설명한 바와 같이, PGC를 분리하기 위한 다른 방법들도 공지되어 있고 선택적으로 사용될 수 있다.

그 다음에 분리된 PGC의 수를 세어 (예를 들면 피펫을 사용하여) 수작업으로 분리하였다. 그 다음에 이 다른 조류 배들로부터 수집된 PGC를 (PGC수를 증가시키기 위하여) 모아서 본 성장인자함유배지에서 배양한다.

이하 "완전"배지라고 부르는 이 배지는 배의 간세포배지와 PGC 내에 일반적으로 포함된 다른 치환체들 뿐 아니라 LIF, bFGF, SCF 및 IGF-I를 포함한다. 보다 상세하게는 본 "완전"배지는, 상기 4가지 성장인자들이 추가되고 10% 우태아혈청, 2 mM L-글루타민, 0.56% 항생제/항유사분열제, 34.56 mM 2-β메르캅토에탄올, 1.0 U/㎕ LIF, 40.0 pg/㎕ bFGF, 60.6 pg/㎕ IGF-I 및 80.0 pg/㎕ SCF를 추가적으로 포함하는 공지의 상업적으로 입수가능한 세포성장배지인 α-MEM을 포함하는 것이 바람직할 것이다.

지금까지 행해진 실험들에 근거하여, 이들은 이들 성장인자들의 바람직한 농도에 해당한다고 생각된다. 그러나 다음에 설명되는 바와 같이, 이들 성장인자의양은 조직배양에서 성공적으로 유지되는 PGC에 따라 변할 수 있다. 특히, 이들 성장인자의 각각의 양은 역효과없이 증가될 수 있다고 알려져 있다. 게다가 이들 바람직한 양은 예를 들면, 다른 조류의 PGC가 배양된다면 변할 수 있다.

언급한 바와 같이, 본 발명자는 기본배지로서 공지의 상업적으로 입수가능한 조직배양액인 α-MEM을 사용했다. 그러나 이들 4가지 필수성장인자들이 역시 존재한다면, 그 대신 다른 배지들로 치환할 수 있다고 예상된다. 출원인은 특히 비제한적이고 가변적인 조성때문에, 우태아혈청을 제거하여 본 "완전배지"를 변형하는 것을 생각한다.

또한 출원인은 피더세포 없이 PGC를 배양했지만, 피더세포도 유용할 수 있다고 생각한다. 특히, 섬유아세포, 바람직하게는 조류의 섬유아세포, 및 가장 바람직하게는 갈리나세아 섬유아세포(더 바람직하게는 닭 섬유아세포)를 사용하면 4가지 필수성장인자가 존재하도록 제공된 조직배양에서 PGC를 유지할 수 있을 것이다. 또한 이들 피더세포는 이들 성장인자를 암호화하는 유전자로 트랜스펙션될 수 있고, 그것에 의해 배양하는 동안 이들 인자를 외부에서 첨가할 필요가 없게 할 수 있다. 필수적으로, 상기 세포들은 이들 성장인자의 지속적인 공급원을 제공할 것이다. (이것은 구성적인 강한 프로모터의 제어 하에 이들 성장인자와 그것을 분비하는 서열들을 위치시켜서 이들 성장인자를 배양된 PGC에 이용할 수 있게 만듬으로써 달성될 수 있다.)

언급한 바와 같이, 이들 인자의 양은 조직배양에서 연장된 기간동안, 조류의 PGC, 바람직하게는 갈리나세아 PGC 및 가장 바람직하게는 닭 또는 칠면조의 연장배양을 가능하게 하는데 효과적인 상대량을 말한다.

바람직하게는, 이들 성장인자의 상대량은 다음 범위 내일 것이다:

LIF 0.1 U/㎕ 내지 100.0 U/㎕, 보다 바람직하게는 1.0 내지 10.0 U/㎕ 및 가장 바람직하게는 1.0 내지 2.0 U/㎕;

IGF-I 6.0 pg/㎕ 내지 6000.0 pg/㎕, 보다 바람직하게는 중량으로 60.0 pg/㎕ 내지 600.0 pg/㎕ 및 가장 바람직하게는 60.0 pg/㎕ 내지 120.0 pg/㎕;

SCF 중량으로 8.0 pg/㎕ 내지 8000 pg/㎕, 보다 바람직하게는 80.0 pg/㎕ 내지 800.0 pg/㎕ 및 가장 바람직하게는 중량으로 80.0 pg/㎕ 내지 160.0 pg/㎕; 및

bFGF 4.0 pg/㎕내지 4000.0 pg/㎕, 보다 바람직하게는 중량으로 40.0 pg/㎕ 내지 400.0 pg/㎕ 및 가장 바람직하게는 40.0 pg/㎕ 내지 80.0 pg/㎕.

