JP3723839B2 - ニワトリの白血病阻止因子（ｌｉｆ）、及びそれをコードする遺伝子 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ニワトリの白血病阻止因子（ＬＩＦ）、及びそれをコードする遺伝子、並びにその製造方法に関する。本発明のニワトリ白血病阻止因子（ＬＩＦ）はニワトリ胚性幹細胞又は胚性生殖細胞などのニワトリの分化可能な細胞の分化防止作用を有し、ニワトリの分化可能な細胞を培養する際の分化防止剤として有用である。
また、本発明は、本発明のニワトリ白血病阻止因子（ＬＩＦ）を用いたニワトリの分化可能な細胞の培養方法、そのための培地、その方法によるトランスジェニックニワトリの作出方法、及びその方法で作出されたトランスジェニックニワトリに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、トランスジェニック動物の作成は、医学・生物学を始め広範な領域において大きな進歩をもたらしてきている。特定の遺伝子が導入されたり、また特定の遺伝子がノックアウトされた動物の作成は、これらの遺伝子の機能を解析するための重要なツールとなってきている。
これらのトランスジェニック動物の作成方法としては、受精卵に外来遺伝子を直接導入するトランスジェニック法と、胚性幹細胞（Embryonic Stem 細胞）を介した遺伝子導入法の２つの方法がある。胚性幹細胞（以下、ＥＳ細胞という。）への遺伝子の導入は、ジーンターゲッティング法により特定のゲノムの位置に目的の遺伝子を導入したり、ノックアウトすることができることから、現在広く応用されている方法である。
【０００３】
このように、ジーンターゲッティング法によるＥＳ細胞を用いたトランスジェニック動物の作成が広く利用されているが、この方法では遺伝子操作中における分化の抑制が重要な問題となる。ＥＳ細胞の培養を行う際にはフィーダー（feeder）細胞を準備するか、分化を抑制するための因子としてのＬＩＦの使用が必要である。
ＬＩＦ（白血病阻止因子（Leukemia Inhibitory Factor））は、ＩＬ−６ファミリーに属するサイトカインの１種であり、細胞を未分化の状態で維持するためには必須の物質である（Smith A., et al., Nature, 336,688-690 (1988)）。
ジーンターゲッティング法によるマウストランスジェニック体の作出にマウスＬＩＦは必須の因子であり、マウス由来のリコンビナントＬＩＦが既に製品化されている。この因子単独でマウス胚性幹細胞の培養が可能となっているが、他の動物にはＬＩＦが確立されておらず、ジーンターゲッティング法によるトランスジェニック動物の作出が困難とされている。
【０００４】
ニワトリは、卵の高い蛋白質生産性が注目され、トランスジェニックニワトリの作出が試みられている。ニワトリの受精卵は比較的取り扱いが容易であり、遺伝子を導入することは問題は少ないが、特定の位置に遺伝子を導入又はノックアウトするためにはジーンターゲッティング法によるトランスジェニックニワトリの作出が必須である。
ニワトリとマウスでは、発生様式が異なることからマウスと同様の方法ではＥＳ細胞を作出することができない。しかし、ニワトリでも発生途中の胚からＥＳ細胞に相当する細胞の分離および培養が可能である。マウスのＥＳ細胞に相当するニワトリの細胞としては、胚盤葉細胞と始原生殖細胞があり、胚盤葉細胞はマウスのＥＳ細胞に匹敵する細胞で、発生途中の胚細胞である。始原生殖細胞は、将来生殖細胞（精子や卵子）へ分化する細胞であり、体外培養が可能な株化細胞の開発が進められている。この株化細胞はＥＧ（Embryonic Germ）細胞と呼ばれている。いずれの細胞も、いかに未分化な状態を維持したまま培養するかが問題であるが、現在のところニワトリＬＩＦが発見されていないために、他の哺乳類ＬＩＦとその他のサイトカインを組み合わせた培地が使用されている。例えば、マウス由来のリコンビナントＬＩＦを用いたニワトリの胚性幹細胞及び胚性生殖細胞の培養系確立のための研究が進められているが、その効果が低いため現在もなお培養系の確立にはいたっていない。
【０００５】
ニワトリは胚の入手が容易であり、胚の操作も容易であることから発生学の研究材料として広く使用されてきた。また、ニワトリは食肉用のみならず、卵の蛋白質生産性が高く産業上も重要であることから、トランスジェニックニワトリの作成技術の確立が求められていた。しかし、ニワトリでは、ニワトリ胚性幹細胞及び胚性生殖細胞の培養系が未確立のままで、人為的な遺伝子改変が自由に行えるレベル（トランスジェニックマウスのレベル）まで到達していなかった。そのための培養系に必須の因子であるニワトリＬＩＦの遺伝子・タンパククローニングが急がれていたが、哺乳類と種が大きく異なるニワトリでは、ＬＩＦの存在さえ未解析であった。このように、ニワトリのＬＩＦ蛋白質の製造がニワトリのトランスジェニックを作出するために求められていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、この問題点を解決するために、最新の分子生物学的手法を駆使し、ニワトリＬＩＦの遺伝子を提供するものである。この遺伝子情報を基に、ニワトリ由来ＬＩＦ蛋白質を安定に供給することができれば、これまで抱えていたトランスジェニックニワトリの作出の問題点が解決されることになる。
