DE69718052T2

DE69718052T2 - Menschliches wachstumsgen und minderwuchse gen bereich

Info

Publication number: DE69718052T2
Application number: DE69718052T
Authority: DE
Inventors: Ercole Rao; Gudrun Rappold-Hoerbrand
Original assignee: RAPPOLD HOERBRAND GUDRUN
Current assignee: RAPPOLD HOERBRAND GUDRUN
Priority date: 1996-10-01
Filing date: 1997-09-29
Publication date: 2003-07-31
Anticipated expiration: 2017-09-30
Also published as: EP1260228A3; DK0946721T3; CA2647169A1; PL332568A1; CZ96699A3; WO1998014568A1; AU744188B2; NO991554D0; KR20000048838A; IL129015A0; AU4625297A; EP0946721B1; US7252974B2; AU744188C; JP2004201692A; NZ334970A; EP1260228A2; HUP9904175A2; BR9712185A; DE69718052D1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Isolierung, Identifikation und Charakterisierung neu identifizierter menschlicher Gene, die für Störungen des menschlichen Wachstums, insbesondere des Minderwuchs- oder Turner Syndroms, verantwortlich sind, sowie auf die Diagnostik und Therapie solcher Störungen.
Die isolierte Genom-DNS oder Fragmente davon können zu pharmazeutischen Zwecken oder als Diagnosewerkzeug oder als Reagenzien zur Identifikation oder Charakterisierung des bei solchen Störungen involvierten genetischen Defekts genutzt werden. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind außerdem menschliche Wachstumsproteine (Transkriptionsfaktoren A, B und C), die nach der Transkription der genannten DNS in die RNS oder mRNS exprimiert werden und zur therapeutischen Behandlung von mit Mutationen in solchen Genen zusammenhängenden Störungen benutzt werden können. Die Erfindung bezieht sich auch auf geeignete cDNS- Sequenzen, die zur Herstellung von für die Behandlung solcher Störungen geeigneten rekombinanten Proteinen verwendet werden können. Gegenstand der Erfindung sind weiter Plasmidvektoren zur Expression der DNS dieser Gene und geeignete Zellen, die solche DNS enthalten. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Mittel und Methoden verfügbar zu machen zur genetischen Behandlung solcher Störungen auf dem Gebiet der Molekularmedizin durch Verwendung eines Expressionsplasmids, das durch Integration der DNS dieser Erfindung stromabwärts von einem Expressionspromotor hergestellt wurde, welcher die Expression in einer Säugetierwirtszelle bewirkt.
Nukleinsäuresequenzen, die bis zu einem gewissen Grad den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen ähneln, sind aus dem bisherigen Stand der Technik als Maus- EST-Sequenzen bekannt: M. Marra et al., EMBL Datenbankeintrag MMA59929, Zugangsnummer AA059929, beschreibt einen Maus-cDNS-Klon (EST Name mj75d03.rl), der eine Länge von 303 Nucleotiden besitzt. Es wird keine weitere Funktion für diesen EST Klon in dem Datenbankeintrag angegeben. Die Sequenz ist in der SEQ ID NO: 17 in der Sequenzliste angegeben. Weiter beschreibt M. Marra et al., EMBL Datenbankeintrag MM3349, Zugangsnummer W1818334, einen zweiten Maus-sDNS- Klon (EST Name mb68b03.r1), der eine Länge von 232 Nucleotiden besitzt. Auch in diesem Fall wird keine weitere Funktion für diesen EST-Klon in dem Datenbankeintrag angegeben. Die Sequenz ist in der SEQ ID NO: 18 in der Sequenzliste angegeben.
Das Wachstum ist einer der grundlegenden Aspekte in der Entwicklung eines Organismus und wird durch ein hoch organisiertes und komplexes System reguliert. Die Körpergröße ist ein von vielfältigen Faktoren bestimmtes Merkmal, das sowohl durch Umwelt- als auch genetische Faktoren beeinflusst wird. Entwicklungsmißbildungen bezüglich der Körpergröße sind ein weit verbreitetes Phänomen unter den Menschen aller Rassen. Mit einer Häufigkeit von 3 von 100 Fällen bildet die Wachstumsverzögerung, die zu Minderwachs führt, die große Mehrheit der bei Menschen vorkommenden angeborenen Defizienzen.
Mit einer Häufigkeit von 1 : 2500 lebend geborenen weiblichen Phänotypen ist das Turner Syndrom eine häufige chromosomale Störung (Rosenfeld et al., 1996). Es wurde geschätzt, dass 1-2% aller menschlichen Konzeptionen 45,X sind und nicht weniger als 99% dieser Föten nicht zur Reife gelangen (Hall und Gilchrist, 1990; Robins, 1990). Es besteht eine bedeutende klinische Veränderbarkeit des Phänotyps mit dem Turner Syndrom (oder Ullrich-Turner Syndrom) (Ullrich, 1930; Turner, 1938) behafieter Personen. Minderwuchs ist jedoch das übereinstimmende Ergebnis und wird zusammen mit der gonadalen Dysgenesie als das Hauptsymptom dieser Störung angesehen. Das Turner Syndrom ist eine wahrhaft vielfältige Störung. Man nimmt an, dass sowohl Embryonensterblichkeit, Minderwuchs, gonadale Dysgenesie als auch die charakteristischen somatischen Merkmale der bei X- und Y-Chromosomen häufig vorkommenden Genmonosomie zuzuschreiben sind. Die diploide Dosis dieser X-Y-homologer Gene wird als Voraussetzung für die normale menschliche Entwicklung unterstellt. Man nimmt an, dass Turnergene (oder anti-Turnergene) bei Mädchen sowohl von den aktiven als auch den inaktiven X-Chromosomen oder Y-Chromosomen exprimiert werden, um eine korrekte Dosierung des Genprodukts zu gewährleisten. Haploinsuffzienz (Defizienz auf Grund nur einer einzigen aktiven Kopie) wäre demzufolge der vermutete, dieser Krankheit zugrunde liegende, genetische Mechanismus.
Eine Vielfalt dem Minderwuchs zugrunde liegender Mechanismen wurde bis jetzt aufgeklärt. Wachstumshormon- und Wachstumshormonrezeptordeflzienzen, sowie Skelettstörungen wurden als Ursache für den Minderwuchsphänotyp beschrieben (Martial et ab, 1979; Phillips et al., 1981; Leung et al., 1987; Goddard et ab, 1995). Jüngst wurden Mutationen an drei menschlichen Fibroblastwachstumsfaktor-Rezeptoren codierenden Genen (FGFR 1-3) als die Ursache verschiedener Skelettstörungen, einschließlich der häufigsten Form des Zwergwuchses, der Achondroplasie, identifiziert (Shiang et al., 1994; Rousseau et al., 1994; Muenke and Schell, 1995). Eine wohlbekannte und häufige (1 : 2500 Frauen) chromosomale Störung, das Turner Syndrom (45,X), wird auch durchweg mit Minderwuchs assoziiert. Insgesamt betrachtet machen alle diese verschiedenen bekannten Ursachen jedoch nur einen kleinen Bruchteil sämtlicher minderwüchsiger Patienten aus, die große Mehrheit der Minderwuchsfälle bleibt bis heute ungeklärt.
Man nimmt an, dass die Geschlechtschromosomen X- und Y-Gene beherbergen, die die Größe beeinflussen (Ogata und Matsuo, 1993). Dies konnte von Genotyp-Phänotyp- Zusammenhängen bei Patienten mit Geschlechtschrornosomenabnormitäten abgeleitet werden. Zytogenetische Studien erbrachten den Beweis, dass terminale Deletionen der kurzen Arme entweder des X- oder des Y-Chromosoms konsequenterweise zu Minderwuchs bei den jeweiligen Individuen führte (Zuffardi et al., 1982; Curry et al., 1984). Von mehr als 20 chromosomalen Umlagerungen verbunden mit terminalen Deletionen des Chromosoms Xp und Yp wurde berichtet, die das/die für Minderwuchs verantwortliche(n) Gen(e) in die pseudoautosomalen Region (PAR1) lokalisieren (Ballablo et al., 1989, Schaefer et al., 1993). Diese Lokalisierung wurde auf die äußersten distalen 700 kb der DNS der PAR1 Region eingeschränkt, mit DXYS 15 als dem flankierenden Marker (Ogata et al., I 992; 1995).
Die Wachstumsregulierung bei Säugetieren ist als komplexes System organisiert. Es ist vorstellbar, dass multiple wachstumsfördernde Gene (Proteine) auf hochgradig organisierte Weise miteinander interagieren. Eines dieser die Körpergröße steuernden Gene wurde versuchsweise in die pseudoautosomale Region PAR1 verlegt (Ballablo et al., 1989), eine Region, die dafür bekannt ist, dass sie zwischen X- und Y- Chromosomen frei ausgetauscht wird (zum Überblick, siehe Rappold, 1993). Die gesamte PARI Region misst annähernd 2.700 kb.
Die für Minderwuchs in Frage kommende kritische Region wurde an Patienten definiert, welche eine Deletion aufwiesen. Minderwuchs ist die Konsequenz, wenn eine ganze 700 kb Region deletiert wird oder wenn ein spezifisches Gen innerhalb dieser kritischen Region in haploidem Zustand vorhanden oder unterbrochen oder mutiert ist (wie es der Fall ist beim idiotypischen Minderwuchs oder Turner Syndrom). Die Häufigkeit des Turner Syndroms beläuft sich auf 1 von 2500 Frauen weltweit; die Häufigkeit dieser Form des idiopathischen Minderwuchses kann auf 1 von 4.000-5.000 Personen geschätzt werden. Mit dem Turner Syndrom behaftete Frauen und minderwüchsige Individuen erhalten üblicherweise eine unspezifische Behandlung mit Wachstumshormon (GH) mehrere Jahre bis über ein Jahrzehnt lang, obwohl es wohl bekannt ist, dass sie normale GH-Werte haben und die GH-Deflzienz nicht das Problem ist. Die Behandlung solcher Patienten ist sehr kostspielig (geschätzte Kosten etwa 30.000 USD p.a.). Aus diesem Grund bestand das Problem, eine Methode und Mittel zu schaffen, Minderwuchspatienten einerseits, die in dem betreffenden Gen einen genetischen Defekt aufweisen, und Patienten andererseits, die keinerlei genetischen Defekt in diesem Gen aufweisen, zu unterscheiden. Patienten mit einem genetischen Defekt in dem jeweiligen Gen - mit entweder einer kompletten Gendeletion (wie beim Turner Syndrom) oder einer Punktmutation (wie beim idiopathischen Minderwuchs) - sollte eine alternative Behandlung ohne humanes GH zur Verfügung stehen, die nun denkbar ist.
