JP2004201692A - ヒト成長遺伝子及び低身長遺伝子領域 - Google Patents

Abstract

それぞれの遺伝子に遺伝欠損を有する一方の低身長患者と該遺伝子にいかなる欠陥をも有さない他方の患者とを区別する方法及び手段を提供すること。
【課題】
【課題手段】 配列番号：１のアミノ酸配列を有する６０アミノ酸のホメオボックスドメインを含むポリペプチドであって、かつヒトの成長に対する制御活性を有するポリペプチドをコードする単離されたヒト核酸分子、該核酸分子又はそれによりコードされるタンパク質を含有してなる医薬組成物。
【選択図】なし

Description

本発明は、ヒトの成長、特に低身長またはターナー症候群に関連する疾患の原因となる、新規に同定されたヒト遺伝子の単離、同定およびキャラクタリゼーション、ならびにかかる疾患の診断および治療に関する。

成長は、高度に組織化され、かつ複雑な系により制御された、生物の発育における基本的な側面の１つである。身長は、環境的因子および遺伝的因子の両方により影響された、多因性の特性である。体長に関する発育奇形はヒトの全人種間の共通の現象である。１００人中３人の発生率をもつ低身長に帰する成長遅延は、ヒトに見られる大多数の先天性の欠損症の原因となっている。

１：２５００の生存−誕生（ｌｉｆｅ−ｂｏｒｎ）表現型の女性の発生率をもつターナー症候群は、共通の染色体疾患である〔ローゼンフェルト（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ）ら，１９９６〕。全てのヒト胎児の１〜２％が４５，Ｘであり、かかる胎児の９９％程度が出産にいたらない〔ホール（Ｈａｌｌ）およびギルクリスト（Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ），１９９０；ロビンス（Ｒｏｂｉｎｓ），１９９０〕。有意な臨床的変動性が、ターナー症候群（またはアルリッヒ−ターナー症候群）を患った人の表現型に存在する〔アルリッヒ（Ｕｌｌｒｉｃｈ），１９３０；ターナー（Ｔｕｒｎｅｒ）１９３８〕。しかしながら、低身長は、一貫した知見であり、この疾患の先導の徴候として考えられる生殖器発育不全を伴う。ターナー症候群は、真性の多因性疾患である。胚の致死率、低身長、生殖器発育不全および特有の体細胞的特徴のどれもがＸ染色体とＹ染色体に共通する遺伝子のモノソミーによるものと思われる。これらのＸ−Ｙ相同遺伝子の二倍体量により、正常なヒトの発育に要求されることが示唆される。ターナー遺伝子（または抗−ターナー遺伝子）は、女性において、正常量の遺伝子産物を保証する活性および不活性の両方のＸ染色体またはＹ染色体から発現されることが予想される。単核不全（１つの活性なコピーのみによる欠失）は、結果的に疾患の根元となる示唆された遺伝機構であろう。

これまで、低身長の根元となる多様な機構が解明されてきた。成長ホルモンおよび成長ホルモンレセプター欠損ならびに骨格疾患は低身長の表現型の原因として記載されてきた〔マーシャル（Ｍａｒｔｉａｌ）ら，１９７９；フィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）ら，１９８１；ロイング（Ｌｅｕｎｇ）ら，１９８７；ゴッダード（Ｇｏｄｄａｒｄ）ら，１９９５〕。近年、３つのヒト繊維芽細胞成長因子レセプターをコードする遺伝子（ＦＧＦＲ １−３）における変異が最も一般的な形態の小人症である、軟骨形成不全を含む、多様な骨格疾患の原因として同定された〔シャング（Ｓｈｉａｎｇ）ら，１９９４；ロウシュー（Ｒｏｕｓｓｅａｕ）ら，１９９４；メンケ（Ｍｕｅｎｋｅ）およびシェル（Ｓｃｈｅｌｌ），１９９５〕。良く知られ、かつ頻繁な（１：２５００女性）染色体疾患である、ターナー症候群（４５，Ｘ）も一貫して低身長に関連する。しかしながら、みんな合わせても、全てのこれらの異なる公知の原因は、全ての低身長患者のうちのほんの少しを説明するだけで、現在のところ非常に多くの低身長の症例が不明なままである。

性染色体Ｘ及びＹは身長の高さに影響を及ぼす遺伝子を保持すると考えられている〔オガタ（Ｏｇａｔａ）およびマツオ（Ｍａｔｓｕｏ），１９９３〕。これは、性染色体異常を有する患者における遺伝子型−表現型の相互関係から推定されることができた。細胞遺伝研究は、ＸまたはＹ染色体のいずれかの短腕の末端欠失がそれぞれの個体において、一貫して低身長を導くという証拠を提供している〔ツファルディ（Ｚｕｆｆａｒｄｉ）ら，１９８２；カリー（Ｃｕｒｒｙ）ら，１９８４〕。染色体ＸｐおよびＹｐの末端欠失に関連する２０以上の染色体転位は、低身長の原因となる１若しくは複数の遺伝子が偽常染色体領域（ＰＡＲ１）に局在することが報告されている〔バラビオ（Ｂａｌｌａｂｉｏ）ら，１９８９，スカエファー（Ｓｃｈａｅｆｅｒ）ら，１９９３〕。この局在は、ＰＡＲ１領域の最も遠位の７００ｋｂのＤＮＡに限定されている（オガタ（Ｏｇａｔａ）ら, １９９２；１９９５）。

哺乳類成長制御は、複雑な系として構成されている。多重の成育促進遺伝子（タンパク質）は高度に組織化された様式でお互いに相互作用することが考えられる。身長を制御するそれらの遺伝子の１つは、Ｘ染色体とＹ染色体との間で自由に変換されることが知られている、偽染色体領域ＰＡＲ１〔バラビオ（Ｂａｌｌａｂｉｏ）ら、１９８９〕へ仮に位置づけされている（総説として、ラッポルド（Ｒａｐｐｏｌｄ），１９９３）。全ＰＡＲ１領域は、約２７００ｋｂである。

遺伝子型／表現型の相互関係は、Ｙｑの近位部分およびＹｐの遠位部分における成長遺伝子の存在を支持している。低身長は、さらに、Ｘｐの末端欠失を有する個体に一貫して見出される。近年、偽常染色体領域の部分的なモノソミーを有する男性及び女性患者の詳細にわたる研究が行われている。遺伝子型−表現型の相互作用に基づいて、テロメアに近接する７００ｋｂのＤＮＡの欠失の最小の共通領域が決定された〔オガタ（Ｏｇａｔａ）ら、１９９２；オガタ（Ｏｇａｔａ）ら、１９９５〕。対象の領域が遺伝子マーカーＤＸＹＳ２０（３ｃｏｓＰＰ）とＤＸＹＳ１５（１１３Ｄ）との間にまたがることが見出され、ＰＡＲ１領域範囲内由来の成育制御のためのすべての候補遺伝子（たとえば、造血成長因子レセプターａ；ＣＳＦ２ＲＡ）〔ゴウ（Ｇｏｕｇｈ）ら，１９９０〕はそれらの物理的な位置に基づいて除外された〔ラッポルド（Ｒａｐｐｏｌｄ）ら，１９９２〕。つまり、該遺伝子が２７００ｋｂのＰＡＲ１領域の７００ｋｂ欠失領域内にあったということである。

最近、性染色体の偽常染色体領域（ＰＡＲ１）の欠失が低身長の個体に発見され、つづいてＰＡＲ１内の７００ｋｂの最小共通欠失領域が規定された。異なる偽常染色体マーカーを用いる患者ＡＫ及びＳＳのＤＮＡのサザンブロット解析により、ＤＸＹＳ１５（１１３Ｄ）に遠位した約７００ｋｂのＸｐ末端欠失を同定した〔オガタ（Ｏｇａｔａ）ら，１９９２；オガタ（Ｏｇａｔａ）ら，１９９５〕。

低身長の重要な領域は、欠損患者により規定されている。低身長は全７００ｋｂの領域を欠失した場合、あるいはこの重要な領域内の特異的な遺伝子が倍数体期に存在する、遮られる又は変異される場合の結果である（イディオタイプの低身長またはターナー症の症例として）。ターナー症候群の頻度は、世界で女性２５００人に１人である；この種の特発性の低身長の頻度は４，０００〜５，０００人に１人であると推定されうる。ターナー症候群の女性といくつかの低身長の個体は、正常な成長ホルモン（ＧＨ）レベルを有し、かつＧＨ欠損は問題とならないことが知られているが、常に１０年を超える長年にわたるＧＨを用いた非特異的な治療を受けている。かかる患者の治療は、非常に高くつく（推定コストは１年につき約３０，０００米国ドル）。したがって、課題は、それぞれの遺伝子に遺伝欠損を有する一方の低身長患者と該遺伝子にいかなる欠陥をも有さない他方の患者とを区別する方法及び手段を提供することにある。

単離されたゲノムＤＮＡまたはその断片を医薬目的に、あるいはかかる疾患に関与する遺伝子欠損の同定もしくはキャラクタリゼーション用の診断道具または試薬として用いることができる。さらに、本発明の主題は、前記ＤＮＡのＲＮＡまたはｍＲＮＡへの転写後に発現し、かつ前記遺伝子における変異に関連する疾患の治療処置に用いられうる、ヒト成長タンパク質（転写因子Ａ、ＢおよびＣ）である。本発明は、さらに、かかる疾患の治療に適する組換えタンパク質の調製に使用されうる適切なｃＤＮＡ配列に関する。本発明のさらなる主題は、これらの遺伝子のＤＮＡの発現のためのプラスミドベクターおよびかかるＤＮＡを含む適切な細胞である。本発明のさらなる主題は、本発明のＤＮＡを、哺乳類宿主細胞での発現をもたらす発現プロモーターの下流に組み込むことにより調製された発現プラスミドを用いる分子医学の分野において、かかる疾患の遺伝子治療の手段および方法を提供することである。

それぞれの遺伝子に遺伝子欠損−（ターナー症候群におけるような）完全な遺伝子欠失または（特発性の低身長におけるような）点突然変異のいずれか−を有する患者は、現在考案されうるヒトＧＨなしの他の治療を可能にするであろう。