さらに、本発明は、本発明の遺伝子情報を基にリコンビナントＬＩＦ蛋白質を大量生産し、トランスジェニックニワトリの作出のためのニワトリ胚性幹細胞及び胚性生殖細胞の培養用試薬として供給することにより、実験用のトランスジェニックニワトリのみならず、畜産動物で最初の実用レベルなトランスジェニック体を供給することを可能にするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ニワトリの白血病阻止因子（以下、ＬＩＦという。）、及びそれをコードする遺伝子、並びにニワトリのＬＩＦの製造方法に関する。
また、本発明は、ニワトリＬＩＦからなるニワトリの分化可能な細胞の分化防止剤、それを用いたニワトリの分化防止方法、ニワトリの分化可能な細胞の培養方法、及びそれを含有してなる培地に関する。
更に本発明は、ニワトリの分化可能な細胞に外来遺伝子を導入、又は特定の遺伝子の発現を阻止するための改変をして、当該分化可能な細胞をニワトリＬＩＦの存在下に培養してなるトランスジェニックニワトリの作出方法、及びその方法で作出されたトランスジェニックニワトリに関する。
【０００８】
本発明者らは、ニワトリ単球系白血病細胞株（ＩＮ２４）をリポ多糖（ＬＰＳ）で刺激して、サブトラクション法により、ＬＰＳ刺激で過剰に発現する遺伝子をクローニングした。これらのクローンのひとつに哺乳類由来ＬＩＦに相同性（約３０％）をもつクローンを得た。
得られたクローンのｃＤＮＡの塩基配列を配列表の配列番号１に示す。この遺伝子は、７８９塩基からなり、７５番目のａｔｇから７０８番目のｔｇａまでの翻訳領域を有する２１１個のアミノ酸からなる蛋白質をコードするものと推定された。
推定される２１１個のアミノ酸からなるニワトリＬＩＦのアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。このアミノ酸配列をアミノ酸の１文字表記により表したものを次に示す。
【０００９】
ＭＲＬＩＰＡＧＶＶＰ ＦＶＡＬＬＬＬＱＲＲ ＰＶＳＧＲＡＬＬＧＴ 30
ＳＳＡＣＰＴＮＧＬＣ ＲＡＮＶＬＥＱＴＲＲ ＱＶＡＬＬＮＡＴＡＱ 60
ＤＬＦＳＬＹＬＫＣＱ ＧＥＰＦＳＳＥＳＤＲ ＬＣＳＰＳＧＩＦＦＰ 90
ＰＦＨＶＮＲＴＴＥＲ ＫＥＶＭＶＡＭＹＫＬ ＦＡＦＬＮＡＳＬＧＮ 120
ＩＴＲＤＱＥＥＬＮＰ ＭＡＫＥＬＬＮＲＬＨ ＮＴＴＫＴＴＲＧＬＩ 150
ＳＮＬＴＣＬＬＣＫＨ ＹＮＩＦＱＶＤＶＳＹ ＧＥＳＳＫＤＫＳＡＦ 180
ＫＫＫＱＱＧＣＱＶＬ ＲＫＹＶＱＶＩＡＱＡ ＡＲＶＬＬＰＨＬＳＰ 210
Ａ 211
【００１０】
また、得られたニワトリＬＩＦの遺伝子の塩基配列及びアミノ酸（１文字表記）を図１に示す。
本発明のニワトリＬＩＦの塩基配列から予想されるアミノ酸配列を、ヒトＬＩＦ及びマウスＬＩＦのアミノ酸配列と比較したものを図２に示す。図２の黒三角印はシステインの位置を示し、白三角印は糖鎖の付加可能な位置を示す。
本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子の予想されるアミノ酸配列は、マウスＬＩＦとの相同性が４０％未満であった。リコンビナントマウスＬＩＦを用いたニワトリ胚性幹細胞及び胚性生殖細胞の培養系では、部分的な作用しか認められておらず、これはマウスＬＩＦと本発明のニワトリＬＩＦの相同性が低いことから裏付けられる。しかし、蛋白質の構造を規定する重要なアミノ酸であるシステインの位置はニワトリ、ヒト、及びマウスにおいて完全に一致していた。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明のニワトリＬＩＦは、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するものに限定されるものではなく、ニワトリに対してＬＩＦの活性を有するものであるならば、配列番号２に示されるアミノ酸の一部が欠失し、他のアミノ酸で置換され、及び／又は他のアミノ酸が付加したものであってもよい。
このような欠失、置換、付加におけるアミノ酸数にはニワトリに対するＬＩＦ活性を有する限り特に制限はないが、好ましくは半数以下、１〜１００、又は１〜５０個程度である。
【００１２】
本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子は、配列表の配列番号１に示される塩基配列を有するものに限定されるものではなく、前記したニワトリに対するＬＩＦ活性を有する蛋白質をコードするものであるならば、配列番号１に示される塩基の一部が欠失し、他の塩基で置換され、及び／又は他の塩基が付加したものであってもよい。また、本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子は、２本鎖のＤＮＡとしても、１本鎖のＤＮＡとしても、またＲＮＡであってもよく、前記した本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子に相補的な塩基を有するものも本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子に包含されている。さらに、本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子はストリージェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有するものも包含されている。
