CN116606920A - 一种定性分析和定量分析基因rilpl1的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因技术领域，具体涉及一种定性分析和定量分析基因RILPL1的试剂盒。本发明提供了一种定性分析基因RILPL1的试剂盒，可以建立RP‑PCR的PCR反应体系，对OPDM患者RILPL1基因突变进行鉴定，优点在于，可以方便和较低成本下检测OPDM患者的致病基因RILPL1是否具有致病性，相对于常规的肌肉活检，具有更好的实用性、对患者创伤更小。
Description
技术领域
本发明涉及基因技术领域，具体涉及一种定性分析和定量分析基因RILPL1的试剂盒。
背景技术
眼咽远端型肌病(Oculopharyngodistal myopathy，OPDM[MIM:164310])是一种罕见的成年早期发病的遗传性神经肌肉病。该病典型的临床表现为青年发病、缓慢进展性对称性上睑下垂、眼外肌麻痹、面部肌肉力弱、饮水呛咳和吞咽困难等球部症状以及远端肢体为主的肌无力。长期以来该病的致病基因未明，缺乏基因诊断指标，导致OPDM常被误诊和诊断延迟。因此，寻找OPDM的致病基因对该病的诊断、基因治疗和发病机制的研究具有重要意义。
本发明通过临床和骨骼肌病理检查，已确诊并收集来自51个家系的OPDM患者，综合运用Nanopore三代测序、RP-PCR(Repeat-primed polymerase chain reaction)和AL-PCR(Fluorescence amplicon length analysis polymerase chain reaction)，发现位于12号染色体的RILPL1基因5’UTR区域CGG重复扩增是OPDM的一个新致病基因，该突变占本组患者的21.6％。因此，RILPL1的5’UTR区域CGG重复扩增是OPDM的全新致病突变。
本发明首次鉴定出OPDM的全新致病基因RILPL1，为该疾病的基因诊断、基因治疗靶点和发病机制研究提供基础。同时，本发明针对该新基因开发了相对应的RP-PCR和AL-PCR辅助分析的方法，大大提高了对OPDM疾病的基因诊断能力。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种定性分析和定量分析基因RILPL1的试剂盒。
一种定性分析基因RILPL1的试剂盒，包括基于SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列设计的定性检测引物。
可选的，所述的定性检测引物为RP-PCR引物；
可选的，所述的定性检测引物包括正向引物RILPL1-F，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，反向引物RILPL1-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物RILPL1-linker-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
可选的，所述定性检测引物中的一个引物标记有荧光报告基团，所述荧光报告基团包括FAM，VIC，Cy3，Cy5，TAMRA，FITC，TRITC，或TET在内的所有荧光基团；
可选的，所述定性检测引物中的一个引物的5’端标记有荧光报告基团。
可选的，还包括DNA聚合酶、dNTPs、二甲基亚砜和/或甜菜碱。
可选的，DNA聚合酶为TaKaRa LA Taq DNA聚合酶；
可选的，dNTPs包括dATP，dTTP，dCTP和7-Deaza-dGTP；
可选的，还包括LongAmp Hot Start Taq Master Mix。
可选的，包括独立包装的DNA聚合酶、PCR反应试剂和引物液：
可选的，采用上述DNA聚合酶、PCR反应试剂和引物液配制的PCR反应体系中，以20μl为计：
TaKaRa LA Taq DNA聚合酶，0.25U；
LongAmp Hot Start Taq Master Mix，浓度为1×；
dATP，dTTP，dCTP和7-Deaza-dGTP的各200μM；
二甲基亚砜，体积百分比为3％；
甜菜碱，1.4M；
正向引物RILPL1-F，0.225μM；
反向引物RILPL1-linker-R，0.225μM；
反向引物RILPL1-R，0.125μM；用双蒸水补足至20μl。
一种非疾病诊断的定性分析基因RILPL1的方法，包括所述的定性分析基因RILPL1的试剂盒。
可选的，配制PCR反应体系，以20μl为计：
TaKaRa LA Taq DNA聚合酶，0.25U；
2×LongAmp Hot Start Taq Master Mix，浓度为1×；
dNTPs，dATP，dTTP，dCTP和7-Deaza-dGTP各200μM；
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正向引物RILPL1-F，0.225μM；
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反向引物RILPL1-R，0.125μM；
基因组DNA，100ng；
用双蒸水补足至20μl。
可选的，PCR反应条件为：95℃下反应5分钟；然后进行10个循环：95℃反应30秒，64℃反应30秒，每个循环下降1℃，72℃下反应2分钟；接着是25个循环：95℃反应30秒，58℃反应30秒，72℃反应2分钟；最后延伸步骤72℃，5分钟。
一种定量分析基因RILPL1的试剂盒，包括基于SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列设计的定量检测引物。
可选的，所述的定量检测引物为AL-PCR引物；
可选的，所述的定量检测引物包括正向引物RILPL1-2-F，其核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，反向引物RILPL1-2-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
可选的，所述定量检测引物中的一个引物标记有荧光报告基团，所述荧光报告基团包括FAM，VIC，Cy3，Cy5，TAMRA，FITC，TRITC或TET在内的所有荧光基团；
可选的，所述定量检测引物中的一个引物的5’端标记有荧光报告基团。
可选的，还包括DNA聚合酶、dNTPs、二甲基亚砜和/或甜菜碱。
可选的，DNA聚合酶为TaKaRa LA Taq DNA聚合酶；
可选的，dNTPs包括dATP，dTTP，dCTP和7-Deaza-dGTP；
可选的，还包括LongAmp Hot Start Taq Master Mix。
可选的，包括独立包装的DNA聚合酶、PCR反应试剂和引物液：
可选的，采用上述DNA聚合酶、PCR反应试剂和引物液配制的PCR反应体系中，以20μl为计：
TaKaRa LA Taq DNA聚合酶，0.25U；
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正向引物RILPL1-F，0.3μM；
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一种非疾病诊断的定量分析基因RILPL1的方法，包括所述的定性分析基因RILPL1的试剂盒。
