CZ96699A3 - Isolovaná lidská molekula nukleové kyseliny kodující polypeptidy, růstový protein a jeho použití a způsob - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká izolace, identifikace a charakterizace nově identifikovaných lidských genů, které odpovídají za vady lidského růstu, zvláště za malou výšku postavy nebo Turnérův syndrom. Dále se vynález týká diagnózy a terapie takových vad. Izolovaná genomová DNA nebo její fragmenty se mohou použít pro farmaceutické účely nebo jako diagnostické nástroje nebo činidla pro identifikaci nebo charakterizaci genetických defektů, které se podílejí na uvedených vadách. Vynález dále popisuje lidské růstové proteiny (transkripční faktory A, B a C) , které se exprimují po transkripci uvedené DNA na RNA nebo mRNA a které se mohou použít při terapii vad spojených s mutacemi v uvedených genech. Dále se popisují vhodné sekvence cDNA, které se mohou použít při přípravě rekombinantních proteinů vhodných pro léčbu takových vad. Předmětem vynálezu jsou dále plazmidové vektory vhodné pro expresi DNA těchto genů a vhodné buňky, které obsahují takovou DNA. Dále se popisují metody genetické léčby uvedených vad v oboru molekulární medicíny za použití expresivního plazmidu připraveného inkorporací DNA dównstream expresivního promotoru, který umožňuje expresi v savčí hostitelské buňce.

Dosavadní stav techniky

Růst je základní aspekt vývoje organizmu. Je regulovaný vysoce organizovaným a komplexním systémem. Výška postavy je multifaktorový rys, který je ovlivněn faktory prostředí a genetickými faktory. Vývojové malformace, které zahrnují výšku postavy, jsou běžným jevem u lidí všech ras. V případě lidí je četnost výskytu 3 ze 100 a retardace růstu vede k malé • · · · · • · · · • · · · · · • · · · · · • · velikosti postavy, za což ve většině případů odpovídají vrozené vady.

Turnérův syndorm je běžná ohromo zoinální vada (Rosenfeld RG, Tesch L-G, Rodriguez-Rigau LJ, McCauley E, Albertsson-Wikland K, Asch R, Cara J, Conte F, Halí JG, Lippe B, Nagel TC, Neely EK, Page DC, Ranke M, Saenger P, Watkins JM, Wilson DM (1994): Recommendations for diagnosis, treatment, and management of individuals with Turner syndrom. The Endocrinologist 4(5) : 351-358) s četností výskytu 1:2 500 u živě narozených žen. Odhaduje se, že 1 až 2 % oplodnění u lidí má karyotyp 45,X a že až 99 % takových plodů nepřichází na svět v termínu (Halí J.G., Gilchrist D.M. (1990): Turner syndrome and its variants. Pedriatr. Clin. North Am. 37: obinson A (1990): Demography and prevalence of Turner syndrome. In: Turner Syndrome., edited by Rosenfield R.G., Grumbach M.M., pp. 93 - 100, New York, Marcel Dekker). U lidí s Turnérovým syndromem (nebo s UllrichTurnerovým syndromem) existuje podstatná klinická variabilita fenotypu (Ullrich, 1930; Turner, 1938). Malá výška postavy je konsistentní nález a spolu s gonádovou dysgenezí se považuje za vedoucí symptom uvedených vad. Turnerový syndrom je skutečná multifaktorová vada. Uvažuje se, že za embryonální letalitu, malou výšku postavy, gonodovou dysgenezi a charakteristické somatické rysy odpovídají monosomy genů, které jsou běžné u X a Y chromozomů. Ukazuje se, že pro normální vývoj člověka jsou nutné diploidy těchto homologních genů X-Y. Očekává se, že Turnérovy geny (nebo anti-Turnerovy geny) se u žen exprimují jak z aktivního tak z neaktivního chromozomu X nebo chromozomu Y, aby se zajistila správná dávka genového produktu. Haplo-nedostatečnost (nedostatečnost způsobená pouze jednou aktivní kopií) naznačuje mechanizmus vedoucí k onemocnění.

Dosud se objasnila řada mechanizmů, které vedou k malé výšce postavy. Nedostatečnost růstového hormonu a receptorů růstového hormonu, stejně jako vady skeletu se popisují jako • · · · · · · · · · ···· · ··· · ·· · • · · · · · ···· · ··· ··· ······ · · • · · · · ·· · ·· ·· příklady fenotypu s malou výškou postavy (Martial et al.,(1979; Phillips et al., 1981; Leung et al., 1987; Goddard et al., 1995). Identifikovaly se mutace ve třech genech, které kódují receptor lidského fibroblastového růstového faktoru (FGFR 1-3) a způsobují řadu vad skeletu. Tyto vady zahrnují většinu forem trpasličího vzrůstu, achondroplázie (Shiang et al. , 1994; Rousseau et al., 1994; Muenke and Schell, 1995) . Dobře známá a častá chromozomální vada ( objevuje se u jedné z 2 500 žen) Turnérův syndrom (45,X) je také spojena s malou výškou postavy. Všechny tyto důvody však odpovídají pouze za malou část pacientů s malou výškou postavy. Většina případů zatím zůstává nevysvětlena.

Věří se, že chromozomy X a Y nesou geny, které ovlivňují výšku postavy (Ogata T, Tyler-Smith C, Purvis-Smith S, Turner G. (1993): Chromosomal localisation of a gene(s) for Turner stigmata on Yp. J. Med. Genet. 30: 918-922). To se může u pacientů s abnormalitami pohlavních chromozomů odvodit ze vztahu genotyp-fenotyp. Cytogenetické studie dokazují, že delece konců krátkých ramen buď chromozomu X nebo Y vedou u některých jedinců k malé výšce postavy (Zuffardi et al., 1982); Curry et al., 1984). Uvádí se více než 20 uspořádání chromozomu, které se spojují s delecemi konců chromozomu Xp a Yp a které nesou gen(y) odpovědné za malou výšku postavy, s pseudoautozornálni oblastí (PARI) (Ballabio A., Bardoni A., Carrozzo R., Andria G., Bick D., Campbell L., Hamel B., Ferguson-Smith M.A., Gimelli G., Fraccaro M., Maraschio P., Zuffardi O., Guilo S., Camerino G., (1989): Contiguous gene syndromes due to deletions in the distal short arm of the arm of the human X chromosome . Proč. Nati. Acad. Sci USA 86: 10001-10005.; Schaefer L., Ferrero G.B., Grillo A., Bassi M.T. Roth E.J. Wapenaar M.C., Van Ommen -J.B., Mohandas T.K., Rocchi M., Zoghbi H.Y. Ballabio A. (1993): A high resolution deletion map of human chromosome Xp22. Nátuře genetics 4: 272279). Pozice těchto genů se zúžila na distální DNA o velikosti i

• · ·

700 kb oblasti PARI, kterou lemuje markér DXYS15 (Ogata T., Goodfellow P., Petit C., Aya M., Matsuo N. (1992): Short stature in a girl with a terminál Xp deletion distal to DXYS15: localization of a growth gene(s) in the pseudoautosomal region. J. Med. Genet. 29: 455-459; Ogata T.,

Yoshizawa A., Muroya K., Matsuo N., Fukushima Y., Rappold G.A., Yokoya S. (1995): Short stature in a girl with partial monosomy of the pseudoautosomal region distal to DXYS15: further evidence for the assignment of the critical region for a pseudoautosomal growth gene(s). J. Med. Genet. 32: 831-834;

Ogata T., Matsuo N. (1995): Turner syndrome and female sex chromosome aberrations: deduction of the principle factors involved in the development of clinical features. Hum. Genet. 95: 607-629) .

Regulace růstu u savců je organizována jako komplexní systém. Je možné, že vysoce organizovaným způsobem spolu reaguje více genů (proteinů), které podporují růst. Jeden z těchto genů, který odpovídá za výšku postavy, se zmapoval až do pseudoautozomální oblasti PARI (Ballabio A., Bardoni A., Carrozzo R., Andria G., Bick D., Campbell L., Hamel B., Ferguson-Smith M.A., Gimelli G., Fraccaro M., Maraschio P., Zuffardi O., Guilo S., Camerino G., (1989): Contiguous gene syndromes due to deletions in the distal short arm of the arm of the human X chromosome . Proč. Nati. Acad. Sci USA 86: 10001-10005) , což je oblast, o které se ví, že je volně zaměnitelná mezi chromozomy X a Y (Rappold G.A. (1993) : The pseudoautosomal region of the human sex chromosomes. Hum. Genet. 92: 315-324). Celá oblast RAPI je přibližně 2 700 kb velká.

U pacientů s delecí se definovala kritická oblast ovlivňující výšku postavy. K malé výšce postavy dochází v případě, když se deletuje celá oblast o velikosti 700 kb nebo když je specifický gen v této kritické oblasti přítomen v haploidním stavu nebo když je přerušen nebo mutován (jako je případ

*· ·· · · · ·· • · « · · · · · ··· · ··· · · · · • · · · · ···· · ··· ··· • · · · · · · ·· ·· · '♦· «· idiotypické malé výšky postavy nebo Turnérův syndrom). Frekvence výskytu Turnérova syndromu ve světě je jedna z 2 500 žen; četnost výskytu tohoto druhu idiopatické malé výšky postavy se odhaduje na 1 případ ze 4 000 až 5 000 osob. Ženám s Turnérovým syndromem a některým jednotlivcům s malou výškou postavy se obvykle po několik let až po několik desítek let aplikuje růstový hormon (GH) , ačkoli je známo, že jejich hladina růstového hormonu v těle je normální a nedostatečnost GH zde není problémem. Léčba takových pacientů je velmi nákladná (odhaduje se přibližně na 30 000 USD ročně). Proto je nutné získat způsob rozlišení pacientů malého vzrůstu, kteří mají genetický defekt a pacienti, kteří nevykazují genetický defekt uvedeného genu. U pacientů s genetickým defektem tohoto genu - buď s úplnou delecí genu (jako je v případě Turnérova syndromu) nebo s bodovou mutací (jako je tomu u idiopatické malé výšky postavy)- je možné aplikovat alternativní léčbu bez lidského růstového hormonu.

Korelace genotyp/fenotyp podporují existenci růstového genu v proximální části Yq a v distální části Yp. Malá výška postavy se také objevuje u jedinců s terminálními delecemi Xp. Proběhlo rozsáhlé vyhledávání pacientů s částečnými monosomiemi pseudoautozomální oblasti. Na základě korelací genotyp-fenotyp se stanovila minimální běžná delece oblasti DNA o velikosti 700 kb (Ogata T., Matsuo N. (1995): Turner syndrome and female sex chromosome aberrations: deduction of the principle factors involved in the development of clinical features. Hum. Genet. 95: 607-629; Ogata T., Goodfellow P.,

Petit C., Aya M., Matsuo N. (1992) : Short stature in a girl with a terminál Xp deletion distal to DXYS15: localization of a growth gene(s) in the pseudoautosomal region. J. Med. Genet. 29: 455-459; Ogata T., Yoshizawa A., Muroya K., Matsuo N.,

Fukushima Y., Rappold G.A., Yokoya S. (1995): Short stature in a girl with partial monosomy of the pseudoautosomal region distal to DXYS15: further evidence for the assignment of the • 4 4 4 4 4 4 4 4 4

494 «49 9944

9444 4 994 9 49 · • 9 444 4 4444 4 444 444 • 44444 4 4

44444 44 4 44 44 critical region for a pseudoautosomal growth gene(s). J. Med. Genet. 32: 831-834). Zjistilo se, že uvedená oblast leží mezi genetickými markéry DXYS20 (3cosPP) a DXYS15 (113D) a u všech genů, které aspirují na řízení růstu, a leží v oblasti PARI (například receptor hemopoietického růstového faktoru; CSF2RA) (Gough N.M., Gearing D.P., Nicola N.A., Baker E., Pritchard

M. , Callen D.F., Sutherland G.R. (1990). Localization of the human GM-CSF receptor gene to the X-Aby pseudoautosomal region. Nátuře 345: 734736), se odstranily na základě jejich fyzikální pozice (Rappold G. A., Wilson T.A., Henke A., Gough

N. M. (1992): Arrangment and localization of the human GM-CSF receptor achain gene CSF2RA within the X-Aby pseudoautosomal region. Genomics 14: 455-461). Geny se nacházely v deleční oblasti o velikosti 700 kb PARI oblasti o velikosti 2 700 kb. Nedávno se objevily u jednotlivců s malým vzrůstem delece pseudoautozomální oblasti (PARI) pohlavních chromozomů a následně se také definovala minimální běžná oblast delece o velikosti 700 kb. Na základě analýzy DNA Southernovým přenosem u pacientů TIK a SS za použití odlišných pseudoautozomální ch markérů se identifikovala Xp terminální delece přibližně 700 kb od DXYS15 (113D) (Ogata T., Matsuo N. (1995): Turner syndrome and female sex chromosome aberrations: deduction of the principle factors involved in the development of clinical features. Hum. Genet. 95: 607-629; Ogata T., Goodfellow P.,

Petit C., Aya M., Matsuo N. (1992) : Short stature in a girl with a terminál Xp deletion distal to DXYS15: localization of a growth gene(s) in the pseudoautosomal region. J. Med. Genet. 29: 455-459; Ogata T., Yoshizawa A., Muroya K., Matsuo N.,

Fukushima Y., Rappold G.A., Yokoya S. (1995): Short stature in a girl with partial monosomy of the pseudoautosomal region distal to DXYS15: further evidence for the assignment of the critical region for a pseudoautosomal growth gene(s). J. Med. Genet. 32: 831-834) .

·

• 4 · ·>·

Podstata vynálezu

Oblast genu odpovídající za malý vzrůst postavy se identifikovala jako oblast o velikosti přibližně 500 kb , s výhodou o velikosti přibližně 170 kb v PARI oblasti chromozomů X a Y. V této oblasti se identifikovaly tři geny jako kandidáti, kteří odpovídají za malý vzrůst. Tyto geny se označily SHOX (také jako SHOX93 nebo HOX93) (SHOX znamená gen obsahující homeobox malého vzrůstu), pET92 a SHOT (gen nesoucí homeobox podobný SHOX na chromozomu 3) . Zvláště významný je gen SHOX, který má dvě oddělená místa sestřihu, což vede ke vzniku dvou variací (SHOXa a b) . Během předchozích výzkumů se analyzovala podstatná část nukleotidové sekvence genu malého vzrůstu (SEQ ID NO: 8) . Mohou se předpovědět a identifikovat exony nebo jejich části (například exon I [G310]/ exon II [ET93]; exon IV [G108]; pET92) . Získané informace o sekvenci se pak mohou použít pro navržení vhodných primerů nebo nukleotidových sond, které hybridizují s částmi genu SHOX nebo jeho fragmenty. Gen SHOX se pak může izolovat běžnými metodami. Na základě další analýzy sekvence DNA genů zodpovědných za malý vzrůst se izoluje nukleotidová sekvence exonu I až V (uvedeno na obrázku č. 1 až 2). Gen SHOX obsahuje homeobox (SEQ ID NO: 1) o velikosti přibližně 180 bp (obrázek č. 2 a obrázek č. 3). Začíná nukleotidem, který kóduje aminokyselinu v pozici 117 (Q) , končí nukleotidem kódujícím aminokyselinu v pozici 176 (E) , to znamená od CAG(440) do GAG(619). U pacientů z Německa (AI) s malou výškou postavy a u pacientů Japonska, kde se testovalo 250 jednotlivců s idiopatickým malým vzrůstem, se identifikoval homeobox jako sekvence homeobox-pET93(SHOX) a zjistily se dvě bodové mutace. Obě bodové mutace se našly ve stejné pozici a vedou ke zkrácení proteinu v pozici aminokyseliny 195. To naznačuje, že zde může existovat tzv. horké místo. Na základě skutečnosti, že obě mutace, které vedou ke zkrácení proteinu, se vyskytují • · •9 ·9 · « 9 9 9 9 · · ·

999 9 99« · 99 · • 99* 9 999· 9 999 999

9 9 9 9 · · • 99 9-9 9 9« 99 ve stejné pozici, je pravděpodobné, že putativní horké místo rekombinace existuje v exonu 4(G108). Primery specifické pro exon jsou například GCA CAG CCA ACC ACC TAG (forward) nebo TGG AAA GGC ATG ATC CGT AAG (reverzní) . Shora uvedený nový gen obsahující homeobox, SHOX, který se nachází v intervalu 170 kb, je alternativně sestřižen a dává vznik dvěma proteinům s odlišnými funkcemi. Při demonstraci skutečnosti, že malá výška postavy je způsobena mutacemi v SHOX, se použila analýza mutace a sekvenování DNA.

Identifikace a klonování kritické oblasti malého vzrůstu podle vynálezu se uskutečnila následujícím způsobem. U 15 jednotlivců s částečnými monosomy v pseudoautozomální oblasti (PARI) se provedla rozsáhlá fyzikální mapovací studie. Korelací výšky těchto jedinců s delečními body se definovala kritická oblast malého vzrůstu (SS) o přibližné velikosti 700 kb. Tato oblast se následně klonovala jako překrývající se kosmidový kontig za použiti kvasinkových umělých chromozomů (YAC) z PARI (Ried K., Mertz A., Nagaraja R., Trusnich M., Riley J., Anand R., Page D., Lehrach H., Elloiso J., Rappold G.A. (1995): Characterization of a yeast artificial chromosome conting spanning the pseudoautosomal region. Genomics 29: 787792) a pomocí metody „chodícího kosmidu (cosmid walking). Za účelem vyhledání genů odpovědných za SS v tomto intervalu se na přibližně 600 kb velkou oblast mezi distálním koncem kosmidu 56G10 a proximálním koncem 51D11 aplikovala řada metod. Za použití selekce cDNA, trapování exonu a CpG klonování se identifikovaly dva nové geny.

Pozice kritického intervalu malého vzrůstu se zúžila na menší interval DNA o velikosti 170 kb tím, že se charakterizovaly ' tři další jedinci (GA, AT a RY) , kteří vykazují malý vzrůst postavy. Za účelem přesného stanovení pozice bodu přerušení u těchto jedinců se provedla na chromozomech v metafázi za použití kosmidu vhodných pro kontig fluorescenční hybridizace in šitu (FISH). Pacient GA, který vykazuje terminální deleci a • · • · · 9 9 9 9 9 · ·

9 9 9 9 9 9 9 · · · 9 • 9 · · · 9 9999 9 999 999

99999* 9 9

99999 99 9 99 99 normální výšku vzrůstu, definuje distální hranici kritické oblasti (bod přerušení se nachází na kosmidu 110E3) a pacient AT vykazující inverzi X chromozomu a normální výšku vzrůstu definoval proximální hranici (bod přerušení se nachází na kosmidu 34F5). Bod přerušení chromozomu Y u pacienta RY, který vykazuje terminální deleci a malý vzrůst, se také nachází na kosmidu 34F5, což naznačuje, že tato oblast obsahuje sekvence s predispozicí k přestavění chromozomů.

Celá oblast ohraničená Xp/Yp se klonovala jako sada přesahujících kosmidu. Ke studiu šesti pacientů s přestavěným chromozomem X, kdy tři z nich jsou normálního vzrůstu a tři mají malou výšku vzrůstu, se použila fluorescenční hybridizace in šitu (FISH) s kosmidy s této oblasti. Korelace genotypufenotypu zúžily kritický interval pro malý vzrůst na 270 kb DNA nebo na dokonce menší interval, jako je 170 kb, který obsahuje gen nebo geny důležité pro růst člověka. Tento interval pokrývá minimálně šest až osm kosmidu a jsou nyní dostupné pro hybridizaci FISH interfáze a metafáze, která je dostupný nástroj pro diagnózu pacientů s idiopatickým malým vzrůstem postavy.

Skutečnost, že cílový gen vede k vadám růstu u lidí (např. oblast malého vzrůstu), nebyla dříve známa. Biologická a klinická asociace pacientů s uvedenou deleci vysvětluje funkci uvedeného genu. V této studii se použila fluorescenční in šitu hybridizace (FISH) za účelem testování metafáze a interfáze jádra lymfocytu u šesti pacientů. Cílem bylo testovat u všech přesahujících kosmidů jejich použitelnost jako sondy pro FISH hybridizaci a stanovit oblasti porušení genu u všech čtyř případů, a tímto způsobem stanovit minimální kritickou oblast genu malého vzrůstu.

Duplikace nebo delece genomové DNA se může uskutečnit kvantitativní PCR nebo odhadem dávky na Southernových blotech nebo použitím RFLP.

·4 444 44 44

444 4 4 4 4444

4444 4 4 4 4 4 4« 4 4 4 444 444444 444 444 • 44444 · 4

44444 44 4 «4 44

Zvláště vhodnou metodou pro přesné rozlišení mezi jednou a zdvojenou dávkou markérů je hybridizace FISH, přičemž její klinická aplikace je v současnosti rutinní záležitostí. Zatímco při FISH hybridizaci interfáze se může zhodnotit absence nebo přítomnost molekulového markéru, hybridizace FISH metafáze chromozomů může poskytnout semi-kvantitativní stanovení delecí uvnitř kosmidu. Uvedeným způsobem se může stanovit delece o velikosti přibližně 10 kb (což odpovídá 25 % redukci signálu). Zvláště je důležité, že prakticky všechny geny onemocnění na lidském X chromosomu jsou spojeny s menšími a většími delecemi v rozmezí od několika kilobazí do několika megabazí DNA (Nelson, D.L., Ballabio A., Cremers F., Monaco A.P., Schlessinger D., (1995). -Report of the sixth international workshop on the X chromosome mapping. Cytogenet. Cell Genet. 71: 308-342).

Vynález dále popisuje sekvence DNA nebo jejich fragmenty, které jsou části genů odpovědných za lidský růst (nebo v případě defektu v těchto genech odpovídají za malý vzrůst). Identifikovaly se tři geny odpovědné za lidský růst. Jsou to SHOX, pET92 a SHOT) . Sekvence DNA nebo fragmenty těchto genů stejně jako sekvence DNA těchto genů v plné délce se mohou transformovat do vhodného vektoru a mohou se dále transfekovat do buněk. Když se takové vektory zavedou do buněk vhodným způsobem, jako jsou přítomny u zdravých jedinců, je možné uvedeným způsobem léčit onemocnění spojené s malým vzrůstem, to znamená například Turnérův syndrom. Onemocnění spojené s malým vzrůstem se může léčit odstraněním nebo mutací růstových genů odpovědných za malý vzrůst. Je také možné stimulovat geny, které kompenzují působení genů odpovědných za malou výšku postavy, to znamená inzercí sekvencí DNA před, za nebo do růstových genů/genů odpovídajících za malou výšku za účelem zvýšit expresi zdravých alel. Uvedenými modifikacemi genů se růstové geny/geny odpovídajících za malou výšku aktivují nebo deaktivují. To se může uskutečnit inzercí • 44 ··· 4« • •4 4*4 « 4 4 4

4444 · 444 4 44 4 44 444 4 4*44 · 444 444

4444 4 4 · 4

4 4 4 4 44 4 44 44 sekvencí DNA do vhodných míst, které jsou v genu nebo blízko genu umístěny tak, že tyto inzerované sekvence DNA interferují s růstovými geny/geny odpovídajícími za malou výšku a tak aktivují nebo brání jejich transkripci. Je také možné před růstové geny začlenit regulační element (například promotorovou sekvenci), aby se geny stimulovaly a staly se aktivní. Dále je možné stimulovat promotorovou sekvenci za účelem nadměrné exprese - v případě Turnérova syndromusprávně fungujících alel a tak kompenzovat chybějící alely. Modifikace genů se může obecně dosáhnout inzercí exogenních sekvencí DNA do růstového genu/genu odpovídajícího za malý vzrůst prostřednictvím homologní rekombinace.

Sekvence DNA podle vynálezu se mohou také použít k transformaci uvedených sekvencí do zvířat, jako jsou savci, prostřednictvím vhodného vektorového systému. Tyto transgenni zvířata se pak mohou použít pro zkoumání in vivo při testování a identifikaci farmaceutických činidel, která jsou použitelná při léčbě onemocnění spojených s malým vzrůstem. Jestliže zvířata pozitivně reagují na aplikaci sloučeniny nebo činidla, pak uvedené činidlo nebo sloučenina nebo jejich deriváty jsou vhodná jako farmaceutická činidla. Sekvence DNA podle vynálezu se mohou také využívat v genetických experimentech za účelem nalezení způsobů, jak kompenzovat ztráty genů odpovědných za malý vzrůst postavy.

Dále vynález popisuje sekvence DNA, které se mohou využít při transformaci buněk. Tyto buňky se mohou použít k identifikaci farmaceutických činidel, jenž se mohou použít při léčbě onemocnění spojených s malou výškou postavy nebo k testování takových látek nebo knihovny látek. Ve vhodném testovacím systému se mohou identifikovat změny fenotypu nebo změny expresivního paternu těchto buněk, což umožňuje identifikaci činidla vhodného pro přípravu léků.

Sekvence DNA podle vynálezu se také mohou použít při tvorbě vhodných primerů, které za přísných podmínek hybridizují se

		• 00 * · · • 000	0 0 0 0 · · 9 0 » ·	• 9 «9 9 0 0 0 0 0 0 0
12		0 0» 00· 00	0 · 0 9 9 ·	9 9 0 · · ·
segmenty genů odpovídajících za	malý	vzrůst	nebo s	jejich
fragmenty. Mohou se konstruovat vhodné	sekvence	primerů,	které
se používají při diagnóze lidí,	které	mají genetický	defekt

způsobující malý vzrůst. Proto je nutné poznamenat, že dvě mutace nalezené v identické pozici naznačují, že existuje mutační horké místo.

Sekvence DNA podle vynálezu zahrnují i takové sekvence, které se degenerovaly na specifické sekvence na základě degenerace genetického kódu nebo které hybridizují za přísných podmínek se specificky danými sekvencemi.

Vynález zdůrazňuje zvláště následující rysy:

a) Molekulu izolované nukleotidové kyseliny kódující polypeptidy obsahující oblast homeoboxu šedesáti amininokyselin, které mají aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1 a vykazují regulující aktivitu lidského růstu.

b) Molekulu izolované DNA obsahující nukleotidovou sekvenci, jak je uvedeno na obrázku č. 2, 3 nebo 4 a zvláště, jak je uvedeno V SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12 nebo SEQ ID NO: 15.

c) Molekuly DNA jsou schopny hybridizovat s molekulami DNA popsanými v odst. b).

d) Molekuly DNA podle odstavce c) jsou schopny hybridizovat s molekulami DNA podle odst. 2 při teplotě 60 °C až 70 °C a v přítomnosti roztoku standardního pufru.

e) Molekuly DNA obsahují nukleotidové sekvence, které vykazují % nebo vyšší homologii s nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12 nebo SEQ ID NO: 15 a kódují polypeptid, který má regulační aktivitu lidského růstu.

f) Lidské růstové proteiny mají aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 11, 13 nebo 16 nebo jejich funkční fragment.

g) Protilátky získané při imunizaci zvířat lidskými růstovými proteiny podle odst. f) nebo jejich antigenní varianty.

h) Farmaceutické kompozice obsahující lidské růstové proteiny nebo jejich funkční fragmenty pro léčbu vad způsobených genetickými mutacemi lidského růstového genu.

* φ φφφ φ φφφφ • φ

ΦΦ 4

Φ Φ Φ • Φ Φ

ΦΦΦ 4

Způsob testování látky účinné při léčbě vad zmiňovaných shora v textu podle odst. h) zahrnující detekci mediátorové RNA hybridizující s libovolnými molekulami DNA popsanými v odstavcích a) až e) , přičemž se měří zesílení exprese molekuly DNA jako odezvy na léčbu hostitelské buňky substancí. Expresivní vektor nebo plazmid obsahující libovolné molekuly nukleové kyseliny popsané v odstavcích a) až e) , které umožňují, aby molekuly DNA se exprimovaly v savčích buňkách.

k) Způsob stanovení genu nebo genů v biologických vzorcích tkání nebo tělních tekutin odpovědných za malý vzrůst.

V případě metody popsané shora v textu v odstavci k) se pro detekci specifických nukleotidových sekvencí s výhodou používají nukleotidové amplifikační metody PCR, které jsou dobře známy v oboru a popisují se například v publikacích Mullis et al., 1986, Cold Spring Harbor Symposium Quant. Biol. 51, 263-273 a Saiki et al., Science 239, 487-491. Stanovené nukleotidové sekvence odpovídající za malý vzrůst jsou hlavně ty, které jsou reprezentovány sekvencemi SEQ ID NO: 2 až SEQ ID NO: 7.

V principu všechny oligonukleotidové primery a sondy vhodné pro amplifikaci a detekci genetického defektu, který odpovídá za poškození lidského růstu v biologických vzorcích, jsou vhodné pro amplifikaci cílové sekvence spojované s malým vzrůstem. V tabulce č. 1 jsou uvedeny vhodný pár primerů specifický pro exon podle vynálezu. Následuje vhodná detekce, přičemž se například provádí radioaktivní nebo jiné značení.

Tabulka č. 1

exon	Sense	Antisense	Produkt	Ta (°C)
	primer	primer	(bp)

44

4 4

444 4 4

4 4 4 4

4 4 4 4

44 »4 4

44

4 4 4

4 4 4

444 444

4

5'-I(G310)	SPI	ASP1	194	58
3'-I(G310)	SP2	ASP2	295	58
II (ET93)	SP3	ASP3	262	76/72/68
III (ET45)	SP4	ASP4	120	65
IV(GI08)	SP5	ASP5	154	62
Va (SHOXa)	SP6	ASP6	265	61

Vysvětlení zkratek u primerů:

SP 1: ATTTCCAATGGAAAGGCGTAAATAAC

SP 2: ACGGCTTTTGTATCCAAGTCTTTTG

SP 3: GCCCTGTGCCCTCCGCTCCC

SP 4: GGCTCTTCACATCTCTCTCTGCTTC

SP 5: CCACACATGACACCTGCTCCCTTTG

SP 6: CCCGCAGGTCCAGGCTAGCTG

ASP1: CGCCTCCGCCGTTACCGTCCTTG

ASP2 ; CCCTGGAGCCGGCGCGCAAAG

ASP3: CCCCGCCCCCGCCCCCGG

ASP4; CTTCAGGTCCCCCCAGTCCCG

ASP5: CTAGGGATCTTCAGAGGAAGAAATVkG

ASP6: GCTGCGCGGCGGGTCAGAGCCCCAG

Jako targetová DNA může také sloužit jednořetězcová RNA. Metody zpětné transkribce RNA na cDNA jsou dobře známy v oboru a popisuje je Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory 1989. V jiném případě preferované metody reverzní transkripce využívají termostabilní DNA polymerázy, které vykazují RT aktivitu.

Shora popsaná metoda se může použít při selekci těch osob ze skupiny lidí, jejichž malý vzrůst postavy se spojuje s genetickým defektem, což umožňuje specifičtější léčbu.

Vynález dále popisuje transkripční faktory A, B a C, které se mohou použít jako farmaceutická činidla. Tyto transkripční faktory inicijují stále neznámou kaskádu biologických účinků na molekulární úrovni, které se spojují s lidským růstem. Tyto *

999 9 999 9 99 9

999 9 9999 · 999 999

9 9 9 9 9 9

9* 99 9 99 99 proteiny nebo jejich funkční fragmenty mají mitogenní účinek na různé buňky. Zvláště mají osteogenní účinek. Mohou se použít při léčbě onemocnění kostí, jako je například osteoporéza, a zvláště všech onemocnění spojených s poškozením regulace vápníku v kostech.

Termín „izolovaný'' znamená původní derivaci molekuly DNA klonováním. Vynález se týká jak přirozeně se vyskytujících sekvencí tak i synteticky připravených.

Molekuly DNA podle vynálezu se mohou použít ve formách genové terapie, která zahrnuje použití expresivních plazmidů připravených inkorporací vhodné sekvence DNA podle vynálezu downstream od expresivního promotoru, který ovlivňuje expresi v savčí hostitelské buňce. Vhodné hostitelské buňky jsou prokaryontní a eukaryontní buňky. Prokaryontní hostitelské buňky jsou například E. coli, Bacillus subtilis a podobně. Prostřednictvím transfekce hostitelských buněk replikony, které pocházejí z druhů adaptovatelných na hostitele, to jsou plazmidové vektory obsahující počáteční bod replikace a regulační sekvence, se mohou uvedené hostitelské buňky transfekovat požadovaným genem nebo cDNA. Takové vektory jsou s výhodou ty, které mají sekvenci, jenž vybaví transfekované buňky vlastnostmi (fenotypem), na jejichž základě se mohou selektovat. V typickém případě se používají jako hostitelé bakterie E. coli kmen K12a, z vektorů se používá buď pBR322 nebo plazmidy pUC. Příklady vhodných promotorů v případě hostitelů E. coli jsou promotor trp, lac promotor nebo lpp promotor. Jestliže je to nutné, sekrece expresivního produktu skrz buněčnou membránu se může ovlivnit spojením sekvence DNA kódující sekvenci signálního peptidu s 5'upstream částí genu. Eukaryontní hostitelské buňky zahrnují buňky získané z obratlovců nebo kvasinek, atd. Jako hostitelské buňky obratlovců se mohou použít buňky COS (Cell, 1981, 23: 175-182) nebo buňky CHO. Aby došlo k expresi mohou se s výhodou použít promotory, které jsou umístěny 5'upstream genu a mají místa

I 9 9 9 > · · · •99 999 sestřihu RNA, polyadenylační a transkripční terminační sekvence.

