DE69028514T2

DE69028514T2 - Leukämiehemmender faktor aus vieharten und seine verwendung zur verbesserung der implantation und der entwicklung von embryonalen zellen

Info

Publication number: DE69028514T2
Application number: DE69028514T
Authority: DE
Inventors: Nicholas Gough; Robert Seamark; Tracey Willson
Original assignee: Amrad Corp Ltd
Current assignee: CSL Innovation Pty Ltd
Priority date: 1989-01-10
Filing date: 1990-01-09
Publication date: 1997-02-20
Anticipated expiration: 2010-01-10
Also published as: US5962321A; DE69028514D1; JPH04502554A; US5641676A; WO1990008188A1; ATE142695T1; EP0453453A4; EP0453453A1; CA2045126A1; NZ232072A; US5418159A; JP2974760B2; EP0453453B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen die Verwendung des Leukämiehemmfaktors (LIF) zur Verbesserung der Implantation und Entwicklung von embryonalen Zellen.
LIF ist ein Protein, das bereits in großen Mengen in gereinigter rekombinanter Form aus E. coli und Hefezellen kloniert, produziert und gereinigt worden ist (internationale Patentanmeldung Nr. PCT/AU88/00093). Gemäß Definition ist LIF ein Faktor mit den folgenden Eigenschaften:
1. Der Fähigkeit zur Unterdrückung der Proliferation von myeloiden leukämischen Zellen, wie M1-Zellen, mit einer damit verbundenen Differenzierung der leukämischen Zellen; und
2. der Fähigkeit zum Konkurrieren mit einem Molekül mit der definierten Sequenz von Mäuse-LIF oder Human-LIF (definiert in der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/AU88/00093) um das Binden an spezielle zelluläre Rezeptoren auf M1-Zellen oder Mäuse- oder Humanmakrophagen. Neben den bisher für Mäuse- und Human-LIF beschriebenen biologischen Eigenschaften wurde festgestellt, daß LIF die folgenden weiteren Eigenschaften besitzt:
(a) Er behält in vitro in Abwesenheit von Nährzellen den pluripotenten Phenotyp der Mäuseembryonenstamm (ES)- Zellinien D3 und EK-cs4 (abgeleitet von Stamm 129/SV- Blastozysten) und CBL63 und HD5 (abgeleitet von C57BL/6-Blastozysten) bei (vgl. internationale Patentanmeldung PCT/AU89/00330);
(b) er gewährleistet, daß die obigen ES-Zellinien nach einer Passage in vitro in Gegenwart von LIF bei Wiedereinführen in die Embryonenumgebung an den Geweben von chimären Mäusen teilhaben;
(c) er zeigt eine selektive Bindung an hohe Affinität aufweisende Rezeptoren auf Mäuse-ES-Zellen (EK-cs1- und D3-Zellen) und embryonalen Karzinom (EC)-Zellen (PCC3- 3A-, F9-, PC13-, P19- und MG2-Zellen); und
(d) das spezifische Binden von ¹²&sup5;I-LIF an hohe Affinität aufweisende Rezeptoren findet nicht in Konkurrenz mit Insulin, IGF-I, IGF-II, saurem und basischem FGF, TGFβ, TNFα, TNFβ, NGF, PDGF, EGF, IL-1, IL-2, IL-4, GM-CSF, G-CSF, Mulit-CSF oder Erythropoietin, jedoch in Konkurrenz mit Mäuse- und Human-LIF statt.
Folglich ist LIF ein wichtiges Hormon mit einer Verwendbarkeit auf dem allgemeinen Gebiet der in-vitro-Embryologie, wie bei der Aufrechterhaltung von ES-Zellinien und der Erhöhung der Wirksamkeit eines Embryonentransfers. Somit besitzt LIF wichtige Anwendungsgebiete in der Viehindustrie. Dies ist bei der Verwendung von ES-Zellen besonders offensichtlich, um einen Weg zur Erzeugung von transgenen Tieren bereitzustellen.
Eine mit den gegenwärtigen in-vitro-Fertilisations (IVF) - und Embryonentransfer (ET)-Programmen verbundene Hauptschwierigkeit insbesondere bei Menschen ist die niedrige Erfolgsrate, die bei der Implantation von befruchteten Embryos erreicht wird. Gegenwärtig liegt die Implantationsrate bei menschlichen IVF-Programmen bei nur 10%. Dies führt zu der gegenwärtigen Praxis, daß bis zu vier befruchtete Embryos bei jeder Behandlung verwendet werden, wodurch es wiederum gelegentlich zu Mehrfachgeburten kommt. Folglich besteht ein Bedarf, die Implantationsrate bei Human-IVF-Programmen zu verbessern. In ähnlicher Weise ist es bei IVF- und ET-Behandlungen von Haustieren, wie Schafen, Rindern, Schweinen und Ziegen, aus ökonomischen Gründen in hohem Maße wünschenswert, eine möglichst hohe Implantationsrate zu erreichen, um die Zahl der befruchteten Embryos, die verloren gehen, und der nicht erfolgreich durchgeführten Behandlungen zu verringern.
In der Entwicklung eines Säugetierembryos durchläuft das befruchtete Ei eine Reihe von Stufen, einschließlich der Morulastufe und der Blastozystenstufe. In der Blastozystenstufe bilden die Zellen eine als das Trophectoderm (dies ist der Vorläufer der Placenta) bekannte äußere Zellschicht sowie eine innere Zellmasse (aus der das gesamte des eigentlichen Embryos hervorgeht). Der Blastozyst ist von der Zona Pellucida, die nachfolgend verlorengeht, wenn der Blastozyst "ausschlüpft bzw. ausgebrütet wird". Die Zellen des Trophectoderms können dann in der Implantationsstufe mit der Wand des Uterus in enge Berührung treten. Vor der Bildung des eigentlichen Embryos durch die innere Zellmasse durch Gastrulation wird die gesamte Zellmasse als "Präembryo" bezeichnet.