Genotyp/Phänotypzusammenhänge erhärteten die Existenz eines Wachstumsgens im proximalen Teil von Yq und im distalen Teil von Yp. Minderwuchs wird auch einheitlich bei Individuen mit terminalen Deletionen von Xp festgestellt. Kürzlich wurde eine extensive Suche nach männlichen und weiblichen Patienten mit partiellen Monosomien der pseudoautosomalen Region unternommen. Auf der Grundlage der Genotyp-Phänotypzusammenhänge wurde eine minimale gemeinsame, neben dem Telomer liegende Deletionsregion von 700 kb DNS bestimmt (Ogata et al., 1992; Ogata et al., 1995). Es erwies sich, dass die Region von Interesse zwischen den genetischen Markern DXYS20 (3cosPP) und DXYS15 (113D) liegt, und alle Kandidatengene für die Wachstumssteuerung i von innerhalb der PARI Region (z. B. der hämopoietische Wachstumsfaktorrezeptor a; CSF2RA) (Gough et al., 1990) aufgrund ihres physischen Ortes (Rappold et al., 1992) ausgeschlossen werden. Das bedeutet, dass die Gene innerhalb der 700 kb Deletionsregion der 2.700 kb PAR1 Region lagen.
Vor kurzem wurden Deletionen der pseudoautosomalen Region (PAR1) der Geschlechtschromosomen bei Individuen mit Minderwuchs entdeckt und daraufhin wurde eine minimale gemeinsame Deletionsregion von 700 kb innerhalb PARI definiert. Mittels Southern-Blot-Analyse auf der DNS der Patienten AK und 55, wobei unterschiedliche pseudoautosomale Marker benutzt wurden, wurde eine terminale Xp- Deletion von etwa 700 kb distal von DXYS15 (113D) identifiziert (Ogata et al. 1992; Ogata et al. 1995).
Die dem Minderwuchs entsprechende Genregion wurde identifiziert als eine Region von etwa 500 kb, vorzugsweise etwa 170 kb in der PAR1 Region der X- und Y- Chromosomen. Drei Gene in dieser Region wurden identifiziert als Kandidaten für das Minderwuchsgen. Diese Gene wurden mit SHOX (auch SHOX93 oder HOX93 genannt), (SHOX = short stature homeobox-containing gene [Minderwuchshomöobox enthaltendes Gen]), pET92 und SHOT (SHOX-like homeobox gene on chromosome three [SHOX-ähnliches Hemöoboxgen auf Chromosom drei]) bezeichnet. Das SHOX-Gen, das zwei getrennte Spleißstellen besitzt, die zu zwei Variationen (SHOX a und b) führen, ist von besonderer Bedeutung. In Voruntersuchungen konnten wesentliche Teile der Nucleotidsequenz des Minderwuchsgens analysiert werden (SEQ ID No. 8). Entsprechende Exons oder Teile davon konnten vorausgesagt und identifiziert werden (z. B. Exon I [63 10]; Exon II [ET93]; Exon IV [G108]; pET92). Die erhaltene Sequenzinformation konnte dann benutzt werden zur Konstruktion geeigneter Primer oder Nucleotidsonden, die zu Teilen des SHOX-Gens oder Fragmenten davon hybridisieren. Mit konventionellen Methoden kann das SHOX-Gen dann isoliert werden. Durch weitere Analyse der DNS-Sequenz dieser Gene, die für den Minderwuchs verantwortlich sind, konnte die Nucleotidsequenz der Exons I-V verfeinert werden (vgl. Abb. 1-3). Das SHOX-Gen enthält eine Homöoboxsequenz (SEQ ID NO: 1) von annähernd 180 bp (siehe Abb. 2 und 3), beginnend von der Nucleotidcodierung für die Aminosäurenposition 117 (Q) bis zur Nucleotidcodierung für die Aminosäurenposition 176 (E), z. B. von CAG (440) bis GAG (619). Die Homöoboxsequenz wird identifiziert als Homöobox-pET93 (SHOX)-Sequenz und zwei Punktmutationen wurden bei minderwüchsigen Individuen bei einem deutschen (A1) und japanischen Patienten durch Aussieben aus 250 Individuen mit idiopathischem Minderwuchs entdeckt. Beide Punktmutationen wurden an identischer Position gefunden und führten zu einem Proteinabbruch an der Aminosäurenposition 195, was vermuten ließ, dass dort ein Mutationspunkt existieren kann. Dank der Tatsache, dass beide gefundene Mutationen, die zu einem Proteinabbruch führten, sich an identischer Position befinden, ist es möglich, dass im Exon 4 (6108) ein mutmaßlicher rekombinationsfähiger Punkt existiert. Exon spezifische Primer können daher, wie nachstehend angegeben, benutzt werden, z. B. GCA CAG CCA ACC ACC TAG (for) oder TGG AAA GGC ATC ATC CGT AAG (rev).
Das oben erwähnte neu entdeckte, eine Homöobox enthaltende SHOX-Gen, das innerhalb des 170 kb Intervalls lokalisiert ist, wird alternativ gespleißt und erzeugt so zwei Proteine mit diverser Funktion. Mutationsanalyse und Sequenzierung der DNS wurden durchgeführt, um zu beweisen, dass Minderwuchs durch Mutationen in SHOX- Genen verursacht werden kann.
Die Identifikation und Klonierung der für Minderwuchs verantwortlichen kritischen Region gemäß der vorliegenden Erfindung wurde wie folgt durchgeführt: Extensive physische Kartierungsstudien wurden an 15 Individuen mit partieller Monosomie in der pseudoautosomalen Region (PAR1) durchgeführt. Durch Korrelieren der Größe dieser Personen mit ihren Deletionsbruchstellen wurde eine tUr den Minderwuchs (SS) verantwortliche kritische Region von annähernd 700 kb definiert. Diese Region wurde anschließend kloniert als ein überlappendes Cosmid contig unter Benutzung künstlicher Hefechromosomen (YACs) aus PAR 1 (Ried et al., 1996) und durch Cosmidwalking. Um nach Kandidatengene für Minderwuchs innerhalb dieses Intervalls zu suchen, wurde eine Vielfalt von Techniken in einer Region von etwa 600 kb zwischen dem distalen Ende des Cosmids 56610 und dem proximalen Ende von SID11 angewandt. Durch cDNS-Selektion, Exon-Abscheidung und CpG-Inselklonierung wurden die beiden neu entdeckten Gene identifiziert.
Die Position des für Minderwuchs verantwortlichen kritischen Intervalls konnte bis zu einem kleineren Intervall von 170 kb der DNS durch Charakterisierung von drei weiteren spezifischen Individuen (GA, AT und RY), welche durchweg minderwüchsig waren, verfeinert werden. Um exakt die Neuordnungsbruchstellen dieser Individuen zu lokalisieren, wurde Fluoreszenz-In situ-Hybridisierung (FISH) an Metaphasen-chromosomen durchgeführt unter Benutzung von Cosmiden vom contig. Patient GA mit einer terminalen Deletion und normaler Körpergröße definierte die distale Begrenzung der kritischen Region (mit der Bruchstelle auf Cosmid 110E3) und Patient AT mit einer X- Chromosomeninversion und normaler Körpergröße die proximale Begrenzung (mit der Bruchstelle auf Cosmid 34F5). Bezüglich der Y-chromosomalen Bruchstelle des Patienten RY mit terminaler Deletion und Minderwuchs wurde ebenfalls entdeckt, dass sie auf Cosmid 34F5 enthalten war, was die Vermutung zuließ, dass diese Region Sequenzen enthält, die zu Chromosomenneuordnungen prädisponieren.
Die gesamte Region, begrenzt durch das Xp/Yp-Telomer, wurde kloniert als ein Set überlappender Cosmide. Mit Hilfe der Fluoreszenz-In situ-Hybridisierung (FISH) mit Cosmiden aus dieser Region wurden sechs Patienten mit X-chromosomalen Neuordnungen, drei mit normaler Körpergröße und drei Minderwüchsige, untersucht.
Genotyp-Phänotypkorrelationen schränkten das für den Minderwuchs verantwortliche kritische Intervall, welches das oder die Gene enthält, die beim menschlichen Wachstum eme bedeutende Rolle spielen, auf 270 kb der DNS oder sogar auf unter 170 kb ein. Ein minimaler Deckungspfad von sechs bis acht Cosmiden, die dieses Intervall überbrücken, steht nun zur Verfügung für die Interphasen- und Metaphasen-FISH und liefert so ein wertvolles Werkzeug für diagnostische Untersuchungen an Patienten mit idiopathischem Minderwuchs.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Abb. 1 ist eine Genkarte des SHOX-Gens einschließlich fünf Exons, die wie folgt identifiziert werden: Exon I: G310, Exon II: ET93, Exon III: ET45, Exon IV: G108 und Exons Va und Vb, wobei die Exons Va und Vb aus zwei verschiedenen Spleißstellen des SHOX-Gens resultieren. Exon II und III enthalten die Homöoboxsequenz von 180 Nucleotiden.
Die Abb. 2 und 3 stellen die Nucleotide und vorhergesagten Aminosäuresequenzen der SHOXa - and SHOXb- Gene dar:
SHOX a: Der vorhergesagte Start der Translation beginnt beim Nucleotid 92 mit dem ersten In frame-Stopeodon (TGA) bei den Nucleotiden 968-970, wobei sich ein offener Leserahmen von 876 bp ergibt, der ein vorhergesagtes Protein von 292 Aminosäuren codiert (bezeichnet als Transkriptionsfaktor A, beziehungsweise SHOXa Protein). Ein In-frame-5'Stopcodon bei Nucleotid 4, das Startcodon und das vorausgesagte Terminationsstopcodon sind fettgedruckt. Die Homöobox ist in Klammern gesetzt (beginnend bei der Aminosäurenposition 117 (Q) bis 176 (E), d. h. von CA6 bis GAG in der Nucleotidsequenz). Die Orte der Introns sind mit Pfeilen angegeben. Zwei vermutliche Polyadenylationssignale in der 3'untranslatierten Region sind unterstrichen.
SHOX b: Ein offener Leserahmen 876 bp existiert von A im ersten Methionin beim Nucleotid 92 bis zum In-frame-Stopcodon beim Nucleotid 767-769, wobei sich ein offener Leserahmen von 675 bp ergibt, der ein vorausgesagtes Protein von 225 Aminosäuren codiert (Transkriptionsfaktor B beziehungsweise SHOXb-Protein). Die Orte der Introns sind mit Pfeilen angegeben. Die Exons I-IV sind identisch mit SHOXa, Exon V ist spezifisch für SHOX b. Ein vermutliches Polyadenylationssignal in der 3'untranslatierten Region ist unterstrichen.
Abb. 4 stellt das Nucleotid und die vorausgesagte Aminosäurensequenz von SHOT dar. Der vorausgesagte Start der Translation beginnt beim Nucleotid 43 mit dem ersten In-frame-Stopcodon (TGA) bei den Nucleotiden 613-615, wobei sich ein offener Leserahmen von 573 bp ergibt, der ein vorausgesagtes Protein von 190 Aminosäuren codiert (bezeichnet als Transkriptionsfaktor C beziehungsweise SHOT-Protein). Die Homöobox ist in Klammern gesetzt (beginnend bei der Aminosäurenposition 11 (Q) bis 70 (E), d. h. CAG bis GAG in der Nucleotidsequenz). Die Orte der Introns sind mit Pfeilen angegeben. Zwei vermutliche Polyadenylationssignale in der 3'untranslatierten Region sind unterstrichen.
Abb. 5 stellt die Exon/Intronorganisation des menschlichen SHOX-Gens und die jeweilige Position in der Nucleotidsequenz dar.

