JP2002510508A - 緑内障の治療剤および診断剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 緑内障を予防し治療するための方法および組成物；および緑内障診断が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 １．発明の背景 緑内障は視神経頭部の杯形成および末梢視覚の喪失によって特徴づけられる視
神経疾患である。場合によっては中枢視覚の喪失もある。患者の大部分において
は、上昇した眼内圧力が存在し、視神経損傷に寄与すると考えられる。緑内障は
先進国における失明の第２の主たる原因である（Ｌｅｓｋｅ， Ｍ．Ｃ．（１
９８３） Ａｍ． Ｊ．ｏｆ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ １１８：１
６６−１９１）。その有病率は年齢と共に増大し、黒人の患者においてより大き
い（Ｌｅｓｋｅ， Ｍ．Ｃ．（１９８３） Ａｍ． Ｊ．ｏｆ Ｅｐｉ
ｄｅｍｉｏｌｏｇｙ １１８：１６６−１９１）。緑内障はほぼ２３０万人の
米国人に罹り、１年間当たりそれらのうちほぼ１２，０００人を失明させる（Ｔ
ｉｅｌｓｃｈ， Ｊ．Ｍ．（１９９３）Ｔｈｅｒａｐｈｙ ｆｏｒ ｇｌ
ａｕｃｏｍａ：ｃｏｓｔｓ ａｎｄ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｉｎ
Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎ
ｓ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｓｔｓ， Ｓ
． Ｆ． Ｂａｌｌ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ， Ｒ． Ｍ．（編、 ６
１−６８頁 Ｋｕｇｌｅｒ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）。

【０００２】 ２．緑内障の最も支配的な形態は一次解放角緑内障（ＰＯＡＧ）、視神経の
変性および杯形成、末梢視野の喪失、および増大した眼内圧力によって特徴づけ
られる視神経の進行性疾患である。ＰＯＡＧが遺伝の複雑な形態とは遺伝的に異
種であることを示す証拠がある。若年性解放角緑内障（ＪＯＡＧ）として知られ
ているＰＯＡＧの初期開始形態は高い浸透度を持つ常染色体優性障害である。

【０００３】 緑内障のかなりの割合が遺伝的ベースを有し（Ｂｅｎｅｄｉｃｔ， Ｔ．Ｗ．
Ｇ． Ａｂｈａｕｎｄｌｕｎｇｅｎ ｚｕｓ ｄｅｍ Ｇｅｂｉｅｔｅ ｄｅｒ
Ａｕｇｅｎｈｅｉｌｋｕｎｄｅ． ”ＲＥＳｌａｕ：Ｌ．Ｆｒｅｕｎｄｅ（１
８４２）； Ｓｔｏｋｅｓ， （１９４０）Ｗ． Ａｒｃｈ Ｏｐｈｔｈａｌｍ
ｏｌ ２４：８８５−９０９；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎ， Ｌ． ａｎｄ Ａ． Ｐ
ｏｓｎｅｒ，（１９５５） Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．；４０：６８１
−６８５；Ｂｅｃｋｅｒ， Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，（１９６０） Ａｍ．Ｊ．Ｏ
ｐｈｔｈａｌｍｏｌ．５０：５５７−５６７；Ｆｒａｎｃｏｉｓ，Ｊ．，ｅｔ．
ａｌ．，（１９６６）Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．；６２：１０６７−１
０７１；Ａｒｍａｌｙ，Ｍ．Ｆ．（１９６７） Ａｒｃｈ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏ
ｌ；７８：３５−４３；Ｄａｖｉｅｓ， Ｔ．Ｇ．．（１９６８）Ｂｒ．Ｊ．Ｏ
ｐｈｔｈａｌｍｏｌ．：５２：３１−３９；Ｊａｙ，Ｂ．，Ｐａｔｅｒｓｏｎ，
Ｇ．（１９７０）Ｔｒａｎｓ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｓｏｃ．Ｕ．Ｋ．；９
０：１６１−１７１；Ｐａｔｅｒｓｏｎ， Ｇ．（１９７０） Ｔｒａｎｓ．Ｏ
ｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｓｏｃ．Ｕ．Ｋ．；９０：５１５−５２５；Ｍｉｌｌｅｒ
， Ｓ．Ｊ．Ｈ．（１９７８）Ｔｒａｎｓ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｓｏｃ．Ｕ
．Ｋ．９８：２９０−２９２）、これは分子レベルで病気の病理生理学メカニズ
ムを調べるのに遺伝的方法を用いることを可能にする。一次解放角緑内障の３つ
の遺伝的に区別されるタイプを引き起こす遺伝子の染色体位置が同定されている
。（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ， Ｖ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ４：４７−５０；Ｓｕｎｄｅｎ， Ｓ．Ｌ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．
（１９６６）６：８６２−８６９；Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．
．（１９９４）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．：５４：６２−７０；Ｗｉｇｇ
ｓ， Ｊ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ；２１：２９９−
３０３；Ｓｔｏｉｌｏｖａ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．．（１９９６）Ｇｅｎｏｍｉｃ
ｓ ３６：１４２−１５０；Ｗｉｒｔｚ， Ｍ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．．（１９９
７）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６０：２９６−３０４）。

【０００４】 緑内障に関与する遺伝子（野生型または突然変異体）を変調し（作用しまたは
拮抗する）治療剤は緑内障の予防および治療に有用であろう。加えて、緑内障の
発病の存在または病気素因に関連する遺伝子中での突然変異の検出は有用な診断
剤を提供し得る。

【０００５】 ２．発明の概要 １つの態様において、本発明は単離されたＧＬＣ１Ａ核酸分子をその要旨とす
る。開示された分子は非−コーディングであり得る（例えば、プローブ、アンチ
センスまたはリボザイム分子）か、あるいは機能的ポリペプチド（例えば、アゴ
ニストまたはアンタゴニストいずれかとして作用することによって、ミオシリン
ポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を特異的に変調するポリペプチド）を
コードすることができる。

【０００６】 さらなる具体例において、該核酸分子は、配列番号７または９として示された
核酸またはその相補体に対して配列において少なくとも７０％、好ましくは８０
％、より好ましくは８５％、なおより好ましくは少なくとも９５％相同であるＧ
ＬＣ１Ａ核酸である。もう１つの具体例において、該核酸は配列番号８または１
０に示されたポリペプチドに対して配列において少なくとも９２％、より好まし
くは少なくとも９５％同様であるポリペプチドをコードする。

【０００７】 また、本発明は配列番号１、２、３、４、５または６に記載された配列の少な
くとも約６つの連続ヌクレオチドまたは配列番号１、２、３、４、５または６に
記載された配列の相補体あるいはその天然に生じる突然変異体にハイブリダイズ
するヌクレオチド配列の領域に対応する実質的に精製されたオリゴヌクレオチド
を含むプローブおよびプライマーを提供する。好ましい具体例において、プロー
ブ／プライマーはさらに検出され得るそれに結合した標識基を含む。

【０００８】 発現のためには、主題のＧＬＣ１Ａ核酸は転写調節配列、例えば、転写プロモ
ーター（例えば、構成的発現または誘導性発現用）または転写エンハンサーまた
はサプレッサー配列のうちの少なくとも１つを含むことができ、その調節配列は
ＧＬＣ１Ａ遺伝子配列に作動可能に連結している。ＧＬＣ１Ａ核酸分子と組み合
わせたかかる調節配列は遺伝子発現のための有用なベクターを提供できる。また
、本発明は、該発現ベクターを使用することによってＧＬＣ１Ａ蛋白質を生産す
るための原核生物または真核生物およびイン・ビトロ（例えば、細胞培養）およ
びイン・ビボ（トランスジェニック）方法であるかを問わず該発現ベクターでト
ランスフェクトされた宿主細胞を記載する。

【０００９】 １つの態様において、本発明は、単離されたミオシリンポリペプチド、好まし
くは例えば、血漿精製または組換え生産ミオシリンペプチドの実質的に純粋な調
製物をその要旨とする。１つの具体例において、該ポリペプチドは配列番号８ま
たは１０に表されたミオシリン蛋白質と同一または類似である。また、脊椎動物
の関連メンバー、特に哺乳動物ミオシリンファミリーの本発明の範囲内のもので
ある。好ましくは、ミオシリンポリペプチドは、配列番号８または１０で表され
たポリペプチドに対して少なくとも約９２％相同、好ましくは少なくとも約９５
％、９６％、９７％、９８％または９９％相同であるアミノ酸配列を有する。好
ましい具体例において、ミオシリンポリペプチドは、配列番号７または９の１つ
において表された核酸配列にハイブリダイズする核酸によってコードされる。主
題のミオシリン蛋白質は、例えば、修飾部位（チロシン、スレオニン、セリンま
たはアスパラギン残基）、を改変する、または蛋白質のグリコシル化を妨げる、
またはシグナル変換に関与する細胞内蛋白質と該蛋白質の相互作用を妨げる突然
変異による、翻訳後修飾に抵抗性である修飾された蛋白質を含む。

【００１０】 ミオシリンポリペプチドは配列番号８または１０に表されるごとき全長蛋白質
を含むことができ、あるいはそれは１以上の特定のモチーフ／ドメイン、または
任意のサイズに対応する断片、例えば、長さが少なくとも５、１０、２５、５０
、１００、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５
、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４６０、４７０、４７５、４８０
、４８５、または４９０アミノ酸を含むことができる。

【００１１】 本発明のもう１つの態様はミオシリン蛋白質を含むキメラ分子（例えば、融合
蛋白質）をその要旨とする。例えば、ミオシリン蛋白質は、第２のポリペプチド
部分、（例えば、ミオシリンポリペプチドに対して関連のない異種の）アミノ酸
配列を有する第２のポリペプチド（例えば、第２のポリペプチド部分はグルタチ
オンーＳ−トランスフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼまたはエピトープタ
ブのごとき酵素活性である）を含む組換え融合蛋白質として提供できる。

【００１２】 本発明のなおもう１つの態様は、免疫原性調製物中のミオシリンポリペプチド
を含む免疫原に関し、該免疫原はミオシリンポリペプチドに特異的な免疫応答、
例えば、体液性応答、抗体応答および／または細胞応答を誘導することができる
。好ましい具体例において、免疫原は配列番号８または１０で表される蛋白質か
らの抗原決定基、例えば、ユニーク決定基を含む。

【００１３】 本発明のなおさらなる態様はミオシリン蛋白質のエピトープと特異的に反応性
である抗体および抗体調製物をその要旨とする。好ましい具体例において、該抗
体は配列番号８または１０で表される少なくとも１つのエピトープに特異的に結
合する。

【００１４】 また、本発明は、ここに記載されたＧＬＣ１Ａ遺伝子の異種形態を含み（好ま
しくは、これを発現する）、あるいは内因性ＧＬＣ１Ａ遺伝子を誤発現する（例
えば、主題のＧＬＣ１Ａ蛋白質の１以上の発現が破壊される動物）トランスジェ
ニック非−ヒト動物をその要旨とする。かかるトランスジェニック動物は、突然
変異したまたは誤発現されたＧＬＣ１Ａ対立遺伝子を含む細胞および組織障害を
研究するための、または薬物スクリーニングで使用するための動物モデルとして
供することができる。別法として、かかるトランスジェニック動物は組換えミオ
シリンペプチドを発現するのに有用であり得る。

【００１５】 さらにもう１つの態様において、本発明は、ミオシリン蛋白質および、例えば
、ウイルス、ミオシリン蛋白質の細胞外リガンド、またはミオシリン蛋白質に結
合する細胞内蛋白質の間の相互作用の阻害剤、あるいはポテンシエーターを同定
するためのテスト化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。

【００１６】 本発明のさらなる態様は、対象が緑内障または突然変異体ＧＬＣ１Ａ遺伝子に
由来するもう１つの障害の危険があるかを決定する方法を提供する。該方法は、
対象の組織において、（ｉ）ミオシリン蛋白質をコードする遺伝子の突然変異（
例えば、配列番号７または９の１つで表された遺伝子、または例えば配列番号１
−６で表されたＧＬＣ１Ａイントロン配列の突然変異）；または（ｉｉ）ＧＬＣ
１Ａ遺伝子の誤発現のうちの少なくとも１つによって特徴付けられる遺伝的病巣
の存在または不存在を検出することを含む。好ましい具体例において、遺伝的病
巣の検出は：ＧＬＣ１Ａ遺伝子からの１以上のヌクレオチドの欠失；遺伝子への
１以上のヌクレオチドの付加、遺伝子の１以上のヌクレオチドの置換、遺伝子の
グロス染色体再配置；（例えば、プロモーター突然変異による）遺伝子のメッセ
ンジャーＲＮＡ転写体のレベルの改変；遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写体の
非−野生型スプライシングパターンの存在；および／または可溶性ミオシリン蛋
白質の異常レベルのうちの少なくとも１つの存在を確認することを含む。

【００１７】 例えば、遺伝的病巣の検出は、（Ｉ）ＧＬＣ１Ａ遺伝子のセンスもしくはアン
チセンス配列またはその天然に生じる突然変異体、またはＧＬＣ１Ａと天然で会
合したイントロンフランキング配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを
含むプローブ／プライマーを提供すること；（ｉｉ）該プローブ／プライマーを
適当な核酸含有試料と接触させること；および（ｉｉｉ）該プローブ／プロイマ
ーを核酸にハイブリダイズさせることによって、遺伝子病巣の存在または不存在
を検出することを含むことができ、例えば、ここに、病巣の検出は、該プローブ
／プライマーを利用してＧＬＣ１Ａ遺伝子および、所望により、フランキング核
酸配列のヌクレオチド配列を決定することを含む。例えば、ポリメラーゼ鎖反応
（ＰＣＲ）でまたは連結鎖反応（ＬＣＲ）でプライマーを使用することができる
。別の具体例において、ミオシリン蛋白質と特異的に免疫反応性である抗体を用
いるイムノアッセイでＧＬＣ１Ａ蛋白質のレベルが検出される。

【００１８】 本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な記載および請求の範囲から明らか
であろう。

【００１９】 ３． 図面の簡単な説明 図１〜９はヒトおよびマウスＧＬＣｌＡ遺伝子配列の整列である。ヒトおよび
マウスＧＬＣｌＡ遺伝子の３つのエクソンおよびフランキング配列が図１〜５、
６および７〜９で整列されている。これらの配列は連続的ではない。エクソン配
列は大文字で報告し、他方、フランキング配列は下方の場合の文字である。マウ
スおよびヒトの間で保存されたヌクレオチドは閉じた丸によって示される。図１
〜５において、エクソン１およびフランキングプロモーターおよびイントロン１
配列が示される。推定プロモーターおよびエンハンサーエレメントのサブセット
は下線を施し、標識する。ＧＲＥ半分部位は「ＧＲ」によつて示される。ヒトＧ
ＬＣｌＡ遺伝子の５’フランキング領域における（ＣＡ）リピート多形もまた下
線を施し、「（ＣＡ）リピート多形」と標識する。図６には、エクソン２および
フランキングイントロン１およびイントロン２配列が示される。図７〜９には、
エクソン３およびフランキングイントロン２および下流配列が示される。ポリア
デニル化シグナル配列は下線を施し、「ポリ−Ａ」と標識する。ヒトＧＬＣｌＡ
遺伝子の下流の（ＣＡ）リピート多形もまた下線を施し、「（ＣＡ）リピート多
形」と標識される。

【００２０】 図１０はヒトおよびマウス・ミオシリン蛋白質の間で保存された推定モチーフ
の模式的表示である。

【００２１】 図１１はマウスおよびヒトＧＬＣｌＡ遺伝子によって予測された蛋白質の整列
である。マウスおよびヒトの間で保存されたアミノ酸は閉じた丸によって示され
る。ヒトＧＬＣｌＡ遺伝子で従前に同定された病気を引き起こす突然変異の位置
が同定される。各ミスセンス突然変異については、突然変異体残基が野生型アミ
ノ酸の上方に直接的に示される。ナンセンス突然変異の位置は「１」によって示
され、挿入突然変異の位置は「２」によって示される。

【００２２】 ４． 発明の詳細な記載 ４．１．一般法 ここに報告するごとく、ＪＯＡＧに関連する遺伝子座は遺伝子連鎖分析によっ
て染色体１ｑ２１−ｑ３１で同定された。２つの大きなＪＯＡＧ家系における緑
内障表現型および高度に多形の遺伝子マーカーの間の観察された組換えは、ＧＬ
Ｃ１Ａ遺伝子を含有する感覚が、マーカーＤ１Ｓ３６６５およびＤ１Ｓ３６６４
の間の染色体１ｑの３ｃＭ領域まで狭まることを可能とした。マーカーハプロタ
イプのさらなる評価は、緑内障家族の３つの対の各々が同一の８連続マーカーの
対立遺伝子を共有することを明らかとし、これは、ＧＬＣ１Ａ遺伝子がＤ１Ｓ１
６１９およびＤ１Ｓ３６６４によって規定されるより狭い間隔内にあることを示
唆する。

【００２３】 染色体１のＧＬＣ１Ａ領域にマッピングされるいくつかの遺伝子は病気原因遺
伝子の候補であると考えられた。３つの遺伝子（ＬＡＭＣ１（Ｈ．Ｃ．Ｗａｔｋ
ｉｎｓら、（１９９３）Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． ２：１０８４）、
ＮＰＲＩ（Ｄ．Ｇ． Ｌｏｗｅら、（１９９０）Ｇｅｎｏｍｉｃ ８：３０４）
およびＣＮＲ２、（Ｓ．Ｍｕｎｒｏら、（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６５：６
１）が、遺伝子内多形マーカーを用いる遺伝子連鎖分析によって候補領域から排
除された。５つのさらなる候補遺伝子はＹＡＣ ＳＴＳ含有量マッピングによっ
て観察された組換え間隔内に判断された：セレクチンＥ（Ｍ．Ｐ．Ｂｅｖｉｌａ
ｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３：１１６０）（Ｇ
ｅｎＢａｎｋ 受託番号Ｍ２４７３６）；セレクチンＬ（Ｔ．Ｆ．Ｔｅｄｄｅｒ
ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７０：１２３（ＧｅｎＢ
ａｎｋ 受託番号Ｍ２５２８０）；ＴＸＧＰ−１（Ｓ．Ｍｉｕｒａ ｅｔ ａｌ
．，（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１：１３１３）（ＧｅｎＢａ
ｎｋ 受託番号ＭＤ９０２２４）；ＡＰＴ１ＬＧ１（Ｔ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ
ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，１５６７）；および
ＴＩＧＲ（Ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ Ｉｎｄｕｃｅ Ｇｌｕｃ
ｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｊ．Ｒ．Ｐｏｌ
ａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅ
ｓ １２：１１３；Ｊ．Ｅｓｃｒｉｂａｎｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：９２１；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ９６／１４４
１１）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｒ９５４９１，Ｒ９５４４７， Ｒ９５４４３
，Ｒ４７２０９）。しかしながら、これらの遺伝子（セレクチンＥおよびセレク
チンＬ）の２つはこのアプローチでは共有されたハプロタイプ間隔の外側にある
ことが判明した。残りの遺伝子（ＡＰＴ１ＬＧ１、ＴＸＧＰ−１およびＴＩＧＲ
）はＹＡＣ ＳＴＳ含有量および照射ハイブリッドマッピング双方によって最も
狭いＪＯＡＧ間隔内にマップされることが判明した。

【００２４】 これらの遺伝子（ＡＰＴ１ＬＧ１およびＴＩＧＲ）の２つをＪＯＡＧを持つ家
族における突然変異につきスクリーニングした。プライマーを利用可能な配列か
ら選択し（Ｔ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｉｎｔ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．６，１５６７，Ｊ．Ｅｓｃｒｉｂａｎｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９
５）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：９２１；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａ
ｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ９６
／１４４１１）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｒ９５４９１， Ｒ９５４４７，Ｒ９
５４４３， Ｒ４７２０９）、一本鎖立体配座家系分析（Ｂ．Ｊ． Ｂａｓｓａ
ｍら、（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９６：８０）および直接ＤＮ
Ａ配列決定によって重複するＰＣＲ増幅産物を評価したＡＰＴ１ＬＧ１およびＴ
ＩＧＲ遺伝子の完全なｃＤＮＡ配列は公表されているが介在する配列の存在は、
それらのコーディング配列の８５−９０％のみがゲノムＤＮＡでスクリーニング
できることを可能とした。８人の関連しないＪＯＡＧ患者をＡＰＴ１ＬＧ１アッ
セイでスクリーニングしたが配列変異体は同定されなかった。

【００２５】 ＴＩＧＲ遺伝子アッセイをまず用いて、４つの異なる１ｑ−連結緑内障家族の
罹ったメンバー、およびハプロタイプデータによって意味された４つのより小さ
い家族の罹ったメンバーをスクリーニングした。８つの家族のうちの４つでアミ
ノ酸改変突然変異が検出された。コドン４３７におけるチロシンからヒスチジン
への突然変異が、１ｑの連鎖した元の家族（Ｖ．Ｃ．Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄら，
（１９９３） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．４．４７）の全ての２２人の罹った
メンバーで検出された。コドン３６４におけるグリシンからバリンへの突然変異
が、１５人の罹患メンバーを持つ１つの事前に報告されていない成人−開始解放
角緑内障を含めた２つの家族で検出された。コドン３６８におけるナンセンス突
然変異（グルタミンから停止）が２つの家族で検出された。後者の突然変異は遺
伝子産物の切形をもたらすことが予測されるであろう。

【００２６】 次いで、４つの異なる集団：該病気の家族履歴を持つ緑内障患者；単一クリニ
ックで見られた未選択一次解放角緑内障発端者；一般的集団（遺伝した網膜病を
持つ患者および先行連鎖研究に参画した家族からの配偶者によって近似）；およ
び正常な眼内圧力および緑内障の個人的または家族的履歴を持たない４０歳を超
える未関連ボランティアをスクリーニングすることによって、これらの３つの変
化を有する２つのＰＣＲアンプリマーにおける突然変異の有病率を評価した。Ｓ
ＳＣＰによって配列変異を含有すると判断されたＰＣＲ産物を配列決定し、未罹
患個体から生じた配列および各罹患個体における正常染色体と比較した。総じて
、ミスセンスまたはナンセンス突然変異が未関連緑内障患者の３−５％で、およ
び対照の０．２％で見いだされた。カイ二乗検定はこの差異が有意であることを
明らかとした（ｐ＜０．００１）。

【００２７】 引き続いての研究において、ＳＳＣＰスクリーニング、続いての１３１２の未
関連個体からのＤＮＡの配列決定は合計３３の配列変化を明らかとした。１ｑ−
連鎖緑内障を持つが、ＳＳＣＰシフトのない３つの家族の発端者からの増幅され
た全ＧＬＣ１Ａコーディング配列の配列決定は、３つのさらなる配列変化を明ら
かとした。これらの３６の変異のうちの１６（表１）は、「恐らく」病気を引き
起こす突然変異についての以下の基準に適合した：１）１以上の緑内障患者にお
ける存在；２）予測されたアミノ酸配列の改変；３）一般的集団の１％未満にお
ける存在；４）９１正常ボランティアにおける不存在。これらの１６の突然変異
は７１６人の緑内障発端者のうち３４人で見いだされた（４．７％）。１０の配
列変化はＧＬＣ１Ａの予測されたアミノ酸配列を改変せず、従って、非病気原因
多形であるようである（表３）。９つの配列変化はＧＬＣ１Ａの予測されたアミ
ノ酸配列（８）または５’フランキング領域（１）を改変したが、以下の理由の
うちの１つで非病気原因多形であるようであると判断された（表２）；それらは
一般的集団の１％を超えて存在した（３）、それらは正常または一般的集団での
み見いだされた（５）、またはそれらはよりあるらしい病気原因突然変異のよう
に同一対立遺伝子で見いだされた（１）。