Obwohl LIF von einer Spezies, beispielsweise bei der Aufrechterhaltung von ES-Zellinien einer anderen oder heterologen Spezies, wirksam sein kann, sollten vorzugsweise homologe Systeme unter Verwendung von LIF und ES-Zellinien aus derselben Spezies entwickelt werden. Es wurde festgestellt, daß Mäuse-LIF-DNA verwendet werden kann, um das LIF-Gen aus einem breiten Bereich von Säugetiergenomen zu identifizieren und das Gen mit Kodierung von LIF aus einer Viehspezies, wie Schweinen oder Schafen, zu klonieren und somit eine LIF- Quelle zur Verwendung bei der Entwicklung von verschiedenen in-vitro-Embryogenesevorgängen, wie ES-Zellinien- und Embryotransfer bei Vieharten, bereitzustellen.
Es wurde nun festgestellt, daß, wenn LIF in einem in-vitro- Embryokulturmedium enthalten ist, der Brütvorgang verbessert wird, wodurch die Zahl der Embryos, die die Entwicklungsstufe durch Durchlaufen von mit der Implantation verbundenen Entwicklungsänderungen vollenden, erhöht wird. Als Ergebnis kann die Implantationsrate für IVF- und ET-Programme durch die Verwendung von LIF in dem in-vitro-Embryokulturmedium deutlich verbessert werden.
Gegenstand eines Aspekts der vorliegenden Erfindung ist folglich eine Verfahren zur Verstärkung der in-vitro-Entwicklung eines Säugetierembryos bis zur Implantationsstufe, wobei das Verfahren die Stufe des in-vitro-Kultivierens des Embryos in einem eine wirksame Menge Säugetier-LIF enthaltenden Kulturmedium während einer zur Verstärkung der Entwicklung eines Embryos bis zur Implantationsstufe ausreichenden Zeit und unter zur Verstärkung der Entwicklung eines Embryos bis zur Implantationsstufe ausreichenden Bedingungen umfaßt.
Erfindungsgemäß verwendbares LIF kann durch rekombinante Maßnahmen aus einem geeigneten LIF-Gen hergestellt werden. Geeignete LIF-Gene sind solche von beliebigen Viehspezies, die durch Kreuzhybridisierung mit einer Nucleotidsonde zu Mäuse-LIF nachgewiesen werden können. Das heißt, ein erstes Nukleinsäuremolekül mit Kodierung für einen Leukämiehemmfaktor einer Viehspezies umfaßt eine Nucleotidsequenz mit der Fähigkeit, mit einem zweiten Nukleinsäuremolekül mit Kodierung für Mäuseleukämiehemmfaktor oder ein Teil hiervon zu hybridisieren.
Der hier und im folgenden verwendete Ausdruck "Nucleotidsonde" bedeutet eine DNA- oder RNA-Sequenz oder eine beliebige Kombination hiervon mit der Fähigkeit, komplementäre Sequenzen durch Hybridisierungstechniken, beispielsweise - ohne darauf begrenzt zu sein - Southernblotting oder Northernblotting oder Koloniehybridisierung, nachzuweisen. Die Sonde kann eine kleine Zahl von Nucleotiden (beispielsweise 6 bis 20) oder das gesamte Gen oder ein Teil oder Teile eines Gens umfassen. Die Sonde kann mit einem detektierbaren bzw. nachweisbaren Signal (beispielsweise einem radioaktiven Isotop) markiert sein.
Unter dem Ausdruck "Nukleinsäure" wird ein Polymer aus vier oder mehr Nudeotiden verstanden, worin die 3'-Position eines Nucleotidzuckers mit der 5'-Position des nächsten Nucleotids über eine Phosphodiesterbrücke verbunden ist. Die Nukleinsäure soll hier und im folgenden lineare oder kreisförmige, einzelsträngige oder doppelsträngige DNA oder RNA sein können.
Der hier und im folgenden verwendete Ausdruck "Viehspezies" soll in seinem allgemeinsten Sinn - ohne darauf begrenzt zu sein - Schafe, Kühe, Schweine, Pferde, Esel und dgl. umfassen. In einer stärker bevorzugten Form umfaßt der Ausdruck Viehspezies Schafe oder Schweine.
Der hier und im folgenden verwendete Ausdruck "Hybridisieren" bedeutet die Fähigkeit zur Ausbildung einer doppelsträngigen dritten Nukleinsäure durch Bildung von Basenpaaren zwischen einzelnen Strängen einer ersten und zweiten Nukleinsäure unter geeigneten Stringenzbedingungen. Die verwendeten Stringenzbedingungen hängen von der relativen Homologie zwischen den relevanten Strängen der ersten und zweiten Nukleinsäuremoleküle ab. Herkömmliche Stringenzbedingungen finden sich bei Maniatis und Mitarbeitern (1982) oder beispielsweise in den nicht beschränkenden Beispielen der vorliegenden Beschreibung.
Wenn folglich die Nukleinsäuren doppelsträngige Moleküle sind, ist das LIF-Gen eine erste Nukleinsäure mit Kodierung für einen Teil oder Teile eines Viehspezies-Leukämiehemmfaktors, die auf einem Strang eine Nucleotidsequenz mit der Fähigkeit, mit einem Strang einer zweiten Nukleinsäure mit Kodierung für einen Teil oder Teile von Mäuse-LIF zu hybridisieren, umfaßt.