Při léčbě vad způsobených mutacemi lidských růstových genů se mohou použít jako činidla podporující růst transkripční faktory A, B a C podle vynálezu. Na základě polymorfizmu, který je znám u eukaryontních genů, se může substituovat jedna nebo více aminokyselin. Jedna nebo více aminokyselin v polypeptidech může být deletována nebo začleněna do jednoho nebo více míst aminokyselinové sekvence polypeptidů SEQ ID NO: 11, 13 nebo 16. Takové polypeptidy jsou nazývány ekvivalentní polypeptidy, pokud vykazují biologickou aktivitu nemodifikovaného polypeptidů, jenž zůstává v podstatě beze změn.

Přehled obrázků na výkrese

Na obrázku č. 1 je zobrazena genetická mapa genu SHOX, který zahrnuje pět exonů, které se označily následujícím způsobem: exon I: G310; exon 2: ET93; exon III: ET45; exon IV: G108; a exony Va a Vb, přičemž exony Va a Vb vedou ke vzniku dvou různých míst sestřihu genu SHOX. Exon II a III obsahuje homeobox o velikosti 180 nukleotidů.

Na obrázcích č. 2 a 3 jsou nukleotidy a předpovězené aminokyselinové sekvence SHOXa a SHOXb.

SHOXa: Předpovězený začátek translace začíná nukleotidem 92, první v rámci je stop kodon (TGA) - nukleotidy 968 - 970, přičemž vzniká otevřený čtecí rámec o velikosti 876 bp, který kóduje předpovězený protein tvořený 292 aminokyselinami (označený jako transkripční faktor A nebo protein SHOX). V rámci je 5'stop kodon v pozici nukleotidu 4, počáteční kodon a předpovězený terminační stop kodon znázorněný tučným písmem. Homeobox je ohraničen boxem (začínající aminokyselinou v pozici 117 (Q) až 176 (E), to v nukleotidové sekvenci odpovídá CAG až GAG) . Pozice intronů je označená šipkami. Dva

99 99 9 99

9 9 9 9 9 9

9999 9 999 9 99 9

999 9 9999 9 999 999

999999 9 9

99999 99 9 99 99 putativní polyadenylační signály v 3' nepřekládané oblasti jsou podtrženy.

SHOXb: Otevřený čtecí rámec o velikosti 876 bp se nachází od A v prvním metioninu nukleotidu 92 do terminačního kodonu v rámci v pozici 767 - 769, což tvoří otevřený čtecí rámec o velikosti 675 bp, který kóduje předpovězený protein o velikosti 225 aminokyselin (transkripčni faktor B nebo protein SHOXb). Pozice intronů jsou označeny šipkami. Exony I až IV jsou identické s SHOXa, exon V je specifický pro SHOXb. Putativní polyadenylační signál v 3' nepřekládané oblasti je podtržen.

Na obrázku č. 4 je nukleotidová sekvence a předpovězená aminokyselinová sekvence SHOT. Předpovězený počátek translace začíná v pozici nukleotidu 43, první v rámci je terminační kodon (TGA) - pozice nukleotidů 613 - 615, přičemž vzniká otevřený čtecí rámec o velikosti 573 bp, který kóduje předpovězený protein tvořený 190 aminokyselinami (označený jako transkripčni faktor C nebo protein SHOT). Homeobox je ohraničen boxem (začínající aminokyselinou v pozici 11(Q) až 70 (E), to v nukleotidové sekvenci odpovídá CAG až GAG).

Pozice intronů je označená šipkami. Dva putativní polyadenylační signály v 3' nepřekládané oblasti jsou podtrženy.

Na obrázku č. 5 je uvedena organizace exon/intron lidského genu SHOX a pozice v nukleotidové sekvenci.

Popis sekvencí SEQ ID:

SEQ ID NO. 1: překládaná aminokyselinová sekvence oblasti

homeoboxu	(180	' bp)
SEQ	ID	NO.	2:	exon	II (ET93)	genu	SHOX
SEQ	ID	NO.	3:	exon	I (G310)	genu ;	SHOX
SEQ	ID	NO.	4 :	exon	III (ET45)	genu	SHOX
SEQ	ID	NO.	5:	exon	IV (G108)	genu	SHOX
SEQ	ID	NO.	6:	exon	Va genu SHOX

«9 9* 9 99 ·· • •9 9 9 · 9999

9999 9 999 9 99 9

9 « 9 9 9999 9 999 99«

9 9 9 · 9 * 9 «99 9« 9« 9 9« «9

SEQ ID NO.	7: exon Vb genu SHOX
SEQ	ID	NO.	8: předchozí nukleotidová sekvence genu SHOX
SEQ	ID	NO.	9: gen ET92
SEQ	ID	NO.	10: sekvence SHOXa (také uvedeno na obrázku č. 2)
SEQ	ID	NO.	11: transkripční faktor A (také uvedeno na obrázku

č. 2)

SEQ ID	NO.	12: sekvence SHOXb	(také uvedeno na obrázku č. 3)
SEQ ID	NO:	13: transkripční	faktor B (také uvedeno na obrázku
Č. 3)
SEQ ID	NO.	14: gen SHOX
SEQ ID	NO.	15: sekvence SHOT	(také uvedeno na obrázku č. 4)
SEQ ID	NO:	16: transkripční	faktor C (také uvedeno na obrázku

č. 4) .

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1: Pacienti

Všech šest studovaných pacientů vykazuje de novo odchylky na pohlavním chromozomu.

Pacient s označením CC je dívka s karyotypem 45,X/46,X psu dic (X) (Xqter ->Xp22.3 : : Xp22.3->Xqter) . Při posledním testu jí bylo 6 1/2 roku, její výška byla 114 cm (25 až 50 % percentil) . Výška postavy její matky je 155 cm, otec nebyl zařazen do analýzy. Detailněji je případ popsán v publikaci Henke A., Wapenaar M., van Ommen G-J., Maraschio P., Camerino O., Rappold G.A. (1991): Deletions within the pseudoautosomal region help map three new markers and indicate role of this region in linear growth. Am. J. Hum. Genet. 49: 811-819.

Pacient s označením GA je dívka s karyotypem 46,X der X (3pter-»3p23: :Xp22.3-»Xqter) . Při posledním testu jí bylo 17 let a zjistila se normální výška (159 cm). Výška její matky je 160 cm, její otec měří 182 cm. Detailněji se pacientka popisuje v publikaci Kulharya A.S., Roop H., Kukolich M.K., Nachtman R.G., Belmont J.W., Garcia-Heras J., (1995): Mild • 9 • Λ*

I ··>· «9

I 9 9 » 9 9

999

9 • 9 99 phenotypic effects of a de novo deletion Xpter—»Xp22.3 a duplication 3pter—>3p23. Am. J. Med. Genet. 56: 16-21.

Pacient s označením SS je dívka s karyotypem 46,X rea (X) (Xqter—»Xq26: :Xp22.3->Xq26: ) . V jedenácti letech její výška byla pod 3 percentil křivky růstu japonských dívek.; její předpovězená výška v dospělosti (148,5 cm) leží pod její cílovou výškou (163 cm) a cílové rozmezí je (155 až 191 cm) . Detailněji je případ popsán v publikaci Ogata T., Goodfellow P., Petit C., Aya M., Matsuo N. (1992) girl with a terminál Xp deletion

Short stature in a distal to DXYS15:

localization of a growth gene(s) in the pseudoautosomal region. J. Med. Genet. 29: 455-459.

Pacient z označením AK je dívka s karyotypem 46,X rea (X) (Xqter-»Xp22.3: :Xp22.3->Xp21.3 :) . Ve 13-ti letech její výška je pod 2 percentil křivky růstu japonských děvčat; její předpovídaná výška v dospělosti (142,8 cm) je pod její cílovou výškou (155,5 cm) a cílové rozmezí je (147,5 až 163,5). Detailněji se případ popisuje v publikaci Ogata T., Yoshizawa A., Muroya K., Matsuo N., Fukushima Y., Rappold G.A., Yokoya S. (1995): Short stature in a girl with partial monosomy of the pseudoautosomal region distal to DXYS15: further evidence for the assignment of the critical region for a pseudoautosomal growth gene(s). J. Med. Genet. 32: 831-834. Pacient označený RY má karyotyp 46,X,r(Y)/46,Xdic r (Y)/45, X[95: 3: 2], jak se zjistilo testem 100 lymfocytů; V 16ti letech je její výška 148 cm; jeho tři bratři dosáhly normální výšky 170 cm (bratr 1, 16 let), 164 cm (bratr 2, 9 let) a 128 cm (bratr 3, 9 let) . Růstová retardace tohoto pacienta je tak silná, že by měla být kompatibilní s další delecí lokusu GCY na Yq.

Pacient s označením AT je chlapec s ataxii a inv(X); v sedmi letech dosahuje normální výšky 116 cm, výška rodičů je 156 cm a 190 cm.

• 9

«I ·· • ··

9

9

9 9 9

999 ·9·

Pacienti pro analýzu mutací

U 250 jednotlivců s idiopatickým malým vzrůstem postavy se vyšetřovaly mutace genu SHOXa. Pacienti se vybraly podle následujících kriterií: výška chronologického věku byla pod 3 centil národního výškového standardu mínus 2 standardní odchylky (SDS); nebylo známé žádné kauzativní onemocnění zvláště : normální váha (délka) v prenatálním stavu, normální tělesné proporce, žádné chronické onemocnění, normální příjem potravy, žádné psychiatrické obtíže, žádná dysplázie skeletu, žádná nedostatečnost růstového hormonu nebo hormonů štítné žlázy.

Rodina A:

Případy 1 a 2 jsou děti malého vzrůstu německé nepokrevné rodiny. Chlapec (případ 1) se narodil v 38 týdnu těhotenství císařským řezem. Porodní váha byla 2 660 g, porodní délka byla 47 cm. Vyvíjel se normálně s výjimkou subnormálního růstu. Při schůzce ve věku 6,4 roku byl proporcionálně malý (106,8 cm, 2,6 SDS) a obézní 22,7 kg) ale jinak normální. Stáří jeho kostí nebylo retardované (odpovídalo 6 letům) a dysplázie kostí se vyloučila na základě vyšetření X-paprsky. Nepravděpodobná je nedostatečnost v hladinách IGF-I a IGFBP-3 stejně jako parametry štítné žlázy, které se v séru prokazují GH nebo nedostatečnost hormonů štítné žlázy. Dívka (případ 2) se narodila v termínu císařským řezem. Porodní váha byla 2 920 g, porodní délka byla 47 cm. Její vývoj byl normální, ale ve 12 měsících se projevil její malý růst (délka 67 cm, -3,0 SDS). Ve čtyřech letech měřila 89,6 cm (-3,6 SDS). Neprojevily se žádné dysmorfní ani dysproporcionální rysy. Nebyla obézní (13 kg). Stáří jejich kostí odpovídalo 3,5 letům a vyloučila se dysplázie kostí. Hormonální parametry byly normální. Je zajímavé poznamenat, že růst děvčete i chlapce odpovídá 50 percentil růstové křivky žen s Turnérovým syndromem. Matka je nejmenší z rodiny a má střední rhizomelickou disproporci • · · · (142,3 cm, -3,8 SDS) . Jedna ze sester (150 cm, -2,5 SDS) a babička z matčiny strany (153 cm, -2,0 SDS) jsou malé postavy, aniž mají nějakou disproporci. Druhá sestra má normální výšku postavy (167 cm, +0,4 SDS). Výška otce je 166 cm (-1,8 cm) a výška dědečka z matčiny strany je 165 cm (-1,9 SDS). Další pacient je japonského původu a vykazuje identické mutace.

Příklad 2: Identifikace genu odpovídajícího za malý vzrůst

A. Hybridizace in sítu

a) Fluorescenční hybridizace in sítu

Provedla se fluorescenční hybridizace in sítu (FISH) za použití kosmidů, které leží v Xp/Yp pseudoautozomální oblasti (PARI). Uskutečnily se FISH studie za použití kosmidů 64/75cos (LLNlcll0H032), E22cos(2e2), Fl/14cos (110A7), Ml/70cos (110E3), P99F2cos(43C11), P99cos (LLNLcll0P2410), B6cosb (1CRFC104H0425), F20cos (34F5), F21cos (ICRFcl04G0411), F3cos2 (9E3), F3cosl (11E6), P117cos (29B11), P6cosl(ICRFcl04P0117), P6cos2 (LLNLcll0E0625) a E4cos (15G7) podle metody popsané v publikacích (Lichter P., Cremer T., Human Cytogenetics: A practical Approach, IRL Press 1992, Oxford, New York, Tokyo). Jeden mikrogram kosmidového klonu se značil biotinem a hybridizoval se s metafází lidských chromozomů za podmínek, které redukují signál z repetivních sekvencí DNA. Detekce hybridizačního signálu probíhá prostřednictvím avidinu spojeného s FITC. Zviditelnění FITC proběhlo za použití chlazeného zdvojeného kamerového sytému (Photometrics, Tucson, AZ) .

b) Fyzikální mapování

Kosmidy se získaly z Lawrence Livermore National Laboratory Xa Y-chromozomové knihovny a z X-chromozomové knihovny instituce Imperiál Cancer Research Fund London (nyní Max Plaňek Institute for Molecular Genetics Berlin). Za použití

• · ·

........

kosmidů distálních k DXYS15, jmenovitě E4cos, P6cos2, P6cosl, P117cos a F3cosl lze stanovit, že jsou stále přítomny dvě kopie E4cos, P6cos2, P6cosl a jedna kopie P117cos a F3cosl. Body porušení na mapě kosmidu P6cosl obou pacientů AK a SS jsou od sebe v maximální vzdálenosti lOkb. Zjistilo se, že abnormální X-chromozomy AK a SS měly deletováno přibližně 630 kb DNA.

Další kosmidy se získaly z ICRF X-chromozomové specifické kosmidové knihovny (ICRFclG4), z Lawrence Livermore Xchromosomové specifické kosmidové knihovny (LLNLcllO) a Ychromozomové specifické knihovny (LLCO3'M'), stejně jako ze samostatně připravené kosmidové knihovny zahrnující celý genom. Kosmidy se identifikovaly hybridizací se všemi známými sondami, které mapují uvedenou oblast a použitím celé YAC jako sondy. Za účelem ověření překryvů v případech, kde nebylo možno použít známých sond, se použily terminační sondy z několika kosmidů.

c) Hybridizace Southernovým přenosem

Analýza Southernovým přenosem za použití pseudoautozomálních markérů poskytuje důkaz, že bod porušení X-chromozomu u pacienta CC leží mezi DXYS20(3cosPP) a DXYS60(U7A ( Henke A., Wapenaar M., van Ommen G-J., Maraschio P., Camerino O., Rappold G.A. (1991): Deletions within the pseudoautosomal region help map three new markers and indicate role of this region in linear growth. Am. J. Hum. Genet. 49: 811-819). Za účelem potvrdit tento nález a definovat pozici bodu porušení, se použily kosmidy 64/75cos, E22cos, Fl/14cos, Ml/70cos, F2cos, P99F2cos a P99cos jako sondy při hybridizací FISH. Pozice bodu porušení na abnormálním chromozomu X u pacinta CC je mezi kosmidy 64/75cos (jedna kopie) a Fl/14cos (dvě kopie) na E22PAC. Pacient CC s normální výškou následně ztratil přibližně 269 až 290 kb DNA.

• ·

Hybridizace Southernovým přenosem se provedla za přísných podmínek v Churchově pufru (0,5 M NaPi pH7,2, 7 % SDS, 1 mM

EDTA) při teplotě 65 °C a promývání se provedlo 40 mM NaPi, 1 % SDS při teplotě 65 °C.

d) Analýza hybridizaci FISH

Biotinem značená kosmidová DNA (velikost inzertu 32 až 45 kb) nebo kosmidové fragmenty (10 až 16 kb) se hybridizovaly s metafází chromozomů, které pochází ze stimulovaných lymfocytů pacientů, za podmínek, jenž se popisují dříve v textu (Lichter P., Cremer T., Human Cytogenetics: A practical Approach, IRL Press 1992, Oxford, New York, Tokyo). Hybridizované sondy se detekovaly prostřednictvím avidinu spojeného s FITC.

e) Amplifikace pCR

Všechny reakce PCR se provedly v objemech 50 ul. V tomto objemu je obsaženo 100 pg až 200 pg templátu, 20 pmolkaždého primeru, 200 uM dNTP (Pharmacia), 1,5 mM MgC12, 75 mM Tris/Hcl pH9, 20 mM (NH4)2SO4 0,01 % (hmot. /objem) Tween 20 a 2 U

Goldstar DNA polymerázy (Eurogentec). Termocykly se provedly na zařízení GeneE (Techne).

f) Amplifikace exonu

Za účelem amplifikace exonu se použily čtyři kosmidové sebrané roztoky, kdy každý zahrnuje čtyři až pět klonů z kosmidových kontigů. Kosmidy v každém kosmidovém roztoku se částečně štěpily restrikčním enzymem Sau3A. Frakce čištěné na gelu v rozmezí velikostí 4 až 10 kb se klonovaly do vektoru pSPL3B štěpeného restrikčním enzymem BamHI (Burn et al., 1995) a použily se při experimentech amplifikace exonu, jak se popisuje dříve v textu (Church et al., 1994).

g) Sekvenování genů ·· ··

Sonifikované fragmenty dvou kosmidů LLOYNCO3'M'15D10 a LLOYNCO3'M'34F5 se odděleně sub-klónovaly do vektorů M13mpl8. Z každé kosmidové knihovny se vybralo alespoň 1 000 plaků, připravila se DNA M13 a sekvenovala se za použití barvivém značených terminátorů, termo-sekvenázy (Amersham) a univerzálního M13-primeru (MWG-BioTech). Gely se provedly na sekvenátoru ABI-377 a data se uspořádala a editovala pomocí programu GAP4 (Staden).

Ze všech šesti pacientů pacient GA měl nejméně chrakterizovaný bod porušení chromozomu. Nejvzdálenější markéry, jejichž přítomnost na chromozomu X se testovala dříve, byly DXS1060 a DXS996, mapují přibližně 6 Mb od telomeru (Nelson, D.L., Ballabio A., CremersF., Monaco A.P., Schlessinger D., (1995). -Report of the sixth International workshop on the X chromosome mapping. Cytogenet. Cell Genet. 71: 308-342). Testovalo se několik kosmidů, které obsahují odlišné sekvence genů z PARI (MIC2, ANT3, CSF2RA a XE7). Všechny byly přítomny na translokačním chromozomu. Kosmidy pokrývající kritickou oblast odpovídající za malý vzrůst postavy, například z chromozomu, přičemž translokační bod porušení je na kosmidů Ml/70cos. Kvantitaivní srovnání intenzity signálu Ml/70cos mezi normálním a znovu uspořádaným chromozomem X ukazuje, že je deletováno přibližně 70 % kosmidů.

Tabulka č. 2

	CC	GA	AK	SS
64/75cos	-	-
E22cos	-	-
Fl/14cos	+	-
Ml/70cos	+	(+)
F2cos	+	+
P99F2cos	+	+
P99cos	+	+
B6cos		+

• · > · · · · • · > ·«

F20cos
F21cos
F3cos2
F3cosl			—
P117cos				—
P6cosl			+	+
P6cos2			+	+
E4cos			+	+

Tabulka č. 2: Tabulka udává souhrn dat z hybridizace FISH pro 16 kosmidů testovaných u čtyř pacientů (-) jedna kopie; indikuje, že kosmid je deletován na znovu uspořádaném chromozomu X, ale je přítomen na normálním chromozomu X (+) dvě kopie; indikuje, že kosmid je přítomen na znovu uspořádaném i na normálním chromozomu X ((+)) oblast bodu porušení; indikuje, že bod porušení se vyskytuje na kosmidu, jak ukazuje hybridizace FISH.

Molekulová analýza u šesti pacientů se znovu uspořádaným chromozomem X za použití kosmidových fluoresčenčně značených kosmidových sond a hybridizace in šitu indikuje, že oblast odpovídající za malý vzrůst je zúžena na interval o velikosti 270 kb, který je ohraničený bodem porušení pacienta GA z jeho centromerové distální strany a u pacientů AK a SS na jeho centromerové proximální straně.

Korelace genotyp-fenotyp může být informativní a může posloužit k zobrazení kritického intervalu, který odpovídá za malý vzrůst postavy, na lidském chromozomu X a Y. V této studii se použila analýza hybridizací FISH ke studiu rozšíření metafáze a interfáze jádra lymfocytů u pacientů, kteří nesou delece a translokace na chromozomu X a body porušení v Xp22.3. Tyto body porušení se jeví být přítomny u dvou ze čtyř pacientů (AK a SS) , což je způsobeno přítomností sekvencí ·· ·· » · · « proximálně 510/520 podstatnou redukci s predispozicí k znovu uspořádání chromozomu. Zjistil se další pacient s kruhovým Y s porušením nacházejícím se v kritické oblasti o velikosti 270 kb, což redukuje kritický interval na 170 kb.

Korelací výšky šesti jedinců s jejich místem porušení se mapoval interval o velikosti 170 kb v pseudoautozomální oblasti, jehož přítomnost nebo absence má podstatný účinek na výšku vzrůstu. Tento interval je ohraničen místem porušení na chromozomu X pacienta GA v místě vzdáleném 340 kb distálně od telemoru (Xptel) a místem porušení u pacientů AT a RY kb Xptel. Toto uspořádání zahrnuje kritického intervalu na téměř jednu čtvrtinu jeho původní velikosti (Ogata T., Goodfellow P., Petit C., Aya M., Matsuo N. (1992) : Short stature in a girl with a terminál Xp deletion distal to DXYS15: localization of a growth gene(s) in the pseudoautosomal region. J. Med. Genet. 29: 455-459; Ogata T., Yoshizawa A., Muroya K., Matsuo N.,

Fukushima Y., Rappold G.A., Yokoya S. (1995): Short stature in a girl with partial monosomy of the pseudoautosomal region distal to DXYS15: further evidence for the assignment of the critical region for a pseudoautosomal growth gene(s). J. Med. Genet. 32: 831-834; Ogata T., Matsuo N. (1995): Turner syndrome and female sex chromosome aberrations: deduction of the principle factors involved in the development of clinical features. Hum. Genet. 95: 607-629). Pro experimenty FISH za účelem testování prevealence a signifikance uvedeného genomového lokusu na velké sérii pacientů s idiopatickým malým vzrůstem je nyní dostupná malá sada šesti až osmi kosmidů.

B. Identifikace kandidáta genu odpovídajícího za malý vzrůst Za účelem hledání transkripčních jednotek v nejmenší kritické oblasti o velikosti 170 kb se provedlo trapování exonu a selekce cDNA u šesti kosmidů (110E3, F2cos, 43C11, 02410, 15D10, 34F5). Trapováním exonu se izolovaly tři různé

pozitivní klony (ET93, ET45 a G108). Všechny z nich se mapovaly zpět ke kosmidu 34F5. Předchozí studie za použití cDNA selekčních protokolů a přístupu k 25 různým knihovnám cDNA vedly k neúspěchu, což naznačuje, že geny v tomto intervalu se exprimují s velmi malým nadbytkem.

Za účelem zjištění, zda nějaký gen v uvedeném intervalu chybí, se stanovila za použití náhodné M13 metody a terminátorové chemie nukleotidová sekvence vzdálená přibližně 140 kb od uvedené oblasti PARI. Za účelem sekvenční analýzy se vybraly kosmidy se vzájemným minimálním překryvem, aby spolu pokryly kritický interval. Provedla se sekvenční analýza a následná předpověď proteinu pomocí programu „X Grail, verze 1.3c, stejně jako trapování exonu pomocí programu FEXHB, což potvrdilo všechny 3 dříve klonované exony. Nedetekoval se žádný jiný gen kódující protein, než co už byl dříve izolován.

C. Izolace genu SHOX odpovídajícího za malý vzrůst

Za předpokladu, že všechny tři exonové klony ET93, ET45 a G108 jsou součástí stejného genu, použily se spolu jako sondy k testování 14 různých knihoven cDNA vytvořených z 12 různých fetálních (plíce, játra, mozek 1 a 2) a dospělých tkání (vaječníky, placenta 1 a 2, fibroblasty, skeletové svalstvo, kostní dřeň, mozek, mozkový kmen, hypotalamus, podvěsek mozkový). Mezi přibližně 14 milióny klony nanesenými na plotny se nedetekoval ani jeden klon. Za účelem izolace transkriptu v plné délce se uskutečnil 3'a 5'RACE. Za účelem 3'RACE se použily primery z exonu G108 na RNA z placenty, skeletového svalstva a fibroblastů z kostní dřeně a z tkáně, kde se exprimuje G108. Ze všech tří tkání se získaly dva různé 3'RACE klony velikosti 1173 a 652 bp, což naznačuje, že existují dva různé 3'exony a a b. Tyto dvě odlišné formy se nazývají SHOXa a SHOXb.

Za účelem zvýšení šancí pro izolaci celé 5'části genu, o kterém se ví, že je exprimován s malým přebytkem, se buněčná • ·0 00 0 000 000 • 000 0 ··* • · 000 0 0 0 0 1 ♦ 0 0 0 0 «

........

linie Hela ošetřila retinoovou kyselinou a forbolesterem ΡΜΆ. RNA z takové indukované buněčné linie a RNA z placenty a skeletového svalstva se použila ke konstrukci „Mararhonovy knihovny cDNA. Ze všech tří tkání se izolovaly identické klony 5'RACE cDNA.

Experimentální postup:

RT-PCR a konstrukce knihovny CDNA.

Od firmy Clontech se získala lidská polyA⁺RNA ze srdce, pankreasu, skeletového svalstva, fetálních ledvin a jater. Celková RNA se izolovala z buněčné linie fibroblastů z kostní dřeně činidlem TRIZOL (Gibco-BRL), způsobem, který popisuje výrobce. První řetězec syntézy cDNA se získal pomocí kitu „Superscript first strand cDNA synthesis kit (Gibco-BRL), kdy počátečním materiálem je 100 ng polyA⁺RNA nebo 10 ug celkové RNA za použití oligo (dt)-ada⁺RNAptorového primeru (GGCCACGCGTCGACTAGTAC[dT]₂oN. Po syntéze prvního řetězce cDNA se reakce naředila 1/10. Při dalších experimentech PCR se použilo 5 ul tohoto ředění. „Marathonova knihovna cDNA se zkonstruovala z polyA⁺RNA skeletového svalstva a placenty amplifikačním kitem pro cDNA (Clontech), jak popisuje výrobce. Knihovny cDNA z fetálního mozku (katalogové číslo # HL5015b), fetální plíce (HL3022a), vaječníků (HLlO98a), podvěsku mozkového (HL1097v) a hypotalamu (HL1172b) se získaly od firmy Clontech. Knihovny cDNA mozku, ledvin, jater a plic se staly součástí rychlého testu panelu lidské cDNA knihovny (Clontech). cDNA knihovna fetálního svalstva se získala z instituce UK Human Genome Mapping Project Resources Center.

D. Sekvenační analýza a struktura genu SHOX

Na základě analýzy sekvencí získaných klonů pomocí 5' a 3'RACE se uspořádala sekvence SHOXa a SHOXb (1349 a 1870 bp). Identifikoval se jedne otevřený čtecí rámec o velikosti 1870 bp (SHOXa) a 1349 bp (SHOXb), který dává vzniku dvou proteinů ·· BB ► · B 4

BBB

B B o 292 aminokyselinách (SHOXa) a 225 aminokyselinách (SHOXb). Oba transkripty a i b se dělí o běžný 5'konec, ale mají odlišný poslední 3'exon . Toto zjištění naznačuje, že se používá alternativní signály sestřihu. Dosáhlo se úplného a sekvenovanou genomovou DNA LL0YNC3M34F5, což umožňuje uspořádání mezi dvěmi cDNA z kosmidů LL0YNCO3M15D10a ustanovení struktury exon-intron (obrázek č. 4) . Gen se skládá ze 6 exonů, jejichž velikost se pohybuje v rozmezí od 58 bp (exon III) do 1146 bp (exon Va). Exon I obsahuje CpG, startovací kodon a 5'oblast. Stop kodon stejně jako 3'nekódující oblast se nachází v každém alternativně sestřiženém exonu Va a Vb.

Příklad 3:

Identifikovaly se dvě cDNA, které tvoří 160 kb velkou oblast, která je kritická pro malý vzrůst. Tyto cDNA korespondují s geny SHOX a pET92. cDNA se se identifikovaly hybridizací subklónů kosmidů s knihovnami cDNA.

Sada kosmidových klonů, které úplně pokrývají kritickou oblast, je genetickým materiálem pro identifikaci kauzativního genu. Projekty pozičního klonování, které vedou k izolaci genů z uvedené oblasti, se uskutečnily trapováním exonu a selekcí cDNA. Zjištěním jejich polohy v pseudoatozomální oblasti se tyto geny mohou vyhnout X-deaktivaci a může se uplatnit účinek dávky.

Klonování genu, který když není přítomen (haploid) nebo je deficitní odpovídá za malý vzrůst, je dalším krokem přesnosti diagnózy a poskytuje základy pro analýzu mutací v genu pomocí například jednořetězcového konformačního polymorfizmu (SSCP). Navíc klonování uvedeného genu a jeho následná biochemická charakterizace otevřela cestu k hlubšímu porozumění biologických procesů, které jsou zahrnuty v řízení růstu. Sekvence DNA podle vynálezu poskytují první molekulový test pro identifikaci jednotlivců se specifickou vadou genu ·· ·· ·· • · · · • · · · • · · · ··♦ · · · >

• · · · · ···· · ··· • · · · · • ·· ·· · v komplexní heterogenní skupině pacientů, kteří vykazují idiopatický malý vzrůst.

Příklad 4: Expresní patern SHOXa a SHOXb

Analýza northernovým přenosem za použití jednotlivých exonů jako hybridizačních sond ukázala odlišný expresivní profil každého exonu, což silně naznačuje, že pruhy o různé velikosti a intenzitě reprezentují produkty křížové hybridizace s jinými genovými sekvencemi bohatými na G,C. Aby se dosáhlo více realistického expresivního profilu genů SHOXa a b, provedly se s RNA z různých tkání RT-PCR experimenty. Zatímco exprese SHOXa se pozorovala ve fibroblastech skeletového svalstva, placenty, pankreasu, srdce a kostní dřeně, exprese SHOXb se omezila na fibroblasty fetální ledviny, skeletového svalstva a kostní dřeně, přičemž zdaleka nej silnější expresi vykazují fibroblasty kostní dřeně.

Exprese SHOXa v několika cDNA knihovnách připravených z fetálního mozku a ze svalstva, z mozku dospělých, z plic a z podvěsku mozkového a skutečnost, že v žádné uvedené knihovně není exprimován SHOXb, podává další důkaz, že exprese jedné formy sestřihu (SHOXa) je více rozšířena než druhá (SHOXb), která se exprimuje převážně tkáňově specifickým způsobem.

K odhadu transkripční aktivity SHOXa a SHOXb na X a Y chromozomu se použila RT-PCR RNA, která se extrahovala z různých buněčných linií, jenž vykazují aktivní X, neaktivní X nebo Y chromozom. Všechny buněčné linie vykazují produkt amplifikace očekávané délky 119 bp (SHOXa) a 541 bp (SHOXb), což je důkaz, že jak SHOXa i b unikly deaktivaci chromozomu X. Geny SHOXa a b kódují nové proteiny homeodomén. Gen SHOX je vysoce konzervativní mezi jednotlivými živočišnými druhy od savců po ryby a ptáky. Na samém 5'konci a 3' konci vedle homeodomény jsou pravděpodobně konzervativní oblasti mezi člověkem a myší, což znamená funkční signifikanci. Během • 4 • ·· 4· 4 • 4444 4

4

• ··· 4 4

4

evoluce mezi člověkem a myší se v těchto oblastech aminokyselin neakumulovaly rozdíly.