【００２８】

【表１】

【表２】

【表３】 ヒトＧＬＣ１Ａ遺伝子およびそのマウスオルソログを含有する細菌人工染色体
（ＢＡＣ）をサブクローンし、配列決定して、遺伝子のゲノム構造を明らかとし
た。ヒトおよびマウスＧＬＣ１Ａ遺伝子は共に３つのエクソンよりなる。エクソ
ン１の５’プロモーター領域、塩基対１−１９０５；エクソン１、塩基対１９０
６−２５０９；およびイントロン１の５’末端、塩基対２５１０−２８００を含
めた）ヒトエクソン１を配列番号１として記載する。（イントロン１の３’末端
、塩基対１−１９３；エクソン２、塩基対１９４−３１９；およびイントロン２
の５’末端、塩基対３２０−６８０を含めた）ヒトエクソン２を配列番号２とし
て記載する。（イントロン２の３’末端、塩基対１−４２７；エクソン３、塩基
対４２８−１２１２；および３’ＵＴＲ、塩基対１２１３−２０００を含めた）
ヒトエクソン３を配列番号３として記載する。（エクソン１の５’プロモーター
領域；塩基対１−１９４７；エクソン１、塩基対１９４８−２５０９；およびイ
ントロン１の５’末端、塩基対２５１０−２８００を含めた）マウスエクソン１
を配列番号４として記載する。（イントロン１の３’末端、塩基対１−１９３；
エクソン２、塩基対１９４−３１９；およびイントロン２の５’末端、塩基対３
２０−６８０を含めた）マウスエクソン２を配列番号５として記載し、（イント
ロン２の３’末端、塩基対１−４２７；エクソン３、塩基対４２８−１２１２お
よび３’ＵＴＲ、塩基対１２１３−１４５６を含めた）マウスエクソン３を配列
番号６として記載する。エクソンの２および３は両遺伝子において１２６塩基対
および７８２塩基対長であり、他方、エクソン１はヒト遺伝子では６０４塩基対
であり、マウス遺伝子では５６２塩基対である。エクソン−イントロン境界はマ
ウスおよびヒトの間で完全に保存されている。ヒトコーディングＧＬＣ１Ａヌク
レオチド配列は１５１２ヌクレオチド（配列番号：７）よりなり、約５７ｋＤａ
の分子量を有する５０４アミノ酸ミオシリン蛋白質（配列番号８）をコードする
。マウスコーディングＧＬＣ１Ａヌクレオチド配列は１４７０ヌクレオチド（配
列番号９）よりなり、約５５ｋＤａの分子量を有する４９０アミノ酸ミオシリン
蛋白質（配列番号１０）をコードする。ヒトおよびマウスコーディング配列はヌ
クレオチドレベルで８３％同一であり、アミノ酸レベルで８２％同一である蛋白
質を予測する。

【００２９】 多くの推定転写調節配列はＧＬＣ１Ａ遺伝子の上流領域で同定された（表４）
。３つのポリアデニル化部位は位置１７１４、１８６４および２００６塩基対の
ヒト遺伝子の３’ＵＴＲに位置し、続いて推定開始コドンがある。加えて、ヒト
ＧＬＣ１Ａ遺伝子は、家族内の遺伝子の分離を追跡するための有用な遺伝子マー
カーでることが判明した２つのＣＡ単純タンデム反復多形（ＳＴＲＰｓ）によっ
て密接に近接される。

【００３０】

【表４】 ヒトＧＬＣ１Ａ遺伝子は４つのフランキング遺伝子（ＳＥＬＬ、ＳＥＬＥ、Ｇ
ＬＣ１Ａ、ＡＰＴ１ＬＧ１、ＡＴ３）の間の染色体１物理的地図に置かれた。こ
れらのフランキング遺伝子のマウス同族体はマウス染色体１上に同一順序で存在
し、これは、マウスＧＬＣ１Ａ遺伝子がＳＥＬＥおよびＡＰＴ１ＬＧ１のマウス
同族体の間のこのシンテニー領域に存在することを示唆する。

【００３１】 ヒトＧＬＣ１Ａの発現は成人組織からのＲＮＡのノーザンブロット分析によっ
て調べた。２．３ｋｂ ｍＲＮＡの高レベル発現が心臓、骨格筋、胃、甲状腺、
気管、骨髄、胸腺、前立腺、小腸および結腸を含めた広範囲な組織で見いだされ
た。豊富ではないＧＬＣ１Ａ発現が肺、膵臓、睾丸、卵巣、脊髄、リンパ節およ
び副腎で観察された。ＧＬＣ１Ａ転写体は脳、胎盤、肝臓、腎臓、脾臓または白
血球では検出されなかった。同様の発現パターンがマウスで観察された。脳のあ
る領域が、全脳組織のポリ−Ａ選択ｍＲＮＡで表される可能性をテストするため
に、脳のいくつかの異なる領域からのＲＮＡで調製されたノーザンブロットを、
ＧＬＣ１Ａプローブを用いてハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは
脊髄で観察されたが、小脳、大脳皮質、髄質、後頭葉、前頭葉、側頭葉、または
被殻では観察されなかった。

【００３２】 図１０はヒトおよびマウスＧＬＣ１Ａ蛋白質双方において存在する蛋白質モチ
ーフを示す。ＧＬＣ１Ａ核酸配列およびコードされたミオシリンアミノ酸配列は
共にＮ−末端領域において非筋肉ミオシンと、およびＣ−末端領域においてオル
ファクトメディンに対する相同性を示す。加えて、ヒトおよびマウスＧＬＣ１Ａ
蛋白質は共に（アミノ酸７１−１５２にわたる）ミオシン−様ドメインにおける
カイネクチンおよび他の細胞骨格蛋白質で観察されるものと同様のロイシンジッ
パードメインを含有する。このモチーフは、アミノ酸７１−８５および１０３−
１５２にわたる２つのサブ領域よりなり、ここに、ロイシン残基は各７の位置で
３ないし８回出現する。ヒトおよびマウスＧＬＣ１Ａ核酸は１０個の推定リン酸
化部位および４つの推定グリコシル化部位を含む。これらの機能的ドメインに加
えて、疎水性領域がミオシリン蛋白質のＮ−末端に出現し、１８位のアラニン残
基が可能な切断部位であり得る単一ペプチドに似た配列を含む。

【００３３】 さらなる分析は、アミノ酸１７−３７および４２６−４４の間の疎水性領域を
明らかとする。しかしながら、これらのドメインの疎水性の長さおよび程度は、
それらが膜にわたらないことを示唆する。ヒトＧＬＣ１Ａ蛋白質のカルボキシ−
末端３アミノ酸はセリン、リシンおよびメチオニンである。この配列は他の蛋白
質においてはペルオキシソーム標的化配列として機能することが示されている（
Ｓｕｂｒａｍａｎｉ， Ｓ （１９９３） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． ｏｆ Ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏ． ９：４４５−４７８）。しかしながら、かかる推定標的化配列は
マウス蛋白質では存在しない。ヒトＧＬＣ１Ａ蛋白質のウェスタンブロット分析
は５７および５９ｋＤにおけるバンドを明らかとし、予測される蛋白質サイズを
確認し、蛋白質がグリコシル化され得るという証拠を提供する。これらの知見は
、ミオシリンが、光受容体細胞のごとき神経上皮の発育に関与する新規細胞骨格
蛋白質であることを示唆する。

【００３４】 図１１はマウスおよびヒトＧＬＣ１Ａ遺伝子についての予測されるアミノ酸配
列の併置を示し、マウスおよびヒトＧＬＣ１Ａ蛋白質配列に関して１６の突然変
異の位置を示す。これらの突然変異のうちの１４は、単一アミノ酸置換の結果と
なるミスセンス突然変異である。これらのうち１２は、ヒトおよびマウスの間で
保存されたアミノ酸で起こり、他方、２つは保存されていないアミノ酸で起こる
。２つの残りの突然変異は２つの保存されたアミノ酸を破壊する挿入およびＧＬ
Ｃ１Ａ蛋白質の末端１３６アミノ酸の切形および１２１の保存残基の喪失の結果
となるナンセンス突然変異を含む。かくして、マウスおよびヒトの間で保存され
たアミノ酸で見いだされる病気原因突然変異のパーセンテージ（８８％）は総じ
ての蛋白質保存交差種とは有意に異ならない（８２％）。

【００３５】 重要なことには、ＧＬＣ１Ａ核酸配列は国際出願ＷＯ ９６／１４４１１に報
告されたＴＩＧＲ遺伝子配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号Ｒ９５４９１、Ｒ９５
４４７、Ｒ９５４４３およびＲ９４７２０９）とは実質的に異なる。事実、報告
されているごとく、ＴＩＧＲ遺伝子配列は機能的蛋白質をコードしない。

【００３６】 ここに開示されたＧＬＣ１Ａ遺伝子、およびＴＩＧＲ遺伝子の間の差異の要約
は表５に提示される。

【００３７】

【表５】 ＴＩＧＲ ＧＬＣ１Ａ配列における前記９つのエラーの結果、４２の正しくな
いアミノ酸予測を引き起こす４５ヌクレオチド差異となる。従って、ヒトＴＩＧ
Ｒアミノ酸配列はヒト・ミオシリン蛋白質配列と約９１．６７％同一であるに過
ぎず、ヒトＴＩＧＲ遺伝子配列はヒトＧＬＣ１Ａ配列と約９７％同一であるに過
ぎない。

【００３８】 この病気遺伝子の同定は、緑内障の病理生理学の理解を増加させ、これは今度
は機能的または突然変異体ＴＩＧＲ遺伝子または蛋白質の生物活性を変調する（
例えば、作動し、または拮抗する）分子を同定するためのアッセイの開発を促進
する。治療的有効量のこれらの分子を、緑内障を持つまたは緑内障を発症する危
険性のある対象に投与して疾患を予防しまたはその重症度を軽減することができ
る。

【００３９】 加えて、ここに記載されたごとく、各ＧＬＣ１Ａ配列変異体の病気原因性質お
よび関連浸透度および開始の年齢の確立は臨床家が特定の配列変化を保有する患
者に緑内障を発症する危険性に関する有用な情報を供することを可能とする。

【００４０】 ４．２定義 便宜のために、明細書、実施例および添付の請求の範囲で使用されるある種の
用語およびフレーズの意味を以下に供する。

【００４１】 本明細書で用いる用語「アゴニスト」は、野生型または突然変異体ミオシリン
生物活性を直接的または間接的に高め、補強しまたは増強する剤（例えば、ミオ
シリン治療剤）をいうことを意味する。

【００４２】 本明細書で用いる用語「アンタゴニスト」は、野生型または突然変異体ミオシ
リン生物活性を直接的または間接的妨げ、最小化しまたは抑制する剤（例えば、
ミオシリン治療剤）をいうことを意味する。

【００４３】 「細胞」、「宿主細胞」または「組換え宿主細胞」は、ここでは相互交換的に
使用される用語である。かかる用語は特定の対象をいうのみならず子孫またはか
かる細胞の子孫をいうと理解される。ある修飾は、突然変異または環境影響によ
り続いての世代で起こり得るのであり、かかる子孫は、事実、親細胞と同一であ
るが、依然としてここに使用される用語の範囲に含まれる。

【００４４】 「キメラ蛋白質」または「融合蛋白質」は、対象ポリペプチドの１つをコード
する第１のアミノ酸と蛋白質の１つのいずれかのドメインに対して外来性のまた
はそれと実質的に相同ではないドメイン（例えば、ポリペプチド部分）を規定す
る第２のアミノ酸配列との融合である。キメラ蛋白質は第１の蛋白質も発現する
生物で（異なる蛋白質であるにも拘わらず）見いだされる外来性ドメインを表す
ことができ、あるいは異なる種類の生物によって発現された蛋白質構造の「種間
」、「属間」等融合であり得る。一般に、融合蛋白質は一般式Ｘ−ミオシリン−
Ｙ（ここに、ミオシリンはミオシリン蛋白質の１つから誘導される蛋白質の少な
くとも一部を表し、ＸおよびＹは独立して存在しないか、または生物におけるミ
オシリン配列の１つに関連しないアミノ酸配列を表す）によって表すことができ
、天然に生じる突然変異体を含む。

【００４５】 本明細書で用いる「相補的」配列は、ハイブリダイズできるように十分な相補
性を有して、安定なデュプレックスを形成する配列をいう。

【００４６】 「送達複合体」は、標的手段（例えば、遺伝子、蛋白質、ポリペプチドまたは
ペプチドの標的細胞表面へのより高い親和性の結合および／または標的細胞によ
る増大した細胞摂取となる分子）を意味する。標的手段の例はステロール（例え
ば、コレステロール）、脂質（例えば、カチオン性脂質、ビロソームまたはリポ
ソーム）、ウイルス（例えば、アデノウイルス、アデノ−関連ウイルス、および
レトロウイルス）または標的細胞特異的結合剤（例えば、標的細胞特異的受容体
によって認識されるリガンド）を含む。好ましい複合体は標的細胞による内部化
に先立って有意な非カップリングをイン・ビボで妨げるのに十分に安定である。
しかしながら、該複合体は、遺伝子、蛋白質、ポリペプチドまたはペプチドが機
能的形態で放出されるように、細胞内で適当な条件下で切断可能である。

【００４７】 よく知られているように、特定のポリペプチドのための遺伝子は個体のゲノム
内に単一または複数コピーで存在し得る。かかる複製遺伝子は同一であり得るか
、あるいはヌクレオチド置換、付加または欠失を含めたある種の修飾を有するこ
とができ、これは全て実質的に同一活性を有するポリペプチドにつき依然として
コードする。かくして、用語「ミオシリンポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
」は特定の個体内の１以上の遺伝子をいうことができる。さらに、ヌクレオチド
配列中のある種の差異が個々の生物間で存在することができ、これは対立遺伝子
と呼ばれる。かかる対立遺伝子差異の結果、コードされたポリペプチドのアミノ
酸配列の差異となり得るかまたはなり得ず、同一の生物学的活性を持つ蛋白質を
依然としてコードする。

【００４８】 本明細書で用いるごとく、用語「遺伝子」または「組換え遺伝子」とは、エク
ソンおよび（所望により）イントロン配列双方を含めた、本発明のポリペプチド
の１つをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子をいう。「組
換え遺伝子」とは、ミオシリンポリペプチドをコードし、ＧＬＣ１Ａ−コーディ
ングエクソン配列を含む核酸をいうが、それは所望により染色体ＧＬＣ１Ａ遺伝
子から、または非関連染色体遺伝子から由来するイントロン配列を含むことがで
きる。主題のミオシリンポリペプチドをコードする例示的組換え遺伝子は配列番
号７および９に表される。用語「イントロン」とは、蛋白質には翻訳されず、一
般にエクソン間に見いだされる所与のＧＬＣ１Ａ遺伝子に存在するＤＮＡ配列を
いう。

【００４９】 「相同性」または「同一性」とは、２つのペプチド間または２つの核酸分子間
の配列同様性をいう。相同性は比較目的で整列させることができる各配列中の位
置を比較することによって決定することができる。比較された配列中の位置が同
一塩基またはアミノ酸によって占められていると、該分子はその位置において相
同である。配列間の相同性の程度は配列によって共有されたマッチングするまた
は相同位置の数の関数である。「未関連」または「非−相同」配列は、本発明の
ＧＬＣ１Ａ配列の一つと４０％未満の、しかし好ましくは２５％未満の同一性を
有する。

【００５０】 本明細書で用いられる用語「相互作用する」とは、例えば、酵母２ハイブリッ
ドアッセイを用いて検出できるごとく、分子間の検出可能な相互作用を含むこと
を意味する。用語相互作用する、は分子間の「結合する」相互作用を含むことも
意味する。相互作用は、例えば、天然における蛋白質−蛋白質または蛋白質−核
酸であってもよい。

【００５１】 ＤＮＡまたはＲＮＡのごとき核酸に関連して本明細書で使用される用語「単離
された」は、マクロ分子の天然源に存在する、各々、他のＤＮＡまたはＲＮＡか
ら分離された分子をいう。例えば、主題のＧＬＣ１Ａポリペプチドの１つをコー
ドする単離された核酸は、好ましくは、ゲノムＤＮＡにおいて天然ではＧＬＣ１
Ａ遺伝子に直ちにフランクする１０キロベース（ｋｂ）以下の核酸配列、より好
ましくは５ｋｂ以下のかかる天然に生じるフランキング配列、最も好ましくは１
．５ｋｂ以下のかかる天然に生じるフランキング配列を含む。本明細書で用いら
れる用語単離された、は組換えＤＮＡ技術によって生産された場合は細胞物質、
ウイルス物質または培養培地が、化学的に合成された場合は前駆体、または他の
化学物質を実質的に含まない核酸またはペプチドをいう。さらに、「単離された
核酸」は、断片として天然に生じず、天然状態で見いだすことができない核酸断
片を含むことを意味する。また、本明細書では用語「単離された」は、他の細胞
蛋白質から単離されたポリペプチドをいうのに使用され、精製されたおよび組換
えのポリペプチドを共に含むことを意味する。

【００５２】 本明細書で使用される用語「変調」とは、例えば、作動することによる上昇調
節（例えば、活性化または刺激）；およびミオシリン生物活性に拮抗することに
よる下降調節（例えば、阻害または抑制）を共に意味する。

【００５３】 「ミオシリン生物活性」、「生物学的活性」または「活性」とは、（天然また
は変性立体配座であるかを問わず）ミオシリンポリペプチドによって、あるいは
そのいずれかの配列によって直接的または間接的に行われる細胞骨格または抗原
性機能をいうことを意味する。細胞骨格機能は（例えば、光受容体を含む）繊毛
のある神経上皮の発達または構造に関与するプロセスを含む。抗原性機能は天然
に生じるまたは変性ミオシリンポリペプチドまたはその断片に対して生起した抗
体と交差反応できるエピトープまたは抗原性部位の保有を含む。

【００５４】 本発明の「非−ヒト動物」は齧歯類、非−ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシの
ごとき哺乳動物、ニワトリ、両生類、爬虫類等を含む。好ましい非−ヒト動物は
ラットおよびマウスを含めた齧歯類科から選択されるが、ツメガエル属のメンバ
ーのごときトランスジェニック両生類、およびトランスジェニックニワトリも例
えば胚発生および組織形成に影響し得る剤を理解し同定するための重要なツール
を提供することができる。用語「キメラ動物」は、ここでは、組換え遺伝子が見
いだされる、あるいは組換え遺伝子が動物のいくつかのしかし全てではない細胞
で発現される動物をいうように使用される。用語「組織−特異的キメラ動物」は
、組換えＧＬＣ１Ａ遺伝子の１つがいくつかの組織に存在しおよび／または発現
されまたは破壊されるが、他のものではそうではないことを示す。

【００５５】 本明細書で用いるごとく、用語「核酸」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）お
よび、適当には、リボ核酸（ＲＮＡ）のごときポリヌクレオチドをいう。該用語
は同等のものとしてヌクレオチドアナログから作成されたＲＮＡまたはＤＮＡの
アナログを含むことが理解され、所望の一本鎖（センスまたはアンチセンス）お
よび二本鎖ポリヌクレオチドである具体例に適用できる。

【００５６】 本明細書で使用されるごとく、用語「プロモーター」とは、当該プロモーター
に作動可能に連結した選択ＤＮＡ配列の発現を調節し、細胞において選択ＤＮＡ
配列の発現に影響するＤＮＡ配列を意味する。該用語は「組織特異的」プロモー
ター、すなわち、特異的細胞（例えば、特異的組織の細胞）においてのみ選択Ｄ
ＮＡ配列の発現に影響するプロモーターを含む。該用語は１つの組織で主として
選択ＤＮＡの発現を調節するが、他の組織では発現を引き起こすいわゆる「遺漏
」プロモーターもカバーする。また、該用語は非−組織特異的プロモーターおよ
び構成的に発現する、あるいは誘導性である（すなわち、発現レベルが制御する
ことができる）プロモーターを含む。

【００５７】 用語「蛋白質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、遺伝子産物をいう
場合には相互交換可能に使用される。

【００５８】 用語「組換え蛋白質」とは、組換えＤＮＡ技術によって生産された本発明のポ
リペプチドをいい、ここに、一般的にはミオシリンポリペプチドをコードするＤ
ＮＡが、宿主細胞を形質転換して異種蛋白質を生産するのに使用される適当な発
現ベクターに挿入される。さらに、組換えＧＬＣ１Ａ遺伝子に関してフレーズ「
に由来する」とは、天然ミオシリン蛋白質のアミノ酸配列、または蛋白質の天然
に生じる形態の（切形を含めた）置換および欠失を含めた突然変異によって創製
されるそれと同様のアミノ酸配列を有する蛋白質を「組換え蛋白質」の意味内に
含めることを意味する。

【００５９】 本明細書で用いる「小分子」とは、約５ｋＤ未満、最も好ましくは約４ｋＤ未
満の分子量を有する組成物をいうことを意味する。小分子は核酸、ペプチド、ポ
リペプチド、ペプチドミメティックス、炭水化物、脂質または他の有機炭素含有
または無機分子であり得る。化学的または生物学的（例えば、菌類、細菌または
藻類抽出物）混合物の広いライブラリーが、本発明のアッセイでのスクリーニン
グに入手可能である。

【００６０】 本明細書で用いるごとく、用語「特異的にハイブリダイズする」または「特異
的に検出する」は、配列番号７または９の１つに示されたＧＬＣ１Ａ配列、また
はそれに相補的な配列、またはその天然に生じる突然変異体のごとき脊椎動物、
好ましくはＧＬＣ１Ａ遺伝子の少なくともほぼ６、１２、２０、３０、５０、１
００、１５０、２００、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６
００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、
１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１
４００、１４５０、１４６０、１４７０、１４８０、１４９０連続ヌクレオチド
にハイブリダイズする本発明の核酸分子の能力をいい、従って、それは、それが
ここに定義する脊椎動物ＧＬＣ１Ａ蛋白質以外の蛋白質をコードする細胞核酸（
例えば、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）に対してそうするよりも少なくとも１０
倍多いハイブリダイゼーション、好ましくは少なくとも５０倍多いハイブリダイ
ゼーション、さらにより好ましくは少なくとも１００倍多いハイブリダイゼーシ
ョンを示す。

【００６１】 「転写調節配列」とは、それらが作動可能に連結した蛋白質コーディング配列
の転写を誘導または制御する開始シグナル、エンハンサー、およびプロモーター
のごときＤＮＡ配列をいうように、明細書を通じて使用される一般的用語である
。好ましい具体例において、組換えＧＬＣ１Ａ遺伝子の１つの転写は、発現が意
図される細胞型において組換え遺伝子の発現を制御するプロモーター配列（また
は他の転写調節配列）の制御下にある。また、組換え遺伝子は、ミオシリン蛋白
質の天然に生じる形態の転写を制御する配列と同一またはそれとは異なる転写調
節配列の制御下にあり得る。