低身長に対応する遺伝子領域は、Ｘ染色体及びＹ染色体のＰＡＲ１領域の約５００ｋｂ、好ましくは約１７０ｋｂの領域として同定されている。この領域における３つの遺伝子は、低身長遺伝子の候補として同定されている。これらの遺伝子は、ＳＨＯＸ（ＳＨＯＸ９３またはＨＯＸ９３ともいう）、〔ＳＨＯＸ＝ｓｈｏｒｔ ｓｔａｔｕｒｅ ｈｏｍｅｏｂｏｘ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｇｅｎｅ（低身長ホメオボックス含有遺伝子）〕、ｐＥＴ９２およびＳＨＯＴ〔ＳＨＯＸ−ｌｉｋｅ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ｇｅｎｅ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｔｈｒｅｅ（第３染色体上のＳＨＯＸ様ホメオボックス遺伝子）〕と表示された。２つの改変体（ＳＨＯＸａおよびｂ）に帰する２つの分離したスプライシング部位を有する遺伝子ＳＨＯＸは特に重要である。予備的な調査において、低身長遺伝子のヌクレオチド配列の本質的な部分を解析することができた（配列番号：８）。それぞれのエキソンまたはそれらの部分を予想し、同定することができた（例えば、エキソンＩ〔Ｇ３１０〕；エキソンＩＩ〔ＥＴ９３〕；エキソンＩＶ〔Ｇ１０８〕；ｐＥＴ９２）。ついで、得られた配列情報をＳＨＯＸ遺伝子またはその断片の部分にハイブリダイズする適切なプライマーまたはプローブをデザインするために用いることができた。ついで、慣用の方法により、該ＳＨＯＸ遺伝子を単離することができた。低身長の原因となる遺伝子のＤＮＡ配列のさらなる解析により、エキソンＩ〜Ｖのヌクレオチド配列を精密化することができた（図１〜３を参照せよ）。該遺伝子ＳＨＯＸは、１１７位のアミノ酸（Ｑ）をコードするヌクレオチドからはじまり１７６位のアミノ酸（Ｅ）をコードするヌクレオチドまで、すなわちＣＡＧ（４４０）からＧＡＧ（６１９）までの約１８０ｂｐのホメオボックス配列（配列番号：１）を含む（図２および図３を参照せよ）。該ホメオボックス配列は、ホメオボックス−ｐＥＴ９３（ＳＨＯＸ）配列として同定され、特発性の低身長の２５０個体にのぼるスクリーニングにより、１人のドイツ人（Ａ１）患者および１人の日本人患者において、２つの点突然変異が低身長の個体に見出された。両方の点突然変異が同一の位置に見出され、１９５位のアミノ酸でのタンパク質切断を導き、変異のホットスポットが存在するかもしれないことが示唆される。タンパク質切断を導く、見出された両方の変異が同一の位置にあるという事実により、組換えの推定ホットスポットが、エキソン４（Ｇ１０８）に存在することが可能である。したがって、エキソン特異的なプライマーは、以下に示すように、例えば、ＧＣＡ ＣＡＧ ＣＣＡ ＡＣＣ ＡＣＣ ＴＡＧ（フォワード）またはＴＧＧ ＡＡＡ ＧＧＣ ＡＴＣ ＡＴＣ ＣＧＴ ＡＡＧ（リバース）として用いられうる。

１７０ｋｂのインターバル内に局在する、前記新規ホメオボックス含有遺伝子であるＳＨＯＸは、択一的にスプライスされ、異なる機能を有する２つのタンパク質を生じる。変異解析およびＤＮＡシークエンスを用いて、低身長がＳＨＯＸにおける変異により引き起こされうることを示した。

本発明の低身長の重要な領域の同定及びクローニングは下記のように行われた：偽常染色体領域（ＰＡＲ１）における部分的なモノソミーを有する１５個体の詳細にわたる物理的マッピング研究を行った。欠失ブレークポイントを有するこれらの個体の高さに相互関係して、約７００ｋｂの低身長（ＳＳ）の重要な領域が規定された。つづいて、該領域をＰＡＲ１〔リエド（Ｒｉｅｄ）ら，１９９６〕から酵母人工染色体〔ＹＡＣ〕を用いて、オーバーラッピングコスミド整列群として、コスミドウォーキングにより、クローン化した。このインターバル内のＳＳの候補遺伝子を検索するために、多様な技術がコスミド５６Ｇ１０の遠位末端と５１Ｄ１１の近位末端との間の約６００ｋｂ領域に適用した。ｃＤＮＡ選抜、エキソントラッピング及びＣｐＧ島クローニングを用いて、２つの新規遺伝子が同定された。

一貫して背の低い３人のさらなる特別な個体（ＧＡ，ＡＴおよびＲＹ）をキャラクタライズすることにより、低身長の重要なインターバルの位置を１７０ｋｂのＤＮＡのより小さいインターバルに精密化することができた。これらの個体の転位ブレークポイントを正確に局在化するために、分裂中期の染色体の蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を、前記整列群由来のコスミドを用いて行った。末端欠失および正常な身長を有する患者ＧＡは、（コスミド１１０Ｅ３上にブレークポイントを有する）重要な領域の遠位の境界を規定し、Ｘ染色体逆位および正常な身長の患者ＡＴは、（コスミド３４Ｆ５上にブレイクポイントを有する）近位の境界を規定する。末端欠失および低身長の患者ＲＹのＹ染色体のブレイクポイントは、さらに、コスミド３４Ｆ５上に含まれることが見出され、該領域が染色体転位しそうな配列を含むことが示唆される。

Ｘｐ／Ｙｐテロメアにより結合される全領域をオーバーラッピングコスミドとのセットとしてクローン化した。該領域由来のコスミドでの蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて、Ｘ染色体転位を有する６人の患者、正常な身長の３人の患者および低身長の３人の患者を研究した。遺伝子型−表現型の相関は、該遺伝子またはヒトの成長に重要な役割を有する遺伝子を含む２７０ｋｂのＤＮＡまたは１７０ｋｂよりも小さいＤＮＡに重要な低身長のインターバルを限定した。このインターバルを架橋している６〜８つのコスミドのタイリングペース（ｔｉｌｉｎｇ ｐａｔｈ）が静止期および分裂中期のＦＩＳＨに利用され、特発性低身長の患者の診断的な調査に価値のある手段をを提供する。

ヒトの成長における疾患を導く標的遺伝子（例えば、低身長領域）は本発明の以前には公知ではなかったので、患者とこの欠失との生物学的および臨床的関連は、該遺伝子の機能へ洞察を与えることができた。本研究において、蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて６人の患者の分裂中期および間期のリンパ球の核を検査した。本目的は、ＦＩＳＨプローブとしての利用のためにオーバーラッピングセットの全てのコスミドを試験することおよび全４症例におけるブレークポイント領域を決定することであり、それにより低身長遺伝子の最小の重要な領域を決定する。

ゲノムＤＮＡの重複および欠失は、注意深く制御された定量的ＰＣＲもしくはサザンブロットにおける量の推定により、またはＲＦＬＰｓを用いることにより技術的に評価することができる。しかしながら、マーカーの単独の量と二倍量との間の正確な分別の特に信頼できる方法は、ＦＩＳＨであり、その臨床的な適用は現在日常的である。間期のＦＩＳＨにおいて、分子マーカーの純粋な非存在または存在が評価されうるが、分裂中期染色体におけるＦＩＳＨは、コスミド内欠失の準定量的な測定を提供してもよい。本発明者は、約１０ｋｂの欠失（２５％のシグナル減少）ですら検出されうる。これは、ヒトＸ染色体の事実上の全疾患遺伝子がほんの数キロ塩基から数メガ塩基のＤＮＡの範囲でより小さい欠失およびより大きい欠失と関連するので重要である〔ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）ら，１９９５〕。

したがって、本発明の主題は、ヒトの成長（または低身長に、それぞれこれらの遺伝子における遺伝欠陥の場合）の原因となる遺伝子の部分のＤＮＡ配列またはその断片である。ヒトの成長の原因となる３つの遺伝子が同定された：ＳＨＯＸ、ｐＥＴ９２およびＳＨＯＴ。これらの遺伝子のＤＮＡ配列または断片、ならびにこれらの遺伝子のそれぞれの全長のＤＮＡ配列は、適切なベクターで形質転換することができ、細胞にトランスフェクトできる。かかるベクターは、適切な方法で健康なヒトに存在する細胞に導入される場合、低身長、すなわちターナー症候群に関与する疾患を、遺伝子治療の新しい手法により治療するために工夫されうる。例えば、低身長の原因となるそれぞれの変異成長遺伝子を除去することにより、低身長を治療することができる。低身長の原因となる遺伝子の作用を補うそれぞれの遺伝子を刺激すること、すなわち、健康なアレルの発現を増やすために成長／低身長遺伝子の前、後ろまたは中にＤＮＡ配列を挿入することにより、刺激することも可能である。かかる該遺伝子の修飾により、成長／低身長遺伝子は、それぞれ活性化または不活化になる。これは、該遺伝子の中または該遺伝子に隣接する適切な部位にＤＮＡ配列挿入することにより達成され、そのためこれらの挿入されたＤＮＡ配列が成長／低身長遺伝子を妨害し、それにより該成長／低身長遺伝子の転写を活性化または妨害する。さらに、該成長遺伝子の前に制御エレメント（例えばプロモーター配列）を挿入して、該遺伝子が活性になるように刺激することが工夫されうる。さらに、ターナー症候群の場合、健常な機能的対立遺伝子を過剰発現し、かつ失われた対立遺伝子を補うためにそれぞれのプロモーター配列を刺激することが工夫されうる。遺伝子の修飾は、一般的に、成長遺伝子／低身長遺伝子に外来性ＤＮＡ配列を挿入することにより相同組換えを介して達成されうる。

さらに、本発明のＤＮＡ配列は、適切なベクター系を介して、哺乳類などの動物への該配列の形質転換のために使用されうる。ついで、これらの形質転換動物は、低身長に関与する疾患の治療に有用な医薬剤をスクリーニングするまたは同定するためのイン・ビボ調査のために用いられうる。該動物が候補化合物または薬剤の投与に対して正に応答する場合、かかる薬剤もしくは化合物またはそれらの誘導体は医薬剤として工夫されうるであろう。さらに、適切な手段により、本発明のＤＮＡ配列は低身長の原因となる遺伝子の欠如を補うために方法を発見することを目的とする遺伝子実験に用いられうる（ノック・アウト動物）。

さらに、本発明のさらなる目的として、該ＤＮＡ配列を細胞への形質転換にも使用されうる。これらの細胞は、低身長に関与する疾患の治療に有用な医薬剤を同定するため、またはかかる化合物もしくは化合物のライブラリーのスクリーニングのために使用されうる。適切な試験系として、これらの細胞の表現型または発現パターンにおける変化を決定することができ、それにより医薬の開発において興味深い候補薬剤の同定を可能にする。

本発明のＤＮＡ配列は、さらにストリンジェントな条件下に低身長遺伝子またはその断片のセグメントにハイブリダイズする適切なプライマーのデザインに使用されうる。低身長を引き起こす遺伝子欠陥を有する人々の診断に有用な適切なプライマー配列が構築されうる。この点で、見出された２つの変異が同一の位置に生じることは注目すべきことであり、変異ホットスポットが存在することが示唆される。

一般的に、本発明のＤＮＡ配列は、遺伝子コードの縮重度に基づき、示された特異的な配列に縮重する該ＤＮＡ配列またはストリンジェントな条件下に特異的に示されたＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列をも包含すると理解される。