상기 개시된 범위에서, 상한은 본 발명에 임계적이지 않고 (성장인자의 제조와 관련한 상당한 비용으로 주어진) 비용에 의해 크게 기술된다.

그러나 이들 바람직한 범위는 예를 들어 α-MEM이 다른 성장배지로 치환되거나 다른 형태의 조류 PGC가 배양된다면 변할 수 있다고 예상된다.

설명된 바와 같이, 이들 PGC는 키메라 조류의 성공적인 생산으로 배양액 중에 긴 기간동안 유지될 수 있다. 지금까지 세포들은 명백하게 역효과없이, 조직배양에서 약 4개월 이상동안 유지되어 왔다. 또한 25일 이상의 세포들에 대해 조류의 배의 생식선을 효과적으로 콜로니를 형성하여 키메라 새를 생산하는 능력을 시험하였다. 그러나 이들 세포는 키메라 새를 생산하기 위한 능력을 보유한 채 무한정 배양될 수 있다고 예상된다.

키메라를 생산하기 위하여 PGC를 사용하는 방법은 상기에서 설명된 선행기술에서 명백한 바와 같이 당해 기술분야에서 공지되어 있다. 바람직하게는, PGC는 뒤에 올 실시예에서 개시된 방법들에 따라 수혜자 조류의 배로 이전될 것이다. 그 다음에, 생식선 내의 PGC의 이동과 콜로니형성, PGC 표현형의 보유에 근거하거나, 또는 부화시켜 사육한 후 생식선 내의 공여자 PGC의 존재를 찾음으로써 성공적인 키메라생산을 평가한다.

본 실시예에서, 발명자들은 천연색에 영향을 미쳐 쉽게 추적되는 유전자형을 선택했다. 공여자 새는 흰색 브로일러형이고 수혜자 새는 검은 깃털을 가진 새였고, 각각은 특별한 잠재적 유전형을 가졌다. 추정되는 키메라는 검은 깃털이었고 검은 새와 짝지웠을 때 검은색/흰색 자손을 생산하였다. 그것에 의해 추정되는 키메라 새를 다른 검은색 깃털을 가진 새와 짝지운 후 생산된 검은색/흰색 깃털을 가진 자손의 생산한 것에 근거하여 성공적인 키메라가 증명되었다.

두 번째 방법에서는, 바 록(Bar Rock) 새를 수혜자로 사용하고, 흰 깃털을 가진 새를 공여자로 사용하였다. 일부 줄무니 깃털을 가진 흰 깃털의 자손을 생산한 것에 근거하여 추정되는 키메라 새가 증명되었다,

그러나, 이 방법은 키메라화에 의하여 어떤 원하는 특징을 도입하기 위해 적용할 수 있어야 한다. 물론, 이것은 전이된 PGC의 유전형 특징에 의존할 것이다.

설명된 바와 같이, 긴 기간동안 배양에서 유지될 수 있는, 본 PGC의 중요한 적용분야는 키메라 조류를 생산하기 위한 것이다. 이것은 배양된 PGC에 원하는 DNA를 도입함으로써 이루어질 수 있다. 수혜자세포 속으로 DNA를 도입하기 위한 수단은 공지되어 있고, 리포펙션, 트랜스펙션, 미세주입, 형질전환, 미세방출기술 등이 포함된다. 특히, 본 발명자는 처음에 리포펙션에 의해 리포터유전자를 함유하는 벡터를 도입하기로 선택하였다. 그러나, 일시적으로 트랜스펙션된 PGC가 만들어지는 동안, 안정한 트랜스펙션된 세포주는 아직 분리되지 않았다. 그러나 이것은 본 PGC를 사용한 공지의 기술에 의해 이루어질 수 있다고 예상된다.