【００６２】 本明細書で用いるごとく、用語「トランスフェクション」とは、核酸媒介遺伝
子導入による核酸、例えば、発現ベクターの受容体細胞への導入を意味する。本
明細書で用いるごとく、「形質転換」とは、外因性ＤＮＡまたはＲＮＡの細胞摂
取の結果として細胞の遺伝子型が変化するプロセスをいい、例えば、形質転換さ
れた細胞は哺乳動物ミオシリンポリペプチドの組換え形態を発現し、あるいは導
入された遺伝子からのアンチセンス発現の場合には、ミオシリン蛋白質の天然に
生じる形態の発現は破壊される。

【００６３】 本明細書で用いるごとく、用語「トランスジーン」とは、それが導入されるト
ランスジェニック動物または細胞に対して部分的にまたは全面的に異種である、
すなわち、外来性である、あるいはそれが導入されるトランスジェニック動物ま
たは細胞の内因性遺伝子に対して相同であるが、それが挿入される（例えば、天
然遺伝子のそれとは異なる、またはその挿入の結果、ノックアウトとなる位置に
それが挿入される）細胞のゲノムを改変するように動物ゲノムに挿入されるよう
に設計され、またはそのように導入される（例えば、哺乳動物ミオシリンポリペ
プチドの１つをコードする、またはそれに対するアンチセンス転写体をぶらさげ
る）核酸配列を意味する。トランスジーンは１以上の転写調節配列および選択さ
れた核酸の最適発現に必要であり得るイントロンのごときいずれかの他の核酸を
含むことができる。

【００６４】 「トランスジェニック動物」とは、いずれかの動物、好ましくは非−ヒト哺乳
動物、鳥類または両生類をいい、ここに、該動物の１以上の細胞は当該分野でよ
く知られたトランスジェニック技術によるごとき、ヒト介在によって導入された
異種核酸を含有する。核酸は細胞の前駆体への導入によって、マイクロインジェ
クションによるごとき思慮深い遺伝子操作によって、または組換えウイルスでの
感染によって直接的または間接的に細胞に導入される。用語遺伝子操作は古典的
交雑育種、または試験官受精を含まず、むしろ組換えＤＮＡ分子の導入に向けら
れる。この分子は染色体内に組み込むことができるか、あるいは染色体外で複製
するＤＮＡであり得る。本明細書で記載される典型的なトランスジェニック動物
において、トランスジーンは、細胞がＧＬＣ１Ａ蛋白質の１つの組換え形態、例
えば、アゴニストもしくはアンタゴニスト形態を発現させるようにする。しかし
ながら、組換えＧＬＣ１Ａ遺伝子がサイレントであるトランスジェニック動物、
例えば、後記するＦＬＰまたはＣＲＥ組換え依存性構築体も考えられる。さらに
、「トランスジェニック動物」は、１以上のＧＬＣ１Ａ遺伝子の遺伝子破壊が、
組換えおよびアンチセンス技術双方を含めたヒト介在によって引き起こされる組
換え動物も含む。

【００６５】 用語「ベクター」とは、それが連結されているもう１つの核酸を輸送すること
ができる核酸分子をいう。好ましいベクターの１つのタイプはエピソーム、すな
わち、染色体外複製することができる核酸である。好ましいベクターは、それら
が連結された核酸の自律的複製および／または発現が可能であるものである。そ
れらが作動可能に連結した遺伝子の発現を指令することができるベクターは、こ
こでは「発現ベクター」という。一般に、組換えＤＮＡ技術における利用性の発
現ベクターは、しばしば、そのベクター形態において、染色体に結合していない
円状二本鎖ＤＮＡループを一般的にいう「プラスミド」の形態である。本明細書
においては、「プラスミド」および「ベクター」は相互交換的に使用される。と
いうのは、プラスミドはベクターの最も普通の形態だからである。しかしながら
、本発明は同等の機能を発揮し、引き続いてそれに対する当該分野で知られるよ
うになる発現ベクターのかかる他の形態を含むことを意図する。

【００６６】 ４．３ 本発明の核酸 後記するごとく、本発明の１つの態様は、ミオシリンポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列を含む単離された核酸、および／またはかかる核酸の同等物
に関する。用語同等物は、本明細書に記載するごとき脊椎動物ミオシリン蛋白質
の活性を有する機能的に同等のミオシリンポリペプチドまたは機能的に同等のペ
プチドをコードするヌクレオチド配列を含むと理解される。同等のヌクレオチド
配列は対立遺伝子変異体のごとき１以上のヌクレオチド置換、付加または欠失だ
け異なる配列を含み；従って、遺伝暗号の縮重による配列番号７または９で示さ
れるＧＬＣ１Ａ遺伝子のヌクレオチド配列とは異なる配列を含む。

【００６７】 好ましい核酸は脊椎動物ＧＬＣ１Ａ核酸である。特に好ましい脊椎動物ＧＬＣ
１Ａ核酸は哺乳動物である。種に拘わらず、特に好ましいＧＬＣ１Ａ核酸は、ヒ
トＧＬＣ１Ａのアミノ酸配列と少なくとも９０％同様であるポリペプチドをコー
ドする。好ましい核酸は、例えば、配列番号８または１０の１つで示された配列
のごとき、脊椎動物ＧＬＣ１Ａのアミノ酸配列と少なくとも９０％相同、より好
ましくは９４％相同のアミノ酸配列を含むＧＬＣ１Ａポリペプチドをコードする
。配列番号８または１０で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、より好
ましくは少なくとも約９８−９９％同様のポリペプチドをコードする核酸もまた
本発明の範囲内にある。特に好ましい具体例において、本発明の核酸は、配列番
号８または１０の１つで示されたアミノ酸ＧＬＣ１Ａ配列をコードする。１つの
具体例において、該核酸は主題のＧＬＣ１Ａポリペプチドの少なくとも１つの生
物活性を有するペプチドをコードするｃＤＮＡである。好ましくは、核酸は配列
番号１−７または９のコーディング領域に対応するヌクレオチド配列の全てまた
は一部を含む。

【００６８】 本発明のさらに他の好ましい核酸は、配列番号８または１０のアミノ酸残基の
全てまたは一部、例えば、その領域の少なくとも２、５、１０、２５、５０、１
００、１５０または２００アミノ酸残基に対応するポリペプチド配列を含むＧＬ
Ｃ１Ａポリペプチドをコードする。例えば、プローブ／プライマーまたはアンチ
センス分子として使用される好ましい核酸分子（すなわち、非コーディング核酸
分子）は長さが少なくとも約６、１２、２０、３０、５０、１００、１２５、１
５０または２００塩基対を含むことができ、他方、コーディング核酸分子は約２
００、２５０、３００、３５０、４００、４１０、４２０、４３０、４３５また
は４４０塩基対を含むことができる。

【００６９】 本発明のもう１つの態様は、配列番号１−７または９の１つによって表される
核酸にハイブリダイズする核酸を提供する。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促
進する適当なストリンジェンシー条件、例えば、約４５℃における６．０×塩化
チトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、続いての５０℃における２．０×
ＳＳＣは当業者に公知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏリｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ
， Ｎ．Ｙ． （１９８９）、６．３．１−６．３．６で見いだすことができる
。例えば、洗浄工程における塩濃度は５０℃における約２．０×ＳＳＣの低スト
リンジェンシーから５０℃における約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーか
ら選択することができる。加えて、洗浄工程における温度は室温、約２２℃にお
ける低ストリンジェンシー条件から約６５℃における高ストリンジェンシー条件
まで増加させることができる。温度および塩は共に変化させることができ、ある
いは温度または塩濃度いずれかを他の変数を変化させつつ一定に保持することが
できる。好ましい具体例において、本発明のＧＬＣ１Ａ核酸は、中程度ストリン
ジェンシー条件、例えば、約２．０×ＳＳＣおよび約４０℃で配列番号１または
２のうちの１つに結合するであろう。特に好ましい具体例において、本発明のＧ
ＬＣ１Ａ核酸は高ストリンジェンシー条件下で配列番号１−７または９の１つに
結合するであろう。

【００７０】 好ましい核酸は、例えば、配列番号８および１０のうちの１つで示される配列
のごとき、哺乳動物ＧＬＣ１Ａのアミノ酸配列と少なくとも約７５％相同、より
好ましくは８０％、なおより好ましくは少なくとも約８５％相同である配列を有
する。配列番号８および１０のうちの１つに表された核酸と少なくとも約９０％
、より好ましくは約９５％、最も好ましくは少なくとも約９８−９９％相同であ
る核酸は、もちろん、本発明の範囲内のものである。好ましい具体例において、
該核酸は哺乳動物ＧＬＣ１Ａ遺伝子であり、特に好ましい具体例において、配列
番号１−７または９のうちの１つのコーディング領域に対応するヌクレオチド配
列の全てまたは一部を含む。

【００７１】 遺伝暗号の縮重により配列番号１−７または９のうちの１つで示されるヌクレ
オチド配列とは異なる配列を有する核酸もまた本発明の範囲内のものである。か
かる核酸は機能的に同等のペプチド（すなわち、ミオシリンポリペプチドの生物
学的活性を有するペプチド）をコードするが、遺伝暗号における縮重により配列
表で示される配列から配列が異なる。例えば、１を超えるトリプレットによって
多数のアミノ酸が表示される。同一のアミノ酸、または同義を特定するコドン（
例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣは各々ヒスチジンをコードする）の結果、ミオシリ
ンポリペプチドのアミノ酸配列に影響しない「サイレント」突然変異がもたらさ
れ得る。しかしながら、主題のミオシリンポリペプチドのアミノ酸配列の変化に
至らないＤＮＡ配列多形が哺乳動物間に存在することが予測される。当業者であ
れば、哺乳動物ミオシリンポリペプチドの活性を有するポリペプチドをコードす
る核酸の１以上のヌクレオチド（例えば、ヌクレオチドの約３−５％まで）にお
けるこれらの変異が天然対立遺伝子変異による所与の種の個体間で存在し得るこ
とを認識するであろう。

【００７２】 後記する実施例によって示されるごとく、ミオシリン蛋白質をコードする核酸
は多数の真核生物細胞のいずれかに存在するｍＲＮＡから得ることができる。ま
た、成人および胚双方からのゲノムＤＮＡから本発明の哺乳動物ミオシリンポリ
ペプチドをコードする核酸を得ることも可能である。例えば、ミオシリン蛋白質
をコードする遺伝子は、本明細書に記載されたプロトコル、ならびに当業者に一
般的に知られたプロトコルに従って、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーからク
ローン化することができる。主題の核酸の単離に適した組織および／またはライ
ブラリーの例は、とりわけ、網膜の光受容体細胞を含む。ミオシリン蛋白質をコ
ードするｃＤＮＡは、胚細胞を含めた、細胞、例えば、脊椎動物細胞、哺乳動物
細胞またはヒト細胞から全ｍＲＮＡを単離することによって得ることができる。
次いで、全ｍＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製し、引き続いて多数の公知の技術
のうちのいずれか１つを用いて適当なプラスミドまたはバクテリオファージに挿
入することができる。また、本発明によって提供されるヌクレオチド配列情報に
従い、確立されたポリメラーゼ鎖反応技術を用いて、哺乳動物ミオシリン蛋白質
をコードする遺伝子をクローン化することができる。本発明の核酸はＤＮＡまた
はＲＮＡであり得る。好ましい核酸は配列番号１および２よりなる群から選択さ
れる配列によって表されるｃＤＮＡである。

【００７３】 ４．３．１ ベクター また、本発明は、少なくとも１つの転写調節配列に作動可能に連結した、ミオ
シリンポリメラーゼをコードする核酸を含有する発現ベクターを提供する。「作
動可能に連結した」とは、ヌクレオチド配列が、該ヌクレオチド配列の発現を可
能とするように調節配列に連結されていることを意味することを意図する。調節
配列は当該分野で認められており、主題の哺乳動物ミオシリン蛋白質の発現を指
令するように選択される。従って、用語「転写調節配列」はプロモーター、エン
ハンサーおよび他の発現制御エレメントを含む。かかる調節配列はＧｏｅｄｄｅ
ｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，
Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ （１９９０）に記載されている。１つの具体例
において、発現ベクターは主題のミオシリンポリメラーゼのアゴニスト活性を有
するペプチドをコードする、あるいは別法として、ミオシリン蛋白質のアンタゴ
ニスト形態であるペプチドをコードする組換え遺伝子を含む。かかる発現ベクタ
ーを用いて細胞をトランスフェクトし、それにより、本明細書に記載された核酸
によってコードされた融合蛋白質を含めたポリペプチドを生産することができる
。さらに、本発明の遺伝子構築体は遺伝子治療プロトコルの一部として用いて、
主題のミオシリン蛋白質の１つのアゴニストまたはアンタゴニスト形態のいずれ
かをコードする核酸を送達することができる。かくして、本発明のもう１つの態
様は、組織中のミオシリン−誘導シグナリングの機能を再構成するように、また
は別法として該機能をなくするように、特に細胞タイプにおいてミオシリンポリ
ペプチドのイン・ビボもしくはイン・ビトロトランスフェクションおよび発現の
ためのベクターをその要旨とする。これは、例えば、蛋白質の天然に生じる形態
が誤発現される場合に、または組織の分化を改変する蛋白質の形態を送達するた
めに望ましいであろう。発現ベクターは新形成形質転換を阻害するのに使用する
こともできる。

【００７４】 前記したもののごときウイルス導入方法に加えて、非ウイルスを使用して動物
の組織において主題のミオシリンポリペプチドの発現を引き起こすこともできる
。遺伝子導入のほとんどの非ウイルス方法は、マクロ分子の摂取および細胞内輸
送のための哺乳動物細胞によって使用される通常のメカニズムに頼る。好ましい
具体例において、本発明の非ウイルス標的化手段は、標的化された細胞による主
題のミオシリンポリペプチド遺伝子の摂取のためのエンドサイトーシス経路に頼
る。このタイプの例示的標的化手段はリポソーム由来系、ポリリシンコンジュゲ
ート、および人工的ウイルスエンベロープを含む。

【００７５】 ４．３．２ プローブおよびプライマー さらに、哺乳動物生物からのＧＬＣ１Ａ遺伝子のクローニングから決定された
ヌクレオチド配列は、さらに、例えば、他の組織からの他の細胞タイプにおける
ホモログ、ならびに他の哺乳動物生物からのホモログを同定しおよび／またはク
ローニングするのに使用されるために設計されたプローブおよびプライマーの創
製を可能とする。例えば、本発明は、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを
含むプローブ／プライア−を提供し、このオリゴヌクレオチドは配列番号１−７
または９よりなる群から選択されるセンスまたはアンチセンス配列の少なくとも
ほぼ１２、好ましくは２５、より好ましくは４０、５０または７５連続ヌクレオ
チドに対してストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の
領域、またはその天然に生じる突然変異体を含む。例えば、配列番号１−７また
は９に表される核酸に基づくプライマーはホモログをクローン化するためにＰＣ
Ｒ反応で用いることができる。本発明の好ましいプライマー対は配列番号１２お
よび１３；１４および１５；１６および１７；１８および１９；２０および２１
；２２および２３；２４および２５；２６および２７；２８および２９；３０お
よび３１；３２および３３；３４および３５；３６および３７；３８および３９
；４０および４１；４２および４３；４４および４５；および４６および４７と
して記載されている。

【００７６】 同様に、主題のＧＬＣ１Ａ配列に基づくプローブを用いて、同一または相同蛋
白質をコードする転写体またはゲノム配列を指令することができる。好ましい具
体例において、該プローブは、さらに、それに結合した標識基を含み、検出する
ことができ、例えば、標識基は放射同位体、蛍光化合物、酵素、および酵素補因
子等から選択することができる。

【００７７】 後記でより詳細に記載するごとく、かかるプローブは、患者からの細胞の試料
中のミオシリンコーディング核酸のレベルを測定する、例えば、ＧＬＣ１Ａ ｍ
ＲＮＡレベルを検出し、またはゲノムＧＬＣ１Ａ遺伝子が突然変異されたまたは
欠失されたかを決定するごとく、ミオシリン蛋白質を誤発現する細胞または組織
を同定するための診断キットの一部として用いることができる。略言すれば、ヌ
クレオチドプローブは、ミオシリンをコードする転写体の存在（または不存在）
につき無傷組織および組織試料の組織学的スクリーニングを促進する主題のＧＬ
Ｃ１Ａ遺伝子から創製することができる。抗−ミオシリン抗体の診断使用と同様
に、ＧＬＣ１Ａメッセージ、またはゲノムＧＬＣ１Ａ配列に向けられたプローブ
の使用は、主題の予測的および治療的評価双方で用いることができる。本明細書
に記載されたイムノアッセイと組み合わせて使用され、オリゴヌクレオチドプロ
ーブは、ミオシリン蛋白質の発現（またはその欠如）に関連したいくつかの異常
性に関与し得る発生的障害のための分子基礎の決定を促進するのを助ける。例え
ば、ポリペプチド合成における変異はコーディング配列中の突然変異から分化さ
せることができる。

【００７８】 ４．３．３． アンチセンス、リボザイムおよびトリプレックス技術 本発明の１つの態様は、「アンチセンス」療法における単離された核酸の使用
に関する。ここに記載されるごとく、「アンチセンス」療法とは、例えば、転写
および／または翻訳を阻害することによって、その蛋白質の発現を阻害するよう
に、主題のＧＬＣ１Ａ蛋白質の１以上をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／または
ゲノムＤＮＡと、細胞条件下で、特異的にハイブリダイズ（例えば、結合）する
オリゴヌクレオチド分子またはその誘導体の投与またはイン・サイチュ創製をい
う。該結合は、二重らせんの主要溝中での特異的相互作用を通じて、例えば、Ｄ
ＮＡデュプレックスに対する結合の場合に、通常の塩基対相補性によることがで
きる。一般に、「アンチセンス」療法とは、当該分野で一般的に使用されている
技術の範囲をいい、オリゴヌクレオチド配列への特異的結合に頼るいずれの療法
も含む。

【００７９】 本発明のアンチセンス構築体は、例えば、細胞中で転写された場合、ミオシリ
ン蛋白質をコードする細胞ｍＲＮＡの少なくともユニーク部分に相補的なＲＮＡ
を生じる発現プラスミドとして送達することができる。別法として、アンチセン
ス構築体はエクス・ビボで創製され、細胞に導入されると、ＧＬＣ１Ａ遺伝子の
ｍＲＮＡおよび／またはゲノム配列とハイブリダイズすることによって発現の阻
害を引き起こすオリゴヌクレオチドである。かかるオリゴヌクレオチドプローブ
は、好ましくは、内因性ヌクレアーゼ、例えば、内因性および／またはエンドヌ
クレアーゼに抵抗性である、従って、イン・ビボで安定な修飾されたオリゴヌク
レオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用される例示的核酸
分子は、ＤＮＡのホスホルアミデート、ホスホチオエートおよびメチルホスホネ
ートアナログである（米国特許第５，１７６，９９６号；第５，２６４，５６４
号；および第５，２５６，７７５号も参照）。加えて、アンチセンス療法で有用
なオリゴマーを構築するための一般的アプローチは、例えば、Ｖａｎ ｄｅｒ
Ｋｒｏｌら（１９８８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６；
およびＳｔｅｉｎら（１９８８） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４８：２６５９−２
６６８によってレビューされている。アンチセンスＤＮＡに関しては、例えば、
注目するＧＬＣ１Ａヌクレオチド配列の−１０および＋１０領域の間の翻訳開始
に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。

【００８０】 アンチセンスアプローチは、ＧＬＣ１Ａ ＲＮＡに相補的であるオリゴヌクレ
オチド（ＤＮＡまたはＲＮＡいずれか）の設計を含む。アンチセンスオリゴヌク
レオチドはＧＬＣ１Ａ ｍＲＮＡ転写体に結合し、翻訳を妨げるであろう。好ま
しいものではあるが、絶対的相補性は必要とはされない。本明細書で言及される
ごとく、ｍＲＮＡの一部に「相補的な」配列は、ＲＮＡとハイブリダイズするこ
とができる十分な相補性を有し、安定なデュプレックスを形成する配列を意味し
；二本鎖アンチセンス核酸の場合には、デュプレックスＤＮＡの一本鎖がかくし
てテストされ、あるいはトリプレックス形成をアッセイすることができる。ハイ
ブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さ双方に依存
するであろう。一般に、ハイブリダイズする核酸が長いと、安定なデュプレック
ス（または当てはまる場合はトリプレックス）を含有し、依然としてそれを形成
するＲＮＡとの塩基ミスマッチは多くなる。当業者であれば、標準的な手法の使
用によってミスマッチの許容される程度を確認して、ハイブリダイズする複合体
の融解温度を決定することができる。

【００８１】 メッセージの５’末端に相補的なオリゴヌクレオチド、例えば、ＡＵＧ開始コ
ドンまでのおよびそれを含めた５’非翻訳配列は翻訳を阻害するにおいて最も効
果的に働く。しかしながら、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列は、最近
、同様にＲＮＡの翻訳を阻害するにおいて効果的であることが示されている（Ｗ
ａｇｎｅｒ， Ｒ． １９９４， Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３３３）。従って、
ＧＬＣ１Ａ遺伝子の５’または３’非翻訳の非コーディングの領域のいずれかに
相補的なオリゴヌクレオチドをアンチセンスアプローチで用いて、内因性ＧＬＣ
１Ａ ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相
補的なオリゴヌクレオチドはＡＵＧ開始コドンの相補体を含むべきである。ｍＲ
ＮＡコーディング領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは翻訳の効果
的ではない阻害剤であるが、本発明で使用できるであろう。ＧＬＣ１Ａ ｍＲＮ
Ａの５’、３’またはコーディング領域にハイブリダイズするように設計するか
を問わず、アンチセンス核酸は長さが少なくとも６つのヌクレオチド、好ましく
は長さが６ないし約５０ヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドであるべきで
ある。ある具体例においては、オリゴヌクレオチドは少なくとも１０ヌクレオチ
ド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、または少なく
とも５０ヌクレオチドである。

【００８２】 標的配列の選択に拘わらず、イン・ビトロ実験をまず行って、遺伝子発現を阻
害するアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力を定量するアンチセンスオリゴヌ
クレオチドの能力を定量するのが好ましい。これらの実験はアンチセンス遺伝子
阻害およびオリゴヌクレオチドの非特異的生物学的効果の間を区別する対照を利
用するのが好ましい。また、これらの実験は標的ＲＮＡまたは蛋白質のレベルを
内部対照ＲＮＡまたは蛋白質のそれと比較するのが好ましい。加えて、アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドを用いて得られた結果を対照オリゴヌクレオチドを用い
て得られたものと比較することが考えられる。対照オリゴヌクレオチドはテスト
オリゴヌクレオチドとほぼ同一の長さであって、オリゴヌクレオチドのヌクレオ
チド配列が、標的配列への特異的ハイブリダイゼーションを妨げるのが必要であ
る以上にはアンチセンス配列と異ならないのが好ましい。

【００８３】 該オリゴヌクレオチドはＤＮＡもしくはＲＮＡまたはキメラ混合物またはその
誘導体または修飾されたバージョン、一本鎖または二本鎖であり得る。オリゴヌ
クレオチドは塩基部位、糖部位、またはリン酸骨格で修飾して、例えば、分子、
ハイブリダイゼーション等の安定性を改良することができる。オリゴヌクレオチ
ドは（例えば、イン・ビボで宿主細胞受容体を標的化するための）ペプチドのご
とき他の付着基、あるいは細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら， １９８９
， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６：６
５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら， １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ
． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８４：６４８−６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／
０９８１０， １９８８年１２月１５日公開参照）または血液脳関門（例えば、
ＰＣＴ公開番号ＷＯ ８９／１０１３４， １９８８年４月２５日公開参照）を
横切る輸送を促進するための剤、ハイブリダイゼーション−トリガード切断剤（
例えば、Ｋｒｏｌら， １９８８， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８
−９７６参照）またはインターカレーティング剤（例えば、Ｚｏｎ， １９８８
， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ５：５３９−５４９参照）を含んでもよい。この
目的で、オリゴヌクレオチドをもう１つの分子、例えば、ペプチド、ハイブリダ
イゼーショントリガード架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション−トリガード
切断剤等にコンジュゲートすることができる。