可选的，配制PCR反应体系，以20μl为计：
TaKaRa LA Taq DNA聚合酶，0.25U；
LongAmp Hot Start Taq Master Mix，浓度为1×；
dNTPs，dATP，dTTP，dCTP和7-Deaza-dGTP各200μM；
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甜菜碱，1.4M；
正向引物RILPL1-F，0.3μM；
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可选的，PCR反应条件为：95℃下反应5分钟；然后进行10个循环：95℃反应30秒，64℃反应30秒，每个循环下降1℃，72℃下反应2分钟；接着是25个循环：95℃反应30秒，58℃反应30秒，72℃反应2分钟；最后延伸步骤72℃，5分钟。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供了一种定性分析基因RILPL1的试剂盒，可以建立RP-PCR的PCR反应体系，对OPDM患者RILPL1基因突变进行鉴定，优点在于，可以方便和较低成本下检测OPDM患者的致病基因RILPL1是否具有致病性，相对于常规的肌肉活检，具有更好的实用性、对患者创伤更小。
2.本发明提供的一种定量分析基因RILPL1的试剂盒，可以建立AL-PCR方法对OPDM患者RILPL1基因CGG重复次数定量，优点在于，可以方便和较低成本下检测OPDM患者的致病基因RILPL1的CGG重复次数，相对于三代测序和Southern-blot检测方法，操作更加方便，时间更短，成本更低。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例5中OPDM患者和正常人的定性分析基因RILPL1的结果；
图2是本发明实施例6中OPDM患者和正常人的定量分析基因RILPL1的结果；
图3是本发明对比例1中OPDM患者和正常人的定性分析基因RILPL1的结果；
图4是本发明对比例2中OPDM患者和正常人的定量分析基因RILPL1的结果；
图5是本发明实施例7中OPDM患者和正常人的定量分析基因RILPL1的结果；
图6是本发明实施例8中部分OPDM患者的定量分析基因RILPL1的结果；
图7是本发明实施例8中200例正常人的定量分析基因RILPL1的结果。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
本发明鉴定出OPDM的一个全新致病基因RILPL1，该基因碱基序列如下(NCBI)：>NC_000012.12:c123533886-123470054Homo sapiens chromosome 12,GRCh38.p13Primary Assembly。上述致病基因RILPL1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例1定性检测引物设计
本实施例提供了基于SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列设计定性检测引物如下：正向引物RILPL1-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物RILPL1-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物RILPL1-linker-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
其中，正向引物RILPL1-F 5’端标记有荧光报告基团，所述荧光报告基团为FAM。
实施例2定量检测引物设计
本实施例提供了基于SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列设计定量检测引物如下：正向引物RILPL1-2-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物RILPL1-2-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
其中，正向引物RILPL1-2-F的5’端标记有荧光报告基团，所述荧光报告基团为FAM。
实施例3一种定性分析基因RILPL1的试剂盒
本实施例提供了一种定性分析基因RILPL1的试剂盒，
包括如下独立包装的DNA聚合酶、PCR反应试剂和引物液；
采用所述DNA聚合酶、PCR反应试剂和引物液配制的PCR反应体系中，以20μl为计：
TaKaRa LA Taq DNA聚合酶，0.25U；
LongAmp Hot Start Taq Master Mix，浓度为1×；
dATP，dTTP，dCTP和7-Deaza-dGTP的各200μM；
二甲基亚砜，体积百分比为3％；
甜菜碱，1.4M；
正向引物RILPL1-F，0.225μM；
反向引物RILPL1-linker-R，0.225μM；
反向引物RILPL1-R，0.125μM；
用双蒸水补足至20μl。
实施例4一种定量分析基因RILPL1的试剂盒
本实施例提供了一种定量分析基因RILPL1的试剂盒，
包括独立包装的DNA聚合酶、PCR反应试剂和引物液；
采用所述DNA聚合酶、PCR反应试剂和引物液配制的PCR反应体系中，以20μl为计：
TaKaRa LA Taq DNA聚合酶，0.25U；
LongAmp Hot Start Taq Master Mix，浓度为1×；
dATP，dTTP，dCTP和7-Deaza-dGTP各200μM；
二甲基亚砜，体积百分比为3％；
甜菜碱，1.4M；
正向引物RILPL1-F，0.3μM；
反向引物RILPL1-AL-R，0.3μM；
用双蒸水补足至20μl。
实施例5一种定性分析基因RILPL1的方法
本实施例提供了一种定性分析基因RILPL1的方法，包括如下步骤：
(1)分别提取已确诊OPDM患者和正常人的基因组DNA，采用TAKARA血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA；
(2)分别以步骤(1)中的OPDM患者和正常人的基因组DNA为模板，利用实施例3中的试剂盒配制得到如下PCR反应体系进行RP-PCR，总反应体积为20μl：
TaKaRa LA Taq DNA聚合酶，0.25U；
LongAmp Hot Start Taq Master Mix，浓度为1×；
dNTPs，dATP，dTTP，dCTP和7-Deaza-dGTP各200μM；
二甲基亚砜，体积百分比为3％；
甜菜碱，1.4M；
正向引物RILPL1-F，0.225μM；
反向引物RILPL1-linker-R，0.225μM；
反向引物RILPL1-R，0.125μM；
基因组DNA，100ng；
用双蒸水补足至20μl。
PCR反应条件为：95℃下反应5分钟；然后进行10个循环：95℃反应30秒，64℃反应30秒，每个循环下降1℃，72℃下反应2分钟；接着是25个循环：95℃反应30秒，58℃反应30秒，72℃反应2分钟；最后延伸步骤72℃，5分钟。