Experimentální postupy:

a) 5'a 3 'RACE

Za účelem klonování transkriptů 5'konce SHOXa a b se provedla metoda 5'RACE za použití zkonstruované „Marathonových cDNA knihoven. Použily se následující oligonukleotidové primery: SHOX B rev. GAAAGGCATCCGTAAGGCTCCC (pozice 697-718, reverzní řetězec [r]) a adaptorový primer API. Proběhla PCR za těchto podmínek: 94 °C po dobu 2 minut, 94 °C po dobu 30 vteřin, 70 °C po dobu 30 vteřin, 72 °C po dobu 2 minut po 5 cyklů. 94 °C po dobu 30 vteřin, 66 °C po dobu 30 vteřin, 72 °C po dobu 2 minut po 5 cyklů. 94 °C po dobu 30 vteřin, 62 °C po dobu 30 vteřin, 72 °C po dobu 2 minut po 25 cyklů. Druhé kolo amplifikace se uskutečnilo za použití 1/100 produktu PCR a následujících oligonukleotidových primerů: SHOX A rev,

GACGCCTTTATGCATCTGATTCTC (pozice 617-640 r) a adaptorového primeru AP2. PCR se provedlo během 35 cyklů s teplotou renaturace 60 °C.

Za účelem klonování transkriptů 3'konce SHOXa a b se provedla metoda 3'RACE, jak popisuje v publikaci Frohman et al., 1988, za použití prvního řetězce cDNA s primerem oligo(dT)adaptoru. Použily se následující oligonukleotidové primery: SHOX A for GAATCAGATGCATAAAGGCGTC (pozice 619-640) a oligo(dT)adaptor. . Proběhla PCR za těchto podmínek: 94 °C po dobu 2 minut, 94 °C po dobu 30 vteřin, 62 °C po dobu 30 vteřin, 72 °C po dobu 2 minut po 35 cyklů. Druhé kolo amplifikace se uskutečnilo za použití 1/100 produktu PCR a následujících oligonukleotidových primerů: SHOX B for, GGGAGCCTTACGGATGCCTTTC (pozice 697-718) a oligo(dT)adaptoru. PCR se provedlo během 35 cyklů s teplotou renaturace 62 °C.

• ·· ··

4· t * ♦ · • 4 4 4 • · ···· · • · » ·· · • 4 * 4 • · • 44 »4 a· a « • 4 »44 4 • 4

Za účelem potvrdit sekvence transkriptů SHOXa a SHOXb se uskutečnila PCR 5'oligonukleotidovým primerem a

3'oligonukleotidovým primerem. V případě SHOXa se použily následující primery: G310 for AGCCCCGGCTGCTCGCCAGC (pozice 5978) a SHOX D rev CTGCGCGGCGGGTCAGAGCCCCAG (pozice 959-982 r) . V případě SHOXb se použily následující primery: G310 for AGCCCCGGCTGCTGCCAGC a SHOX2A rev GCCTCAGCAGCAAAGCAAGATCCC (pozice 1215-1238 r) . Obě PCR se provedly za podmínek: 94 °C po dobu 2 .minut, 94 °C po dobu 30 vteřin, 70 °C po dobu 30 vteřin, 72 °C po dobu 2 minut po 5 cyklů. 94 °C po dobu 30 vteřint, 70 °C po dobu 30 vteřin, 72 °C po dobu 2 minut po 5 cyklů. 94 °C po dobu 30 vteřin, 65 °C po dobu 30 vteřin, 72 °C po dobu 2 minut po 35 cyklů. Produkty se čistily na gelu a klonovaly se za účelem sekvenační analýzy.

b) Analýza SSCP

Amplifikovaná genomová DNA pocházející z pacientů se analyzovala způsobem SSCP, který se popisuje v publikaci Orita M., Suzuki Y., Sekiya T., and Hayashi K., (1989): Rapid and sensitive detection of point mutations and polymorphisms using the polymerase chain reaction. Genomics 5:874-879). 1 až 5 ul produktů PCR se smíchalo s 5 ul denaturačního roztoku, který obsahuje 95 % formamidu a 10 mM EDTA pH8, a denaturovaly se při teplotě 95 °C po dobu 10 minut. Vzorky se ihned ochladily na ledu a nanesly se na 10 % polyakrylamidový gel (akrylamid : bisakryamid = 37,5 : 1 a 29 : 1; gel s více sloty, báze TGGE, Qiagen), který obsahuje 2 % glycerol a 1 x TBE. Elektroforéza proběhla při teplotě 15 °C při napětí 500 V po dobu 3 až 5 hodin a obarvila se stříbrem, jak se popisuje TGGE manuálu (Qiagen, 1993).

c) Klonování a sekvenování produktů PCR

Produkty PCR se klonovaly do vektoru pMOSBlue za použití pMOSBlueT-sady vektorů od firmy Amersham. Kultura z jedné ·« 9 • · ·

kolonie kultivovaná přes noc se lyžovala povalením ve 100 ul vody po dobu 10 minut. Lyzáty se použily jako templáty pro PCR se specifickými primery. SSCP produktů PCR umožnila identifikaci klonů, které obsahují různé alely. Klony se sekvenovaly za použití vektorových primerů Uni a T7 značených CY5 způsobem sekvenování v cyklech, jak popisuje výrobce (ThermoSequenase Kit (Amersham)) na atomatickém sekvenétoru ALF (Pharmacia).

d) Testování cDNA knihoven pomocí PCR

Aby se detekovala exprese SHOXa a b provedlo se PCR testování několika knihoven cDNA a prvního řetězce cDNA s SHOXa a b specifickými primery. V případě knihoven cDNA se použil ekvivalent DNA 5 x 10⁸ pfu. V případě SHOXa se použily primery SHOX E rev GCTGAGCCTGGACCTGTTGGAAAGG (pozice 713-737 r) a SHOX a for. V případě SHOXb se použily následující primery SHOX B for a SHOX2A rev. Obě PCR se provedly za podmínek: 94 °C po

dobu 2	minut,	94	1 °c	po	dobu 30	vteřin, 68	°C po dobu	30
vteřin,	72 °C	PO	dobu	40	vteřin po	5 cyklů. 94	° C po dobu	30
vteřin,	65 °C	PO	dobu	30	vteřin, 72	° C po dobu	40 vteřin po	5

cyklů. 94 °C po dobu 30 vteřin, 62 °C po dobu 30 vteřin, 72 °C po dobu 40 vteřin po 35 cyklů

e) PCR testování knihoven cDNA

Aby se detekovala exprese SHOXa a b provedlo se PCR testování několika knihoven cDNA s SHOXa a b specifickými primery.

V případě knihoven cDNA se použil ekvivalent DNA 5 x 10⁸ pfu.

V případě SHOXa se použily primery SHOX E rev GCTGAGCCTGGACCTGTTGGAAAGG (pozice 713-737 r) a SHOX a for.

V případě SHOXb se použily následující primery SHOX B for a SHOX2A rev. Obě PCR se provedly za podmínek: 94 °C po dobu 2 minut, 94 °C po dobu 30 vteřin, 68 °C po dobu 30 vteřin, 72 °C po dobu 40 vteřin po 5 cyklů. 94 °C po dobu 30 vteřin, 65 °C po dobu 30 vteřin, 72 °C po dobu 40 vteřin po 5 cyklů. 94 °C po dobu 30 vteřin, 62 °C po dobu 30 vteřin, 72 °C po dobu 40 vteřin po 35 cyklů.

Příklad 5: Expresivní patern 0G12, což je putativní homolog SHOX a SHOT

Za účelem stanovení expresivního paternu se provedla hybridizace in šitu u embryí myší z 5. dne p.c. a 18,5 dne p.c. , u fetálních a u nově narozených zvířat. Expresi bylo možno ukázat u vyvíjejících se zárodků noh, v mesodermu nasalních postupů, které se podílejí na tvorbě nosu a patra, u očních víček, u aorty, ve vyvíjejících se žláz samic, ve vyvíjející se páteři (omezených na diferenciaci motorických neuronů) a v mozku. Na základě tohoto expresivního paternu a na mapování pozice jeho lidského homologu SHOT, SHOT reprezentuje pravděpodobně kandidáta Cornelia de Lange syndromu, který zahrnuje malý vzrůst.

Příklad 6: Izolace nového genu homeoboxu podobného SHOX SHOT na chromozomu 3, který souvisí s lidským růstem/s malým vzrůstem postavy.

U člověka se izoloval nový gen nazývaný SHOT (SHOX homolog na chromozomu 3), který vykazuje nejvíce homologie s myším genem OG12 a lidským SHOX. Lidský gen SHOT a myší OG12 jsou vysoce homologní. Vykazují 99 % identity na úrovni proteinu. Ačkoli se to ještě neprokázalo, díky homologii mezi SHOT a SHOX (jde o identitu pouze v homeooblasti) je pravděpodobné, že gen SHOT také odpovídá za malý vzrůst nebo lidský růst.

Gen SHOT se izoloval za použití primerů ze dvou nových lidských EST (HS 1224703 a HS 126759) z databáza EMBL, přičemž se amplifikuje reverzně přepsaná RNA z linie fibroblastů kostní dřeně (Rao E., Weiss B., Mertz A., et al., (1995): Construction of a cosmid conting spanning the short stature candidate region in the pseudosomal region PAR 1. In: Turner • ·

9 9 • 9 9 «

« ·» • 9 · · · · 9 • · · β 9 9 9 · • 9 9 9999 · ··· 999

9 9 9 9

Λ 9 9 9 9 9 syndrome in a life spán respective: Research and clinical aspects. Proceeding of the 4^th International Symposium on Turner Syndrome, Gothenburg, Sweden, 18-21 May, 1995., edited by Albertsson-Wikland K., Ranke M.B., pp. 19-24, Elsevier. 5'a 3'konec genu SHOT se generoval RACE-PCR z fibroblastové knihovny kostní dřeně, která se zkonstruovala podle publikace Rao E., Weiss B., Fukami M., Rump A., Niesler B., Metz A.,

Muroya K., Binder G., Kirsch S., Winkelmann M., Nordsiek G., Heinrich U., Breuning Μ. H., Ranke M.B., Rosenthal A., Ogata T., Rappold G.A. (1997): Pseudoautosomal deletions encompassing a navel homeobox gene cause groxth failure in idiopathic short stature and Turner syndrome. Nátuře Genet 15:54-62. Gen SHOT se mapoval analýzou FISH chromozomu 3q25/q26 a dále se mapoval myší homolog syntetické oblasti na myším chromozomu 3. Na základě expresivního paternu OG12, což je myší homolog genu SHOT, gen SHOT reprezentuje kandidáta odpovídajícího za Cornelia Lange syndrom (který vykazuje malou výšku vzrůstu a další rysy, kam patří kraniofaciální abnormality) , který se mapoval v tomto intervalu na chromozomu 3q25/26.

Příklad 7: Vyhledávání mutací u pacientů s idiopatickým malým vzrůstem

Sekvence DNA podle vynálezu se používají při PCR, LCR a při jiných známých technologiích, za účelem stanovení, zda takoví jednotlivci s malou výškou vzrůstu vykazují malé delece nebo bodové mutace v genu odpovídajícím za malý vzrůst.

U 91 (z celkového počtu 250 jednotlivců) nezávislých pacientů mužského a ženského pohlaví s idiopatickou malou výškou vzrůstu (odhad četnosti idiopatické malé výšky vzrůstu v obecné populaci se odhaduje na 2 až 2,5 %) se testovala přítomnost malých změn v uspořádání nebo bodové mutace v genu SHOXa. Navrhlo se šest sad primerů PCR, ne pouze za účelem amplifikace jednotlivých exonů, ale také sekvencí, které ·· ·· t· ·« lemují exon a malé části 5ÚTR. V případě největšího exonu, exon I, se generovaly dva další primery uvnitř exonu. Primery, které se používaly při PCR, se uvádějí v tabulce č. 2.

Provedl se jednořetězcový konformační polymorfizmus (SSCP) všech amplifikováných exonů, jehož velikost se pohybuje v rozmezí od 120 do 295 bp. Pouze v případě dvou jednotlivců s malou výškou vzrůstu (Y91 a AI) se identifikoval posun pohyblivosti pruhů. Klonovaly se a sekvenovaly fragmenty, které vykazují pozměněné paterny SSCP (unikátní konformery SSCP) . Aby se zabránilo vzniku PCR a sekvenačních artifaktů, sekvenování se provedlo na dvou řetězcích za použití dvou nezávislých reakcí PCR. Mutace u pacienta Y91 se nachází v pozici 28 bp 5'konce startovacího kodonu v 5'UTR a zahrnuje substituci, kdy guanin se nahradí citidínem. Aby se zjistilo, jestli tato mutace reprezentuje řídký polymorfizmus nebo je odpovědná za fenotyp regulací exprese genu, například slabším navázáním translačních iniciačních faktorů, testovaly se pacientovi rodiče a sestra. Přestože sestra a otec pacienta dosahují normální CP (data nejsou uvedeny). Uvedená substituce bází reprezentuje řídký polymorfizmus, který neovlivňuje fenotyp.

Klonování a sekvenování unikátních konformerů SSCP pacienta Al vykazuje transici bází, kdy citidin nahradí thymidin (nukleotid 674), která zavede terminační kodon do pozice aminokyseliny 195 předpovězených aminokyselinových sekvencí 225 a 292. Aby se stanovilo, zda tato nesmyslná mutace je geneticky asociována s malou výškou vzrůstu rodiny, provedla se rodová analýza. Zjistilo se, že všech šest jednotlivců s malou výškou vzrůstu (definovanou jako výška nižší než 2 standardní odchylky) vykazuje nenormální posun SSCP a transici cytidinu za thymidin. Ani otec, ani jedna z tet a dědeček z matčiny strany, kteří dosáhly normální výšky nevykazují mutaci, což naznačuje, že babička přenesla mutovanou alelu na její dvě dcery a na jejich dvě vnoučata. U této rodiny * 4 • ·

4 44 44

4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4

44444 4 444 444 • · 4 4 <4 4 ·· «4 existuje shoda mezi přítomností mutovaných alel a fenotypu vykazujícího malou výšku vzrůstu.

Stejná situace, která se popisuje shora v textu, se zjistila u jiného pacienta s malou výškou vzrůstu, který je japonského původu.

Příklad 8:

Sekvence DNA podle vynálezu se používají pro charakterizaci funkce genu nebo genů. Sekvence DNA se mohou použít jako otázky při vyhledávání bází v databázích aminokyselin a nukleových kyselin za účelem identifikace příbuzných genů nebo genových produktů. Jako otázka pro vyhledávání v databázi aminokyselin se použila částečná aminokyselinová sekvence SHOX93. Test vykazuje velmi vysokou homologii s mnoha známými proteiny homeoboxů. Sekvence cDNA podle vynálezu se mohou použít při produkci peptidu rekombinantní metodou. Při produkci proteinu rekombinantním způsobem se mohou použít různé expresivní systémy, které jsou dobře známy v oboru.

Běžnou syntézou peptidu (syntéza proteinů podle Merrifieldovy metody) se syntetizoval peptid se sekvencí CSKSFDQKSKDGNGG a podle standardního protokolu se získaly polyklonální protilátky z králíků a kuřat.

6*4 4» 4 «4 44

	38			4 4 4 4 4 4 «4444 «4 4	4 4 4 4 4 4
Seznam literatury
Ashworth A., Rastan S.,	Lovell-	Badge R.,	Kay	G., (1991):	X-
chromosome inactivation	may	explain	the	difference	in

viability of XO humans and mice. Nátuře 351: 406-408.

Blagowidow N., Page D.C., Huff D., Mennuti MT (1989): UllrichTurner syndrome in an XY female fetus with deletion of the sex-determining portio of the Y chromosome. Am. J. med. Genet. 34: 159-162.

Cantrell M.A., Bicknell J.N., Pagon RA et al. (1989): Molecular analysis 46,XY females and regional assignment of a new Y-chromosome-specific probe. Human. Genet. 83. 88-92.

ConnorJ.M., Loughlin S.A.R. (1989): Molecular genetics of Turner's syndrome.Acta Pediatr. Scand. (Suppl.) 356: 77-80.

Disteche C.M., Casanova M., Saal H., Friedman C., Sybert V., Graham J., Thline H., Page D.C., Fellous M., (1986): Smáli deletions of the short arm of the Y-chromosome in 46,XY females. Proč. Nati. Acad. Sci USA 83: 7841-7844.

Ferguson-Smith M.A. (1965) : Karyotype-phenotype correlations in gonadal dysgenesis and their bearing on the pathogenesis of malformations. J. med. Gent. 2: 142-155.

Ferrari D., Kosher R.A., Dealy C.N. (1994): Limb mesenchymal cells inhibited from undergoing cartilage differentiation by a tumor promoting phorbol ester maintain expression of the homeobox-containing gene MSX1 and fail to exhibit gap junctional communication. Biochemical and Biophysical Research

Communications. 205(1):429-434.

9

I 9 ·

99999 9 999 99« «

9> 9 99 99

Fischer M., Bur-Romero P., Brown L.G. et al., (1990): Homologous ribosomal protin genes in the human X- and Ychromosomes escape from X-inactivation and possible implementation for Turner syndrome. Cell 63: 1205-1218.

Freund C., Horsford D.J., Mclnnes R.R. (1996): Transcription factor genes and the developing eye: a genetic perspective: Hum. Mol. Genet. 5: 1471-1488.

Gehring W. J., Qian Y.Q., Billeter, Furukubo-Tokunaga K., Schier A. F., Resendez-Perez D., Affolter M., Otting G., Wuthrich K., (1994): Homeodomein-DNA recognition . Cell 78:

211-223.

Grumbach M.M., Conte F.A. ¢1992): Disorders of sexual differentation. In: Williams textbook of endocrinology, 8^th edn.m edited by Wilson J.D., Foster D.W., pp. 853-952, Philadelphia, WB Saunders.

Hernandez D., Fisher E.M.C. (1996): Down syndrome genetics: unravelling a multifactorial disorder. Hum. Mol. Genet. 5: 1411-1416.

Kenyon C., (1994) : If birds can fly, why can't we? Homeotic genes and evolution . Cell 78: 175-180.

Krumlauf R., (1994): Hox genes in vertebrate development. Cell

78: 191-201.

Lawrence P.A., Morata G., (1994): Homeobox genes: their function in Drosophila segmentation and pattern formation. Cell 78: 181-189.

F FF FF F FF FF

FFF FFF FFFF

F F · · · FFF F FF F * F FFF F FFFF · FFF FFF FFFFFF F F

FFF FF <F F FF F-F

Lehrach H., Drmnac R., Hoheisel J.D., Larin Z., Lemon G.,

Monaco A.P., Nizetic D., et al., Hybridization finger printing in genome mapping and sequencing. In Davies K.E., Tilghman S.,

Eds. Genome Analysis 1990: 39-81 Cold Spring Harbor, NY.

Levilliers J., Quack B., Weissenbach J., Petit C., (1989):

Exchange of terminál pdrtions of X- and Y-chromosomal short arms in human XY females. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 22962300.

Lippe B.M. (1991) : Turner Syndrome. Endocrinol. Metab. Clin.

North Am. 20: 121-152. Magenis R.E., Tochen M.L. Holahan K.P.,

Carey T., Allen L., Brown M.G. (1984): Turner syndrome resulting from partial deletion of Y-chromosome short arm: localization of male determinantns. J. Pediatr 105: 916-919.

Pohlschmidt M., RappoldG.A., Krause M., Ahlert D., Hosenfeld D., Weissenbach J., Gal A. (1991): Ring Y chromosome: Molecular characterization by DNA probes. Cytogenet. Cell Genet. 56: 65-68.

Qiagen (1993) TGGE Handbook, Diagen GmbH, TGMA 41123/93.

Osenfeld R.G. (1992): Turner syndrome: a guide for physicians.

Second edition. The Turner's Syndrome Sciety.

Rovescalli A.C., Asoh S., Nirenberg M. (1996): Gloning and characterization four murine homeobox genes. Proč. Nati. Acad.

Sci. USA 93: 10691-10696.

Shalet S.M. (1993): Leukemia in children treated with growth hormone. Journal o fPediatric Endocrinology 6: 109-11

Vimpani G.' Farquhar J deficiency.

	41	• · · 4 4 · 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4	44 4 44 44 4 4 4 4 4 4 4 4 444 4 44 4 4 4 4444 4 444 444 4 4 4 4 4 44 4 44 44
• /	Vimpani	A.F., Lidgard	G.P., Cameron	E.H.D.,
w.	(1977)	Prevalence of	severe growth	hormone
Br.	Med. J.	2: 427-430.

Zinn A.R., Page D.C., Fisher E.M.C. (1993): Turner syndrome: the čase of the missing sex chromosome. TIG 9(3): 90-93.

• «» 9· 9 99 99

999 999 9 9 9 9 • · · · · 9 19 1 9 1 9 • 1 9 11 9 1111 1 111 111

199 19 19 1 9· «9

Sekvenční protokol (1)

Obecné informace:

Navrhovatel:
(A)	JMÉNO	: Rappold-Hoerbrand, Gudrun
(B)	ULICE	: Hausackerweg 14
(C)	MĚSTO	: Heidelberg
(D)	ZEMĚ:	Německo
(E)	ZIP:	69118

(ii) Název vynálezu: Molekula nukleové kyseliny kódující polypeptidy a způsoby jejího použití.

(iii) Počet sekvencí: 16 (iv) Počítačem čitelná forma:

(A) TYP MÉDIA: disketa (B) POČÍTAČ: kompatibilní s IBM PC (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, verze #1.30 EPO (2) (vi) Data předchozích přihlášek (A) PŘIHLÁŠKA č. US 60/027,633 (B) DATUM PODÁNÍ: 01-10-1996 (vi) Data předchozích přihlášek (A) PŘIHLÁŠKA č. US 60/027,633 (B) DAT UM PODÁNÍ: 01-10-1996

Informace o sekvenci SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 60 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární

9* ·· 4 44 44

4 4 4 4 4 4

4 4 4 « 44 4

4 · « 4 4 ···· 4 444 444 · » 4 · 4 4 4

........ ** ·’ (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1

Gin 1

Arg

Arg

Ser

Au:g 5

Thr

Aan

Phe

Thr

Leu 10

Glu

Gin

Leu

Aan

Glu 15

Leu

Glu

Arg

Leu

Phe 20

Aap

Glu

Thr

Hia

Tyr 25

Pro

Aap

Ala

Phe

Met 30

Arg

Glu

Glu

Leu

Ser 35

Gin

Arg

Leu

Gly

Leu 40

Ser

Glu

Ala

Arg

Val 45

Gin

Val

Trp

Phe

Gin 50

Aan

Arg

Arg

Ala

Lya 55

Cya

Arg

Ly3

Gin

Glu 60

(2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 209 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „exon II: ET93 (v) TYP FRAGMENTU: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2

GGATTTATGA	ATGCAAAGAG	AAGCGCGAGG	ACGTGAAGTC	GGAGGACGAG	GACGGGCAGA	60
CCAAGCTGAA	ACAGAGGCGC	AGCCGCACCA	ACTTCACGCT	GGAGCAGCTG	AACGAGCTCG	120
AGCGACTCTT	CGACGAGACC	CATTAGCCCG	ACGCCTTCAT	GCGCGAGGAG	CTCAGCCAGC	180
GCCTGGGGCT	CTCCGAGGCG	CGCGTGCAG				209

(2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 368 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis= „exon I: G310 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3:

• 9 • 9 • 999 • 9 k · > 9

9 » 9

I 9

9 9 9

9

GTGATCCACC	CGCGCGCACG	GGCCGTCCTC	TCCGCGCGGG	GAGACGCGCG	CATCCACCAG	60
CCCCGGCTGC	TCGCCAGCCC	CGGCCCCAGC	CATGGAAGAG	CTCACGGCTT	TTGTATCCAA	120
GTCTTTTGAC	CAGAAAAGCA	AGGACGGTAA	CGGCGGAGGC	GGAGGCGGCG	GAGGTAAGAA	180
GGATTCCATT	ACGTACCGGG	AAGTTTTGGA	GAGCGGACTG	GCGCGCTCCC	GGGAGCTGGG	240
GACGTCGGAT	TCCAGCCTCC	AGGACATCAC	GGAGGGCGGC	GGCCACTGCC	CGGTGCATTT	- 300
GTTCAAGGAC	CACGTAGACA	ATGACAAGGA	GAAACTGAAA	GAATTCGGCA	CCGCGAGAGT	360
GGCAGAAG					r	368

(3) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 58 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „exon III: ET45 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4:

GTTTGGTTCC AGAACCGGAG AGCCAAGTGC CGCAAACAAG AGAATCAGAT GCATAAAG (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 89 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „exon IV: G108 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5:

GCGTCATCTT GGGCACAGCC AACCACCTAG ACGCCTGCCG AGTGGCACCC TACGTCAACA

TGGGAGCCTT ACGGATGCCT TTCCAACAG •44 444

4» (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1166 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „exon : Va (Xij POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 6:

GTCCAGGCTC	AGCTGCAGCT	GGAÁGGCGTG	GCCCACGCGC	ACCCGCACCT	GCACCCGCAC
CTGGCGGCGC	ACGCGCCCTA	cctgatgttc	CCCCCGCCGC	CCTTCGGGCT	GCCCATCGCG
TCGCTGGCCG	AGTCCGCCTC	GGCCGCCGCC	GTGGTCGCCG	CCGCCGCCAA	AAGCAACAGC
AAGAATTCCA	GCATCGCCGA	CCTGCGGCTC	AAGGCGCGGA	AGCACGCGGA	GGCCCTGGGG
CTCTGACCCG	CCGCGCAGCC	CCCCGCGCGC	CCGGACTCCC	GGGCTCCGCG	CACCCCGCCT
GCACCGCGCG	TCCTGCACTC	AACCCCGCCT	GGAGCTCCTT	CCGCGGCC^C	CGTGCTCCGG
GCACCCCGGG	AGCTCCTGCA	AGAGGCCTGA	GGAGGGAGGC	TCCCGGGACC	GTCCACGCAC
GACCCAGCCA	GACCCTCGCG	GAGATGGTGC	AGAAGGCGGA	GCGGGTGAGC	GGCCGTGCGT
CCAGCCCGGG	CCTCTCCAAG	GCTGCCCGTG	CGTCCTGGGA	cCC.TGGAGAA	GGGTAAACCC
CCGCCTGGCT	GCGTCTTCCT	CTGCTATACC	CTATGCATGC	GGTTAACTAC	ACACGTTTGG
AAGATCCTTA	GAGTCTATTG	AAACTGCAAA	GATCCCGGAG	CTGGTCTCCG	ATGAAAATGC
CATTTCTTCG	TTGCCAACGA	TTTTCTTTAC	TACCATGCTC	CTTCCTTCAT	CCCGAGAGGC
TGCGGAACGG	GTGTGGATTT	GAATGTGGAC	TTCGGAATCC	CAGGAGGCAG	GGGCCGGGCT
CTCCTCCACC	GCTCCCCCGG	AGCCTCCCAG	GCAGCAATAA	GGAAATAGTT	CTCTGGCTGA
GGCTGAGGAC	GTGAACCGCG	GGCTTTGGAA	AGGGAGGGGA	GGGAGACCCG	AACCTCCCAC
GTTGGGACTC	CGACGTTCCG	GGGACCTGAA	TGAGGACCGA	CTTTATAACT	TTTCCAGTGT
TTGATTCCCA	AATTGGGTCT	GGTTTTGTTT	TGGATTGGTA	TTTTTTTTTT	TTTTTTTTTT
TGCTGTGTTA	CAGGATTCAG	ACGCAAAAGA	CTTGCATAAG	AGACGGACGC	GTGGTTGCAA
GGTGTCATAC	TGATATGCAG	CATTAACTTT	ACTGACATGG	AGTGAAGTGC	AATATTATAA
ATATTATAGA	TTAAAAAAAA	AATAGC

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1166 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 625 párů baží (E) TYP: nukleová kyselina (F) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová

9-9

99

9 9 «9 9 9 · « 9 9

9 9 9 9

99 99 9

9 9 9 « 9 9 9

999 999

9

99 • 9 • 999 (G) TOPOLOGIE: lineární (iii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „exon Vb (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 7:

ATGGAGTTTT GCTCTTGTCG CCCAGGCTGG AGTATAATGG CATGATCTCG ACTCACTGCA 60

ACCTCCGCCT CCCGAGTTCA AGCGATTCTC CTGCCTCAGC CTCCCGAGTA GCTGGGATTA 120

CAGGTGCCCA CCACCATGTC AAGATAATGT TTGTATTTTC AGTAGAGATG GGGTTTGACC 180

ATGTTGGCCA GGCTGGTCTC GAACTCCTGA CCTCAGGTGA TCCACCGGCC TTAGCCTCCC 240

AAAGTGCTGG GATGACAGGC GTGAGCCCCT GCGCGCGGCC TTTGTAACTT TATTTTTAAT 300

TTTTTTTTTT TTTTAAGAAA GACAGAGTCT TGCTCTGTCA CCCAGGCTGG AGCACACTGG 360

TGCGATCATA GCTCACTGCA GCCTCAAACT CCTGGGCTCA AGCAATCCTC CCACCTCAGC 420

CTCCTGAGTA GCTGGGACTA CAGGCACCCA CCACCACACC CAGCTAATTT TTTTGATTTT 480

TACTAGAGAC GGGATCTTGC TTTGCTGCTG AGGCTGGTCT TGAGCTCCTG AGCTCCAAAG 540

ATCCTCTCAC CTCCACCTCC CAAAGTGTTA GAATTACAAG CATGAACCAC TGCCCGTGGT 600

CTCCAAAAAA AGGACTGTTA CGTGG

625

B BB BB · BB BB ··· BBB BBBB • BBB B BBB B B B B

B B · B B B BBBB · BBB BBB BBBBBB B * (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 8: (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 15577 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP	MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
	(A)	POPIS: /popis = „HOX93
(ix)	RYSY:
	(A)	NÁZEV/KLÍČ: exon
	(B)	POZICE: 1498..1807
	(D)	JINÉ INFORMACE: /funkce = „část exonu I (G310)
(ix)	RYSY:
	(A)	NÁZEV/KLÍČ: misc_
	(B)	POZICE: 3844..4068
	(D)	JINÉ INFORMACE: /funkce = „oblast pET92 (první

část)

(ix)	RYSY:
(A) (B) (D) část	NÁZEV/KLÍČ: misc_ POZICE: 4326..4437
JINÉ INFORMACE: /funkce = )	„oblast pET92	(druhá
(ix)	RYSY:
	(A)	NÁZEV/KLÍČ: misc_
	(B)	POZICE: 4545..4619
	(D)	JINÉ INFORMACE: /funkce =	„oblast pET92	(třetí

část) (ix) RYSY:

(A) NÁZEV/KLÍČ: misc_ (B) POZICE: 5305..5512 (D) JINÉ INFORMACE: /funkce = „část exonu II (ET93) (ix) RYSY:

(A) NÁZEV/KLÍČ: mise

44

4 4

44

4 4 4

4 4 4

444 444

4 (B) POZICE: 11620..11729 (D) JINÉ INFORMACE: /funkce (G108) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 8:

„část exonu IV

CTCTCCCTGT	TGTGTCTCTC	TTTCTCTCTC	TCCATCTCTC	TCCGTCTTTC	CCCCTCTGTC	60
TCTTTCTCTG	TCTCCATCCC	TCTGTCTCTC	CCTTTCTCTC	TGTCTTTCCT	TGTCTCTCTC	120
TTTCTCTCTC	TCTCTCCATC	TCTCTCTCTC	CCGGTCTCTC	TCTCTCCATC	TCCCCGTCTC	180
TCCGTTTCTC	TCTCTGCCTC	TCCCTGTCTG	TCTCTCTCTT	TGTGTGTGTT	ACACACACCC	240
CAACCCACCG	TCACTCATGT	CCCCCCACTG	CTGTGCCATC	TCACACAAGT	TCACAGCTCA	300
GCTGTCATCC	TGGGTCCCCA	GGCCCCGCCG	GGGAGGAAGA	TGCGCCGTGG	GGTTACGGGA	360
GGAAGGGGAC	TCCGGGCCTC	CTGGTGCCCC	ACTTTATTTG	CAGAAGGTCC	TTGGCAGGAA	420
CCGTGACGCG	TTTGGTTTCC	AGGACTTGGA	AAACGAATTT	CAGGTCGCGA	TGGCGAGCAC	480
CGGCTTCCCC	TGAAGCACAT	TCAATAGCGA	GAGGCGGGAG	GGAGCGAGCA	GGAGCATCCC	540
ACCATGAAAA	CCAAAAACAC	AAGTATTTTT	TTCACCCGGT	AAATACCCCA	GACGCCAGGG	600
TGACAGCGCG	GCGCTAAGGG	AGGAGGCCTC	GCGCCGGGGT	CCGCCGGGAT	T CTGGCGCGGG	660
CGGAAAGAAT	ATAGATCTTT	ACGAACCGGA	TCTCCCGGGG	ACCTGGGCTT	CTTTCTGCGG	720
GCGCTGGAAA	CCCGGGAGGC	GGCCCCGGGG	ATCCTCGGCC	TCCGCCGCCG	CCGCCTCCCA	780
AGCGCCCGCG	TCCCGGTTTG	GGGACACCCG	GCCCCTTCTT	CTCACTTTCG	GGGATTCTCC	840
AGCCGCGTTC	CATCTCACCA	ACTCTCCATC	CAAGGGCGCG	CCGCCACCAA	CTTGGAGCTC	900
ATCTTCTCCC	AAAATCGTGC	GTCCCCGGGG	CGCCCGGGTC	CCCCCCCTCG	CCATCTCAAC	960
CCCGGCGCGA	CCCGGGCGCT	TCCTGGAAAG	ATCCAGGCGC	CGGGCTCTGC	GCTCCTCCCG	1020
GGAGCGAGGG	CGGCCGGACA	ACTGGGACCC	TCCTCTCTCC	AGCCGTGAAC	TCCTTGTCTC	1080