【００１３】
また、本発明は、前記した本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子の断片を提供する。本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子の断片は、本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子を検出、同定又は定量するためのプローブとして、また本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子を得るためのプライマーとして利用される。
本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子の断片としては、本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子の中の５〜５０塩基、５〜３０塩基、１０〜３０塩基程度の任意の位置の配列を用いることができる。
【００１４】
本発明のニワトリＬＩＦの製造方法としては、前記した本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子を用いて公知の方法により行うことができる。例えば、配列番号１に示される塩基配列を有する遺伝子を発現ベクターに組み込んで、これを用いて宿主細胞を形質転換して、形質転換された宿主細胞を培養することにより製造することができる。宿主細胞としては大腸菌などの原核細胞や、酵母やマウスの細胞などの真核細胞を使用することができる。
本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子をもとに、原核細胞系もしくは真核細胞系を用いて、リコンビナントニワトリＬＩＦを作成することにより、トランスジェニックニワトリを作出するために必要なニワトリＬＩＦを大量に製造することができる。
【００１５】
本発明のニワトリの分化可能な細胞としては、ニワトリ胚性幹細胞、胚性生殖細胞などが挙げられる。
本発明のニワトリＬＩＦは、ニワトリの分化可能な細胞を培養する際にその培養系に添加して当該細胞の分化を防止することができる。したがって、本発明のニワトリＬＩＦは、ニワトリの分化可能な細胞の分化防止剤として使用することができる。本発明の分化防止剤は、精製された本発明のニワトリＬＩＦをそのまま使用することもできるが、適当な担体と混合して使用することもできる。また、本発明のＬＩＦを予め培地に混合して、ニワトリの分化可能な細胞を培養するための培地とすることもできる。
また、本発明は本発明のＬＩＦを用いたニワトリの分化可能な細胞の培養方法を提供する。前記した本発明の分化防止剤を培養系に添加して、又は前記した本発明の培地を用いて、ニワトリの分化可能な細胞を培養する方法を提供する。
【００１６】
さらに、本発明は、トランスジェニックニワトリの作出方法、及びこの方法で作出されたトランスジェニックニワトリを提供する。本発明の好ましいトランスジェニックニワトリの作出方法としては、ニワトリ胚性幹細胞、胚性生殖細胞などのニワトリの分化可能な細胞を、好ましくはジーンターゲッティング法などにより特定のゲノムの位置に発現可能な外来遺伝子を導入したり、また特定のゲノムの位置に特定の遺伝子の発現を阻止するための改変、例えばプロモーター領域などのエクソン領域を破壊するための外来遺伝子の導入又はコードされるアミノ酸を変更若しくは付加するための遺伝子の改変などを行うことにより、遺伝情報が改変された細胞を培養して、生育させる方法が挙げられる。ニワトリ胚性幹細胞や胚性生殖細胞を分化可能な細胞として使用した場合には、通常はキメラニワトリが得られるので、この次の世代のものが目的の遺伝子が導入又はノックアウトされたトランスジェニックニワトリとなる。
【００１７】
本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子をもとに作出されるリコンビナントニワトリＬＩＦは、トランスジェニックニワトリを作出する確立した手法を提供するための待望の発見であり、これにより、これまで不可能であったニワトリ胚性幹細胞及び胚性生殖細胞の未分化状態での継代維持が可能となり、これまでニワトリでは困難であった生体外での導入遺伝の選抜が可能となる。すなわち、これまでトランスジェニックニワトリを作出する上で問題であったすべての問題が本発明により解決されることになる。
また、これらの細胞の培養系が確立されれば、マウスレベル以上にニワトリでは、トランスジェニック体の作出が容易になり、養鶏業界では品種改良への利用、有用物質（医薬品、臨床検査試薬等）の生産（卵で生産）が可能となる。
【００１８】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１９】
実施例１ （ニワトリＬＩＦの遺伝子クローニング）
ニワトリ単球系白血病細胞株（ＩＮ２４）をリポ多糖（ＬＰＳ）で刺激したものと刺激していないものから別々にｍＲＮＡを精製し、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。