(3)将步骤(2)中获得的PCR产物分别使用3500xl基因分析仪进行毛细管电泳分离并使用GeneMapper软件进行数据分析。OPDM患者和正常人(正常对照)的分析结果见图1所示，由图1中的OPDM患者的分析结果可以看到锯齿峰，说明检测到了基因RILPL1，基因RILPL1的5’UTR区CGG重复突变，正常人的分析结果未看到锯齿峰，说明未检测到基因RILPL1的5’UTR区CGG重复突变。
实施例6一种定量分析基因RILPL1的方法
本实施例提供了一种定量分析基因RILPL1的方法，包括如下步骤：
(1)分别提取已确诊OPDM患者和正常人的基因组DNA，采用TAKARA血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA；
(2)分别以步骤(1)中的OPDM患者和正常人的基因组DNA为模板，利用实施例4中的试剂盒配制得到如下PCR反应体系进行AL-PCR，总反应体积为20μl：
TaKaRa LA Taq DNA聚合酶，0.25U；
LongAmp Hot Start Taq Master Mix，浓度为1×；
dNTPs，dATP，dTTP，dCTP和7-Deaza-dGTP各200μM；
二甲基亚砜，体积百分比为3％；
甜菜碱，1.4M；
正向引物RILPL1-F，0.3μM；
反向引物RILPL1-AL-R，0.3μM；
基因组DNA，100ng；
用双蒸水补足至20μl。
PCR反应条件为：95℃下反应5分钟；然后进行10个循环：95℃反应30秒，64℃反应30秒，每个循环下降1℃，72℃下反应2分钟；接着是25个循环：95℃反应30秒，58℃反应30秒，72℃反应2分钟；最后延伸步骤72℃，5分钟。
(3)将步骤(2)中获得的PCR产物分别使用3500xl基因分析仪进行毛细管电泳分离并使用GeneMapper软件进行数据分析。OPDM患者和正常人的分析结果见图2所示，由图2中可以看到OPDM患者基因RILPL1的5’UTR区CGG重复突变159次，位于OPDM患者CGG重复次数139-197次之内，正常人的分析结果可以看到基因RILPL1的5’UTR区CGG重复突变属于正常人的范围内(9-16次)。
对比例1一种定性分析基因RILPL1的方法
本实施例提供了一种定性分析基因RILPL1的方法，包括如下步骤：
(1)分别提取已确诊OPDM患者和正常人的基因组DNA，采用TAKARA血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA；
(2)分别以步骤(1)中的OPDM患者和正常人的基因组DNA为模板，配制得到如下PCR反应体系进行RP-PCR，总反应体积为20μl：Prime STAR GXL DNA聚合酶，0.25U；
PrimeSTAR GXL缓冲液，浓度为1×；
dNTPs，dATP，dTTP，dCTP和7-Deaza-dGTP各200μM；
二甲基亚砜，体积百分比5％；
甜菜碱，1M；
正向引物RILPL1-F，0.3μM；
反向引物RILPL1-linker-R，0.3μM；
反向引物RILPL1-R，0.1μM；
基因组DNA，100ng；
用双蒸水补足至20μl。
PCR反应条件为：98℃下反应10分钟；然后进行9个循环：98℃反应30秒，66℃反应15秒，每个循环下降1℃，72℃下反应4分钟；接着是28个循环：98℃反应30秒，58℃反应15秒，72℃反应4分钟；最后延伸步骤72℃，10分钟。
(3)将步骤(2)中获得的PCR产物分别使用3500xl基因分析仪进行毛细管电泳分离并使用GeneMapper软件进行数据分析。OPDM患者和正常人的分析结果见图3所示，无法对OPDM患者和正常人进行有效区分。
对比例2一种定量分析基因RILPL1的方法
本实施例提供了一种定量分析基因RILPL1的方法，包括如下步骤：
(1)分别提取已确诊OPDM患者和正常人的基因组DNA，采用TAKARA血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA；
(2)分别以步骤(1)中的OPDM患者和正常人的基因组DNA为模板，配制得到如下PCR反应体系进行AL-PCR，总反应体积为20μl：Prime STAR GXL DNA聚合酶，0.25U；
PrimeSTAR GXL缓冲液，浓度为1×；
dNTPs，dATP，dTTP，dCTP和7-Deaza-dGTP各200μM；
二甲基亚砜，体积百分比5％；
甜菜碱，1M；
正向引物RILPL1-F，0.3μM；
反向引物：RILPL1-AL-R、RILPL1-AL-R1(5’-3’：CAAACTCGTGCAACTCCCAAACT，参见序列表SEQ ID NO.7所示)或RILPL1-AL-R2(5’-3’：CTCGGCCACGTTCTTCTCCA，参见序列表SEQID NO.7所示)，0.3μM；
基因组DNA，100ng；
用双蒸水补足至20μl。
PCR反应条件为：95℃下反应5分钟；然后进行10个循环：95℃反应30秒，64℃反应30秒，每个循环下降1℃，72℃下反应2分钟；接着是25个循环：95℃反应30秒，58℃反应30秒，72℃反应2分钟；最后延伸步骤72℃，5分钟。
(3)将步骤(2)中获得的PCR产物分别使用3500xl基因分析仪进行毛细管电泳分离并使用GeneMapper软件进行数据分析。OPDM患者和正常人的分析结果见图4所示，特异性针对RILPL1基因的引物RILPL1-F和三种R引物：RILPL1-AL-R、RILPL1-AL-R1、RILPL1-AL-R2，均无法检测出OPDM患者的重复次数。
实施例7一种定量分析基因RILPL1的方法
本实施例提供了一种定量分析基因RILPL1的方法，包括如下步骤：
(1)分别提取已确诊OPDM患者和正常人的基因组DNA，采用TAKARA血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA；
(2)分别以步骤(1)中的OPDM患者和正常人的基因组DNA为模板，利用实施例4中的试剂盒配制得到如下PCR反应体系进行AL-PCR，总反应体积为20μl：TaKaRa LA Taq DNA聚合酶，0.25U；
LongAmp Hot Start Taq Master Mix，浓度为1×；
dNTPs，dATP，dTTP，dCTP和7-Deaza-dGTP各200μM；
二甲基亚砜，体积百分比为3％；
甜菜碱，1.4M；
正向引物RILPL1-F，0.3μM；
反向引物RILPL1-AL-R、RILPL1-AL-R1或RILPL1-AL-R2，0.3μM；
基因组DNA，100ng；
用双蒸水补足至20μl。
PCR反应条件为：95℃下反应5分钟；然后进行10个循环：95℃反应30秒，64℃反应30秒，每个循环下降1℃，72℃下反应2分钟；接着是25个循环：95℃反应30秒，58℃反应30秒，72℃反应2分钟；最后延伸步骤72℃，5分钟。
(3)将步骤(2)中获得的PCR产物分别使用3500xl基因分析仪进行毛细管电泳分离并使用GeneMapper软件进行数据分析。OPDM患者和正常人的分析结果见5所示，特异性针对RILPL1基因的引物RILPL1-F和RILPL1-AL-R可检测出OPDM患者的重复次数，而利用引物RILPL1-F和RILPL1-AL-R1、RILPL1-AL-R2均无法检测出OPDM患者的重复次数。
实施例8
本实施例通过临床和骨骼肌病理检查，已确诊并收集来自51个家系的51例OPDM先证者按照实施例6的方法进行检测，结果显示OPDM患者RILPL1基因的CGG重复次数在139-197次，部分OPDM患者AL-PCR分析RILPL1基因结果如图6所示。