• 99 99 9 99 94

999 «99 9999

9 9« 9 999 9 99 9 • 9 9 9 9 9 9999 · 999 999

9499*9 9 9

999 99 99 9 99 99

TCTGTCTCTC	T C aGCAGGAA	AAC ± GGAGTT	TGCTTTTCCT	CCGGCCACGG	AAAGAACGCG	1140
GGTAACCTGT	GTGGGGGGCT	CGGGCGCCTG	CGCCCCCCTC	CTGCGCGCGC	GCTCTCCCTT	1200
CCAAAAATGG	GATCTTTCCC	CCTTCGCACC	AAGGTGTACG	GACGCCAAAC	AGTGATGAAA	1260
TGAGAAGAAA	GCCAATTGCC	GGCCTGGGGG	GTGGGGGAGA	CACAGCGTCT	CTGCGTGCGT	1320
CCGCCGCGGA	GCCCGGAGAC	CAGTAATTGC	ACCAGACAGG	CAGCGCATGG	GGGGCTGGGC	1380
GAGGTCGCCG	CGTATAAATA	GTGAGATTTC	CAATGGAAAG	GCGTAAATAA	CAGCGCTGGT	1440
GATCCACGCG	CGCGCACGGG	CCGTCCTCTC	CGCGCGGGGA	GACGCGCGCA	TCCACCAGCC	1500
CCGGCTGCTC	GCCAGCCCCG	GCCCCAGCCA	TGGAAGAGCT	CACGGCTTTT	GTATCCAAGT	1560
CTTTTGACCA	GAAAAGCAAG	GACGGTAACG	GCGGAGGCGG	AGGCGGCGGA	GGTAAGAAGG	1620
ATTCCATTAC	GTACCGGGAA	GTTTTGGAGA	GCGGACTGGC	GCGCTCCCGG	GAGCTGGGGA	1680
CGTCGGATTC	CAGCCTCCAG	GACATCACGG	AGGGCGGCGG	CCACTGCCCG	GTGCATTTGT	1740
TCAAGGACCA	CGTAGACAAT	GACAAGGAGA	AACTGAAAGA	ATTCGGCACC	GCGAGAGTGG	1800
CAGAAGGTAA	GTTCCTTTGC	GCGCCGGCTC	CAGGGGGGCC	CTCCTGGGGT	TCGGCGCCTC	1860
CTCGCCACGG	AGTCGGCCCC	GCGCGCCCCT	CGCTGTGCAC	ATTTGCAGCT	CCCGTCTCGC	1920
CAGGGTAAGG	CCCGGGCCGT	CAGGCTTTGC	CTAAGAAAGG	AAGGAAGGCA	GGAGTGGACC	1980
CGACCGGAGA	CGCGGGTGGT	GGGTAGCGGG	GTGCGGGGGG	ACCCAGGGAG	GGTCGCAGCG	2040
GGGGCCGCGC	GCGTGGGCAC	CGACACGGGA	AGGTCCCGGG	CTGGGGTGGA	TCCGGGTGGC	2100
TGTGCCTGAA	GCCGTAGGGC	CTGAGATGTC	TTTTTCATTT	TCTTTTTCTT	TCCTTTCCTT	2160
TTTTTGTTTG	TTTGTTTGTT	TGTTTGAGAC	AGAGTCTCGC	TCTGTCCCCC	AGGCTGGAGT	2220
GCAGTGGTGC	GATCTCGGCT	CACTGCAACC	TCCGCCTCCT	GGGTTCAAGC	GATTCTCCTG	2280
CCTCAGCCTC	CCCAGTAGCT	GGGATTACAG	GCATGCACCA	CCACGCCTGG	CTAATTTTTG	2340
TGCTTTTAGT	AAAGACGGGG	ATTCACCATG	TTGGCCAGGC	TGGTCTCGAA	CTCCTGACCT	2400
CAGGTGATCC	ACCCGCCTCG	GCCTCCCAAA	GTGCTGGGAT	GACAGGCGTG	AGGCACCGCG	2 4 60
CCCGGCCTGG	GTCCTGACGG	CTTAGGATGT	gtgtttctgt	CTCTGCCTGT	CTGCCTTGTA	, 2520
TTTACGGTCA	CCCAGACGCA	CAGAGGAGCC	GTCTCCACGC	GCCTTCCCAG	CGCTCAGCGC	2580
CTGCCGGGCC	CCCGGAGATC	ACGGGAAGAC	TCGAGGCTGC	GTGGTAGGAG	ACGGGAAGGC	264 0
CCCGGGTCAG	CTCGGTTCTG	TTTCNCTTTA	AGGAACCCTT	CATTATTATT	TCATTGTTTT	2700
CCTTTGAACG	TCGAGGCTTG	ATCTTGGCGA	AAGCTGTTGG	GTCCATAAAA	ACCACTCCCG	2760
TGAGCGGAGG	TGGCCGGGAT	CTGGATGGGG	CGCGAGGGGC	CCCGGGGAAG	CTGGCGGCTT	2820
CGCGGGCGCG	TCCTAAGTCA	AGGTTGTCAG	AGCGCAGCCG	GTTGTGCGCG	GCCCGGGGGN	2880
AGCTCCCCTC	TGGCCCTTCC	TCCTGAGACC	TCAGTGGTGG	GTCGTCCCGT	GGTGGAAATC	2940
GGGGAGTAAG	AGGCTCAGAG	AGAGGGGCTG	GCCCCGGGGA	TCTCTGTGCA	CACACGACAA	3000
CTGGGCGGCA	TACATCTTAA	GAATAAAATG	GGCTGGCTGT	GTCGGGGCAC	AGCTGGAGAC	3060

• 00 00 • · · 0 0

0 0 0 * 0 • · 0 0 0 0

0 0 0 0

0 0 0 0 00 ·· • · 0 · • · 0 · • 00 · · · 0

0 0

00 00

GGCTATGGAC	GCCTGTTATG	TTTTCATTAC	AAAGACGCAG	AGAATCTAGC	CTCGGCTTTT	3120
GCTGATTCGC	AAAGTTGAGG	TGCGAGGGTG	AATGCCCCAA	AGGTAATTCT	TCCTAAGACT	3180
CTGGGGCTAC	CTGCTCTCCG	GGGCCCTGCA	TTTGGGGTGT	GGAGTGGCCC	CGGGAAATAG	3240
CCCTTGTATT	CGTAGGAGGC	ACCAGGCAGC	TTCCCAAGGC	CCTGACTTTG	TCGAAGCAGA	3300
AAGCTGTGGC	TACGGTTTAC	AAAGCAGTCC	CCGGTTTCTG	ACCGTCTAAG	AGGCAGGAGC	3360
CCAGCCTGCC	TTTGACAGTG	AGAGGAGTTC	CTCGCTACAC	ACTGCTGCGG	GCACCCGGCA	3420
CTGTAATTCA	TACACAGAGA	GTTGGCCTTC	CTGGACGCAA	GGCTGGGAGC	CGCTTGAGGG	3480
CCTGCGTGTA	ATTTAAGAGG	GTTCGCANGC	GCCCGGCGGC	CGCTTCTGNT	GGGGTTGCTT	3540
TTTGGTTGTC	CTTCNGCAAA	CACCGTTTTG	CTCCTCTNGN	AACTCTCTCT	TNCTCCCCCN	3600
TGGCCNGTNG	GACCCGGGNA	NGAGCAAAGT	GTCCTCCAGA	CCNTTTTGAA	ANGTGAGAGG	3660
AAAATAAAGA	CCAGGCCAAA	NNGACCCAGG	GCCACAGGAG	AGGAGACAGA	GAGTCCCCGT	3720
TACATTTTNC	CCCTTGGCTG	GGTGCAGAAA	GACCCCCGGG	CCAGGACTGC	CACCCAGGCT	3780
ACTATTTATT	CATCAGATCC	AAGTTAAATC	GAGGTTGGAG	GGCAGGGGAG	AGTCTGAGGT	3840
TACCGTGGAA	GCCTGGAGTT	TTTGGGNAAC	AGCGTGTCCC	CGCCGAGCCT	GGGAGCCCGT	3900
GGGTTCTGCA	AAGCCTGCGG	GTGTTTGAGG	ACTTTGAAGA	CCAGTTTGTC	AGTTGGGCTC	3960
AATTNCCTGG	GGTTCAGACT	TAGAGAAATG	AAGGAGGGAG	AGCTGGGGTC	GTCTCCAGGA	4020
AACGATTCAC	TTGGGGGGAA	GGAATGGAGT	gttcttgcag	GCACATGTCT	GTTAGGAGGT	4080
GAAACAGAAT	GTGAAATCCA	CGTTGGAGTA	AGCGTCCAGC	GCTGAATGTA	GCTCGGGGTG	4140
GGGTGGGAGG	GCCCTGGTGT	GGATCGTGGA	AGGNAAGAAA	GACAGAACAG	GGTGCTAGTA	4200
TTTACC.CCGT	TNCCCTGTAG	ACACCCTGGA	TTTGTCAGCT	TTGCAAGCTT	CTTGGTTGCA	4260
GCGGCCTTGC	CTGTGCCCCT	TTGAGACTGT	TTCCAGACTA	AACTTCCAAA	TGTCAGCCGC	4320
TTACCCTTGA	CAGCAAGGGA	CATCTCATTA	GGGCATCGCG	TGCTTCTCAT	CTGTGNCTCA	4380
GCAGGCCCNG	AGATAGG/vAN	CANGAGGGGC	NGTTGGNAGA	TGCNCACTTC	CACCAGCCCT	4440
GGGNTTGAAG	GGGANGCGAN	GGGANGACNA	CCTTTTANCT	TAAACCCCTN	GAGCTTGGTN	4500
CAGAGAGGNC	TGAATGTCTA	AAATGAGGAA	GAAAAGGTTT	TTCACCTGGA	AACGCTTGAG	4560
GGCTGAGTCT	TCTGGCCNTT	CTGACNTCCC	CCAGCAAATA	CAGACAGGTC	ACCAANCTAC ř GACCGCGTGT	4620
TGGAGATGAG	AAAGTGCCAT	TTTTGGCACA	CTCTGGTGGG	GTAGGTGCCC	4680
GAAAAANGTG	GGAANNGGAG	AGATTTCTGN	CGCACGCGGT	TCAGCCCCCA	GGCGCGGNTG	4740
GCNGCATTCN	AGGNTACTCA	GACGCGGTTC	TGCTGTTCTG	CTGAGAAACA	GGCTTGGGGT	4800
AGGGGCTCCT	AGCTCCGCCA	GATCGCGGAG	GGACCCCCAG	CCCTCCTGCG	CTGCAGCGGT	4860
GGGGATAGCG	TCTCTCCGTA	GGCCTAGAAT	CTGCAACCCG	CCCCGGGTCC	TCCCCGTGTC	4920
CTTCCCGGGC	GTCCCGCCGG	GGATCCCACA	GTTGGCAGCT	CTTCCTCAAA	TTCTTTCCCT	4980
TAAAAATAGG	ATTTGACACC	CCACTCTCCT	TAAAAAAAAA	AAATAAGAAA	AAAAGGTTAG	5040
GTTATGTCAA	CAGAGGTGAA	GTGGATAATT	GAGGAAACGA	TTCTGAGATG	AGGCCAAGAA	5100

9 9 9 9 • 99 9« • · ♦ · · • »99 · · • · 9 9 9 9 • 99 · 9 «

999 99 99 9

99

9 9 9

9 9 9

999 999

9

AACAACGCTC	GTGCAAAGCC	CAGGTTTTTG	GGAAAGCAGC	GAGTATCCTC	CTCGGCTTTT	5160
GCGTTATGGA	CCCCACGCAG	TTTTTGCGTC	AAAGCGCATT	GGTTTTCGAG	GGCCCCCTTT	5220
CCACCGCGGG	ATGCACGAAG	GGGTTCGCCA	CGTTGCGCAA	AACCTCCCCG	GCCTCAGCCC	5280
TGTGCCCTCC	GCTCCCCACG	CAGGGATTTA	TGAATGCAAA	GAGAAGCGCG	AGGACGTGAA	5340
GTCGGAGGAC	GAGGACGGGC	AGACCAAGCT	GAAACAGAGG	CGCAGCCGCA	CCAACTTCAC	5400
GCTGGAGCAG	CTGAACGAGC	TCGAGCGACT	TTTTGACGAG	ACCCATTAGC	CCGACGCCTT	5460
CATGCGCGAG	GAGCTCAGCC	AGCGCCTGGG	GCTTTCCGAG	GCGCGCGTGC	AGGTAGGAAC	5520
GCGGGGGCGG	GGGCGGGGGG	CCCGGAGCCA	TCGCGTGGTC	CTCGGGAGCG	CACAGCACGC	5580
GTACAGCCAC	CTGCGCCCGG	GCCGCCGCCG	TCCCCTTCCC	GGAGCGCGGG	GAGGTTGGGT	5640
GAGGGACGGG	CTGGGGTTCC	TGGACTTTTG	GAGACGCCTG	AGGGCTGTAG	GATGGGTTCA	5700
TTGCGTTTGT	TTTTCACCAA	CAGCAAACAA	ATATATATAC	ATATATATTA	TACAAATAAC	57 60
ΑΑΑΤΑΑΑΤΑΤ	ATATGTTATA	CAGATGGGTA	TATTGTATAT	ATTATAGATA	TTTGTTCGTC	5820
CTTGGTGCAA	AGACACCGGG	TGAACCCATA	TATTGGCTCC	TGACTGCCTT	CGGTTCCCCT	5880
GGGATTGGTT	ATAGGGGGAA	CACATGCAAA	CAAAACTTTC	CCTGGATTAT	ACTTAGGAGA	5940
CGAAGCTACA	GATGCGTTTG	ATGCAGAGTG	TTTTACAAGA	TTTTTCATTT	AAAAAAAAAT	6000
GTGTCTTTTG	GCCCCTGATT	CCCCTCCGTC	TTCCCGTGTG	GCTGCATTGA	AAAGGTTTCC	6060
TTAGGATGAA	AGGAGAGGGG	TGTCCTCTGT	CCCTAGGTGG	AGAGAAACAG	GGTCTTCTCT	6120
TTCCTCCGTT	TTTTCACCTA	CCGTTTCTAT	CTCCCTCCTC	CCCTCTCCAG	CCCTGTCCTC	6180
TGCTACAAAC	CACCCCCTCC	TCCCTCCGGC	TGTGGGGAGC	GCAGGAGCAC	GTTGGGCATC	6240
TGGATGAGCG	GNAGACTATT	AGCGGGGCAC	GGGGGCTCCC	cgaggagcgc	GCGAATTCAC	6300
GCTGCCCCAT	GAGACCAGGC	ACCGGGGGGC	GGAGGGGCCT	TGGGTGTCCG	CAGAGGGACG	6360
GGCGGGCAGA	GCCTTCCTCC	GCATTCTAAA	CATTCACTTA	AiAGGTATGAG	TTTANTTTCA	6420
GGGGTGCTGC	TGGGAGAGCC	TCCAAATGGC	TTCTTCCAGC	CCCTGCCTGA	CAGTTCAGCT	6480
CCCCTGGAAG	GTCAACTCCT	CTAGTCCTTT	CTCCTGGTTC	TGGGCAGGAC	AGAAGTGGGG	6540
GGAGGGAGAG	AGAGAGAGAG	AGAGAGAGAG	ACGGTCAGGA	TCCCCGGACC	CTGGGGAACC	6600
CGTCAAAAAT	AAATGZvAATT	AAGATTGCCG	ACCAGAG/aGA	GAACCGTGAC	AAAGCAAACG r	6660
GCGTTCAAAG	CAAAGAGACG	AACTGAAAGC	CCGTTCCCGT	AGGACTGGTT	ATGAGGTCAA	6720
CACATTCAAA	CACAGCTTGC	TCTGGATTTT	GCTGAGCAGA	GGAAGATACA	GATGCATTTG	67 80
ATCCAAAGTG	TGTTACATCT	TTCATTATAT	GTGTGTCTAT	ATATATAAAC	ATATATAAAT	6840
ATATAAACAT	ACATAAATGT	ATGTAAATAT	ATATAATCTA	TATACATATA	ΤΑΑΑΤΛΤΑΤΑ	6900
AACACATATA	TAATATATAA	ATCTATAAAC	ΑΤΑΤΑΤΛΑΤΑ	TATAAACATA	AATATATAAA	6960
CATATATAAT	ATATAAATAT	ATTAACATAT	ATAAAATATG	ΤΑΤΛΑΑΤΑΤΑ	TATAAACATA	7020
TAAACATATA	ΤΑΑΑΤΛΤΑΤΑ	AACATATAAA	TATATAAACA	ΤΑΤΛΤΑΑΑΤΑ	TATACAAACA	7080

• 44 ··

4« 4 · ·

4444 4 ·

4 4 4 4 4

4 4 4 4

444 44 ·· '·»>

4 4 4

4 4 4

444 444

4 4

44 4 4 • · 4444

TATTGTATAT	ATATAAATAT	ATATAAAAAC	ATATATATAC	ATATAAAAAT	ATATATAAAC	7140
ATATATACAT	ATAAAGAAAT	ATATATAAAC	ATATATACAT	ATAAATATAC	ATATATAAAC	7200
ATATATATAC	ATAAAATATA	TATAAACATA	TATACATATA	AAAATATATA	TATATTAACA	7260
TATATATACA	TATAAAAATA	TATATATTAA	CATATATATA	CATATAAAAA	TATATATATA	7320
TTTTTGGCCC	CTGATTCCCT	TCGGTTCCTG	TGGGATGGGT	GATTGAGTCA	ACACATTCAA	7380
ACACAACTTT	TCCATCGATG	TTGCTTAGGA	GATGAGGATA	CAGATGCGTT	TGATGGAGAG	7440
GGTTTTACAA	GCTCTTTCAT	TTAAATATAT	ATATATATAT	ATATATATTT	TTTGGCTCCT	7500
GATTCTCTTC	CGTCTTCCCA	TGTGGCTGCA	TTTTAAAAGG	CTTCCCTAAG	ATCGTTACGA	7560
TTAAATCAAC	CCTCCCCAGG	CATCTTTACC	GAGGGCTGTG	GTCCCCAAAG	CGATACAGCC	7620
CAGGAGGGAG	AGAGGCTTTG	GTGACTTGGA	GGAAGGACTG	TGTCCCTCCT	TAGGGCGTCT	7680
GTGGCCTCAG	TGAGGGAAGG	AAGCTGCATC	AGACAGGGGT	TTCCTCGCTG	TCCACCCCTC	7740
TGGGAGAAGA	TGGATTGGGC	TGCCCCGNTA	TAAATTAATG	AAAAGATTAA	AGTTTCGCTA	7800
AAGGGGACAT	CGAGTTTATG	TGTCATCTCC	TGGTGNTCTG	TGTGCCNTGG	GATNCTGCAA	7860
TATATCCCAN	NGCCCTTGAT	GNNNTACTGT	TTNCTATAAA	ΑΑ1ΊΝΤΑΑΑΤΝ	TACTTGTNNA	7920
ATTTAANTTC	CNNNACACTA	TTTNCTTTCC	NNGTNAGTCT	NATTANCCGA	NCGAGAGCAN	7980
CGNTTAGTTN	CAGCTNGCGG	AAAATTGGTT	GTGGGGTGTG	TGCGGACCCC	NGAGNAACGC	8040
CCNNTAAAAT	NAAAGACAAA	NTCNGGGGAC	AAGNCTNGGG	GGTTATCGNN	ATTGCNNAGG	8100
GGTCGNCATG	AAAANTTTAA	CGACGGTAAA	TAATAATAAA	AANNCAAACA	TGGGAATGNC	8160
AATAAAAGAC	ATAATTCTCC	NNATCSCCGC	GG<jvjtG\jAAAG	GATCCTATAG	TAAAGGCGAG	8220
TGCGCTTTGA	GGGGTCATAA	AAATCAATTA	GTTCCAACAC	CCACGTCCCG	CGTTGAGGGG	8280
acggggacga	GCAGGGACAG	AAAAAGAAAC	CATATTTGAA	TCCCATCTCT	CTGTGAATTC	8340
TTGGGTCACA	TGCGTCTCAG	TACAGCCCGT	CCCGTGCTGT	GACCGGATAG	AGTTTCAATT	8400
TACTGTGGAA	ATTTGCTGTA	AATAAATTGA	GCATCCGATA	GAAGCTGŤTG	CTGATTAACC	8460
TTTTATTTTT	AGCGTGGCCC	TGCAAAGTCG	TATCACCCAG	CTGTCAGGCT	TCTAATCGAA	8520
AGTTATGAGA	CC.ACGGTGAG	GGGCAGGCGG	ΤΑΑΤΪΤΑΑΤΤ	ACAACAAATA	TCTTTGGGTT	8580
TATGGCGCAG	AGCTAAATTA	AATGTCATTA	TTCACTGTCT	GTNAATGGNA	AATCAAAANN r TTTAATNGAA	8640
GGAAATCGCA	NTTACGGNCA	TTTGGGNNAA	ANGAAAGCGG	GGNAGTGCTC	8700
NNGAAATAAC	TGTCTTAAGC	AGTGTCACAC	ACTTCACTTA	CCATATTCGN	GGCCTNAATT	8760
GGAANNTGGA	TCGTNNGAAT	CACTCCNAAG	ACTNGATTTA	TTANGCGCTT	CACGNCAGCN	8820
NGGCNTAATT	CATCNACTTN	NGTATTCTTC	ATCNNNNATT	TTTTTTTTTC	CTCTCNNGCC	8880
GTGTTNNGAA	GGGAGAGTGA	ATGAGGCTTT	CCACGTTTCA	GGAGGATTTT	CTTTTTTGAA	8940
AAATGCCCTT	CCAGAGGCTT	TTGGGTGGCT	GGCTTGCTTT	CTGGGCCCTG	GAGGANGACA	9000
GGCGGANGAG	TCCAGGTGGG	CATGGAGAGG	CACAGTGGCA	GGTCACCTGG	ATGGTCAGTG	9060
GAGGTGGAGG	TCTGAAGGCG	CCAGCTTTGG	AAATTATTGG	TGAATTTCGA	TGTCAGCACC	9120

• ·4 ·

• 444 ·· r ·

4 4

444 44 ♦

4

4

4 • · 4444 • 4

4

4

444

4

4

444

AGGNCAGGGG	CCTTTTTGGC	GGGGGTGTGA	GGGANGGATG	ANCTTTGCTG	GGAAANNCAG	9180
GATCAGGTTC	TCCAGGCGCA	CTGCAGCCCG	GTAGGACCCA	CTTTGGAAAT	GAAAAGCCAG	9240
TTNCCGAAAG	CTGGGCTGGA	AGCTTCCGTG	TTGGGTTCAA	GAGCAAGTTC	ACGTTGCGCT	9300
GTGTAGACTC	CTGGCTGCTC	CCAAACTCTG	AGGGTTTTCT	GAGGTTCCCT	TCATAGGGGC	9360
ACCGGCCCTG	GGCCATGCAC	AGTGCGTAAG	GGTGGCTGTG	GGCCGAGGGA	CCCAGCACGT	9420
GTTTTGCCCA	CAACAGCCGG	AGTGACTGGT	TCACTCACCG	CCTTGGCGGA	GGACGCCTGT	9480
TCTCTGGACG	AATCATTTCT	CTTGGGTGGT	GACTGCCTTG	TGGGTCAAGG	TGCAGGTTTT	9540
CTGCCACAGA	AAACCTGTTA	GGAGGAATTA	AGCGACTAAG	ACTGTCAGGG	AGGTGGTGGT	9600
GGGGGANGAG	GNAGGGGGTG	GTGTCCAGAT	TACCAGGCAT	AGGCTAAACT	GCCTGCACTC	9660
TCCAGCTGGT	CTGTCTGTGG	AGGAGGGGAT	TGTCAATACT	GGGAGAGCAG	AGGAGGCTCG	9120
TAGGAGGTGA	GAGGGGGTGG	AATTTGCATG	CAAATCTTCA	CATGAGGCCT	GTGTGAATTT	9780
CTCCAGCCTC	CTGAGGGTCC	CCTGCGCTAT	TGCACTCAAC	TTCTTGATAG	TTTACCCCAA	9840
GACTCAGAAG	TCCTTAGAGG	GGCAGAATGC	CCCCACCACA	AAGCCTGCTA	TCCTTGGGCG	9900
TCCTCAGGAC	CCTTGGTCAT	GAATGGGACC	CTTTCATGTA	TGGGGACCCT	TGGTAATATG	9960
AATGGGACGC	CTTCAGCTCC	CCAGGGCTTC	CGAGGAGGCC	GAGAAGGGCA	AAGACACTTC	10020
CGAGGAGGCC	GAGAAGGGCA	AAGACATTTT	CTGGGCTTGG	TGTGTCAAGA	GCTAGATTGG	10080
AGAAGGGGCT	GGATTTGGAA	CTCTTTAGCC	ATCAGCTCAC	CCTCTCCGTT	TGTGGCTAAA	10140
GTCTGAAGGT	GGAAACTTCG	GTTCTCCTAC	AGGGTCTACA	GGAGTTGGGG	GGCGGGGCGC	10200
CCACACAGAA	CGCTGGAAAG	TTCGACAGTC	CACTTCCACT	GGCTCGGAAC	TCACTTTTTC	10260
ACCTTAAGTT	CATCAGCGGT	AACGCATAGG	TCTCACTTAG	GCAGGGCACG	GATGATTTAA	10 320
CAATTTCTAC	TTCTAGGTCA	GGTGCGGTGG	CTCACACCTC	TAATCCCAGC	ACTTTGGGAG	0380
GCCCAGGAGG	GTGGATCGCT	TGAGGTCAGG	AGTTTGAGAC	CAGCCTGGCC	AACATGGTGA	10440
AACCCCGTCT	CTACTAAAAT	ACGAAAATTA	GCCAGGCATG	GTGGTGAGCA	CCTGTAATTC	10500
CAGCTACTCG	GGAGGCTGAG	GCAGGACAAT	CGCTTGAACC	TGGGAGGTGG	ACGTTGCAGT	10560
GAGGTGAGAT	CACACCACTG	CACTCCAGCC	TGGATGAGAG	AGCAAGACTC	TGTCTCAAAA	10620
ACAAAATAAA	ACAAAAACAA	AACAAAAATC	AAAAAAGAAA	ACCCAATTTC	CAGTTCTAGG	10680
CCAGGTGCAG	TGGCTCACGC	CTGTCATCCC	AGCACTTTGG	GAGGCCCAGG	AGGGTGGATC	10740
GCTTGAGGTC	AGGAGTTCGA	GACCAGCCTG	GCCAACATGG	TGAAACCCCA	TCTTTACTAA	10800
AAATACAAAC	GTTAGCTGGG	TGTGGTGGTG	TGCGCCTGTA	ATCCCAGCTA	CTCGGGAAGC	10860
TGAGGCTGGA	GAATTGCTTG	AATCTGGGAG	GTGGAGGTTG	CAGGGAGGCG	AGATAGTGCC	10920
ACTGCAGTCC	AGCCTGGACC	AGAGAGCAAG	ACTCCGTCTC	AAAAACAAAA	GAAAGCAAAA	10980
ACAAAAAACA	AGAGACCAGC	CTGGCCAACA	TGGTGAAACC	GCGTCTTTAC	TAAAATACAA	11040
AATTAGCCGG	GCATGGTGGT	GGGCACCTGT	AGTCCCAGCT	ACTCGGGAGG	CTGAGGCAGG	11100

• φ • φ

			54	Φ	1 Φ Φ Φ · · ·	•
AGAATGGCTT	GAACCTGGGA	GGTGGAGCTT	GCAGTGAGCC	GAGATAGTGC	CACTGCACTC	11160
CAGCCTGGGC	GACAGAGCGA	GACTTGATTT	CAGAACCACC	ACCACCACAA	CAAAACAAAA	11220
CAAAAAATCC	AAAAAAACCC	CAATTTCCAG	TAGTAGGTAG	TCAGTGATGC	AGGGCTGGAG	11280
ACAGAGGGGC	GGTAAGTGTC	TGGGCGCCCA	CCATCAGTCA	CCTCCCAGCT	CCCANGAGGT	11340
GCAAAGTGCT	TGGTTCAGCC	TCATGGGAAG	GATGCTCCCT	GGGGAGGCTG	GGCTGGGTTC	11400
ACAGGGCTCT	TCACATCTCT	CTCTGCTTCT	NCCCCAAGGT	TTGGTTNCCA	GAACCGGAGA	11460
GCCAAGTGCC	GNCAAACAAG	AGAATCAGAT	GCATAAAGGT	GGGTGTCGGG	ACTGGGGGGA	11520
CCTGAAGCTG	GGGGATCCTG	GTCCAGGAGG	GATGGGGTCG	ACAAGGTGCT	GGCTACACCC	11580
AGGACCACCA	CACTGACACC	TGCTCCCTTT	GGACACAGGC	GTCATCTTGG	GCACAGCCAA	11640
CCACCTAGAC	GCCTGCCNGA	GTGGCACCCT	ACGTCAACAT	GGGAGCCTTA	CGGATGCCTT	11700
TCCAACAGGT	AGCTCACTTT	TTCTTCCTCT	GNAAGATCCC	TAGGGACCTG	CTGCTCCCTT	11760
CCCCTTTCCC	CTATTTGCTG	CCGCATCGTG	ACACTCCTAG	TCCCTCCCTG	CCCCTGCAGA	11820
CTTCTCAGCT	GGCCCTTAGA	AAAAAAGCCT	CTTTTCCGAG	GAGGCATTTA	CAGGCACCTT	11880
GGCACCTATG	AAATCAGGCT	GGGCCAGGCG	GGGTGGCTCA	CACCTGTCAT	CCCAGCACTT	11940
TGGGAGGCCA	AGGTTAGGAG	TTTGAGACCA	GCCTGGACAA	CATAGCAAAA	GCCTGTCTCT	12000
ACTAAAAATA	CAAAAAAAAA	TTAACAGGGA	GTGGTGGTGG	GCACCTGTAA	TCCCAGCTAC	12060
TTGGGAGGCT	GAGGCAGGAG	AATCACTTGA	ACCCGGGAGG	CCGAGGTTGC	GGTGAGCCGA	12120
GATCGTGCCA	TTGCACTCCA	GGCTGGGCGA	CAGAGTGAGA	CTCTGTCTCA	AAAAATAAAT	12180
ΑΑΑΤΛΛΑΤΑΛ	ATGTAAAAAA	ATAAAAATAG	GTCGGGCACG	GTGGCTCACG	TCTGTAATCC	12240
CAGCACTTTG	GAAGGCCGAG	GTGGGTGGAT	GACAGGGTCA	AGAGATTGAG	ACCATCCTGG	12300
CCAACATGGC	AAAATGCCGT	CTCTACTAAA	AAATACAAAA	ATTAGGCGGG	CGTGGTGGCG	12360
.GGTGCCTGTA	ATCCCAGCTA	CTCGGGAGGC	TGAGGCAGGA	GAATCGGTTG	AACCCGGGAT	12420
GCGGAGGTTG	CAGTGAGCGG	AGATCACATC	ACTGCACTCC	AGGCTGGGCA	ACAAGAGCGA	12480
AACTGCGTCT	TACAATAAAT	AAATAGATAA	ATAAATAAAC	AAATAAACTT	TACTTTAGAA	12540
ACAAATCCCT	GTCCGTGTTT	GTCTTTTCAC	CTGTCCTGCA	GGGAAAACAA	AACATAAAAT	12600
GTCAAGGCAA	ATAGTAGTG/3	TTTCATTCCG	GGAAAAAGAA	AGTGGATGTT	TGCCTTCACC	12660
ctttctcgtc	CTTCCTCTGG	TGCTCCTCAN	GGCCCANGGG	NAGAGGGTGG	AAAGTNCAGA	12720
GGAAGAAAGA	CGGGGCTGGG	GGGGGGGGTC	CGTGGGGACC	CAGGCAGGCA	TGTTCCCNAT	12780
TTCCNTGTCT	TCACNTTCAA	AGNAGGGGCC	CCTCGNCTCT	GGAATGAGGC	CTACGGTTTC	12840
CTTTCCCNGA	AGAGTTNCCC	CTTTGTGAGC	TTACGGCTTC	GGAGTGAACC	TCGGTGCAAC	12900
CTGTTATTAA	AACACACAGA	GGCTAATGCC	AGCAAAAACA	CGCCCCCCGC	TCCTGGTTTC	12960
AGAGGGAAGA	AAAAAATTCA	TAAGCACGGC	CATGCTTTTC	TAATAAAAAT	TCATTAAATA	13020
ATCGTTATAA	GGGATGAAGC	CGGGAGGGGA	GAGGAGAGGA	ACACAATCAA	GAGACTTTCT	13080