Kurze Beschreibung der SEO ID:

SEQ ID No. 1: translatierte Aminosäurensequenz der Homöoboxdomäne (180 bp)
SEQ ID No. 2: Exon II (ET93) des SHOX-Gens
SEQ ID No. 3: Exon I (G310) des SHOX-Gens
SEQ ID No. 4: Exon III (ET45) des SHOX-Gens
SEQ ID No. 5: Exon IV (G108) des SHOX-Gens
SEQ ID No. 6: Exon Va des SHOX-Gens
SEQ ID No. 7: Exon Vb des SHOX-Gens
SEQ ID No. 8: vorbereitende Nucleotidsequenz des SHOX-Gens
SEQ ID No. 9: ET92-Gen
SEQ ID No. 10: SHOXa-Sequenz (siehe auch Abb. 2)
SEQ ID No. 11: Transkriptionsfaktor A (siehe auch Abb. 2)
SEQ ID No. 12: SHOXb-Sequenz (siehe auch Abb. 3)
SEQ ID No. 13: Transkriptionsfaktor B (siehe auch Abb. 3)
SEQ ID No. 14: SHOX-Gen
SEQ ID No. 15: SHOT-Sequenz (siehe auch Abb. 4)
SEQ ID No. 16: Transkriptionsfaktor C (siehe auch Abb. 4)
Da das zu Störungen beim humanen Wachstum führende Zielgen (d. h. die für den Minderwuchs verantwortliche Region) vor dieser Erfindung unbekannt war, konnte die biologische und klinische Assoziation von Patienten mit dieser Deletion einen Einblick in die Funktion dieses Gens vermitteln. In der vorliegenden Studie wurde die Fluoreszenz- In-situ-Hybridisierung (FISH) angewandt, um die Metaphasen- und Interphasen- Lymphozytennuclei von sechs Patienten zu untersuchen. Das Ziel war es, alle Cosmide des überlappenden Sets auf Ihre Nützlichkeit als FISH-Sonden zu testen und die Bruchstellenregionen in allen vier Fällen und dadurch die kleinste kritische Region für das Minderwuchsgen zu bestimmen.
Duplikation und Deletion einer Genom-DNS kann technisch bewertet werden durch sorgfältig kontrollierte quantitative PCR oder Dosisschätzung an Southern Blots oder durch Benutzung von RFLPs. Eine besonders verlässliche Methode zur genauen Unterscheidung zwischen einfacher und doppelter Dosis der Marker ist jedoch die FISH, deren klinische Anwendung gegenwärtig Routine ist. Während in der Interphasen-FISH die bloße Abwesenheit oder Anwesenheit eines molekularen Markers ausgewertet werden kann, kann FISH an Metaphasenchromosomen eine semi-quantitative Messung von Inter-Cosmid-Deletionen liefern. Vorliegender Erfinder hat bestimmt, dass Deletionen von etwa 10 kb (25% der Signalreduktion) noch entdeckt werden können. Dies ist von Bedeutung, da praktisch alle Krankheitsgene auf dem menschlichen X-Chromosom mit kleineren und größeren Deletionen in der Größenordnung von wenigen Kilobasen bis zu mehreren Megabasen der DNS assoziiert wurden (Nelson et al., 1995).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher DNS-Sequenzen oder Fragmente davon, die Teil der Gene sind, die für das menschliche Wachstum (beziehungsweise für Minderwuchs im Falle von genetischen Defekten auf diesen Genen) verantwortlich sind. Drei für menschliches Wachstum verantwortliche Gene sind identifiziert worden: SHOX, pET92 und SHOT. DNS-Sequenzen oder Fragmente dieser Gene, sowie die entsprechenden Gesamtlängen-DNS-Sequenzen dieser Gene können in einen geeigneten Vektor transformiert und in Zellen transfektiert werden. Wenn solche Vektoren in Zellen eingeführt werden auf eine geeignete Weise, wie sie in gesunden Menschen vorhanden sind, ist es vorstellbar, dass bei Minderwuchs involvierte Krankheiten, wie das Turner Syndrom, durch moderne Mittel der Gentherapie behandelt werden. Zum Beispiel kann Minderwuchs durch Entfernung der entsprechenden, für Minderwuchs verantwortlichen, mutierten Wachstumsgene behandelt werden. Es ist auch möglich, die jeweiligen Gene zu stimulieren, die die Aktion der für Minderwuchs verantwortlichen Gene kompensieren, d. h. durch Insertion von DNS-Sequenzen vor oder nach den Wachstums-IMinderwuchsgenen oder innerhalb dieser, um die Expression der gesunden Allele zu verstärken. Durch solche Modifikationen der Gene werden die Wachstums-/Minderwuchsgene aktiviert, beziehungsweise still. Dies kann durchgeführt werden durch Insertion von DNS- Sequenzen an geeigneten Stellen innerhalb des Gens oder angrenzend an das Gen, so dass diese zwischengeschalteten DNS-Sequenzen auf die Wachstums-/Minderwuchsgene einwirken und dadurch ihre Transkription aktivieren oder verhindern. Es ist auch denkbar, ein regulatorisches Element einzufügen (d. h. eine Promotorsequenz), bevor genannte Wachstumsgene die Gene dazu stimulieren, aktiv zu werden. Weiter ist es denkbar, die entsprechende Promotorsequenz zu stimulieren, um - im Falle des Turner Syndroms - das gesunde funktionelle Allel zu überexprimieren und das fehlende Allel zu kompensieren. Die Modifikation von Genen kann im Allgemeinen erreicht werden durch Insertion exogener DNS-Sequenzen in das Wachstums-/Minderwuchsgen über homologe Rekombination.
Die DNS-Sequenzen gemäß dieser Erfindung können auch für die Transformation dieser Sequenzen in Tiere wie Säugetiere mittels eines geeigneten Vektorsystems genutzt werden. Diese transgenen Tiere können dann benutzt werden für In-vivo-Untersuchungen zur Auswahl und Identifikation pharmazeutischer Agenzien, die für die Behandlung der beim Minderwuchs involvierten Krankheiten brauchbar sind. Wenn Tiere auf die Verabreichung einer in Frage kommenden Verbindung oder eines Agens positiv reagieren, sind solche Agenzien oder Verbindungen oder deren Derivate als pharmazeutische Agenzien vorstellbar. Durch geeignete Mittel können die erfindungsgerechten DNS-Sequenzen auch in genetischen Experimenten eingesetzt werden mit dem Ziel, Methoden zu finden, um den für den Minderwuchs verantwortlichen Genverlust zu kompensieren (Knockout-Tiere).
Bei einem weiteren Ziel dieser Erfindung können die DNS-Sequenzen auch dazu verwendet werden, in Zellen transformiert zu werden. Diese Zellen können benutzt werden zur Identifizierung pharmazeutischer Agenzien, die für die Behandlung von beim Minderwuchs involvierten Krankheiten nützlich sind, oder für die Auswahl solcher Verbindungen oder Bibliotheken von Verbindungen. In einem geeigneten Testsystem können Variationen im Phänotyp oder Expressionsmuster solcher Zellen bestimmt werden, wodurch die Identifikation interessanter in Frage kommender Agenzien bei der Entwicklung pharmazeutischer Arzneimittel ermöglicht wird.
Die DNS-Sequenzen dieser Erfindung können auch für den Entwurf geeigneter Primer genutzt werden, die mit Segmenten der Minderwuchsgene oder Fragmenten davon unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Geeignete Primersequenzen können konstruiert werden, die bei der Diagnose von Menschen, die einen Minderwuchs verursachenden, genetischen Defekt besitzen, nützlich sind. In dieser Hinsicht ist es beachtenswert, dass die beiden gefundenen Mutationen an identischer Position auftreten, was vermuten lässt, dass ein Mutationspunkt existiert.
Allgemein bedeuten die DNS-Sequenzen gemäß dieser Erfindung, dass sie auch solche DNS-Sequenzen umfassen, die zu den dargestellten spezifischen Sequenzen auf Grund der Degeneration des genetischen Codes degeneriert sind oder unter stringenten Bedingungen mit den spezifisch dargestellten DNS-Sequenzen hybridisieren.
Die vorliegende Erfindung umfasst insbesondere folgende Aspekte:
a) Ein Polypeptide codierendes, isoliertes, humanes Nucleinsäuremolekül, das eine Homöoboxdomäne von sechzig Aminosäuren mit der Aminosäurensequenz SEQ ID NO: 1 enthält und auf menschliches Wachstum eine regulative Aktivität ausübt.
b) Ein isoliertes DNS-Molekül, das die Nucleotidsequenz im Wesentlichen wie in Abb. 2, Abb. 3 oder Abb. 4 angegeben und insbesondere wie in SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 oder SEQ ID NO: 15 dargestellt enthält.
c) DNS-Moleküle, die fähig sind, zu den DNS-Molekülen von Punkt b) zu hybridisieren.
d) DNS-Moleküle nach Punkt c) oben, die zur Hybridisierung mit den DNS-Molekülen von Punkt 2 bei einer Temperatur von 60-70ºC und in Anwesenheit einer Standardpufferlösung fähig sind.
e) DNS-Moleküle, die eine Nucleotidsequenz umfassen, welche eine Homologie von siebzig Prozent oder höher mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 oder SEQ ID NO: 15 aufweist und ein Polypeptid codiert, das auf menschliches Wachstum eine regulative Aktivität ausübt.
f) Menschliche Wachstumsproteine, die die Aminosäurensequenz SEQ ID NO: 11, 13 oder 16 oder ein funktionelles Fragment davon besitzen.
g) Antikörper, die durch Immunisierung von Tieren mit menschlichen Wachstumsproteinen des Punktes f) oder antigenetischen Varianten davon gewonnen werden.
h) Pharmazeutische Zusammensetzungen, die menschliche Wachstumsproteine oder funktionelle Fragmente davon umfassen, für die Behandlung von Störungen, die durch genetische Mutationen des menschlichen Wachstumsgens verursacht sind.
i) Methode der Forschung nach einer zur Behandlung der oben unter Punkt h) erwähnten Störungen wirksamen Substanz, die das Aufspüren der Boten-RNS umfasst, welche zu irgendeinem der unter a)-e) beschriebenen DNS-Molekülen hybridisiert, so dass eine Verstärkung der Expressionen des DNS-Moleküls als Reaktion auf die Behandlung der Wirtszelle mit dieser Substanz gemessen wird.
j) Ein Expressionsvektor oder Plasmid, der oder das irgendeines der unter a)-e) oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle enthält, das die Expression der DNS-Moleküle in Säugetierzellen möglich macht.
k) Methode zur Bestimmung des Gens oder der Gene, die für Minderwuchs verantwortlich sind, in einer biologischen Probe von Körpergeweben oder - flüssigkeiten.
Bei der Methode k) oben werden vorzugsweise Nucleotidamplifikationstechniken, z. B. die PCR, zur Entdeckung spezifischer Nucleotidsequenzen angewendet, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind und zum Beispiel von Mullis et al. 1986, Cold Spring Harbor Symposium Quant. Biol. 51, 263-273, und Saiki et al., 1988, Science 239, 487-491, die hiermit durch Erwähnung einbezogen werden, beschrieben wurden. Die für Minderwuchs verantwortlichen, zu bestimmenden Nucleotidsequenzen sind hauptsächlich die von den Sequenzen SEQ ID No. 2 bis SEQ ID No. 7 dargestellten.
Prinzipiell sind alle Oligonucleotidprimer und -sonden zur Amplifikation und Detektion eines genetischen Defekts, der für vermindertes menschliches Wachstum verantwortlich ist, in einer biologischen Probe geeignet, eine mit Minderwuchs verbundene Zielsequenz zu amplifizieren. Insbesondere werden geeignete exonspezitische Primerpaare gemäß dieser Erfindung in Tabelle 1 aufgezeigt. Danach wird eine brauchbare Detektion, d. h. eine radioaktive oder nicht-radioaktive Markierung ausgeführt. Tabelle 1:
Erläuterung der Abkürzungen für die Primer:
SP1: ATTTCCAATGGAAAGGCGTAAATAAC
SP2: ACGGCTTTTGTATCCAAGTCTTTTG
SP3: GCCCTGTGCCCTCCGCTCCC
SP4: GGCTCTTCACATCTCTCTCTGCTTC
SP5: CCACACTGACACCTGCTCCCTTTG
SP6: CCCGCAGGTCCAGGCTCAGCTG
ASP1: CGCCTCCGCCGTTACCGTCCTTG
ASP2: CCCTGGAGCCGGCGCGCAAAG
ASP3: CCCCGCCCCCGCCCCCGG
ASP4: CTTCAGGTCCCCCCAGTCCCG
ASP5: CTAGGGATCTTCAGAGGAAGAAAAAG
ASP6: GCTGCGCGGCGGGTCAGAGCCCCAG
Auch eine Einzelstrang-RNS kann als Target verwendet werden. Methoden für reverse transkribierende RNS in cDNS sind auch wohlbekannt und in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Molekularidonierung, Ein Laborhandbuch] New York, Cold Spring Harbor Laboratory 1989, beschrieben. Alternativ bevorzugte Methoden für die reverse Transkription benutzen thermostabile DNS-Polymerasen, welche RT Aktivität besitzen.
Des Weiteren kann die oben beschriebene Technik zur Selektion von solchen Personen aus einer Gruppe benutzt werden, deren Minderwuchs durch einen genetischen Defekt gekennzeichnet ist und als Konsequenz eine spezifischere medizinische Behandlung erlaubt.
Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung besteht darin, dass die Transkriptionsfaktoren A, B und C als pharmazeutische Agenzien verwendet werden können. Diese Transkriptionsfaktoren setzen eine noch unbekannte Lawine biologischer Effekte auf einer Molekularebene im Zusammenhang mit menschlichem Wachstum aus. Diese Proteine oder funktionelle Fragmente davon haben einen mitogenetischen Effekt auf verschiedene Zellen. Insbesondere haben sie einen osteogenetischen Effekt. Sie können bei der Behandlung von Knochenkrankheiten angewendet werden, wie z. B. Osteoporose, und vor allem bei all jenen Krankheiten, die bei einer Störung der Knochencalciumregulierung beteiligt sind.
Der Begriff "isoliert" bezieht sich, wie er hier verwendet wird, auf die Originalabweichung des DNS-Moleküls durch Klonierung. Es wird jedoch klargestellt, dass sich dieser Begriff nicht darauf beschränken soll und diese Erfindung bezieht sich in der Tat sowohl auf natürlich vorkommende als auch synthetisch hergestellte Sequenzen nach den Kenntnissen des Fachmannes auf diesem Gebiet.
Die DNS-Moleküle dieser Erfindung können in Formen der Gentherapie benutzt werden, die die Verwendung eines Expressionsplasmids beinhalten, das durch Eingliederung einer geeigneten DNS-Sequenz dieser Erfindung abwärts nach einem die Expression in einer Säugetierwirtszelle bewirkenden Expressionspromotor zubereitet wird. Passende Wirtszellen sind prokaryontische oder eukaryontische Zellen. Prokaryontische Wirtszellen sind zum Beispiel E. coli, Bacillus subtilis und Ähnliches. Durch Transfektion von Wirtszellen mit Replikonen, die von Spezien abstammen, die an den Wirt adaptierbar sind, das heißt, Plasmidvektoren, die einen Replikationsstartpunkt und Regulatorsequenzen enthalten, können diese Wirtszellen mit dem gewünschten Gen oder der cDNS umgestimmt werden. Solche Vektoren sind vorzugsweise jene, die eine Sequenz besitzen, die die umgestimmten Zellen mit einer Eigenschaft (Phänotyp) versehen, dank derer sie ausgewählt werden können. Zum Beispiel wird für E. coli Wirte typischerweise die Art E. coli K12 benutzt und für den Vektor können im Allgemeinen entweder pBR322 oder pUC Plasmide verwendet werden. Beispiele für geeignete Promotoren für E. coli Wirte sind der trp Promotor, lac Promotor oder lpp Promotor. Wird dies gewünscht, kann die Sekretion des Expressionsprodukts durch die Zellmembran bewirkt werden durch Bindung einer für eine Signalpeptidsequenz codierende DNS-Sequenz an die 5'Stromaufwärtsseite des Gens. Eukaryontische Wirtszellen schließen Zellen ein, die von Wirbeltieren oder Hefen usw. abgeleitet sind. Als eine Wirbeltierwirtszelle können COS- Zellen (Cell, 1981, 23: 175-182) oder CHO-Zellen benutzt werden. Vorzugsweise können Promotoren benutzt werden, die bei 5'stromaufwärts auf dem Gen positioniert sind, um exprimiert zu werden, und RNS-Spleißpositionen, Polyadenylations- und Transkriptions-determinationssequenzen besitzen.
Die Transkriptionsfaktoren A, B und C dieser Erfindung können benutzt werden, um Störungen zu behandeln, die durch Mutationen in den menschlichen Wachstumsgenen verursacht sind, und können als wachstumsfördernde Agenzien verwendet werden. Dank des im Fall von eukaryontischen Genen bekannten Polymorphismus können eine oder mehrere Aminosäuren substituiert werden. Auch können eine oder mehrere Aminosäuren in den Polypeptiden an einer oder mehreren Stellen der Aminosäurensequenz der Polypeptide SEQ ID NO: 11, 13 oder 16 deletiert oder eingefügt werden. Solche Polypeptide beziehen sich im Allgemeinen auf äquivalente Polypeptide, solange die unterschwellige biologische Aktivität des unmodifizierten Polypeptids im Wesentlichen unverändert bleibt.
Die vorliegende Erfindung wird durch folgende Beispiele veranschaulicht:

Beispiel 1

Patienten

Alle sechs untersuchten Patienten hatten de novo Geschlechtschromosomenaberrationen.
CC ist ein Mädchen mit dem Karyotypen 45,X/46,X psu dic (X) (Xqter → Xp22.3::Xp22.3 → Xqter). Bei der letzten Untersuchung im Alter von 6 1/2 Jahren, betrug seine Körpergröße 114 cm (25-50% Percentile). Seine Mutter maß 155 cm, der Vater stand für eine Analyse nicht zur Verfügung. Details können bei Henke et al., 1991, nachgelesen werden.
GA ist ein Mädchen mit dem Karyotypen 46,X der X (3pter → 3p23::Xp22.3 → Xqter). Bei der letzten Untersuchung im Alter von 17 Jahren wurde eine normale Körpergröße von 159 cm beobachtet. Seine Mutter misst 160 cm und sein Vater 182 cm. Details können bei Kulharya et al. 1995, nachgelesen werden.
55 ist ein Mädchen mit dem Karyotypen 46,X rea (X) (Xqter → Xq26:: Xp22.3 → Xq26:). Im Alter von 11 Jahren war seine Körpergröße unter der 3. Percentilewachstumskurve für japanische Mädchen geblieben; seine voraussichtliche Größe als Erwachsene (148.5 cm) war unter der Zielgröße (163 cm) und unter dem Zielbereich (155 bis 191 cm). Details können bei Ogata et alt, 1992, nachgelesen werden.
AK ist ein Mädchen mit dem Karyotypen 46,X rea (X) (Xqter → Xp22.3::Xp22.3 → Xp21.3:). Im Alter von 13 Jahren blieb seine Körpergröße unter der 2. Percentilewachstuniskurve für japanische Mädchen; seine voraussichtliche Größe als Erwachsene (142.8 cm) war unter der Zielgröße (155.5 cm) und unter dem Zielbereich (147.5-163.5 cm). Details können bei Ogata et alt, 1995, nachgelesen werden.
RY: der Karyotyp des Ring Y Patienten lautet 46,X,r(Y)/46,Xdic r(Y)/45,X[95 : 3 : 2], wie er an 100 Lymphozyten untersucht wurde; im Alter von 16 Jahren betrug seine endgültige Körpergröße 148 cm; die Körpergröße seiner drei Brüder war im normalen Bereich mit jeweils 170 cm (beim 16 jährigen Bruder 1), 164 cm (beim 14-jährigen Bruder 2) und 128 cm (beim 9 jährigen Bruder 3). Die Wachstumsverzögerung dieses Patienten ist so schwer, dass sie auch mit einer zusätzlichen Deletion des GCY Locus auf Yq kompatibel wäre.
AT: Junge mit Ataxia und inv(X); normale Körpergröße von 116 cm im Alter von 7 Jahren, die Größe der Eltern beträgt jeweils 156 cm und 190 cm.

Patienten für die Mutationsanalyse:

250 Individuen mit idiopathischem Minderwuchs wurden auf Mutationen in SHOXa hin getestet. Die Patienten wurden auf Grund folgender Kriterien ausgewählt: Körpergröße nach chronologischem Alter war unter dem 3. Percentile der nationalen Körpergrößenstandards, minus 2 Standardabweichungen (SDS); keine verursachende Krankheit war bekannt, insbesondere: normales Gewicht (Länge) im Schwangerschaftsalter, normale Körperproportionen, keine chronische organische Störung, normale Nahrungsmittelaufnahme, keine psychiatrische Störung, keine Skelettfehlbildungsstörung, kein Schilddrüsen- oder Wachstumshorznonmangel.

Familie A:

Die Fälle 1 und 2 sind minderwüchsige Kinder einer deutschen nicht blutsverwandten Familie. Der Junge (Fall 1) wurde in der 38. Schwangerschaftswoche durch Kaiserschnitt geboren. Das Geburtsgewicht betrug 2660 g, die Geburtsgröße 47 cm. Er entwickelte sich normal, abgesehen von subnormalem Wachstum. Bei der Untersuchung im Alter von 6.4 Jahren war er proportioniert klein (106.8 cm, - 2.6 SDS) und obese (22.7 kg), aber ansonsten normal. Sein Knochenalter war nicht retardiert (6 Jahre) und eine Knochendysplasie wurde durch Röntgenstrahlenanalyse ausgeschlossen. IGF-I- und IGFBP-3- Werte sowie Thyroidparameter im Serum ließen GH- oder Thyroid-hormondefizienz als unwahrscheinlich erscheinen. Das Mädchen (Fall 2) wurde termingerecht durch Kaiserschnitt geboren. Das Geburtsgewicht betrug 2920 g, die Geburtsgröße 47 cm. Seine Entwicklungsmeilensteine waren normal, aber im Alter von 12 Monaten wurde langsames Wachstum offenbar (Länge: 67 cm, - 3.0 SDS). Mit 4 Jahren betrug die Größe 89.6 cm (- 3.6 SDS). Keine dysmorphischen Merkmale oder Dysproportionen waren erkennbar. Es war nicht obese (13 kg). Sein Knochenalter betrug 3.5 Jahre und Knochendysplasie war ausgeschlossen. Die Hormonparameter waren normal. Interessant ist festzustellen, dass sowohl das Mädchen als auch der Junge nach der 50 Percentilewachstumskurve für Mädchen mit dem Turner Syndrom heranwuchsen. Die Mutter ist die Kleinste der Familie und hat eine leichte rhizomele Dysproportion (142.3 cm, - 3.8 SDS). Eine ihrer beiden Schwestern (150 cm, - 2.5 SDS) und die Großmuter mütterlicherseits (153 cm, -2.0 SDS) sind alle klein ohne jegliche Dysproportion. Eine Schwester hat normale Größe (167 cm, + 0.4 SDS). Die Größe des Vaters beträgt 166 cm (- 1.8 SDS) und die Größe des Großvaters mütterlicherseits 165 cm (- 1.9 SDS). Der andere Patient war japanischer Herkunft und wies die identische Mutation auf.