Obwohl die Isolierung eines geeigneten LIF-Gens zur Erzeugung von rekombinantem LIF zur erfindungsgemäßen Verwendung durch die zweite Nukleinsäure mit Kodierung für Mäuse-LIF oder Teile hiervon an einem Beispiel veranschaulicht wird, ist es möglich, daß eine unterschiedliche Nukleinsäure mit Kodierung für Nicht-Mäuse-LIF, jedoch mit der Fähigkeit zur Hybridisierung mit Mäuse-LIF-Nukleinsäure verwendet werden kann. Die Verwendung einer für Nicht-Mäuse-LIF kodierenden zweiten Nukleinsäure ist folglich auch in geeigneter Weise möglich, vorausgesetzt, daß die für Nicht-Mäuse-LIF kodierende Nukleinsäure mit der zweiten Nukleinsäure mit Kodierung für Mäuse-LIF oder Teile hiervon hybridisieren kann.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich (auch) auf die Verwendung von Nukleinsäuren mit Kodierung für die vollständige Länge aufweisende LIF-Moleküle oder von einem Teil oder Teilen von LIF-Molekülen zur Herstellung von rekombinantem LIF zur erfindungsgemäßen Verwendung. Folglich können die Nukleinsäuren die vollständige Kodiersequenz von Säugetier-LIF aufweisen oder einzelne oder mehrere Nucleotidadditionen, -deletionen und/oder -substitutionen tragen oder gerade einen Teil des LIF-Moleküls, beispielsweise einen N- terminalen oder C-terminalen Teil, darstellen. Folglich umfaßt der Ausdruck "Teile" eines LIF-Moleküls eine beliebige oder mehrere benachbarte Aminosäurereihen, die in einem LIF- Molekül enthalten sind, und darüber hinaus natürliche, chemische und/oder rekombinante Derivate.
Wenn folglich rekombinanter LIF erfindungsgemäß verwendet werden soll, sind die die erste oben definierte Nukleinsäure umfassenden rekombinanten DNA- oder RNA-Moleküle derart mit einer oder mehreren Regulatorbereichen operativ verknüpft, daß die ersten Nukleinsäure in einem geeigneten Wirt und unter den erforderlichen Bedingungen in ein rekombinantes LIF-Produkt oder ein Derivat oder einen Teil hiervon transkribiert und translatiert wird. Das rekombinante Molekül umfaßt des weiteren einen für den angestrebten Wirt geeigneten Replikationsbereich oder kann mehr als einen Replikationsbereich umfassen, wenn mehr als ein Wirt verwendet wird. Vektoren und geeignete Wirte sind dem Fachmann auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannt und sind in den nicht beschränkenden Beispielen der vorliegenden Beschreibung, in der PCT/AU88/00093 und bei Maniatis und Mitarbeitern (1982) beschrieben.
Die vorliegende Erfindung zur Verstärkung der in-vitro- Entwicklung eines Säugetierembryos bis zur Implantationsstufe erstreckt sich auf die Verwendung von rekombinantem Vieh- LIF und vorzugsweise - ohne darauf begrenzt zu sein - von Schaf- und Schweine-LIF oder Derivaten oder Teilen hiervon. Derartige Derivate oder Teile hiervon wurden oben beschrieben, umfassen jedoch einzelne oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -additionen neben dem oder in dem natürlichen oder synthetischen Vieh-LIF-Molekül. Die Bedingungen zur Herstellung von rekombinantem LIF sind in der internationalen Patentanmeldung PCT/AU88/00093 beschrieben, obwohl Abweichungen und/oder Modifikationen zur diesen Bedingungen in Abhängigkeit von der verwendeten Wirtzelle durchgeführt werden können. Jede beliebige derartige Variation und/oder Modifikation soll unter den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen. Die Wirtzellen können eukaryontische Zellen (beispielsweise Hefezellen, Säugetierzellen, Pflanzenzellen usw.) oder prokaryontische Zellen (beispielsweise Escherichia-coli-Zellen, Bacillus-sp.-Zellen, Pseudomonas-sp.-Zellen usw.) sein.
Vorzugsweise läßt man sich die Präembryos bis zur Stufe der Bildung der Blastozysten (Präbrütembryos) entwickeln, bevor LIF in das Kulturmedium eingetragen wird, da es sich gezeigt hat, daß LIF den Brütprozeß verstärkt, wodurch es zu einer höheren Zahl von Embryos kommt, die diese Entwicklungsstufe vollenden. Wie im folgenden gezeigt werden wird, erhöht jedoch das Einbringen von LIF in das Kulturmedium vor der Bildung der Blastozysten oder sowohl vor als auch nach der Blastozystenbildung auch die Zahl der Präembryos, die die Entwicklungsstufe vollenden, indem mit der Implantation verbundene Entwicklungsveränderungen durchlaufen werden. Als Ergebnis kann die Implantationsrate von IVF- und ET-Programmen durch die Verwendung von LIF in dem in-vitro-Kulturmedium deutlich verbessert werden.
Der hier und im folgenden verwendete Ausdruck "Säugetierembryos" soll in seinem breitesten Sinn Embryos von Menschen, Wiederkäuern oder anderen Vieharten umfassen. Es ist jedoch selbstverständlich, daß, obwohl die vorliegende Erfindung anhand der Entwicklung von Mäuseembryos in vitro veranschaulicht wird, sich die vorliegende Erfindung auch auf die Verwendung von LIF bei der Entwicklung von Embryos anderer Spezies, einschließlich Menschen, Wiederkäuern und Tieren, wie Schafen, Rindern, Pferden, Eseln, Ziegen und dgl., erstreckt.
Der hier und im folgenden verwendete Ausdruck "Säugetier- LIF" umfaßt Human-, Mäuse-, Wiederkäuer-LIF und LIF anderer Viehspezies, wie von Schafen, Schweinen, Rindern, Ziegen, Eseln, Pferden und dgl.