TTGAACTTTT TCTCCCTGCT TCAAATACAA AGCAATCTTC TGTGGGCCTG GGCCTGGGGG 13140 • ·

GTTTCCCCCT	TTCTCTGCAG	CCCATTGGGA	GGAAGAAAAT	GCTTCCCTGA	ANGTTGCTGC	13200
AAAATTGTTT	CTGTTTTTCT	TTTCTTTTTC	TTTTTTTTTT	TTTTTTGAGA	CGGAGTCTCG	13260
CTCTGTCACC	AGGCTGGAGT	GCAATGGTAT	GATCTCAGCT	CACTGCAACC	TCCACGTTCC	13320
TGTTTCAAGT	CATTCTCCTG	CCTCAGCCTC	CTGAGTAGCT	GGGACTACAG	GCGCCCGCCA	13380
CCACGCCCGG	CTAGTGTTTG	TATTTTTAGA	AAAGACAGGG	TTTCCCCATG	TTGGCCAGGC	13440
TGGTCTTGAA	CTCCTGTCCT	CAAGTGATCT	GCCTGCCTCG	GCCTCCCAAA	GTGCTGTGTT	13500
TCTGTTTTTC	TTTCCCCGCT	TTCTTAGGAG	GCCATCGGGA	AGAATAAAAT	GCTTTCCTTG	13560
AAGTTGATGC	AAAATTGTTT	CTGTTTTTCT	TTTCTCTTTT	CTTTCTTTTT	GAGATGGAGT	13620
CTCGCTCTTT	CACCCAGGCT	GGAGGGCAGT	GGCGCGACCT	CGGCTCACTG	CAACCTCCGC	13680
CTCCCGGGTT	CAAGCGATTC	TCCTGCCTCA	GCCTCCGGAG	TAGCTGGGAT	TACAGGCACC	13740
TGCCAGTATG	CCTGGCTAAT	TTTATTATTT	TTAGTAGAGA	CGGGGTTTCA	CCATGTTGGC	13800
CAGGCTGGTC	TCAAACTCCT	GACCTCAGGT	GATCCGCCCG	CCTCGCCTCC	CAAAGTGATG	13860
GGATGANCAG	GNCATNGAGC	NCACCGTGCC	CGGCCCTCTA	ACTCTTTACC	AGACATAAAG	13920
TCTCCNNTTC	CCCTTTCTAA	ATGTATATAT	TGTGTTTTTA	AAAGTTAACA	GCAGGGATCC	13980
CACCTCATTN	CCCCGCTNCT	CTCCCCAAGA	CCTGTCCTGC	ACGTTGCACA	CAGCAGGTGT	14040
GCCCTGGACA	TATCCCAAAC	CCACGCTGAA	AGAAAGAGGG	TCTCACTACA	CGTATGATAT	14100
CTGTGNATCC	TTTAAACATC	TCCGTGGCTT	CCAGGCAACA	CAGCCATAAA	TAGGAATCTC	14160
ATGTCTGACA	TGATACCGGG	ACCATGTATG	GGNAAATTCT	GGGTGTGAAG	TTCCAGCTAC	14220
CCCCGCAGAG	GCANCCATTG	CATACCCTCC	AGAAACTCCC	CTGCCGTTNC	AAGCCAAAGA	14280
CACAACACAA	ACAGCNTCCG	AGAGAGGGTG	TCATTGAAAA	TCAATACCAT	CATAAGAGCA	14340
CACAGCACCG	TCTTTCTCTT	CTGCCCGTTG	ATACACAATT	ATGAGCAATT	TGCTAACACT	14400
GACAACTCGT	GGCAAGAACA.	GGTCGTGTTG	ATACGGTTGC	CTCGTGAGGA	CCCATCTGTC	14460
TTCTGGGGTC	TTGCCTGGAA	CGGAGATCGG	AGTTCAGGGT	GGCTAATAGA	ATCATTACTC	14520
ACCTAGGGAC	ACAGAATNAT	GAGGGTTACC	CCCAGTTAAG	TGCATACAGT	CAAACGGACG	14580
GCTGCTCTGG	AAGGTACAGT	GACGTGAACA	GCTTTTATGA	AATGCCTAGA	TCTGGACCTT	14 640
CCATACCTGA	GCCACCGTTC	CAAAGCACTG	GGCGTTTTTC	AGATACTTTC	ATGAGAA7ÝTG	14700
TTGTCAACAC	CGCAAGTTTG	CAGTACACAG	TCTGAAAGAT	ATTCTTGTAT	ATGTAGATGT	14760
CTGTAGATGC	CCTGAAGGTG	TGTAGACTTT	AGACACCCAG	AAGGTGTGTA	GATGTCTGTA	14820
GACACCTTCT	ATGTGTGTAG	ATGTCTGTAG	ACGCCCTGCA	GGTGTGTAGA	TATATCTAGA	14880
TGGTCTGCCT	GTGTATGATA	CACGCTAAAA	AGACATTTGT	GGTGGACACT	AGTTGATTAT	14940
TTAGGACTAT	GAGATGGGAA	AGGAAGNAGC	AACCAGCAGT	GAAAGGCATG	TGGTGGGTGG	15000
GGGGTTGGCA	TTGCAGTGGG	GTCCTCNTGA	NGCAGGTGAC	ACCCACTATA	GGGCTGCCCT	15060
TGGNATGGAC	gctttgtnga	AGCTGTTTGA	TTTCACCACA	CCAAGCCTGG	AGGCACGGAC	15120

			56		• · 9 · • · · · * • · « · « • » · « • · · · ·	• » • · · • · · · · • · • · «
ATTCCAGGAT	GGTGAGGAGT	CTGCAAAGGA	GGAGATTGGA	GGAGGTG£AA	TATCCCTAGA	15180
GTACGAGAGA	TGAGATAGGA	GAGCTGTATA	AATAGCACTA	CCAGCCGGAT	GCGGTGGCTC	15240
ACGCCTGTCA	TCCCAGCAGT	TTAGGAGGCT	GAGGCAGGCG	GATCACCTGA	GGTCAGGAGT	15300
TCCAGAACAG	CCTGGCCAAC	ACAATGAAAC	CCGATCTTTA	CTAAAAATAC	AAGATTAGCT	15360
GGGCACGGTG	TCTCACGCCT	GTCATCCCTG	CACTTTGGGA	GGTCGAGGTG	CGOAGATCAT	15420
GAGGTCAGTT	TGGCCAACGC	GGCGAAACCC	CGTCTCTACT	AAAAATACAA	AAAAGTAGCC	15480
GGGCGTGGTG	GTGGGCACCT	GTAGTCCCAG	CTACTAGGGA	GGCTGAGGCA	GGAGAATCGC	15540
TTGAACCCGG	ATGCGGACAT	TGCAGTGAGC	CGAGATC			15577

(2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 753 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „segment genu ET92 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 9:

CGTGGAAGCC	TGGAGTTTTT	GGGAACAGCG	TGTCCCCGCC	GAGCCTGGGA	GCCCGTGGGT	60
TCTGCAAAGC	CTGCGGGTGT	TTGAGGACTT	TGAAGACCAG	TTTGTCAGTT	GGGCTCAATT	120
CCTGGGGTTC	AGACTTAGAG	AAATGAAGGA	GGGAGAGCTG	GGGTCGTCTC	CAGGAAACGA	180
TTCACTTGGG	GGGAAGGAAT	GGAGTGTTCT	TGCAGGCAGA	TGTCTGTTAG	GAGGTGAAAC	240
AGAATGTGAA	ATCCACGTTG	GAGTAAGCGT	CCAGCGCTGA	ATGTAGCTCG	GGGTGGGGTG	300
GGAGGGCCCT	GGTGTGGATC	GTGGAAGGAA	GAAAGACAGA	ACAGGGTGCT	AGTATTTACC	360
CCGTTCCCTG	TAGACACCCT	GGATTTGTCA	GCTTTGCAAG	CTTCTTGGTT	GCAGCGGCCT	420
TGCCTGTGCC	CCTTTGAGAC	TGTTTCCAGA	CTAAACTTCC	AAATGTCAGC	CCCTTACCCT	480
TGACAGCAAG	GGACATCTCA	TTAGGGCATC	GCGTGCTTCT	CATCTGTGCT	CAGCAGGCCC	54 0
GAGATAGGAA	CAGAGGGGCG	TTGGAGATGC	CACTTCCACC	AGCCCTGGGT	TGAAGGGGAG	600
CGAGGGAGAC	ACCTTTTACT	TAAACCCCTG	AGCTTGGTCA	GAGAGGCTGA	ATGTCTAAAA	660
TGAGGAAGAA	AAGGTTTTTC	ACCTGGAAAC	GCTTGAGGGC	TGAGTCTTCT	GCCCTTCTGA	720

CTCCCCCAGC AAATACAGAC AGGTCACCAA CTA

753 • · • · (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1890párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „SHOXa (ix) RYSY:

(A) NÁZEV/KLÍČ: cds (B) POZICE: 91..968 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 10:

GTGATCCACC CGCCGCACGG GCCGTCCTCT CCGCGCGGGG AGACGCGCGC ATCCACCAGC 60

CCCGGCTGCT CGCCAGCCCC GGCCCCAGCC ATG GAA GAG CTC ACG GCT TTT GTA 114

Met Glu Glu Leu Thr Ala Phe Val

5

TCC Ser

AAG Lys 10

TCT Ser

TTT Phe

GAC CAG AAA

AGC AAG GAC

GGT Gly

AAC Asn 20

GGC Gly

GGA Gly

GGC Gly

GGA Gly

162

Asp

Gin

Ly3 15

Ser

Lys

Asp

GGC

GGC

GGA

GGT

AAG

AAG

GAT

TCC

ATT

ACG

TAC

CGG

GAA

GTT

TTG

GAG

210

Gly 25

Gly

Gly

Gly

Lys

Lys 30

Asp

Ser

Ile

Thr

Tyr 35

Arg

Glu

Val

Leu

Glu 40

AGC

GGA

CTG

GCG

CGC

TCC

CGG

GAG

CTG

GGG

ACG

TCG

GAT

TCC

AGC

CTC

258

Ser

Gly

Leu

Ala

Arg 45

Ser

Arg

Glu

Leu

Gly 50

Thr

Ser

Asp

Ser

Ser 55

Leu

CAG

GAC

ATC

ACG

GAG

GGC

GGC

GGC

CAC

TGC

CCG

GTG

CAT

TTG

TTC

AAG

306

Gin

Asp

Ile

Thr 60

Glu

Gly

Gly

Gly

His 65

Cys

Pro

Val

His

Leu 70

Phe

Lys

GAC

CAC

GTA

GAC

AAT

GAC

AAG

GAG

A7A

CTG

AAA

GAA

TTC

GGC

ACC

GCG

354

Asp

His

Val 75

Asp

Asn

Asp

Lys

Glu 80

Lys

Leu

Lys

Glu

Phe 85

Gly

Thr

Ala

AGA

GTG

GCA

GAA

GGG

ATT

TAT

GAA

TGC

AAA

GAG

AAG

CGC

GAG

GAC

GTG

402

Arg

Val 90

Al a

Glu

Gly

Ile

Tyr 95

Glu

Cys

Lys

Glu

Lys 100

Arg

Glu

Asp

Val

AAG

TCG

GAG

GAC

GAG

GAC

GGG

CAG

ACC

AAG

CTG

AAA

CAG

AGG

CGC

AGC

450

Lys 105

Ser

Glu

Asp

Glu

Asp 110

Gly

Gin

Thr

Lys

Leu 115

Lys

Gin

Arg

Arg

Ser 120

CGC

ACC

AAC

TTC

ACG

CTG

GAG

CAG

CTG

AAC

GAG

CTC

GAG

CGA

CTC

TTC

498

Arg

Thr

Asn

Phe

Thr 125

Leu

Glu

Gin

Leu

Asn 130

Glu

Leu

Glu

Arg

Leu 135

Phe

GAC

GAG

ACC

CAT

TAC

CCC

GAC

GCC

TTC

ATG

CGC

GAG

GAG

CTC

AGC

CAG

546

Asp

Glu

Thr

His 140

Tyr

Pro

Asp

Ala

Phe 145

Met

Arg

Glu

Glu

Leu 150

Ser

Gin r

CGC

CTG

GGG

CTC

TCC

GAG

GCG

CGC

GTG

CAG

GTT

TGG

TTC

CAG

AAC

CGG

594

Arg

Leu

Gly 155

Leu

Ser

Glu

Ala

Arg 160

Val

Gin

Val

Trp

Phe 165

Gin

Asn

Arg

AGA

GCC

AAG

TGC

CGC

AAA

CAA

GAG

AAT

CAG

ATG

CAT

AAA

GGC

GTC

ATC

642

Arg

Al a 170

Lys

Cys

Arg

Lys

Gin 175

Glu

Asn

Gin

Met

His 180

Lys

Gl y

Val

I le

• · • · >

690

TTG GGC ACA GCC AAC CAC CTA GAC GCC TGC CGA GTG GCA CCC TAC GTC Leu Gly Thr Ala Aan His Leu Asp Ala Cys Arg Val Ala Pro Tyr Val 185 190 195 200

AAC ATG GGA GCC TTA CGG ATG CCT TTC CAA CAG GTC CAG GCT CAG CTG Asn Met Gly Ala Leu Arg Met Pro Phe Gin Gin Val Gin Ala Gin Leu

738

205

210

215

CAG

CTG

GAA

GGC

.GTG

GCC

CAC

GCG

CAC

CCG

CAC

CTG

CAC

CCG

CAC

CTG

786

Gin

Leu

Glu

Gly

Val

Ala

His

Ala

His

Pro

His

Leu

HÍ3

Pro

His

Leu

220

225

230

GCG

GCG

CAC

GCG

CCC

TAC

CTG

ATG

TTC

CCC

CCG

CCG

CCC

TTC

GGG

CTG

834

Ala

Ala

His

Ala

Pro

Tyr

Leu

Met

Phe

Pro

Pro

Pro

Pro

Phe

Gly

Leu

235

240

245

CCC

ATC

GCG

TCG

CTG

GCC

GAG

TCC

GCC

TCG

GCC

GCC

GCC

GTG

GTC

GCC

882

Pro

Ile

Ala

Ser

Leu

/Via

Glu

Ser

Ala

Ser

Ala

Ala

Ala

Val

Val

Ala

2S0

255

260

GCC

GCC

GCC

AAA

AGC

AAC

AGC

AAG

AAT

TCC

AGC

ATC

GCC

GAC

CTG

CGG

930

Ala

Ala

Ala

Lys

Ser

Asn

Ser

Lys

Asn

Ser

Ser

Ile

Ala

Asp

Leu

Arg

265

270

275

280

CTC

AAG

GCG

CGG

AAG

CAC

GCG

GAG

GCC

CTG

GGG

CTC

TG ACCCGCCGCG

978

Leu

Lya

Ala

Arg

Lys

His

Ala

Glu

Ala

Leu

Gly

Leu

285

290

CAGCCCCCCG	CGCGCCCGGA	CTCCCGGGCT	CCGCGCACCC	CGCCTGCACC	GCGCGTCCTG	1038
CACTCAACCC	CGCCTGGAGC	TCCTTCCGCG	GCCACCGTGC	TCCGGGCACC	CCGGGAGCTC	1098
CTGCAAGAGG	CCTGAGGAGG	GAGGCTCCCG	GGACCGTCCA	CGCACGACCC	AGCCAGACCC	1158
TCGCGGAGAT	GGTGCAGAAG	GCGGAGCGGG	TGAGCGGCCG	TGCGTCCAGC	CCGGGCCTCT	1218
CCAAGGCTGC	CCGTGCGTCC	TGGGACCCTG	GAGAAGGGTA	AACCCCCGCC	TGGCTGCGTC	1278
TTCCTCTGCT	ATACCCTATG	CATGCGGTTA	ACTACACACG	TTTGGAAGAT	CCTTAGAGTC	1338
TATTGAAACT	GCAAAGATCC	CGGAGCTGGT	CTCCGATGAA	AATGCCATTT	CTTCGTTGCC	1398
AACGATTTTC	TTTACTACCA	'PQ/’' 'Τ' f* c' 'Γ *Γ f*	TTCATCCCGA	GAGGCTGCGG	AACGGGTGTG	1458
GATTTGAATG	TGGACTTCGG	AATCCCAGGA	GGCAGGGGCC	GGGCTCTCCT	CCACCGCTCC	1518
CCCGGAGCCT	CCCAGGCAGC	AATAAGGAAA	TAGTTCTCTG	GCTGAGGCTG	AGGACGTGAA	1578
CCGCGGGCTT	TGGAAAGGGA	GGGGAGGGAG	ACCCGAACCT	CCCACGTTGG	GACTCCCACG	1638
TTCCGGGGAC	CTGAATGAGG	ACCGACTTTA	TAACTTTTCC	AGTGTTTGAT	TCCCAAATTG	1698
GGTCTGGTTT	TGTTTTGGAT	TGGTATTTTT	T T T T T T	TTTTTTGCTG	TGTTACAGGA	1758
TTCAGACGCA	AAAGACTTGC	ATAAGAGACG	GACGCGTGGT	TGCAAGGTGT	CATACTGATA	1818
TGCAGCATTA	ACTTTACTGA	CATGGAGTGA	AGTGCAATAT	ΤΛΤΑΑΑΤΑΤΤ	ATAGATTAAA	1878

f

AAAAAAATAG CA

1890 ·· • A 9 • 9 9 9 • 9 9 • 9 9

9 9 9 9

9« 9

9

9.9

99

9 9 9 • 9 9 9 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 292 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 11:

Met 1

Glu

Glu

Leu

Thr 5

Ala

Phe

Val

Ser

Lys 10

Ser

Phe

Asp

Gin

Lys 15

Ser

Lys

Asp

Gly

Asn 20

Gly

Gly

Gly

Gly

Gly 25

Gly

Gly

Gly

Lys

Lys 30

Asp

Ser

Xle

Thr

Tyr 35

Arg

Glu

Val

Leu

Glu 40

Ser

Gly

Leu

Ala

Arg 45

Ser

Arg

Glu

Leu

Gly 50

Thr

Ser

Asp

Ser

Ser 55

Leu

Gin

Asp

Ile

Thr 60

Glu

Gly

Gly

Gly

His 65

Cys

Pro

Val

His

Leu 70

Phe

Lys

Asp

His

Val 75

Asp

Asn

Asp

Lys

Glu 80

Ly3

Leu

Lys

Glu

Phe 85

Gly

Thr

Ala

Arg

Val 90

Ala

Glu

Gly

Ile

Tyr 95

Glu

Cy3

Ly3

Glu

Lys 100

Arg

Glu

Asp

Val

Lys 105

Ser

Glu

Asp

Glu

Asp 110

Gly

Gin

Thr

Lys

Leu 115

Lys

Gin

Arg

Arg

Ser 120

Arg

Thr

Asn

Phe

Thr 125

Leu

Glu

Gin

Leu

Asn 130

Glu

Leu

Glu

Arg

Leu 135

Phe

Asp

Glu

Thr

His 140

Tyr

Pro

Asp

Ala

Phe 145

Met

Arg

Glu

Glu

Leu 150

Ser

Gin

Arg

Leu

Gly 155

Leu

Ser

Glu

Ala

Arg 160

Val

Gin

Val

Trp

Phe 165

Gin

Asn

Arg

Arg

Ala 170

Lys

Cys

Arg

Lys

Gin 175

Glu

Asn

Gin

Met

His 180

Lys

Gly

Val

Ile

Leu 185

Gly

Thr

Ala

Asn

His 190

Leu

Asp

Ala

Cys

Arg 195

Val

Ala

Pro

Tyr

Val 200

Asn

Met

Gly

Ala

Leu 205

Arg

Met

Pro

Phe

Gin 210

Gin

Val

Gin

Ala

Gin 215

Leu

Gin

Leu

Glu

Gly 220

Val

Ala

His

Ala

His 225

Pro

His

Leu

His

Pro 230

His

Leu

Ala

Ala

His 235

Ala

Pro

Tyr

Leu

Met 240

Phe

Pro

Pro

Pro

Pro 245

Phe

Gly

Leu

Pro

Ile 250

Ala

Ser

Leu

Ala

Glu 255

Ser

Ala

Ser

Ala

Ala 260

Ala

Val

Val

Ala

Ala 265

Ala

Ala

Lys

Ser

Asn 270

Ser

Ly3

Asn

Ser

Ser 275

Ile

Ala

Asp

Leu

Arg 280

Leu

Lys

Ala

Arg

Lys 285

His

Ala

Glu

Ala Leu Gly Leu 290 ·· ·· « « · · ··* ·· (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1354 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „SHOXb (ix) RYSY:

(A) NÁZEV/KLÍČ: cds (B) POZICE: 91..768 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 12:

GTGATCCACC CGGCGCACGG GCCGTCCTCT CCGCGCGGGG AGACGCGCGC ATCCACCAGC 60

CCCGGCTGCT CGCCAGCCCC GGCCCCAGCC ATG GAA GAG CTC ACG GCT TTT GTA 114

Met Glu Glu Leu Thr Ala Phe Val

295 300

TCC Ser

AAG Lys

TCT Ser

TTT Phe

GAC Asp 305

CAG AAA AGC AAG GAC

GGT AAC Gly Asn

GGC Gly

GGA Gly

GGC Gly 315

GGA Gly

162

Gin

Lys

Ser

Lys

Asp 310

GGC

GGC

GGA

GGT

AAG

AAG

GAT

TCC

ATT

ACG

TAC

CGG

GAA

GTT

TTG

GAG

210

Gly

Gly

Gly

Gly

Lys

Lys

Asp

Ser

Ile

Thr

Tyr

Arg

Glu

Val

Leu

Glu

320

325

330

AGC

GGA

CTG

GCG

CGC

TCC

CGG

GAG

CTG

GGG

ACG

TCG

GAT

TCC

AGC

CTC

258

Ser

Gly

Leu

Ala

Arg

Ser

Arg

Glu

Leu

Gly

Thr

Ser

Asp

Ser

Ser

Leu

335

340

345

CAG

GAC

ATC

ACG

GAG

GGC

GGC

GGC

CAC

TGC

CCG

GTG

CAT

TTG

TTC

AAG

306

Gin

Asp

Ile

Thr

Glu

Gly

Gly

Gly

His

Cys

Pro

Val

His

Leu

Phe

Lys

350

355

360

GAC

CAC

GTA

GAC

AAT

GAC

AAG

GAG

AAA

CTG

AAA

GAA

TTC

GGC

ACC

GCG

354

Asp

His

Val

Asp

Asn

A3p

Lys

Glu

Lys

Leu

Lys

Glu

Phe

Gly

Thr

Ala

365

370

375

380

AGA

GTG

GCA

GAA

GGG

ATT

TAT

GAA

TGC

AAA

GAG

AAG

CGC

GAG

GAC

GTG

402

Arg

Val

Ala

Glu

Gly

Ile

Tyr

Glu

Cys

Lys

Glu

Lys

Arg

Glu

Asp

Val

385

390

395

AAG

TCG

GAG

GAC

GAG

GAC

GGG

CAG

ACC

AAG

CTG

AAA

CAG

AGG

CGC

AGC

450

Lys

Ser

Glu

Asp

Glu

Asp

Gly

Gin

Thr

Lys

Leu

Lys

Gin

Arg

Arg

Ser

400

4 05

4 10

CGC

ACC

AAC

TTC

ACG

CTG

GAG

CAG

CTG

AAC

GAG

CTC

GAG

CGA

CTC

TTC

498

Arg

Thr

Asn

Phe

Thr

Leu

Glu

Gin

Leu

Asn

Glu

Leu

Glu

Arg

Leu

Phe

415

420

425

GAC

GAG

ACC

CAT

TAC

CCC

GAC

GCC

TTC

ATG

CGC

GAG

GAG

CTC

AGC

CAG

546

Asp

Glu

Thr

His

Tyr

Pro

Asp

Ala

Phe

Met

Arg

Glu

Glu

Leu

Ser

Gin

430

435

440

CGC

CTG

GGG

CTC

TCC

GAG

GCG

CGC

GTG

CAG

GTT

TGG

TTC

CAG

AAC

CGG

594

Arg

Leu

G1 y

Leu

Ser

Glu

Ala

Arg

Val

Gin

Val

Trp

Phe

Gin

Asn

Arg

445

450

455

4 60 r

• 9

9 · 9

AGA GCC AAG TGC

CGC AAA CAA GAG AAT

CAG ATG

CAT His

AAA Lys

GGC Gly

GTC Val 475

ATC Ile

642

Arg Ala Lys

Cys

Arg 465

Lya

Gin

Glu

Asn

Gin 470

Met

TTG

GGC

ACA

GCC

AAC

CAC

CTA

GAC

GCC

TGC

CGA

GTG

GCA

CCC

TAC

GTC

690

Leu

Gly

Thr

Ala

Aan

HÍ3

Leu

Asp

Ala

Cys

Arg

Val

Ala

Pro

Tyr

Val

480

485

4 90

AAC

ATG

GGA

GCC

TTA

CGG

ATG

CCT

TTC

CAA

CAG

ATG

GAG

TTT

TGC

TCT

738

Asn

Met

G1 y

Ala

Leu

Arg

Met

Pro

Phe

Gin

Gin

Met

Glu

Phe

Cys

Ser

495

500

505

TGT

CGC

CCA

GGC

TGG

AGT

ATA

ATG

GCA

TGA

TCTCGACTCA CTGCAACCTC

788

Cy3

Arg

Pro

Gly

Trp

Ser

Ile

Met

Ala

*

510

515

CGCCTCCCGA GTTCAAGCGA TTCTCCTGCC TCAGCCTCCC GAGTAGCTGG GATTACAGGT 848

GCCCACCACC ATGTCAAGAT AATGTTTGTA TTTTCAGTAG AGATGGGGTT TGACCATGTT 908

GGCCAGGCTG GTCTCGAACT CCTGACCTCA GGTGATCCAC CCGCCTTAGC CTCCCAAAGT 968

GCTGGGATGA CAGGCGTGAG CCCCTGCGCC CGGCCTTTGT AACTTTATTT TTAATTTTTT 1028

TTTTTTTTTA AGAAAGACAG AGTCTTGCTC TGTCACCCAG GCTGGAGCAC ACTGGTGCGA 1088

TCATAGCTCA CTGCAGCCTC AAACTCCTGG GCTCAAGCAA TCCTCCCACC TCAGCCTCCT 1148

GAGTAGCTGG GACTACAGGC ACCCACCACC ACACCCAGCT AATTTTTTTG ATTTTTACTA 1208

GAGACGGGAT CTTGCTTTGC TGCTGAGGCT GGTCTTGAGC TCCTGAGCTC CAAAGATCCT 1268

CTCACCTCCA CCTCCCAAAG TGTTAGAATT ACAAGCATGA ACCACTGCCC GTGGTCTCCA 1328

AAAAAAGGAC TGTTACGTGG AAAAAA 1354 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 226 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 13:

· • F FF F F · F • · F ·

FFF FFF

F F

F · ··

Met 1

Glu

Glu

Leu

Thr 5

Ala

Phe

Val

Ser

Lys 10

Ser

Phe

Asp

Gin

Lys 15

Ser

Lys

Asp

Gly

Asn 20

Gly

Gly

Gly

Glv

Gly 25

Gly

Gly

Gly

Lys

Lys 30

Asp

Ser

Xle

Thr

Tyr 35

Arg

Glu

Val

Leu

Glu 40

Ser

Gly

Leu

Ala

Arg 45

Ser

Arg

Glu

Leu

Gly 50

Thr

Ser

Asp

Ser

Ser 55

Leu

Gin

Asp

Ile

Thr 60

Glu

Gly

Gly

Gly

His 65

Cys

Pro

Val

His

Leu 70

Phe

Lys

Asp

His

Val 75

Asp

Asn

Asp

Lys

Glu 80

Ly3

Leu

Lys

Glu

Phe 85

Gly

Thr

Ala

Arg

Val 90

Ala

Glu

Gly

Ile

Tyr 95

Glu

Cys

Lys

Glu

Lys 100

Arg

Glu

Asp

Val

Lys 105

Ser

Glu

Asp

Glu

Asp 110

Gly

Gin, r

Thr

Lys

Leu 115

Lys

Gin

Arg

Arg

Ser 120

Arg

Thr

Asn

Phe

Thr 125

Leu

Glu

Gin

Leu

Asn 130

Glu

Leu

Glu

Arg

Leu 135

Phe

Asp

Glu

Thr

His 140

Tyr

Pro

Asp

Ala

Phe 145

Met

Arg

Glu

Glu

Leu 150

Ser

Gin

Arg

Leu

Gly 155

Leu

Ser

Glu

Ala

Arg 160

Val

Gin

Val

Trp

Phe 165

Gin

Asn

Arg

Arg

Ala 170

Lys

Cys

Arg

Lys

Gin 175

Glu

Asn

Gin

Met

His

Lys

Gly

Val

I le

Leu

Gly

Thr

Al a

Asn

Hi 3

Leu

Asp

180

185

190

Ala

Cys

Arg 195

Val

Ala

Pro

Tyr

Val 200

Asn

Met

Gly

Ala

Leu 205

Arg

Met

Pro

Phe

Gin 210

Gin

Met

Glu

Phe

Cys 215

Ser

Cys

Arg

Pro

Gly 220

Trp

Ser

Ile

Met

Ala

225

4 4 4 4

4 4 ··

4444 * 4

4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 •«•44 4 4 4 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32367 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „kosmid: LLNOYCO3'M'34F5 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 14:

TTTCTCTGTC	TCCATCCCTC	TGTCTCTCCC	TTTCTCTCTG	TCTTTCCTTG	TCTCTCTCTT	60
TCTCTCTCTC	TCTCCATCTC	TCTCTCTCCC	TGTCTCTCTC	TCTCCATCTC	CCCGTCTCTC	120
CGTTTCTCTC	TCTGCCTCTC	CCTGTCTGTC	TCTCTCTTTC	TGTGTCTTAC	ACACACCCCA	180
ACCCACCGTC	ACTCATGTCC	CCCCACTGCT	GTGCCATCTC	ACACAAGTTC	ACAGCTCAGC	240
TGTCATCCTG	GGTCCCCAGG	CCGCGCCGGG	GAGGAAGATG	CGCCGTGGGG	TTACGGGAGG	300
AAGGGGACTC	CGGGCCTCCT	GGTGCCCCAC	TTTATTTGCA	GAAGGTCCTT	GGCAGGAACC	360
GTGACGCGTT	TGGTTTCCAG	GACTTGGAAA	ACGAATTTCA	GGTCGCGATG	GCGAGCACCG	420
GCTTCCCCTG	AAGCACATTC	AATAGCGAGA	GGCGGGAGGG	AGCGAGCAGG	AGCATCCCAC	480
CATGAAAACC	AAAAACACAA	gtattttttt	CACCCGGTAA	ATACCCCAGA	CGCCAGGGTG	540
ACAGCGCGGC	GCTAAGGGAG	GAGGCCTCGC	GCCGGGGTCC	GCCGGGATCT	GGCGCGGGCG	600
GAAAGAATAT	AGATCTTTAC	GAACCGGATC	TCCCGGGGAC	CTGGGCTTCT	TTCTGCGGGC	660
GCTGGAGACC	CGGGAGGCGG	CCCCGGGGAT	CCTCGGCCTC	CGCCGCCGCC	GCCTCCCAAG	720
CGCCCGCGTC	CCGGTTTGGG	GACACCCGGC	CCCTTCTTCT	CACTTTCGGG	GATTCTC^AG	780
CCGCGTTCCA	TCTCACCAAC	TCTCCATCCA	AGGGCGCGCC	GCCACCAACT	TGGAGCTCAT	840
CTTCTCCCAA	GATCGTGCGT	CCCCGGGGCG	CCCGGGTCCC	CCCCCTCGCC	ATCTCAACCC	900
CGGCGCGACC	CGGGCGCTTC	CTGGAAAGAT	CCAGGCGCCG	GGCTCTGCGC	TCCTCCCGGG	960
AGCGAGGGCG	GCCGGACGAC	TGGGACCCTC	CTCTCTCCAG	CCGTGAACTC	CTTGTCTCTC	1020
TGTCTCTCTC	TGCAGGAAAA	CTGGAGTTTG	CTTTTCCTCC	GGCCACGGAG	AGAACGCGGG	1080
TAACCTGTGT	GGGGGGCTCG	GGCGCCTGCG	CCCCCCTCCT	GCGCGCGCGC	TCTCCCTTCC	1140
AAAAATGGGA	TCTTTCCCCC	TTCGCACCAA	GGTGTACGGA	CGCCAAACAG	TGATGAAATG	1200