本発明は、特に下記の概念を包含する：
ａ）配列番号：１のアミノ酸配列を有する６０アミノ酸のホメオボックスドメインを含有するポリペプチドであって、かつヒト成長に対する制御活性を有するポリペプチドをコードする単離されたヒト核酸分子。
ｂ）本質的に図２、図３または図４に示された核酸配列、とりわけ配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１５に示された核酸配列を含む単離されたＤＮＡ分子。
ｃ）ｂ）のＤＮＡ分子にハイブリダイズしうるＤＮＡ分子。
ｄ）６０〜７０℃の温度で、かつ標準緩衝液の存在下に、２．のＤＮＡ分子とのハイブリダイゼーションが可能な前記ｃ）のＤＮＡ分子。
ｅ）配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１５のヌクレオチド配列と７０％以上の相同性を有し、かつヒト成長に対する制御活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ分子。
ｆ）配列番号１１、１３もしくは１６のアミノ酸配列を有するヒト成長タンパク質またはその機能的断片。
ｇ）ｆ）のヒト成長タンパク質またはその抗原性改変体での動物の免疫により得られた抗体。
ｈ）ヒト成長タンパク質またはその機能的断片を含有する、ヒト成長遺伝子の遺伝子変異により引き起こされた疾患を治療するための医薬組成物。
ｉ）物質による宿主細胞の処置に応答するＤＮＡ分子の発現レベルにおける増大を測定するために、ａ）〜ｅ）に記載されたＤＮＡ分子のいずれかにハイブリダイズするメッセンジャーＲＮＡを検出する工程を含む、前記ｈ）の疾患の治療に有用な物質のスクリーニング方法。
ｊ）ＤＮＡ分子を哺乳類細胞において発現させることが可能である、前記ａ）〜ｅ）記載の核酸分子のいずれかを含む発現ベクターまたはプラスミド。
ｋ）体の組織または体液の生物学的試料中における、低身長の原因となる１若しくは複数の遺伝子の決定方法。

前記ｋ）の方法において、好ましくは核酸増幅技術、例えばＰＣＲなどを、当業者に公知の特異的なヌクレオチド配列、ならびに、例えば参照により本明細書中に取り込まれるムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ． ５１，２６３−２７３およびサイキ（Ｓａｉｋｉ）ら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，４８７−４９１に記載の特異的なヌクレオチド配列を検出するのに用いられる。決定対象の低身長ヌクレオチド配列は、主に配列番号：２〜配列番号：７の配列により示されるものである。

原則として、生物学的試料中の減少した（ｄｅｍｉｎｉｓｈｅｄ）ヒトの成長の原因となる遺伝子欠損を増幅し検出するための全てのオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、標的の低身長関連配列を増幅するのに適する。特に好適な本発明のエキソン特異的プライマー対は、表１により提供される。つづいて好適な検出、例えば、放射活性または非放射活性標識が行われる。

プライマーの略語の説明：

さらに、一本鎖ＲＮＡを標的として用いることができる。ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する方法も熟知されており、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８９に記載される。一方、好ましい逆転写方法は、ＲＴ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを利用する。

さらに、以前に記載された技術は、遺伝子欠損により特徴づけられた低身長であるヒトの群からこれらのヒトを選択するために用いられ、それは結果として、より特異的な医学的治療を可能とする。

本発明の他の主題において、転写因子Ａ、ＢおよびＣが医薬剤として用いられうる。これらの転写因子は、ヒト成長に関与する分子レベルへの生物学的影響のいまだ未知のカスケードを開始する。これらのタンパク質またはそれらの機能的断片は様々な細胞に対する細胞分裂促進性の効果を有する。とりわけ、該タンパク質またはそれらの機能的断片は、骨形成効果を有する。該タンパク質またはそれらの機能的断片は、骨粗鬆症などの骨の疾患、特に骨のカルシウム制御の障害に関与する全ての疾患の治療に用いられうる。

本明細書に用いられるように、「単離された」という語は、クローニングによるＤＮＡ分子の最初の由来をいう。しかしながら、この語は、限定を意図するものではないことが理解され、当業者により理解されるであろうように、実際には、本発明は、天然由来および合成的に調製された配列の両方に関する。

本発明のＤＮＡ分子は、哺乳類宿主細胞において発現をもたらす発現プロモーターの下流に本発明の適切なＤＮＡ配列を組み込むことにより調製された発現プラスミドの使用に関与する遺伝子治療の形態で使用されてもよい。好適な宿主細胞は原核細胞または真核細胞である。原核宿主細胞は、例えば、大腸菌、枯草菌などである、つまり複製開始点およびレギュレーター配列を含むプラスミドベクター宿主に適合する種由来のレプリコンで宿主細胞をトランスフェクトすることにより、これらの宿主細胞を所望の遺伝子またはｃＤＮＡでトランスフェクトすることができる。かかるベクターは、好ましくは洗濯されうる性質（表現型）を有するトランスフェクト細胞を提供する配列を有するものである。例えば、大腸菌宿主として、大腸菌Ｋ１２株が典型的に使用され、ベクターとして、ｐＢＲ３２２またはｐＵＣプラスミドのいずれかを一般的に使用することができる。大腸菌宿主に好適なプロモーターの例示は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーターまたはｌｐｐプロモーターである。所望であれば、細胞膜を介する発現産物の分泌は、該遺伝子の５’上流側にシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することによりもたらすことができる。真核宿主細胞としては、セキツイ動物または酵母など由来の細胞が挙げられる。セキツイ動物の宿主細胞として、ＣＯＳ細胞（Ｃｅｌｌ，１９８１，２３：１７５−１８２）またはＣＨＯ細胞が用いられうる。好ましくは、発現対象の遺伝子の５’上流に位置し、かつＲＮＡスプライシング位置、ポリアデニル化および転写終結配列を有するプロモーターが用いられうる。

本発明の転写因子Ａ、ＢおよびＣを用いて、ヒト成長遺伝子における変異により引き起こされた疾患を治療することができ、成長促進剤として用いることができる。真核生物の遺伝子の場合に知られる多型により、１以上のアミノ酸が置換されてもよい。さらに、ポリペプチド中の１以上のアミノ酸が、配列番号１１、１３または１６のポリペプチドのアミノ酸配列における１以上の部位で欠失または挿入されうる。かかるポリペプチドは、一般に非修飾ポリペプチドの根元をなす生物学的活性が本質的に変化しないままであれば、同等のポリペプチドという。

本発明を下記実施例により説明する。

患者
研究した全６人の患者はデ・ノボでの性染色体異常を有した。
ＣＣは、核型４５，Ｘ／４６，Ｘ ｐｓｕ ｄｉｃ （Ｘ）（Ｘｑｔｅｒ→Ｘｐ２２．３：：Ｘｐ２２．３ → Ｘｑｔｅｒ）の女子である。６歳半の年齢の最後の検査で、彼女の身長は１１４ｃｍであった〔２５−５０％百分位数〕。彼女の母親の身長は１５５ｃｍであり、父親は解析の求めに応じなかった。詳細は、ヘンケ（Ｈｅｎｋｅ）ら、１９９１を参照のこと。

ＧＡは、核型４６，Ｘ ｄｅｒ Ｘ（３ｐｔｅｒ → ３ｐ２３：：Ｘｐ２２．３ → Ｘｑｔｅｒ）の女子である。１７歳の最後の検査で、正常な身長（１５９ｃｍ）が観察された。彼女の母親の身長は１６０ｃｍであり、父親の身長は１８２ｃｍである。詳細は、クルハリャ（Ｋｕｌｈａｒｙａ）ら，１９９５を参照のこと。

ＳＳは、核型４６，Ｘ ｒｅａ （Ｘ）（Ｘｑｔｅｒ → Ｘｑ２６：：Ｘｐ２２．３ → Ｘｑ２６：）の女子である。１１歳のとき、彼女の身長は、日本人の女子の３番目の百分位数の成長曲線より下のままであった；彼女の推定成人身長（１４８．５ｃｍ）は、彼女の目標身長（１６３ｃｍ）および目標の範囲（１５５〜１９１ｅｍ）より下であった：詳細は、オガタ（Ｏｇａｔａ）ら，１９９２を参照のこと。

ＡＫは、核型４６，Ｘ ｒｅａ （Ｘ）（Ｘｑｔｅｒ → Ｘｐ２２．３：：Ｘｐ２２．３ → Ｘｐ２１．３：）の女子である。１３歳のとき、彼女の身長は、日本人の女子の２番目の百分位数の成長曲線より下のままであった；彼女の推定成人身長（１４２．８ｃｍ）は、彼女の目標身長（１５５．５ｃｍ）および目標の範囲（１４７．５〜１６３．５ｅｍ）より下であった。詳細は、オガタ（Ｏｇａｔａ）ら，１９９５を参照のこと。

ＲＹ：環状Ｙ患者の核型は、１００リンパ球で検査されたように、４６，Ｘ，ｒ（Ｙ）／４６，Ｘｄｉｃ ｒ（Ｙ）／４５，Ｘ〔９５：３：２〕である；１６歳の年齢のとき、彼の最終身長は１４８であった；彼の３人の兄弟の身長は、全員、それぞれ１７０ｃｍ（１６歳，兄弟１）、１６４ｃｍ（１４歳、兄弟２）および１２８ｃｍ（９歳、兄弟３）の正常な範囲である。この患者の成長遅延はあまりにも厳しいのでＹｑ上のＧＣＹ位置のさらなる欠失と矛盾しないであろう。 ＡＴ：失調症およびｉｎｖ（Ｘ）の男子；７歳で１１６ｃｍの正常な身長であり、両親の身長は、それぞれ１５６ｃｍおよび１９０ｃｍである。

変異解析のための患者
ＳＨＯＸａの変異について、特発性の低身長を患った２５０個体を試験した。該患者は、下記特徴で選抜した：暦年齢の身長は、国民身長平均の３番目の百分位数より下であり、マイナス２の標準偏差（ＳＤＳ）であった；特に原因となる疾患は知られなかった：妊娠年齢として正常な体重（身長）、正常な体型、慢性器官疾患無し、正常な食事量、精神医学的疾患無し、骨形成不全無し、甲状腺または成長ホルモン欠陥無し。