In den Figuren zeigen:

Fig. 1 betrifft Beispiel 1. Die Identifizierung von LIF-Genhomologen in DNA von verschiedenen Säugetierspezies durch Kreuzhybridisierung mit einer Mäuse-cDNA-Sonde.
Fig. 2 zeigt die Nucleotidsequenz des Schweine-LIF-Gens. Der mit der mRNA synonyme Strang von zwei Teilen des Schweine- LIF-Gens mit einer Größe von 2,07 kbp der aus dem Klon λPGLIF-E2 stammenden Sequenz, der die beiden Exons mit Kodierung für das reife Protein des Schweine-LIF-Gens umspannt, ist unter Verwendung des Einbuchstabencodes nach allgemein üblicher Standardpraxis, worin A für Desoxyadenosin-5'-phosphat, C für Desoxycytidin-5'-phosphat, G für Desoxyguanosin-5'-phosphat und T für Desoxythymidin-5'-phosphat stehen, in 5'- T 3'-Richtung angegeben. Die durch die beiden Exons des durch Homologie mit der Mäuse-, Human- und Schaf-cDNA und den Gensequenzen (internationale Patentanmeldung Nr. PCT/AU88/00093) definierten Schweine-LIF-Gens kodierte Aminosäuresequenz ist die über der Gensequenz angegebene Sequenz, wobei ALA für Alanin, ARG für Arginin, ASN für Asparagin, ASP für Asparaginsäure, CYC für cystein, GLN für Glutamin, GLU für Glutaminsäure, GLY für Glycin, HIS für Histidin, ILE für Isoleucin, PHE für Phenylalanin, PRO für Prolin, SER für Serin, THR für Threonin, TRP für Tryptophan, TYR für Tyrosin und VAL für Valin stehen.
Fig. 3 zeigt die Nucleotidsequenz des Schaf-LIF-Gens. Der zur mRNA synonyme Strang von drei Teilen des Schaf-LIF-Gens mit einer Größe von ungefähr 1,5 kbp der aus dem Klon λOGLIFR2 stammenden Sequenz, der die drei Proteinkodierbereiche des Schaf-LIF-Gens umspannt, ist unter Verwendung des Einbuchstabencodes gemäß üblicher Standardpraxis in 5' T 3'-Richtung angegeben, wobei A für Desoxyadenosin-5'-phosphat, C für Desoxycytidin-5'-phosphat, G für Desoxyguanosin- 5'-phosphat und T für Desoxythymidin-5'-phosphat stehen. Die durch die drei Exons des Schaf-LIF-Gens gemäß Definition durch Homologie mit der Mäuse- und Human-cDNA und Gensequenzen (internationale Patentanmeldung PCT/AU88/00093) kodierte Aminosäuresequenz ist über der Gensequenz angegeben, wobei ALA für Alanin, ARG für Arginin, ASN für Asparagin, ASP für Asparaginsäure, CYS für cystein, GLN für Glutamin, GLU für Glutaminsäure, GLY für Glycin, HIS für Histidin, ILE für Isoleucin, PHE für Phenylalanin, PRO für Prolin, SER für Serin, THR für Threonin, TRP für Tryptophan, TYR für Tyrosin und VAL für Valin stehen.
Fig. 4 zeigt die Aminosäuresequenz von Schweine-LIF und einen Vergleich mit Mäuse-, Human- und Schaf-LIF. Die Aminosäuresequenz von Mäuse-LIF (M) gemäß Bestimmung durch direkte Aminosäuresequenzierung und Nucleotidsequenzanalyse von für LIF kodierenden cDNAS (PCT/AU88/00093) ist in der obersten Zeile, die entsprechende Human- und Schafaminosäuresequenz (H und O) gemäß Bestimmung durch Nucleotidsequenzanalyse der Human- und Schaf-LIF-Gene (PCT/AU88/00093) in der mittleren Zeile und die entsprechende Sequenz von Schweine- LIF (P) in der unteren Zeile angegeben. Der N-terminale Rest von reifem Mäuse-LIF gemäß Bestimmung durch direkte Aminosäuresequenzierung ist als + 1 bezeichnet. Identitäten zwischen Mäuse- und Human-LIF, zwischen Human- und Schaf-LiF oder zwischen Schaf- und Schweine-LIF sind durch Sterne und konservative Substitutionen (Arg/Lys; Glu/Asp; Ser/Thr; Ile/Leu/Val) durch Striche angegeben.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung weiter veranschaulichen. Die Beispiele 1 bis 4 zeigen, wie erfindungsgemäß verwendbarer LIF hergestellt werden kann.