바람직하게는, 조류에서 작동가능한 서열의 조절적 제어하에서, 예를 들어 치료용 폴리펩티드, 성장인자, 효소 등 원하는 유전자를 암호화하는 DNA가 도입될 것이다. 바람직하게는 이들 조절서열은 진핵생물유래, 가장 바람직하게는 조류, 예를 들면 닭의 조절서열일 것이다. 예를 들어 조류유전자 또는 바이러스로부터 유래된, 조류세포에서 작동가능한 프로모터는 당해 기술분야에서 공지되어 있다.

처음에, 원하는 단백질을 생산하는 안정한 세포주가 분리되어 키메라 생산에 사용될 것이다. 또한, 도입된 DNA는 삽입된 DNA를 포함하는 세포를 보다 쉽게 확인하기 위하여, 그 발현이 쉽게 검출되는 표지 DNA를 포함하는 것이 바람직하다. 그러한 선택표지는 공지되어 있고, β-락타마제, β-갈락토시다제, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 등이 포함된다.

그 다음에 조류의 배에 생성된 유전자도입 PGC를 주입하면 유전자도입 키메라 조류가 만들어질 것이다. 바람직하게는, 그 다음에 원하는 단백질을 이 유전자도입 조류의 알에서 회수하여 단백질을 지속적으로 공급할 것이다. 선택적으로 단백질은 키메라 새로부터 직접적으로 회수될 수 있는데, 예를 들면 체계적인 순환시스템으로부터 분리될 수 있다.

다음의 물질과 방법은 하기 설명되는 실험에서 사용되었다.

물질 및 방법

동물

흰색(E/E 및 I/I) 브로일러형 닭을 장기간 PGC 배양시스템을 개발하기 위한 PGC의 공여자로 사용하였다. 두가지 형태의 새, 우성 검은색 날개(E/- 및 i/i) 닭과 바 록(E/E 및 i/i)을 수혜자 배로 사용하였다. 흰색 브로일러(WB)형 PGC로 주입된 우성 검은 새는 E/-(WB)로 표기하고, 흰색 브로일러형 PGC로 주입된 바 록 새는 BR(WB)로 표기하였다.

PGC 추출

단계 13 내지 14 배를 PGC 추출용으로 선택하였다. 문헌{Naito et al.,Mol. Reprod. Dev., 37:167-171(1994)}에 개시된 바와 같이, 마이크로 피펫을 사용하여 등쪽대동맥으로부터 PGC를 수집하였다. 20 배아로부터 PGC를 10% 우태아혈청으로 보충하고, 피콜(Ficoll) 밀도 구배 원심분리에 의해 농축된 행크(Hanks') 용액에 모았다{Naito et al.,Mol. Reprod. Dev., 39:153-171 (1994)}. PGC의 수를 세고, 방울 당 약 100 PGC로 배지(DMEM, 서로 다른 양의 성장인자 포함)의 10 ㎕ 방울에 분포시켰다. 배양 방울은 살균광 광유로 씌웠다.

PGC를 수혜자 배로 주입

단계 14-15 배를 수혜자 배로 사용하였다. 알을 적당한 표면에 놓은 후, 배가 스스로 나머지 알의 상부에서 자라도록 방치하였다. 미세 핀셋을 사용하여 껍질 내에 작은, 약 10mm 이하의 "창"을 만들었다. 4% 항생제를 가진 인산염 완충 염수의 혼합물을 첨가하여 배를 표면에 가까이 가져왔다. 배를 그것의 심장이 보이도록 조절한 후, 주변 정맥 및/또는 등쪽대동맥을 쉽게 확인할 수 있었다. 0.04% 트리판 블루를 함유한 배지 2㎕에서 200개의 공여자 PGC를 마이크로피펫으로 취하였다. PGC를 수혜자 배의 등쪽대동맥에 주입하였다. 삽입 세포 염료인 트리판 블루는 그것이 전해졌을 때 PGC 현탁액을 시각화할 수 있었다. 주입 후, 열려있는 알 껍질을 수술용 테이프로 막고, 파라핀으로 보강하였다. 알들을 습한 CO₂인큐베이터 내에서 감시 하에 24시간 동안 유지한 후, 부화할 때까지 보통 인큐베이터로 전이시켰다.

PGC의 생존 가능 형광 착색

전이 성공 및/또는 생식선으로 이동하기 위한 PGC의 능력을 평가하기 위하여, PGC를 DiI 형광 착색제로 착색시켰다. 전이 24시간 후, 배를 수집하고 페트리 접시 위에 놓고, 에피-형광 분석을 위해 장착된 역 현미경 하에서 관찰하였다.