ファミリーＡ：
症例１および２は、ドイツ人の血を分けていない家族の低身長の子供である。男子（症例１）は帝王切開により妊娠第３８週目に生まれた。誕生時の体重は、２６６０ｇであり、誕生時の身長は４７ｃｍであった。彼は、普通より劣る成長を除いて正常に発育した。６．４歳の年齢での検査で、彼は、比例して小さく（１０６．８ｃｍ，−２．６ＳＤＳ）、肥満（２２．７ｋｇ）であったが、他の点では正常であった。彼の骨の年齢は遅延しておらず（６歳）、Ｘ線解析により骨形成不全が除外された。ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰ−３レベルならびに血清中の甲状腺パラメーターはＧＨまたは甲状腺ホルモン欠陥がありそうもなかった。女子（症例２）は、帝王切開により出産予定日に生まれた。誕生時の体重は２９２０ｇであり、誕生時の身長は４７ｃｍであった。彼女の発育の時点は正常であったが、１２か月の年齢までに成長不良が明らかとなった（身長：６７ｃｍ、−３．０ＳＤＳ）。４歳のとき、彼女は８９．６ｃｍの身長であった（−３．６ＳＤＳ）。形態不全の特徴すなわち体型不全は明らかではなかった。彼女は、肥満ではなかった（１３ｋｇ）。彼女の骨年齢は３．５歳であり、骨形成不全は排除された。ホルモンパラメーターは正常であった。該女子と該男子の両方はターナー症候群の女性の５０百分位数の成長曲線で成長した。母親は、ファミリーのなかで最も小さく、軽い四肢体型不全を有する（１４２．３ｃｍ、−３．８ＳＤＳ）。彼女の２人の姉妹の１人（１５０ｃｍ、−２．５ＳＤＳ）および母方の祖母（１５３ｃｍ、−２．０ＳＤＳ）は、いかなる体型不全をももたずに全員低かった。一方の姉妹は、正常な身長を有する（１６７ｃｍ、＋０．４ＳＤＳ）。父親の身長は１６６ｃｍ（−１．８ＳＤＳ）であり、母方の祖父の身長は１６５ｃｍ（−１．９ＳＤＳ）であった。他の患者は生まれが日系人であり、同一の変異を示した。

低身長遺伝子の同定
Ａ．イン・サイチュハイブリダイゼーション
ａ）蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
Ｘｐ／Ｙｐ偽常染色体領域（ＰＡＲ１）に存在するコスミドを用いる蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を行った。コスミド６４／７５ｃｏｓ（ＬＬＮＬｃ１１０Ｈ０３２）、Ｅ２２ｃｏｓ（２ｅ２）、Ｆ１／１４ｃｏｓ（１１０Ａ７）、Ｍ１／７０ｃｏｓ（１１０Ｅ３）、Ｐ９９Ｆ２ｃｏｓ（４３Ｃ１１）、Ｐ９９ｃｏｓ（ＬＬＮＬｃ１１０Ｐ２４１０）、Ｂ６ｃｏｓｂ（１ＣＲＦｃ１０４Ｈ０４２５）、Ｆ２０ｃｏｓ（３４Ｆ５）、Ｆ２１ｃｏｓ（ＩＣＲＦｃ１０４Ｇ０４１１）、Ｆ３ｃｏｓ２（９Ｅ３）、Ｆ３ｃｏｓ１（１１Ｅ６）、Ｐ１１７ｃｏｓ（２９Ｂ１１）、Ｐ６ｃｏｓ１（ＩＣＲＦｃ１０４Ｐ０１１７）、Ｐ６ｃｏｓ２（ＬＬＮＬｃ１１０Ｅ０６２５）およびＥ４ｃｏｓ（１５Ｇ７）を用いたＦＩＳＨ研究を公開された方法〔リヒター（Ｌｉｃｈｔｅｒ）およびクレマー（Ｃｒｅｍｅｒ），１９９２〕に従って行った。簡単には、それぞれのコスミドクローン１マイクログラムをビオチンで標識し、反復性ＤＮＡ配列からのシグナルを抑制する条件下にヒト分裂中期の染色体とハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションシグナルの検出はＦＩＴＣ共役アビジンを介した。ＦＩＴＣのイメージを冷却電荷共役装置カメラシステム（ｃｏｏｌｅｄ ｃｈａｒｇｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｄｅｖｉｃｅ ｃａｍｅｒａ ｓｙｓｔｅｍ）〔Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を用いて撮影された。

ｂ）物理マッピング
コスミドはローレンス・リバーモア・ナショナル・ラボラトリー（Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）Ｘ−およびＹ−染色体ライブラリーならびにインペリアル・キャンサー・リサーチ・フンド・ロンドン（Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｕｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ）〔現マックス・プランク・インスティチュート・フォア・モレキュラー・ジェネティックス・ベルリン（Ｍａｘ Ｐｌａｎｃｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｂｅｒｌｉｎ）Ｘ染色体ライブラリーから得られた。ＤＸＹＳ１５に遠位のコスミド、すなわち、Ｅ４ｃｏｓ、Ｐ６ｃｏｓ２、Ｐ６ｃｏｓ１、Ｐ１１７ｃｏｓおよびＦ３ｃｏｓ１を用いて、２コピーのＥ４ｃｏｓ、Ｐ６ｃｏｓ２、Ｐ６ｃｏｓ１が、まだ存在し、１コピーのＰ１１７ｃｏｓおよびＦ３ｃｏｓ１が存在する。ＡＫとＳＳの両方の患者のブレークポイントは、コスミドＰ６ｃｏｓ１上にお互いから１０ｋｂの最大物理距離で位置づけした。ＡＫとＳＳの異常なＸ染色体が、約６３０ｋｂのＤＮＡを欠失したことを結論づけた。

さらにコスミドをＩＣＲＦ Ｘ染色体特異的コスミドライブラリー（ＩＣＲＦｃ１０４）、ローレンス・リバーモアＸ染色体特異的コスミドライブラリー（ＬＬＮＬｃ１１０）およびＹ染色体特異的ライブラリー（ＬＬＣＯ３’Ｍ’）ならびに全ゲノムをカバーする自作のコスミドライブラリーから得た。この領域に位置する全ての公知プローブとのハイブリダイゼーションにより、および全ＹＡＣｓをプローブとして用いることによりコスミドを同定した。オーバーラップを証明するため、複数のコスミド由来の末端プローブを、公知のプローブを用いてオーバーラップが証明できなかった症例に用いた。
ｃ）サザンブロットハイブリダイゼーション

異なる偽常染色体マーカーを用いるサザンブロット解析は患者ＣＣのＸ染色体上のブレークポイントがＤＸＹＳ２０（３ｃｏｓＰＰ）とＤＸＹＳ６０（Ｕ７Ａ）間に存在するという証拠を提供する〔ヘンケ（Ｈｅｎｋｅ）ら、１９９１〕。この知見を確認し、ブレークポイントの位置を精密化するために、コスミド６４／７５ｃｏｓ、Ｅ２２ｃｏｓ、Ｆ１／１４ｃｏｓ、Ｍ１／７０ｃｏｓ、Ｆ２ｃｏｓ、Ｐ９９Ｆ２ｃｏｓおよびＰ９９ｃｏｓをＦＩＳＨプローブとして用いた。Ｅ２２ＰＡＣ上のコスミド６４／７５ｃｏｓ（１コピー）およびＦ１／１４ｃｏｓ（２コピー）の間に患者ＣＣの異常Ｘのブレークポイントの位置を決定することができた。正常な身長の患者ＣＣは、結果的に約２６０〜２９０ｋｂのＤＮＡを欠如していた。

サザンブロットハイブリダイゼーションは、チャーチ（Ｃｈｕｒｃｈ）緩衝液（０．５Ｍ ＮａＰｉ ｐＨ７．２，７％ＳＤＳ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）中、６５℃、高ストリンジェント条件で行い、６５℃で４０ｍＭ ＮａＰｉ、１％ＳＤＳ中で洗浄した。

ｄ）ＦＩＳＨ解析
ビオチン化コスミドＤＮＡ（挿入断片サイズ３２−４５ｋｂ）またはコスミド断片（１０−１６ｋｂ）を以前に記載された（リヒター（Ｌｉｃｈｔｅｒ）およびクレマー（Ｃｒｅｍｅｒ），１９９２）ような条件下に患者の刺激されたリンパ球由来の分裂中期染色体とハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたプローブは、アビジン共役ＦＩＴＣを介して検出された。

ｅ）ＰＣＲ増幅
全てのＰＣＲは、１００ｐｇ〜２００ｎｇ鋳型、２０ｐｍｏｌの各プライマー、２００μＭ ｄＮＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、７５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ９、２０ｍＭ （ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ 、０．０１％（ｗ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ２０および２ＵのＧｏｌｄｓｔａｒ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）を含む５０μｌ容量中で行った。サーマルサイクルはＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ ＧｅｎｅＥ（Ｔｅｃｈｎｅ）で行った。

ｆ）エキソン増幅
コスミド整列群由来の各々４〜５クローンからなる４つのコスミドプールをエキソン増幅実験に用いた。各コスミドプール中のコスミドはＳａｕ３Ａで部分的に切断した。４〜１０ｋｂのサイズ範囲のゲル精製画分をＢａｍＨＩ切断ｐＳＰＬ３Ｂベクター〔バーン（Ｂｕｒｎ）ら、１９９５〕にクローン化し、以前に記載されたように〔チャーチ（Ｃｈｕｒｃｈ）ら，１９９４〕、エキソン増幅実験に用いた。

ｇ）ゲノムシークエンス
２つのコスミドＬＬＯＹＮＣＯ３’Ｍ’１５Ｄ１０およびＬＬＯＹＮＣＯ３’Ｍ’３４Ｆ５の音波処理断片を別々にＭ１３ｍｐ１８ベクターにサブクローニングした。各コスミドライブラリーから、少なくとも１０００プラークを取り、Ｍ１３ＤＮＡを調製し、ダイ・ターミネーター、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびユニバーサルＭ１３−プライマー（ＭＷＧ−ＢｉｏＴｅｃｈ）を用いてシークエンスした。ゲルをＡＢＩ−３７７シークエンサーで流し、データーを集め、ＧＡＰ４プログラム（Ｓｔａｄｅｎ）で編集した。

全６人の患者のうち、ＧＡは最小のよくキャラクタライズされた染色体のブークポイントを有した。以前にＸ上における存在または非存在を試験した最も遠位のマーカーは、ＤＸＳ１０６０およびＤＸＳ９９６であり、それらはテロメアから約６Ｍｂに位置する〔ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）ら，１９９５〕。ＰＡＲ１内由来の異なる遺伝子配列を含むいくつかのコスミド（ＭＩＣ２、ＡＮＴ３、ＣＳＦ２ＲＡおよびＸＥ７）を試験し、全てが転座染色体上に存在した。例えば染色体などの低身長の重要な領域内由来のコスミドで、それによりコスミドＭ１／７０ｃｏｓ上の転座ブレークポイントに位置するコスミド。正常Ｘと整列化Ｘとの間のＭ１／７０ｃｏｓのシグナル強度の定量比較は、このコスミドの約７０％が欠失されたことを示す。

表２：この表は、４人の患者において試験した１６コスミドのＦＩＳＨデータを要約する。
〔−〕 １コピー；それぞれのコスミドが整列化Ｘ上で欠失されたが正常 Ｘ染色体に存在することを示す。
〔＋〕 ２コピー；それぞれコスミドが整列化Ｘ染色体上および正常Ｘ染 色体上に存在することを示す。
〔（＋）〕ブレークポイント領域；ブレークポイントがＦＩＳＨにより示 されたコスミド内に生じることを示す。