本实施例还对200例正常人按照实施例6的方法进行检测，200例正常人对照通过AL-PCR分析鉴定RILPL1基因CGG重复数的频率分布结果如图7所示，正常人对照的RILPL1基因的CGG重复次数为9-16次。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<120> 一种定性分析和定量分析基因RILPL1的试剂盒
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 63833
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttcctctccg gccccgcgct ctgccgcccc tcaggcccgc accgccccga ggcgcccggc 60
ccggctccat tgagcgcaac tcggatccca acttgggagg cgccgcgggc ctgcgcacgc 120
gcgcgccctc cccgctgccg ccgccgccgc cgccgccgcc gccgcccact cgggagcagc 180
tccgggccga gccgggcgcc cagaccccgg gcccgcacac cccgcgccgc cgcccgtgcc 240
cgcgcccgcg cccgccgccc gctgcccgct gcgccctcgc cccagcgccc gctgagcgcg 300
cccgcccgcg gcccaggctg ggcccggccg gcccggccct cgacagcggc aagtttggga 360
gttgcacgag tttgcggggc gggggacagg ccaggagggt ggccatggag gaggagcggg 420
ggtcggcgct ggcggccgag tcggcgctgg agaagaacgt ggccgagctg accgtcatgg 480
acgtgtacga catcgcgtcg cttgtgggcc acgagttcga gcgggtcatt gaccagcacg 540
gctgcgaggc catcgcgcgc ctcatgccca aggtcgtgcg cgtcctggag atcctggagg 600
tgctggtcag ccgccaccac gtcgcgcccg agctggacga gctgcgcctg gagctggacc 660
gcctgcgcct ggagaggatg gaccgcatcg agaaggagcg caagcaccag aaggtgggcg 720
gcggcctcgg tctgtccgtc cgggcagtgg gaccgcgggg acccaagggc tcttccgcat 780
tgggcagctg tgggtgcgca cgtgtgtgtg ttcagggacc ggaccagagg agacccgacg 840
tggggaggga gggaggccct ggccttcttt tgcccgacca ggggtggctg gcagatacca 900
cccgagagat taagagctgt tctctggagt tccaatccca cctttaccgt ttaatagctg 960
tgtgacttta ggtaagttac ttaacctctc tgtgctttat ttcctcacct gtcaaatggt 1020
aatcataata ggacccacct tagaagaatt aaatgggacc atataagcta agtgcttaga 1080
catattattc tcttccagac atgaaataag cctcttggcc tcccgagtta ccaagaagat 1140
gtgacatcag gcccaggacc ctttcttcat cccccccccc cccagtctcc ccagagcaaa 1200
gggaatgtga cctccagcca ctgagcttcg tgacccctag tcttcgggtt catatttgca 1260
actttcttcc cgggactccc ctagcttatg aacctgtggt agcccgtgtt ctctcctctg 1320
attttatcct taatcctcac aggactctat agagactatc ttcattttac agataaagaa 1380
accgagggtc acagtgggag gagcaatttg tcccaaatta gtggtgagag agtcccagcc 1440
cccgtgtctc ctccccaccc tgtttgaatt gggggaaagg gatgatttgg ggtggcttta 1500
aggctaagcc tctgccctgt gatcaggagt ctctctgaat cagggcctcc ccactgggcc 1560
tggagttcag acgaggtttc tggagaaaag gaagtgaaag acatgtggtt tcctgcccta 1620
acctcagcca gggatgctct tggcagcccc ttcagactga gaatgggagg aaacaccttt 1680
ccttgaggga tcagggtgcc tgagcagtct ccagcttgct gttcagcctc aggaaataca 1740
gatggcctct ctgaacctca ggggcaggcc atcccttatt gtgtactttg atggatctct 1800
gtgttttgga gtaaaatagc caaagctggg tctgaaccct ttacctgagg gcagacccac 1860
aggtaggtaa cagcaccatt gccatgtttg actgtgctcg tcctcatggg tccctatgcc 1920
ctaggggcag gaaggaaact caggctccca agagttgagc agcatttccg aggtcactct 1980
gggagcctga aaatgctttg acctgtaatt aatttcaaga ctcctagaag ctaggacttt 2040
ggagctagac agcctggttt caaaccctac cacttgcagg ctgtgtgatc ttgggcaaat 2100
cacccagcat ctctgtgctt cagtttcctc agttctaaaa tgggatagta atagtacccc 2160
cattagaatg tgatgaggtt taaagagtta atataaatac atataaagtg ttcaggacag 2220
agcctgccca tagcaagggc tttgcaagtc ttaaaattct ttttaggcct ggagagacat 2280
tcattgaggt gctcacaggc tcatattagg aaaccgtccc caccccaagc acctctactc 2340
ctaccctaga ggcctccatc tctcatagag ggtcaaggag gcaagggacc ttggaaattc 2400