Beispiel 2

Identifikation des Minderwuchsgens

A. In-situ-Hybridisierung

a) Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)

Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) wurde unter Benutzung von Cosmiden, die in der Xp/Yp pseudoautosomalen Region (PAR1) gelegen sind, durchgeführt. FISH Studien, welche die Cosmide 64/7Scos (LLNLc110H032), E22cos (2e2), F1/14cos (110A7), M1/70cos (110E3), P99F2cos (43C11), P99cos (LLNLc110P2410), B6cosb (ICRFc104H0425), F20cos (34F5), F2lcos (ICRFc104G0411), F3cos2 (9E3), F3cos1 (11E6), P117cos (29B11), P6cos1 (ICRFc104P0117), P6cos2 (LLNLc110E0625) und E4cos (15G7) benutzten, wurden nach veröffentlichten Methoden (Lichter und Cremer, 1992) durchgeführt. Kurz zusammengefasst wurde ein Mikrogramm des jeweiligen Cosmidklons mit Biotin gekennzeichnet und hybridisiert zu humanen Metaphasenchromosomen unter Bedingungen, die Signale von repetitiven DNS-Sequenzen unterdrücken. Die Detektion des Hybridisierungssignals erfolgte über FITC-konjugiertes Avidin. Bilder von FITC wurden aufgenommen mit einem gekühlten, ladungsgekoppelten Flächencamerasystem (Photometrics, Tucson, AZ).

b) Physische Kartierung

Cosmide wurden von X- and Y-Chromosomenbanken des Lawrence Livermore National Laboratory und von der X-Chromosomenbank des Imperial Cancer Research Fund London (jetzt Max Planck Institut für Molekulargenetik Berlin) abgeleitet. Benutzt man Cosmide distal zu DXYS15, namentlich E4cos, P6cos2, P6cos1, P117cos und F3cos1, kann man bestimmen, dass zwei Kopien von E4cos, P6cos2, P6cos1 und eine Kopie von P117cos und F3cos1 noch vorhanden sind. Bruchstellen beider Patienten AK und SS liegen auf Cosmid P6cos1 mit einer maximalen physischen Entfernung von 10 kb voneinander. Hieraus wurde geschlossen, dass die anormalen X-Chromosomen von AK und SS etwa 630 kb DNS deletiert haben.
Weitere Cosmide wurden von der ICRF X-Chromosomen-spezifischen Cosmidbank (ICRFc104), der Lawrence Livermore X-Ghromosornen spezifischen Cosmidbank (LLNLc110) und der Y-Chromosomen-spezifischen Bank (LLCO&sub3;'M'), sowie von einer selbst hergestellten Cosmidbank, die das gesamte Genom erfasste, abgeleitet. Die Cosmide wurden durch Hybridisierung mit allen bekannten Sonden identifiziert, die auf dieser Region liegen und durch Benutzung von ganzen YACs als Sonden. Um Überlappungen zu prüfen, wurden in Fällen, in denen Überlappungen unter Benutzung bekannter Sonden nicht nachgewiesen werden konnten, Endsonden verschiedener Cosmide benutzt.

c) Southern-Blot-Hybridisierung

Die Southern-Blot-Analyse, welche unterschiedliche pseudoautosomale Marker benutzte, lieferte den Beweis dafür, dass die Bruchstelle auf dem X-Chromosom der Patientin CC zwischen DXYS20 (3cosPP) und DXYS60 (U7A) (Henke et al. 1991) gelegen ist. Um dieses Ergebnis zu bestätigen und den Bruchstellenort zu präzisieren wurden die Cosmide 64/7Scos, E22cos, F1/14cos, M1/70cos, F2cos, P99F2cos und P99cos als FISH-Sonden angewendet. Der Bruchstellenort auf dem anormalen X- Chromosom der Patientin CC konnte zwischen den Cosmiden 64/7Scos (eine Kopie) und FI/14cos (zwei Kopien) auf dem E22PAC bestimmt werden. Die Patientin CC mit normaler Körpergröße verlor demzufolge ungefähr 260-290 kb der DNS.
Southern-Blot-Hybridisierungen wurden unter stringenten Bedingungen in Church- Puffern (0.5 M NaPi pH 7.2, 7% SDS, 1mM EDTA) bei 65ºC durchgeführt und in 40 mM NaPi, 1% SDS bei 65ºC gewaschen.

d) FISH-Analyse

Biotinylierte Cosmid-DNS (Insertionsgröße 32-45 KB) oder Cosmidfragmente (10-16 kb) wurden zu Metaphasenchromosomen von stimulierten Lymphozyten von Patienten unter bisher beschriebenen Bedingungen hybridisiert (Lichter und Cremer, 1992). Die hybridisierte Sonde wurde über Avidin-konjugierte FITC entdeckt.

e) PCR-Amplifikation

Alle PCRs wurden in 50 ul Volumina durchgeführt, die 100 pg - 200 ng Template, 20 pmol von jedem Primer, 200 uM dNTP's (Pharmazie), 1.5 mM MgCl&sub2;, 75 mMTris/HCl pH9, 20mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 0.01% (w/v) Tween20 und 2 U of Goldstar DNS Polymerase (Eurogentec) enthielten. Das thermale Durchlaufen wurde in einem Thermocycler GeneE (Techne) durchgeführt.

f) Exon-Amplifikation

Vier Cosmidpools, bestehend für alle vier bis fünf Klone aus den Berührungscosniiden, wurden zu Exon-Amplifikationsexperimenten benutzt. Die Cosmide in jedem Cosmidpool wurden teilweise mit Sau3A digeriert. Gelgereinigte Fraktionen im Größenbereich von 4-10 kb wurden kloniert in dem BamHI-digerierten pSPL3B-Vektor (Burn et al. 1995) und für die Exon-Amplifikationsexperimente wie zuvor beschrieben verwendet (Church et al., 1994).

g) Genomische Sequenzierung

Sonifizierte Fragmente der beiden Cosmide LLOYNCO&sub3;'M' 1 5D 10 und LLOYNCO&sub3;'M'34F5 wurden getrennt subkloniert in M13mp18 Vektoren. Aus jeder Cosmidbank wurden wenigstens 1000 Plaques herausgepickt, M13-DNS zubereitet und sequenziert unter Benutzung von Anfärbe-Terminatoren, ThermoSequenase (Amersham) und universellem MI3-Primer (MWG-BioTech). Die Gels wurden auf ABI-377- Sequenzern bearbeitet und die Daten wurden mit dem GAP4 Programm (Staden) zusammengestellt und editiert.
Von allen sechs Patienten hatte GA die am wenigsten gut gekennzeichnete Chromosomenbruchstelle. Die am weitesten distal gelegenen Marker, die zuvor auf ihre Anwesenheit oder Abwesenheit auf dem X-Chromosom hin getestet wurden, waren DXS 1060 und DXS996, welche etwa 6 Mb vom Telomer entfernt liegen (Nelson et al., 1995). Mehrere Cosmide, die verschiedene Gensequenzen innerhalb PARI (MIC2, ANT3, CSF2RA, und XE7) enthielten, wurden getestet und alle waren auf dem Translokationschromosom vorhanden, weshalb Cosmide aus der für Minderwuchs verantwortlichen kritischen Region, z. B. dem Chromosom, die Transiokations-bruchstelle auf Cosmid MI/70cos platzieren. Ein quantitativer Vergleich der Signalintensitäten von M1/70cos zwischen dem normalen und dem neugeordneten X-Chromosom ergibt, dass etwa 70% dieses Cosmids deletiert ist. TABELLE 2
Tabelle 2: Diese Tabelle fast die FISH-Daten für die 16 Cosmide zusammen, die an vier Patienten getestet wurden.
[-] eine Kopie; gibt an, dass das jeweilige Cosmid auf dem neugeordneten X-Chromosom deletiert wurde, aber auf dem X- Chromosom
vorhanden ist
[+] zwei Kopien; gibt an, dass das jeweilige Cosmid auf dem neugeordneten und dem normalen X-Chromosom vorhanden ist
[(+)] Bruchstellenregion; gibt an, dass die Bruchstelle innerhalb des Cosmids auftritt, wie durch FISH bewiesen
Zusammengefasst zeigt die Molekularanalyse an sechs Patienten mit X-chromosomalen Neuordnungen unter Benutzung von Fluoreszenz-markierten Cosmidsonden und In-situ- Hybridisierung, dass die für Minderwuchs verantwortliche kritische Region auf ein Intervall von 270 kb beschränkt werden kann, begrenzt durch die Bruchstelle der Patientin GA auf ihrer distalen Zentromerseite und durch die Patienten AK und SS auf ihrer proximalen Zentromerseite.
Genotyp-Phänotypkorrelationen können informativ sein und wurden gewählt, um das für Minderwuchs verantwortliche kritische Intervall auf dem menschlichen X- und Y- Chromosom zu skizzieren. In der vorliegenden Studie wurde die FISH-Analyse angewandt, um Metaphasenstreuung und Interphasennuclei der Lymphozyten von Patienten zu untersuchen, welche auf dem X-Chromosom Deletionen und Tranlokationen und innerhalb Xp22.3 Bruchstellen aufwiesen. Diese Bruchstellen scheinen bei zwei der vier Patienten (AK und SS) zusammengeballt zu sein wahrscheinlich auf Grund der Anwesenheit von Sequenzen, die zu Chromosomenneuordnungen prädisponieren. Ein zusätzlicher Ring Y- Patient wurde festgestellt mit einer Unterbrechung in der kritischen 27U kb Region, wodurch das kritische Intervall auf eine 170 kb Region reduziert wurde.
Durch Korrelieren der Körpergröße aller sechs Personen mit Ihrer Deletionsbruchstelle wurde ein Intervall von 170 kb innerhalb der pseudoautosomalen Region kartographiert, dessen Anwesenheit oder Abwesenheit einen bedeutungsvollen Effekt auf die Körpergröße hat. Dieses Intervall ist begrenzt durch die X-Chromosomenbruchstelle der Patientin GA bei 340 kb distal vom Telomer (Xptel) und durch die Bruchstellen der Patienten AT und RY proximal von 510/520 kb Xptel. Diese Zuweisung stellt eine beträchtliche Reduzierung des kritischen Intervalls auf fast ein Viertel der bisherigen Größe dar (Ogata et al., 1992; Ogata et al., 1995). Ein kleines Set von sechs bis acht Cosmiden ist jetzt für FISH-Experimente verfügbar, um den Vorrang und die Bedeutung dieses Genomlocus an einer großen Reihe von Patienten mit idiopathischem Minderwuchs zu testen.

B. Identifikation des in Frage kommenden Minderwuchsgens

Um nach Transkriptionseinheiten innerhalb der kleinsten, kritischen 170 kb Region zu suchen, wurde das Exon-Einfangen und die cDNS-Selektion an sechs Cosmiden (110E3, F2cos, 43C11, P2410, 15D10, 34F5) durchgeführt. Drei verschiedene positive Klone (ET93, ET45 und G108) wurden isoliert durch Exon-Einfangen, von denen alle auf Cosmid 34F5 lagen. Frühere Studien, die cDNS-Selektionsprotokolle und eine Fülle von 25 verschiedenen cDNS-Banken benutzten, hatten sich als erfolglos erwiesen, was die Vermutung zuließ, dass Gene in diesem Intervall mit einer sehr geringen Abundanz exprimiert sind.
Um herauszufinden, ob irgendein Gen in diesem Intervall fehlte, wurde die Nucleotidsequenz von etwa 140 kb aus dieser Region von PARI bestimmt, indem die M13- Random-Methode und Färbeteniinatorchemie angewandt wurden. Die Cosmide für die Sequenzanalyse wurden so gewählt, dass sie einander minimal überlappten und gemeinsam das kritische Intervall überspannten. Die DNS-Sequenzanalyse und nachfolgende Proteinvoraussage wurden durch das "X Grail" Programm, Version 1.3c, sowie durch das Exon-Einfangprogramm FEXHB durchgeführt und bestätigten alle 3 zuvor klonierte Exons. Es konnten keine anderen Protein-codierenden Gene als die zuvor isolierten entdeckt werden.