すなわち、Ｘ染色体転位を有する６患者における、蛍光標識コスミドプローブを用いた分子分析とイン・サイチュハイブリダイゼーションは、患者ＧＡのブレークポイントとは動原体遠位側で境界を接し、患者ＡＫおよびＳＳのブレークポイントとは動原体近位側で境界を接する２７０ｋｂインターバルに低身長重要領域を絞り込みうることが示される。

遺伝子型と表現型の相関は有益な情報であるが、これを利用して、ヒトのＸおよびＹ染色体上の低身長重要インターバルを描写することを選んだ。本研究においては、ＦＩＳＨ解析を用いて、Ｘ染色体上の欠失と転位およびＸｐ２２．３内のブレークポイントを有する患者のリンパ球の中期スプレッド（metaphase spreads ）と間期核（interphase nuclei ）を調べた。調べた４患者中２人（ＡＫおよびＳＳ）において、おそらく染色体再配列の素因となっている配列が存在するために、これらのブレークポイントがクラスターを形成しているものと思われる。さらに別の症例においては、Ｙ環の２７０ｋｂ重要領域に分断があって、重要部分が１７０ｋｂ領域に減少させていることが判明した。

全６個体全員の身長と欠失ブレークポイントとの相関を調べることにより、その有無が身長に対して有意な影響を及ぼす偽常染色体領域のなかに１７０ｋｂの部分がマッピングされた。このインターバルは、患者ＧＡのＸ染色体ブレークポイントとはテロメア（Ｘｐｔｅｌ）から遠位側３４０ｋｂの位置で、また患者ＡＴおよびＲＹのブレークポイントとはＸｐｔｅｌから近位側５１０/ ５２０ｋｂの位置で境界を接していた。このように位置が決まったことで、重要部分は当初サイズ［オガタら（Ogata ）、1992；オガタら（Ogata ）、1995］の4 分の1 近くまで顕著に短縮したことがわかる。６〜８個の少数のコスミドのセットをＦＩＳＨ実験に用いて、多数の特発性低身長患者の群について、このゲノム座の発現頻度と影響を調べることができる。

Ｂ．低身長遺伝子候補の同定
最小１７０ｋｂ重要領域内の転写ユニットを探索するために、６種類のコスミド( １１０Ｅ３、Ｆ２ｃｏｓ、４３Ｃ１１、Ｐ２４１０、１５Ｄ１０、３４Ｆ５) のエキソントラッピングとｃＤＮＡ選択を行った。エキソントラッピングにより、３種類の陽性クローン( ＥＴ９３、ＥＴ４５、およびＧ１０８) を単離したが、これらのものはいずれもコスミド３４Ｆ５に逆マッピングされた。ｃＤＮＡ選択プロトコルと２５種類の過剰ｃＤＮＡライブラリーを用いた過去の研究は不成功に終わったことから、この部分に存在する遺伝子は、発現頻度が非常に低いことが示唆された。

この部分における特定遺伝子の欠損の有無を調べるために、ランダムＭ１３法とダイターミネーターの作用を用いて、ＰＡＲ１のこの領域に由来する約１４０ｋｂのヌクレオチド配列を決定した。配列解析用のコスミドは、互いに最小のオーバーラップになるように、また集合的に重要部分をスパンするように選択した。ＤＮＡ配列分析に及び「Ｘ Ｇｒａｉｌ」プログラムのバージョン１．３ｃならびにエキソントラッピングプログラムＦＥＸＨＢによるタンパク質推定を行い、３つの予めクローン化したエキソン全部を確認した。予め単離した１つのタンパク質コード化遺伝子を検出できなかった。

Ｃ．低身長遺伝子候補ＳＨＯＸの単離
全３つのエキソンクローンＥＴ９３、ＥＴ４５およびＧ１０８は同一の遺伝子の一部であると仮定し、これらをまとめてプローブとして用い、胎児組織（肺、肝臓、脳１および２）ならびに成人組織（卵巣、胎盤１および２、繊維芽細胞、骨格筋、骨髄、脳、脳幹、視床下部、下垂体）の１２種類から１４種類のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。約１，４００万個のプレート培養クローンからはただ一つの単一クローンも検出されなかった。全長転写物を単離するために、３’および５’ＲＡＣＥを行った。３’ＲＡＣＥについては、Ｇ１０８が発現することが示されている組織の胎盤、骨格筋、および骨髄繊維芽細胞由来のＲＮＡ上でエキソンＧ１０８由来プライマーを使用した。これら3 種類の組織すべてから１１７３ｂｐと６５２ｂｐの2 種類の3 ’ＲＡＣＥクローンが得られ、2 種類の3 ’エキソンａとｂが存在することが示唆された。該2 種類のエキソン型をＳＨＯＸａおよびＳＨＯＸｂと命名した。

低頻度で発現されることが知られている遺伝子の完全５’部分を単離する可能性を高めるために、Ｈｅｌａ細胞株をレチノイン酸とホルボールエステルＰＭＡで処理した。かかる誘導細胞株由来のＲＮＡと胎盤および骨格筋に由来するＲＮＡを用い、「マラソンｃＤＮＡライブラリー」を構築した。３つの組織すべてから、同一の5 ’ＲＡＣＥ ｃＤＮＡクローンを単離した。

実験方法：
ＲＴ−ＰＣＲとｃＤＮＡライブラリーの構築
心臓、膵臓、胎盤、骨格筋、胎児腎臓および肝臓のヒトポリＡ⁺ ＲＮＡをClontech社から購入した。製造業者により記載されたように、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Gibco-BRL 社）を用いて、骨髄繊維芽細胞株から全ＲＮＡを単離した。オリゴ（ｄＴ）- アダプタープライマー（ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣ[ ｄＴ] ₂₀Ｎを用い、スーパースクリプト第一鎖ｃＤＮＡ合成キット（Gibco-BRL 社）により、１００ｎｇのポリＡ+ ＲＮＡまたは１０μｇの全ＲＮＡから第一鎖ｃＤＮＡ合成を行った。第一鎖ｃＤＮＡ合成終了後、反応混合物を10倍に希釈した。この希釈液5 μｌずつをさらにＰＣＲ実験に供した。

製造業者により記載されたように、マラソンｃＤＮＡ増幅キット（Clontech社）を用い、骨格筋および胎盤のポリＡ⁺ ＲＮＡから「マラソンｃＤＮＡライブラリー」を構築した。

胎児脳（カタログ番号ＨＬ５０１５ｂ）、胎児肺（ＨＬ３０２２ａ）、卵巣（ＨＬ１０９８ａ）、下垂体（ＨＬ１０９７ｖ）、および視床下部（ＨＬ１１７２ｂ）のｃＤＮＡライブラリーをClontech社から購入した。脳、腎臓、肝臓、および肺のｃＤＮＡライブラリーは、クイックスクリーンヒトｃＤＮＡライブラリーパネル（Clontech社）に添付のものを用いた。胎児筋肉ｃＤＮＡライブラリーを英国ヒトゲノムマッピングプロジェクトリソースセンターから入手した。

Ｄ．配列解析とＳＨＯＸ遺伝子の構造
５’および３’ＲＡＣＥ由来クローンの配列を分析することにより、ＳＨＯＸａおよびＳＨＯＸｂ（１３４９および１８７０ｂｐ）のコンセンサス配列を決定した。１８７０ｂｐ（ＳＨＯＸａ）および１３４９ｂｐ（ＳＨＯＸｂ）の単純オープンリーディングフレームが同定され、２９２アミノ酸（ＳＨＯＸａ）および２２５アミノ酸（ＳＨＯＸｂ）の２つのタンパク質が見つかった。これらａとｂの転写物の両方は共通の5 ’末端を持っていたが、異なる最後の３’エキソンを有し、知見は、択一的スプライシングシグナルの利用可能性を示唆する。２つのｃＤＮＡとコスミドＬＬ０ＹＮＣＯ３”Ｍ”１５Ｄ１０およびＬＬ０ＹＮＣ３”Ｍ”３４Ｆ５由来のシークエンスしたゲノムＤＮＡとの完全なアラインメントを行い、エキソン−イントロン構造を確定することができた（図4 ）。この遺伝子は、５８ｂｐ（エキソンＩＩＩ）から１１４６ｂｐ（エキソンＶａ）のサイズにわたる6 つのエキソンから構成される。エキソンＩはＣｐＧ島と開始コドンと5 ’領域を含む。終止コドンならびに３’非コード領域は、択一的スプライシングエキソンＶａとＶｂのそれぞれの中に局在される。

低身長に重要であると同定される１６０ｋｂ領域にマッピングされる2 個のｃＤＮＡを同定した。これらのｃＤＮＡは、遺伝子ＳＨＯＸとｐＥＴ９２に対応する。該ｃＤＮＡは、コスミドのサブクローンをｃＤＮＡライブラリーにハイブリダイゼーションにより同定した。

重要領域全体をカバーするコスミドクローンのセットを用いることで、原因遺伝子を同定するための遺伝子材料が提供されている。この領域からの遺伝子単離を目的として、エキソントラッピングおよびｃＤＮＡ選択技術によるポジショナルクローニングを試みた。これらの遺伝子は偽常染色体領域内に位置するため、Ｘ−不活化を受けずに用量効果を示すものと考えられる。

欠損（半数体）または欠失すると低身長を引き起こす遺伝子のクローニングは、診断精度をさらに向上させる手段の一つであり、例えば単鎖高次構造多型分析（ＳＳＣＰ）による遺伝子内突然変異分析の基礎を提供する。また、この遺伝子をクローン化し、続く生化学的キャラクタライゼーションにより、成長制御に関与する生物学的プロセスをより深く理解する道が開かれる。

本発明のＤＮＡ配列によれば、複雑で不均一な特発性低身長患者集団の中で特定の遺伝子欠陥を有する個体を同定する最初の分子学的検査法が提供される。

ＳＨＯＸａとＳＨＯＸｂの発現パターン
単一のエキソンをハイブリダイゼーションプローブとして用いるノーザンブロット分析で、各エキソンごとに異なる発現プロファィルが明らかとなり、異なるサイズと強度のバンドは、ＧとＣの多い他の遺伝子配列とのクロス−ハイブリダイゼーション産物であることをしめすことが示唆される。ＳＨＯＸａとｂの両遺伝子のより詳細な発現プロファィルを達成するために、異なる組織に由来するＲＮＡにつき、ＲＴ−ＰＣＲ実験を行った。骨格筋、胎盤、膵臓、心臓、および骨髄繊維芽細胞ではＳＨＯＸａの発現が見られたのに対し、ＳＨＯＸｂの発現は、胎児の腎臓、骨格筋、および骨髄繊維芽細胞に限定されており、骨髄繊維芽細胞で一層高い発現が認められた。