BEISPIEL 1

Identifizierung von Säugetier-LIF-Genen durch Kreuzhybridisierung mit einer Mäuse-LIF-cDNA-Sonde

Es wurde jüngst (PCT/AU88/00093) ein Verfahren zur Verwendung eines radioaktiv markierten Fragments von Mäuse-LIF- cDNA als Hybridisierungssonde beschrieben, um das Human-LIF- Gen auf Southernblots nachzuweisen. Fig. 1 zeigt, daß ähnliche Bedingungen verwendet werden können, um mutmaßliche LIF- Genhomologe in verschiedenen Säugetier-DNAs, einschließlich der DNA von Schafen, Schweinen, Kühen, Meerschweinchen, Hunden, Affen, Menschen und Ratten, nachzuweisen. Es ist darauf hinzuweisen, daß in jeder Spezies unter Verwendung dieser Sonde lediglich ein einziges Gen nachgewiesen wird, wobei es keine Hinweise auf Wiederholungssequenzen gibt. Es ist ferner darauf hinzuweisen, daß die Hybridisierungsintensität der mutmaßlichen LIF-Genhomologen unter der der Mäusesonde gegenüber Nagetier-DNA liegt. Dies deutet auf einen niedrigeren Homologiegrad hin.
Jede Spur auf dem Gel enthält 10 µg Genom-DNA aus einer jeden der angegebenen Spezies, die vollständig mit der Restriktionsendonuclease BamHI verdaut worden war. Nach einer Elektrophorese durch ein 0,8% g/v Agarosegel und einer Übertragung auf Nitrocellulose unter Verwendung von Standardbedingungen wurde die immobilisierte DNA mit einem Fragment von Mäuse-LIF-cDNA aus dem durch Nicktranslation auf eine spezifische Aktivität von ungefähr 2 x 10&sup8; cpm/µg ³²P-markierten Klon PpLIF7-2b (PCT/AU88/00093) hybridisiert. Das Filter wurde vorhybridisiert und bei 65ºC in 0,9 M NaCl, 0,09 M Natriumcitrat (6 x SSC), 0,2% g/v Ficoll, 0,2% g/v Polyvinylpyrrolidin, 0,2% g/v Rinderserumalbumin, 50 µg/ml E.-coli-tRNA, 0,1 mM ATP und 2 mM Natriumpyrophosphat hybridisiert. Während der Hybridisierung wurden 0,1% g/v SDS und die Sonde in einer Menge von ungefähr 2 x 10&sup7; cpm/ml zugegeben. Nach 16stündiger Hybridisierung bei 65ºC wurde das Filter ausgiebig in zweimal SSC, 0,1% g/v SDS bei 65ºC gewaschen und anschließend unter Verwendung eines Kodak XAR-5- Films und von zwei Schirmen bei -70ºC autoradiographiert.