• Β Β ·»· ·· ·· •« · #·· BBBB • BBB » Β Β · Β · · · » · · « · · ···· · BBB BBB • Β Β Β Β Β · · • Β · · Β Β Β * Β· · *

AGAAGAAAGC	CAATTGCCGG	CCTGGGGGGT	GGGGGAGACA	CAGCGTCTCT	GCGTGCGTCC	1260
GCCGCGGAGC	CCGGAGACCA	GTAATTGCAC	CAGACAGGCA	GCGCATGGGG	GGCTGGGCGA	1320
GGTCGCCGCG	TATAAATAGT	GAGATTTCCA	ATGGAAAGGC	GTAAATAACA	GCGCTGGTGA	1380
TCCACCCGCG	CGCACGGGCC	GTGCTCTCCG	CGCGGGGAGA	CGCGCGCATC	CACCAGCCCC	1440
GGCTGCTCGC	CAGCCCCGGC	CCCAGCCATG	GAAGAGCTCA	CGGCTTTTGT	ATCCAAGTCT	1500
TTTGACCAGA	AAAGCAAGGA	CGGTAACGGC	GGAGGCGGAG	GCGGCGGAGG	TAAGAAGGAT	1560
TCCATTACGT	ACCGGGAAGT	TTTGGAGAGC	GGACTGGCGC	GCTCCCGGGA	GCTGGGGACG	1620
TCGGATTCCA	GCCTCCAGGA	CATCACGGAG	GGCGGCGGCC	ACTGCCCGGT	gcatttgttc	1680
AAGGACCACG	TAGACAATGA	CAAGGAGAAA	CTGAAAGAAT	TCGGCACCGC	GAGAGTGGCA	1740
GAAGGTAAGT	TCCTTTGCGC	GCCGGCTCCA	GGGGGGCCCT	CCTGGGGTTC	GGCGCCTCGT	1800
CGCCACGGAG	TCGGCCCCGC	GCGCCCCTCG	CTGTGCACAT	TTGCAGCTCC	CGTCTCGCCA	1860
GGGTAAGGCC	CGGGCCGTCA	GGCTTTGCCT	AAGAAAGGAA	GGAAGGCAGG	AGTGGACCCG	1920
ACCGGAGACG	CGGGTGGTGG	GTAGCGGGGT	GCGGGGGGAC	CCAGGGAGGG	TCGCAGCGGG	1980
GGCCGCGCGC	GTGGGCACCG	ACACGGGAAG	GTCCCGGGCT	GGGGTGGATC	CGGGTGGCTG	2040
TGCCTGAAGC	CGTAGGGCCT	GAGATGTCTT	TTTCATTTTC	TTTTTCTTTC	CTTTCCTTTT	2100
TTTGTTTGTT	TGTTTGTTTG	TTTGAGACAG	AGTCTCGCTC	TGTCCCCCAG	GCTGGAGTGC	2160
AGTGGTGCGA	TCTCGGCTCA	CTGCAACCTC	CGCCTCCTGG	GTTCAAGCGA	TTCTCCTGCC	2220
TCAGCCTCCC	CAGTAGCTGG	GATTACAGGC	ATGCAGCACC	ACGCCTGGCT	AATTTTTGTG	2280
CTTTTAGTAA	AGACGGGGAT	TCACCATGTT	GGCCAGGCTG	GTCTCGAACT	CCTGACCTCA	2340
GGTGATCCAC	CCGCCTCGGC	CTCCCAAAGT	GCTGGGATGA	CAGGCGTGAG	GCACCGCGCC	2400
CGGCCTGGGT	CCTGACGGCT	TAGGATGTGT	GTTTCTGTCT	CTGCCTGTCT	GCCTTGTATT	2460
TACGGTCACC	CAGACGCACA	GAGGAGCCGT	CTCCACGCGC	CTTCCCAGCG	CTCAGCGCCT	2520
GCCGGGCCCC	CGGAGATCAC	GGGAAGACTC	GAGGCTGCGT	GGTAGGAGAC	GGGAAGGCCC	2580
CGGGTCAGCT	CGGTTCTGTT	TCCTTTAAGG	AACCCTTCAT	TATTATTTCA	TTGTTTTCCT	2640
TTGAACGTCG	AGGCTTGATC	TTGGCGAAAG	CTGTTGGGTC	CATAAAAACC	ACTCCCGTGA	2700
GCGGAGGTGG	CCGGGATCTG	GATGGGGCGC	GAGGGGCCCC	GGGGAAGCTG	GCGGCTTCGC	2760
GGGCGCGTCC	TAAGTCAAGG	TTGTCAGAGC	GCAGCCGGTT	GTGCGCGGCC	r CGGGGGAGCT	2820
CCCCTCTGGC	CCTTCCTCCT	GAGACCTCAG	TGGTGGGTCG	TCCCGTGGTG	GAAATCGGGG	2880
AGTAAGAGGC	TCAGAGAGAG	GGGCTGGCCC	CGGGGATCTC	TGTGCACACA	CGACAACTGG	2940
GCGGCATACA	TCTTAAGAAT	AAAATGGGCT	GGCTGTGTCG	GGGCACAGCT	GGAGACGGCT	3000
ATGGACGCCT	GTTATGTTTT	CATTACAAAG	ACGGAGAGAA	TCTAGCCTCG	gcttttgctg	3060
ATTCGCAGAG	TTGAGGTGCG	AGGGTGAATG	CCCCAAAGGT	aattcttcct	AAGACTCTGG	3120
GGCTACCTGC	TCTCCGGGGC	CCTGCATTTG	GGGTGTGGAG	TGGCCCCGGG	AAATAGCCCT	3180
TGTATTCGTA	GGAGGCACCA	GGCAGCTTCC	CAAGGCCCTG	ACTTTGTCGA	AGCAGAAAGC	3240

• 9 •

• 9 · · * · · · 9

9« 9 • · · 9 9 »9 99 • 9 9 9 9

9 9 9 9 9 >99· 9 »·· 999 • 9 9 • 9 9 9 9

TGTGGCTACG	GTTTACAAAG	CAGTCCCCGG	TTTCTGACCG	TCTAAGAGGC	AGGAGCCCAG	3300
CCTGCCTTTG	ACAGTGAGAG	GAGTTCCTCC	CTACACACTG	CTGCGGGCAC	CCGGCACTGT	3360
AATTCATACA	CAGAGAGTTG	GCCTTCCTGG	ACGCAAGGCT	GGGAGCCGCT	TGAGGGCCTG	3420
CGTGTAATTT	AAGAGGGTTC	GCAGCGCCCG	GCGGCCGCTT	CTGTGGGGTT	GCTTTTTGGT	3480
TGTCCTTCGC	AGACACCGTT	TTGCTCCTCT	GAACTCTCTC	TTCTCCCCCT	GGCCGTGGAC	3540
CCGGGAGAGC	AAAGTGTCCT	CCAGACCTTT	TGAAAGTGAG	AGGAAAATAA	AGACCAGGCC	3600
AAAGACCCAG	GGCCACAGGA	GAGGAGACAG	AGAGTCCCCG	TTACATTTTC	CCCTTGGGTG	3660
GGTGCAGAAA	GACCCCCGGG	CCAGGACTGC	CACCCAGGCT	ACTATTTATT	CATCAGATCC	3720
AAGTTAAATC	GAGGTTGGAG	GGCAGGGGAG	AGTCTGAGGT	TACCGTGGAA	GCCTGGAGTT	3780
TTTGGGAACA	GCGTGTCCCC	GCCGAGCCTG	GGAGCCCGTG	GGTTCTGCAA	AGCCTGCGGG	3840
TGTTTGAGGA	CTTTGAAGAC	CAGTTTGTCA	GTTGGGCTCA	ATTCCTGGGG	TTCAGACTTA	3900
GAGAAATGAA	GGAGGGAGAG	CTGGGGTCGT	CTCCAGGAAA	CGATTCACTT	GGGGGGAAGG	3960
AATGGAGTGT	TCTTGCAGGC	ACATGTCTGT	TAGGAGGTGA	AACAGAATGT	GAAATCCACG	4020
TTGGAGTAAG	CGTCCAGCGC	TGAATGTAGC	TCGGGGTGGG	GTGGGAGGGC	CCTGGTGTGG	4080
ATCGTGGAAG	GAAGAAAGAC	AGAACAGGGT	GCTAGTATTT	ACCCCGTTCC	CTGTAGACAC	4140
CCTGGATTTG	TCAGCTTTGC	AAGCTTCTTG	GTTGCAGCGG	CCTTGCCTGT	GCCCCTTTGA	4200
GACTGTTTCC	AGACTAAACT	TCCAAATGTC	AGCCCCTTAC	CCTTGACAGC	AAGGGACATC	4260
TCATTAGGGC	ATCGCGTGCT	TCTCATCTGT	GCTCAGCAGG	CCCGAGATAG	GAACAGAGGG	4320
GCGTTGGAGA	TGCCACTTCC	ACCAGCCCTG	GGTTGAAGGG	GAGCGAGGGA	GACACCTTTT	4380
ACTTAAACCC	CTGAGCTTGG	TCAGAGAGGC	TGAATGTCTA	AAATGAGGAA	GAAAAGGTTT	4440
TTCACCTGGA	AACGCTTGAG	GGCTGAGTCT	TCTGCCCTTC	TGACTCCCCC	AGCAAATACA	4500
GACAGGTCAC	CAACTACTGG	AGATGAGAAA	GTGCCATTTT	TGGCACACTC	TGGTGGGGTA	4560
GGTGCCCGAC	CGCGTGTGAA	AAAGTGGGAA	GGAGAGATTT	CTGCGCACGC	GGTTCAGCCC	4620
CCAGGCGCGG	TGGCGCATTC	AGGTACTCAG	ACGCGGTTCT	GCTGTTCTGC	TGAGAAACAG	- 4 680
GCTTCGGGTA	GGGGCTCCTA	GCTCCGCCAG	ATCGCGGAGG	GACCCCCAGC	CCTCCTGCGC	4740
TGCAGCGGTG	GGGATAGCGT	CTCTCCGTAG	GGCTAGAATC	TGCAACCCGC	CCCGGGTCeT	4800
CCCCGTGTCC	TTCCCGGGCG	TCCCGCCGGG	GATCCCACAG	TTGGCAGCTC	TTCCTCAAAT	4860
TCTTTCCCTT	AAAAATAGGA	TTTGACACCC	CACTCTCCTT	AAAAAAAAAA	AATAAGAAAA	4920
AAAGGTTAGG	TTATGTCAAC	AGAGGTGzAAG	TGGATAATTG	AGGAAACGAT	TCTGAGATGA	4980
GGCCAAGAAA	ACAACGCTCG	TGCAAAGCCC	AGGTTTTTGG	GAAAGCAGCG	AGTATCCTCC	5040
TCGGCTTTTG	CGTTATGGAC	CCCACGCAGT	TTTTGCGTCA	AAGCGCATTG	GTTTTCGAGG	5100
GCCCCCTTTC	CACCGCGGGA	TGCACGAAGG	GGTTCGCCAC	GTTGCGCAAA	ACCTCCCCGG	5160
CCTCAGCCCT	GTGCCCTCCG	CTCCCCACGC	AGGGATTTAT	GAATGCAAAG	AGAAGCGCGA	5220

99 9· 9

	66	* · · « • · ·· * • · * · · • · · » ··« ·· ·<	9 9 • 9 9 9 99 9 9 • 9 9
GGACGTGAAG	TCGGAGGACG	AGGACGGGCA	GACCAAGCTG	AAACAGAGGC	GCAGCCGCAC	5280
CAACTTCACG	CTGGAGCAGC	TGAACGAGCT	CGAGCGACTC	TTCGACGAGA	CCCATTACCC	5340
CGACGCCTTC	ATGCGCGAGG	AGCTCAGCCA	GCGCCTGGGG	CTCTCCGAGG	CGCGCGTGCA	5400
GGTAGGAACC	CGGGGGCGGG	GGCGGGGGGC	CCGGAGCCAT	CGCCTGGTCC	TCGGGAGCGC	5460
ACAGCACGCG	TACAGCCACC	TGCGCCCGGG	CCGCCGCCGT	CCCCTTCCCG	GAGCGCGGGG	5520
AGGTTGGGTG	AGGGACGGGC	TGGGGTTCCT	GGACTTTTGG	AGACGCCTGA	GGCCTGTAGG	5580
ATGGGTTCAT	TGCGTTTGTT	TTTCACCAAC	AGCAAACAAA	TATATATACA	TATATATTAT	5640
ACAAATAACA	AATAAATATA	TATGTTATAC	AGATGGGTAT	ATTGTATATA	TTATAGATAT	5700
TTGTTCGTCC	TTGGTGCAAA	GACACCCGGT	GAACGCATAT	ATTGGCTCCT	GACTGCCTTC	5760
GGTTCCCCTG	GGATTGGTTA	TAGGGGCAAC	ACATGCAAAC	AAAACTTTCC	CTGGATTATA	5820
CTTAGGAGAC	GAAGCTACAG	ATGCGTTTGA	TCCAGAGTGT	TTTACAAGAT	TTTTCATTTA	5880
AAAAAAAATG	TGTCTTTTGG	CCCCTGATTC	CCCTCCGTCT	TCCCGTGTGG	CTGCATTGAA	5940
AAGGTTTCCT	TAGGATGAAA	GGAGAGGGGT	GTGCTCTGTC	CCTAGGTGGA	GAGAAACAGG	6000
GTCTTCTCTT	TCCTCCGTTT	TTTCAGCTAC	GGTTTGTATC	TCCCTCCTCC	CCTCTCCAGC	6060
CCTGTCCTCT	GCTACAAACC	ACCCCCTCCT	CCCTCCGGCT	GTGGGGAGCG	CAGGAGCACG	6120
TTGGGCATCT	GGATGAGCGG	AGACTATTAG	CGGGGCACGG	GGGCTCCCCG	AGGAGCGCGC	6180
GAATTCACGC	TGCCCCATGA	GACCAGGCAC	CGGGGGGCGG	AGGGGCCTTG	GGTGTCCGCA	6240
GAGGGACGGG	CGGGCAGAGC	CTTCCTCCGC	ATTCTAAACA	TTCACTTAAA	GGTATGAGTT	6300
TATTTCAGGG	GTGCTGCTGG	GAGAGCCTCC	AAATGGCTTC	TTCCAGCCCC	TGCCTGACAG	6360
TTCAGCTCCC	CTGGAAGGTC	ZáACTCCTCTA	GTCCTTTCTC	CTGGTTCTGG	GCAGGACAGA	6420
AGTGGGGGGA	GGGAGAGAGA	GAGAGAGAGA	GAGAGAGACG	GTCAGGATCC	CCGGACCCTG	6480
GGGAACCCGT	CAAAAATAAA	TGAAATTAAG	ATTGCCGACC	AGAGAGAGAA	CCGTGACAAA	6540
GCAAACGGCG	TTCAAAGCAA	AGAGACGAAC	TGAAAGCCCG	TTCCCGTAGG	ACTGGTTATG	6600
AGGTCAACAC	ATTCAAACAC	AGGTTGCTCT	GGATTTTGCT	GAGCAGAGGA	AGATACAGAT	6660
GCATTTGATC	CAAAGTGTGT	TACATCTTTC	ATTATATGTG	TGTCTATATA	TATAAACATA	6720
ΤΑΤΛΑΑΤΑΤΑ	TAAACATACA	TAAATGTATG	TAAATATATA	TAATCTATAT	ACATATATAA	6780
ATATATAAAC	ACATATATAA	TATATAAATC	TATAAACATA	TATAATATAT	AAACATAAAT	6840
ATATAAACAT	ATATAATATA	TAAATATATT	AACATATATA	AAATATGTAT	AAATATATAT	6900
AAACATATAA	ACATATATAA	ATATATAAAC	ATATAAATAT	ATAAACATAT	ATAAATATAT	6960
ACAAACATAT	TGTATATATA	TAAATATATA	TAAAAACATA	TATATACATA	TAAAAATATA	7020
TATAAACATA	TATACATATA	AAGAAATATA	TATAAACATA	TATACATATA	AATATACATA	7080
TATAAACATA	TATATACATA	AAATATATAT	AAACATATAT	ACATATAAAA	ATATATATAT	7140
ATTAACATAT	ATATACATAT	AAAAATATAT	ATATTAACAT	ATATATACAT	ATAAAAATAT	7200
ATATATATTT	TTGGCCCCTG	ATTCCCTTCG	GTTCCTGTGG	GATGGGTGAT	TGAGTCAACA	7260

9« 99 • 9 '9 • *4

4 ·

4 44 4

4 · fl ·

4 · 4

.....

• ·« ·· • · » · · · « # · « · · · • •««v * ··· · · · • « · *

CATTCAAACA

TGGAGAGGGT

GGCTCCTGAT

GTTACGATTA

TACAGCCCAG

GGCGTCTGTG

ACCCCTCTGG

TCGCTAAAGG

CAATATATCC

CCACACTATT

ATTGGTTGTG

AAGCTGGGGG

AAAACAAACA

CCTATAGTAA

CGTCCCGCGT

CATCTCTCTG

CGGATAGAGT

GCTGTTGCTG

TCAGGCTTCT

ACAAATATCT z\TGGAAATCA

AATGAAGAAA

TTGGAATGGA

TCATCACTTG

ATGAGGCTTT

TTGGGTGGCT

TGGAGAGGCA

AGCTTTGGAA

GGTGTGAGGG

CCGGTAGGAC

TGTTGGGTTC

TGAGGGTTTT

AGGGTGGCTG

CAACTTTTCC

TTTACAAGCT

TCTCTTCCGT

AATCAACCCT

GAGGGAGAGA

GCCTCAGTGA

CAGAAGATGG

GGACATCGAG

CAGCCCTTGA

TCTTTCCGTA

GGGTGTGTGC

TTATCGATTG

TGGGAATGCA

AGGCGAGTGC

TGAGGGGACG

TGAATTCTTG

TTCAATTTAC

ATTAACCTTT

AATCGAAAGT

TTGGGTTTAT

AAAGGAAATC

TAACTGTCTT

TCGTGAATCA

TATTCTTCAT

CCACGTTTCA

GGCTTGCTTT

CAGTGGCAGG

ATTATTGGTG

AGGATGACTT

CCACTTTGGA

AAGAGCAAGT

CTGAGGTTCC

TGGGCCGAGG

ATCGATGTTG

CTTTCATTTA

CTTCCCATGT

CCCCAGGCAT

GGCTTTGGTG

GGGAAGGAAG

ATTGGGCTGC

TTTATGTGTC

TGTACTGTTT

GTCTATTACC

GGACCCCGAG

CAGGGGTGGC

ATAAAAGACA

GCTTTGAGGG

GGGACGAGCA

GGTCACATGC

TGTGGAAATT

TATTTTTAGC

TATGAGACCA

GGCGCAGAGC

GCATTACGGC

AAGCAGTGTC

CTCCAAGACT

CATTTTTTTT

GGAGGATTTT

CTGGGCCCTG

TCACCTGGAT

AATTTCGATG

TGCTGGGAAA

AATGAAAAGC

TCACGTTGCG

CTTCATAGGG

GACCCAGCAC

CTTAGGAGAT

AATATATATA

GGCTGCATTT

CTTTACCGAG

ACTTGGAGGA

CTGCATCAGA

CCCGTATAAA

ATCTCCTGGT

CTATAAAAAT

GACGAGAGCA

AACGCCCTAA

ATGAAAATTT

TAATTCTCCA

GTCATAAAAA

GGGACAGAAA

GTCTCAGTAC

TGCTGTAAAT

GTGGCCCTGC

CGGTGAGGGG

TAAATTAAAT

ATTTGGGAAA

ACACACTTCA

GATTTATTAG

TTTCCTCTCG

CTTTTTTGAA

GAGGAGACAG

GGTCAGTGGA

TCAGCACCAG

CAGGATCAGG

CAGTTCCGAA

CTGTGTAGAC

GCACCGGCCC

GTGTTTTGCC

GAGGATACAG

TATATATATA

TAAAAGGCTT

GGCTGTGGTC

AGGACTGTGT

CAGGGGTTTC

TTAATGAAAA

GTCTGTGTGC

AAATTACTTG

CGTTAGTTCA

AATAAAGACA

AACGACGGTA

TCGCCGCGGG

TCAATTAGTT

AAGAAACCAT

AGCCCGTCCC

AAATTGAGCA

AAAGTCGTAT

CAGGCGGTAA

GTCATTATTC

GAAAGCGGGG

CTTACCATAT

CGCTTCACGC

CCGTGTTGAA

AAATGCCCTT

GCGGAGAGTC

GGTGGAGGTC

GCAGGGGCCT

TTCTCCAGGC

AGCTGGGCTG

TCCTGGCTGC

TGGGCCATGC

CACAACAGCC

ATGCGTTTGA

TATATTTTTT

GCCTAAGATC

CCCAAAGCGA

CCCTCCTTAG

CTCGCTGTCC

GATTAAAGTT

CTGGGATCTG

TAATTTAATT

GCTGCGGAAA

AATCGGGGAC

AATAATAATA

GGGAAAGGAT

CCAACACCCA

ATTTGAATCC

GTGCTGTGAC

TCCGATAGAA

CACCCAGCTG

TTTAATTACA

ACTGTCTGTA

AGTGCTCTTT

TCGGGCCTAA

AGCGGCTAAT

GGGAGAGTGA

CCAGAGGCTT

CAGGTGGGCA r

TGAAGGCGCC

TTTTGGCGGG

GCACTGCAGC

GAAGCTTCCG

TCCCAAACTC

ACAGTGCGTA

GGAGTGACTG

7320

7380

7440

7500

7560

7620

7680

7740

7800

7860

7920

7980

8040

8100

8160

8220

8280

8340

8400

8460

8520

8580

8640

8700

8760

8 20

8880

8940

9000

9060

9120

9180

9240 » 9 » 9

999 *

• 9 9 ·

	68	• 9 9 9 9 •9999 9«	• «
GTTCACTCAC	CGCCTTGGCG	GAGGACGCCT	GTTCTCTGGA	CGAATCATTT	CTCTTGGGTG	9300
GTGACTGCCT	TGTGGGTCAA	GGTGCAGGTT	TTCTGCCACA	GAAAACCTGT	TAGGAGGAAT	9360
TAAGCGACTA	AGACTGTCAG	GGAGGTGGTG	GTGGGGGAGA	GGAGGGGGTG	GTGTCCAGAT	9420
TACCAGGCAT	AGGCTAAACT	GCCTGCACTC	TCCAGCTGGT	CTGTCTGTGG	AGGAGGGGAT	9480
TGTCAATACT	GGGAGAGCAG	AGGAGGCTCG	TAGGAGGTGA	GAGGGGGTGG	AATTTGCATG	9540
caaatcttca	CATGAGGCCT	GTGTGAATTT	CTCCAGCCTC	CTGAGGGTCC	CCTGCGCTAT	9600
TGCACTCAAC	TTCTTGATAG	TTTACCCCAA	GACTCAGAAG	TCCTTAGAGG	GGCAGAATGC	9660
CCCCACCACA	AAGCCTGCTA	TCCTTGGGCG	TCCTCAGGAC	CCTTGGTCAT	GAATGGGACC	9720
CTTTCATGTA	TGGGGACCCT	TGGTAATATG	AATGGGACGC	CTTCAGCTCC	CCAGGGCTTC	9780
CGAGGAGGCC	GAGAAGGGCA	AAGACACTTC	CGAGGAGGCC	GAGAAGGGCA	AAGACATTTT	9840
CTGGGCTTGG	TGTGTCAAGA	GCTAGATTGG	AGAAGGGGCT	GGATTTGGAA	CTCTTTAGCC	9900
ATCAGCTCAC	CCTCTCCGTT	TGTGGCTAAA	GTCTGAAGGT	GGAAACTTCG	GTTCTCCTAC	9960
AGGGTGTACA	GGAGTTGGGG	GGCGGGGCGC	CCACACAGAA	CGCTGGAAAG	TTCGACAGTC	10020
CACTTCCACT	GGCTCGGAAC	TCACTTTTTC	ACCTTAAGTT	CATCAGCGGT	AACGCATAGG	10080
TCTCACTTAG	GCAGGGCACG	GATGATTTAA	CAATTTCTAC	TTCTAGGTCA	GGTGCGGTGG	10140
CTCACACCTC	TAATCCCAGC	ACTTTGGGAG	GCCCAGGAGG	GTGGATCGCT	TGAGGTCAGG	10200
AGTTTGAGAC	CAGCCTGGCC	AACATGGTGA	AACCCCGTCT	CTACTAAAAT	ACGAAAATTA	10260
GCCAGGCATG	GTGGTGAGCA	CCTGTAATTC	CAGCTACTCG	GGAGGCTGAG	GCAGGAGAAT	10320
CGCTTGAACC	TGGGAGGTGG	ACGTTC-CAGT	GAGGTGAGAT	CACACCACTG	CACTCCAGCC	10380
TGGATGAGAG	AGCAAGACTC	TGTCTCAAAA	ACAAAATAAA	ACAAAAACAA	AACAAAAATC	10440
AAAAAAGzAAA	ACCCAATTTC	CAGTTCTAGG	CCAGGTGCAG	TGGCTCACGC	CTGTCATCCC	10500
AGCACTTTGG	GAGGCCCAGG	AGGGTGGATC	GCTTGAGGTC	AGGAGTTCGA	GACCAGCCTG	10560
GCCAACATGG	TGAAACCCCA	TCTCTACTAA	AAATACAAAC	GTTAGCTGGG	TGTGGTGGTG	10620
TGCGCCTGTA	ATCCCAGCTA	CTCGGGAAGC	TGAGGCTGGA	GAATTGCTTG	AATCTGGGAG	10680
GTGGAGGTTG	CAGGGAGGCG	AGATAGTGCC	ACTGCAGTCC	AGCCTGGACC	AGAGAGCAAG	10740
ACTCCGTCTC	AAAAACAAAA	GAAAGCAAAA	ACAAAAAACA	AGAGAC.CAGC	CTGGCCAACA	10800
TGGTGAAACC	GCGTCTCTAC	TAAAATACAA	AATTAGCCGG	GCATGGTGGT	r GGGCACCTGT	10860
AGTCCCAGCT	ACTCGGGAGG	CTGAGGCAGG	AGAATGGCTT	GAACCTGGGA	GGTGGAGCTT	10920
GCAGTGAGCC	GAGATÁGTGC	CACTGCACTC	CAGCCTGGGC	GACAGAGCGA	GACTTGATTT	10980
CAGAACCACC	ACCACCACAA	CAAAACAAAA	CAAAAAATCC	AAAAAAACCC	CAATTTCCAG	11040
TACTAGGTAG	TCAGTGATGC	AGGGCTGGAG	ACAGAGGGGC	GGTAAGTGTC	TGGGCGCCCA	11100
CCATCAGTCA	CCTCCCAGCT	CCCAGAGGTG	CAAAGTGCTT	GGTTCAGCCT	CATGGGAAGG	11160
ATGCTCCCTG	GGGAGGCTGG	GCTGGGTTCA	CAGGGCTCTT	CACATCTCTC	TCTGCTTCTC	11220
CCCAAGGTTT	GGTTCCAGAA	CCGGAGAGCC	AAGTGCCGCA	AACAAGAGAA	TCAGATGCAT	11280

• 99

9

999

9 9

9 9

999 9· • ·

AAAGGTGGGT	GTCGGGACTG	GGGGGACCTG	AAGCTGGGGG	ATCCTGCTCC	AGGAGGGATG	11340
GGGTCGACGA	GGTGCTGGCT	ACACCCAGGA	CCACCACACT	GACACCTGCT	CGCTTTGGAC	11400
ACAGGCGTCA	TCTTGGGCAC	AGCCAACCAC	CTAGACGCCT	GCCGAGTGGC	ACGCTACGTC	11460
AACATGGGAG	CCTTACGGAT	GCCTTTCCAA	CAGGTAGCTC	ACTTTTTCTT	CCTCTGAAGA	11520
TCCCTAGGGA	CCTGCTGCTC	CCTTCCCCTT	TCCCGTATTT	GCTGGCGCAT	CCTGACACTC	11580
CTAGTCCCTC	CCTGCCCCTG	CAGACTTCTC	AGCTGGCCCT	TAGAAAAAAA	GCCTCTTTTC	11640
CGAGGAGGCA	TTTACAGGCA	CCTTGGCACC	TATGAAATCA	GGCTGGGCCA	GGCGGGGTGG	11700
CTCACACCTG	TCATCCCAGC	ACTTTGGGAG	GCTGAGGAGG	GTGCATCACC	TGAGATCAGG	11760
AGTTCAAGAC	CAGCCTGGCC	AACTTAACGA	AACCCCGTCT	ATTAAAAATA	CAAAATGGGT	11820
GTGGTGGCTC	ACGCCTGTCA	TCCCAGCACT	TTGGGAGGCC	GAGGCAGGTG	GATCACCTGA	11880
GGTCAGGAAT	TCGAGACCAG	CCTGACCAAC	ATGCTGAAAC	CCCGTCTGTA	CTGAAAACAC	11940
AAAGCTTAGC	CGGGCGTGGT	GGTGCACACC	TGTGATCCCA	GGTACTTGGG	AGGGAGAATC	12000
ACTTGAACCT	GGGAGGTGGA	GGTTGCCGTG	AGCCAATATC	GCGCCACTGC	ACTCCACTCT	12060
GGGTGACAGA	GTGAGACTCC	AAGACTCCAT	CTCAAAAAAA	AAAAAAAAAA	TCAGGCTGTA	12120
AAAATCCACT	TTTGGGAAGG	TGAACACACA	CAAGCCCAAA	CAGAAATCTG	ACAAAAACCA	12180
GAGGGGTGAA	AAGTCCACAC	AGTCAGGCAC	CCCCACCTGG	CTTGCTGCCT	GGTTAAGAAG	12240
GGCGCAGATG	CCTGTGCCTG	GATACCAGAG	ATGGGACAGA	CACCCATTCC	CTTTTCATCA	12300
CCACCCCCGA	GTGCCCGAGG	GCCTGGGGCG	TCTGCCTGGC	CCCTGGCCCC	TGGCTTGGGC	12360
TCTGCACCTC	TGAACTGGAG	ACACCCTACT	CAGCTCCCCA	CTTACTTTGG	AGTGAGCAGC	12420
GCTTGGGTGC	CCAGCGTGGA	TTTGGGGCTT	CCAGGGAGTC	GGGGTTCGGT	CGCGGAGCCC	12480
AAGCTTCCCA	AGGGCGCCCC	CGCCCTGCCC	TGGCTTAGTG	GTGGGGATGG	GATGGGGGGA	12540
AACGGGGAGC	TGCGTGGAAG	GAGGTGAAGG	GTCACAGGAG	GAGAGAGCGC	AGCGCCCACG	12600
TGCGCCCTGC	CTGAACGCGC	AGCGCAGCGC	CCGGGTGCGG	TGCCCCTTGC	CCCTTCGGTC	12660
CCTAATTTGG	GGATCGGGAG	TGCATGCGCG	GGCGGAACGG	GCTTGGGGGG	GGGGGTCTGG	12720
CAGGGCGGAC	GCGTGGCCTC	CCTTCTTCAC	cgttttattc	CAAGGGGACA	GGCTGGGGAT	12780
TGTATTTGGG	CGCGTGTTTG	GCTGAGGGTG	CAGGGACTTG	GGGGGTGGCG	GTGGGGAGGG	12840
CGGAAGGTAT	AAACGTATAA	ATCATAAGTA	AACAACTCAG	AAATGGACCC	CGAGCGCTGG	12900
TCGCCGCTAG	CTCTCCAGCT	CTCCCTGGCC	CAGGCCCGAA	GGAGAGGGGT	CCGCATCCCT	12960
CCGCGGTTCT	CCTCTCCTGG	GTACCTGGCC	TTGAGGTGGG	GGAACGAGCC	TACTTCTTGT	13020
ACCGTCTTTT	GCCGACGGCG	GGACCCAGTG	AAATTAGGCC	GTTGGAGCCC	GCAGGCCTGC	13080
CTGGCTTTGC	GCACCGGAGT	CTTGGGGACC	TGGTGTCCCC	GGGAAAAACT	TGGGGACCTG	13140
GTATCCCCGG	GAGAGGCTTG	GGGACCTGGT	GTCCCGGGAG	AGGCTTGGGT	ACCTGGTTTC	13200
TCTGGAAGAG	GCTTGGACAC	CTGGTGTCCT	GGGAGGGCCT	TTGGGACCTG	GTGTCCTGGG	13260