胎児の脳、肺および筋肉ならびに成人の脳、肺および下垂体から調製された数種類のｃＤＮＡライブラリーにおいてＳＨＯＸａが発現され、調べたライブラリーのいずれにおいてもＳＨＯＸｂは発現されなかったことから、一方のスプライス型（ＳＨＯＸａ）はより広範囲に発現され、他方（ＳＨＯＸｂ）は主に組織特異的に発現されるといううさらなる証拠が与えられる。

ＸおよびＹ染色体上のＳＨＯＸａとＳＨＯＸｂの転写活性を調べるために、活性Ｘ染色体、不活性Ｘ染色体またはＹ染色体を唯一のヒト染色体として含む様々な細胞株から抽出したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲを用いた。すべての細胞株は、１１９ｂｐ（ＳＨＯＸａ）および５４１ｂｐ（ＳＨＯＸｂ）という予想された長さの増幅産物が現れ、ＳＨＯＸａとｂはいずれもＸ染色体不活化を回避するという事実が証明された。

ＳＨＯＸａとＳＨＯＸｂは、新規のホメオドメインタンパク質をコードする。ＳＨＯＸは、哺乳類から魚類およびハエまでの種にわたり高度に保存される。ホメオドメイン−の側の５’末端と3 ’末端が、ヒトとマウスの間で保存されている領域であるらしく、機能的意義を示す。これらのアミノ酸領域の違いは、ヒトとマウスの進化の過程で蓄積することはなかった。

実験方法：
ａ）５’および３’ＲＡＣＥ
ＳＨＯＸａおよびｂ転写物の5 ’末端をクローン化するために、上記で構築した「マラソンｃＤＮＡライブラリー」を用いて、５’ＲＡＣＥを行った。下記オリゴヌクレオチドプライマー：ＳＨＯＸ Ｂ ｒｅｖ、ＧＡＡＡＧＧＣＡＴＣＣＧＴＡＡＧＧＣＴＣＣＣ（６９７- ７１８位、逆鎖［ｒ］）およびアダプタープライマーＡＰ1 を用いた。下記タッチダウンパラメーター：９４℃２分間、９４℃３０秒間、７０℃３０秒間、７２℃２分間を５サイクル、９４℃３０秒間、６６℃３０秒間、７２℃分間を５サイクル、９４℃３０秒間、６２℃３０秒間、７２℃２分間を２５サイクルによりＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物の１/ １００量と下記ネスティッドオリゴヌクレオチドプライマー：ＳＨＯＸ Ａ ｒｅｖ、ＧＡＣＧＣＣＴＴＴＡＴＧＣＡＴＣＴＧＡＴＴＣＴＣ（６１７- ６４０位ｒ）およびアダプタープライマーＡＰ２を用いて、第２ラウンド目の増幅を行った。アニーリング温度６０℃で３５サイクルのＰＣＲを行った。

ＳＨＯＸａおよびｂ転写物の３’末端をクローン化するために、オリゴ（ｄＴ）アダプターを付けた第一鎖ｃＤＮＡを用いて、既報〔フロッホマンら（Frohman et al.）、1988〕に従い、３’ＲＡＣＥを行った。下記オリゴヌクレオチドプライマー：ＳＨＯＸ Ａ ｆｏｒ、ＧＡＡＴＣＡＧＡＴＧＣＡＴＡＡＡＧＧＣＧＴＣ（６１９- ６４０位）およびオリゴ（ｄＴ）アダプターを用いた。下記パラメーターを用いて、ＰＣＲを行った。すなわち、９４℃２分間、９４℃３０秒間、６２℃３０秒間、７２℃２分間を３５サイクル行った。ＰＣＲ産物の１/ １００量と下記ネスティッドオリゴヌクレオチドプライマー：ＳＨＯＸ Ｂ ｆｏｒ、ＧＧＧＡＧＣＣＴＴＡＣＧＧＡＴＧＣＣＴＴＴＣ（６９７- ７１８位）およびオリゴ（ｄＴ）アダプターを用いて、第２ラウンド目の増幅を行った。アニーリング温度６２℃で３５サイクルのＰＣＲを行った。

ＳＨＯＸａおよびＳＨＯＸｂ転写物の配列を確認するために、５’オリゴヌクレオチドプライマーと３’オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＳＨＯＸａについては、下記プライマー：Ｇ３１０ ｆｏｒ、ＡＧＣＣＣＣＧＧＣＴＧＣＴＣＧＣＣＡＧＣ（５９- ７８位）およびＳＨＯＸ Ｄ ｒｅｖ、ＣＴＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＴＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧ（９５９- ９８２位、ｒ）を用いた。ＳＨＯＸｂについては、下記プライマー：Ｇ３１０ ｆｏｒ、ＡＧＣＣＣＣＧＧＣＴＧＣＴＣＧＣＣＡＧＣおよびＳＨＯＸ２Ａ ｒｅｖ、ＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＡＡＧＡＴＣＣＣ（１２１５- １２３８位、ｒ）を用いた。下記タッチダウンパラメーター：９４℃２分間、９４℃３０秒間、７０℃３０秒間、７２℃２分間を５サイクル、９４℃３０秒間、６８℃３０秒間、７２℃２分間を５サイクル、９４℃３０秒間、６５℃３０秒間、７２℃２分間を３５サイクルにより、両者のＰＣＲを行った。産物をゲル精製し、配列分析のためにクローン化した。

ｂ）ＳＳＣＰ分析
既報の方法〔オリタら（Orita et al.）、1989〕に従い、患者のゲノム増幅ＤＮＡのＳＳＣＰ分析を行った。１〜５μｌのＰＣＲ産物を、９５％ホルムアミドと１０ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８を含む変性液５μｌと混合し、９５℃で１０分間変性させた。試料をただちに氷上で冷やし、２％グリセリンと１ｘＴＢＥを含む１０％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝３７．５：１および２９：１；Ｍｕｌｔｉｓｌｏｔｇｅｌ、ＴＧＧＥベース、Qiagen社）に負荷した。ゲルを１５℃、５００Ｖで３〜５時間泳動させ、ＴＧＧＥハンドブック（Qiagen社、1993）の記載に従い銀染色を行った。

ｃ）ＰＣＲ産物のクローニングと配列決定
Amersham社から入手したｐＭＯＳＢｌｕｅＴ- ベクターキットを用いて、ＰＣＲ産物をｐＭＯＳＢｌｕｅにクローン化した。単一のコロニーの一夜培養物を、１００μｌのＨ₂ Ｏ中で１０分間煮沸することで、溶解した。溶解物をクローン化ＰＣＲ産物に特異的なプライマーを用いるＰＣＲの鋳型として使用した。ＰＣＲ産物のＳＳＣＰにより、異なる対立遺伝子を含むクローンの同定ができた。ＣＹ５標識ベクタープライマーＵｎｉおよびＴ７を用い、メーカー指定のサイクルシークエンシング（ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅキット（Amersham社））により、ＡＬＦ高速自動シークエンサー（Pharmacia 社）で、クローンの配列を決定した。

ｄ）ｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲスクリーニング
ＳＨＯＸａおよびｂの発現を検出するために、ＳＨＯＸａおよびｂ特異的プライマーを用いて、数種類のｃＤＮＡライブラリーと第一鎖ｃＤＮＡのＰＣＲスクリーニングを行った。ｃＤＮＡライブラリーについては、５ｘ１０⁸ ｐｆｕ相当のＤＮＡを用いた。ＳＨＯＸａについては、プライマーＳＨＯＸ Ｅ ｒｅｖ、ＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＴＴＧＧＡＡＡＧＧ（７１３- ７３７位、ｒ）およびＳＨＯＸａ ｆｏｒを用いた。ＳＨＯＸｂについては、下記プライマー：ＳＨＯＸ Ｂ ｆｏｒおよびＳＨＯＸ２Ａ ｒｅｖを用いた。下記タッチダウンパラメーター：９４℃２分間、９４℃３０秒間、６８℃３０秒間、７２℃４０秒間を５サイクル、９４℃３０秒間、６５℃３０秒間、７２℃４０秒間を５サイクル、９４℃３０秒間、６２℃３０秒間、７２℃４０秒間の処理を３５サイクルを用いて、両者のＰＣＲを行った。

ｅ）ｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲスクリーニング
ＳＨＯＸａおよびｂの発現を検出するために、ＳＨＯＸａおよびｂ特異的プライマーを用いて、数種類のｃＤＮＡライブラリーと第一鎖ｃＤＮＡのＰＣＲスクリーニングを行った。ｃＤＮＡライブラリーについては、５ｘ１０⁸ ｐｆｕ相当のＤＮＡを用いた。ＳＨＯＸａについては、プライマーＳＨＯＸ Ｅ ｒｅｖ、ＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＴＴＧＧＡＡＡＧＧ（７１３- ７３７位、ｒ）およびＳＨＯＸａ ｆｏｒを用いた。ＳＨＯＸｂについては、下記プライマー：ＳＨＯＸ Ｂ ｆｏｒおよびＳＨＯＸ２Ａ ｒｅｖを用いた。下記タッチダウンパラメーター：９４℃２分間、９４℃３０秒間、６８℃３０秒間、７２℃４０秒間を５サイクル、９４℃３０秒間、６５℃３０秒間、７２℃４０秒間を５サイクル、９４℃３０秒間、６２℃３０秒間、７２℃４０秒間の処理を３５サイクルを用いて、両者のＰＣＲを行った。

ＳＨＯＸとＳＨＯＴの両者の推定マウスホモログであるＯＧ１２の発現パターン
受胎後５日目から受胎後１８．５日目のマウス胚ならびに胎児の動物および新生動物のイン・サイチュハイブリダイゼーションを行い、発現パターンを確定した。発現は、発生段階の肢芽、鼻と口蓋の形成に関与する上顎骨前頭突起の中胚葉、眼瞼、大動脈、発生段階の雌性生殖腺、発生段階の脊髄（分化中の運動神経に限定）、および脳で見られた。この発現パターンおよびヒトホモログであるＳＨＯＴのマッピング位置からみて、ＳＨＯＴは、低身長を含むコルネリア・ド・ランゲ症候群の原因遺伝子の恐らく候補であろうことを示す。

ヒトの成長と低身長に関係する第３染色体上の新規ＳＨＯＸ様ホメオボックス遺伝子ＳＨＯＴの単離
ネズミＯＧ１２遺伝子とヒトＳＨＯＸ遺伝子との最も高い相同性を有するＳＨＯＴと呼ばれる新規遺伝子（第３染色体上のＳＨＯＸ相同染色体）をヒトから単離した。ヒトＳＨＯＴ遺伝子とネズミＯＧ１２遺伝子は高度に相同的であり、タンパク質レベルで９９％同じである。まだ証明はなされていないが、ＳＨＯＴとＳＨＯＸの間には顕著な相同性があるため（ホメオドメイン内のみの同一性）、ＳＨＯＴも恐らく低身長やヒトの成長に関与する遺伝子であろう。