【００８４】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されるものではないが、５−フルオ
ロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、
ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロ
キシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン
、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ
−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチ
ルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデ
ニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−
アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキ
シアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−
メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−
Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ウイブトキ
ソシン、シウドウラシル、ウラシル−２−チオシトシン、５−メチル−２−チオ
ウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシ
ル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メ
チル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル
）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンよりなる群から選
択される少なくとも１つの修飾された塩基部位を含むことができる。

【００８５】 また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されるものではないが、アラ
ビノース、２−フルオロアラビノース、キシリロース、およびヘキソースよりな
る群から選択される少なくとも１つの修飾された糖部位を含むことができる。

【００８６】 さらにもう１つの具体例において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはホスホ
ロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロア
ミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエ
ステル、およびホルムアセタールまたはそのアナログよりなる群から選択される
少なくとも１つの修飾されたリン酸骨格を含む。

【００８７】 さらにもう１つの具体例において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはα−ア
ノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは相補的Ｒ
ＮＡとで特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、ここに、通常の立体配座とは対照
的に、ストランドは相互に平行に走る（Ｇａｕｔｉｅｒら， １９８７， Ｎｕ
ｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５：６６２５−６６４１）。オリゴヌクレオ
チドは２’−０−メチルリボ核酸（Ｉｎｏｕｅら， １９８７， Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． １５：６１３１−６１４８）、またはキメラＲＮＡ−
ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら， １９８７， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２１５
：３２７−３３０）である。

【００８８】 本発明のオリゴヌクレオチドは当該分野で公知の標準的方法によって、例えば
、（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ等から商業
的に入手可能なもののごとき）自動ＤＮＡ合成器の使用によって合成することが
できる。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはＳｔｅｉｎら（１
９８８， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． １６：３２０９）の方法によ
って合成することができ、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは制御された
ポアガラスポリマー支持体などの使用によって調製することができる（Ｓａｒｉ
ｎら， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ
．Ａ． ８５：７４４８−７４５１）。

【００８９】 ＧＬＣ１Ａコーディング領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドを用い
ることができるが、転写された非翻訳領域が最も好ましい。

【００９０】 アンチセンスヌクレオチドはイン・ビボでミオシリンを発現する細胞に送達さ
れるべきである。アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを送達するための多数の方法
が開発されている；例えば、アンチセンス分子は組織部位に直接的に注射するこ
とができ、あるいは所望の細胞を標的化するように設計された修飾アンチセンス
分子（例えば、標的細胞表面で発現された受容体または抗原に特異的に結合する
ペプチドまたは抗体に結合したアンチセンス）を全身投与することができる。

【００９１】 しかしながら、内因性ｍＲＮＡの翻訳を支持するのに十分なアンチセンスの細
胞内濃度を達成するのはしばしば困難である。従って、好ましいアプローチは、
アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なｐｏｌまたはｐｏｌプロモーター の制御下にある組換えＤＮＡ構築体を利用する。患者において標的細胞をトラン
スフェクトするためのかかる構築体の使用の結果、内因性ＧＬＣ１Ａ転写体とで
相補的塩基対を形成するであろう一本鎖ＲＮＡの十分量の転写がもたらされ、そ
れにより、ＧＬＣ１Ａ ｍＲＮＡの翻訳を防止する。例えば、細胞によって摂取
され、アンチセンスＲＮＡの転写を指令するように、ベクターをイン・ビボで導
入することができる。転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを生産する限り、か
かるベクターはエピソームで留まり、染色体に組み込まれるようになる。かかる
ベクターは当該分野における組換えＤＮＡ技術方法によって構築することができ
る。ベクターはプラスミド、ウイルス、または哺乳動物細胞における複製および
発現で使用される当該分野で公知の他のものであり得る。アンチセンスＲＮＡを
コードする配列の発現は、哺乳動物、好ましくはヒト細胞で作用することが当該
分野で知られているいずれかのプロモ−タ−によることができる。かかるプロモ
ーターは誘導性または構成的であってよい。かかるプロモーターは、限定される
ものではないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈ
ａｍｂｏｎ， １９８１， Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０）、ラウス
肉腫ウイルスの３’ロング末端リピートに含有されたプロモーター（Ｙａｍａｍ
ｏｔｏら， １９８０， Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジ
ンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ
ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７８：１４４１−１４４５）、メ
タロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら， １９８２， Ｎａｔ
ｕｒｅ， ２９６：３９−４２）等を含む。いずれのタイプのプラスミド、コス
ミド、ＹＡＣまたはウイルスベクターを用いて、組織部位、例えば、脈絡叢また
は視床下部に直接的に導入することができる組換えＤＮＡ構築体を調製すること
もできる。別法として、所望の組織に選択的に感染するウイルスベクターを用い
ることができ（例えば、脳では、ヘルペスウイルスを用いることができ）、この
場合、投与はもう１つの経路（例えば、全身）によって達成することができる。

【００９２】 ＧＬＣ１Ａ ｍＲＮＡ転写体を触媒により切断するように設計されたリボザイ
ム分子を用いて、ＧＬＣ１Ａ ｍＲＮＡの翻訳およびミオシリンの発現を防止す
ることもできる（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ ９０／１１３６４、１９９０年
１０月４日公開；Ｓａｒｖｅｒら， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１
２２２−１２２５参照）。部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイム
を用いてＧＬＣ１Ａ ｍＲＮＡを破壊することができるが、ハンマーヘッドリボ
ザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは標的ｍＲＮＡとで相補的
塩基対を形成するフランキング領域によって指令される位置でｍＲＮＡを切断す
る。唯一の要件は、標的ｍＲＮＡが以下の２塩基の配列を有することである：５
’−ＵＧ−３’。ハンマーヘッドリボザイムの構築および生産は当該分野でよく
知られており、ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ， １９８８， Ｎａｔ
ｕｒｅ， ３３４：５８５−５９１に十分に詳細に記載されている。ヒトＧＬＣ
１Ａ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列内に数１００の可能なハンマーヘッドリボザ
イム切断部位がある。好ましくは、リボザイムは、切断認識部位がＧＬＣ１Ａ
ｍＲＮＡの５’末端近くに位置して、効率を増加させ、非機能的ｍＲＮＡ転写体
の細胞内蓄積を最小化するように設計される。

【００９３】 また、本発明のリボザイムはＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａ Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ａにおいて天然で生じ（ＩＶＳ、またはＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡとして知られ
ている）、Ｔｈｏｍａｓ Ｃｅｃｈおよび同僚によって広く記載されている（Ｚ
ａｕｇら， １９８４， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２４：５７４−５７８；Ｚａｕ
ｇおよびＣｅｃｈ， １９８６；Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３１：４７０−４７５；
Ｚａｕｇら， １９８６， Ｎａｔｕｒｅ， ３２４：４２９−４３３；Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｔｅｎｔｓ Ｉｎｃ．による公開された特許出願ＷＯ ８
８／０４３００；ＢｅｅｎおよびＣｅｃｈ， １９８６， Ｃｅｌｌ， ４７：
２０７−２１６）もののごときＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以後、「Ｃｅｃ
ｈ−タイプリボザイム」）も含む。Ｃｅｃｈ−タイプリボザイムは標的ＲＮＡ配
列にハイブリダイズし、しかる後、標的ＲＮＡの切断が起こる８塩基対活性部位
を有する。本発明は、ＧＬＣ１Ａに存在する８塩基対活性部位配列を標的化する
Ｃｅｃｈ−タイプリボザイムを含む。

【００９４】 アンチセンスアプローチにおけるごとく、リボザイムは修飾されたオリゴヌク
レオチド（例えば、改良された安定性、標的化等につき）よりなることができ、
イン・ビボでＧＬＣ１Ａを発現する細胞、例えば、視床下部および／または脈絡
叢に送達されるべきである。送達の好ましい方法は、トランスフェクトされた細
胞が十分量のリボザイムを生産して、内因性ＧＬＣ１Ａメッセージを破壊し、翻
訳を阻害するように、強力な構成的ｐｏｌまたはｐｏｌプロモーターの制御 下にあるリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築体の使用を含む。アンチセンス
分子とは異なりリボザイムは触媒的であるので、より低い細胞内濃度しか効率で
必要でない。

【００９５】 また、内因性ＧＬＣ１Ａ遺伝子発現は、相同組換えを用い、ＧＬＣ１Ａ遺伝子
またはそのプロモーターの「ノックアウト」を不活化することによって内因性Ｇ
ＬＣ１Ａ遺伝子発現を減少させることができる（例えば、Ｓｉｍｉｔｈｉｅｓら
， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１７：２３０−２３４；Ｔｈｏｍａｓ ＆
Ｃａｐｅｃｃｈｉ， １９８７， Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２；Ｔｈｏｍ
ｐｓｏｎら， １９８９ Ｃｅｌｌ ５：３１３−３２１；その各々を出典明示
してその全部を本明細書の一部とみなす）。例えば、内因性ＧＬＣ１Ａ遺伝子（
ＧＬＣ１Ａ遺伝子のコーディング領域または調節領域）に相同なＤＮＡによって
近接された突然変異体の非機能的ＧＬＣ１Ａ（または完全に無関係のＤＮＡ配列
）を、選択マーカーおよび／または負の選択マーカーと共にまたはそれなくして
用いて、イン・ビボでＧＬＣ１Ａを発現する細胞をトランスフェクトすることが
できる。標的化相同組換えを介する、ＤＮＡ構築体の挿入の結果、ＧＬＣ１Ａ遺
伝子の不活化がもたらされる。かかるアプローチは農業分野で特に適し、ここに
、ＥＳ（胚幹）細胞に対する修飾を用いて、不活性ＧＬＣ１Ａを持つ動物子孫を
創製することができる（例えば、Ｔｈｏｍａｓ ＆ Ｃａｐｅｃｃｈｉ １９８
７およびＴｈｏｍｐｓｏｎ １９８９， 前掲参照）。しかしながら、このアプ
ローチはヒトで適合されることができる。但し、適当なウイルスベクター、例え
ば、脳組織、例えば、視床下部および／または脈絡叢への送達のためのヘルペス
ウイルスベクターを用い、イン・ビボで所要の部位の直接的に投与しまたは標的
化されるものとする。

【００９６】 別法として、内因性ＧＬＣ１Ａ遺伝子発現は、ＧＬＣ１Ａ遺伝子の調節領域（
すなわち、ＧＬＣ１Ａプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的にデ
オキシリボヌクレオチド配列を標的化して、身体中の標的細胞におけるＧＬＣ１
Ａ遺伝子の転写を防止する三重らせん構造を形成することによって減少させるこ
とができる（例えば、一般に、Ｈｅｌｅｎｅ， Ｃ． １９９１， Ａｎｔｉｃ
ａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．， ６（６）：５６９−８４；Ｈｅｌｅｎｅ，
Ｃ．ら， １９９２， Ａｎｎ， Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ６６
０：２７−３６；およびＭａｈｅｒ， Ｌ．Ｊ．， １９９２， Ｂｉｏａｓｓ
ａｙｓ １４（１２）：８０７−１５参照）。

【００９７】 同様に、本発明のアンチセンス構築体は、ミオシリン蛋白質の１つの正常生物
学的活性に拮抗することによって、組織の操作、例えば、組織分化、イン・ビボ
、エクス・ビボ組織培養で用いることができる。

【００９８】 さらに、アンチセンス技術（例えば、アンチセンス分子のマイクロインジェク
ション、またはその転写がＧＬＣ１Ａ ｍＲＮＡまたは遺伝子配列に関してアン
チセンスであるプラスミドでのトランスフェクション）を用いて、発生事象にお
けるミオシリンの役割、ならびに成人組織におけるミオシリンの正常細胞機能を
調べることができる。かかる技術は細胞培養で利用することができるが、後記で
詳細に記載するごとくトランスジェニック動物の創製で用いることができる。

【００９９】 リボザイムはＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子で
ある。リボザイム作用のメカニズムは、相補的標的ＲＮＡに対するリボザイム分
子の配列特異的ハイブリダイゼーション、続いてのエンドヌクレアーゼ分解切断
を含む。リボザイム分子の組成は標的遺伝子ｍＲＮＡに相補的な１以上の配列を
含まなければならず、ｍＲＮＡ切断を担うよく知られた触媒配列を含まなければ
ならない。この配列については、出典明示してその全部において本明細書の一部
とみなす米国特許第５，０９３，２４６号参照。ミオシリン蛋白質をコードする
ＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ分解切断を特異的かつ効果的に触媒する作成さ
れたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子はそれ自体本発明の範囲内である。

【０１００】 いずれの可能なＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位も、以下の配列ＧＵ
Ａ、ＧＵＵおよびＧＵＣを含むリボザイム切断部位についての注目する分子をス
キャンすることによってまず同定する。一旦同定すれば、切断部位を含有する標
的遺伝子の領域に対応する１５および２０リボヌクレオチド間の短いＲＮＡ配列
を、オリゴヌクレオチドを配列不適当とし得る二次構造のごとき予測される構造
特徴につき評価することができる。候補細胞の適当性は、リボヌクレアーゼ保護
アッセイを用い、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへのそ
の接近性をテストすることによって標記することもできる。

【０１０１】 転写の阻害のために三重らせん形成で使用されるべき核酸分子は、好ましくは
、一本鎖であり、デオキシリボヌクレオチドよりなる。これらのオリゴヌクレオ
チドの塩基組成は、一般に、デュプレックスの１つのストランドに存在すべきプ
リンまたはピリミジンいずれかのサイズ可能なストレッチを要する、フーグステ
ィーン塩基対合則を介する三重らせん形成を促進すべきである。ヌクレオチド配
列ピリミジン−ベースであってよく、この結果、得られた三重らせんの３の会合
ストランドを横切るＴＡＴおよびＣＧＣトリプレットがもたらされる。ピリミジ
ン−リッチの分子は、そのストランドに対する平行向きのデュプレックスの一本
鎖のプリン−リッチの領域に相補的な塩基を供する。加えて、例えば、Ｇ残基の
ストレッチを含有するプリン−リッチな核酸分子を選択することができる。これ
らの分子は、ＧＣ対が豊富なＤＮＡデュプレックスとで三重らせんを形成し、こ
こに、プリン残基の大部分は標的化デュプレックスの一本鎖に位置し、トリプレ
ックスにおける３つのストランドを横切るＣＧＣトリプレットが得られる。

【０１０２】 別法として、三重らせん形成につき標的化することができる可能な配列は、い
わゆる「スイッチバック」核酸分子を創製することによって増加させることがで
きる。スイッチバック分子は、それがデュプレックスの第１ストランドと塩基対
合し、次いで、他のものと対合し、デュプレックスの１つのストランドに存在す
べきプリンまたはピリミジンいずれかのサイズ可能なストレッチの必要性を排除
するように、５’−３’、３’−５’様式で合成される。

【０１０３】 本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、リボザイム、および三重らせん分
子は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の合成につき当該分野で知られているいずれかの
方法によって調製することができる。これらは、例えば、固相ホスホルアミダイ
ト化学合成のごとき当該分野でよく知られているオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成するための技術を含む。別法と
して、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のイン・
ビトロおよびイン・ビボ転写によって創製することができる。かかるＤＮＡ配列
は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターのごとき適当なＲＮＡポリメラ
ーゼプロモーターを取り込む非常に種々のベクターに取り込むことができる。別
法として、使用するプロモーターに応じて、ＲＮＡを構成的にまたは誘導的にア
ンチセンスを合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築体を細胞系に安定な導入をする
ことができる。

【０１０４】 さらに、細胞内安定性および半減期を増加させる手段として、核酸分子に対す
る種々のよく知られた修飾を導入することができる。可能な修飾は、限定される
ものではないが、分子の５’および／または３’末端へのリボヌクレオチドまた
はデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列の付加またはオリゴデオキシリ
ボヌクレオチド骨格内のホスホジエステラーゼ結合よりもむしろホスホロチオエ
ートまたは２’Ｏ−メチルの使用を含む。

【０１０５】 ４．４ 本発明のポリペプチド また、本発明は、特に他のシグナル変換因子および／またはミオシリンポリペ
プチドと通常会合することができる転写因子から単離された、または他の細胞蛋
白質が実質的にない、利用可能なミオシリンポリペプチドを作成する。用語（こ
こでは「汚染蛋白質」ともいう）「他の細胞蛋白質が実質的にない」または「実
質的に純粋または精製された調製物」とは、約２０（重量）％未満の汚染蛋白質
を有する、好ましくは約５重量％未満の汚染蛋白質を有するミオシリンポリペプ
チドの調製物を含むと定義される。主題のポリペプチドの機能的形態は、ここに
記載するクローン化された遺伝子を用いることによって、精製された調製物とし
てまず調製することができる。「精製された」とは、ペプチドまたはＤＮＡもし
くはＲＮＡ配列に言及する場合、示された分子が他の蛋白質のごとき他の生物学
的マクロ分子の実質的に不存在下で存在することを意味する。本明細書で用いる
用語「精製された」とは、好ましくは、存在する同一タイプの生物学的マクロ分
子の少なくとも８０乾燥重量％、より好ましくは９５−９９重量％の範囲、最も
好ましくは少なくとも９９．８重量％を意味する（しかし、水、緩衝液、および
他の小分子、特に５０００未満の分子量を有する分子は存在できる）。本明細書
で用いるごとく用語「純粋な」とは、好ましくは、直前の「精製された」と同一
の数字的限定を有する。「単離された」および「精製された」は、その天然状態
の天然物質または（例えば、アクリルアミドゲル中で）成分に分離されたが、純
粋な（例えば、汚染蛋白質、または変性剤およびポリマー、例えば、アクリルア
ミドまたはアガロース）物質または溶液を含有する天然物質を含まない。好まし
い具体例において、精製されたＧＬＣ１Ａ調製物は、例えば、非−ヒト細胞にお
けるヒトミオシリン蛋白質の組換え発現によって達成することができるように、
ミオシリンがそれから通常は生産される同一動物からのいずれの汚染蛋白質も欠
くであろう。

【０１０６】 １以上の特定のモチーフおよび／またはドメインに、または任意のサイズ、例
えば、少なくとも５、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０アミノ
酸の長さに対応する全長蛋白質または断片は本発明の範囲内である。

【０１０７】 例えば、単離されたミオシリンポリペプチドは配列番号８または１０に表され
たミオシリンポリペプチドに対応するアミノ酸配列の全てまたは一部を含むこと
ができる。ミオシリン蛋白質の単離されたペプチジル部分は、かかるペプチドを
コードする核酸の対応する断片から組換え生産されたペプチドをスクリーニング
することによって得ることができる。加えて、断片は、通常のメリーフィールド
固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学のごとき当該分野で知られた技術を用いて
化学的に合成することができる。例えば、本発明のミオシリンポリペプチドは、
断片の重複のない所望の長さの断片に任意に分割し、あるいは好ましくは所望の
長さの重複する断片に分割することができる。該断片は（組換えによりまたは化
学的合成によって）生産することができ、テストして、野生型（例えば、「真性
」）ミオシリン蛋白質のアゴニストまたはアンタゴニストとして機能することが
できるペプチジル断片を同定することができる。

【０１０８】 本発明のもう１つの態様はミオシリン蛋白質の組換え形態に関する。天然ミオ
シリン蛋白質に加えて、本発明による好ましい組換えポリペプチドは、配列番号
８または１０によって表されるアミノ酸配列と少なくとも９１％、９２％、９３
％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同である。好ま
しい具体例において、本発明のミオシリン蛋白質はミオシリン蛋白質である。特
に好ましい具体例において、ミオシリン蛋白質は配列番号１−７または９の１つ
のコーディング配列を含む。特に好ましい具体例において、ミオシリン蛋白質は
ミオシリン生物活性を有する。

【０１０９】 本発明は、さらに、哺乳動物生物に由来する遺伝子によってコードされた、お
よび配列番号８または１０に表されたミオシリン蛋白質に進化的に関連するアミ
ノ酸配列を有する主題のミオシリンポリペプチドの１つの組換え形態に関する。
かかる組換えミオシリンポリペプチドは、好ましくは、添付の配列表の野生型（
「真性」）ミオシリン蛋白質の少なくとも１つの生物学的活性のアゴニストまた
はアンタゴニストのいずれかの役割の１つで機能することができる。ミオシリン
蛋白質のアミノ酸配列に関し、用語「進化的に関連した」とは、天然に生起した
アミノ酸配列を有する両ポリペプチド、また例えば組合せ突然変異誘発によって
誘導されたミオシリンポリペプチドの突然変異変異体もいう。本発明で好ましい
かかる進化的に誘導されたミオシリンポリペプチドは、ミオシリン生物活性を有
し、配列番号８または１０よりなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも
９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９
％相同である。

【０１１０】 一般に、ミオシリン蛋白質の活性（例えば、「生物活性」）を有するここで言
及されるポリペプチドは、配列番号８または１０で示されるミオシリン蛋白質の
アミノ酸配列の全てまたは一部に対応する（例えば、同一または相同）アミノ酸
配列を有する、および天然に生じるミオシリン蛋白質の生物学的／生化学的活性
の全てまたは一部を模倣しまたはそれに拮抗するポリペプチドと定義される。本
発明によると、ポリペプチドはミオシリン蛋白質の天然に生じる形態の特異的ア
ゴニストまたはアンタゴニストであれば生物学的活性を有する。

【０１１１】 本発明は、さらに、主題のミオシリンポリペプチドを生産する方法に関する。
例えば、主題のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を指令する核
酸ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を、ペプチドの発現が起こるのを
可能とする適当な条件下で培養することができる。細胞を収穫し、溶解させ、蛋
白質を単離することができる。細胞培養は宿主細胞、培地、他の副産物を含有す
る。細胞培養に適した培地は当該分野でよく知られている。組換えミオシリンポ
リペプチドは細胞培養培地、宿主細胞から、またはイオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、およびかかるペプチド
につき特異的な抗体での免疫アフィニティー精製を含めた蛋白質を精製するため
の当該分野で知られた技術を用いて単離することができる。好ましい具体例にお
いて、組換えミオシリンポリペプチドは、ＧＳＴ融合蛋白質またはポリ（Ｈｉｓ
）融合蛋白質のごとき、その精製を促進するドメインを含有する融合蛋白質であ
る。

【０１１２】 さらに、ある条件下では、ミオシリンアゴニスト（ミメティック）またはミオ
シリンアンタゴニストいずれかの１つとして限定された能力で機能して、蛋白質
の天然に生じる形態の生物学的活性のサブセットのみを促進しまたは阻害する主
題のミオシリンポリペプチドの１つのホモログを提供するのが有利であり得るこ
とが一般的に認められるであろう。かくして、限定された機能のホモログでの処
理によって特異的生物学的効果が誘導され得り、ミオシリン蛋白質の天然に生じ
る形態の生物学的活性の全てに指向されるアゴニストまたはアンタゴニストでの
処理に対する副作用は少ない。