« 4 44

4 4 • 4 ·

44

4 4 4

4 4 4

444 444

4

44

AGAGGCTTGG	AGATCTGTTG	TCCTGGGAGA	GGCTTGGGGA	CCTGGTGTCC	CTGGAGAGGC	13320
TTGGGGACCT	GGTGACCTTG	GAGAGGCTTG	GAGACCTGGT	GTTCTGGGAG	AGCCTTGGGG	13380
ACCTGGTGTT	CTGGGAGAGG	CTTGGGGACC	TGGTGTCTCT	GGAAGAGGCT	TGGACACCTG	13440
GTGACCCGGG	AGGGCCTTGG	GGATCTGGTG	TCCCGGGAGA	GCCTTGGGGA	CCTGGTGTCC	13500
TGGGAGAGGC	TTGGGGACCT	GGTGACCTTG	GAGAGGCTTG	GGGACCTGGT	GTCCTGAGAG	13560
AGCCTTGGGG	ATCTGGTGTC	CCAGGAGAGG	CTTGGGGACC	TGGTGTCTCT	GGAAGAGGCT	13620
TGGACACCTG	GTGTCCTGGG	GAGAGGCTTG	GGGACCTGGT	GTCCTGGGAG	AGGCTTGGGG	13680
ACCTGGTGTC	CTGGGAGAGG	CTTGGAGATC	TGGTGAGCCG	GGAGAGGCTT	GGGGACCTGG	13740
TGTCCCGGGA	GAGGCTTGGG	GACTTGGTGT	CCCGGGAGAG	GCTTGAACAC	CTGGTGTCCC	13800
AGGAGAGGCT	TGGGGACCTG	GTGACCTTGG	AGAGGCCTGG	GGACCTGGTG	ACCCGGGAGA	13860
GCCTTGGGGA	CCTGGTGTCC	TGGGGAGAGC	CTTGGGGACC	TGGTGACCTT	GGAGAGGCTT	13920
GGGGACCTGG	TGTCTCGGGA	GTGCCTTGGG	GACCTAGTGA	CCCGGGAGAG	GCTTGGGGAC	13980
CTGGTGTCCC	GGGAGAGGCT	TGGGGACCTG	GTGTCCTGGG	AGAGCCTTGG	GGATCTGGTG	14040
TCCTGGGGAG	AGGCTGGGGG	ACCTGGTGTC	TCGGGAGAGA	GCCTTGGGGA	CCTGGTGACC	14100
CGGGAGAGGC	TTGGACACCT	GGTGTCCCGG	GAGAGGCTTG	GGGACCTGGT	GACCCGGGAG	14160
AGCCTTGGGG	ACCTGGTGTC	CTGGGGAGAG	GCTGGGGGAC	CTGGTGTCTC	GGGAGAGAGC	14220
CTTGGGGACC	TGGTGACCCG	GGAGAGGCTT	GGACACCTGG	TGTCCCGGGA	GAGGCTTGGG	14280
AGCCTGGTGT	CCCGGGAGAG	CCTTGGGGAC	CAGGTGACCT	TGGAGAGGCT	TGGGGACCTG	14340
GTGATCTTGG	AGAGGCTTC-G	GGACCTGGTG	TCTCGGGAGA	GGTTACGGGG	GCTGGTTGGG	14400
GGAGAGAACG	TTGTGAGCCA	AAGTCCCTGA	ATCCCTGCGA	AAAGÁGCGCA	TCGGGAGCTC	14460
CCCCTGAGGG	CGTTCCATTT	GTGGACCCCC	CTCCCATGCG	CTTTGCAGGG	AGCTGTTCGG	14520
ATTCCCCTGG	CCCGGCTCCC	GCGGATGCAT	CCAGTGGCAG	CGCCAATTCT	GGGCCAGGGG	14580
GAAGGAGGAA	AGGCGGGTGT	GGGGTGGTCT	CCACGGCTGG	AGAAGGGGCG	ACGCTCCCTA	14640
GGGGAGAAGA	GGCACGTTGG	GGGTTTCCGG	GGGCGCGGGG	CGGAGCAGGC	CCCCCAGTCC	14700
CCATCCTGCG	CCCTCACCCC	GCCGGGTCCG	CTCCCGCAGG	TCCAGGCTCA	GCTGCAGCTG	14760
GAAGGCGTGG	CCCACGCGCA	CCCGCACCTG	CACCCGCACC	TGGCGGCGCA	CGCGCCCTAC r GTCCGCCTCG	14820
CTGATGTTCC	CCCCGCCGCC	CTTCGGGCTG	CCCATCGCGT	CGCTGGCCGA	14880
GCCGCCGCCG	TGGTCGCCGC	CGCCGCCAAA	AGCAACAGCA	AGAATTCCAG	CATCGCCGAC	14940
CTGCGGCTCA	AGGCGCGGAA	GCACGCGGAG	GCCCTGGGGC	TCTGACCCGC	CGCGCAGCCC	15000
CCCGCGCGCC	CGGACTCCCG	GGCTCCGCGC	ACCCCGCCTG	CACCGCGCGT	CCTGCACTCA	15060
ACCCCGCCTG	GAGCTCCTTC	CGCGGCCACC	GTGCTCCGGG	CACCCCGGGA	GCTCCTGCAA	15120
GAGGCCTGAG	GAGGGAGGCT	CCCGGGACCG	TCCACGCACG	ACCCAGCCAG	ACCCTCGCGG	15180
AGATGGTGCA	GAAGGCGGAG	CGGGTGAGCG	GCCGTGCGTC	CAGCCCGGGC	CTCTCCAAGG	15240

CTGCCCGTGC GTCCTGGGAC CCTGGAGAAG GGTAAACCCC CGCCTGGCTG CGTCTTCCTC 15300

999· • 9

9

9

999 9 9 • 9 99 • 99

TGCTATACCC	TATGCATGCG	GTTAACTACA	CACGTTTGGA	AGATCCTTAG	AGTCTATTGA	15360
AACTGCAAAG	ATCCCGGAGC	TGGTCTCCGA	TGAAAATGCC	ATTTCTTCGT	TGCCAACGAT	15420
TTTCTTTACT	ACCATGCTCC	TTCCTTCATC	CCGAGAGGCT	GCGGAACGGG	TGTGGATTTG	15480
AATGTGGACT	TCGGAATCCC	AGGAGGCAGG	GGCCGGGCTC	TCCTCCACCG	CTCCCCCGGA	15540
GCCTCCCAGG	CAGCAATAAG	GAAATAGTTC	TCTGGCTGAG	GCTGAGGACG	TGAACCGCGG	15600
GCTTTGGAAA	GGGAGGGGAG	GGAGACCGGA	ACCTCCCACG	TTGGGACTCC	CACGTTCCGG	15660
GGACCTGAAT	GAGGACCGAC	TTTATAACTT	TTCCAGTGTT	TGATTCCCAA	ATTGGGTCTG	15720
GTTTTGTTTT	GGATTGGTAT	TTTTTTTTTT	TTTTTTTTTT	GCTGTGTTAC	AGGATTCAGA	15780
CGCAAAAGAC	TTGCATAAGA	GACGGACGCG	TGGTTGCAAG	GTGTCATACT	GATATGCAGC	15840
ATTAACTTTA	CTGACATGGA	GTGAAGTGCA	ATATTATAAA	TATTATAGAT	ΤΑΑΑΑΑΆΑΑΑ	15900
ATAGCCGTGC	ACTCTTGACC	CCGTCAACGT	CCAACGTGGA	AAAGGCGTTA	CCTCTTCTCC	15960
CAGCGCTGGC	CGCCTGGCCA	CTGAGGGCCC	TTTGCAAAAA	TCACGGGTGT	AGAGATGGCC	16020
CTGGGCGCGC	TGGGAGTGTG	GTTGTGTTTC	TGAAGGGGAT	AAAAGAGGGC	ACGGTGGTGC	16080
CAAGATATCA	GTTTGGTACC	TGAGCTGTTT	GTGGTTGGGA	AGCGTAAAAG	CCAGGGAGAG	16140
ATCCAGAGAG	TTTTCAAGTT	TTTGCAGATG	TAGGTGGTTC	CAGCTTTTCT	TTCTCCCCTA	16200
CTCCATCTTC	TGCGTTCCCC	CAGTTCTTTT	ATTTCTTTGT	TTTTTATTTT	TGAGACAGAG	16260
ACTTGCTTTG	TCGCCCAGGC	TGGAGTGCAG	TGGCGCAATG	TCAGCTCACT	GCCACCTCCA	16320
CCTCCCGGGT	TCAAGCGATG	CTCCTGCCTC	AGCCTCCCGA	GTAGCTGGGA	CTACAGGCAC	16380
CTGCCACCAC	CCCCGGCTAA	TTTTTTGTAT	TTATAGTAGA	GACGGGGTTT	CACCGTGTTG	16440
GCCAGGCTCG	TCTCGAACTC	CTGACCTCAG	GTGATCTGCC	CGCCTCGGCC	TCCCAACGTG	16500
CCCCCAGTTT	TATAAACAGC	AGATAGCAAC	TTGTCGTCAC	AGCTGGCATG	GGCTGGACAG	16560
TTGCTTGAAA	TGACCTAACC	AAAAACATTC	AAGGGTTCTG	CCCCCAGATT	TCGGGAGATC	16620
CACGTTCCAT	GTTCTGATTG	GTTTTCTGGG	AACACAGCAA	GGGGTTTGGT	GAGCTCCGAG	16680
AAGATCCATC	TGCATGATTG	GCATTAGTTA	CCACAGCCTG	CCCAGAGAGA	AACTATCTTC	_16740
TCCCAACATT	TACTAACATC	CACTGGTCAA	CTCTCTTATT	TCCATAACAC	ATTTGCATCT	16800
TTCTGGATTC	AAGCTTGGTG	GTTTTCTTTC	CTAACTTCTG	ATTTAGATAC	TTCTCCCfGA	16860
GGT GvjGoAT A	AAAGAAAAAA	AAAAAACAAC	*£*	CTTCCGCATA	ACACTTTCTA	16920
TCTTGTCACT	GAGCTGAACT	GTAGATCCAT	TTGGACCCGT	CTCATTTGTA	TCTTCTGATA	16980
TTCTTTATAC	AAACCAAAAG	TCCCCTTCAA	CATTTTTTAT	GTCAAAATGT	TACAACCGCT	17040
GTAAAATGAC	GGAGAGAGAG	AGAAAGAATC	CCAGACATTA	ACGGTATTAG	AGAGTTTGCC	17100
TCATTCATCC	ATTTTTCTTA	AAAGCTGGAA	ATTAAAAAAA	AAAAAGAGAG	AGAGAGGCTT	17160
TAATAGTTAA	GCTGAAATTT	TTATCGAAAA	GAAGAATTGC	ATTTTGAATC	TTTGGGAAGT	17220
AGGTTCATTC	ATCAGAGTAT	GTAACCCTTT	GGAAAAGTGG	TTGGTAAGAT	ATGTACAGCC	17280

9

	72	9 9 9 9 9 9 99 9 9 9 «99 • 9 9 9 999 99 9	9 9 9 9 9 99999 · 9 9 9 9
CTAGATTTTT	TTTTTTTTAA	CCAAAAAGGC	TGAGTAATTT	TGAAAAATCG	AAACATAACA	17340
GTGTGTCATC	ATTTCCTCCC	AAGAAAAAGC	TCACTCCACG	TGAGTAGAAA	GACATCTACC	17400
TGGTCCCTGT	AGAATCTGAA	CGTTTCTCTT	TAGAGACGGA	ATTTCAATCT	TGTTGCCCAG	17460
GCTGGAGTGC	AGTGGCACAA	TCTCGGCTCA	CCGCAACCTC	CGCCTCCCGG	GTTCAAGCCA	17520
TTCTCCTGCC	TCAGTCTCCC	GAGTAGCTGG	GATTACAGGC	ACCTGCCACC	AGGCCTGGGT	17580
AACTTTCTGG	TATTTTTAGT	AGAGACAGGG	TTTCAGCCTC	CCGAGTAGCT	GGGATTACAG	17640
GCACCTGCCA	CCAGGCCTGG	GTAACTTTCT	GGTATTTTTA	GTAGAGACAG	GGTTTCAGCC	17700
TCCGGAGTAG	CTGGGATTAC	AGGCACCTGC	CACCAGGCCT	GGGTAACTTT	CTGGTAGTTT	17760
TAGTAGAGAC	AGGGTTTCGG	CCTCCCGAGT	AGCTGGGATT	ACAGGCACCT	GCCACCAGGC	17820
CTGGGTAACT	TTCTGGTATT	TTTAGTAGAG	ACAGGGTTTC	GGCCTCCCGA	GTAGCTGGGA	17880
TTACAGGCAC	CTGCCACCAG	GCCTGGGTAA	CTTTCTGGTA	TTTTTAGTAC	AGACAGGGTT	17940
TCGGCCTCCT	GAGTAGCTGG	GATTACAGGC	ACCTGCCACC	AGGCCTGGGT	AACTTTCTGG	18000
TAGTTTTAGT	AGAGACAGGG	TTTCAGCCTC	CCGAGTAGCT	GGGATTACAG	GCACCTGCCA	18060
CCAGGCCTGG	GTAATTTTTT	TGCATTTTTG	GTAGAGACAG	GTTTTTGCCG	TGTTGGCCCG	18120
GCTGGTCTCA	AACTCCTGAC	CTCAGGTTGA	CCTGCCCGCT	TTGTCCCTCG	CAAAGTGCTG	18180
GGATTACAGG	CGTGAGCCAC	CACACCTGGC	CTGAATCTGA	ACTTTTAAAA	GGGAGTTACT	18240
GACTCTCAAC	TGTGCGGGGA	CGGTTTCACT	TTGATTTAAT	ATGGAAAGAG	GGCCAAGTGT	18300
CATCCTCACA	AATGGGTCCC	CGAAGCAGAT	CAAACGCAGA	GAACTGTGAG	GGTGGGACAC	18360
GAGTGTCTGT	GGACACTGGC	TGCCTTTGGC	TTTTCTCCTG	CGAGAGAAGT	TGGGTGACTT	18420
TCTGTAGGTG	GATGAGTGAT	CCCTGAATGA	GTGTGGGGTA	CGTGTATGCT	AGCTGCTTCT	18480
TTCTCCCTGA	AACTCTCGGA	T GvrAAGv, A/^G	TAAGAAATTC	AGCTTGGGCT	G j GACCAG l Γ	18540
CTCACCACCA	ACGCCCTCTT	CTCTCTCCCT	TCTCCTTCCT	TCCTTCCTTC	CTTCCTTTCT	18600
TTCTTTTTCT	TTCTTTCTCT	CTTTCTTTCT	TTTCTTTCTT	TCTGTTTCTT	TCCTTTTTAT	18660
CTTTCTCTCT	TTTTCTTTCT	CTTTTCCTTT	TTTGTTTCTT	TCTTTCTTTT	TCTTTCTTTC	18720
TTTTTCTTTC	TTCTTTCTTT	CTTCGATGAA	GTCTCACTCT	GTCACCCAGG	CTGGAGTGCA	*18780
GTGGTGCAAT	CCCAGCTCAC	1 <jGA I CCl C Γ	ACCTCCTGGC	TTCAAGAAAT	TCTCCTGCCT	18840
CAGCCTCCCA	AGTAGCTGGG	ATGACAGGCA	CCCACCACCA	TTCCCGGATA	ATTTTTGTAT	18900
TTTTTAGTAG	AGACTGGGTT	TCGCCATGTT	GGCCAGGCTG	GTCTTGAACT	CCTGACCTCA	18960
CATGATCCAC	CCGCCTCAGC	CTCCCAGAGT	GCTGGGATTA	CGGGGTGAGG	CACCGCGCCC	19020
GGCCTCCTCT	CTCTTTTTCT	GAGATGTTTA	GGAAGGACTG	GGCTGATGGG	GACCCTCTGT	19080
ATGTGATGTG	CGTGGGTTTG	GTTTCCCGGA	AGGCCCTCCA	GAGACACGTT	TGCGTGAACA	19140
TTCAGCATGG	AAACAACATA	CGTCTCTCCA	CAGGAGGTGA	GAAATTGAAT	TTATGGGGTG	19200
GGTGTACGCT	GGCGATTCTT	GGTGCTTTTT	GCTCAAAACA	AGGTTCTTTT	GAAAGTCACG	19260

TTCCTGCTTT CCCTGTGGCT TCCCGGTGAG CTCGCTCGCA GAGCAAGGAA TACCACCCAG 19320

9 9 9

9

	73	4 4 4 4 « 444 4 4 4 · 4 4 4*4 * 44444 4	4 4 4 4 4 4 44 44 4 4 4 4
AGAGCAACGT	GGGCTGTGTT	CCGTTGTAAC	GCCGTTGCAG	AGAGAGGATT	TGGTGTGTGA	19380
GATCCGTACC	AGCTCCAGCA	CACTGATAGG	AACACGTTGC	TGGCCGAACT	GAACGATGCT	19440
GGGTTGGGTC	CTGATTGATA	CGTATTTTCT	TCCCTCCTCT	CCCCAAAACT	TGGCCAAATA	19500
GTCCGTGGAG	GGTTGTCAGT	CGCCGCAGTT	GAGCAAAAAA	CACTTCTTCC	TTTGAGTGGC	19560
TGTTCTGGTG	AAATCTGTTT	CTGACATATC	CACTTTTCTC	TCTCTTTTCT	CTCTCTCTGA	19620
CTGCGAAGCA	CCCACAGGGA	GAAGGAATTG	GATGTATCGG	ATGTTGGTAT	TAGATTTTCT	19680
TTCTCCGTTC	GAGTCTCTGA	CTGGTGCATA	CTTTGCAAAG	GTGTGTTCCT	GGCAATTGCC	19740
AAGAGTTAGA	AAAATGCACC	TTCTCTGGTG	GCCGTTGGGG	TGTTGTTTCA	CAGGCAGTGG	19800
TGACAGGGCC	CCTTGGCTGT	GGCTGTCTTC	TCCAGCGCCG	TGGATAAAGA	GACGGGACAG	19860
ATTCTGTGCC	TCTGTACGAT	TTAGAGCGTA	ACTGACCGCG	TCCAACACCC	GTTTTTCCAC	19920
TTACAAAGCT	GGTGGTGCGA	CGGGCTTGGT	GTCTCCCGTA	CGGGAAGGAG	GCCTTTGGGC	19980
CGCTCCAAAG	ACGCCCTGTC	GTAGGAATGG	CCTCTCCATC	CCGCCAAAGT	CCAGCCAGGC	20040
CCCCGAAATG	GTCCCATTTC	CTTGGAAGCC	TGAGTTTCTG	TTCTGGTCTT	GCTGCTGTCC	20100
TTGGCCACGT	CAGCACGTGG	GAGCATCTGT	GGATACCGCA	GAGTCTGGGG	ACAGCTGGGC	20160
GTTTAACCGA	AATGAAGCCG	AGACGGGTTT	CAGGTTTTGG	TGCCAAGCTC	TGGTCAGGAT	20220
GAAAGGGAAA	TACCAGAGTC	CTCTGTCCTC	GCCTCTGGGT	TTCATGCTGA	CCTTTCTAAC	20280
ATTTGTTTTC	CCCTAAGAAC	AAGCAGAAGC	CTCCAGCTCC	CTTTAGCTCC	ACAGTTTTCC	20340
CGGGGACATA	GCGAGGATGG	CACACGGCAG	CCACTCCCAC	GACACACATT	TCGGAGGCAC	2Ό4ΟΟ
TTTGCTGGAA	GCCGCTTGTC	TCCTCCAGCT	TTGGGAGGTC	TGGGGAGGAG	AGAGGCTTTC	20460
GGTGGACACG	TTTGACATTA	AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	AAAAAAACTG	GTGCCTAATT	20520
TATTAAAGAG	AATTAGCTTA	GCGAGTATAT	GCTGATATTC	TTCGACACAC	GTGGGTAAGT	20580
TGATGCCATT	TATAAATGTT	TTATTGAAAT	TTGATATTTA	ATGAGAAGCC	GGTTAAGGAA	2064 0
TGTAGACAAT	ATCCCGTTTC	AAAGCTATGA	AATGTGCTAT	TTATTGAAAG	GGGATGTGGC	20700
TTCACGAGTT	CAGCCCATTG	TACGTGCAGG	TCCCGTGGGA	AGGAGGCAAA	AGCCCCTGCT	20760
TCTTACTTTG	TGATGTATGT	GCATTTGTTA	TTTATTTTTT	TTTCCTTGGT	CGGACGTTCA	*20820
TAAATATGTA	CTATTTTAAT	TATGTCGAGT	GTAAATTTGA	CATCGCGTTG	CATTTATTTT	20880
TATATTTCTG	AAAACTGTTG	CTTTTTCTTT	TTCCCTCCCC	CATTGACGAC	ATAGCGGtCC	20940
CCGCGTCCGG	GTTACAAATA	CATCTACAGA	TATTTTCAGG	GATTGCTTCA	GATGAAAACA	21000
AATCACACAC	CGTTTCCCAA	ACCAACAGTC	TTCACATTTC	TATCCCTCTG	TTATTGTCGG	21060
CAGGCGGTGA	GGGGTAGAAA	AAAAACAAAC	AAACAAACAG	AAAAAAAAAC	CAAAAAAAAC	21120
CACCCTGAGT	TTCTCTGGTG	ACGCCCTCAT	TCTCCTAACG	TTCAATAATC	TCAATGTTGA	21180
GTTGCAGCAA	CAGACTGTAT	TTTTGTGACG	CCCCGTAGTA	TGAATGTACA	TCTTGTAAAA	21240

• 4

4 «44

CTGAGATATA AATAAACTTA TAAATATTTG TATTCAAGTG TTAAAAAAAA AAAAATTCTC 21300

4 4 4 *

• 44 » 44 44

4 4 4 4

4444 4 ·

4 444 444444

4 4 4 4 4 ·*· ·* ·* * • 44 4

4

AACCTCTCCC	CTGAGGACAG	gcttattgga	AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	ATCCTGAGTC	21360
GGCCGTGGCT	GAACACAGAG	TGTTGTTCTG	CTGCGTGCAT	TTCCAGGGTG	GGTACCCAGT	21420
GTTGCCCCCC	AGCCTTAGAT	CGGGAGGTAC	CATTGACTTT	TGGTTGTATC	CCATCCCCTT	21480
CCTTTACTGA	AACCTACCTC	CCCGCTTCTC	AGCCAACGTC	CCCCCAGAAG	GTGGCAAAAA	21540
AAACAGAGGA	AAAAGCCCTG	ATTTGAATCA	AGTCAGAGCT	GCTAATTCTC	CACTTTCTTT	21600
ΑΑΤΤ7ΆΤΤΑΑ	TTTATTTTTT	TTTTTGAGAC	TGAGTCTCGC	TCTGTCGCCC	AGGCCGGAGG	21660
AGTGCAGGGG	CGCGATCTCG	GCTCACCGCG	ACCTCCGCCT	CCCGGGTTCA	AGCGACTCTC	21720
CTGCCTCAGC	CTCCCGAGTA	GCTGGGATGA	CAGTCACCTG	CACCACCGCG	CCGGGCTCAT	21780
TTTTGTATTT	TTAGTAGCAA	TGGGGTTTCA	CCGTGTTGGT	CAGGCTGGTC	TCGAACTCCT	21840
GACCTCGTGA	TCCACCCGCG	TCTGGGCCCG	GCCGGTGATG	TGTGTGCTTT	TAACTTTTAT	21900
TTTGTTCCAG	TTTTCGACAG	TGGGACGGAT	TTTCCAGCAC	GGTCTTGCAA	GGATGATTGA	21960
GTCATTTTTG	AGACAAAAAA	TATAATAATA	ATAAATGGAA	AAAGAAATCG	ACTTTTAAAA	22020
ATGACAAATT	TTTTTTTTTT	TTTTTTGCAT	AGATTTTTCT	CTCTTTATGT	AAAGGAAAGT	22080
TCATGATTGG	ATTTGGCCGG	CCTGACTGCT	TCCCGGCTGT	GATAAAAAAC	ACATGTGAGC	22140
TGGGAGGGAA	GTGGGGGAGG	GACACAGCTG	CCCACACAGG	GTTCCCACCG	CGGTTACAGG	22200
GTGGGCAGTG	CTGGGGGAGC	TTTCTCTGTG	GGGGGCTCAG	AGCCTGAGGA	CAGGTGAGGC	22260
TCTCCGACAC	CTCCCCAGTT	GCCTGGAGTC	TAAACCGTCC	GTTGTCTGTA	CCGTCCGTTC	22320
TTCCTGCTGA	CTCCTGGTAG	TTCCTGAAAG	CTTCTCTTGG	CCAGAGAAGG	GGTTTCAGAG	22380
GCCGTGTGTC	CAGGCCATTC	TGCAAAGTGC	AACTTGACCG	TTCCTTTCCT	TTTCTGGCCT	22440
GCGTGGTCTG	AAGCTCAGAG	CCCTCTCTTC	ACCCAGCCTG	TGTGTGTCTT	GCCGGACAGA	22500
AGAAAAATGG	TGCTTTTTGC	GTGTTAGCAG	AGGTGCTTTT	CATGGCTGAC	CTCAACGCGT	22560
CCATCTCCAG	CCTTGACCAA	GCTGTTTTTT	AGGGGCAAAC	GCAGGCAAGT	TCTGAATGCA	22620
CACAGTTATT	TCATGGTTAA	ACTATTCAGC	TTTGGCCGGG	CGCAGTGTGG	CTCTCACGCC	22680
TGTCATCCCA	GCACTTTGGG	AGGCCGAGGC	GGGTGGATCA	CCTGAGGTCA	GGAGTTCGAG	22740
ACCAGCCTGG	CCAACACGGT	GAAACTCTAT	CTCTACTAAA	AATACAAAAA	TTAGCCGGGC	22800
GTGGTGGTGT	GTATCTGTAA	TCCCAGCTAC	TCAGGAAGCT	GAGGCAGGAG	AATCGCTTGG	22860
ACCCAGGAGG	CGGAGGTTGC	ACTGAGCCGA	GATCGCGCCA	TTGCACTCCA	GCCTGGGCG/A	22920
CAGAGCCAGA	CGCTGTCTCA	AAAAAATGAA	ΤΑΑΤΑΑΛΑΤΑ	AAATAACAGG	AACTAAATAA	22980
AATAAAACGT	TCAGCTTTGT	TCTGCAAATC	CACTCCTATT	GTTTTACGTG	GTTTGAGAGA	23040
CTCTGTCCCT	TAGAAATAGA	TGTTTGTTGC	CAATTGTAAT	GAATCTGTTT	CAAAAATGAA	23100
CAGAATATTC	AAATGGTTTG	AGAGATCTTT	TCCCTTAGAA	ATAGCTTGTT	GCCAATCACA	23160
AAGAATGTTT	TTCAAAAATG	AATGGAATCT	TCCTGGATAT	CGCTTCCAGA	TCTTCATTTT	23220
TTTTGCATAG	TTCAACCTGA	AAAGTAAGTG	TCTCAGCCCT	GAATTTCTTT	CTGATTTTTC	23280
CATGGGTTGT	CTTGCAGACT	TCTCTGGACT	TGACCACATT	TAAAAAAAAA	AAAATTAACT	23340

«9

9 4

9 4«

4 4

4 4

94« ··

9994 9

4 • 4 4«

4 4

4 ·

444 944 «

94

TTTTCACACG	GACACGGTTT	CAATAGGAAT	GAGATCTTTG	AGTTTTTATG	TAACAGATTC	23400
TTACCATCAG	TTCTCAGATT	CCCAAATTAC	ACACAAAAAG	CCACGGACTT	CGCCTCCTGC	234 60
TAACATGTCC	TTCTGTTTCT	GAGGCTTCTG	TTGGTGTTAG	ACTTTCATGT	TTAATAGCAG	23520
ACAATGTAGG	GATTTAAAGA	AAAATGCAGA	GAAAGCAAAA	ACACTGACCA	AACACACGGA	23580
GATAAGCTTT	CTAAAGCCTT	TGTTCTTGGA	GTTGTCGTTA	AAAAAAAAAA	GTTGTTTTAA	23640
ACTTTGCAAG	CATGCCTATA	TTGAACTCAT	AAGCAAGAGA	GCCAAGAAAA	ATAGTGTCGG	23700
TCGTCTACTC	TACACGTTTT	CCCAAAACAG	ACGTATTTTA	ATTTCTTTTG	TTTGAACTCA	23760
CAGATGCTGA	GAGTTAAAAG	TTAAATTTTT	GTCATGAACA	ATAGTGGCCA	AAACCACAGT	23820
TACTTTTGCA	CTATAGCATA	AT7VAGAAAAA	TACAGGCTGG	GCTCGGTGGC	TCACACCTGT	23880
AATCAAAGCA	CTTTTGGAGG	CGAAACAGCC	AGATCCCTTG	AGCCCAGGAG	ATTGAGACCA	23940
GCCTGGGCAA	CATAGCGAGA	CCCTCATCTC	TACAAAAAAG	GTTTGTTACA	TATGTAACAA	2 4000
ACCTGCACAT	TGTGCACATG	TACCCTAAAA	CTTAAAGTAT	AATAATAAAA	AAATTAAAAA	24060
AAAATTCACC	AATCAACTGC	CTGCTGGTGC	CTTCAAGAGA	CTCACCTAAC	ACATAAGGAC	24120
TTGCATAAAC	TTATAAAACA	ATTCAATGGA	AGAATCCTTG	AAAGTATTCT	GAGAAGACAG	24180
TATAATAAAC	TGATTTCTAA	AAAGGCTATA	AAAAATTGAA	TAAATCATTG	TTGGGCATCC	24240
TGTGCTGAAA	TATAATGCAG	CCAATAAAAA	TTACAAAATG	AATAAACATT	TTATAACAAT	24300
AAAAAAAAGT	CAAATAATTA	GGCAGGCATG	GTGGTGCTCT	CCTACGGTTG	AAGCTATTCA	24360
GCAGGCAAGA	GGATACTTTG	TTTTTGTTTT	TTAATTTTTT	TTGAGACAGA	GTCTCGCTCT	24420
GTTGCCAGGC	TGGAGTGCAG	TGGCGTGATC	TCAGCTCACT	GTAATTTCTG	CCTCCCGGGT	24480
TCAAGCGATT	TTCCTGCCCC	AGCCTCCCGA	GTAGCTGGGA	TTACAGGTGC	CCGCCACCAC	24540
ACCTGGCTAA	TTTCTTTTGT	ATTTTTAGTA	GAGACGAGGT	TTCCCCATGT	TGGCCAGGCT	24600
GGTTTTGAGC	TCCCGACCTC	GGGTGATCCA	CCCGCCTCAG	CCTCCCAAAG	TGCTGGGATG	24660
ACAGGCGTGA	GCCACCGCGC	CTGGCCCAGG	AGGATTATTT	GATCCCAGGA	GGTGGAGGCT	24720
GCAGGAAGCC	ATGATTGCAC	CACTGCACTC	CAGCCTGGCT	GACAGAGTGA	GACCACATCT	24780
CTAAATAAAT	GAATAAATAC	AGGCAGAAAC	TTTTTTTGTT	TTGTTTTGAT	GGAGTCTTGC	*24840
TCTGTCACCA	GGCAGGAGTG	CAGTGGTGCC	ATCTCAGCTC	ACTGCAACCT	CCACCTCCTG	2 4 900
GGTTCAAGCA	ATCCTCCTGC	CTCAGCCTCC	CGAGTAGCTG	GGATTACAGG	TGCCCGCGAC	24960
CACGCCCGGC	TAATTTTTTG	TATGTTTAGT	AGAGACGGGA	TTTCACCGTG	TTAGCCAGGA	25020
TGGTCTTGAT	CTCTTGACTT	TGTGATCTGC	CTGCCTCAGC	CTCCCAAAGT	GCTGGGATTA	25080
CAGGCATGAG	CCCAGGAGTT	CAAGACCAGC	CTCAGCAACA	AAGTGAGACC	TTTTCTCTCC	25140
AAAAAATCAA	AAATTTAGCC	AGCTGTGGTG	GCTCCTGCCC	GTGATCCCAG	TACTGTGGGA	25200
GGCTGAGGCA	GAATTGCTTG	AGCCCAGGAG	TTCGAGACCA	ACCTCAGCAA	AAAGGACTCT	25260

CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTATAT ATATATATAT ATATATATAT 25320