この２種の細胞から得られたｃＤＮＡを用いてクロンテックＰＣＲ選択ｃＤＮＡサブトラクションキット（CLONTECH PCR-Select cDNA Subtraction kit）を用いてサブトラクション法を行った。得られたｃＤＮＡは、ｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローニングした。これらのクローンをＪＭ１０９大腸菌に形質転換し、寒天培地上で培養後、出現したコロニーをＰＣＲ法により選抜した。選抜方法はｐＧＥＭ−Ｔベクターの塩基配列中のｐＵＣ−Ｍ１３フォーワードプライマーとリバースプライマー配列を用いてＰＣＲを行い、ベクター内にｃＤＮＡが挿入されているクローンのみを選択した。結果を図３に図面に代わる写真で示す。
【００２０】
最終的に１２２クローンを選抜し、これらのクローンのプラスミドを精製した後、オートシークエンサーを用いてそれぞれのクローンの塩基配列を決定した。
決定された塩基配列をそれぞれデータベースで照合した結果、１２２クローン中のひとつのクローンが、哺乳類（ウシ、ブタなど）由来ＬＩＦに相同性（約３０％）をもつクローンであることがわかった。
以上のことから得られたクローンが、ニワトリＬＩＦをコードする遺伝子の一部（２５９ｂｐ）であると判断した。このクローンの塩基配列をもとに、クローンテック社のスマートＲＡＣＥキット（CLONTECH Smart-RACE kit）を用いたＲＡＣＥ法により、完全長のニワトリＬＩＦのクローニングを行った。
【００２１】
得られたニワトリＬＩＦ遺伝子の塩基配列に基づいて図４に示される位置に３’用及び５’用のプライマーを用意して、アダプター配列間でＰＣＲを行った。図４の上段は前記で得られた２５９ｂｐの配列を模式的に示したものであり、下段はその具体的な配列を示したものである。
この結果、ニワトリＬＩＦの全翻訳領域を含む７８９ｂｐを決定した。
決定した塩基配列を図５に示す新たなプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法により得られた断片から確認した。図５の四角の枠の部分は翻訳領域を示し、斜線の網掛けの部分は前記のサブトラクション法により得られた２５９ｂｐの部分を示す。図５の下段の矢印はＲＴ−ＰＣＲのプライマー部分を示す。
このＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅された５０２ｂｐの断片の電気泳動の結果を図６に図面に代わる写真で示す。図６のレーンＭはマーカーを示し、黒三角印は５０２ｂｐの断片の位置を示す。
得られたニワトリＬＩＦの遺伝子の塩基配列及びアミノ酸（１文字表記）を図１に示す。また、その塩基配列を配列表の配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００２２】
【発明の効果】
本発明は、外来遺伝子を導入したニワトリ（トランスジェニックニワトリ）の作成に必須とされているニワトリＬＩＦ及びそれをコードする遺伝子を初めて提供するものである。本発明は、外来遺伝子を導入したニワトリ（トランスジェニックニワトリ）の作成に道を拓くとともに、医薬品を始め有用物質の大量生産に繋がることが期待される。これまで、トランスジェニックニワトリの作成は、ニワトリＬＩＦが不明であったことから研究の進展やその実用化が極端に遅れているが、本発明のニワトリＬＩＦの提供により、マウスと同様な程度の実用化が可能となる。
ニワトリは、胚の入手が容易で、その操作性もよいので、本発明のニワトリＬＩＦによりニワトリの胚性細胞の培養系を確立することができ、マウスレベル以上にニワトリのトランスジェニック体の作出が容易になり、実験室レベルはもとより、養鶏業界では品種改良への利用が可能となり、またニワトリの卵は蛋白質の生産性が高く有用物質（医薬品、臨床検査試薬等）の生産などの実用化が可能となる。本発明は、畜産動物で最初の実用レベルなトランスジェニック体の供給に道を拓くものである。
【００２３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のニワトリＬＩＦのアミノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
【図２】図２は、本発明のニワトリＬＩＦのアミノ酸配列を、ヒトＬＩＦ及びマウスＬＩＦのアミノ酸配列と比較したものである。
【図３】図３は、サブトラクション法により得られたクローンの中から選抜されたクローンの結果を示す図面に代わる写真である。
【図４】図４は、サブトラクション法で得られたクローンからＲＡＣＥ法を行ったときのプライマーの位置及びその配列を示す。
【図５】図５は、本発明のニワトリＬＩＦのｃＤＮＡの塩基配列の構造を模式的に示したもので、矢印は配列を確認するために行ったＲＴ−ＰＣＲ法のプライマーの位置を示す。
【図６】図６は、ＲＴ−ＰＣＲ法によって得られた５０２ｂｐ断片の結果を示す図面に代わる写真である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ニワトリの白血病阻止因子（ＬＩＦ）、及びそれをコードする遺伝子、並びにその製造方法に関する。本発明のニワトリ白血病阻止因子（ＬＩＦ）はニワトリ胚性幹細胞又は胚性生殖細胞などのニワトリの分化可能な細胞の分化防止作用を有し、ニワトリの分化可能な細胞を培養する際の分化防止剤として有用である。