PGC 배양 조건

인간 백혈병 저해 인자(Lif), 인간 기본 섬유아세포 성장인자(bFGF), 인간 인슐린-유사 성장인자(IGF-I) 및 인간 간세포 인자(SCF)의 여러가지 농도를 시험하였다. 또한, 닭 섬유아세포 및 마우스 STO 세포 피더 층으로 처리된 마이토마이신을 시험하였다.

PGC 장기간 세포 배양 배지

하기 실험에서, 완전한 세포 배양 배지는 하기 치환체를 포함하여 이루어졌다: α-MEM(Bio Whittaker, Walkersville, MD, Cat# 12-169F), 10% 우태아혈청(Hyclone, Logan, UT, Cat# 30070.03), 2 mM L-글루타민(Sigma, St.Louis, MO, Cat# G7513), 0.48% 항생제/항진균제(Signa, St.Louis, MO, Cat# A7292), 132 μM 2β메르캅토에탄올(GIBCO-BRL, Grand Island, NY, Cat 2195-023), 0.00625 U/㎕의 백혈병 저해 인자(LIF), 0.25 pg/㎕의 기본 섬유아세포 성장인자(b-FGF), 0.5625 pg/㎕의 인슐린 유사 성장인자(IGF-I) 및 4.0 pg/㎕의 간세포 인자(SCF)(Genzyme, Cambridge, MA, Cat#'s 1999-01, 1208-00, FG1211-1 and 1833-01 for LIF, bFGF, IGF-I and SCF, respectively). 배지는 배지 5㎕을 제거하고 2X 새로운 배지 5㎕을 첨가하여 매일 변화시켰다. 2X 새로운 배지는 성장인자가 얼마간의 연속 배양 기간 후에 불안정해질 것으로 생각되었다. 그러나, 최종 결과는 성장인자의 농도가 두배가 되었다. 따라서, 최종 배지는 현재 다음과 같은 성장인자 농도를 함유한다: 0.0125 U/㎕의 백혈병 저해 인자(LIF), 0.5 pg/㎕의 기본 섬유아세포 성장인자(bFGF), 1.125 pg/㎕의 인슐린 유사 성장인자-I(IGF-I) 및 8.0 pg/㎕의 간세포 인자(SCF). 여기 기재된 성장인자 농도의 범위는 연속 배양에서, PGC의 유지 및 증식을 증진시킨다. 또한, 이어서 이들 세포가 앞에서 확인된 농도에서 선택적으로 생존 및 증식한다는 것이 밝혀졌다. (또한, 성장인자가 상기 배지에서 변화될 수 있다는 것이 설명되었다. 특히, 상기 논의된 바와 같이, 원시배세포 배양액을 유지하기 위해 특히 바람직한 배지는 LIF, IGF-I, SCF 및 bFGF의 양이 하기와 같은 상기와 동일한 치환체를 포함하여 이루어질 것이다:

LIF : 1.0 단위/㎕

bFGF : 40.0 pg/㎕

SCF : 80.0 pg/㎕

IGF-I : 60.0 pg/㎕.)

이러한 배양 조건을 사용하여, 수집 후 3 내지 4일 내에, 크고, 조밀하고, 느슨하게 부착한 세포 덩어리(어떤 덩어리는 그 속에 수백개의 세포를 가진다)를 형성하기 위한 PGC를 찾아내었다. 마지막 7일에 덩어리는 그들 주위에 다수의 죽은 세포 및 세포 파편을 가지기 시작하였다. PGC 덩어리는 그들이 세포 단일층이 되기 전 4주까지 살아 남았다. 1, 2 및 3주에, 덩어리를 분리, 생명 염료 DiI으로 착색시키고, 수혜자 배로 전이시켰다. 세 시점에서 모두 세포는 어떤 수혜자 배 생식선에서 발견되었다. 생식선에서 착색된 PGC를 보인 세포수 및 배의 수는 PGC 배양 시간에 역비례하였다.