【０１１３】 主題のミオシリン蛋白質の各々のホモログは、区別される点突然変異によって
、または切形によってのごとき、突然変異誘発によって創製することができる。
例えば、それが誘導されたミオシリンポリペプチドの生物学的活性と実質的に同
一または単にサブセットを保有するホモログを突然変異は生起させることができ
る。別法として、ミオシリン蛋白質を含む、生化学的経路の下流または上流メン
バーの競合的に結合することによるごとく、蛋白質の天然に生じる形態の機能を
阻害することができる蛋白質のアンタゴニスト形態を創製することができる。加
えて、構成的に活性である蛋白質のアゴニスト形態を創製することができる。か
くして、ヒトミオシリン蛋白質および本発明によって供されたそのホモログは遺
伝子発現の正または負のレギュレーターのいずれかであり得る。

【０１１４】 また、本発明の組換えミオシリンポリペプチドは、例えば、ユビキチン化また
は蛋白質と会合した他の酵素的標的化を改変する突然変異による、蛋白質分解切
断に抵抗性である蛋白質のバージョンのごとき、真性ミオシリン蛋白質のホモロ
グを含む。

【０１１５】 また、グリコシル基、脂質、ホスフェート、アセチル基等のごとき、他の化学
部位との共有結合または凝集コンジュゲートを形成することによって、ミオシリ
ンポリペプチドを化学的に修飾して、誘導体を創製することもできる。ミオシリ
ン蛋白質の共有結合誘導体は、蛋白質のアミノ酸側鎖の官能基またはポリペプチ
ドのＮ−末端またはＣ−末端に化学的部位を連結することによって調製すること
ができる。

【０１１６】 主題のミオシリンポリペプチドの構造の修飾は、治療的または予防的効果、安
定性（例えば、エクス・ビボ寿命およびイン・ビボでの蛋白質分解に対する抵抗
性）、または（例えば、蛋白質のリン酸化パターンを改変するための）翻訳後修
飾を増強する目的であり得る。かかる修飾されたペプチドは、蛋白質の天然に生
じる形態の少なくとも１つの活性を保持し、またはその特異的アンタゴニストを
生じるように設計すると、本明細書で詳細に記載されるミオシリンポリペプチド
の機能的同等体であると考えられる。かかる修飾されたペプチドは、例えば、ア
ミノ酸置換、欠失または付加によって生産することができる。

【０１１７】 例えば、イソロイシンまたはバリンでのロイシンの、グルタメートでのアスパ
ルテートの、セリンでのスレオニンの単離された置き換え、または構造的に関連
するアミノ酸でのアミノ酸の同様の置き換え（すなわち、等電子および／または
等電子的突然変異）が得られた分子の生物学的活性に対する主要効果を有しない
であろうことを予測するのは合理的である。保存的置換は、その側鎖に関連する
アミノ酸のファミリー内で起こるものである。遺伝子的にコードされるアミノ酸
は、ファミリーに分類される：（１）酸性＝アスパルテート、グルタメート；（
２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリ
ン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリ
プトファン、および（４）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、
システイン、セリン、スレオニン、チロシン。同様に、アミノ酸レパートリーは
（１）酸性＝アスパルテート、グルタメート；（２）塩基性＝リシン、アルギニ
ン、ヒスチジン、（３）脂肪族＝グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソ
ロイシン、セリン、スレオニン（セリンおよびスレオニンは所望により脂肪族−
ヒドロキシルとして別に分類することができる）；（４）芳香族＝フェニルアラ
ニン、チロシン、トリプトファン；（５）アミド＝アスパラギン、グルタミン；
および（６）硫黄−含有＝システインおよびメチオニンとして分類することがで
きる（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， 第２版， Ｌ． Ｓｔｒｅｙｅｒ
， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．編：１９８１）。ペプチドのアミノ
酸配列の変化の結果、機能的ミオシリンホモログが得られるか（例えば、得られ
たポリペプチドが野生型形態を模倣するまたはそれに拮抗するという意味で機能
的）は、野生型蛋白質と同様に細胞における応答を生じる、またはかかる応答を
完全に阻害する変異体ペプチドの能力を評価することによって容易に決定するこ
とができる。１を超える置換が起こるポリペプチドは容易に同様にテストするこ
とができる。

【０１１８】 本発明では、さらに、主題のミオシリン蛋白質ならびに切形突然変異体の組合
せ突然変異体の組を創製する方法が考えられ、それは遺伝子発現を変調するにお
いて機能的である可能な変異体配列（例えば、ホモログ）を同定するのに特に有
用である。かかる組合せライブラリ−をスクリーニングする目的は、例えば、ア
ゴニストまたはアンタゴニストいずれかとして作用できる、あるいは別法として
新規活性を全て一緒に保有する新規ミオシリンホモログを創製することである。

【０１１９】 同様に、ミオシリンホモログは、選択的に遺伝子発現を阻害する現在の組合せ
アプローチによって創製することができる。例えば、突然変異誘発は、他のシグ
ナル経路蛋白質（またはＤＮＡ）に結合するが、なおシグナルの増殖を妨げるこ
とができるミオシリンホモログを提供することができ、例えば、該ホモログは優
性陰性突然変異体であり得る。さらに、本発明によるミオシリンのある種のドメ
インの操作は融合蛋白質で使用するのにより適したドメインを提供することがで
きる。

【０１２０】 １つの具体例において、変異体の変化したライブラリ−は核酸レベルの組合せ
突然変異体によって創製され、変化した遺伝子ライブラリ−によってコードされ
る。例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、可能なＧＬＣ１Ａ配列の縮重
組が個々のポリペプチドとして、あるいはＧＬＣ１Ａ配列の組をその中に含有す
る（例えば、ファージ提示のための）より大きな融合蛋白質の組として発現でき
るように、遺伝子配列に酵素的に連結することができる。

【０１２１】 可能なミオシリンホモログのライブラリ−が縮重オリゴヌクレオチド配列から
創製することができる多くの方法がある。縮重遺伝子配列の化学的合成は自動Ｄ
ＮＡ合成器で行うことができ、次いで、合成遺伝子を適当な発現ベクターに連結
することができる。遺伝子の縮重組の目的は、１つの混合物において、可能なミ
オシリン配列の所望の組をコードする配列の全てを供することである。縮重オリ
ゴヌクレオチドの合成は当該分野でよく知られている（例えば、Ｎａｒａｎｇ，
ＳＡ（１９８３） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３； Ｉｔａｋｕｒａら
， （１９８１） Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｐｒｏｃ ３ｒｄ Ｃｌ
ｅｖｅｌａｎｄ Ｓｙｍｐｏｓ． Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ＡＧ Ｗ
ａｌｔｏｎ編， アムステルダム：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ２７３−２８９頁；Ｉｔ
ａｋｕｒａら（１９８４） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５３：
３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４） Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６；
Ｉｋｅら（１９８３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １１：４７７参
照）。かかる技術は他の蛋白質の指向された進化で使用されてきた（例えば、Ｓ
ｃｏｔｔら（１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０； Ｒｏｂ
ｅｒｔｓら（１９９２） ＰＮＡＳ ８９：２４２９−２４３３； Ｄｅｖｌｉ
ｎら （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６；Ｃｗiｒｌａ ら（１９９０） ＰＮＡＳ ８７：６３７８−６３８２；ならびに米国特許出願
第５，２２３，４０９号、第５，１８７，３４６号および第５，０９６，８１５
号参照）。

【０１２２】 同様に、コーディング配列断片のライブラリ−は、スクリーニングおよび生物
活性断片の引き続いての選択のためのミオシリン断片の変化した集団を創製する
ためのＧＬＣ１Ａクローンを提供することができる。化学合成を含めた、かかる
ライブラリ−を創製するために種々の技術が当該分野で知られている。１つの具
体例において、（ｉ）ニッキングが分子当たり約１回のみ起こる条件下で、ＧＬ
Ｃ１Ａコーディング配列の二本鎖標準ＰＣＲ断片をヌクレアーゼで処理し、（ｉ
ｉ）二本鎖標準ＤＮＡを変性し、（ｉｉｉ）該ＤＮＡを再生して異なるニックト
産物からセンス／アンチセンス対を含むことができる二本鎖標準ＤＮＡを形成さ
せ、（ｉｖ）Ｓ１ヌクレアーゼでの処理によって再形成デュプレックスから一本
鎖標準部分を除去し、次いで（ｖ）得られた断片ライブラリ−を発現ベクターに
連結することによってコーディング配列断片のライブラリ−を創製することがで
きる。この例示的方法によって、種々のサイズのＮ−末端、Ｃ−末端および内部
断片をコードする発現ライブラリ−を誘導することができる。

【０１２３】 点突然変異または切形によって作成された組合せライブラリ−の遺伝子産物を
スクリーニングし、ある特性を有する遺伝子産物についてのｃＤＮＡライブラリ
−をスクリーニングするための広い範囲の技術が当該分野で知られている。かか
る技術は、一般に、ＧＬＣ１Ａホモログの組合せ突然変異誘発によって創製され
た遺伝子ライブラリ−の迅速なスクリーニングに適合するであろう。大きな遺伝
子ライブラリ−をスクリーニングするための最も広く使用される技術は、典型的
には、遺伝子ライブラリ−を複製可能な発現ベクターにクローニングし、適当な
細胞を得られたベクターのライブラリ−で形質転換し、次いで、所望の活性の検
出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離を
促進する条件下で組合せ遺伝子を発現させることを含む。後記する例示的アッセ
イの各々は、組合せ突然変異誘発技術によって創製された多数の縮重ＧＬＣ１Ａ
配列をスクリーニングするのに必要な高スループット分析に使用することができ
る。組合せ突然変異誘発は、例えば、１０^２６分子のオーダーの突然変異体蛋白
質の非常に大きなライブラリ−を創製する能力を有する。このサイズの組合せラ
イブラリ−は、高スループットスクリーニングアッセイでスクリーニングするこ
とを技術的に挑戦している。この問題を克服するために、新しい技術、レクルシ
ブアンサンブル突然変異体（ＲＥＭ）が最近開発され、これは、ランダムにおい
て非常に高い割合の非機能的蛋白質を回避し、機能的蛋白質の頻度を単に増強さ
せ、かくして、配列スペースの有用なサンプリングを達成するのに必要な複雑性
を減少させる。ＲＥＭは、適当な選択またはスクリーニング方法が使用される場
合に、ライブラリ−中の機能的突然変異体の頻度を増強させるアルゴリズムであ
る（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ， １９９２， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９
：７８１１−７８１５；Ｙｏｕｒｖａｎら， １９９２， Ｐａｒａｌｌｅｌ
Ｐｒｏｂｌｅｍ Ｓｏｌｖｉｎｇ ｆｒｏｍ Ｎａｔｕｒｅ， ２， Ｉｎ Ｍ
ａｎｎｅｒｌ ａｎｄ Ｍａｎｄｅｒｉｃｋ編， Ｅｌｓｅｖｉｒ Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， アムステルダム，４０１−４１０頁；Ｄｅｌｇｒａｖｅ
ら， １９９３， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（３）：３２
７−３３１）。

【０１２４】 また、本発明は、本発明の哺乳動物ミオシリンポリペプチドの上流または下流
成分との結合を破壊することができるミメティックス、例えば、ペプチドまたは
非ペプチド剤を創製するミオシリン蛋白質の減少を提供する。かくして、前記し
たかかる突然変異誘発は、例えば、それによって正にまたは負に調節されるかを
問わず、（その活性のアクチベーターおよびリプレッサー双方を含めた）上流で
機能できる蛋白質への、またはミオシリンポリペプチドの下流で機能できる蛋白
質または核酸への主題のミオシリンポリペプチドの結合に関与する蛋白質−蛋白
質相互作用に参画するミオシリン蛋白質の決定基をマップするのにも有用である
。説明すると、ミオシリンの上流または下流成分の分子認識に関与する主題のミ
オシリンポリペプチドの臨界的残基は決定でき、それを使用して真性ミオシリン
蛋白質のその部位への結合を競合的に阻害するミオシリン−由来ペプチドミメテ
ィックスを創製することができる。たとえば、他の細胞外蛋白質の結合に関与す
る主題のミオシリン蛋白質の各々のアミノ酸残基をマップするためのスキャンニ
ング突然変異誘発を使用することによって、相互作用を促進するミオシリン蛋白
質の残基を模倣するペプチドミメティックス化合物を創製することができる。次
いで、ミメティックスを用いて、ミメティックス蛋白質の正常機能と相互作用さ
せることができる。例えば、かかる残基の非加水分解正ペプチドアナログは、ベ
ンゼジアゼピン（例えば、Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒら， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇ．Ｒ． Ｍａｒｓｈａｌｌ編，
ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ、１９８８参照）
、アゼピン（例えば、Ｈｕｆｆｍａｎら， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇ．Ｒ． Ｍａｒｓｈａｌｌ編， ＥＳＣＯ
Ｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｎ，オランダ，１９８８）、置換されたガン
マラクタム環（Ｇａｒｖｅｙら， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａ
ｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，， Ｇ．Ｒ． Ｍａｒｓｈａｌｌ編，ＥＳＣＯＭ Ｐｕ
ｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ、１９８８）、ケト−メチレンペプチ
ドミメティックス（Ｅｗｅｎｓｏｎら（１９８６） Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ
． ２９：２９５；およびＥｗｅｎｓｏｎら， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔｒｕｃ
ｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ （Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈ
ｅ ９ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ） Ｐｉ
ｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． Ｒｏｃｋｌａｎｄ， ＩＬ， １９８５
）、β−ターンジペプチドコア（Ｎａｇａｉら（１９８５） Ｔｅｔｒａｈｅｄ
ｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２６：６４７；およびＳａｔｏら（１９８６） Ｊ Ｃｈｅ
ｍ Ｓｏｉ Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ １：１２３１）、ｂ−アミノアルコ−
ル（Ｇｏｒｄｏｎら、（１９８５） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ
． Ｃｏｍｍｕｎ． １２６：４１９；およびＤａｎｎら（１９８６） Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １３４：７１）を用いて創
製することができる。

【０１２５】 ４．４．１ 組換えミオシリンポリペプチドを発現する細胞 また、本発明は、主題のミオシリンポリペプチドの組換え形態を発現するため
にトランスフェクトした宿主細胞に関する。該宿主細胞は原核生物または真核生
物細胞であってよい。かくして、全長蛋白質の全部または選択された部分をコー
ドする、ミオシリン蛋白質のクローニングに由来するヌクレオチド配列を用いて
、微生物または真核生物細胞プロセスを介してミオシリンポリペプチドの組換え
形態を生成させることができる。発現ベクターのごとく、ポリヌクレオチド配列
を遺伝子構築体に連結し、次いで、真核生物（酵母、鳥類、昆虫または哺乳動物
）または原核生物（細菌）細胞いずれかの宿主に形質転換またはトランスフェク
トすることは、他のよく知られた蛋白質、例えば、ＭＡＰキナーゼ、５３頁、Ｗ
Ｔ１、ＰＴＰホスフォターゼ、ＳＲＣ等を生産するのに使用される標準的手法で
ある。同様の手法、またはその修飾を使用して、主題の発現に関して微生物手段
または組織−培養技術によって組換えミオシリンポリペプチドを調製することが
できる。

【０１２６】 組換えＧＬＣ１Ａ遺伝子は、ミオシリン蛋白質またはその一部をコードする核
酸を、原核生物細胞、真核生物細胞、または双方での発現に適したベクターに連
結することによって生産することができる。主題のミオシリンポリペプチドの組
換え形態の生産のための発現ベクターはプラスミドおよび他のベクターを含む。
例えば、ミオシリンポリペプチドの発現に適したベクターは、タイプ：Ｅ． ｃ
ｏｌｉのごとき原核生物細胞での発現のためのｐＢＲ３２２−由来プラスミド、
ｐＥＭＢＬ−由来プラスミド、ｐＥＸ−由来プラスミド、ｐＢＴａｃ−由来プラ
スミドおよびｐＵＣ−由来プラスミドのプラスミドを含む。

【０１２７】 酵母にて組換え蛋白質の発現のための多数のベクターが存在する。例えば、Ｙ
ＥＰ２４、ＹＩＰ５、ＹＥＰ５１、ＹＥＰ５２、ｐＹＥＳ２、およびＹＲＰ１７
は、遺伝子構築体をＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに導入するのに有用なクローニ
ングおよび発現ベクターである（例えば、Ｂｒｏａｃｈら （１９８３） Ｅｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ； Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ編， Ｍ． Ｉｎｏｕｙｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，
８３頁参照，これは出典明示して本明細書の一部とみなす）。これらのベクター
は、ｐＢＲ３２２起点の存在のためＥ．ｃｏｌｉで、および酵母２ミクロンプラ
スミドの複製決定基のためＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで複製することができる
。加えて、アンピシリンのごとき薬物抵抗性マーカーを用いることができる。例
示的具体例において、ミオシリンポリペプチドは、配列番号１−７または９で表
されるＧＬＣ１Ａの１つのコーディング配列をサブクローニングすることによっ
て発現ベクターを利用して組換えにより生産される。

【０１２８】 好ましい哺乳動物発現ベクターは、細菌中でのベクターの増殖を促進するため
の原核生物配列、および真核生物細胞で発現される１以上の真核生物転写単位を
共に含有する。ｐｃＤＮＡＩａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐ
ＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴＫ２、ｐＲＳＶｎｅ
ｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来のベクターは真
核生物細胞のトランスフェクションに適した哺乳動物発現ベクターの例である。
これらのベクターのいくつかはｐＢＲ３２２のごとき細菌プラスミドからの配列
で修飾して、原核生物および真核生物細胞双方において複製および薬物抵抗性を
促進する。別法として、ウシ・パピローマ（ＢＰＶ−１）、またはエプステイン
−バールウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ−由来ｐ２０５）のごときウイルスの
誘導体を、真核生物細胞における蛋白質の一過性発現で使用することができる。
プラスミドの調製および宿主生物の形質転換で使用される種々の方法は当該分野
でよく知られている。原核生物および真核生物細胞双方での他の適当な発現系、
ならびに一般的組換え手法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， Ｓａｍｂｒｏｏｋ，
ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９）， 第１６および１７章
参照。

【０１２９】 いくつかの例において、バクロウイルス発現系の使用によって組換えミオシリ
ンポリペプチドを発現させるのが望ましいであろう。かかるバクロウイルス発現
系の例は（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１のごとき）ｐＶ
Ｌ−由来ベクター、（ｐＡｃＵＷ１のごとき）ｐＡｃＵＷ−由来ベクター、およ
び（β−ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃ のごとき）ｐＢｌｕｅＢａｃ−由来ベ クターを含む。

【０１３０】 Ｎ−末端の一部を欠く形態、すなわち、シグナルペプチドを欠く切形突然変異
体のごとき、ミオシリン蛋白質の一部のみを発現するのが望ましい場合、発現さ
せるべき所望の配列を含有するオリゴヌクレオチド断片に開始コドン（ＡＴＧ）
を付加するのが必要であろう。Ｎ−末端位置におけるメチオニンは、酵素メチオ
ニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）の使用によって酵素的に切断することができ
ることが当該分野で良く知られている。ＭＡＰはＥ． ｃｏｌｉ（Ｂｅｎ−Ｂａ
ｓｓａｔら （１９８７） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６９：７５１−７
５７）およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍからクローン化さ
れており、そのイン・ビトロ活性は組換え蛋白質で証明されている（Ｍｉｌｌｅ
ｒ５（１９８７） ＰＮＡＳ ８４：２７１８−１７２２）。従って、Ｎ−末端
メチオニンの除去は、所望ならば、ＭＡＰを生産する宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌ
ｉまたはＣＭ８９またはＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においてミオシリン−由
来ポリペプチドをイン・ビボで発現させることによって、精製されたＭＡＰのイ
ン・ビトロ使用によって（例えば、Ｍｉｌｌｅｒら，前掲の手法）によって達成
することができる。

【０１３１】 他の具体例において、後記でより詳細に記載されたトランスジェニック動物を
組換え蛋白質を生産するのに使用することができる。

【０１３２】 ４．４．２ 融合蛋白質および免疫原 もう１つの具体例において、ポリペプチドについてのコーディング配列は、異
なるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含めた融合遺伝子の一部とし
て取り込むことができる。このタイプの発現系は、ミオシリン蛋白質の免疫原性
断片を生産するのが望ましい条件下で有用であり得る。例えば、ロタウイルスの
ＶＰ６キャプシド蛋白質は、モノマー形態またはウイルス粒子の形態いずれかで
、ミオシリンポリペプチドの一部についての免疫学的担体として使用することが
できる。抗体がそれに対して生起される主題のミオシリンの一部に対応する核酸
配列を、ビリオンの一部としてのミオシリンエピトープを含む融合蛋白質を発現
する組換えウイルスの組を生産するのに後記ワクシニアウイルス構造蛋白質につ
いてのコーディング配列を含む融合遺伝子構築体に取り込むことができる。Ｂ型
肝炎表面抗原を利用する免疫原性融合蛋白質の使用により、組換え肝炎Ｂビリオ
ンにつき融合蛋白質を同様にこの役割で利用することができることが証明されて
いる。同様に、ミオシリン蛋白質およびプロウイルスキャプシド蛋白質の一部を
含有する融合蛋白質につきコードするキメラ構築体を創製して、ポリペプチド抗
原の組の免疫原性を増強することができる（例えば、ＥＰ公開番号：０２５１４
９；およびＥｖａｎｓら（１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３８５；Ｈｕａ
ｎｇら（１９８８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：３８５５；およびＳｃｈｌｉ
ｅｎｇｅｒら（１９９２） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６：２参照）。

【０１３３】 ペプチド−ベースの免疫化についての多重抗原ペプチドもまた免疫原を創製す
るのに利用することができ、ここに、ミオシリンポリペプチドの所望の一部は、
オリゴマー分岐リシンコアへのペプチドの有機化学合成から直接的に得られる（
例えば、Ｐｏｓｎｅｔｔら（１９８８） ＪＢＣ ２６３：１７１９およびＮａ
ｒｄｅｌｌｉら（１９９２） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：９１４参照）
。また、ミオシリン蛋白質の抗原決定基を細菌細胞によって発現させ、提示する
ことができる。

【０１３４】 免疫原性を増強するために融合蛋白質を利用するに加えて、融合蛋白質は蛋白
質の発現を促進することができ、従って、本発明のミオシリンポリペプチドの発
現で使用することができることが広く認められている。例えば、ミオシリンポリ
ペプチドはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ−融合）蛋白質とし
て創製することができる。かかるＧＳＴ−融合蛋白質は、例えば、グルタチオン
−誘導体化マトリックスの使用によってミオシリンポリペプチドの精製を容易と
することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｂｅｌら編（Ｎ．Ｙ．： Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９１）参照）。

【０１３５】 もう１つの具体例において、組換え蛋白質の所望の部分のＮ−末端のポリ−（
Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位配列のごとき、精製リーダー配列につきコ
ードする融合遺伝子は、Ｎｉ２＋金属樹脂を用いるアフィニティークロマトグラ
フィーによる発現された融合蛋白質の精製を可能とする。次いで、精製リーダー
配列を、引き続いて、精製蛋白質を生成させるためのエンテロキナーゼでの処理
によって除去することができる（例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉら（１９８７） Ｊ．
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１１：１７７；およびＪａｎｋｎｅｃｈｔ
ら ＰＮＡＳ ８８：８９７２参照）。融合遺伝子を作成するための技術は当業
者に公知である。本質的には、異なるポリペプチド配列につきコードする種々の
ＤＮＡ断片の接合は、連結のための平滑末端またはスタガー−末端、適切な末端
を生じさせるための制限酵素消化、適当には粘着末端を満たすこと、望ましくな
い接合を回避するためのアルカリ性ホスファターゼ処理、および酵素連結を使用
する、通常の技術により行われる。もう１つの具体例において、融合遺伝子は、
自動ＤＮＡ合成器を含めた通常の技術によって合成することができる。別法とし
て、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、引き続いて、アニールしてキメラ遺伝子配列を
創製することができる２つの連続遺伝子断片の間に相補的突出を生起するアンカ
ープライマーを用いて行うことができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏ
ｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌら編
， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：１９９２参照）。