また、本発明は、本発明のニワトリ白血病阻止因子（ＬＩＦ）を用いたニワトリの分化可能な細胞の培養方法、そのための培地、その方法によるトランスジェニックニワトリの作出方法、及びその方法で作出されたトランスジェニックニワトリに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、トランスジェニック動物の作成は、医学・生物学を始め広範な領域において大きな進歩をもたらしてきている。特定の遺伝子が導入されたり、また特定の遺伝子がノックアウトされた動物の作成は、これらの遺伝子の機能を解析するための重要なツールとなってきている。
これらのトランスジェニック動物の作成方法としては、受精卵に外来遺伝子を直接導入するトランスジェニック法と、胚性幹細胞（Embryonic Stem 細胞）を介した遺伝子導入法の２つの方法がある。胚性幹細胞（以下、ＥＳ細胞という。）への遺伝子の導入は、ジーンターゲッティング法により特定のゲノムの位置に目的の遺伝子を導入したり、ノックアウトすることができることから、現在広く応用されている方法である。
【０００３】
このように、ジーンターゲッティング法によるＥＳ細胞を用いたトランスジェニック動物の作成が広く利用されているが、この方法では遺伝子操作中における分化の抑制が重要な問題となる。ＥＳ細胞の培養を行う際にはフィーダー（feeder）細胞を準備するか、分化を抑制するための因子としてのＬＩＦの使用が必要である。
ＬＩＦ（白血病阻止因子（Leukemia Inhibitory Factor））は、ＩＬ−６ファミリーに属するサイトカインの１種であり、細胞を未分化の状態で維持するためには必須の物質である（Smith A., et al., Nature, 336,688-690 (1988)）。
ジーンターゲッティング法によるマウストランスジェニック体の作出にマウスＬＩＦは必須の因子であり、マウス由来のリコンビナントＬＩＦが既に製品化されている。この因子単独でマウス胚性幹細胞の培養が可能となっているが、他の動物にはＬＩＦが確立されておらず、ジーンターゲッティング法によるトランスジェニック動物の作出が困難とされている。
【０００４】
ニワトリは、卵の高い蛋白質生産性が注目され、トランスジェニックニワトリの作出が試みられている。ニワトリの受精卵は比較的取り扱いが容易であり、遺伝子を導入することは問題は少ないが、特定の位置に遺伝子を導入又はノックアウトするためにはジーンターゲッティング法によるトランスジェニックニワトリの作出が必須である。
ニワトリとマウスでは、発生様式が異なることからマウスと同様の方法ではＥＳ細胞を作出することができない。しかし、ニワトリでも発生途中の胚からＥＳ細胞に相当する細胞の分離および培養が可能である。マウスのＥＳ細胞に相当するニワトリの細胞としては、胚盤葉細胞と始原生殖細胞があり、胚盤葉細胞はマウスのＥＳ細胞に匹敵する細胞で、発生途中の胚細胞である。始原生殖細胞は、将来生殖細胞（精子や卵子）へ分化する細胞であり、体外培養が可能な株化細胞の開発が進められている。この株化細胞はＥＧ（Embryonic Germ）細胞と呼ばれている。いずれの細胞も、いかに未分化な状態を維持したまま培養するかが問題であるが、現在のところニワトリＬＩＦが発見されていないために、他の哺乳類ＬＩＦとその他のサイトカインを組み合わせた培地が使用されている。例えば、マウス由来のリコンビナントＬＩＦを用いたニワトリの胚性幹細胞及び胚性生殖細胞の培養系確立のための研究が進められているが、その効果が低いため現在もなお培養系の確立にはいたっていない。
【０００５】
ニワトリは胚の入手が容易であり、胚の操作も容易であることから発生学の研究材料として広く使用されてきた。また、ニワトリは食肉用のみならず、卵の蛋白質生産性が高く産業上も重要であることから、トランスジェニックニワトリの作成技術の確立が求められていた。しかし、ニワトリでは、ニワトリ胚性幹細胞及び胚性生殖細胞の培養系が未確立のままで、人為的な遺伝子改変が自由に行えるレベル（トランスジェニックマウスのレベル）まで到達していなかった。そのための培養系に必須の因子であるニワトリＬＩＦの遺伝子・タンパククローニングが急がれていたが、哺乳類と種が大きく異なるニワトリでは、ＬＩＦの存在さえ未解析であった。このように、ニワトリのＬＩＦ蛋白質の製造がニワトリのトランスジェニックを作出するために求められていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、この問題点を解決するために、最新の分子生物学的手法を駆使し、ニワトリＬＩＦの遺伝子を提供するものである。この遺伝子情報を基に、ニワトリ由来ＬＩＦ蛋白質を安定に供給することができれば、これまで抱えていたトランスジェニックニワトリの作出の問題点が解決されることになる。
さらに、本発明は、本発明の遺伝子情報を基にリコンビナントＬＩＦ蛋白質を大量生産し、トランスジェニックニワトリの作出のためのニワトリ胚性幹細胞及び胚性生殖細胞の培養用試薬として供給することにより、実験用のトランスジェニックニワトリのみならず、畜産動物で最初の実用レベルなトランスジェニック体を供給することを可能にするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ニワトリの白血病阻止因子（以下、ＬＩＦという。）、及びそれをコードする遺伝子、並びにニワトリのＬＩＦの製造方法に関する。