수혜자 배로 PGC 전이

PGC 전이를 위하여, 수혜자 알을 해부 범위 하에 수평으로 놓았다. 알의 공적으로 작은 구멍을 뚫어 알의 내압을 낮추고 유출을 방지하였다. 10 mm의 창을 알의 내표면 위에 열고- 4% 항생제/항유사분열제를 가진 PBS 1ml를 구멍을 통해 주입하여 이것이 알 껍질 창과 동일 평면보다 약간 낮아질 때까지 배를 키웠다. PGC를 주입하기 위하여, 30 ㎛ 피펫을 비스듬히 자르고, 마이크로포지를 사용하여 끌어 연마된 모서리를 가진 미세점을 형성하였다. 하기한 바와 같이 니들-피펫 및 흡인 튜브를 사용하여 분리된 배 전이 당 200 PGC를 손으로 골라 내었다. 전이 전및 피펫 중에 있는 동안, PGC를 트리판 블루 착색제 0.04% 용액과 혼합하였다. 배 당 총 주입 용적은 2 ㎕이었다. 마지막 단계에서, 수혜자 배를 주변 정맥의 일부가 보이도록 위치시켰다. PGC가 들어 있는 니들-피펫을 삽입하고, 내용물을 조심스럽게 배출시켰다. 니들-피펫을 수초간 제자리에 고정시키고 나서 제거하였다. 수혜자 알을 수술용 테이프 2층으로 밀봉하고 파라핀 왁스로 전영역을 코팅하였다. 그리고 나서, 수혜자 알을 회전 인큐베이터에 다시 넣고, 부화할 때까지 배양하였다.

PGC 표현형 평가

닭 PGC는 과요오드산 쉬프 착색(periodic acid Schiff skaining, PAS)에 대해 양성이고, 알칼리성 포스파타제에 대해 양성인 것으로 주장되었다. 그러나, 닭 PGC가 후자에 대해 양성이라는 설득력 있는 증거는 없다. 닭 PGC를 특성화하기 위한 대체 효소 및 분자 표지법이 없는 가운데, 수혜자 배에 세포를 전이시키고 성장한 배의 생식선에서의 이들의 존재를 평가함으로써 이들의 표현형을 평가하였다. 이 방법은 수혜자 배에 전이시키기 전에 α-MEM 배지에서 100 ㎍/ml DiI 중에 PGC의 배양 및 세정을 필요로한다. 전이 24시간 후 수혜자 배를 옮겨 역 현미경 하에 놓았다. 생식선에서 관찰된 DiI 표지 세포는 성공적인 생식선으로의 PGC 이동 및 PGC 특성 유지 확인을 설명해준다. 수혜자 배를 부화하도록 방치하여, PGC 표현형 유지를 평가하기 위한 두번째 방법을 수행하고, 부화 후 생식선에서 공여자 PGC의 존재를 평가하였다.

PGC 평가를 위한 육종 전략

두 가지 육종 전략은 다음과 같다. 첫번째 방법에서는 가능한 유전자형이 i/i, E/E, s/s, b/b인 수혜자 검은 깃털 새들 및 유전자형이 I/I, E/E, S/S, B/B인 공여자 흰색 깃털 브로일러형 새들을 사용하였다. 수혜자 동물이 키메라, 즉, 그들의 PGC와 공여자 PGC를 그들의 생식선에 함유한다는 것을 입증하기 위하여, 그들을 순수한 검은 깃털 새들과 짝지어 주었다. 그 결과 자손이 모두 검은 깃털이면, 그 동물은 키메라가 아니라고 보았다. 그러나, 어떤 자손이 일부가 검은 깃털인 흰색 깃털이면, 그 수혜자 동물은 키메라일 것이다. 두번째 육종 전략에서는 흰색 깃털 브로일러형 새들은 계속 공여자로 사용하는 반면, 수혜자 배로는 바 록 새들을 사용하였다. 이러한 후자의 경우, 추정되는 키메라 새들을 순수한 바 록과 짝지어 주었을 때, 약간 줄무늬가 있는 깃털을 가진 흰색 깃털 자손의 존재는 양성 키메라 새를 확인시켜 주었다. 키메라로 추정되는 각 새로부터 50 자손을 얻은 후에 키메라 상태로 결론지었다.