BEISPIEL 2

Isolierung des Schweine-LIF-Gens

Eine Bibliothek von teilweise mit Sau 3A verdauter Schweinegenom-DNA wurde durch Hybridisierung mit sowohl Mäuse-LIF- cDNA als auch einem Teil des Human-LIF-Gens als Sonden auf ein LIF-Gen enthaltende Klone gescreent. Das als Sonde verwendete Mäuse-LIF-cDNA-Fragment entsprach dem LIF-Kodierbereich und stammte aus dem Klon pLIFmut1. Das als Sonde verwendete Humangenfragment entsprach dem das Human-LIF-Gen umspannenden, 3kbp großen BamHI-Fragment und stammte aus dem Klon pHGLIFBaml (PCT/AU88/00093). Die Hybridisierungsbedingungen wurden bereits früher beschrieben (PCT/AU88/00093). Kurz gesagt, wurden die Genombibliothek darstellende Phagenplaques in einer Dichte von 50.000 Plaques pro 10 cm Petrischale gezüchtet und gemäß der Beschreibung von Maniatis und Mitarbeitern (1982) aus Nitrocellulose überführt. Vier Nitrocellulosefilter wurden von jeder Schale hergestellt. Vor der Hybridisierung wurden die Filter mehrere Stunden bei 65ºC in 6 x SSC (SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat), 0,2% g/v Ficoll, 0,2% g/v Polyvinylpyrrolidin, 0,2% g/v Rinderserumalbumin, 2 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM ATP, 50 µg/ml E.-coli-tRNA und 0,1% g/v SDS (16-18 h bei 65ºC) inkubiert. Die Mäuse-LIF-cDNA- und Human-LIF-Genom-DNA-Fragmente wurden jeweils durch Nicktranslation unter Verwendung von [α-³²P]-dATP auf eine spezifische Aktivität von ungefähr 2 x 10&sup8; cpm/µg oder durch willkürliches Primen auf eine spezifische Aktivität von ungefähr 10&sup9; cpm/µg radioaktiv markiert und der Hybridisierung in einer Konzentration von ungefähr 2 x 10&sup6; cpm/ml zugegeben. Für jede Petrischale wurden zwei Nitrocellulosefilter mit der Mäusesonde und zwei mit der Humansonde hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Filter ausgiebig in 6 x SSC, 0,1% g/v SDS bei 65ºC gewaschen und anschließend autoradiographiert. Die auf vier Filtern (Vierfachfiltern) positiven Plaques wurden aufgenommen und in einer geringeren Dichte wie oben beschrieben abermals gesichtet. Die Verwendung von zwei unterschiedlichen Sonden verringerte gleichzeitig die Chance einer Identifizierung von Klonen, die kurze Sequenzsegmente, die mit der einen oder anderen der Sonden eine zufällige Sequenzähnlichkeit zeigen, enthalten. Von den ursprünglich identifizierten Klonen wurde eines (λPGLIF-E2) gereinigt. Die DNA aus diesem λ-Klon wurde mit einer Reihe von Restriktionsendonucleasen (einschließlich SalI, das das gesamte Segment der klonierten Genom-DNA freisetzt) verdaut. Nach Verdauung mit den rekombinanten Phagen-DNAs und elektrophoretischer Auftrennung auf Agarosegelen wurde die DNA auf Nitrocellulose überführt und mit der Mäuse-LIF-cDNA-Sonde (unter den oben angegebenen Bedingungen) hybridisiert, um die das LIF-Gen enthaltenden Fragmente zu ermitteln. Selbst nach einem Waschen mit höherer Stringenz (0,2 x SSC, 65ºC) zeigte die Schweine-DNA noch eine starke Hybridisierung mit der Mäusesonde. Es wurde ein 2,4 kbp großes BamHI-Fragment identifiziert, das mit der Mäuse-cDNA-Sonde hybridisierte und von der Größe her dem in Southernblots von Schweine-Genom-DNA identifizierten Fragment entsprach. Dieses Fragment wurde in den Plasmidvektor pUC12 unter Bildung des Klons pPLIFBaml subkloniert.

BEISPIEL 3

Isolierung des Schaf-LIV-Gens

Eine Bibliothek von teilweise mit Sau 3A verdauter und mit dem Lambda-Phagen-Kloniervektor EMBL 3A ligierter Schaf- Genom-DNA wurde durch Hybridisierung mit sowohl Mäuse-LIF- cDNA als auch einem Teil des Human-LIF-Gens als Sonden auf ein LIF-Gen enthaltende Klone gescreent. Das als Sonde verwendete Mäuse-LIF-cDNA-Fragment entsprach dem das Human-LIF- Gen umspannenden, 3 kbp großen BamHI-Fragment und stammte aus dem Klon pHGLIFBaml (PCT/AU88/00093). Die Hybridisierungsbedingungen waren die bereits in der PCT/AU88/00093 und in Beispiel 2 beschriebenen.
Von den 8 ursprünglich identifizierten Klonen wurde ein Klon (λOGLIFR2) gereinigt. Die DNA aus diesem λ-Klon wurde mit einer Reihe von Restriktionsendonucleasen (einschließlich SalI, das das gesamte Segment der klonierten Genom-DNA freisetzt) verdaut. Nach Verdauung der rekombinanten Phagen-DNAs und elektrophoretischer Auftrennung auf Agarosegelen, wurde die DNA auf Nitrocellulose überführt und mit der Mäuse-LIF- cDNA-Sonde (unter den oben angegebenen Bedingungen) hybridisiert, um die das LIF-Gen enthaltenden Fragmente zu ermitteln. Selbst nach einem Waschen bei höherer Stringenz (0,2 x SSC, 65ºC) zeigte die gesamte Schaf-DNA noch eine starke Hybridisierung mit der Mäusesonde. Es wurde ein ungefähr 3 kbp großes BamHI-Fragment identifiziert, das mit der Mäuse-cDNA- Sonde hybridisierte. Dieses Fragment wurde in den Plasmidvektor pEMBL8+ unter Bildung des Klons pOGLIFBaml subkloniert.