ＥＭＢＬデータベースから２つの新規ヒトＥＳＴ（ＨＳ１２２４７０３およびＨＳ１２６７５９）由来のプライマーを用いて、ＳＨＯＴを単離し、骨髄繊維芽細胞株［ラオら（Rao et al.）、1997］から逆転写したＲＮＡを増幅した。既報［ラオら（Rao et al.）、1997］に従い構築された骨髄繊維芽細胞ライブラリーから、ＲＡＣＥ−ＰＣＲにより、ＳＨＯＴの５’および３’末端を生成した。ＦＩＳＨ分析により、ＳＨＯＴは染色体３ｑ２５/ ｑ２６にマッピングされ、ネズミホモログはマウス第３染色体上のシンテニー領域にマッピングされた。マウスホモログであるＯＧ１２の発現パターンからみて、ＳＨＯＴは、３ｑ２５/ ２６上のこの染色体部分にマッピングされるコルネリア・ド・ランゲ症候群（低身長や頭蓋顔面異常などの症状を示す）の原因遺伝子候補である。

特発性低身長患者における突然変異の検索
本発明のＤＮＡ配列を、ＰＣＲ、ＬＣＲ、およびその他の公知技術に用いて、低身長患者が低身長遺伝子に小型欠失または点突然変異を有しているかどうかを調べた。

開始時、合計９１例（総計２５０例）の無関係な特発性低身長症例の男女（通常の集団における特発性低身長の発生率は２〜２．５％と推定される）につき、ＳＨＯＸａ遺伝子における小さい転位または点突然変異の有無を調べた。シングルエキソンを増幅するだけでなく、エキソンをフランキング配列および５’ＵＴＲの小型部分の配列も増幅するために、６セットのＰＣＲプライマーを設計した。最大のエキソンすなわちエキソン１については、さらに２つの内部エキソンプライマーを作成した。ＰＣＲに用いたプライマーを表２に示した。

サイズが１２０から２９５ｂｐにわたるすべての増幅エキソンの単鎖高次構造多型分析（ＳＳＣＰ）を実施した。バンド泳動シフトは、低身長の２症例( Ｙ９１およびＡ１) だけに見られた。ＳＳＣＰパターンが変化した断片( ユニークＳＳＣＰコンフォーマー) をクローン化し、配列を決定した。ＰＣＲと配列決定のアーチファクトを防ぐため、配列決定は、２つの独立したＰＣＲ反応を用いて２本の鎖上で行った。患者Ｙ９１における突然変異は５’ＵＴＲ中の開始コドンの５’側２８ｂｐの位置に存在し、シチジンからグアニンへの置換を伴っている。この突然変異が希な多型であるのか、たとえば翻訳開始因子と比較的弱い結合を示すなどして遺伝子発現を調節することで表現型の原因となっているのかを確認するために、この男性患者の両親と姉妹を調べた。正常身長の姉妹と父親は二人ともに同じＳＳＣＰ変異を示していたことから（データは示さず) 、この塩基置換は表現型とは無関係の希な多型であると考えられる。

患者Ａ１のユニークＳＳＣＰコンフォーマーのクローン化と配列決定を行ったところ、それぞれ予想された２２５個および２９２個のアミノ酸から成る配列のアミノ酸１９５位に終止コドンを導入するシチジンからチミジンへの置換( ヌクレオチド６７４) が見つかった。このナンセンス突然変異が対象家族における低身長と遺伝的に関連しているかどうかを調べるために、家系分析を行った。６名の低身長患者（身長が標準偏差の２倍以下の場合と定義する）全員が異常なＳＳＣＰシフトとシチジンからチミジンへの置換を有することが判明した。正常身長を有する父親や１名のおばや母方の祖父はこの突然変異を示さなかったことから、祖母が突然変異対立遺伝子を娘のうちの２名と２名の孫に遺伝させたことがわかった。すなわち、この家族において突然変異対立遺伝子と低身長表現型の間に一致が見られた。
上記と同じ状況が、日系人の低身長患者でも見られた。

本発明のＤＮＡ配列を用いて、単数または複数遺伝子の機能のキャラクタライゼーションを行った。該ＤＮＡ配列を、核酸またはアミノ酸データベースの検索クエリーとして用いて、関連遺伝子または遺伝子産物を同定することができる。ＳＨＯＸ９３の部分アミノ酸配列をアミノ酸データベースの検索クエリーとして用いた。この検索で、多くの公知ホメオボックスタンパク質と非常に高い相同性を示すことが判明した。本発明のｃＤＮＡ配列を用いて、組換え技術によりペプチドを製造することができる。当該分野に熟練せる者にとって公知の様々な発現系を用いて、組換えタンパク質の製造を行うことができる。

従来のペプチド合成法( メリーフィールド法によるタンパク質合成) により、配列ＣＳＫＳＦＤＱＫＳＫＤＧＮＧＧを有するペプチドを合成し、常法に従い、ウサギとニワトリのポリクローナル抗体を調製した。

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配列番号の簡単な説明
配列番号：１：ホメオボックスドメイン（１８０ｂｐ）の翻訳されたアミノ酸配列
配列番号：２：ＳＨＯＸ遺伝子のエキソンＩＩ（ＥＴ９３）
配列番号：３：ＳＨＯＸ遺伝子のエキソンＩ（Ｇ３１０）
配列番号：４：ＳＨＯＸ遺伝子のエキソンＩＩＩ（ＥＴ４５）
配列番号：５：ＳＨＯＸ遺伝子のエキソンＩＶ（Ｇ１０８）
配列番号：６：ＳＨＯＸ遺伝子のエキソンＶａ
配列番号：７：ＳＨＯＸ遺伝子のエキソンＶｂ
配列番号：８：ＳＨＯＸ遺伝子の初期ヌクレオチド配列
配列番号：９：ＥＴ９２遺伝子
配列番号：１０：ＳＨＯＸａ配列（図２も参照のこと）
配列番号：１１：転写因子Ａ（図２も参照のこと）
配列番号：１２：ＳＨＯＸｂ配列（図３も参照のこと）
配列番号：１３：転写因子Ｂ（図３も参照のこと）
配列番号：１４：ＳＨＯＸ遺伝子
配列番号：１５：ＳＨＯＴ配列（図４も参照のこと）
配列番号：１６：転写因子Ｃ（図４も参照のこと）

図１は、下記：エキソンＩ：Ｇ３１０、エキソンＩＩ：ＥＴ９３、エキソンＩＩＩ：ＥＴ４５、エキソンＩＶ：Ｇ１０８ならびにエキソンＶａおよびＶｂｖとして同定される５つのエキソンを含むＳＨＯＸ遺伝子の遺伝子地図であり、それにより、エキソンＶａおよびＶｂがＳＨＯＸ遺伝子の２つの異なるスプライシング部位から生じる。エキソンＩＩおよびＩＩＩは１８０ヌクレオチドのホメオボックス配列を含む。

図２は、ＳＨＯＸａおよびＳＨＯＸｂのヌクレオチド配列ならびに推定アミノ酸配列を示す：ＳＨＯＸａ：転写の推定される開始は、ヌクレオチド９２で始まり、最初のイン・フレーム終止コドン（ＴＧＡ）はヌクレオチド９６８〜９７０にあり、２９２アミノ酸の推定タンパク質をコードする８７６ｂｐのオープンリーディングフレームを生じる（それぞれ転写因子ＡまたはＳＨＯＸａタンパク質と示す）。イン・フレームの、ヌクレオチド４の５’終止コドン、開始コドンおよび推定ターミネーション終止コドンは太字である。ホメオボックスを箱で囲む（１１７位のアミノ酸（Ｑ）から始まり１７６位のアミノ酸（Ｅ）まで、すなわちヌクレオチド配列でＣＡＧからＧＡＧまで）。イントロンの位置を矢印で示す。３’非翻訳領域の２つの推定ポリアデニル化シグナルに下線を付す。ＳＨＯＸｂ：８７６ｂｐのオープンリーディングフレームはヌクレオチド９２の最初のメチオニンのＡからヌクレオチド７６７〜７６９のイン・フレーム終止コドンまでに存在し、２２５アミノ酸の推定タンパク質をコードする６７５ｂｐのオープンリーディングフレームを生じる（それぞれ転写因子ＢまたはＳＨＯＸｂタンパク質）。イントロンの位置を矢印で示す。エキソンＩ〜ＩＶはＳＨＯＸａと一致し、エキソンＶはＳＨＯＸｂに特異的である。３’非翻訳領域の推定ポリアデニル化シグナルに下線を付す。

図３は、ＳＨＯＸａおよびＳＨＯＸｂのヌクレオチド配列ならびに推定アミノ酸配列を示す：ＳＨＯＸａ：転写の推定される開始は、ヌクレオチド９２で始まり、最初のイン・フレーム終止コドン（ＴＧＡ）はヌクレオチド９６８〜９７０にあり、２９２アミノ酸の推定タンパク質をコードする８７６ｂｐのオープンリーディングフレームを生じる（それぞれ転写因子ＡまたはＳＨＯＸａタンパク質と示す）。イン・フレームの、ヌクレオチド４の５’終止コドン、開始コドンおよび推定ターミネーション終止コドンは太字である。ホメオボックスを箱で囲む（１１７位のアミノ酸（Ｑ）から始まり１７６位のアミノ酸（Ｅ）まで、すなわちヌクレオチド配列でＣＡＧからＧＡＧまで）。イントロンの位置を矢印で示す。３’非翻訳領域の２つの推定ポリアデニル化シグナルに下線を付す。ＳＨＯＸｂ：８７６ｂｐのオープンリーディングフレームはヌクレオチド９２の最初のメチオニンのＡからヌクレオチド７６７〜７６９のイン・フレーム終止コドンまでに存在し、２２５アミノ酸の推定タンパク質をコードする６７５ｂｐのオープンリーディングフレームを生じる（それぞれ転写因子ＢまたはＳＨＯＸｂタンパク質）。イントロンの位置を矢印で示す。エキソンＩ〜ＩＶはＳＨＯＸａと一致し、エキソンＶはＳＨＯＸｂに特異的である。３’非翻訳領域の推定ポリアデニル化シグナルに下線を付す。

図４は、ＳＨＯＴのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列である。転写の推定される開始は、ヌクレオチド４３で始まり、最初のイン・フレーム終止コドン（ＴＧＡ）はヌクレオチド６１３〜６１５にあり、１９０アミノ酸の推定タンパク質をコードする５７３ｂｐのオープンリーディングフレームを生じる（それぞれ転写因子ＣまたはＳＨＯＴタンパク質と示す）。ホメオボックスを箱で囲む（１１位のアミノ酸（Ｑ）から始まり７０位のアミノ酸（Ｅ）まで、すなわちヌクレオチド配列でＣＡＧからＧＡＧまで）。イントロンの位置を矢印で示す。３’非翻訳領域の２つの推定ポリアデニル化シグナルを下線を付す。