tctcgtgtgg cgcctcttat taacagggac caaggggctt tgaccagatc acacagaagt 2460
cctggcacct atactgtccc ccaactgggg ctctttagtt ctgttgcggg ggagctggga 2520
gaaatccttg gaagccatcg gaggccacca ggtctgaagt cacatggaat tgtcagcagc 2580
tgcacttgtt gcctctggaa agtgttcagc tgggaagtga acaccgtgcg ctcagggcca 2640
gggcttgttg acttacattg aggatgacct ctctaaatca aggatgcaat tcttttccca 2700
ccccagcccc agacccgttt acttcacatt cttgggatgg agagagactt gtatgatttt 2760
tttttttttt tcctgcagag tctcaaaggc tcttcaaggt gatatttcca caaaaatgtt 2820
tttggcatgt cctggtttag tctgtccacc tccattcctc ttccctttcc cctcttcttc 2880
cctacccctt cttccttgtc tctctcgctt tcagcaatta tggctccagt aaaggacata 2940
cactttcttc cccctactcc tcctctcagt agacccactc actcacttcc actcatcact 3000
cagatgcagg ccacagttgt gtcatgttct gtctcattac tcagtctgca actctgatga 3060
caggccatag cgagcacagt gcccttcttg gtaccatggc tctgcagaga aaagcaaagt 3120
ctcatgtcag gcagcaggcg ggtaacaggg aagaaaggga aaacacaaat aaattctaga 3180
aagcaatggc tgggctgata cactcgcgtg taacatacca gactatgcta ttcattcact 3240
cattcagcga atatatttac tgagaaccta ctgtgtgcca tgcattgttc tgggcactgg 3300
gaagacagta atgaccatga cagatgaggc cttggccctg atgagcctga ctttttagtg 3360
tagtgctata ccatagaaat attatgcagc tttgccatgt taataaaaaa cagtgaagtt 3420
ggctgggcgc ggtggctcac acctgtaatc ccagcacttt tggggggcca aggcgggtgg 3480
atcacttgag gtcaggaatt caagaccagc ttggccaata tggcaaaacc ccatttctac 3540
taaaaataca aaaattagcc gggcatggtg gcgagtgcct ataatcccag ctattcagga 3600
agctgaggca ggagaatcgc ttgaacccgg gaggcagaga ttgcagcgag tcgaaatcac 3660
accattgcac tccagcctgg gtgacagagt gagactctgt ctcaaaaaca acaacaacaa 3720
caaaccagtg aggttaattt taatatatct tatgggaccc agtagatcca aaatattttc 3780
atttcaacat gtaatcagta taaaaactta tcatttgata ttctgcactc tttttttcct 3840
actacatctt tgaaatctgg tgtgtcttta acccctgctg cacatttcca ctcagaccag 3900
ccacatgtca aatgctcaac agccacgtgt ggctactgac tttccatggg atggtgcaat 3960
tattctagca tgaggaagag atagagattt tttttctcct tttttttttt tttgagtcag 4020
ggacgtactc tgtcatccag gccagagagc aatgatggca tcacggctcc ctgcagccct 4080
gaacacctgg attcaagtga tcctcctgcc tcagcctcct gagtagctaa gactacaggc 4140
acactgtaat ttttttttcc tttagagaca aggtgtcact atgttgccca ggctagtctt 4200
gagcttttgg gctcaagcag tcctcctgtc ttgtcctccc aaagtgctgg gactacaggt 4260
ttgatccact gtgcttagcc aggatagatt aaaaaaaaaa aaaaaattca ggctgggcac 4320
agtgtttcac acctgtaatc ccagcacttt gggaggccga ggcagctgga tcacttgagg 4380
tcaggaggtc aagaccatcc tggccaacat ggcaaaacct catccctact aaaaatacaa 4440
aaattagctg ggtgtggtgg cgcacgcctc aggaggcaga ggcaggagaa tcgcttgaac 4500
ctgggaggtg aaggttgcgt tgagccgaga tcatatcact gcactccagc ctgagcaaca 4560
gagcgagact ttgtctcaga aaaaaaaaat cagcttataa taagtgccat aaagaaaata 4620
aaactgggag acatgaaaga gactgactag ggtggtagtc taacagatgg ggcagtcagg 4680
aagtcttccc tgaggaggtg acatctgagc tgagatctga atgaaggata ggatccagcc 4740
acagattgat ctgggggaga ggcattctag gcagaagacg tggctagtgc aaaggtcctg 4800
aggtaggaat gcacttggca tgttcaaaga acacagagtc ggtgtggctg gagcagagca 4860
agtgaggaag aggactggga gatgaatcag gaaggtgccg gggcttgtag gctcagatga 4920
ggaatttgag gactcttggt gctgagggaa gaacgtgaag gagatgattg atcagggctg 4980
acttctccgg agaaccactg ggctggtatg gaggcagcat gagattctga gtggtcaact 5040
cagaggcgag aatcagcaac cccagcatca acttcagttc gttgagagaa gaaaaaaaaa 5100