BEISPIEL 4

Bestimmung der Nucleotid- und Aminosäuresequenz von Schweine- und Schaf-LIF

Die Nucleotidsequenzierung erfolgte nach dem Didesoxykettenterminationsverfahren (Sanger und Mitarbeiter, 1977) unter Verwendung der SEQUENASE (eingetragene Handelsbezeichnung) -Reagenzien und des SEQUENASE-Protokolls (United States Biochemicals). Die Nucleotidsequenzen der Schweine- und Schaf- LIF-DNA sind in den Fig. 2 und 3 dargestellt. Bei den Matrizen handelt es sich um einzelsträngige DNA verschiedener Fragmente aus dem 2,4 kbp großen BAMHI-Fragment von pLIFBaml oder dem 3 kbp großen BamHI-Fragment von pOGLIFBaml, das in M13-Phagenvektoren (Messing und Vieira, 1982) subkloniert war. Die verwendeten Primer waren sowohl ein externer Primer in der M13-Sequenz als auch verschiedene zu Sequenzen in dem Gen komplementäre Oligonucleotide.
Die so bestimmten Schweine- und Schaf-LIF-Sequenzen sind in Fig. 2 bzw. 3 dargestellt. Eine Ausrichtung dieser Sequenzen mit den Human- und Mäusegensequenzen zeigt, daß die Sequenzen Kodierbereiche enthalten, die zu Mäuse- und Human-LIF stark homologe Proteine spezifizieren. Die durch diese Kodierbereiche kodierten Proteinsequenzen sind oberhalb der Nucleotidsequenzen angegeben.
Die vollständige Aminosäuresequenz von Schweine- und Schaf- LIF ist in Fig. 4 mit den Sequenzen von Mäuse- und Human-LIF ausgerichtet, wobei Identitäten durch Sternchen und konservative Substitutionen durch Striche angegeben sind. Zahlreiche große Blöcke der Aminosäuresequenz bleiben bei allen vier Spezies ganz konserviert. Es ist jedoch offensichtlich, daß die Schweinesequenz mit der Schafsequenz näher verwandt ist als mit der Human- und Mäusesequenz. Ein Vergleich einer jeden dieser vier LIF-Sequenzen ist in Tabelle 1 dargestellt, worin lediglich der reife Teil des LIF-Moleküls betrachtet wird, ausgenommen des hydrophoben Leaders. In diesem Vergleich werden nur Identitäten bewertet. Tabelle 1 Vergleich der LIF-Aminosäuresequenzen (prozentuale Identität)
Die in der PCT/AU88/00093 beschriebenen Verfahren können zur Konstruktion verschiedener Expressionsvektoren, die das LIF- Gen einer Viehspezies (beispielsweise Schaf oder Schwein) tragen, verwendet werden. Derartige Vektoren umfassen Hefevektoren, beispielsweise YEpsecl (Baldari und Mitarbeiter, 1987), und E.-coli-Vektoren, beispielsweise den Vektor pGEX- 2T (Smith und Johnson, 1988, Gearing und Mitarbeiter, 1989). Die Expressionsbedingungen sind in der PCT/AU88/00093 beschrieben.

BEISPIEL 5

Die Verstärkung der Entwicklung von 8 Zellen umfassenden Mäuseembryos durch Zugabe von LIF wird im folgenden Beispiel beschrieben, das die vorliegende Erfindung veranschaulichen, jedoch in keiner Weise beschränken soll.

1. MATERIALIEN UND METHODEN

Tiere

Drei bis vier Wochen alte Balb-C x C57-F1-Mäuseweibchen wurden mit 7,5 IU PMSG (Folligon, Intervet, Australien) und 48 h später mit 7,5 IU hCG (Chorulon, Intervet, Australien) vorbehandelt, um eine Superovulation zu erreichen. Unmittelbar nach der hCG (Human-Chorion-Gonadotrophin)-Injektion wurden die behandelten weiblichen Tiere mit fruchtbaren männlichen Tieren (CBA-C57-Stamm, ein weibliches und ein männliches Tier pro Käfig) zusammengebracht. Am nächsten Morgen wurde jedes weibliche Tier darauf untersucht, ob als Beweis fur eine Paarung ein Vaginalpfropfen vorhanden war. Dies wurde dann als Tag 1 der Schwangerschaft angesehen.

Medien

Das Kulturmedium wurde aus pulverförmigem essentiellem Minimalmedium (MEM; Eagle, mit Earleschen Salzen, mit L-Glutamin ohne Natriumbicarbonat, Flow Laboratories, GB), das in Milli-Q-Wasser gelöst und mit 1 µg/ml Glucose, 25 mM Natriumbicarbonat und 10% (v/v) wärmeinaktiviertem fötalem Kalbserum (FCS; CSL, Australien) ergänzt war, zubereitet. Eine antibiotische/antimykotische Lösung wurde auch zugegeben, um pro 100 ml Lösung 10.000 Einheiten Penicillin, 10.000 µg Streptomycin und 25 µg Fungizon (CSL, Australien) bereitzustellen. Der pH-Wert und die Osmolarität der Medien wurden auf 7,40 bzw. 280 mOsm eingestellt. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Medien durch Filtration (Acrodisc 0,2 µm Filter, Gelman Sciences Inc., USA) sterilisiert.

Embryos

Am dritten Schwangerschaftstag wurden die weiblichen Tiere zwischen der 1300. und der 1500. Stunde, d.h. 71-73 h nach der hCG-Injektion, durch Cervicaldislokation getötet. Der gesamte Geschlechtstrakt wurde herausseziert bzw. -präpariert und in Earlesche ausgeglichene Salzlösung ohne Calcium und Magnesium (EBS9) bei 37ºC eingebracht. Danach wurden die 8-Zellembryos aus der Eileiter-Uterus-Verbindung herausgezupft/gespült und nach einmaligen Waschen in Kulturmedium in eine Vergleichsgruppe oder experimentelle Gruppe (siehe im folgenden) aufgeteilt, wobei sie in einer befeuchteten Gasumgebung von 5% CO&sub2; in Luft bei 37ºC gehalten wurden.

Züchtung der Embryos

Für den Versuch wurden die 8-Zellembryos willkürlich einer Vergleichsgruppe bzw. experimentellen Gruppe zugeordnet, wobei jede Gruppe aus 8 Replikaten mit Embryos von 4-6 Mäusen, die pro Replikat verwendet wurden, bestand. Die Embryos wurden etwa 15-20 min nach Gewinnung aus dem Uterus in einer Menge von 10-20 pro Ausnehmung in die Ausnehmungen gegeben und in vitro während 5 Tagen in den das Kulturmedium alleine (1 ml/Ausnehmung) oder das Kulturmedium mit der angegebenen LIF (1000 µ/ml)-Ergänzung enthaltenden Ausnehmungen gehalten. Diese LIF-Dosis wurde ausgewählt, da sie für die Hemmung einer Differenzierung von ES-Zellen optimal ist (internationale Patentanmeldung Nr. PCT/AU89/00330).