C. Isolierung des für Minderwuchs in Frage kommenden SHOX-Gens

In der Annahme, dass alle drei Exonklone ET93, ET45 und G108 Teil desselben Gens sind, wurden sie gemeinsam als Sonden benutzt, um 14 verschiedene cDNS-Banken von 12 verschiedenen fetalen (Lunge, Leber, Gehirn 1 und 2) und erwachsenen Geweben (Eierstock, Plazenta 1 und 2, Fibroblast, Skelettmuskel, Knochenmark, Gehirn, Gehirnstamm, Hypothalamus, Pituitaria) zu durchsieben. Nicht ein einziger Klon unter annähernd 14 Millionen plattierten Klonen wurde entdeckt. Um das Transkript in voller Länge zu isolieren, wurde 3' und 5'RACE durchgeführt. Für 3'RACE benutzte man Primer vom Exon G108 auf der RNS von Plazenta, Skelettmuskel- und Knochenmarkfibroblasten, also auf Geweben, in denen G108 nachgewiesenermaßen exprimiert war. Zwei verschiedene 3'RACE Klone von 1173 and 652 bp wurden von allen drei Geweben abgeleitet, was vermuten ließ, dass zwei verschiedene 3'Exons a und b existieren. Die beiden verschiedenen Formen wurden SHOXa und SHOXb genannt.
Um die Chancen zu vergrößern, den kompletten S'Abschnitt eines Gens zu isolieren, das bekanntermaßen mit niedriger Abundanz exprimiert ist, wurde eine HeLa-Zellreihe mit Retinolsäure und Phorbolester PMA behandelt. Die RNS aus einer solchen induzierten Zellreihe und die RNS aus Plazenta und Skelettmuskel wurden für die Konstruktion einer 'Marathon cDNS-Bank' genutzt. Aus allen drei Geweben wurden identische 5'RACE cDNS Klone isoliert.

Experimentelle Verfahren:

RT-PCR und cDNS-Bankkonstruktion

Humane polyA&spplus;RNS von Herz, Pankreas, Plazenta, Skelettmuskel, fetaler Niere und Leber wurden von Clontech gekauft. Eine gesamte RNS wurde aus einer Knochenmarkfibroblastzellreihe mit dem TRIZOL-Reagens (Gibco-BRL) wie vom Hersteller beschrieben isoliert. Die Synthese des ersten cDNS-Strangs wurde durchgeführt mit der Ausrüstung für die Synthese des Superskripts des ersten cDNS-Strangs (Gibco-BRL) beginnend mit 100 ng polyA+RNS oder 10 ug der Gesamt-RNS unter Benutzung des Oligo(dt)-Adapterprimers (GGCCACGCGTCGACTAGTAC[dT]&sub2;&sub0;N. Nach der Synthese des ersten cDNS-Strangs wurde das Reaktionsgemisch 1/10 verdünnt. Für weitere PCR-Experimente wurden 5Ld dieser Verdünnungen benutzt.
Eine 'Marathon-cDNS-Bank' wurde aus Skelettmuskel und Plazenta-polyA&spplus;RNS mit der Marathon-cDNS-Amplifikationsausrüstung (Clontech) wie vom Hersteller beschrieben konstruiert.
cDNS-Banken von fetalem Gehirn (catalog # HL5015b), fetaler Lunge (HL3022a), Eierstock (HL1098a), Pituitaria (HL1097v) und Hypothalamus (HL1172b) wurden von Clontech gekauft. cDNS-Banken von Gehirn, Niere, Leber und Lunge waren Teil des Schnellsiebtests der humanen cDNS-Bank (Clontech). Eine cDNS-Bank von fetalen Muskeln wurde beim UK Human Genome Mapping Project Resource Center erhalten [Zentrum für Ressourcen aus dem Humangenomkartographierprojekt im Vereinigten Königreich].

D. Sequenzanalyse und Struktur des SHOX-Gens

Eine übereinstimmende Sequenz von SHOXa und SHOXb (1349 und 1870 bp) wurde durch Analyse von Sequenzen von durch 5' und 3'RACE abgeleiteten Klonen zusammengestellt. Ein einziger offener Leserahmen von 1870 bp (SHOXa) und 1349 bp (SHOXb) wurde identifiziert und ergab zwei Proteine von 292 (SHOXa) und 225 Aminosäuren (SHOXb). Beide Tranakripte a und b teilen sich ein gemeinsames 5'Ende, haben aber ein unterschiedliches letztes 3'Exon, ein Ergebnis, das zur Benutzung von alternativen Spleißsignalen anregte. Eine komplette Ausrichtung zwischen den beiden cDNS und der sequenzierten Genom-DNS von den Cosmiden LLOYNCO&sub3;"M"15D10 und LLOYNC3"M"34F5 wurde erreicht, wodurch die Aufstellung der Exon-Intron- Struktur möglich wurde (Abb. 4). Das Gen ist aus 6 Exons zusammengesetzt, deren Größe von 58 bp (Exon III) bis 1146 bp (Exon Va) reicht. Exon I enthält eine CpG- Insel, das Startcodon und die 5'Region. Ein Stopcodon sowie die nichtcodierende 3'Region befinden sich in jedem der alternativ gespleißten Exons Va und Vb.

Beispiel 3

Zwei cDNS wurden identifiziert, die in der als für Minderwuchs kritisch identifizierte 160 kb Region kartographisch erfasst sind. Diese cDNS entsprechen den Genen SHOX und pET92. Die cDNS wurden identifiziert durch Hybridisierung von Subklonen der Cosmide zu cDNS-Banken.
Durch die Verwendung des Sets der Cosmidklone mit kompletter Abdeckung der kritischen Region wurde nun das genetische Material zur Identifizieren des verursachenden Gens geliefert. Positionsklonierungsprojekte, welche auf die Isolierung von Genen aus dieser Region abzielten, wurden mittels Exoneinfang- und cDNS- Selektionstechniken ausgeführt. Auf Grund ihres Orts innerhalb der pseudoautosomalen Region kann angenommen werden, dass diese Gene der X-Inaktivierung entgehen und einen Dosierungseffekt ausüben.
Die Klonierung des zu Minderwuchs führenden Gens, wenn es abwesend (haploid) oder defizient ist, stellt einen weiteren Schritt in Richtung auf die Genauigkeit der Diagnose dar, wobei er die Grundlage für Mutationsanalyse innerhalb des Gens liefert durch zum Beispiel Einzelstrang-Konformationspolymorphismus (SSCP). Zusätzlich haben die Klonierung dieses Gens und dessen nachfolgende biochemische Charakterisierung den Weg geebnet für ein tieferes Verständnis der bei der Wachstumssteuerung involvierten biologischen Prozesse.
Die DNS-Sequenzen dieser Erfindung liefern einen ersten molekularen Test zur Identifikation von Personen mit einer spezifischen genetischen Störung innerhalb der komplexen heterogenen Gruppe von Patienten mit idiopathischem Minderwuchs.

Beispiel 4

Expressionsmuster von SHOXa und SHOXb

Die Northern-Blot-Analyse, die Einzelexons als Hybridisierungssonden benutzt, ergab ein unterschiedliches Expressionsprotil für jedes Exon, was stark darauf hinwies, dass die Bänder verschiedener Größe und Intensitäten Cross-Hybridisierungsprodukte zu anderen G,C reichen Gensequenzen darstellen. Um ein realistischeres Expressionsprofil der beiden Gene SHOXa and b zu erhalten, wurden RT-PCR-Experimente auf der RNS von verschiedenen Geweben durchgeführt. Während die Expression von SHOXa in Skelettmuskel-, Plazenta-, Pankreas-, Herz- und Knochenmarkfibroblasten beobachtet wurde, war die Expression von SHOXb auf fetale Nieren-, Skelettmuskel- und Knochenmarkfibroblasten beschränkt, mit der bei weitem höchsten Expression in Knochenmarkfibroblasten.
Die Expression von SHOXa in mehreren cDNS-Banken, die von fetalem Gehirn, Lunge und Muskel, von erwachsenem Gehirn, Lunge und Pituitaria hergestellt waren, und von SHOXb in keiner der getesteten Banken lieferte den zusätzlichen Beweis, dass eine gespleißte Form (SHOXa) breitergefächert und die andere (SHOXb) in einer vorherrschend gewebespezifischen Weise exprimiert ist.
Um die Transkriptionsaktivität von SHOXa und SHOXb auf dem X- und Y- Chromosom zu bestimmen, wendeten wir RT-PCR auf einer RNS an, die aus unterschiedlichen Zellreihen extrahiert war, die das aktive X-, das inaktive X- oder das Y-Chromosom als die einzigen menschlichen Chromosomen enthielten. Alle Zellreihen ergaben ein Amplifikationsprodukt der erwarteten Länge von 119 bp (SHOXa) und 541 bp (SHOXb), womit der eindeutige Beweis erbracht war, dass sowohl SHOXa als auch b der X-Inaktivierung entgehen.
SHOXa und SHOXb codieren neu entdeckte Homöodomäne-Proteine. SHOX ist hochgradig erhalten durch alle Spezien von den Säugetieren bis zu den Fischen und Fliegen. Das wirkliche 5'Ende und das wirkliche 3'Ende - außer der Homöodomäne - sind ähnlich erhaltene Regionen bei Mensch und Maus, womit auf eine funktionelle Bedeutung hingewiesen wird. Unterschiede in solchen Aminosäureregionen durften sich während der Evolution von Mensch und Maus nicht anhäufen.

Experimentelle Verfahren:

a) 5' und 3'RACE

Um das S'Ende der SHOXa- und b-Transkripte zu klonieren, wurde 5'RACE unter Benutzung der konstruierten 'Marathon-cDNS-Banken' durchgeführt. Die folgenden Oligonucleotidprimer wurden benutzt: SHOX B rev,
GAAAGGCATCCGTAAGGCTCCC (Position 697-718, Reversestrang [r]) und der Adaptorprimer AP 1. Die PCR erfolgte unter Benutzung folgender Aufsetzparameter: 94ºC für 2 min. 94ºC für 30 sec, 70ºC für 30 sec, 72ºC für 2 min für 5 Zyklen. 94ºC für 30 sec, 66ºC für 30 sec, 72ºC für 2 min für S Zyklen. 94ºC für 30 sec, 62ºC für 30 sec, 72ºC für 2 min für 25 Zyklen. Eine zweite Amplifikationsrunde wurde durchgeführt unter Benutzung von I/100 des PCR-Produkts und der folgenden ineinander greifenden Oligonucleotidprimer: SHOX A rev, GACGCCTTTATGCATCTGATTCTC (Position 617-640 r) und der Adaptorprimer AP2. Die PCR wurde für 35 Zyklen bei der Annealingstemperatur von 60ºC ausgeführt.
Um das 3'Ende der SHOXa- und b-Transkripte zu klonieren, wurde 3'RACE durchgeführt, wie zuvor beschrieben (Frohman et al., 1988) unter Benutzung von durch Oligo(dT)adaptorprimer synthetisierten Erststrang-cDNS. Folgende Oligonucleotidprimer wurden benutzt: SHOX A for, GAATCAGATGCATAAAGGCGTC (Position 619-640) und der Oligo(dT)adaptor. Die PCR wurde unter Benutzung folgender Parameter ausgeführt: 94ºC für 2 min. 94ºC für 30 sec, 62ºC für 30 sec, 72ºC für 2 min für 35 Zyklen. Eine zweite Amplifikationsrunde wurde durchgeführt unter Benutzung von 1/100 des PCR-Produkts und der folgenden ineinander greifenden Oligonucleotidprimer: SHOX B for, GGGAGCCTTACGGATGCCTTTC (Position 697-718) und des Oligo(dT)Adaptors. Die PCR wurde für 35 Zyklen bei der Annealingstemperatur von 62ºC ausgeführt.
Um die Sequenzen der SHOXa- und SHOXb-Transkripte zu validieren, wurde PCR mit einem 5'Oligonucleotidprimer und einem 3'Oligonucleotidprimer ausgeführt. Für SHOXa wurden folgende Primer benutzt: G310 for, AGCCCCGGCTGCTCGCCAG(3 (Position 59-78) und SHOX D rev, CTGCGCGGCGGGTCAGAGCCCCAG (Position 959-982 r). Für SHOXb wurden folgende Primer benutzt: G310 for, AGCCCCGGCTGCTCGCCAGC und SHOX2A rev, GCCTCAGCAGCAAAG CAAGATCCC (Position 1215-1238 r). Beide PCR erfolgten unter Benutzung folgender Aufsetzparameter: 94ºC für 2 min. 94ºC für 30 sec, 70ºC für 30 sec, 72ºC für 2 min für 5 Zyklen. 94ºC für 30 sec, 68ºC für 30 sec, 72ºC für 2 min für 5 Zyklen. 94ºC für 30 sec, 65ºC für 30 sec, 72ºC für 2 min für 35 Zyklen. Die Produkte wurden gel-gereinigt und für Sequenzierungsanalyse kloniert.