gaatttaggg ttaaagtctg tattcattcc ctgtggctgc tgtaacaaat caacacaaac 5160
tggtcgggcg cggtggctca agcctgtaat cccagcactt tggaggctga agcgggcgga 5220
tcacaaggtc aggagatcga gaccatcctg gctaacacgg tgaaaccccg tctctactaa 5280
aaatacaaaa aattagccgg gcgtggtggc gggcgcctgt ggtcccagct acttcggagg 5340
ctgaggcagg agaatggcat gaacccggga ggcggagctt gcagtgagcc gagatcgcac 5400
cactgcactc cagcctgggt gacagagtga gactccgtct caaaaaaaaa aaacaaacaa 5460
caacaaaaaa atcaacacaa acttagtggc tcaaaacagc agaaatgtgt tatctttttt 5520
ttttttttga gacagcatct cactctgttg cccaggctgg cgtgccgtgc gtgaccattg 5580
gctcactgca gcttcagcct cctgggctca agcaatcctc ccgcctcagc ttcccaagta 5640
gctcaactgc aggcatgtgc caccacaccc agcttaattt ttagcagaga tggggtcttg 5700
ccatgttgcc caggctggct gcagactcct gggctcaagt gattctcctg cctcagcctc 5760
ccaaagtact agaattacag gcgtgaccca ccatgcctgg ccagaaatgt attgtcttat 5820
tgaactggat aatccaatat tatggataca atgtcataca gtattatgga ggcatatgtg 5880
taattatcaa tataaataat actggagaaa tttccggacg tcagaagtcg gaaatggctc 5940
tcactgagtt caaatcaagg tgttgggaag gctccactcc tttggggggc tgtggaggag 6000
gatccatttc tttgccttcc ccaacttatg gactctgcat tccctggctt gtggcccctt 6060
cctccatctt caaagccagc agcgtagctt cttcccatct ccctcatatt cctctaacgc 6120
tgacctgcct tcctcttacg aagaccctgg catgacatcg gcccaccaga taatccagcc 6180
agataatcca gaatcatctc cccatctcac aagctctttt ttttgagaca cagtttcagt 6240
ctgtcaccca ggctggagtg cagtggcatg atctcggctc actgcaacct ctgcttccct 6300
cagctcactg taacctctgc ctcccaggtt caagtgattc tcatgcctca gcctgctgag 6360
tagctaggat ttcaggtgca cgccaccatg cccagctaat ttttgtattt ttagtagaca 6420
gagttttgct gtgttgtcca ggctggtctc gaactcctga cctcaagtga tcctcctgcc 6480
ttggcctccc aaattgctgt gattataggc gtaagccatc atgcccagcc tcaagagcct 6540
tttttataaa aaaaaaaagt tggggtcttg ctctgtcacc caggctggag tgctgtggtg 6600
caatcacagc tcactgcagc ctcaacctcc ggggctcaag tgatcctccc acctcagcct 6660
cccaagtagc tggtactaca ggcatgcact accacgccca gctaattttt gtatttttta 6720
tagagacaga gttttgccat gttgcccagg ctgttctcaa actcctagcc taaatcaatg 6780
ctcccacctc agcctcctaa attacaagga ttataggtat gagccaccgt gccatgccta 6840
agatccttaa cttaatcatc tctgcacagt cccttttgcc atgtaaggta acatattctc 6900
agggattagg acttggatga ctttaagagc cattattctc cctgccccag ccagttacac 6960
ttgactgata ttctctgagc cccgtgtgag cccagcctat gccaattgga aacagagagg 7020
aacagggctg gatgagcctc tttctgcttc caggccccat ctgcttatgg gaggtcaaca 7080
ttccctctcc atccctccac caccacttcc accccggccc tgcccttcac ctcccctggt 7140
gaccttgcgc cctctgtgca aatactaggc tattactcct ctcttcccca atgcagcagg 7200
cttctgacaa aggaggtggg tctgagaact tatttagaag atggacagag gccatgccta 7260
gcatccggcc acctggccgc ttgtgatgaa ttgtagggat gggacagaga tcagcacaca 7320
cattgttagt gctttctggg tgccgggcat attccaggcg ctttacttat agtaaccatt 7380
taatcctcac acccaccctt cccggcagat accacactag tttcctcatt tgtggggcac 7440
cagaaggctg aataactcgc caaggtcagc tagtaagcag cagaaacagg attcagactt 7500
agggcggcag gctccagtgt ccatgccttg aaccactatt ttattttatt ttttatttat 7560
tttattttaa ttttattttt tgacatggag tctcattctg tgccccaggc tggagtgcag 7620
tggcttgatc tcggctcact acagcctctg cctctcaggt tcaagcagtt ctcctggctc 7680
agcttcccaa gtagcgggga ttacaggtgc ccaccaccat gcccggctaa tttttgtatt 7740
ttcagtagag acggggtttt gccatgctgg ccaggctggt ctcaaactcc tgacctcaag 7800