	• 76	• ·« ·· • · · • · ·· · • · · « · • · · * «· ·· ·«	• ·» • · * * • · · · · ···*· · ·»· • « · • ··	»· « * • · • · · • ··
GAGTTTCAAA	AATTGCTGGG	TGACCAGCTC	ATCTACTGGT	TTTCCCCTTG	GGAAAGTGAA	25380
ATTGTCATGT	ATTGAAGATT	TCCAAGGAAG	TTGTATTGAA	TGAGAAACAA	ACTCAATCTG	25440
TTCGTGTTTA	AAGAGCTGCA	GTGCGTTTGC	TGTGTTTCCC	ATAAAACTGC	ACTTCCAAAA	25500
GACACGCTGA	GAAAGGAGAC	CAGGATTTGT	AATTCAGAAA	TTGGAAAGCA	AGTTAGGCTG	25560
GACGTGGTAG	CTCATGCTTG	TTGTAATCTC	AGCACTCTGG	GAGGCTGAGG	CAGGAGGATC	25620
ACTTGAGCCC	AGGAGTTCAA	GACCAGCCCG	TGCCACATGG	TGAAACCCTG	TCTCTCCAAA	25680
AAATAAAACA	TTTAGCCAGA	TGTGGTGACT	CATGCCTGTA	ATCCCGGTAT	TCTGGGAGGC	25740
TGAGGCAGAG	TTGCTTGAGC	CCAGGAGTTC	AAGACCAGCC	TCGGCAACAA	AGTGAGACCC	25800
TGTCTCTCCA	AAAAATAAAA	CATTTAGCCA	GCTGTGGTGA	CTCATGCCTG	TAATCTCAGT	25860
ACTCTGGGAG	GCTGGGGCAG	AATGGCTTGA	GCCCAGGAGT	TCGAGACCAA	CCTCAGCAAC	25920
AAAGTGAGAT	CTTGTTTGTC	CAAAAAATCA	AAAATTTAGC	CAGCTGTGCT	GGCTCATGCC	25980
TGTAATCCCG	GTACTCTGGG	AGGCTGAGGC	AGAATCGTTT	GAGCCCAGGA	GTTCGAGACC	2 6040
AACCTCAGCA	ACAAAGTGAG	ATCTTGTTTC	TCCAAAAAAA	TCAAAAATTT	AGCCAGCTGT	26100
GCTGGCTGGT	GCCTGTAATC	CCGGTACTCT	GGGAGGCTGA	GGCGGAATTG	CTTGAGCCCA	2 6160
GGAGTTCAAG	ACCAGCCTCA	GCAACAAAGT	GAGATCTTGT	TTCTCCAAAA	AATAAAACAT	26220
TTAGTCAGCT	GTGGTGGGTC	AAGCCTGTGA	TCCCAGCATT	TTGGGAGGCC	GAGGCGGGCG	26280
GATCACGAGG	TCATGAGATC	GAGACCATCC	TGGCTAACAC	GGTGAAACCC	CGTCTCTACT	26340
AAAAATACAA	AGAAAATTAG	CCGGGCGTGG	TGGCGGGCGC	CTGTAGTCCC	AGCTACTCAG	26400
GAGGCTGAGG	CAGGAGAÁTG	CCGTGAGCCT	GGGAGGCGGA	CCATGCAGTG	AGTCAAGATC	26460
GCGCCACTGC	CCTCCAGCCT	GGGCCACAGA	GCAAGACTCC	GTCTCAAAAA	/AAAAAAAAAA	26520
AAAACTGCTG	CCCAACCTGT	GTTTGCACCA	CTGCCCTCCA	GCCTGGGCAA	CAGAGCAAGA	26580
CTCCGTCTCA	AAAAAAAAAA	AATGCTGCCC	AAGCTGTGTT	TGCACCACTG	CCCTCCAGCC	26640
TGGGCAACAG	AGCAAGACTC	CGTCTCAAAA	AAAAAAAAAA	AAAATGCTGC	CCAAGCTGTG	26700
TTTGCACCAC	TGCCCTCCAG	CCTGGGCAAC	AGAGCAAGAC	TCTGTCTCAA	/AAAAAAAAAA	26760
AATGCTGCCC	AAGCTGTGTT	TGCACCACTG	CCCTCCGGCC	TGGGCAACAG	AGCAAGACTC	_ 26820
CGTCTCAAAA	AAAAAAAAAA	AATGCTGCCC	AAGCTGTGTT	TGCACCACTG	CCCTCCAGCC	26880
TGGGCAACAA	AGCAAGCCTC	AGCTTTCTGC	CATCTCCACA	ACCAAGAAAG	CAATTCACAC	26940
AGAAATCAGT	GGATCGTGCA	GTGACCTCTT	CAGAAAACCA	ATGAGTTTTC	CACCTGAGGA	27000
ACTGTTTCTG	AGCCCCATTC	AGAAAAACAC	ATCCCTGTAA	CTGCAGGGCA	GATTTACTCA	27060
CTGTATGCCT	GTTTAAATAA	AGCTTCCAGC	CTCTGCATGG	GGTCTGTCTG	GAAGCTCCTG	27120
TATCTGTCCC	ACATTCTTGG	AATCACAATG	CACCCTTGGG	AGGAAGATAT	GTATTTAAAG	27180
GGAGTGGATG	TTATGGTGAG	AAAATGCTGC	CCATCCTTCT	AGAAGACAAA	AGCCACACAA	27240
AATACATCAC	AAGAACCAGT	TTTTTTCAGA	GAAGAACCTG	CACAAAGAAC	CTGCTCCCCC	27300
CACACCCCCA	CACACAGGTG	AATTAACAGG	ATGTATGTTT	TATCATAAAA	GCACAGGTTT	27360

·· • · • · • 9 · 9 9 9

9 9 9 9 ·

9·· 99 99 9 • ·· ·· · • ··· • · ···· • 9 99

9 9 9

9 9 9

999 999

9

99

GTTTCCTATG	CACTCTCTGA	GGATTTGGCC	ATATGCAAAG	ATGTACAAAA	ACCTTCTCTT	27420
TCCCCAGGGA	ACCGTAACCC	GTCTGAAAAG	ATGCCCTTCT	CAGAAGCGAG	TTGAACGATT	27480
GTTGGAAAAG	ATAAAATACG	ACGTGCACAC	ACACAGTAGA	GAAATGTCAC	CCATGCAAAT	27540
TATGTGTTTG	AATGGAACAC	ATTCAGGAAG	CTAAATGGGG	TATGACCACA	CATTTGGGTT	27600
GATTTATTTG	ACGAGTGGAA	GGGGCAGATG	GAAATGAATA	CTGCTGTTTT	CCTTTGGAAG	27660
GCCATATATG	GGAATACGAA	GAGGATTACT	TTGGAAGTTT	AGCTTCTCCA	GGTGGTCTCT	27720
CTCTCTCTCT	CTTTTTTTGA	GACAGAGTCT	CACTCTGTCA	CCCAGGCTGC	AGTGCAATGG	27780
CGTGCTCTCG	GCTCACTGCA	ACCTCAGCCT	CCCAGGTACA	AGCGATTCTC	CTGCCTCAGC	27840
CTCCCGAGTA	GCTGGGATCA	CAGGTGTGCA	CCACCACGGC	TGGCTAATGT	TTGTATTTTC	27900
AGTAGAGATG	AGGTTTTACC	ATGTTGGGCA	GGCTGGTCTT	GAACTCGTGA	CCTCAGGTGA	27960
TCCGCCTGCC	TCGGCCTCCC	AAAGTGCTGG	GATGACAGAC	ATGAGCTAGC	ACGCCCGGCC	28020
CCAGGTGGTC	TTTTTAGCGG	GTATTAAAGC	AGCTTTCTCT	CTGAGCCTTA	AACCATGAAG	28080
ATAGACAGAC	TCAGTGTATG	GGTTTTAGAG	TTGTAATTTT	ATAAAAATAA	GAAAAAGTCG	28140
ACCTATCATT	GATGGTTAGT	ATTTTTTGTA	GCAGTTGCAT	GCAATATTAG	GATAAGGCAT	28 200
GTTCTCAAAA	AGAACTCTTT	3? T T T 3? *5* T	TTTGAGACGG	AGTCTGGCTC	TGTCACCCAG	28260
GCTGGAGTGC	AGTGGCACGA	TCTCCGCTCA	CTGCAAGCTC	CTCTTCCCGG	GTTCACGCCA	28320
TTCTCCTGCC	TCAGGCTCCC	CAGTAGCTGG	GACTACAGGC	GCCCGCCACC	ACGGCCGGCT	28380
AATTTTTTGT	ATTTTTAGTA	GAGACGGGGT	TTCACCATGT	TAGCCAGGAA	GGTCTCGATC	28440
TCC7GACCTC	ATGATCCC-TC	CGCCTCAGCC	TCCCAAAGTG	CTGGGACTAC	AGGCGTGAGC	28500
CACTGCACTT	GGCCTTTTTT	TTTTTTTAGA	TGGACTTTTG	CTCTTGTCGC	CCAGGCTGGA	28560
GTATAATGGC	ATGATCTCGA	CTCACTGCAA	CCTCCGCCTC	CCGAGTTCAA	GCGATTCTCC	2 8 620
TGCCTCAGCC	TCCCGAGTAG	CTGGGATTAC	AGGTGCCCAC	CACCATGTCA	AGATAATGTT	2 8 680
TGTATTTTCA	GTAGAGATGG	GGTTTGACCA	TGTTGGCCAG	GCTGGTCTCG	AACTCCTGAC	28740
CTCAGGTGAT	CCACCCGCCT	TAGCCTCCCA	AAGTGCTGGG	ATGACAGGCG	TGAGCCCCTG	28800
CGCCCGGCCT	TTGTAACTTT	ATTTTTAATT	TTTTTTTTTT	TTTAAGAAAG	ACAGAGTCTT	*28860
GCTCTGTCAC	CCAGGCTGGA	GGAGAC Γ Gvj Γ	GGGATCATAG	CTCACTGCAG	CC I CzWAC I C	28920
CTGGGCTCAA	GCAATCCTCC	CACCTCAGCC	TCCTGAGTAG	CTGGGACTAC	AGGCACCČAC	2 8980
CACCACACCC	AGCTAATTTT	TTTGATTTTT	ACTAGAGACG	GGATCTTGCT	TTGCTGCTGA	29040
GGCTGGTCTT	GAGCTCCTGA	GCTCCAAAGA	TCCTCTCACC	TCCACCTCCC	AAAGTGTTAG	29100
AATTACAAGC	ATGAACCACT	GCCCGTGGTC	TCCAAAAAAA	GGACTGTTAC	GTGGATGTTC	29160
TAGCTTCCTG	TTCTCGTCTT	TTCTTTGTTA	ATTGTACAGT	TTGAGGGTGT	GTGTGCGTGT	29220
GCGCACGTGT	GTGTGTGCAG	TCTCCTGATT	TCATGTATTT	AATTGTTATT	ACCACCACCT	29280
CCATCTCTCA	TTCCTTCTTA	CCCTCACTGT	GTAAAGATAC	ATGTTGTTTT	TAAATTTTAT	29340

GTATTTATAT	TTATTTATTT	GTATTTCTGA	GACAGAGTCT	CACTCTGTTG	CCCAGGCTAG	29400
TGGCATGATC	TCAGCTCACA	GCAACCTTTG	CCTCCTGGGT	TCAAGCGATT	CTCCTGCCTC	29460
AGCCTCCCGA	GTAGCTGAGA	TTACAGGCAC	ACACCACCAC	ACCCGGCTAG	TTTTGTTTTG	29520
AGACGGAGTC	TCGCTCTGTT	GCAGGCTGCA	GTGCAGTGGC	GTGATCCTGG	CTCACTGCAA	29580
CCTCTGCCTC	CTGGATTCAA	GCGATTCTCC	TGCCTCAGCC	TCCCAAGTAG	CTGGGATTAC	29640
AGGCGCCCAC	CGCCACACCT	GGCTAATTTT	TTATTGGTAG	TAGAGACGGG	GTTTCTCCAT	29700
GTTGACCAGA	CTGGTCTTGA	ACTCCCAACC	TCGGGTGATC	CACCCACCTG	GGCCTCCCAA	29760
AGTGCTGGGA	TGACAGGCGA	GGGCCACCGC	GTCCAGCCTT	CTTCTTCTTC	TTCTTTTTTT	29820
TTTTTTTAAG	ATGGAGTTTC	ACTCTGTTGC	CCAGGCTGGA	GTGCAGTGGT	GCAATCTCGG	29880
CTCCCTGGAA	CCTCCACCTC	CCAGGTTCAA	GAAATTCTTT	TGCCTCAGCC	TCCCGAGTAG	29940
CTGGGACTAC	AGGTGCCCGC	CACCACACCC	ACCTAATGTT	TGTATTTTTT	TGGTAGAGAC	30000
GGGGCTTCAC	CACATTGGCC	AGGCTGGTCT	TGAACTCCTG	ACTTCAGATG	ATCCTCCTGC	30060
CTCAGCCTCC	CAGAGTGTTG	GGATTACAGG	CGTGAGCCAC	GGTGCCCGGC	CAGACGTCAT	30120
GTCTTAGGAA	ATCAGAAAGT	GGGTAGTTTC	CGCACTCTGA	GGAGAAAAAG	AGACGTCCGG	30180
CGAAGAGAAA	GGAGAGTGAA	AGGATGTCTC	CTCTTGTCTG	TAGCCTGTTC	TCAATCGTGA	30240
GTGAGCCAAT	TGCCAGAAAC	TGAGGGTGCT	TCATTTGGCC	AGGCAAGCTT	CTCAACAGAA	30300
TGTCTAAGTA	CTTGTTAATG	CTGAGAAGCT	CTCCAAGCTA	CTGCACTCCA	GCCTGGGTGA	30360
CAGAGCACGA	CCTTGTCTGA	AAACAATTAA	TTAATCAATT	AATTAATATA	ATGAAATCAT	30420
ACTGAACTCA	GGAGACCATT	GGGGTGGGCA	GGGCTGGGGT	TGGAAAGGAA	CATAAAATAT	30480
GGTGCAATGG	actttgctcc	AGTCTCCCTC	CCCATCTCTT	CTCGCCAAGA	GTCTCTGGAG	30540
GGAGCATGGG	GAAGATGCTT	TGGGAATCTG	TAACTTCTTG	TCTTGTAAAC	AGAATATCTA	30600
AGTAATTGTT	AATGCTGAGA	AGTTATAGAT	TTCCAAAGCC	TTTCTCCAGG	CTACGGACAA	30660
GGGTCATGGG	TTACTCAGTG	TTACAGAAAG	AATGACATGG	AGATGTTTGT	TACATCTTAA	30720
GGAACCATGA	GGGGCCAGAG	TATTTTACTC	TAAGTG7AGA	TGGTACATTG	GCCACGCCTG	30780
TCCCAACACC	ACCAATGGTG	GCACCTAACT	TTTGTGTTTG	TGCCCCACAT	TTCTTCTTCT	30840
TTTCTGACGT	AAATGCAAGT	GATATTCCTT	GGAAACCATG	CTGCAGCAAG	AGGCCATCTG	30900
ACTACTAGTG	ATACCCTGTA	GCTCACCTAC	AGCAGCTCAC	TTGAAGCAGC	TCACČCATAG	30960
CTCAGGTATA	GCTCACCTGC	AGCGGCTCAC	CTGTAGCTCA	CGTGTAGCTC	ACTTGTAGCA	3 1020
GCTCACTGGT	AGCTCACCTG	CAGCAGCTCA	CCTGTACCTC	ACCTGTACCT	CACCTGCAGC	31080
AGCTCACCTG	TAGCTCACCT	GTACGTGAGC	CACCGTACCC	GGCCAGCAAG	ACCCCATTTC	31140
TAAAATAAAT	ACACAAAAAT	TAGCCGGACG	CGGTGGCGCG	TGTCTGTAGT	TGTAGCTACT	31200
CAGGAGGCTG	AGGTGGGAGG	ATTGCTGGAG	GCTGGGAGGT	AGAGGCTGCA	GTGAACCGTG	31260
ATCCAGCCAC	TGTACTCTAG	CCTGGATGAC	ATAGCAAAAC	CTTGTCTCAA	AAAACAAAAA	31320
CAAAAAACAA	AACAAAGAAA	CAAACAAAAA	ACCCACACAC	ACCGGAAAAC	AAAACAAAAA	31380

• ·0 · ··· · · · · • 0 Q · 0 0000 0 000 000

0 0 0 0 · ·

			79		•to ·· ··	0
GCAAAAAGGA	AAGAAAAGAG	AGCCAGGTCC	CAAATATATA	TTTCCTTGGA	GAACCATTTG	31440
CAAAGAGCAC	ACTTAAGGCC	GGGCGCGGTG	GCTCACGCCT	GTCATCCCGG	CACTTTGGGA	31500
GGCCGAGGTG	GGTGGATCAC	GAGGTTGGGA	GATCGÁGACC	ATCCTGGCCA	ACATGGCGAA	31560
ACCCCATCTC	TACTAAAAAT	ACAAAAAATC	AGCCAGGTGC	TGAGGCAGGT	GCCTGTAGTC	31620
CCAGCCACTC	AGGAGGCTGA	GGCAGGAGAA	TGGCATGAAC	CTGGGAGGTG	GAGGTTGGAG	31680
TGAGCCGAGA	TCGCGCCCCT	GCACTCCAGC	CTGGGCGACA	GAGCGAGACT	CCTTCTCAAA	31740
TAAATAAATA	AATAAATAAC	AAAGAGCAAA	CTTAAAATTG	TCTCAGAAAT	CCCACGGGAT	31800
ATTGGATCTC	CCTCATGCCT	ATCTGATGAC	ACTTTGAGTG	TCTGGGGCCC	CGTGCCTATT	318 60
TTCTGGGGTT	CCCAGAAGCT	GCCGTTCTGA	AAGTGTGGCT	CTCGGGGACG	TGGCACAGGT	31920
GTGGATGTCT	GTTTTAAATG	TCAGGCGTTT	GGACGTTGAG	GAACGTGAGG	CTGAAGGTCG	31980
GCTTCGCCGA	CCCCCTGAGT	TTAGGGTCCT	gccttttaaa	ATCTTCCCAG	CACTCTGTTG	32040
TTCACGCAAG	CGTCCCATCT	GTTTGGGTGG	CCGTGCCGTC	TGCATCTGTC	TCGAACCTTC	32100
ACAGCTTTGC	AGAATATCCT	GTTTCTCAAT	ACGGATGGAG	AAACACGAGA	CGCGTTTTCT	32160
GGGTTATTTT	AGCCGTCACG	GAGAACCCCA	GACTGATGTG	TGCTAATGAC	CTCATTAATG	32220
ATACTCTGAG	GCAGACAGCC	CTGCCTGATC	TTAACAACAT	TTTTTAAATT	TCTTTTTTTG	32280
TTGTTGTTGT	TACAGCATCA	TTCATATAAC	GTAGGAAACC	GTGATCAGTA	GCTTTTAGGA	32340
TATTTGCAAC	AGGGTGTAAC	ADAAABD				32367

(2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 806 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (iii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „SHOT (ix) RYSY:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) POZICE: 43..615 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 15:

GTGTCCCCGG	AGCTGAAAGA	TCGCAAAGAG	GATGCGAAAG	GGATGGAGGA	CGAAGGCCAG	60
ACCAAAATCA	AGCAGAGGCG	AAGTCGGACC	AATTTCACCC	TGGAACAACT	CAATGAGCTG	120
GAGAGGCTTT	TTGACGAGAC	CCACTATCCC	GACGCCTTCA	TGCGAGAGGA	ACTGAGCCAG	180
CGACTGGGCC	TGTCGGAGGC	CCGAGTGCAG	GTTTGGTTTC	AAAATCGAAG	AGCTAAATGT	240
AGAAAACAAG	AAAATCAACT	CCATAAAGGT	GTTCTCATAG	GGGCCGCCAG	CCAGTTTGAA	300
GCTTGTAGAG	TCGCACCTTA	TGTCAACGTA	GGTGCTTTAA	GGATGCCATT	TCAGCAGGTT	360
CAGGCGCAGC	TGCAGCTGGA	CAGCGCTGTG	GCGCACGCGC	ACCACCACCT	GCATCCGCAC	420

«· »44 ·· • 4 4 4 4 4

4 4 * 4 ·

4 4 4 4 »44 44 44 ř» 4 4 4 4 4 4

4

4 4

CTGGCCGCGC	ACGCGCCCTA	CATGATGTTC	CCAGCACCGC	CCTTCGGACT	GCCGCTCGCC	480
ACGCTGGCCG	CGGATTCGGC	TTCCGCCGCC	TCGGTAGTGG	CGGCCGCAGC	AGCCGCCAAG	540
ACCACCAGCA	AGGACTGCAG	CATCGCCGAT	CTCAGACTGA	AAGCCAAAAA	GCACGCCGCA	600
GCCCTGGGTC	TGTGACVCCA	ACGCCAGCAC	CAATGTCGCG	CCTGTCCCGC	GGCACTCAGC	660
CTGCASNCCC	TNDDKANMCG	TTRCTYHTCM	ATTACACTTT	GGGACCYCGG	GDBAGVCCTT	720
TTNNAGACTT	YVATKGGSCW	CSCTGGBCCC	TBRKGAWAC	TTGSGHYCGR	GAACCGAKHT	780
GCCCABAYGA	GGACCRGTTT	GGAKDG				806

(2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 190 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetě
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP	MOLEKULY: peptid
(xi)	POPIS	SEKVENCE: SEQ ID NO: 16:

Met 1

Glu

Asp

Glu

Gly 5

Gin

Thr

Lys

Ile

Lys 10

Gin

Arg

Arg

Ser

Arg 15

Thr

Asn

Phe

Thr

Leu 20

Glu

Gin

Leu

Asn

Glu 25

Leu

Glu

Arg

Leu

Phe 30

Asp

Glu

Thr

His

Tyr 35

Pro

A3p

Ala

Phe

Met 40

Arg

Glu

Glu

Leu

Ser 4 5

Gin

Arg

Leu

Gly

Leu 60

Ser

Glu

Ala

Arg

Val 55

Gin

Val

Trp

Phe

Gin 60

Asn

Arg

Arg

Ala

Lys 65

Cys

Arg

Lys

Gin

Glu 70

Asn

Gin

Leu

His

Lys 75

Gly

Val

Leu

Ile

Gly 80

Ala

Al a

Ser

Gin

Phe 85

Glu

Ala

Cys

Arg

Val 90

Ala

Pro

Tyr

Val

Asn 95

Val

Gly

Ala

Leu

Arg 100

Met

Pro

Phe

Gin

Gin 105

Val

Gin

Ala

Gin

Leu 110

Gin

Leu

Asp

Ser

Ala 115

Val

Ala

Hi 3

Ala

His 120

His

Hi 3

Leu

His

Pro 125

His

Leu T

Ala

Ala

His 130

Ala

Pro

Tyr

Met

Met 135

Phe

Pro

Ala

Pro

Pro 140

Phe

Gly

Leu

Pro

Leu 145

Ala

Thr

Leu

Ala

Ala 150

Asp

Ser

Ala

Ser

Ala 155

Ala

Ser

Val

Val

Ala 160

Ala

Ala

Ala

Ala

Ala 165

Ly3

Thr

Thr

Ser

Ly3 170

Asp

Ser

Ser

Ile

Ala 175

Asp

Leu

Arg

Leu

Lys

Ala

Lys

Lys

His

Ala

Ala

Ala

Leu

Gly

Leu

180 185 .. 190

Změněné nároky

·«· ····♦· ·· • · · * 99 9 99· • · 9 9

Claims (35)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Molekula nukleové kyseliny kódující polypeptidy, které obsahují oblast homeoboxu tvořenou 60-ti aminokyselinami a mají aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1 a vykazují regulační aktivitu lidského růstu a dále obsahují nukleotidovou sekvenci SHOX ET93 (SEQ ID NO:2) a nukleotidovou sekvenci SHOX ET45 (SEQ ID NO: 4).
2. 2. Molekula DNA podle nároku 1, která kóduje polypeptid, jehož délka je 150 až 350 aminokyselin.
3. 3. Molekula DNA podle libovolného z nároků 1 nebo 2, která dále obsahuje nukleotidovou sekvenci SHOX G310 (SEQ ID NO: 3).
4. 4. Molekula DNA podle libovolného z nároků 1 až 3, která dále obsahuje nukleotidovou sekvenci SHOX G108 (SEQ ID NO: 5).
5. 5. Molekula DNA podle libovolného z nároků 1 až 4, která dále obsahuje nukleotidovou sekvenci SHOX Va (SEQ ID NO: 6) nebo SHOX Vb (SEQ ID NO: 7) .
6. 6. Molekula DNA podle libovolného z nároků 1 až 5, která kóduje polypeptid vybraný ze skupina, která zahrnuje:

   a) transkripční faktor A, který má v podstatě aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO: 11),

   b) transkripční faktor B, který má v podstatě aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO: 13).
7. 7. Sekvence DNA podle libovolného z nároků 1 až 6, přičemž DNA je genomová nebo izolovaná DNA odpovědná za regulaci lidského růstu.

   φφ φφ φ φ φ φ Φ· φ · • φφφ φ φ φ φ φ φφ φφ

   ΦΦΦΦ φ

   φφ φφ r φ φ φ » φ φ φ φφφ φφφ

   Φ φ φ φ φ φ
8. 8. Sekvence DNA podle libovolného z nároků 1 až 6, přičemž DNA je cDNA.
9. 9. cDNA podle nároku 8, která v podstatě obsahuje nukleotidovou sekvenci SHOXa (SEQ ID NO: 10) nebo SHOXb (SEQ ID NO: 12).
10. 10. DNA podle nároku 7, která v podstatě obsahuje nukleotidovou sekvenci genu SHOX (SEQ ID NO: 14).
11. 11. Lidský růstový protein, který má aminokyselinovou sekvenci danou v sekvenci (SEQ ID NO: 11) (transkripční faktor SHOXa), nebo jeho funkční fragment vykazující regulační aktivitu lidského růstu
12. 12. Lidský růstový protein, který má aminokyselinovou sekvenci danou v sekvenci (SEQ ID NO: 13) (transkripční faktor SHOXb), nebo jeho funkční fragment vykazující regulační aktivitu lidského růstu.
13. 13. Lidský růstový protein, který má aminokyselinovou sekvenci danou v sekvenci (SEQ ID NO: 16) (transkripční faktor SHOT) , nebo jeho funkční fragment vykazující regulační aktivitu lidského růstu.
14. 14. cDNA kódující protein, který má aminokyselinovou sekvenci danou v (SEQ ID NO: 11), (SEQ ID NO: 13) nebo (SEQ ID NO: 16).
15. 15. Farmaceutická kompozice, vyznačuj ící se tím, že obsahuje protein podle libovolného z nároků

    11, 12 nebo 13.

    .)

    99 99 9

    9 9 9 9 9 ·

    9999 9 99« 9

    9 999 999999

    999999 9 9 • 9999 99 » 99 99

    9 9

    9 9

    999 999
16. 16. Způsob léčby malé výšky vyznačující se tím, že zahrnuje subjektu, je-li to nutné, terapeuticky účinné proteinu podle nároku 11, 12 nebo 13.

    postavy, aplikaci množství
17. 17. Použití proteinu podle nároku 11, 12 nebo 13 při přípravě farmaceutické kompozice vhodné pro léčbu malé výšky postavy.
18. 18. Použití sekvence DNA podle libovolného z nároků 1 až 10 nebo 14 nebo jejího fragmentu, která vykazuje regulační aktivitu lidského růstu, při přípravě farmaceutické kompozice pro léčbu vad spojených s mutacemi genu odpovídajícího za malou výšku postavy.
19. 19. Použití sekvence DNA podle libovolného z nároků 1 až 10 nebo 14 nebo jejího fragmentu, která vykazuje regulační aktivitu lidského růstu, při přípravě kitu pro identifikaci jedinců, kteří mají genetický defekt odpovědný za poškození lidského růstu.
20. 20. Použití sekvence DNA podle libovolného z nároků 1 až 10 nebo 14 nebo jejího fragmentu, která vykazuje regulační aktivitu lidského růstu, při identifikaci genu odpovědného za malou výšku lidské postavy.
21. 21. Způsob stanovení malé výšky postavy na základě molekul RNA nebo DNA, vyznačující se tím, že molekula biologického vzorku, který se zkoumá, se amplifikuje v přítomnosti dvou nukleotidových sond komplementárních s libovolnou ze sekvencí DNA uvedených v SEQ ID NO: 2 až SEQ ID NO: 7 a následně se stanoví pomocí vhodného detekčního systému.

    <*

    99 9· 9

    9 9 9 · • 999 9 999

    9 999 9 9 9 9

    9 9 9 9 9

    99999 99 9 ·9

    9 9 9

    9 9 9
22. 22. Použití způsobu podle nároku 21 při identifikaci osob, které mají genetický defekt odpovědný za malou výšku postavy.
23. 23. Transgenní zvíře nebo zvíře s deaktivovaným genem, vyznačující se tím, že je transformované genem odpovědným za malou výšku postavy, který obsahuje sekvenci DNA podle libovolného z nároků 1 až 10 nebo 14.
24. 24. Buňky transformované sekvencí DNA podle libovolného z nároků 1 až 10 nebo 14.
25. 25. Testovací systém, vyznačující se tím, že je vhodný pro identifikaci nebo testování činidel použitelných při léčbě malé výšky lidské postavy, který zahrnuje buňky podle nároku 24.
26. 26. Způsob identifikace nebo testování kandidátů farmaceutických činidel použitelných při léčbě vad vztahujících se k mutacím genu odpovídajícího za malou výšku postavy, vyznačující se tím, že zahrnuje testovací systém podle nároku 25 a stanovení změn fenotypu uvedených buněk nebo změn produktů exprese uvedených buněk po té, co se uvedené buňky dostanou do kontaktu s uvedenými kandidáty farmaceutických činidel.
27. 27. Expresivní vektor, vyznačující se tím, že obsahuje molekulu DNA podle nároků 1 až 10 nebo 14, která je schopna způsobit expresi kódovaného polypeptidu.
28. 28. Způsob in vivo léčby genovou terapií vad růstu u lidí spojených alespoň s jednou mutací v genu SHOX nebo SHOT, vyznačující se tím, že zahrnuje zavedení expresivního plazmidu do lidských buněk, ve kterém molekula DNA podle libovolného z nároků 1 až 10 nebo 14 je začleněna ve • »· »· · • ·»«

    9 9 9

    9»

    99» 9 * »· « • 9 9

    9 9 9

    9 9999

    9» ·» ·

    99

    9 9 9

    9 9 9

    999 999

    9

    99 směru 3'konce polynukleotidu od expresivního promotoru, jenž způsobuje expresi v lidské hostitelské buňce.
29. 29. Způsob podle nároku 28, vyznačuj ící se tím, zeje vhodný pro léčbu Turnérova syndromu nebo malé výšky postavy.
30. 30. Použití lidských růstových proteinů nebo jejich funkčních fragmentů, které mají regulační aktivitu lidského růstu, při přípravě léků pro léčbu pacientů, jenž vykazují genetickou mutaci genů lidského růstu SHOX (SEQ ID NO: 8) nebo SHOT (SEQ ID NO: 15) s tou podmínkou, že je vyloučena příprava léků pro léčbu pacientů trpících Turnérovým syndromem.
31. 31. Použití lidských růstových proteinů nebo jejich funkčních fragmentů, které mají regulační aktivitu lidského růstu, při přípravě léků pro léčbu pacientů, jenž vykazují genetickou mutaci genů lidského růstu SHOX (SEQ ID NO: 8) nebo SHOT (SEQ ID NO: 15) a u nichž se použitím molekul DNA schopných hybridizovat se sekvencí DNA genů lidského růstu SHOX nebo SHOT zjistilo, že mají genetický defekt odpovědný za malou výšku postavy, s tou podmínkou, že je vyloučena příprava léků pro léčbu pacientů trpících Turnérovým syndromem.
32. 32. Použití podle nároků 30 až 31, kde genetická mutace je způsobena horkým místem mutace v sekvenci DNA kódující bod zkrácení proteinu v pozici aminokyseliny 195 v lidském růstovém genu SHOX.
33. 33. Použití podle libovolného z nároků 30 až 32, kde lidský růstový protein je lidský růstový hormon.
34. 34. Způsob léčby pacientů vykazujících vady způsobené mutacemi lidských růstových genů SHOX (SEQ ID NO: 8) nebo SHOT • 44 • 4 4

    444

    4 4 4 4

    44444 4

    4

    44 (SEQ ID NO: 15) , vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci pacientovi, je-li to nutné, farmaceuticky aktivní množství lidského růstového proteinu s tou podmínkou, že se vyloučí léčba pacientů trpících Turnérovým syndromem.
35. 35. Způsob léčby pacientů vykazujících vady způsobené mutacemi lidských růstových genů SHOX (SEQ ID NO: 8) nebo SHOT (SEQ ID NO: 15) a u nichž se použitím molekul DNA schopných hybridizovat se sekvencí DNA lidských růstových genů SHOX nebo SHOT zjistilo, že mají genetický defekt odpovědný za malou výšku postavy, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci pacientovi, je-li to nutné, farmaceuticky aktivní množství lidského růstového proteinu s tou podmínkou, že je vyloučena léčba pacientů trpících Turnérovým syndromem.

    • ·« ·· * . ·· ·· · φ φ φ φφφφ φ φ · · φ φφφ « φφ · • φ φφφ φ φφφφ · φφφ φφφ ···«·· · φ

    ΦΦΦ·· φφ « φ» φφ