자손 시험

추정되는 키메라 E/-(WB) 새와 WB 새를 교배시켰을 때, 그들이 공여자 (WB)PGC로부터 유래한 경우에는 순수한 흰색 새끼를 생산하였고, (E/-)PGC로부터 유래한 경우에는 검은 얼룩 깃털 새끼를 생산하였다. 이와 유사하게, BR(WB)를 WB 새와 교배시켰을 때, 그들이 공여자 (WB)PGC로부터 유래한 경우에는 순수한 흰색 새끼를 생산하였고, (BR)PGC로부터 유래한 경우에는 흰색-얼룩인 검은 새끼를 생산하였다. 또한, 추정되는 BR 키메라 새들을 서로 교배시켰다. 후자에서, 두 (WB)PGC 사이에 수정이 일어난 경우에는 흰색 새끼가 생산되었고, 두 (BR)PGC 사이에 수정이 일어난 경우에는 검은 새끼가 생산되었다. 검은 얼룩 깃털을 가진 중간형 흰색 새끼는 (BR)PGC와 (WB)PGC가 수정된 경우에만 생산되었다.

25일 이상 장기간 배양

연속 배양 25일 후, PGC 덩어리는 빠르게 퍼지는 단일층을 형성하였다. 이들 세포 단일층은 상부 표면에서 평평한 부착 베이스 및 느슨한 덩어리 및 PGC 유사 세포 체인을 깎았다. 이들 세포 단일층의 일부 다발은 PAS 양성이 남아있다. 이들 단일층으로부터 얻은 DiI 착색 세포들을 수혜자 배로 전이시켰다. 일부 배는 그들의 생식선에 편재된 세포를 거의 나타내지 않았다. 세포 단일층은 성공적으로 계대배양되었다. 일반적으로, 이들 세포는 이들의 증식이 느려지고, 늙고, 섬유아세포가 보이기 시작하기 전에 3 내지 5번 계대배양할 수 있다. 연속 배양에서 약 4개월 동안 뚜렷한 분화 없이 여러번 계대배양하고 성장을 계속하는 세포주는 거의 없다.

단일층으로 부터 얻은 두 세포주 P102896 및 P110596을 냉동시켰다. 전자는 뚜렷한 분화를 보이지 않았고, 알칼리성 포스파타제에 대해 약한 양성이었던 반면, 후자는 신경세포 형태를 나타내었고, 알칼리성 포스파타제에 대해 강한 양성이었다. 여기 기재된 바와 같은 PGC 단일층의 다른 특성은 분화전능 및 다능성에 대한 평가로 남아있다.

결과 요약

키메라 닭을 신선하고 저온보존된 PGCS로부터 생산하였다. 신선한 PGC 전이로 생산된 34마리의 추정되는 키메라 닭 중 25마리(74%)는 자손 시험 후 진짜 키메라 동물로 입증되었다. 저온보존된 PGC로 생산된 34마리의 추정되는 키메라 닭 중 30마리(88%)는 진짜 키메라 닭으로 설명되었다. 모든 경우 40마리의 자손이 생산되었고, 키메라 새 당 수정된 공여자 PGC의 수는 주로 30% 내지 60%의 범위인, 1.4% 내지 100% 범위이었다. 주 범위가 주입 후 생식선으로 이동한 PGC의 수를 반영하는 것으로 가정하면, 주입 당 성공 범위는 다양하였다. 그러나, 수혜자 생식선 내에서 확인된 PGC의 수에 영향을 주었을 다른 메커니즘이 작용했을 수도 있다. 이러한 메커니즘은 본 연구에서는 평가하지 않았다. 또한, 평균적으로, 키메라 새의 자손에서 성비의 뚜렷한 변화는 관찰되지 않았다.

PGC 배양 조건

본 연구에서 세포 피더 층은 PGC의 장기간 배양조건을 개선하지 않았다. 연구된 어떤 농도에서도 성장인자 단독으로는 시험관 내에서 분화 없이 PGC를 유지하지 못했다. 작은 성공으로 두 가지 및 세 가지 성장인자의 조합도 연구하였다. 우리의 결과에 기초하여 볼 때, PGC의 장기간 배양에는 상기 인자들 모두(LIF, BFGF, IGF-I 및 SCF)가 필요한 것으로 보인다. 우리는 PGC의 장기간 배양을 위한 가장 좋은 가능한 조건을 밝히기 위한 노력으로 상기 성장인자의 상이한 농도 및 조합을 계속 연구하고 있다. 우리가 관찰한 PGC의 DiI 착색을 기초로 하여, 우리의 배양 조건 하에서, 주입 후 14일 연속 배양액으로부터 나온 PGC가 수혜자 배의 생식선으로 이동한 것을 관찰하였다. 우리는 또한 25일 동안 배양액에서 유지된 PGC를 3개의 수혜자 배로 전이시켰다. 셋 중 하나의 배가 자손 시험에 의해 밝혀진 바와 같은 키메라였다.