tgatccgcct gccttggcct cccaaggtgc caggattaca ggtgtgagcc actgcgcctg 7860
gcccttaaac cactgtttta tacagacaac agcaaccctg ctttgtgagc tagcttacgg 7920
ttttaccaag taccgttttt ttgtttgttt gtttgtttgt ttgttttttg cgggggtgga 7980
gggctaccag ctttatcaat ataattcaga taccataaca ctcatttaaa gtgtacactt 8040
ctggctgggc acggtggctc acgcctgtac tcccagcact ttgggaggcc aaggtgggaa 8100
gattgcttga gccctggagg ttgagacaag cctgggcaac atagcaatac cccatttgtt 8160
tctttttttt tttttttttt ttttttgaga cagtgtctca ctctgtcacc caggctggag 8220
tgcagtggta caatcccagc tcaccacaac ctccacctct gagattcaag cagttctcct 8280
gcctcagcct cctgagtagc tgggattaca ggtgtctgcc accacacccg gctaattttt 8340
tgtattttta gtagagacag ggtttcacca tattggtcag gctggtctcg aactcctgac 8400
ctcaagtgat ctgcccacct cggcctccca aagtgctgag gttacaggca tgatccacca 8460
cactcagcca gcaatacccc atctctaaaa aaaaaaaaaa aaattagcca gtcatggtgg 8520
cgtctgcctg tagtcccagc tactgggagg ctgaggtggg aggatcactt gagcccagga 8580
gttcaaggct gcaatgagct ataactgtgt cactgcactc cagcctgggt gacagaacaa 8640
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tcacacacca cacacacaga tgccaccgca cagacataca ctcacactgc acacaccaca 22620
cacacacaga cctcacacac acaccacaca cagacctcag acacaccaca cacacacata 22680
cagacctcac acaccacaca cacacagacc tcacacaaac accacacaca gacctcacac 22740
acaccacaca cacacataga cctcacacac cacacacaca gacctaacac acacaccaca 22800
cacagacctc acacacacac agaccccaca caccacacac acacagatgc caccacacag 22860
acatacactc acactgcaca caccacacac acagacctca cacacaccac acacacacag 22920
acctcacaca tcacatacac acaaacctta cacacaccac acacacacag acctcacaca 22980
atacacacac acacagacct cacacacaca ctgcacacag acctcacaca ccacacacac 23040
acagacctca cacacaccat acacagacct cacacactac acacacacat cacacacata 23100
taccacacac acacagaccc cacattcaca cacacagacc tcacacacac accagacaca 23160
gacctcacat tgacaccaca cacagacctc acacaccaca cacacacaga cctcacacac 23220
accatacaca gacctcacac actacacaca cacatcacac acatatacca cacacacaca 23280
gaccccacat tcacacacac agacctcaca cacacaccag acacagacct cacattgaca 23340
ccacacacag acctcacaca caccatacac agacctcaca cactacacac acacatcaca 23400
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gacacagacc tcacattgac accacacaca gacctcacac accacacaca cacacacaca 23520
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tgtcctcatc ttcccccatc agcaggcgga gatgaattgt accagtaggg cccttggcca 24000
gctagtgttt cttatctttt ccttttaaac attctggtgg aaaacatgtc gcagaattgc 24060
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ttgtttgttt gtttgtttgt ttgttgtttt gagacggagt ctcactctcc tgcccaggct 24780
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cctgggcaat aaagtgagac tccgtctcaa aaaaataaaa aaaaaaacaa aaaaacttga 28860
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cctggaatac agagacgaat gagacaggct gatgcctcta ggacgatcat ataaaatccc 29400
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tgatgtggta atgtctttgc agttgtgtta tttcattcca gatctttctt tttttttttt 29880
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tgggattaca ggcgtgcacc accatgcctg gctaattttt tgtattttta gtagagacag 30060
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cgcttggcta gttaaaaaaa aaaaaatctt tttgtagaaa cagggtcttg ttatgttgcc 32640