【０１３６】 ４．４．３ 抗体 本発明のもう１つの態様は、ミオシリン蛋白質と特異的に反応性である、抗体
またはその結合断片に関する。例えば、ｃＤＮＡ配列に基づき、ミオシリン蛋白
質に由来する免疫原を用いることによって、抗−蛋白質／抗−ペプチド抗血清ま
たはモノクローナル抗体は標準的なプロトコルによって作成することができる（
例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐ
ｒｅｓｓ：１９８８）。マウス、ハムスターまたはウサギのごとき哺乳動物をペ
プチドの免疫原性形態（例えば、ミオシリンポリペプチドまたは抗体応答を惹起
することができる抗原断片、または前記した融合蛋白質）で免疫化することがで
きる。蛋白質またはペプチドに免疫原性を付与する技術は、担体へのコンジュゲ
ーションまたは当該分野でよく知られた他の技術を含む。ミオシリン蛋白質の免
疫原性部分をアジュバントの存在下で投与することができる。免疫化の進行は、
血漿または血清中での抗体力価の検出によってモニターすることができる。標準
的なＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイを抗原としての免疫原と共に用いて抗
体のレベルを評価することができる。好ましい具体例において、主題の抗体は、
哺乳動物のミオシリン蛋白質の抗原決定基、例えば、配列番号２によって表され
る蛋白質の抗原決定基または密接に関連するホモログ（例えば、少なくとも９２
％相同、より好ましくは少なくとも９４％相同）に免疫特異的である。

【０１３７】 ミオシリンポリペプチドの抗原調製での動物の免疫化に続き、抗−ミオシリン
抗血清を得ることができ、所望ならば、ポリクローナル抗−ミオシリン抗体を血
清から単離することができる。モノクローナル抗体を生産するには、抗体−産生
細胞（リンパ球）を免疫化動物から収穫することができ、ハイブリドーマ細胞を
得るための骨髄腫細胞のごとき死滅化細胞での標準的な体細胞融合手法によって
融合することができる。かかる技術は当該分野でよく知られており、例えば、（
元来ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ， （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ，
２５６：４９５−４９７によって開発された）ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞
ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂａｒら（１９８３） Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔ
ｏｄａｙ， ４：７２）、ヒトモノクローナル抗体を生産するためのＥＢＶ−ハ
イブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら， （１９８５） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ．
Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ７７−９６頁）を含む。ハイブリドーマ細胞を、本
発明のミオシリンポリペプチドと特異的に反応性である抗体の生産につき免疫化
学的にスクリーニングし、かかるハイブリドーマ細胞を含む培養からモノクロー
ナル抗体を単離することができる。

【０１３８】 本明細書で用いる用語抗体は、主題の哺乳動物ミオシリンポリペプチドの１つ
と特異的に反応性であるその断片を含ませる意図である。従来技術を用いて抗体
を断片化し、断片を全抗体につき前記したのと同様に利用性につきスクリーニン
グすることができる。例えば、ペプシンで抗体を処理することでＦ（ａｂ）２断
片を創製することができる。Ｆ（ａｂ）２断片を処理してジスルフィド架橋を減
少させてＦａｂ断片を得ることができる。本発明の抗体は、さらに、抗体の少な
くとも１つのＣＤＲ領域によって付与されたミオシリン蛋白質に対する親和性を
有するジ特異的およびキメラ分子を含ませる意図である。

【０１３９】 ミオシリンエピトープに特異的に結合する抗体を組織試料の免疫化学的染色で
用いて、主題のミオシリンポリペプチドの各々の発現の豊富さおよびパターンを
評価することもできる。免疫−沈殿およびイムノブロッティングで抗−ミオシリ
ン抗体を診断的に用いて、臨床試験手法の一部として組織におけるミオシリン蛋
白質レベルを検出し、評価することができる。例えば、かかる測定は、増殖障害
の開始または進行の予測的評価で有用であり得る。同様に、個体におけるミオシ
リン蛋白質レベルをモニターする能力は、かかる障害に罹った個体のための所与
の治療法の効率の測定を可能とすることができる。ミオシリンポリペプチドのレ
ベルは、大脳脊髄体液または羊膜体液の試料中のごとき、体液中の細胞から測定
することができ、あるいはバイオプシーによって生産されるごとく、組織中で測
定することができる。抗−ミオシリン抗体を用いる診断アッセイは、例えば、変
性障害、特に誕生時に発現されるものの初期診断を助けるように設計されたイム
ノアッセイを含むことができる。また、抗−ミオシリンポリペプチド抗体を用い
る診断アッセイは、初期診断および表現型真性物または過形成障害で助けるよう
に設計されたイムノアッセイを含むことができる。

【０１４０】 本発明の抗−ミオシリン抗体のもう１つの適用は、ｇｔｌｌ、ｇｔ１８−２３
、ＺＡＰ、およびＯＲＦ８のごとき発現ベクターで構築されたｃＤＮＡライブラ
リーの免疫学的スクリーニングにおけるものである。正しいリーディングフレー
ムおよび向きに挿入されたコーディング配列を有するこのタイプのメツセンジャ
ーライブラリーは融合蛋白質を生産することができる。例えば、ｇｔｌｌは、そ
のアミノ酸がβ−ガラクトシダーゼアミノ酸配列よりなり、そのカルボキシ末端
が外来性ポリペプチドよりなる融合蛋白質を生産するであろう。ミオシリン蛋白
質の抗原エピトープ、例えば、特定のミオシリン蛋白質の他のオルソログまたは
同一種からのパラログを、次いで、例えば、感染プレートからリフトされたニト
ロセルロースフィルターを抗−ミオシリン抗体と反応させるものとして、抗体で
検出することができる。このアッセイによって検出された陽性ファージを、次い
で、感染プレートから単離することができる。かくして、ミオシリンホモログの
存在を検出し、ヒトからの（スプライシング変異体を含めた）別のイソ形態がそ
うできるように、他の動物からクローン化することができる。

【０１４１】 ４．５ トランスジェニック動物 本発明は、さらに、種々の目的で用いて、例えば、ミオシリン治療剤を同定す
ることができるトランスジェニック動物を提供する。本発明のトランスジェニッ
ク動物は、ＧＬＣｌＡプロモーターの制御下にある、または異種プロモーターの
制御下にある、異種ＧＬＣｌＡ遺伝子またはその断片を含有する非ヒト動物を含
む。従って、本発明のトランスジェニック動物は、野生型ミオシリン蛋白質もし
くはその断片、またはその突然変異体および多形変異体を含めたその変異体をコ
ードするトランスジーンを発現する動物であり得る。かかる動物は、例えば、多
形差異のごとき、配列番号８または１０に記載された配列からのミオシリン蛋白
質のアミノ酸配列の差異の効果を測定するのに使用できる。また、これらの動物
を用いて、特異的部位におけるミオシリン蛋白質の発現の効果を測定し、または
ミオシリン治療剤を同定し、またはイン・ビボでその活性を確認するために使用
することもできる。

【０１４２】 トランスジェニック動物は、ＧＬＣｌＡプロモーターまたはその断片の制御下
にある、レポーター遺伝子のごとき、トランスジーンを含有する動物でもあり得
る。これらの動物は、例えば、ＧＬＣｌＡ遺伝子発現を変調することによるごと
く、ミオシリンの生産を変調する薬物を同定するのに有用である。ＧＬＣｌＡ遺
伝子プロモーターは、例えば、ＧＬＣｌＡ ｃＤＮＡ断片でゲノムライブラリー
をスクリーニングすることによって単離し、当該分野で公知の方法に準じて特徴
付けすることができる。本発明の好ましい具体例において、該ＧＬＣｌＡ遺伝子
を含有するトランスジェニック動物を用いて、ＧＬＣｌＡ発現を変調するその能
力につきステロイドホルモンとして知られている生物活性分子のクラスをスクリ
ーニングする。

【０１４３】 本発明の範囲内にあるさらに他の非ヒト動物は、内因性ＧＬＣｌＡ遺伝子の発
現が突然変異されたまたは「ノックアウトされた」ものを含む。「ノックアウト
」動物は、特定の遺伝子または遺伝子類のホモ接合またはヘテロ接合を担うもの
である。これらの動物を用いて、ＧＬＣｌＡの不存在の結果、特定の表現型が得
られるか否か、特にこれらのマウスが心臓病または癌に対する高い感受性のごと
き、特異的病気を有するか、または発症するようであるかを判断することができ
る。さらに、これらの動物は、後記で概説するごとくＧＬＣｌＡ遺伝子の突然変
異に起因する疾患を軽減しまたは緩和する薬物におけるスクーニングで有用であ
る。また、これらの動物は、ＧＬＣｌＡ遺伝子における、特異的アミノ酸差異、
または対立遺伝子変異の効果を測定するのにも有用である。すなわち、ＧＬＣｌ
Ａノックアウト動物は、例えば、ＧＬＣｌＡの突然変異形態または対立遺伝子変
異体を発現するトランスジェニック動物と交差させることができ、かくして、野
生型ミオシリン蛋白質ではなく突然変異蛋白質のみを発現する動物が得られる。

【０１４４】 トランスジェニックおよびノックアウトされた非ヒト動物を得るための方法は
当該分野でよく知られている。ノックアウトマウスは、ノックアウトされるべき
遺伝子をコードするマウス胚幹細胞染色体に「ノックアウト」構築体を相同組込
することによって創製される。１つの具体例において、動物のゲノムを修飾する
ための相同組換えを用いる方法である遺伝子標的化を用いて、培養された胚幹細
胞に変化を導入することができる。注目するＧＬＣｌＡ遺伝子をＥＳ細胞に標的
化することによって、これらの変化を動物の生殖系に導入してキメラを創製する
ことができる。遺伝子標的化は、組織培養細胞に、標的ＧＬＣｌＡ遺伝子座に相
同なセグメントを含み、ＧＬＣｌＡゲノム配列に対する意図した配列修飾（例え
ば、挿入、欠失、点突然変異）を含むＤＮＡ標的化構築体を導入することによっ
て達成される。次いで、処理された細胞を正確な標的化につきスクリーニングし
て、適切に標的化されたものを同一し単離する。

【０１４５】 胚幹細胞における遺伝子標的化は、事実、１以上のＧＬＣｌＡゲノム配列での
相同組換えを受けるように節敬された標的化トランスジーン構築体の使用を介し
てＧＬＣｌＡ遺伝子機能を破壊するための手段として本発明では考えられるスキ
ームである。標準化構築体はＧＬＣｌＡ遺伝子のエレメントでの組換えに際して
、陽性選択マーカーが遺伝子のコーディング配列に挿入される（または置き換え
られる）ように並べられる。挿入された配列は、陽性選択特性を供しつつ、ＧＬ
ＣｌＡ遺伝子を機能的に破壊する。例示的ＧＬＣｌＡ標的化構築体は後記で詳細
に記載する。

【０１４６】 一般に、ノックアウト動物を生産するのに使用される胚幹細胞（ＥＳ細胞）は
、創製すべきノックアウト動物と同一の種のものであろう。かくして、例えば、
マウス胚幹細胞は、通常、ノックアウトマウスの創製で使用されるであろう。

【０１４７】 胚幹細胞は、Ｄｏｅｔｃｈｍａｎら（１９８５）Ｊ． Ｅｍｂｒｙｏｌ． Ｅ
ｘｐ． ８７：２７−４５）によって記載されているもののごとき当業者によく
知られた方法を用いて創製され維持される。しかしながら、いずれのＥＳ細胞系
を用いることもでき、選択された系は、典型的には、発生する胚の生殖系に取り
込み、その一部となって、ノックアウト構築体の生殖系伝達を創製する細胞の能
力につき選択される。かくして、この能力を有すると考えられるいずれのＥＳ細
胞系もここで使用に適する。典型的には、ＥＳ細胞の生産で使用される１つのマ
ウス株は１２９Ｊ株である。もう１つの好ましいＥＳ細胞系はネズミ細胞系Ｄ３
である（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
， カタログ番号ＣＫＬ １９３４）。さらにもう１つの好ましいＥＳ細胞系は
ＷＷ６細胞系である（Ｉｏｆｆｅら（１９９５） ＰＮＡＳ ９２：７３５７−
７３６１）。Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ
Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｅ
． Ｊ． Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， ワシントンＤ．Ｃ
．［１９８７］）においてＲｏｂｅｒｔｓｏｎにより；Ｂｒａｄｌｅｙら（１９
８６） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｄｅｖｅｌ． Ｂｉｏｌ． ２
０：３５７−３７１）により；およびＨｏｇａｎら（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ
ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒ
ｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ［１９８６］）によ
り記載されているもののごとき、当業者によく知られた方法を用いてノックアウ
ト構築体挿入のために細胞を培養し調製される。

【０１４８】 ノックアウト構築体とは、幹細胞系に導入され、突然変異させるべき注目する
遺伝子の染色体遺伝子座においてゲノムと組み換えることを可能とする核酸のユ
ニークに配置された断片をいう。かくして、所与のノックアウト構築体は、破壊
のために標的化されるべき所与の遺伝子に特異的である。それらも拘わらず、多
くの共通するエレメントがこれらの構築体の間に存在し、これらのエレメントは
当該分野でよく知られている。典型的なノックアウト構築体は、突然変異させる
べき遺伝子をコードするゲノム遺伝子座の５’および３’末端双方からの約０．
５ｋｂ以上１０．０ｋｂ以下の核酸断片を含有する。これらの２つの断片は、ネ
オマイシン抵抗性遺伝子（ｎｅｏ^Ｒ）のごとき陽性選択マーカーをコードする核
酸の介入断片によって分離される。注目するゲノム遺伝子座の極３’末端から核
酸に連結された陽性選択マ−カ−をコ−ドする核酸に連結されたゲノム遺伝子座
の極５’末端からの核酸よりなる、得られた核酸断片は、ノックアウトされるべ
きＧＬＣｌＡについてのコーディング配列または注目する他の遺伝子のほとんど
を省く。得られた構築体をこの遺伝子座において染色体と相同的に組み換えると
、その結果、ゲノム遺伝子座から、構造遺伝子として知られた省略されたコーデ
ィング配列が喪失する。かかる稀な相同組換え事象が起こった幹細胞は、陽性選
択マーカーをコードする遺伝子の核酸のゲノムへの安定な組込、および続いての
適当な薬物（本例ではネオマイシン）の存在下でマーカー遺伝子を発現する細胞
についての選択によって選択することができる。この塩基技術に対する変形が存
在し、当該分野でよく知られている。例えば、「ノックイン」構築体とは、３’
ゲノム遺伝子座断片をコードする核酸に連結されるが、コーディング配列のいず
れも省略されず、かくして、使用された５’および３’ゲノム断片が、陽性選択
マーカー遺伝子をコードする核酸の導入によって破壊される前にまず連続した点
で異なる陽性選択マーカーをコードする核酸に連結した５’ゲノム遺伝子座断片
をコードする核酸の同一塩基配置をいう。この「ノックイン」タイプの構築体は
、かくして、シグナルエクソンのごとき、突然変異させるべき遺伝子のゲノム遺
伝子座の限定された領域のみがクローニングおよび遺伝子操作で利用できる場合
、突然変異トランスジェニック動物の構築で非常に有用である。別法として、「
ノックイン」構築体を用いて、標的化遺伝子の単一機能的ドメインを特異的に排
除し、その結果、コードされたポリペプチドの他のドメインの機能を保持しつつ
、１つの機能が欠失した標的化遺伝子のポリペプチドを発現するトランスジェニ
ック動物が得られる。このタイプの「ノックイン」突然変異体は、頻繁に、いわ
ゆる「優性陰性」突然変異体の特徴を有する。何故ならば、特にホモ多量体化す
る蛋白質の場合、それは、それが由来する野生型遺伝子のポリペプチド産物の作
用（または「毒」）を特異的にブロックすることができるからである。ノックイ
ン技術の変形において、マーカー遺伝子の発現が標的化遺伝子の転写調節エレメ
ントの制御下とするように、マーカー遺伝子を注目するゲノム遺伝子座に組み込
む。マーカー遺伝子は、その活性が検出できる酵素（例えば、β−ガラクトシダ
ーゼ）をコードするものであり、酵素基質は適当な条件下で細胞に添加すること
ができ、酵素活性を分析することができる。当業者ならば、他の有用なマーカー
および所与の細胞においてその存在を検出する方法に精通しているであろう。全
てのかかるマーカーは、本発明の教示の範囲内に含まれると考えられる。

【０１４９】 前記したごとく、前記した「ノックアウト」および「ノックイン」構築体の相
同組換えは非常に稀であり、しばしば、かかる構築体はゲノムのランダム領域に
非相同的に挿入され、そこでは、欠失につき標的化された遺伝子に対して効果は
なく、およびそこでは、支配的に組換えられて、改変されることを意図していな
いもう１つの遺伝子を破壊する。かかる非相同組換え事象は、前記ノックアウト
およびノックイン構築体を、それらがいずれかの端部において陰性選択マーカー
によって近接挟まれるように修飾することによってそれに対して選択することが
できる（恐らくは、当該分野でよく知られた適当な組織培養培地中で細胞系を発
現することに対してそのポリペプチド産物を選択することができる、チミジンキ
ナーゼ遺伝子の２つの対立遺伝子変異体、すなわち、５−ブロモデオキシウリジ
ンのごとき薬物を含有するものの使用を介する）。かくして、本発明のかかるノ
ックアウトおよびノックイン構築体の好ましい具体例は、陰性選択マーカーをコ
ードする第２の核酸に連結される同一ゲノム遺伝子座の３’末端をコードする核
酸に連結された陽性選択マーカーの核酸に連結したゲノム遺伝子座の５’末端を
コードする核酸の連結した陰性選択マーカーをコードする核酸よりなる。得られ
たノックアウト構築体およびゲノムの間の非相同組換えは、通常、これらの陰性
選択マーカー遺伝子の一方または双方の安定な組込が得られ、よって、非相同組
換えを受ける細胞は、適当な選択培地（例えば、５−ブロモデオキシウリジンの
ごとき薬物を含有する培地）中での増殖によって選択することができる。陽性選
択マーカーについてのおよび陰性選択マーカーに対する同時選択の結果、ノック
アウト構築体が突然変異されるべき遺伝子の遺伝子座で相同組換えされたクロー
ンがひどく豊富となる。得られたノックアウトされた幹細胞系における標的化遺
伝子遺伝子座での予測される染色体改変の存在は、当業者によく知られたサザー
ンブロット分析技術によって確認することができる。別法として、ＰＣＲを使用
することができる。

【０１５０】 細胞に挿入されるべき各ノックアウト構築体は、まず、線状形態でなければな
らない。従って、もしノックアウト構築体がベクター（前掲）に挿入されたなら
ば、線状化は、当該ＤＮＡを、ノックアウト構築体配列内ではなくベクター配列
内のみを切断するように選択された適当な制限エンドヌクレアーゼで消化するこ
とによって達成される。

【０１５１】 挿入のために、当業者に公知のごとく、ノックアウト構築体は、選択された挿
入方法のための適当な条件下でＥＳ細胞に添加される。例えば、もしＥＳ細胞が
エレクトロポレーションに付されるべき場合、ＥＳ細胞およびノックアウト構築
体ＤＮＡが、エレクトロポレーションマシーンを用い、製造業者の使用ガイドラ
インに従って、電気パルスに暴露される。エレクトロポレーションの後、ＥＳ細
胞は、典型的には、適当なインキュベーション条件下で回復できるようになる。
次いで、細胞を、前記説明のごとく、ノックアウト構築体の圧力につきスクリー
ニングする。１以下の構築体をＥＳ細胞に導入すべき場合、各ノックアウト構築
体は同時にまたはある時点で導入することができる。

【０１５２】 適当な位置にノックアウト構築体を含有する適当なＥＳ細胞が前記で概説した
選択技術によって同定された後、細胞を胚に挿入することができる。挿入は当業
者に知られた種々の技術で達成されるが、好ましい方法はマイクロインジェクシ
ョンによるものである。マイクロインジェクションでは、約１０−３０細胞をマ
イクロピペットに収集し、発生の適当な段階に胚に注入して、ノックアウト構築
体を含有する外来性ＥＳ細胞を発生している胚に取り込むことを可能とする。例
えば、形質転換されたＥＳ細胞は未分化胚芽細胞にマイクロインジェクションす
ることができる。ＥＳ細胞の挿入に使用される胚についての発生の適当な段階は
非常に種依存性であるが、マウスでは、それは約３．５日である。胚は、妊娠雌
の子宮を灌流することによって得られる。これを投与するための適当な方法は当
業者に公知であり、例えば、Ｂｒａｄｌｅｙら（前掲）によって記載されている
。

【０１５３】 発生の正しい段階のいずれの胚も使用するのに適するが、好ましい胚を作成す
る。マウスにおいては、好ましい胚はＥＳ細胞遺伝子によってコードされた被覆
色彩とは異なる被覆色彩につきコードする遺伝子を有することができる。このよ
うにして、（ＥＳ細胞が発生する胚に取り込まれたことを示す）モザイク被覆色
彩を探すことによって、ノックアウト構築体の存在につき子孫を容易にスクリー
ニングすることができる。かくして、例えば、もしＥＳ細胞系が白色毛皮につい
ての遺伝子を担うならば、選択された胚は黒色または茶色毛皮についての遺伝子
を担うであろう。

【０１５４】 ＥＳ細胞が胚に導入された後、該胚は摂取につき偽妊娠養母の子宮に移植する
ことができる。いずれの養母を使用することもできるが、養母は、典型的には、
十分に育種し再生する能力につき、および幼児を世話する能力につき選択される
。かかる養母は、典型的には、同一種の精管切除雄と接合させることによって調
製する。偽妊娠養母の段階は成功する移植につき重要であり、それは種依存性で
ある。マウスについては、この段階は約２−３日偽妊娠である。

【０１５５】 養母から生まれた子孫は、まず、被覆色彩選択戦略が（前記したごとく、添付
の実施例におけるごとく）使用されたモザイク被覆色彩につきスクリーニングす
ることができる。加えて、あるいは代替法として、子孫の尾組織からのＤＮＡは
、前記したサザーンブロットおよび／またはＰＣＲを用いてノックアウト構築体
の前駆体につきスクリーニングすることができる。次いで、モザイクであるよう
に見える子孫を相互に交雑させて、もしそれらがその生殖系においてノックアウ
ト構築体を担うと考えられれば、ホモ接合ノックアウト動物を創製させる。ホモ
接合体は、この交雑の産物であるマウス、ならびにヘテロ接合体であることが知
られているマウスおよび野生型マウスからのゲノムＤＮＡの同等量のサザーンブ
ロットによって同定することができる。