また、本発明は、ニワトリＬＩＦからなるニワトリの分化可能な細胞の分化防止剤、それを用いたニワトリの分化防止方法、ニワトリの分化可能な細胞の培養方法、及びそれを含有してなる培地に関する。
更に本発明は、ニワトリの分化可能な細胞に外来遺伝子を導入、又は特定の遺伝子の発現を阻止するための改変をして、当該分化可能な細胞をニワトリＬＩＦの存在下に培養してなるトランスジェニックニワトリの作出方法、及びその方法で作出されたトランスジェニックニワトリに関する。
【０００８】
本発明者らは、ニワトリ単球系白血病細胞株（ＩＮ２４）をリポ多糖（ＬＰＳ）で刺激して、サブトラクション法により、ＬＰＳ刺激で過剰に発現する遺伝子をクローニングした。これらのクローンのひとつに哺乳類由来ＬＩＦに相同性（約３０％）をもつクローンを得た。
得られたクローンのｃＤＮＡの塩基配列を配列表の配列番号１に示す。この遺伝子は、７８９塩基からなり、７５番目のａｔｇから７０８番目のｔｇａまでの翻訳領域を有する２１１個のアミノ酸からなる蛋白質をコードするものと推定された。
推定される２１１個のアミノ酸からなるニワトリＬＩＦのアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。このアミノ酸配列をアミノ酸の１文字表記により表したものを次に示す。
【０００９】
ＭＲＬＩＰＡＧＶＶＰ ＦＶＡＬＬＬＬＱＲＲ ＰＶＳＧＲＡＬＬＧＴ 30
ＳＳＡＣＰＴＮＧＬＣ ＲＡＮＶＬＥＱＴＲＲ ＱＶＡＬＬＮＡＴＡＱ 60
ＤＬＦＳＬＹＬＫＣＱ ＧＥＰＦＳＳＥＳＤＲ ＬＣＳＰＳＧＩＦＦＰ 90
ＰＦＨＶＮＲＴＴＥＲ ＫＥＶＭＶＡＭＹＫＬ ＦＡＦＬＮＡＳＬＧＮ 120
ＩＴＲＤＱＥＥＬＮＰ ＭＡＫＥＬＬＮＲＬＨ ＮＴＴＫＴＴＲＧＬＩ 150
ＳＮＬＴＣＬＬＣＫＨ ＹＮＩＦＱＶＤＶＳＹ ＧＥＳＳＫＤＫＳＡＦ 180
ＫＫＫＱＱＧＣＱＶＬ ＲＫＹＶＱＶＩＡＱＡ ＡＲＶＬＬＰＨＬＳＰ 210
Ａ 211
【００１０】
また、得られたニワトリＬＩＦの遺伝子の塩基配列及びアミノ酸（１文字表記）を図１に示す。
本発明のニワトリＬＩＦの塩基配列から予想されるアミノ酸配列を、ヒトＬＩＦ及びマウスＬＩＦのアミノ酸配列と比較したものを図２に示す。図２の黒三角印はシステインの位置を示し、白三角印は糖鎖の付加可能な位置を示す。
本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子の予想されるアミノ酸配列は、マウスＬＩＦとの相同性が４０％未満であった。リコンビナントマウスＬＩＦを用いたニワトリ胚性幹細胞及び胚性生殖細胞の培養系では、部分的な作用しか認められておらず、これはマウスＬＩＦと本発明のニワトリＬＩＦの相同性が低いことから裏付けられる。しかし、蛋白質の構造を規定する重要なアミノ酸であるシステインの位置はニワトリ、ヒト、及びマウスにおいて完全に一致していた。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明のニワトリＬＩＦは、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するものに限定されるものではなく、ニワトリに対してＬＩＦの活性を有するものであるならば、配列番号２に示されるアミノ酸の一部が欠失し、他のアミノ酸で置換され、及び／又は他のアミノ酸が付加したものであってもよい。
このような欠失、置換、付加におけるアミノ酸数にはニワトリに対するＬＩＦ活性を有する限り特に制限はないが、好ましくは半数以下、１〜１００、又は１〜５０個程度である。
【００１２】
本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子は、配列表の配列番号１に示される塩基配列を有するものに限定されるものではなく、前記したニワトリに対するＬＩＦ活性を有する蛋白質をコードするものであるならば、配列番号１に示される塩基の一部が欠失し、他の塩基で置換され、及び／又は他の塩基が付加したものであってもよい。また、本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子は、２本鎖のＤＮＡとしても、１本鎖のＤＮＡとしても、またＲＮＡであってもよく、前記した本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子に相補的な塩基を有するものも本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子に包含されている。さらに、本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子はストリージェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有するものも包含されている。
【００１３】
また、本発明は、前記した本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子の断片を提供する。本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子の断片は、本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子を検出、同定又は定量するためのプローブとして、また本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子を得るためのプライマーとして利用される。