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caaactcgtg caactcccaa act 23
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctcggccacg ttcttctcca 20
Claims (16)
1.一种定性分析基因RILPL1的试剂盒，其特征在于，包括基于SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列设计的定性检测引物。
2.根据权利要求1所述的定性分析基因RILPL1的试剂盒，其特征在于，所述的定性检测引物为RP-PCR引物；
可选的，所述的定性检测引物包括正向引物RILPL1-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物RILPL1-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物RILPL1-linker-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
可选的，所述定性检测引物中的一个引物标记有荧光报告基团，所述荧光报告基团包括FAM，VIC，Cy3，Cy5，TAMRA，FITC，TRITC，或TET；
可选的，所述定性检测引物中的一个引物的5’端标记有荧光报告基团。
3.根据权利要求1或2所述的定性分析基因RILPL1的试剂盒，其特征在于，还包括DNA聚合酶、dNTPs、二甲基亚砜和/或甜菜碱。
4.根据权利要求3所述的定性分析基因RILPL1的试剂盒，其特征在于，DNA聚合酶为TaKaRa LA Taq DNA聚合酶；
可选的，dNTPs包括dATP，dTTP，dCTP和7-Deaza-dGTP；
可选的，还包括LongAmp Hot Start Taq Master Mix。
5.根据权利要求4所述的定性分析基因RILPL1的试剂盒，其特征在于，包括独立包装的DNA聚合酶、PCR反应试剂和引物液；
可选的，采用所述DNA聚合酶、PCR反应试剂和引物液配制的PCR反应体系中，以20μl为计：
TaKaRa LA Taq DNA聚合酶，0.25U；
LongAmp Hot Start Taq Master Mix，浓度为1×；
dATP，dTTP，dCTP和7-Deaza-dGTP的浓度各200μM；
二甲基亚砜，体积百分比为3％；
甜菜碱，1.4M；
正向引物RILPL1-F，0.225μM；
反向引物RILPL1-linker-R，0.225μM；
反向引物RILPL1-R，0.125μM；
用双蒸水补足至20μl。
6.一种非疾病诊断的定性分析基因RILPL1的方法，其特征在于，包括利用权利要求1-5任一项所述的定性分析基因RILPL1的试剂盒。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，配制PCR反应体系，以20μl为计：
TaKaRa LA Taq DNA聚合酶，0.25U；
LongAmp Hot Start Taq Master Mix，浓度为1×；
dNTPs，dATP，dTTP，dCTP和7-Deaza-dGTP各200μM；
二甲基亚砜，体积百分比为3％；
甜菜碱，1.4M；
正向引物RILPL1-F，0.225μM；
反向引物RILPL1-linker-R，0.225μM；
反向引物RILPL1-R，0.125μM；
基因组DNA，100ng；
用双蒸水补足至20μl。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为：95℃下反应5分钟；然后进行10个循环：95℃反应30秒，64℃反应30秒，每个循环下降1℃，72℃下反应2分钟；接着是25个循环：95℃反应30秒，58℃反应30秒，72℃反应2分钟；最后延伸步骤72℃，5分钟。
9.一种定量分析基因RILPL1的试剂盒，其特征在于，包括基于SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列设计的定量检测引物。
10.根据权利要求9所述的定量分析基因RILPL1的试剂盒，其特征在于，所述的定量检测引物为AL-PCR引物；
可选的，所述的定量检测引物包括正向引物RILPL1-2-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物RILPL1-2-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
可选的，所述定量检测引物中的一个引物标记有荧光报告基团，所述荧光报告基团包括FAM，VIC，Cy3，Cy5，TAMRA，FITC，TRITC或TET；
可选的，所述定量检测引物中的一个引物的5’端标记有荧光报告基团。
11.根据权利要求9或10所述的定量分析基因RILPL1的试剂盒，其特征在于，还包括DNA聚合酶、dNTPs、二甲基亚砜和/或甜菜碱。
12.根据权利要求11所述的定量分析基因RILPL1的试剂盒，其特征在于，DNA聚合酶为TaKaRa LA Taq DNA聚合酶；
可选的，dNTPs包括dATP，dTTP，dCTP和7-Deaza-dGTP；
可选的，还包括LongAmp Hot Start Taq Master Mix。
13.根据权利要求12所述的定量分析基因RILPL1的试剂盒，其特征在于，
包括独立包装的DNA聚合酶、PCR反应试剂和引物液；
可选的，采用所述DNA聚合酶、PCR反应试剂和引物液配制的PCR反应体系中，以20μl为计：
TaKaRa LA Taq DNA聚合酶，0.25U；
LongAmp Hot Start Taq Master Mix，浓度为1×；
dATP，dTTP，dCTP和7-Deaza-dGTP各200μM；
二甲基亚砜，体积百分比为3％；
甜菜碱，1.4M；
正向引物RILPL1-F，0.3μM；
反向引物RILPL1-AL-R，0.3μM；
用双蒸水补足至20μl。
14.一种非疾病诊断的定量分析基因RILPL1的方法，其特征在于，包括利用权利要求9-13任一项所述的定性分析基因RILPL1的试剂盒。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，配制PCR反应体系，以20μl为计：
TaKaRa LA Taq DNA聚合酶，0.25U；
2×LongAmp Hot Start Taq Master Mix，浓度为1×；
dNTPs，dATP，dTTP，dCTP和7-Deaza-dGTP各200μM；
二甲基亚砜，体积百分比为3％；
甜菜碱，1.4M；
正向引物RILPL1-F，0.3μM；
反向引物RILPL1-AL-R，0.3μM；
基因组DNA，100ng；
用双蒸水补足至20μl。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为：95℃下反应5分钟；然后进行10个循环：95℃反应30秒，64℃反应30秒，每个循环下降1℃，72℃下反应2分钟；接着是25个循环：95℃反应30秒，58℃反应30秒，72℃反应2分钟；最后延伸步骤72℃，5分钟。
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