【０１５６】 ノックアウト子孫を同定し特徴付ける他の手段は利用できる。例えば、ノーザ
ンブロットを用いて、ノックアウトされた遺伝子、マーカー遺伝子、または双方
いずれかをコードする転写体の存在または不存在につきｍＲＮＡをプローブする
ことができる。加えて、ウェスタンブロットを用いて、ウェスタンブロットを特
定のミオシリン蛋白質に対する抗体、またはマーカー遺伝子産物に対する抗体で
プローブすることによって子孫の種々の組織においてノックアウトされたＧＬＣ
ｌＡ遺伝子の発現のレベルを評価することができ、ここにこの遺伝子は発現され
る。最後に、（細胞の固定および動物の標識のごとき）イン・サイチュ分析およ
び／または子孫からの種々の細胞のＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞ソーティング）を
、ノックアウト構築体遺伝子産物の存在または不存在につき探すための適当な抗
体を用いて行うことができる。

【０１５７】 ノックアウトまたは破壊トランスジェニック動物を作成するさらに他の方法も
一般に知られている。例えば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ
Ｅｍｂｒｙｏ， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．，
１９８６）参照。例えば、リコンビナーゼ配列（後記）によってＧＬＣｌＡ遺
伝子の不活化の組織特異的および／または一過性制御を制御できるように、例え
ば、標的配列を挿入するための相同組換えによって、リコンビナーゼ依存性ノッ
クアウトも創製することができる。

【０１５８】 １を超えるノックアウト構築体および／または１を超えるトランスジーン発現
構築体を含有する動物を、いくつかの方法のうちいずれかで調製する。調製の好
ましい方法は、各々が所望のトランスジェニック表現型の１つを含有する一連の
哺乳動物を創製することである。かかる動物を一連の交雑、戻し交雑および選抜
を介して一緒に育種して、全ての所望のノックアウト構築体および／または発現
構築体を含有する単一動物を最終的に創製させ、ここに、該動物は、ノックアウ
ト構築体および／またはトランスジーンの存在を除いて野生型に対して類遺伝子
性（遺伝的に同一）である。

【０１５９】 ＧＬＣｌＡトランスジーンは蛋白質の野生型形態をコードすることができ、あ
るいはアゴニストおよびアンタゴニスト、ならびにアンチセンス構築体を含めた
、そのホモログをコードすることができる。好ましい具体例において、トランス
ジーンの発現は、例えば、所望のパターンで発現を制御するシス−作用性配列を
利用して細胞、組織または発生段階の特異的サブセットに制限される。本発明に
おいては、ミオシリン蛋白質のかかるモザイク発現は、系列分析の多くの形態で
必須であり得、加えて、例えば、正常胚内の組織の小パッチでの発生を大いに改
変し得るＧＬＣｌＡ発現の欠如の効果を評価する手段を提供する。これに向けて
、組織特異的調節配列および条件調節配列を用いて、ある種の空間パターンにお
いてトランスジーンの発現を制御することができる。さらに、発現の一時的パタ
ーンを、例えば、組換え系または原核生物転写調節配列によって提供することが
できる。

【０１６０】 トランスジーンの発現を可能とする遺伝子技術は、イン・ビトロで部位−特異
的遺伝子操作を介して調節することができ；当業者に公知である。例えば、標的
配列の遺伝子組み換えを触媒するリコンビナーゼの調節された発現を可能とする
遺伝子系は利用できる。本明細書で用いるごとく、フレーズ「標的配列」とは、
リコンビナーゼによって遺伝的に組み換えられたヌクレオチド配列をいう。標的
遺伝子はリコンビナーゼ認識配列によって近接挟まれ、一般に、リコンビナーゼ
活性を発現する細胞において切除されまたは逆位とされる。リコンビナーゼ触媒
組換え事象は、標的配列の組換えの結果、主題のミオシリン蛋白質の１つの発現
の活性化または抑制いずれかがもたらされるように設計することができる。例え
ば、アンタゴニストホモログまたはアンチセンス転写体をコードするもののごと
き、組換えＧＬＣｌＡ遺伝子の発現に干渉する標的配列の切除は、その遺伝子の
発現を活性化するように設計することができる。蛋白質の発現とのこの干渉は、
プロモーターエレメントまたは内部停止コドンからのＧＬＣｌＡ遺伝子の空間的
分離のごとき種々のメカニズムに由来することができる。さらに、遺伝子の配列
がリコンビナーゼ認識配列によって近接挟まれ、最初に、プロモーターエレメン
トに関して３’または５’向きに細胞にトランスフェクトされるトランスジーン
を作成することができる。かかる場合において、標的配列の逆位は、プロモータ
ー駆動転写活性化を可能とするプロモーターエレメントに関する向きにコーディ
ング配列の５’末端を置くことによって主題の遺伝子を再度配向させるであろう
。

【０１６１】 本発明のトランスジェニック動物は全てその複数の細胞内に本発明のトランス
ジーンを含み、そのトランスジーンは細胞増殖、死滅および／または分化の調節
に関して「宿主細胞」の表現型を改変する。本明細書に記載された１以上のトラ
ンスジーン構築体を利用して本発明のトランスジェニック生物を生産することが
できるので、一般的記載は、一般的に外因性遺伝物質に言及することによってト
ランスジェニック生物の生産を与える。この一般的記載は当業者によって採用さ
れて、後記する方法および材料を利用し、特異的トランスジーン配列を生物に取
り込むことができる。

【０１６２】 例示的具体例において、バクオリオファードＰ１（Ｌａｋｓｏら（１９９２）
ＰＮＡＳ ８９：６２３２−６２３６；Ｏｒｂａｎら（１９９２） ＰＮＡＳ
８９：６８６１−６８６５）またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ （Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら （１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：
１３５１−１３３５；ＰＣＴ公開ＷＯ ９２／１５６９４）のｃｒｅ／ｌｏｘＰ
リコンビナーゼ系いずれかを用いて、イン・ビボ部位−特異的遺伝子組み換え系
を創製することができる。ＣｒｅリコンビナーゼはｌｏｘＰ配列間に位置する介
入標的配列の部位−特異的組換えを触媒する。ｌｏｘＰ配列は、Ｃｒｅリコンビ
ナーゼがそれに結合し、Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介遺伝子組み換えで必要な３４
塩基対ヌクレオチドリピート配列である。ｌｏｘ配列の向きは、Ｃｒｅリコンビ
ナーゼが存在する場合に介入標的配列が切除されまたは逆転されるかを決定し（
Ａｂｒｅｍｓｋｉら（１９８４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５９：１
５０９−１５１４）；ｌｏｘＰ配列が直接的リピートとして向く場合は標的配列
の切除を触媒し、ｌｏｘＰ配列が逆転リピートとして向く場合は標的配列の逆転
を触媒する。

【０１６３】 従って、標的配列の遺伝子組換えはＣｒｅリコンビナーゼの発現に依存する。
リコンビナーゼの発現は、調節制御、例えば、組織−特異的、発生段階−特異的
、外部から添加された剤によって誘導性または抑制性であるものに付されるプロ
モーターエレメントによって調節することができる。この調節された制御の結果
、リコンビナーゼ発現がプロモーターエレメントによって媒介される細胞におい
てのみ標的配列の遺伝子組み換えがもたらされる。かくして、組換えミオシリン
蛋白質の活性化発現はリコンビナーゼ発現の制御を介して調節することができる
。

【０１６４】 組換えミオシリン蛋白質の発現を調節するためのｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナ
ーゼ系の使用は、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび主題の蛋白質を共にコードするト
ランスジーンを含有するトランスジェニック動物の構築を要する。Ｃｒｅリコン
ビナーゼおよび組換えＧＬＣｌＡ遺伝子を共に含有する動物は、「二重」トラン
スジェニック動物の構築を介して提供することができる。かかる動物を提供する
便宜な方法は、各々がトランスジーン、例えば、ＧＬＣｌＡ遺伝子およびリコン
ビナーゼ遺伝子を含有する２つのトランスジェニック動物を作成することである
。

【０１６５】 同様の条件トランスジーンは、ＧＬＣｌＡトランスジーンの発現を促進するた
めに同時に発現されるべき原核生物蛋白質を要する原核生物プロモーター配列を
用いて提供することができる。例示的プロモーターおよび対応するトランス−活
性化原核生物蛋白質が米国特許第４，８３３，０８０号に与えられる。

【０１６６】 さらに、条件トランスジーンの発現は、遺伝子治療−様方法によって誘導する
ことができ、ここに、トランス−作用性蛋白質、例えば、リコンビナーゼまたは
原核生物蛋白質をコードする遺伝子は、細胞型特異的方法で、組織に送達され、
発現させる。この方法によって、ＧＬＣｌＡトランスジーンは、トランス−アク
チベーターの導入によって「スイッチが入れられる」まで成人までサイレントの
ままである。

【０１６７】 例示的具体例において、本発明の「トランスジェニック非ヒト動物」は、非ヒ
ト動物の生殖系にトランスジーンを導入することによって生産される。種々の発
生段階の胚標的細胞を用いてトランスジーンを導入することができる。胚標的細
胞の発生段階に依存して、異なる方法を用いる。本発明を実施するのに使用され
るいずれかの動物の特異的系は、一般的良好な健康、良好な胚収率、胚における
良好な前核可視性、および良好な再生フィットネスにつき選択される。加えて、
ハプロタイプは重要な因子である。例えば、トランスジェニックマウスを生産す
べき場合、Ｃ５７ＢＬ／６またはＦＶＢ系のごとき株がしばしば使用される（Ｊ
ａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ， ＭＥ）。好
ましい株はＣ５７ＢＬ／６またはＤＢＡ／１のごときＨ−２^ｂ、Ｈ−２^ｄまたは
Ｈ−２^ｑハプロタイプを持つものである。本発明を実施するのに使用される系は
それ自体トランスジェニックであり、および／またはノックアウトであり得る（
すなわち、１以上の部分的にまたは完全に抑制された遺伝子を有する動物から得
られる）。

【０１６８】 １つの具体例において、トランスジーン構築体は単一段階胚に導入される。接
合体はマイクロインジェクションに最良の標的である。マウスにおいて、雄前核
は直径ほぼ２０ミクロンのサイズに達し、これはＤＮＡ溶液の１−２ｐｌの再現
可能な注射を可能とする。遺伝子導入のための標的としての接合体の使用は、ほ
とんどの場合に、注射されたＤＮＡが最初の切断前に宿主遺伝子に導入されるで
あろう点で主要な利点を有する（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら（１９８５） ＰＮＡＳ
８２：４４３８−４４４２）。その結果、トランスジェニック動物の細胞は組み
込まれたトランスジーンを担うであろう。これは、一般に、創製体の子孫に対す
るトランスジーンの効果的な遺伝で反映されるであろう。というのは、生殖細胞
の５０％がトランスジーンを保有するからである。

【０１６９】 通常、受精胚を 前核が出現するまで適当な培地でインキュベートする。ほぼ
この時点において、トランスジーンを含むヌクレオチド配列を後記するごとく雌
または雄前核に導入される。マウスのごときいくつかの種において、雌前核が好
ましい。卵子核または接合体雌前核によってそれが加工される前に、外因性遺伝
物質が接合体の雄ＤＮＡ相補体に添加されるのが最も好ましい。卵子核または雌
前核は、恐らくは、雄ＤＮＡのプロタミンをヒストンで置き換えることによって
雄ＤＮＡ相補体に影響する分子を放出し、それにより、雌および雄ＤＮＡ相補体
の組合せを促進してジプロイド接合体を形成する。

【０１７０】 かくして、雌前核によってそれが影響される前に外因性遺伝物質をＤＮＡの雄
相補体またはＤＮＡのいずれかの他の相補体に添加するのが好ましい。例えば、
雄前核の形成後できる限り速やかに外因性遺伝物質を初期雄前核に添加し、これ
は、雄および雌前核がよく分離され、共に細胞膜に近くに位置する場合である。
別法として、外因性遺伝子物質を、それが脱縮合を受けるように誘導された後に
精子の核に添加し得る。次いで、外因性遺伝物質を卵子に添加することができる
か、あるいは脱縮合精子を、しかる後速やかにトランスジーン構築体と共に卵子
に添加し得る。

【０１７１】 トランスジーンヌクレオチド配列の胚への導入は、例えば、マイクロインジェ
クション、エレクトロポレーション、またはリポフェクションのごとき当該分野
で公知のいずれかの手段によって達成することができる。トランスジーンヌクレ
オチド配列の胚への導入後に、該胚を種々の時間の長さでイン・ビトロでインキ
ュベートすることができ、あるいは代理宿主に再移植することができ、あるいは
双方ができる。母性へのイン・ビトロインキュベーションは本発明の範囲内のも
のである。１つの共通の方法は、種に応じて、約１−７日間イン・ビトロで胚を
インキュベートし、次いで、それらを代理宿主に再移植することである。

【０１７２】 本発明の目的では、接合体は、完全な生物に発育することができるジプロイド
細胞の実質的な形成である。一般に、接合体は、配偶子または複数の配偶子から
の２つのハプロイド核の融合によって天然または人工的に形成された核を含有す
る卵よりなるであろう。かくして、配偶子核は天然で適合するもの、すなわち、
分化を受け、機能する生物に発育することができる生きた接合体がもたらされる
ものでなければならない。一般に正倍数性の接合体が好ましい。もし異数体接合
体が得られるならば、染色体の数はいずれかの配偶子が由来する生物の異数体に
関して１を超えて変化すべきではない。

【０１７３】 同様の生物学的考慮に加えて、物理的なものは、接合体の核に、または接合体
核の一部を形成する遺伝物質に添加することができる外因性遺伝物質の量（例え
ば、容量）も支配する。もし遺伝物質が除去されないならば、添加することがで
きる外因性遺伝物質の量は、物理的に破壊されることなく吸着されるであろう量
によって制限される。一般に、その代わりに、外因性遺伝物質の容量は約１０ピ
コリットルを超えないであろう。添加の物理的効果は、接合体の生存性を物理的
に破壊する程は大きくあってはならない。ＤＮＡ配列の数および種類の生物学的
制限は特定の接合体に応じて変化し、外因性遺伝物質の機能は当業者に容易に明
らかとなる。何故ならば、得られた接合体の外因性遺伝物質を含めた遺伝物質は
、機能的生物への接合体の分化および発育を開始し維持できるものでなければな
らない。

【０１７４】 接合体に添加されるトランスジーン構築体のコピー数は添加された外因性遺伝
物質の全量に依存し、遺伝子形質転換が起こるのを可能とする量であろう。理論
的には、１コピーのみが必要である；しかしながら、一般に、多数コピー、例え
ば、１，０００−２０，０００コピーのトランスジーン構築体を利用して、１つ
のコピーが機能的であることを保証する。本発明に関しては、外因性ＤＮＡ配列
の表現型発現を増強する挿入された外因性ＤＮＡ配列の各々の１を超える機能す
るコピーを有するという利点がしばしばあるであろう。

【０１７５】 核遺伝物質への外因性遺伝物質の添加を可能とするいずれの技術も、それが細
胞、核膜または他の存在する細胞もしくは遺伝子構造を破壊しない限り利用する
ことができる。外因性遺伝物質はマイクロインジェクションによって核遺伝物質
に優先的に挿入される。細胞または細胞構造のマイクロインジェクションは知ら
れており、当該分野で使用される。

【０１７６】 再移植は標準的な方法を用いて達成される。通常、代理宿主を麻酔し、胚を卵
管に挿入する。特定の宿主に移植された胚の数は種によって変化し、通常、種が
天然で生じる子孫の数に匹敵するであろう。

【０１７７】 代理宿主のトランスジーン子孫は、いずれかの適当な方法によってトランスジ
ーンの存在および／または発現につきスクリーニングされ得る。スクリーニング
は、しばしば、トランスジーンの少なくとも一部に相補的なプローブを用いて、
サザーンブロットまたはノーザンブロットによって達成される。トランスジーン
によってコードされる蛋白質に対する抗体を用いるウェスタンブロット分析は、
トランスジーン産物の存在につきスクリーニングするために別法もしくはさらな
る方法として使用することができる。典型的には、ＤＮＡは尾組織から調製され
、トランスジーンにつきサザーン分析またはＰＣＲによって分析される。別法と
して、最高レベルでトランスジーンを発現すると考えられる組織または細胞はサ
ザーン分析またはＰＣＲを用いてトランスジーンの存在および発現につきテスト
されるが、いずれの組織または細胞タイプもこの分析で用いることができる。

【０１７８】 トランスジーンの存在を評価するための別のまたはさらなる方法は、限定され
るものではないが、酵素および／または免疫学的アッセイのごとき適当に生化学
的アッセイ、特定のマーカーまたは酵素活性のための組織学的染色、フローサイ
トメトリー分析等を含む。また、血液の分析は、血液中のトランスジーン産物の
存在を検出し、ならびに血液細胞および他の血液成分の種々のタイプのレベルに
対するトランスジーンの効果を評価するのに有用であり得る。

【０１７９】 トランスジェニック動物の子孫は、トランスジェニック動物を適当なパートナ
ーと接合させることによって、またはトランスジェニック動物から得られた卵お
よび／または精子のイン・ビトロ受精によって得ることができる。パートナーと
の交配を行うべき場合、パートナーはトランスジェニックおよび／またはノック
アウトであってよく、またはなくてもよく、それがトランスジェニックである場
合、それは同一または異なるトランスジーンまたは双方を含有することができる
。別法として、パートナーは親系であり得る。イン・ビトロ受精を用いる場合、
受精した胚は代理宿主に移植することができ、あるいはイン・ビトロでインキュ
ベートすることができる。いずれかの方法を用い、子孫は、前記した方法、また
は他の適当な方法を用い、トランスジーンの存在につき評価することができる。

【０１８０】 本発明により生産されたトランスジェニック動物は、外因性遺伝物質を含むで
あろう。前記したごとく、外因性遺伝物質は、ある具体例においては、ミオシリ
ン蛋白質（アゴニストまたはアンタゴ二スト）の生産をもたらすＤＮＡ配列、ア
ンチセンス転写体またはミオシリン突然変異体である。さらに、かかる具体例に
おいては、配列は、特別のタイプの細胞で生産されたトランスジーンの発現を可
能とする発現を好ましくは可能とする転写制御エレメント、例えば、プロモータ
ーに結合されるであろう。

【０１８１】 また、レトロウイルス感染を用いてトランスジーンを非ヒト動物に導入するこ
とができる。発生する非ヒト胚をイン・ビトロで未分化胚芽細胞段階で培養する
ことができる。この時間の間、胚芽細胞はレトロウイルス感染に対する標的であ
り得る（Ｊａｅｎｉｃｈ，Ｒ． （１９７６） ＰＮＡＳ ７３：１２６０−１
２６４）。胚芽細胞の効果的な感染は透明体（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈ
ｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ， Ｈｏｇａｎ編 （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ， １９８６）を除去する酵素治療によって得られる。トランス
ジーンを導入するのに使用されるウイルスベクター系は、典型的には、トランス
ジーンを担う複製欠陥レトロウイルスである（Ｊａｈｎｅｒら（１９８５） Ｐ
ＮＡＳ ８２：６９２７−６９３１；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら（１９８
５） ＰＮＡＳ ８２：６１４８−６１５２）。トランスフェクションは容易で
あり、ウイルス生産細胞の単層で胚芽細胞を培養することによって効果的に得ら
れる（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ， 前掲；Ｓｔｅｗａｒｔら（１９８７）
ＥＭＢＯ Ｊ． ６：３８３−３８８）。別法として、感染は後記段階で行う
ことができる。ウイルス−ウイルス生産細胞を胚芽細胞に注入することができる
（Ｊａｈｎｅｒら（１９８２） Ｎａｔｕｒｅ ２９８：６２３−６２８）。創
製体のほとんどはトランスジーンに対してモザイクである。というのは、組込は
トランスジーン非ヒト動物を形成した細胞のサブセットにおいてのみ起こる。さ
らに、創製体は、一般に子孫において分離するゲノムにおいて異なる位置でトラ
ンスジーンの種々のレトロウイルス挿入を含有することができる。加えて、中期
妊娠胚の子宮内レトロウイルス感染によって生殖系にトランスジーンを導入する
こともできる（Ｊａｈｎｅｒら（１９８２），前掲）。

【０１８２】 トランスジーン導入に対する第３のタイプの標的は胚幹細胞（ＥＳ）である。
ＥＳ細胞はイン・ビトロで培養したプレ−移植胚から得られ、胚と融合される（
Ｅｖａｎｓら（１９８１） Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４−１５６；Ｂｒａｄ
ｌｅｙら（１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３０９：２５５−２５８；Ｇｏｓｓｌｅ
ｒら（１９８６） ＰＮＡＳ ８３：９０６５−９０６９；およびＲｏｂｅｒｔ
ｓｏｎら（１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２２：４４５−４４８）。トランスジ
ーンはＤＮＡトランスフェクションまたはレトロウイルス−媒介導入によってＥ
Ｓ細胞に効果的に導入することができる。かかる形質転換ＥＳ細胞は、従って、
非ヒト動物から胚芽細胞と組み合わされることができる。しかる後、ＥＳ細胞は
胚をコロニー化し、得られたキメラ動物の生殖系に寄与する。レビューについて
は、Ｊａｅｎｉｓｃｋ， Ｒ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１４
６８−１４７４。

【０１８３】 ４．６ ＧＬＣｌＡ治療剤についての薬物スクリーニングアッセイ 緑内障の存在に関連する遺伝子におけるＧＬＣｌＡ遺伝子および特異的突然変
異の発見に基づいて、当業者であれば、緑内障の発症に干渉しまたはそれを妨げ
る薬物をスクリーニングするための種々の標準的なアッセイのいずれかを使用す
ることができる。緑内障の分子的基礎にアドレスすることによって、これらの剤
を用いて存在する治療剤よりも優れることが予測される。

【０１８４】 例えば、これらの突然変異に関連した正確な表現型の同定は、蛋白質の重要な
領域を機能的に同定することができる。これらの特異的突然変異は、次いで、細
胞系における過剰発現およびトランスジェニック動物の創製を含む他の実験で用
いることができる。理想的には、個体の寿命において非常に異なる時点で緑内障
を再現良く引き起こす突然変異を同定することができ、これらの突然変異が細胞
の発現システムやトランスジェニック動物への効果に同様の違いを持っているこ
とを示すことが出来る。

【０１８５】 加えて、ＧＬＣｌＡ遺伝子産物および蛋白質をコードする遺伝子と相互作用す
る蛋白質は今や同定することができる。というのは、ＧＬＣｌＡ遺伝子と相互作
用するる蛋白質は種々のタイプの緑内障の病院における関与につき重要な標的で
あろう。

【０１８６】 さらに、ヒトにおいて緑内障を引き起こすことが知られている突然変異が組織
ならびに動物モデルにおいて蛋白質トラッキングを改変するか否かを発見する実
験が試みられるだろう。というのは、ＧＬＣｌＡ遺伝子における突然変異におい
てそれを通じて病気を引き起こす１つのメカニズムは他の重要な遺伝子産物の発
現を改変するでろう。これは、例えば細胞質網膜のレベルで突然変異体蛋白質の
増大した除去によって引き起こされた細胞内で全蛋白質輸送に影響することによ
って起こり得る。

【０１８７】 緑内障の病因のさらなる理解は、緑内障の治療で有用であり得る薬物の新しい
クラスを同定するのに有用である。例えば、ＧＬＣｌＡは細胞のステロイドに対
する暴露によって誘導されることが見いだされている。従って、このステロイド
効果をブロックすることができる薬物は、緑内障の発症を防止しまたは遅延され
るのに有用であることが判明するはずである。