本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子の断片としては、本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子の中の５〜５０塩基、５〜３０塩基、１０〜３０塩基程度の任意の位置の配列を用いることができる。
【００１４】
本発明のニワトリＬＩＦの製造方法としては、前記した本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子を用いて公知の方法により行うことができる。例えば、配列番号１に示される塩基配列を有する遺伝子を発現ベクターに組み込んで、これを用いて宿主細胞を形質転換して、形質転換された宿主細胞を培養することにより製造することができる。宿主細胞としては大腸菌などの原核細胞や、酵母やマウスの細胞などの真核細胞を使用することができる。
本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子をもとに、原核細胞系もしくは真核細胞系を用いて、リコンビナントニワトリＬＩＦを作成することにより、トランスジェニックニワトリを作出するために必要なニワトリＬＩＦを大量に製造することができる。
【００１５】
本発明のニワトリの分化可能な細胞としては、ニワトリ胚性幹細胞、胚性生殖細胞などが挙げられる。
本発明のニワトリＬＩＦは、ニワトリの分化可能な細胞を培養する際にその培養系に添加して当該細胞の分化を防止することができる。したがって、本発明のニワトリＬＩＦは、ニワトリの分化可能な細胞の分化防止剤として使用することができる。本発明の分化防止剤は、精製された本発明のニワトリＬＩＦをそのまま使用することもできるが、適当な担体と混合して使用することもできる。また、本発明のＬＩＦを予め培地に混合して、ニワトリの分化可能な細胞を培養するための培地とすることもできる。
また、本発明は本発明のＬＩＦを用いたニワトリの分化可能な細胞の培養方法を提供する。前記した本発明の分化防止剤を培養系に添加して、又は前記した本発明の培地を用いて、ニワトリの分化可能な細胞を培養する方法を提供する。
【００１６】
さらに、本発明は、トランスジェニックニワトリの作出方法、及びこの方法で作出されたトランスジェニックニワトリを提供する。本発明の好ましいトランスジェニックニワトリの作出方法としては、ニワトリ胚性幹細胞、胚性生殖細胞などのニワトリの分化可能な細胞を、好ましくはジーンターゲッティング法などにより特定のゲノムの位置に発現可能な外来遺伝子を導入したり、また特定のゲノムの位置に特定の遺伝子の発現を阻止するための改変、例えばプロモーター領域などのエクソン領域を破壊するための外来遺伝子の導入又はコードされるアミノ酸を変更若しくは付加するための遺伝子の改変などを行うことにより、遺伝情報が改変された細胞を培養して、生育させる方法が挙げられる。ニワトリ胚性幹細胞や胚性生殖細胞を分化可能な細胞として使用した場合には、通常はキメラニワトリが得られるので、この次の世代のものが目的の遺伝子が導入又はノックアウトされたトランスジェニックニワトリとなる。
【００１７】
本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子をもとに作出されるリコンビナントニワトリＬＩＦは、トランスジェニックニワトリを作出する確立した手法を提供するための待望の発見であり、これにより、これまで不可能であったニワトリ胚性幹細胞及び胚性生殖細胞の未分化状態での継代維持が可能となり、これまでニワトリでは困難であった生体外での導入遺伝の選抜が可能となる。すなわち、これまでトランスジェニックニワトリを作出する上で問題であったすべての問題が本発明により解決されることになる。
また、これらの細胞の培養系が確立されれば、マウスレベル以上にニワトリでは、トランスジェニック体の作出が容易になり、養鶏業界では品種改良への利用、有用物質（医薬品、臨床検査試薬等）の生産（卵で生産）が可能となる。
【００１８】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１９】
実施例１ （ニワトリＬＩＦの遺伝子クローニング）
ニワトリ単球系白血病細胞株（ＩＮ２４）をリポ多糖（ＬＰＳ）で刺激したものと刺激していないものから別々にｍＲＮＡを精製し、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。
この２種の細胞から得られたｃＤＮＡを用いてクロンテックＰＣＲ選択ｃＤＮＡサブトラクションキット（CLONTECH PCR-Select cDNA Subtraction kit）を用いてサブトラクション法を行った。得られたｃＤＮＡは、ｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローニングした。これらのクローンをＪＭ１０９大腸菌に形質転換し、寒天培地上で培養後、出現したコロニーをＰＣＲ法により選抜した。選抜方法はｐＧＥＭ−Ｔベクターの塩基配列中のｐＵＣ−Ｍ１３フォーワードプライマーとリバースプライマー配列を用いてＰＣＲを行い、ベクター内にｃＤＮＡが挿入されているクローンのみを選択した。結果を図３に図面に代わる写真で示す。