장기간 배양조건 하에서의 PGC 표현형

수집 후, 크기 및 그들의 세포질 내의 지방 방울의 존재에 의해서 PGC를 인식한다. 회수하고 약 48시간 후에, PGC는 함께 덩어리를 형성하고 덩어리의 트립신분해 후 관찰되는 세포의 수와 덩어리의 크기 내의 성장에 의해 입증된 바와 같이 분할하기 시작한다. 덩어리를 형성하는 PGC만이 살아남고, 나머지는 모두 죽는다. 일반적으로 100 PGC로 시작한 배양은 7일 내에 결국 평균 600 내지 800 PGC로 된다. 명백히, 일부 PGC는 유효한 속도는 아니지만 분할한다. 그러나, 상기에서 나타낸 바와 같이, 이들 PGC는 생식선에 모이기 위한 그들의 능력을 유지한다.

25일 이상의 장기간 배양

연속배양 25일 후, PGC 덩어리는 신속하게 퍼지는 단일층을 형성한다. 이들 세포의 단일층은 평평한 부착성 베이스와 더 느슨한 덩어리와 상부면에 PGC 유사세포의 체인을 가진다. 이들 세포의 단일층의 일부 다발은 PAS 양성으로 남아있다. 이들 세포의 단일층으로부터 얻은 DiI 염색세포는 수혜자 배로 전이되었다. 일부 배는 그들의 생식선에 편재된 세포가 거의 없었다. 세포단일층은 성공적으로 계대배양되었다. 일반적으로 이들 세포는 늙어서 그들의 증식이 느려지기 시작하기 전에 3 내지 5 계대배양을 겪을 수 있고 외관상 섬유아세포와 유사해진다. 다중 계대배양을 겪고 연속배양에서 약 4개월 동안 명백한 분화없이 계속 잘 자라는 세포주는 거의 없다.

단일층으로부터 얻어진 2개의 세포주, P102896와 P110596를 냉동하였다. 전자는 명백한 분화를 나타내지 않았고 알칼리성 포스파타제에 대해 최저한으로 양성이었던 반면, 후자는 뉴런세포 형태를 나타내었고 알칼리성 포스파타제에 대해 매우 양성이었다. 본 명세서에서 설명된 바와 같은 PGC의 또다른 특성화는 전체형성능과 분화다능에 대해 분석되지 않은 채 남아있다.

특히, 상기 4가지 성장인자를 사용하여 적어도 25일 동안 배양된 PGC는 생식선을 성공적으로 콜로니형성할 수 있고 키메라 닭을 생산할 수 있는 것으로 나타났다. 또한, 우리는 PGC세포를 배양에서 4개월 이상동안 유지하였다. 이들 배양은 여전히 원하는 PGC 표현형을 가지는 세포를 포함하는 것으로 보인다. 이들 세포는 키메라 새를 생산하기 위한 그들의 능력에 대해서 시험하지 않았지만, 그들의 외관에 근거하여, 그들이 그것에 유용할 것으로 예상된다.

PGC 트랜스펙션

PGC의 트랜스펙션에 녹색 형광단백질 리포터 유전자를 가진 벡터의 리포펙션을 사용하였다. 평균 1/50 PGC에서 일시적으로 트랜스펙션되었지만, 그러나 안정한 트랜스펙션된 세포계는 아직 발달하지 않았다.

요약하면, 이 결과는 PGC가 긴 기간동안 유지되고 키메라 새의 생산에 성공적으로 이용될 수 있다는 것을 나타낸다. 성장인자 농도에서의 또다른 변화와 다른 성장인자의 사용은 배양조건을 더 최적화할 수 있다. 유용해지기 위해서는, PGC 배양시스템은 생식선으로 이동하기 위한 PGC능력을 유지하면서 PGC의 트랜스펙션과 선택을 허용하여야 한다. 또한, (동일자 출원된) 관련출원에서 보다 상세히 개시된 바와 같이, 연장된 배양 후인 1998년 8월 3일에 닭 PGC는 ES 세포 표현형으로 돌아간다(Matsui et al., Cell, 70:841-847, 1992). 따라서, 분산된 ES세포를 수혜자배반엽에 주입하는 것은 키메라 및 유전자도입 닭을 위한 다른 수단이 될 것이다.