図５は、ヒトＳＨＯＸ遺伝子のエキソン／イントロン構造およびヌクレオチド配列におけるそれぞれの位置を与える。 図６は、配列表を示す。

図７は、配列表を示す。

図８は、配列表を示す。

図９は、配列表を示す。

図１０は、配列表を示す。

図１１は、配列表を示す。

図１２は、配列表を示す。

図１３は、配列表を示す。

図１４は、配列表を示す。

図１５は、配列表を示す。

図１６は、配列表を示す。

図１７は、配列表を示す。

図１８は、配列表を示す。

図１９は、配列表を示す。

図２０は、配列表を示す。

図２１は、配列表を示す。

図２２は、配列表を示す。

図２３は、配列表を示す。

図２４は、配列表を示す。

図２５は、配列表を示す。

図２６は、配列表を示す。

図２７は、配列表を示す。

図２８は、配列表を示す。

図２９は、配列表を示す。

図３０は、配列表を示す。

図３１は、配列表を示す。

図３２は、配列表を示す。

図３３は、配列表を示す。

図３４は、配列表を示す。

図３５は、配列表を示す。

図３６は、配列表を示す。

図３７は、配列表を示す。

図３８は、配列表を示す。

図３９は、配列表を示す。

図４０は、配列表を示す。

図４１は、配列表を示す。

図４２は、配列表を示す。

図４３は、配列表を示す。

図４４は、配列表を示す。

図４５は、配列表を示す。

図４６は、配列表を示す。

図４７は、配列表を示す。

図４８は、配列表を示す。

Claims (44)

1. 配列番号：１のアミノ酸配列を有する６０アミノ酸のホメオボックスドメインを含むポリペプチドであって、かつヒトの成長に対する制御活性を有するポリペプチドをコードする単離されたヒト核酸分子。
2. 下記の群：
   ａ）（ｉ）配列番号：１のアミノ酸配列を有する６０アミノ酸のホメオボックスドメインを含むポリペプチドであって、かつヒトの成長を制御する生物学的活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉ）１以上のアミノ酸残基が欠失、付加もしくは置換されていることを除いて配列番号：１のアミノ酸配列を有する６０アミノ酸のホメオボックスドメインを含むが、ヒトの成長を制御する同等の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有してなる単離されたＤＮＡ分子；
   ｂ）ＳＨＯＸ ＥＴ９３〔配列番号：２〕のヌクレオチド配列およびＳＨＯＸ ＥＴ４５〔配列番号：４〕のヌクレオチド配列またはその断片を含有してなる単離されたＤＮＡ分子；
   ｃ）ａ）またはｂ）のＤＮＡ分子にハイブリダイズしうる核酸分子；ならびに
   ｄ）ａ）またはｂ）のＤＮＡ分子と７０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含有してなるＤＮＡ分子、
   から選ばれた、請求項１記載の核酸分子。
3. 配列番号：１の６０アミノ酸のホメオボックスドメインへのＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸の伸長を有するポリペプチドをコードする請求項２記載のＤＮＡ分子。
4. １５０〜３５０アミノ酸の長さを有するポリペプチドをコードする請求項３記載のＤＮＡ分子。
5. さらに、ＳＨＯＸ Ｇ３１０〔配列番号：３〕のヌクレオチド配列を含有してなる請求項２〜４いずれか記載のＤＮＡ分子。
6. さらに、ＳＨＯＸ Ｇ１０８〔配列番号：５〕のヌクレオチド配列を含有してなる請求項２〜５いずれか記載のＤＮＡ分子。
7. さらに、ＳＨＯＸ Ｖａ〔配列番号：６〕またはＳＨＯＸ Ｖｂ〔配列番号：７〕のヌクレオチド配列を含有してなる請求項２〜６いずれか記載のＤＮＡ分子。
8. 下記の群：
   ａ）本質的に〔配列番号：１１〕のアミノ酸配列を有する転写因子Ａ；
   ｂ）本質的に〔配列番号：１３〕のアミノ酸配列を有する転写因子Ｂ；および
   ｃ）本質的に〔配列番号：１５〕のアミノ酸配列を有する転写因子Ｃ
   から選ばれたポリペプチドをコードする請求項１〜４いずれか記載のＤＮＡ分子。
9. ＳＨＯＸ ＥＴ９３〔配列番号：２〕のヌクレオチド配列を含有してなるＤＮＡ配列。
10. さらに、ＳＨＯＸ Ｇ３１０〔配列番号：３〕のヌクレオチド配列を含有してなる請求項９記載のＤＮＡ配列。
11. さらに、ＳＨＯＸ ＥＴ４５〔配列番号：４〕のヌクレオチド配列を含有してなる請求項９または１０記載のＤＮＡ配列。
12. ． さらに、ＳＨＯＸ Ｇ１０８〔配列番号：５〕のヌクレオチド配列を含有してなる請求項９〜１２いずれか記載のＤＮＡ配列。
13. さらに、ＳＨＯＸ Ｖａ〔配列番号：６〕またはＳＨＯＸ Ｖｂ〔配列番号：７〕のいずれかのヌクレオチド配列を含有してなる請求項９〜１２いずれか記載のＤＮＡ配列。
14. ＳＨＯＸ ＥＴ９３〔配列番号：２〕のヌクレオチド配列およびＳＨＯＸ ＥＴ４５〔配列番号：４〕のヌクレオチド配列を含有してなる請求項９記載のＤＮＡ配列。
15. １５． ＳＨＯＸ ＥＴ９３〔配列番号：2 〕のヌクレオチド配列、ＳＨＯＸ ＥＴ４５〔配列番号：４〕のヌクレオチド配列およびＳＨＯＸ Ｇ１０８〔配列番号：５〕のヌクレオチド配列を含有してなる請求項９記載のＤＮＡ配列。
16. ＳＨＯＸ Ｇ３１０〔配列番号：３〕、ＳＨＯＸ ＥＴ９３〔配列番号：２〕、ＳＨＯＸ ＥＴ４５〔配列番号：４〕およびＳＨＯＸ Ｇ１０８〔配列番号：５〕のヌクレオチド配列を含有してなる請求項９〜１５いずれか記載のＤＮＡ配列。
17. さらに、ＳＨＯＸ Ｖａ〔配列番号：６〕のヌクレオチド配列を含有してなる請求項１７記載のＤＮＡ配列。
18. さらに、ＳＨＯＸ Ｖｂ〔配列番号：７〕のヌクレオチド配列を含有してなる請求項１６記載のＤＮＡ配列。
19. 本質的に〔配列番号：１４〕で同定されたＰＡＲ１領域の単離されたゲノム配列からなる請求項９記載のＤＮＡ配列。
20. ＳＨＯＸ ＥＴ９２〔配列番号：９〕のヌクレオチド配列を含有してなるＤＮＡ配列。
21. ． ＤＮＡがヒトの成長の制御の原因となる、ゲノムＤＮＡまたは単離されたＤＮＡである請求項９〜２０いずれか記載のＤＮＡ配列。
22. ＤＮＡがｃＤＮＡである請求項９〜２１いずれか記載のＤＮＡ配列。
23. 本質的にＳＨＯＸａ〔配列番号：１０〕またはＳＨＯＸｂ〔配列番号：１２〕のヌクレオチド配列からなる請求項２２記載のｃＤＮＡ。
24. 本質的にＳＨＯＴ〔配列番号：１４〕のヌクレオチド配列からなる請求項２２記載のｃＤＮＡ。
25. 〔配列番号：１１〕で示されるアミノ酸配列を有するヒト成長タンパク質（転写因子ＳＨＯＸａ）またはその機能的断片。
26. 〔配列番号：１３〕で示されるアミノ酸配列を有するヒト成長タンパク質（転写因子ＳＨＯＸｂ）またはその機能的断片。
27. 〔配列番号：１５〕で示されるアミノ酸配列を有するヒト成長タンパク質（転写因子ＳＨＯＴ）またはその機能的断片。
28. ． 請求項２５、２６または２７いずれか記載のタンパク質をコードするｃＤＮＡ。
29. 請求項２５〜２７いずれか記載のタンパク質を含有してなる医薬組成物。
30. 請求項２５〜２７いずれか記載のタンパク質の治療上有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む低身長の治療方法。
31. 低身長の治療用の医薬組成物を調製するための請求項２５〜２７いずれか記載のタンパク質の使用。
32. 低身長遺伝子の変異に関連する疾患の治療用の医薬組成物を調製するための請求項１〜２４いずれか記載のＤＮＡ配列の使用。
33. 減少した（ｄｅｍｉｎｉｓｈｅｄ）ヒトの成長の原因となる遺伝子欠陥を有する個体の同定用のキットを調製するための請求項１〜２４いずれか記載のＤＮＡ配列の使用。
34. ヒトの低身長の原因となる遺伝子の同定のための請求項３３記載のＤＮＡ配列の使用。
35. 検査対象の生物学的試料分子が配列番号：２〜配列番号：７記載のいずれかのＤＮＡ配列に完全にまたは部分的に相補的な２つのヌクレオチドプローブの存在下に増幅され、つづいて適切な検出系で決定される、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子に基づく低身長の決定方法。
36. 低身長の原因となる遺伝子欠陥を有する人の同定のための請求項３５記載の方法の使用。
37. 請求項１〜２４いずれか記載のＤＮＡ配列を含む低身長の原因となる遺伝子で形質転換されたトランスジェニック動物。
38. 請求項１〜２４いずれか記載のＤＮＡ配列で形質転換された細胞。
39. 請求項３８記載の細胞を含有するヒト低身長の治療に有用な医薬剤を同定またはスクリーニングするための試験系。
40. 請求項３９記載の試験系を提供する工程、および該細胞と該医薬剤の候補物とを接触させたのち、該細胞の表現型における変化または該細胞の発現産物における変化を決定する工程を含む、低身長遺伝子中の変異に関連する疾患の治療に有用な医薬剤の候補物を同定またはスクリーニングする方法。
41. コードされたポリペプチドの発現をもたらしうる請求項１〜８いずれか記載のＤＮＡ分子を含有してなる発現ベクター。
42. ヒトの宿主細胞における発現をもたらす発現プロモーターの下流に請求項１〜８いずれか記載のＤＮＡ分子を組み込んだ発現プラスミドをヒト細胞に導入する工程を含む、ＳＨＯＸまたはＳＨＯＴ遺伝子における少なくとも１種の変異に関連したヒトの成長疾患の遺伝子治療によるイン・ビボ治療方法。
43. ターナー症候群または低身長の治療のための請求項４２記載の方法。
44. 転写因子Ａ、ＢもしくはＣまたはそれらの抗原性断片を用いて哺乳類を免疫し、かつかかる哺乳類から抗体を単離することにより得られた抗体。

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