【００２０】
最終的に１２２クローンを選抜し、これらのクローンのプラスミドを精製した後、オートシークエンサーを用いてそれぞれのクローンの塩基配列を決定した。
決定された塩基配列をそれぞれデータベースで照合した結果、１２２クローン中のひとつのクローンが、哺乳類（ウシ、ブタなど）由来ＬＩＦに相同性（約３０％）をもつクローンであることがわかった。
以上のことから得られたクローンが、ニワトリＬＩＦをコードする遺伝子の一部（２５９ｂｐ）であると判断した。このクローンの塩基配列をもとに、クローンテック社のスマートＲＡＣＥキット（CLONTECH Smart-RACE kit）を用いたＲＡＣＥ法により、完全長のニワトリＬＩＦのクローニングを行った。
【００２１】
得られたニワトリＬＩＦ遺伝子の塩基配列に基づいて図４に示される位置に３’用及び５’用のプライマーを用意して、アダプター配列間でＰＣＲを行った。図４の上段は前記で得られた２５９ｂｐの配列を模式的に示したものであり、下段はその具体的な配列を示したものである。
この結果、ニワトリＬＩＦの全翻訳領域を含む７８９ｂｐを決定した。
決定した塩基配列を図５に示す新たなプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法により得られた断片から確認した。図５の四角の枠の部分は翻訳領域を示し、斜線の網掛けの部分は前記のサブトラクション法により得られた２５９ｂｐの部分を示す。図５の下段の矢印はＲＴ−ＰＣＲのプライマー部分を示す。
このＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅された５０２ｂｐの断片の電気泳動の結果を図６に図面に代わる写真で示す。図６のレーンＭはマーカーを示し、黒三角印は５０２ｂｐの断片の位置を示す。
得られたニワトリＬＩＦの遺伝子の塩基配列及びアミノ酸（１文字表記）を図１に示す。また、その塩基配列を配列表の配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００２２】
【発明の効果】
本発明は、外来遺伝子を導入したニワトリ（トランスジェニックニワトリ）の作成に必須とされているニワトリＬＩＦ及びそれをコードする遺伝子を初めて提供するものである。本発明は、外来遺伝子を導入したニワトリ（トランスジェニックニワトリ）の作成に道を拓くとともに、医薬品を始め有用物質の大量生産に繋がることが期待される。これまで、トランスジェニックニワトリの作成は、ニワトリＬＩＦが不明であったことから研究の進展やその実用化が極端に遅れているが、本発明のニワトリＬＩＦの提供により、マウスと同様な程度の実用化が可能となる。
ニワトリは、胚の入手が容易で、その操作性もよいので、本発明のニワトリＬＩＦによりニワトリの胚性細胞の培養系を確立することができ、マウスレベル以上にニワトリのトランスジェニック体の作出が容易になり、実験室レベルはもとより、養鶏業界では品種改良への利用が可能となり、またニワトリの卵は蛋白質の生産性が高く有用物質（医薬品、臨床検査試薬等）の生産などの実用化が可能となる。本発明は、畜産動物で最初の実用レベルなトランスジェニック体の供給に道を拓くものである。
【００２３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のニワトリＬＩＦのアミノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
【図２】図２は、本発明のニワトリＬＩＦのアミノ酸配列を、ヒトＬＩＦ及びマウスＬＩＦのアミノ酸配列と比較したものである。
【図３】図３は、サブトラクション法により得られたクローンの中から選抜されたクローンの結果を示す図面に代わる写真である。
【図４】図４は、サブトラクション法で得られたクローンからＲＡＣＥ法を行ったときのプライマーの位置及びその配列を示す。
【図５】図５は、本発明のニワトリＬＩＦのｃＤＮＡの塩基配列の構造を模式的に示したもので、矢印は配列を確認するために行ったＲＴ−ＰＣＲ法のプライマーの位置を示す。
【図６】図６は、ＲＴ−ＰＣＲ法によって得られた５０２ｂｐ断片の結果を示す図面に代わる写真である。
Claims (6)
- 配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２に示されるアミノ酸の一部が欠失し、他のアミノ酸で置換され、及び／又は他のアミノ酸が付加したアミノ酸配列を有し、ニワトリの白血病阻止因子（ＬＩＦ）活性を有するニワトリの白血病阻止因子（ＬＩＦ）。
- 請求項１に記載されるニワトリの白血病阻止因子（ＬＩＦ）をコードする遺伝子。
- ニワトリの白血病阻止因子（ＬＩＦ）をコードする遺伝子が、配列表の配列番号１に示される塩基配列、又は配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなる請求項２に記載の遺伝子。
- 請求項２又は３に記載の遺伝子を用いてニワトリの白血病阻止因子（ＬＩＦ）を製造する方法。
- 請求項２又は３に記載の遺伝子を含有してなるベクター。
- ベクターが発現ベクターである請求項５に記載のベクター。
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