b) SSCP-Analyse

Die SSCP-Analyse wurde an genomisch amplifizierter DNS von Patienten gemäß einer zuvor beschriebenen Methode durchgeführt (Orita et al., 1989). Ein bis fünf ul der PCR- Produkte wurden vermischt mit 5 ul einer Denaturierungslösung, die 95% Formamid und IOmM EDTA p118 enthielt und bei 95ºC 10 min. lang denaturierte. Proben wurden unmittelbar auf Eis gekühlt und auf ein 10% Polyacryamidgel (Acrylamide: Bisacryamide = 37.5 : 1 and 29 : 1; Multislotgel, TGGE Base, Qiagen), das 2% Glycerol und 1xTBE enthielt, aufgelegt. Die Gels wurden bei 15ºC mit 500 V 3 bis 5 Stunden lang bearbeitet und silbergefärbt wie im TGGE-Handbuch (Qiagen, 1993) beschrieben.

c) Klonierung und Sequenzierung der PCR-Produkte

Die PCR-Produkte wurden in pMOSBIue unter Benutzung des pMOSBlueT- Vektorsatzes von Amersham kloniert. Übernachtkulturen einzelner Kolonien wurden in 100 ul H&sub2;O durch 10-minütiges Kochen lysiert. Die Lysate wurden benutzt als Template für PCR mit spezifischen Primern für das klonierte PCR-Produkt. Die SSCP von PCR- Produkten ermöglichte die Identifikation von Klonen, die verschiedene Allele enthielten. Die Klone wurden mit den CY5 markierten Vektorprimern Uni und T7 mittels der Zyklussequenzierungsmethode sequenziert, die vom Hersteller beschrieben wurde (ThermoSequenase Kit (Amersham)) auf einem automatischen ALF-Express-Sequenzer (Pharmazie).

d) PCR-Screening von cDNS-Banken

Um die Expression von SHOXa und b aufzuspüren, wurde ein PCR-Screening von mehreren cDNS-Banken und Erststrang-cDNS mit SHOXa und b spezifischen Primern durchgeführt. Für die eDNS-Banken wurde eine SxlOg pfu äquivalente DNS benutzt. Für SHOXa wurden die Primer SHOX E rev, GCTGAGCCTGGACCTGTTGGAAAGG (Position 713-737 r) und SHOX a for benutzt. Für SHOXb wurden folgende Primer benutzt: SHOX B for und SHOX2A rev. Beide PCR erfolgten unter Benutzung der Aufsetzparameter 94ºC für 2 min. 94ºC für 30 sec, 68ºC für 30 sec, 72ºC für 40 sec für S Zyklen. 94ºC für 30 sec, 65ºC für 30 sec, 72ºC für 40 sec für 5 Zyklen. 94ºC für 30 sec, 62ºC für 30 sec, 72ºC für 40 sec für 35 Zyklen.

Beispiel 5

Expressionsmuster von OG12, dem vermutlichen Maushomolog sowohl von SHOX als auch von SHOT

In-situ-Hybridisierung an Mäuseembryos im Alter zwischen Tag 5 p.k. und Tag 18,5 p.k. sowie an fetalen und neugeborenen Tieren wurde durchgeführt, um das Expressionsmuster aufzustellen. Die Expression wurde in den sich entwickelnden Gliedknospen, im Mesoderm nasaler Prozesse, die zur Formation von Nase und Palatum beitragen, im Augenlid, in der Aorta, in den sich entwickelnden weiblichen Gonaden, in dem sich entwickelnden Rückenmark (beschränkt auf differenzierende motorische Neuronen) und im Gehirn vorgefunden. Auf der Grundlage dieses Expressionsmusters und auf die Kartierungsposition seines humanen homologen SHOT, stellt SHOT wahrscheinlich einen Kandidaten für das Cornelia de Lange-Syndrom dar, das Minderwuchs einschließt.

Beispiel b

Isolierung des neu entdeckten SHOX-ähnlichen Homöoboxgens auf Chromosom drei, SHOT, das mit menschlichem Wachstum/Minderwuchs zusammenhängt

Ein neues Gen, genannt SHOT (für SHOX-Homolog auf Chromosom drei), das die meiste Homologie mit dem OG12 Gen der Maus und dem menschlichen SHOX-Gen aufweist, wurde beim Menschen isoliert. Das menschliche SHOT-Gen und die Maus- OG12-Gene sind hochgradig homolog mit 99% Identität des Proteinwertes. Obwohl noch nicht bewiesen, ist es dank der auffallenden Homologie zwischen SHOT und SHOX (Identität nur innerhalb der Homöodomäne) wahrscheinlich, dass SHOT auch ein Gen ist, das am Minderwuchs oder menschlichem Wachstum beteiligt sein kann.
SHOT wurde isoliert unter Benutzung von Primern aus zwei neuen menschlichen ESTs (HS 1224703 und HS 126759) aus der EMBL Datenbank, um eine reverse-transkribierte RNS von einer Knochenmarkfibroblastenrelhe (Rao et al. 1997) zu amplifizieren. Die 5' und 3'Enden von SHOT wurden erzeugt durch RACE-PCR aus einer Knochenmarkfibroblastenbank, die gemäß Rao et al., 1997 konstruiert wurde. SHOT wurde durch Fisch-Analyse auf das Chromosom 3q25/q26 kartographiert und das Maushomolog auf die synthetische Region auf dem Mauschromosom 3. Auf der Grundlage des Expressionsmusters von OG12, seinem Maushomolog, stellt SHOT einen Kandidaten für das Cornelia Lange-Syndrom (welches Minderwuchs und andere Merkmale, einschließlich kraniofaziale Abnormitäten, aufweist) dar, das auf diesem Chromosomenintervall auf 3q25126 kartographiert ist.

Beispiel 7

Suche nach Mutationen bei Patienten mit Idiopathischem Minderwuchs

Die DNS-Sequenzen dieser Erfindung werden bei den PCR-, LCR- und anderen bekannten Technologien genutzt, um zu bestimmen, ob solche minderwüchsige Personen kleine Deletionen oder Punktmutationen im Minderwuchsgen aufweisen.
Eine Gesamtzahl von anfänglich 91 (von insgesamt 250 Personen) nicht verwandten männlichen und weiblichen Patienten mit idiopathischem Minderwuchs (idiopathischer Minderwuchs tritt mit einer geschätzten Häufigkeit von 2-2,5% in der allgemeinen Bevölkerung auf) wurden auf kleine Neuordnungen oder Punktmutationen im SHOXa- Gen hin getestet. Sechs Sets von PCR-Primern wurden entwickelt, um nicht nur einzelne Exons sondern auch das Exon flankierende Sequenzen und einen kleinen Teil des 5'UTR zu amplifizieren. Für das größte Exon, das Exon eins, wurden zwei zusätzliche innenexon-Primer erzeugt. Die für die PCR benutzten Primer sind in Tabelle 2 dargestellt.
Einstrang-Konformationspolymorphismus (SSCP) wurde an allen amplifizierten Exons, deren Größe von 120 bis 295 bp reichte, durchgeführt. Bandmobilitätsänderungen wurden bei nur 2 Individuen mit Minderwuchs identifziert (Y91 und A1). Fragmente, die veränderte SSCP-Muster hergaben (nur SSCP-Konformer) wurden kloniert und sequenziert. Um PCR- und Sequenzierungsartefakte zu vermeiden, wurde die Sequenzierung an zwei Strängen durchgeführt unter Benutzung zweier unabhängiger PCR-Reaktionen. Die Mutation bei dem Patienten Y91 liegt 2Bbp 5' vom Startcodon im 5'UTR und beinhaltet eine Zytidin-Guaninsubstitution. Um herauszufinden, ob diese Mutation einen seltenen Polymorphismus darstellt oder verantwortlich ist für den Phänotyp durch Regulierung der Genexpression d. h. durch eine schwächere Bindung von Translationsinitiationsfaktoren, wurden seine Eltern und eine Schwester getestet. Da sowohl die Schwester als auch der Vater mit normaler Körpergröße ebenfalls dieselbe SSCP-Variante (Daten nicht dargestellt) aufwiesen, stellt diese Basensubstitution einen seltenen Polymorphismus dar, der mit dem Phänotyp nicht in Zusammenhang stand.
Die Klonierung und Sequenzierung eines einzigen SSCP-Konformers bei Patient Al ergab eine Zytidin-Thymidinbasentransition (Nucleotid 674), welche ein Determinationscodon in der Aminosäurenposition 195 der vorausgesagten 225, beziehungsweise 292 Aminosäurensequenzen einführt. Um zu bestimmen, ob diese Nonsense-Mutation mit dem Minderwuchs in der Familie genetisch assoziiert ist, wurde eine Stammbaumanalyse durchgeführt. Es ergab sich, dass alle sechs minderwüchsigen Individuen (deren Körpergröße als unter 2 Standardabweichungen definiert ist) eine anormale SSCP-Änderung und die Zytidin-Thymidintransition aufwiesen. Weder der Vater, noch eine Tante, noch der Großvater mütterlicherseits mit normaler Körpergröße wiesen diese Mutation auf, was darauf hinwies, dass die Großmutter das mutierte Allel auf zwei ihrer Töchter und Ihre beiden Enkel übertragen hat. Somit besteht eine Übereinstimmung mit dem Vorhandensein des Mutationsalleis und dem minderwüchsigen Phänotyp in dieser Familie.
Die identische Situation wie die oben geschilderte wurde bei einem anderen Patienten japanischer Herkunft beobachtet.

Beispiel 8

Die DNS-Sequenzen dieser Erfindung werden zur Charakterisierung der Funktion eines Gens oder von Genen genutzt. Die DNS-Sequenzen können als Suchmaschinen für Datenbanken auf der Suche nach Nucleinsäuren- oder Aminosäurendatenbanken für die Identifikation verwandter Gene oder Genprodukte benutzt werden. Die partielle Aminosäurensequenz von SHOX93 wurde als Suchmaschine von Aminosäurendatenbanken benutzt. Die Suche ergab eine sehr hohe Homologie mit vielen bekannten Homöoboxproteinen. Die cDNS-Sequenzen dieser Erfindung können genutzt werden, um das Peptid rekombinant zu produzieren. Verschiedene Expressionssysteme, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, können zur rekombinanten Proteinproduktion verwendet werden.
Durch konventionelle Peptidsynthese (Proteinsynthese nach der Merrilield-Methode), wurde ein Peptid, das die Sequenz CSKSFDQKSKDGNGG besitzt, synthetisiert und polyklonale Antikörper wurden nach Standardprotokollen sowohl bei Hasen als auch bei Hühnem abgeleitet.