Claims (20)

1. (i) 원하는 조류로부터 원시배세포를 분리하는 단계; 및

   (ii) 조직 배양에서 연장된 기간 동안 상기 PGC를 유지하기에 충분한 양으로 포함된 하기 성장인자를 적어도 함유하는 배지에서 상기 원시배세포를 배양하는 단계를 포함하여 이루어지는 연장된 기간 동안 조류 원시배세포를 유지하기 위한 배양법:

   (1) 백혈병 저해 인자(LIF)

   (2) 기본 섬유아세포 성장인자(bFGF)

   (3) 간세포 인자(SCF) 및

   (4) 인슐린-유사 성장인자(IGF-I).
2. 제 1항에 있어서, 상기 성장인자의 최소량이 바람직하게는 하기 범위인 것을 특징으로 하는 배양법:

   (1) LIF 0.1 U/㎕ 내지 100.0 U/㎕

   (2) bFGF 4.0 pg/㎕ 내지 4000 pg/㎕

   (3) IGF-I 6.0 pg/㎕ 내지 6000.0 pg/㎕, 및

   (4) SCF 8.0 pg/㎕ 내지 8000 pg/㎕.
3. 제 2항에 있어서, 상기 성장인자의 양이 바람직하게는 하기 범위인 것을 특징으로 하는 배양법:

   (1) LIF 0.1 U/㎕ 내지 10.0 U/㎕

   (2) bFGF 40.0 pg/㎕ 내지 400.0 pg/㎕

   (3) IGF-I 60.0 pg/㎕ 내지 600.0 pg/㎕, 및

   (4) SCF 80.0 pg/㎕ 내지 800.0 pg/㎕.
4. 제 1항에 있어서, 상기 조류 PGC가 갈리나세아(Gallinacea)속 조류로부터 얻어진 것임을 특징으로 하는 배양법.
5. 제 4항에 있어서, 상기 PGC가 닭 PGC 또는 칠면조 PGC인 것을 특징으로 하는 배양법.
6. 제 1항에 있어서, 상기 PGC가 배양에서 14일 이상 유지되는 것을 특징으로 하는 배양법.
7. 제 6항에 있어서, 상기 PGC가 배양에서 25일 이상 유지되는 것을 특징으로 하는 배양법.
8. 제 7항에 있어서, 상기 PGC가 배양에서 4개월 이상 유지되는 것을 특징으로 하는 배양법.
9. 제 1항에 있어서,

   (iii) 생성된 PGC를 원하는 핵산 서열로 트랜스펙션 또는 형질전환시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 배양법.
10. 제 9항에 있어서, 상기 핵산 서열이 치료적 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 배양법.
11. (i) 조류로부터 원시배세포를 분리하는 단계;

    (ii) 그러한 PGC를 적어도 하기 성장인자를 함유하는 조직 배양 배지에서 유지하는 단계;

    (1) 백혈병 저해 인자(LIF)

    (2) 기본 섬유아세포 성장인자(bFGF)

    (3) 간세포 인자(SCF)

    (4) 인슐린-유사 성장인자(IGF-I);

    (iii) 상기 PGC를 수혜자 조류 배로 전이시키는 단계; 및

    (iv) 원하는 PGC 표현형을 가진 키메라 조류를 선택하는 단계를 포함하여 이루어지는 키메라 조류를 생성하는 개선된 방법.
12. 제 11항에 있어서, 상기 PGC가 갈리나세아(Gallinacea)속 조류 배로부터 유래한 것임을 특징으로 하는 방법.
13. 제 12항에 있어서, 상기 조류 배가 칠면조 또는 닭 배인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 11항에 있어서, 상기 PGC가 수혜자 조류 배로 전이되기 전에 원하는 핵산 서열로 트랜스펙션 또는 형질전환되는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 14항에 있어서, 상기 핵산 서열이 치료적 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 15항에 있어서, 단계 (iv)에 따라 생성된 키메라 조류의 알로부터 상기 치료적 폴리펩티드를 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 11항에 있어서, 상기 PGC가 수혜자 조류 배의 등쪽대동맥 및/또는 주변 정맥 또는 수혜자 배반엽에 주입되는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제 1항의 배양법에 의해 얻어진 조류 PGC 세포주.
19. 제 18항에 있어서, 상기 세포주가 닭 또는 칠면조 PGC 세포주인 것을 특징으로 하는 세포주.
20. 제 18항에 있어서, 삽입된 핵산 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 세포주.