Bestimmung der morphologischen Entwicklung

Die Beobachtungen der Embryoentwicklung erfolgten täglich unter Verwendung eines Umkehrmikroskops, wobei die Zahlen der die Morula-, Blastozysten- oder Brutblastozystenstufe erreichenden Embryos aufgezeichnet wurden (Hsu, 1979). Am 4. bis 5. Tag der Züchtung durchliefen viele Embryos die mit einer Implantation in Verbindung stehenden Entwicklungsänderungen (Sherman, 1978). Für diese Untersuchung wurden die Nachbrütembryos (post hatching embryos) als die Stufe 1 erreichend vermerkt, wenn sie proliferierende Trophectodermzellen zeigten, und als die Stufe 2 erreichend vermerkt, wenn sie ein Auswachsen der Trophectodermzellen zeigten.

2. ERGEBNISSE

Die Wirkung auf die Entwicklung der Mäuse-8-Zellembryos in vitro unter Zugeben von LIF (10³ Einheiten/ml) zu dem Kulturmedium vor (PRE) oder nach (POST) Bildung der Blastozysten ist in Tabelle 2 dargestellt. Die Ergebnisse sind als prozentuale anfängliche Zahl der Embryos (n = 35), die die Entwicklungsstufe vollenden, angegeben. Tabelle 2
*Ledigleich Vergleich
Durch Kombinieren der Daten aus allen Experimenten, in denen LIF (10³ Einheiten/ml) dem Kulturmedium zugegeben worden war, wurde eine definierte Wirkung festgestellt, wo die LIF- Zugabe die Entwicklung von 8-Zellmäuseembryos bis zu Implantationsstufe 2 (vgl. Materialien und Methoden, Bestimmung der morphologischen Entwicklung) verstärkt. Die Daten sind die folgenden:

BEISPIEL 6

Expression von Schaf-LIF

Durch Intronentfernung und stellengerichtete Mutagenese in einer Weise, die zu der zuvor beim Human-LIF-Gen beschriebenen Weise analog ist, wurde ein benachbarter (contiguous) Kodierbereich für Schaf-LIF konstruiert.
Der so konstruierte Schaf-LIF-Kodierbereich wurde in der richtigen (Klone 3 und 15) und falschen (Klon 5) Orientierung in den Hefeexpressionsvektor YEpsec-1 kloniert. Die LIF-Aktivität wurde bestimmt, wobei die Ergebnisse in Tabelle 3 dargestellt sind. Die LIF-Aktivität wird als Einheiten/ml gemäß Bestimmung unter Verwendung des M1-Zelldifferenzierungsbioassays gemäß der obigen Beschreibung ausgedrückt. Der positive Mäusevergleichsklon (Maus +ve) ist ein Hefeklon, das YEpsec-1 mit dem in der richtigen Orientierung insertierten Mäuse-LIF-Gen enthält. Tabelle 3

BEISPIEL 7

Rezeptorbindungskonkurrenztest

Der Rezeptorbindungskonkurrenztest wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Der Test zeigt die Fähigkeit des von Hefe abgeleiteten Schaf-LIFs, mit iodiertem Mäuse-LIF um die Bindung an spezifische Zellrezeptoren auf Mausleberzellen zu konkurrieren. Tabelle 4

Angegebene Literaturstellen

Baldan und Mitarbeiter, EMBO J 6: 229-234, 1987;
Y.C. Hsu, Developmental Biology 68, 4530616, 1979;
Maniatis und Mitarbeiter, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, USA, 1982;
Messing und Vieira, Gene 19: 269-276, 1982;
Sanger und Mitarbeiter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463- 5462, 1977;
Sherman, Methods in Mammalian Reproduction, New York: Academic Press, S. 81-125, 1978;
Smith und Johnson, Gene 67: 31-40, 1988;
Gearing, Nicola, Metcalf, Foote, Willson, Gough and Williams, Biotechnology 7: 1157-1161, 1989.

Claims

1. Verfahren zur Verstärkung der in-vitro-Entwicklung eines Säugetierembryos bis zur Implantierungsstufe, wobei das Verfahren die Stufe des in-vitro-Kultivierens des Embryos in einem eine wirksame Menge des Säugetier-LIF enthaltenden Kulturmedium während einer zur Verstärkung der Entwicklung eines Embryos bis zur Implantationsstufe ausreichenden Zeit und unter zur Verstärkung der Entwicklung eines Embryos bis zur Implantierungsstufe ausreichenden Bedingungen umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Säugetierembryo von Menschen, Mäusen oder Vieh herstammt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Säugetierembryo aus einer Viehspezies isoliert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Säugetier-LIF von Menschen, Mäusen oder einer Viehspezies herstammt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Säugetier-LIF von einer Viehspezies herstammt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Viehspezies Schafe, Schweine, Ziegen, Kühe, Pferde oder Esel sind.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Viehspezies Schafe oder Schweine sind.