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SEQUENZLISTE

(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Rappold-Hoerbrand, Gudrun, Dr.
(B) STRASSE: Hausackerweg 14
(C) STADT: Heidelberg
(E) LAND: Deutschland
(F) POSTLEITZAHL (ZIP): 69118
(A) NAME: Rao, Ercole
(B) STRASSE: Odenwaldstrasse 11
(C) STADT: Riedstadt-Erfelden
(E) LAND: Deutschland
(F) POSTLEITZAHL (ZIP): 64560
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: MENSCHLICHES WACHSTUMSGEN UND MINDERWUCHSGEN-BEREICH
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN; 16
(iv) COMPUTERLESBARE FORM; ,
(A) MEDIUMTYP: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM compatibler PC
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)
(vi) FRÜHERE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US 60/027,633
(B) ANMELDUNGSDATUM: O1. OKT. 1996
(vi) FRÜHERE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: EP 97100583.0
(B) ANMELDUNGSDATUM: 16. JAN. 1997
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 60 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGVORKOMMEN: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 209 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGVORKOMMEN: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "exon II: ET93"
(v) FRAGMENTTYP: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 368 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGVORKOMMEN: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "exon T: G310" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 58 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGVORKOMMEN: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "exon III: ET45" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 89 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGVORKOMMEN: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "exon IV: G108" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 1166 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGVORKOMMEN: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "exon: Va" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ TD NO: 7:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 625 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGVORKOMMEN: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG; /desc = "exon Vb" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 15577 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGVORKOMMEN: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "HOX93"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: exon
(B) ORT: 1498..1807
(D) ANDERE INFORMATION:/Funktion = "Teil von exon I (G310)"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc feature
(B) ORT: 3844..4068
(D) ANDERE INFORMATION:/Funktion = "pET92 Region (erster Teil)"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc feature
(B) ORT: 4326..4437
(D) ANDERE INFORMATION:/Funktion = "pET92 Region (zweiter Teil)"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc feature
(B) ORT: 4545..4619
(D) ANDERE INFORMATION:/Funktion = "pET92 Region (dritter Teil)"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: exon
(B) ORT: 5305..5512
(D) ANDERE INFORMATION:/Funktion = "Teil von exon II (ET93)"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: exon
(B) ORT: 11620..11729
(D) ANDERE INFORMATION:/Funktion = "Teil von exon IV (G108)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 753 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGVORKOMMEN: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "ET92 Gensegment" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTTKA:
(A) LÄNGE: 1890 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGVORKOMMEN: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ü) MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "SHOXa"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) ORT: 91..968 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 292 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 1354 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGVORKOMMEN: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "SHOXb"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) ORT: 91..768 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12;
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 226 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 32367 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGVORKOMMEN: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "COSMID: LLNOYCO3'M'34F5" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NO: 15:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 806 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGVORKOMMEN: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "SHOT"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) ORT: 43..615 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NO: 16:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 190 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGVORKOMMEN: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:

SEQUENZLISTE II

< 110> Rappold-Hoerbrand, Gudrun
< 120> Menschliches Wachstumsgen und Minderwuchsgenbereich
< 140> EP 97 944 906.3-2106
< 141> 1997-09-29
< 160> 2
< 170> PatentIn Ver. 2.1
< 210> Informationen für SEQ ID No. 17
< 211> 303
< 212> DNA
< 213> Mus musculus
< 300>
< 301> Mar ra, M. et al.
< 302> mj75d03.r1 Soares mouse p3NMF19.5 Mus musculus cDNA clone
< 308> EMEL Database Entry MMA59929, Accession Number AA059929
< 309> 1996-09-24 < 400> 1
< 210> Informationen für SEQ ID No. 18
< 211> 323
< 212> DNA
< 213> Mus musculus
< 300>
< 301> Marra, M. et al.
< 302> mb68b03.r1 Soares mouse p3NMF19.5 Mus musculus cDNA clone
< 308> EMBL Database Entry MM3349, Accession Number W1818334
< 309> 1996-05-04 < 400> 2

Claims

1. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend die Nukleotidsequenz SHOX ET93 [SEQ ID NO: 2] und eine aus der Gruppe SHOX G310 [SEQ ID NO: 3], SHOX ET45 [SEQ ID NO: 4], SHOX G108 [SEQ ID NO: 5], SHOX Va [SEQ ID NO: 6] und SHOX Vb [SEQ ID NO: 7] ausgewählte Nukleotidsequenz.

2. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, umfassend die Nukleotidsequenzen von SHOX ET93 [SEQ ID NO: 2], SHOX ET45 [SEQ ID NO: 4] und SHOX G108 [SEQ ID NO: 5].

3. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 2, weiter umfassend die Nukleotidsequenzen von SHOX G310 [SEQ ID NO: 3].

4. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 3, weiter umfassend die Nukleotidsequenzen von SHOX Va [SEQ ID NO: 6].

5. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 3, weiter umfassend die Nukleotidsequenzen von SHOX Vb [SEQ ID NO: 7].

6. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend für Polypeptide, die eine Homeoboxdomäne aus sechzig Aminosäuren mit der Aminosäuresequenz [SEQ ID NO: 1] enthalten, und weiter umfassend die Nukleotidesequennz von SHOX ETG3 [SEQ ID NO: 2] und die Nukleotidsequenz von SHOX ET45 [SEQ ID NO: 4].

7. Nukleinsäuremolekül nach Ansprach 6, das für ein 150 bis 350 Aminosäuren langes Polypeptid mit einer N-terminalen und/oder C-terminalen Verlängerung der aus sechzig Aminosäuren bestehenden Homeoboxdomäne [SEQ ID NO: I] codiert.

8. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 4, das für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz [SEQ ID NO: 11] codiert.

9. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 5, das für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz [SEQ ID NO: 13] codiert.

10. Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1-9, wobei es sich bei dem Nukleinsäuremolekül um ein genomisches Nukleinsäuremolekül handelt.

11. Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1-9, wobei es sich bei dem Nukleinsäuremolekül um eine cDNA handelt.

12. Nukleinsäuremolekül nach Artspruch 11, umfassend die Nukleotidsequenz von SHOXa [SEQ ID NO: 10].

13. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 11, umfassend die Nukleotidsequenz von SHOXb [SEQ ID NO: 12].

14. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, bestehend aus der Teilnukleotidsequenz des SHOX-Gens [SEQ ID NO: 8].

15. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, bestehend aus der Nukleotidsequenz des SHOX- Gens [SEQ ID NO: 14].

16. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, die an ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 14 oder 15 unter den folgenden stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert: 0.5 M NaPi pH 7.2, 7% SDS und 1 mM EDTA bei 65ºC, mit anschließendem Waschen in 40 mM NaPi und 1% SDS bei 65ºC, mit der Maßgabe, daß die Sequenzen [SEQ ID NO: 17] (wie in M. Marra et al., EMBL Database Entry MMA59929 offenbart) und [SEQ ID NO: 18] (wie in M. Marra et al., EMBL Database Entry MM3349 offenbart) ausgeschlossen sind.

17. Polypeptid mit der Aminosäuresequenz [SEQ ID NO: 11].

18. Polypeptid mit der Aminosäuresequenz [SEQ ID NO: 13].

19. Expressionsvektor oder Plasmid, umlüssend ein Nukleinsäuremoleküle nach einem der Ansprüche 1-16.

20. Zelle, transformiert mit einem Expressionsvektor oder Plasmid nach Anspruch 19.

21. Transgenes oder knock-out, nicht menschliches Tier, transformiert mit einem Expressionsverktor oder Plasmid nach Anspruch 19.

22. Verfahren zur Identifizierung oder zum Screenen von Kandidaten für pharmazeutische Mittel, die für die Behandlung von Krankheiten, die mit dem Gen für Minderwuchs [SEQ ID NO: 8] oder [SEQ rn NO: 14] in Zusammenhang stehen, geeignet sind, umfassend das Bereitstellen einer transformierten Zelle nach Anspruch 20 und das Bestimmen von Variationen im Phänotyp dieser Zellen oder von Variationen in den Expressionsprodukten dieser Zellen nach Inkontaktbringen der Zellen mit den pharmazeutischen Mitteln.

23. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1-13 oder eines Nukleinsäuremolekuls, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die an ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 14 oder 15 unter den folgenden stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert: 0.5 M NaPi pH 7.2, 7% SDS und 1 mM EDTA bei 65ºC, mit anschließendem Waschen bei 40 mM NaPi und 1% SDS bei 65ºC, als Primer zur Herstellung eines Diagnosekits für die Identifizierung von Individuen mit einem vermuteten genetischen Defekt im SHOX-Gen [SEQ ID NO: 8] oder [SEQ ID NO: 14].

24. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1-13 oder eines Nukleinsäuremoleküls, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die an ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 14 oder 15 unter den folgenden stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert: 0.5 M NaPi pH 7.2, 7% SDS und 1 mM EDTA bei 65ºC, mit anschließendem Waschen in 40 mM NaPi und 1% SDS bei 65ºC, als Primer zur Analyse einer aus einem menschlichen Individuum isolierten biologischen Probe für die Identifizierung von Individuen mit einem vermuteten genetischen Defekt im SHOX-Gen [SEQ ID NO: 8] oder [SEQ ID NO: 14].

25. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1-13 oder eines Nukleinsäuremoleküls, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die an ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 14 oder 15 unter den folgenden stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert: 0.5 M NaPi pH 7.2, 7% SDS und 1 mM EDTA bei 65ºC, mit anschließendem Waschen in 40 mM NaPi und 1% SDS bei 65ºC, zur Bestimmung der Menge an Expressionsprodukt oder der Sequenz des menschlichen SHOX-Gens in einer aus einem menschlichen Individuum isolierten biologischen Probe für die Identifizierung von Individuen mit einem vermuteten genetischen Defekt im SHOX Gen, wobei das SHOX Gen die unter [SEQ ID No. 8] oder [SEQ ID No. 14] angegebene Nukleotidsequenz aufweist.

26. Verwendung nach Anspruch 23, 24 oder 25, wobei das Nukeinsäuremolekül aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:

GCA CAG CCA ACC ACC TAG;

TOG AAA GGC ATC ATC CGT AAG;

ATT TCC AAT GGA AAG GCG TAA ATA AC (SP1);

ACC GCT TTT GTA TCC AAG TCT TTT G (SP2);

GCC CTG TGC CCT CCG CTC CC (SP3);

GGC TCT TCA CAT CTC TCT CTG CTT C (SP4);

CCA CAC TGA CAC CTG CTC CCT TTG (SP5);

CCC GCA GGT CCA GGC TCA GCT G (SP6);

CGC CTC CGC CGT TAC CGT CCT TG (ASP1);

CCC TGG AGC CGG CGC GCA AAG (ASP2);

CCC CGC CCC CGC CCC CGG (ASP3);

CTT CAG GTC CCC CCA GTC CCG (ASP4);

CTA GGG ATC TTC AGA GGA AGA AAA AG (ASP5); and

GCT GCG CGG CGG GTC AGA GCC CCA G (ASP6).

27. Verfahren zur Bestimmung eines genetischen Defekts anhand von RNA- oder DNA-Molekülen in einer aus einem menschlichen Individuum mit einem vermuteten genetischen Defekt im SHOX-Gen isolierten biologischen Probe, wobei das SHOX-Gen die unter [SEQ ID No. 8] oder [SEQ ID No. 14] angegebene Nukleotidsequenz aufweist.

28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1-13 oder ein Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die an ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 14 oder 15 unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert, als Primer zur Bestimmung eines genetischen Defekts im SHOX-Gen [SEQ ID No. 8] oder [SEQ ID No. 14] verwendet wird, wobei die stringenten Hybridisierungsbedingungen wie folgt sind: 0.5 M NaPi pH 7.2, 7% SDS und 1 mM EDTA bei 65ºC mit anschließendem Waschen in 40 mM NaPi und 1% SDS bei 65ºC.