【０１８８】 さらに後記するごとく、化合物の非滋養に高いスループットスクリーニングに
適当なイン・ビトロアッセイを行うことができる。このアプローチの最も単純な
例として、ＧＬＣｌＡ遺伝子産物に対する抗体を用いて、ＧＬＣｌＡ遺伝子産物
の誘導のための単純なＥＬＩＳＡアッセイを開発し、次いで、９６ウェルマイク
ロタイタープレート様式でこのアッセイを行って、遺伝子産物のステロイド誘導
をブロックするにおいて効率につき非常に多数の薬物をスクリーニングすること
ができる。このようにして、自動的方法を用いて、効率につき何千もの閾値治療
化合物をスクリーニングすることができる。

【０１８９】 また、ＧＬＣｌＡ遺伝子の構造／機能の知識は、直ちに、緑内障に関与し得る
他の遺伝子を示唆する。かかる鍵は、ホモロジーの実験、進化、遺伝子内の構造
的モチーフの評価、およびポリジーン病を引き起こす遺伝子を同定するように設
計された分析を用いる遺伝実験から来る。

【０１９０】 ここに記載された元の連鎖実験において、緑内障遺伝子の２２の絶対キャリア
ーのうち３つはひどい緑内障表現型を発現しないことが認められた。この情報は
、他の遺伝子がＧＬＣｌＡ突然変異の効果を静めることができるのを示唆する。
かかる緩和遺伝子につきサーチする１つの強力な方法は、異なるバックグラウン
ドにおいて緑内障を引き起こす遺伝子を発現することである。これは、トランス
ジェニック動物を創製し、異なる遺伝マウス株につき緑内障を引き起こす遺伝子
を育種することによってなすことができる。もし異なる株で表現型が改変される
ならば、これらの動物は緩和遺伝子が同定することができるように戻し交配する
ことができる。

【０１９１】 前記したアッセイのいくつかは、今や、さらに詳細に後記する。

【０１９２】 ４．６．１ 細胞フリーアッセイ 化合物のライブラリーおよび天然抽出物をテストするプログラムをスクリーニ
ングする多くの薬物において、所与の時間で考えられる化合物の数を最大化する
にし高スループットアッセイが望ましい。精製されたまたは半精製された蛋白質
で誘導することができるように、無細胞系で行われるアッセイは、しばしば、そ
れらを創製して迅速な開発およびテスト化合物によって媒介される分子標的での
改変の比較的容易な検出を可能とすることができる点で好ましい「一次」スクリ
ーニングである。さらに、テスト化合物の細胞毒性および／または生物学的利用
性は、一般に、イン・ビトロ系では無視することができ、その代わり分子標的に
対する薬物の効果に主として焦点を当てるアッセイが、上流または下流エレメン
トでの結合親和性の改変で発現され得る。従って、本発明の例示的スクリーニン
グアッセイにおいて、注目する化合物を、それらがそれによって正にまたは負に
調節されるかを問わず、（その活性のアクチベーターおよびリプレッサーを共に
含む）上流で機能し得る蛋白質またはミオシリンポリペプチドの下流で機能し得
る蛋白質または核酸と接触させる。次いで、化合物および上流または下流エレメ
ントの混合物に、ミオシリンポリペプチドを含有する組成物を添加する。ミオシ
リンとその上流または下流エレメントとの複合体の検出および定量は、ミオシリ
ンおよびミオシリン−結合エレメントの間の阻害（または増強）複合体としての
化合物の効率を決定する手段を提供する。化合物の効率は、テスト化合物の種々
の濃度を用いて得られたデータから用量依存性曲線を創製することによって評価
することができる。さらに、対照アッセイを行って、比較のためのベースライン
を供することもできる。対照アッセイにおいては、単離され精製されたミオシリ
ンポリペプチドを、ミオシリン−結合エレメントを含有する組成物に添加し、複
合体の形成をテスト化合物の不存在下で定量する。

【０１９３】 ミオシリンポリペプチドおよびミオシリン結合エレメントの間の複合体形成は
、種々の技術によって検出することができる。複合体の形成の変調は、例えば、
イムノアッセイによって、またはクロマトグラフィー検出によって、放射標識、
蛍光標識、または酵素標識ミオシリンポリペプチドのごとき検出可能に標識され
た蛋白質を用いて定量することができる。

【０１９４】 典型的には、蛋白質の１つまたは双方の非複合体化形態の複合体の分離を容易
とするミオシリンまたはその結合蛋白質を固定化し、ならびにアッセイの自動化
を収容するのが望ましいであろう。候補剤の存在下または不存在下において、上
流または下流エレメントへのミオシリンの結合は、反応体を含有するために適し
たいずれかの容器中で達成することができる。その例はマイクロタイタープレー
ト、テストチューブ、およびミクロ遠心チューブを含む。１つの具体例において
、蛋白質がマトリックスに結合するのを可能とするドメインを付加する融合蛋白
質を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／
ミオシリン（ＧＳＴ／ミオシリン）融合蛋白質をグルタチオンセファロースビー
ド（Ｓｉｇｍａ， Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）または
グルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着させ、これを、次いで
、細胞溶解物、例えば、３５Ｓ−標識したもの、およびテスト化合物と組み合わ
せ、混合物を塩およびｐＨについての生理学的条件において、複合体形成に対し
て導電的条件下でインキュベートするが、わずかによりストリンジェントな条件
も望まれ得る。インキュベーションに続き、ビーズを洗浄していずれの未結合標
識も除去し、マトリックスを固定化し、放射標識を直接的に（例えば、シンチラ
ント中に置かれたビーズ）、または複合体が引き続いて解離された後に上清中で
測定する。別法として、複合体はマトリックスから解離でき、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
によって分離でき、添付の実施例に記載したごとくビーズ画分で見いだされるミ
オシリン−結合蛋白質のレベルを標準的な電気泳動技術を用いてゲルから定量し
た。

【０１９５】 マトリックス上に蛋白質を固定化するための他の技術もまた主題のアッセイで
使用するのに利用できる。例えば、ミオシリンまたはその同族結合蛋白質はビオ
チンおよびストレプトアビジンのコンジュゲ−ションを利用して固定化すること
ができる。例えば、ビオチン化ミオシリン分子は、当該分野でよく知られている
技術を用いてビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製す
ることができ（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ
， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）、ストレプトアビジン−被覆した９６ウェルプ
レート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェル中で固定化することができ
る。別法として、ミオシリンと反応性であるが、上流または下流エレメントの結
合に干渉しない抗体をプレートのウェルに誘導体化し、ミオシリンを抗体コンジ
ュゲーションによってウェル中で捕獲する。前記したごとく、ミオシリン−結合
蛋白質およびテスト化合物の調製はプレートのミオシリン−提示ウェル中でイン
キュベートし、ウェルに捕獲された複合体の量を定量することができる。かかる
複合体を検出する例示的方法は、ＧＳＴ−固定化複合体につき前記したものに加
えて、ミオシリン結合エレメントと反応性である、あるいはミオシリン蛋白質と
反応性であって、結合エレメントと競合する抗体を用いる複合体の免疫検出；な
らびに結合エレメントと会合する酵素活性、固有または外因的活性を検出するこ
とに頼る酵素連結アッセイを含む。後者の例において、酵素は化学的にコンジュ
ゲートすることができるか、あるいはミオシリン−ＢＰとの融合蛋白質として供
することができる。説明すると、ミオシリン−ＢＰはホースラディッシュペルオ
キシダーゼと化学的に架橋するかまたはそれと遺伝子的に融合することができ、
複合体中に捕獲されたポリペプチドの量を、酵素の発色基質、例えば、３，３’
−ジアミノ−ベンザジン四塩化物または４−クロロ−１−ナフトールで評価する
ことができる。同様に、ポリペプチドおよびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラ
ーゼを含む融合蛋白質を提供することができ、１−クロロ−２，４−ジニトロベ
ンゼンを用いてＧＳＴ活性を検出することによって複合体形成を定量することが
できる（Ｈａｂｉｇら（１９７４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４９：
７１３０）。

【０１９６】 複合体中に捕獲された蛋白質の１つを定量するための免疫検出に頼るプロセス
では、抗−ミオシリン抗体のごとき蛋白質に対する抗体を用いることができる。
別法として、複合体中で検出される蛋白質は、ミオシリン配列に加えて、（例え
ば、商業的源から）容易に入手できる第２ポリペプチドを含む融合蛋白質の形成
で「タグされたエピトープ」であり得る。例えば、前記したＧＳＴ融合蛋白質は
ＧＳＴ部位に対する抗体を用いる結合の定量で使用することもできる。他の有用
なエピトープタグは、ｃ−ｍｙｃからの１０−残基を含むｍｙｃ−エピトープ（
例えば、Ｅｌｌｉｓｏｎら（１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６
６：２１１５０−２１１５７参照）、ならびにｐＦＬＡＧ系（Ｉｎｔｅｒｎａｔ
ｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）またはｐＥＺＺ−
蛋白質Ａ系（Ｐｈａｒａｍａｃｉａ， ＮＪ）を含む。

【０１９７】 ４．６．２ 細胞ベースの系 前記したごとき無細胞アッセイに加えて、本発明によって提供された突然変異
体および機能的ＧＬＣｌＡ核酸および蛋白質の容易に入手できる源は、小分子ア
ゴニスト／アンダコニスト等を同定するための細胞−ベースのアッセイの創製を
容易とする。例えば、細胞を注目するテスト剤の存在下および不存在下で組換え
ミオシリン蛋白質を過剰生産するようにでき、該アッセイはテスト剤によって媒
介された標的細胞によるミオシリン応答での変調のためにスコア取りする。無細
胞系アッセイに関しては、ミオシリン−依存性応答（阻害または増強）における
統計学的に有意な変化を生じる剤を同定することができる。例示的具体例におい
て、ミオシリンの発現または活性は細胞中で変調され、（組織分化、増殖、腫瘍
形成性のごとき）注目するリードアウトに対する注目する化合物の効果を測定す
る。例えば、ミオシリン−依存性シグナルカスケードに応答して上昇または下降
調節される遺伝子の発現をアッセイすることができる。好ましい具体例において
、かかる遺伝子の調節領域、例えば、５’フランキングプロモーターおよびエン
ハンサー領域は、容易に検出することができる遺伝子産物をコードする（ルシフ
ェラーゼのごとき）検出可能なマーカーに作動可能に連結されている。

【０１９８】 例示的細胞または細胞系は眼組織（例えば、小柱ネットワークまたは線毛体上
皮細胞）；ならびにＨｅＬａ細胞およびＣＯＳ細胞、例えば、ＣＯＳ−７（ＡＴ
ＣＣ＃ ＣＲＬ−１６５１）のごとき哺乳動物属細胞系に由来することができる
。さらに、ここに議論したトランスジェニック動物を用いて、この障害のための
細胞培養モデルとして使用することができる、緑内障に関与する１以上のタイプ
を含有する細胞系を創製することができる。本発明の緑内障性トランスジェニッ
ク動物に由来する一次培養を利用することができるが、連続的細胞系の創製が好
ましい。トランスジェニック動物からの連続的細胞系を駆動することができる技
術（例えば、Ｓｍａｌｌら， １９８５， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．
５：６４２−６４８参照）。

【０１９９】 これらの細胞を用い、細胞増殖、移動、ファゴサイトーシス、（例えば、細胞
外マトリックス成分の）接着および／または生合成を含めた種々の終点に対する
テスト化合物の効果をテストすることができる。次いで、該細胞を、限定される
ものでないが、細胞形態、細胞増殖、細胞移動、および細胞接着の変化を含めた
緑内障に関連する表現型につき調べることができる。

【０２００】 ミオシリン蛋白質それ自体、または他の蛋白質の複合体においてＤＮＡに結合
し、遺伝子の転写を修飾することができる事象において、ミオシリン応答性調節
配列が検出可能なマーカー遺伝子に作動可能に連結した転写ベースのアッセイを
用いることができよう。

【０２０１】 細胞に対する化合物の影響をモニタリングするのは、基本的な薬物スクリーニ
ングにおいてのみならず、臨床試験において適用することができる。かかる臨床
試験においては、遺伝子のパネルの発現を特定の薬物の治療効果の「リードアウ
ト」として使用することができる。

【０２０２】 さらにもう１つの態様において、ミオシリンに結合するまたはそれと相互作用
する他の細胞蛋白質（「ミオシリン−結合蛋白質」または「ミオシリン−ｂｐ」
についてのコーディング配列を単離するために、主題のミオシリンポリペプチド
を用いて、「２ハイブリッド」アッセイを創製することができる（例えば、米国
特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３） Ｃｅｌｌ ７２：
２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら（１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．
２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌ（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら（１９９３） Ｏｎ
ｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ ＷＯ９４／１０３
００参照）。

【０２０３】 略言すれば、２ハイブリッドアッセイは、２つの別の融合蛋白質からのイン・
ビボで機能的な転写アクチベーター蛋白質を再構成するのに頼る。特に、該方法
はハブリッド蛋白質を発現するキメラ遺伝子を利用する。説明すると、第１のハ
イブリッド遺伝子は、ミオシリンポリペプチドについてのコーディング配列に枠
内で融合した転写アクチベーターのＤＮＡ−結合ドメインについてのコーディン
グ配列を含む。第２のハイブリッド蛋白質は、ｃＤＮＡライブラリーからの試料
遺伝子に枠内で融合した転写活性化ドメインをコードする。もし餌および試料ハ
イブリッド蛋白質が相互作用できる、例えば、ミオシリン−依存性複合体を形成
することができるならば、それらは転写アクチベーターの２つのドメインに近接
させる。この近接は、転写アクチベーターに応答する転写調節部位に作動可能に
連結するレポーター遺伝子の転写を引き起こすのに十分であり、レポーター遺伝
子の発現を検出し、それを用いてミオシリンおよび試料蛋白質の相互作用につき
スコア取りすることができる。

【０２０４】 本発明は、さらに、前記スクリーニングアッセイによって同定された新規剤お
よびここに記載した処理のためのその使用に関する。

【０２０５】 ４．７ 病気を治療する方法 緑内障に加えて、本発明のミオシリン治療剤が治療で使用できる種々の病理的
疾患があり得る。

【０２０６】 野生型ミオシリンのアンタゴニストまたはアゴニストであるかを問わず、「ミ
オシリン治療剤」は、適当には、単離されたポリペプチド、遺伝子治療構築体、
アンチセンス分子、ペプチドミメティックス、非核酸、非ペプチド小分子、また
はここに提供された薬物アッセイで同定された剤を含めた、前記調製のいずれか
であり得る。

【０２０７】 前記したごとく、ある種の突然変異体ＧＬＣｌＡ遺伝子を有する主題は緑内障
を発症する傾向にある。突然変異体ＧＬＣｌＡ遺伝子発現の下降調節および／ま
たは突然変異体ミオシリン蛋白質の活性の減少（例えば、アンチセンス、リボザ
イム、三重らせんまたは抗体分子を使用）および／または野生型ＧＬＣｌＡ遺伝
子発現の上昇調節および／または野生型ミオシリン蛋白質の活性の得られた減少
（例えば、遺伝子治療または蛋白質置換治療剤を使用）は、従って、病気の兆候
を軽減するのに有用であることが判明するはずである。ＧＬＣｌＡ遺伝子発現ま
たはミオシリン蛋白質活性を増加させるまたは減少させるものとして同定された
化合物は、緑内障に関連する兆候を治療または軽減するのに治療的有効量で対象
に投与することができる。

【０２０８】 ４．７．１ 有効量 かかる化合物の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％で致
死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な量）を測定するた
めに、細胞培養または実験動物において標準的な医薬的手法によって測定するこ
とができる。毒性および治療的効果の間の用量比は治療指標であり、それは比率
ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指標を呈する化合物が
好ましい。毒性効果を呈する化合物を使用することができるが、かかる化合物を
患部組織に標的化する送達系を設計して未感染細胞に対する可能な損傷を最小化
し、それにより、副作用を減少させるように注意する。

【０２０９】 細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトで使用されるあ
る範囲の用量を処方するのに使用することができる。かかる化合物の用量は、好
ましくは、ほとんどまたは全く毒性を持たないＥＤ５０を含むある範囲の循環濃
度内にある。用量は使用される投与形態および利用される投与経路に依存してそ
の範囲内で変化させ得る。本発明の方法で使用されるいずれの化合物についても
、治療有効量はまず細胞培養アッセイから評価することができる。細胞培養で測
定されたＩＣ５０（すなわち、兆候の半最大阻害を達成するテスト化合物の濃度
）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために用量を動物において処方することが
できる。かかる処方を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより正確に測定するこ
とができる。血漿中のレベルは、例えば、高効率液体クロマトグラフィーによっ
て測定することができる。

【０２１０】 ４．７．２ 処方および使用 本発明により使用される医薬組成物は、１以上の生理学的に許容される担体お
よび賦形剤を用いて常法により処方することができる。かくして、化合物および
生理学的に許容される塩および溶媒を、例えば、注射、注入または（口または鼻
を通じての）ガス注入または経口、口腔、非経口または直腸経路によって投与の
ために処方することができる。

【０２１１】 かかる治療のためには、本発明のオリゴマーは、全身および局所または局所化
投与を含めた種々の投与負荷のために処方することができる。技術および処方は
、一般に、Ｒｅｍｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ， Ｍｅａｄｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ，
ＰＡに見いだすことができる。全身投与では、筋肉内、静脈内、腹腔内および
皮下を含めた注射が好ましい。注射では、本発明のオリゴマーは、好ましくはハ
ンクスの溶液またはリンゲル溶液のごとき生理学的に適合する緩衝液中にて、液
体溶液に処方することができる。加えて、オリゴマーは固体形態に処方すること
ができ、使用に先立って再溶解または懸濁させることができる。凍結乾燥形態も
含まれる。

【０２１２】 経口投与では、医薬組成物は、例えば、結合剤（例えば、予備ゲル化されたト
ウモロシデンブン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセル
ロース）；充填剤（例えば、ラクトース、マイクロクリスタリンセルロースまた
はリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タル
クまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンブングリコ
ール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）のごと
き医薬上許容される賦形剤での常法手段によって調製された錠剤またはカプセル
剤の形態を取ることができる。錠剤は当該分野でよく知られている方法によって
被覆することができる。経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロッ
プ剤または懸濁剤の形態を取ることができ、あるいはそれらは使用前に水または
他の適当なビヒクルとの構成で乾燥生成物として提示することができる。かかる
液体製剤は懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または
水素化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒク
ル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分別植物油
）；および保存剤（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエ
ートまたはソルビン酸）のごとき医薬上許容される添加剤での常法手段によって
調製することができる。また、該製剤は緩衝剤塩、フレーバー剤、着色剤および
甘味剤を適当には含有することができる。

【０２１３】 経口投与用の製剤は、適当には、活性化合物の制御放出を与えるように処方す
ることができる。

【０２１４】 口腔投与では、組成物は常法で処方した錠剤またはロゼンジの形態を取ること
ができる。

【０２１５】 吸入による投与では、本発明で使用される化合物は、便宜には、適当なプロペ
ラント、例えば、ジクロロジフルオロメチン、トリクロロフルオロメチン、ジク
ロロテトラフルオロエチン、二酸化炭素または他の適当なガスを使用して、圧力
パックまたはネビュライザーからアエロゾルスプレイ提示の形態で送達すること
する。圧縮アエロゾルの場合には、投与単位は計量された量を送達するためのバ
ルブを供することによって測定することができる。吸入機または注入器で使用さ
れる、例えば、ゼラチンのカプセル剤およびカートリッジは、化合物の粉末ミッ
クスまたはラクシートまたはデンプンのごとき適当な粉末ベースを含有するよう
に処方することができる。

【０２１６】 化合物は、注入、例えば、ボーラス注射または連続的点滴によって非経口投与
用に処方することができる。注射用の処方は、単位投与形態で、保存剤を添加し
たアンプルまたは多重用量容器中で提示することができる。組成物は油性または
水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンのごとき形態を取ることがで
きる。別法として、有効成分は適当な使用前にビヒクル、例えば、滅菌パイロジ
ェンフリー水とでの構成のための粉末中に存在させることができる。

【０２１７】 また、化合物は、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドのごとき通常の
坐薬基剤を含有する坐薬または保持浣腸のごとき直腸組成物に処方することがで
きる。

【０２１８】 前記した処方に加えて、該化合物はデポ調製として処方することができる。か
かる長期持続処方は移植（例えば、皮下または筋肉内）によって、または筋肉内
注射によって投与することができる。かくして、例えば、（例えば、許容される
油中のエマルジョンとしての）適当なポリマーまたは疎水性物質とで、またはイ
オン交換樹脂、または貧溶性誘導体として、例えば、貧溶性塩として処方するこ
とができる。

【０２１９】 全身投与は経粘膜または経皮手段によることもできる。経粘膜または経皮投与
では、予め浸透させるためにバリアーに対して適した浸透剤を処方で用いる。か
かる浸透剤は一般的に当該分野で知られており、例えば、経粘膜投与胆汁酸塩お
よびフシジン酸誘導体を含む。加えて、洗剤を用いて浸透を容易とすることがで
きる。経粘膜投与は鼻孔スプレイを通じてまたは坐薬を用いることができる。局
所投与では、本発明のオリゴマーは当該分野で一般的に知られている軟膏、唾液
、ゲルまたはクリームに処方される。

【０２２０】 臨床的状況では、治療ＧＬＣｌＡ遺伝子のための遺伝子送達系を、各々当該分
野で精通されている、多数の方法のうちのいずれかによって患者に導入すること
ができる。例えば、遺伝子送達系の医薬製剤を、例えば、静脈内注射によって全
身導入することができ、標的細胞における蛋白質の特異的導入は、受容体遺伝子
の発現を制御する転写調節配列による遺伝子送達ビヒクル、細胞型または細胞型
発現、またはその組合せによって供されたトランスフェクションの特異性から支
配的に起こる。他の具体例において、組換え遺伝子の最初の送達は、かなり局所
化された動物への導入でより限定されている。例えば、遺伝子送達ビヒクルはカ
テーテル（例えば、米国特許第５，３２８，４７０号）によって、または定位注
射（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４） ＰＮＡＳ ９１：３０５４−３０５７）
によって導入することができる。配列番号１または２、それに対する配列ホモロ
グよりなる群から選択される群で表される配列のうちのいずれかの１つのごとき
ＧＬＣｌＡ遺伝子を、例えば、Ｄｅｖら（（１９９４） Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅ
ａｔ Ｒｅｖ． ２０：１０５−１１５）によって記載されている技術を用いる
エレクトロポレーションによって遺伝子治療構築体にて送達することができる。
特異的な効果的かつ高度に局所化された目の病気の治療を供するウイルスよりな
る遺伝子治療ベクターはＥｒｉｋｓｓｏｎに対する公開された国際出願番号ＷＯ
９５／３４５８０に記載されている。

【０２２１】 遺伝子治療構築体の医薬製剤は、実質的に適当な希釈剤中の遺伝子送達系より
なることができ、あるいは遺伝子送達ビヒクルが包埋された徐放マトリックスを
含むことができる。別法として、完全な遺伝子送達系、例えば、レトロウイルス
ベクターが組換え細胞から無傷で生産することができ、医薬製剤は遺伝子送達系
を生産する１以上の細胞を含むことができる。

【０２２２】 該組成物は、所望ならば、有効成分を含有する１以上の単位投与形態を含有す
ることができるパックまたはディスペンサーデバイスにて提示することができる
。該パックは、例えば、ブリスターパックのごとき金属またはプラスチックフォ
イルを含むことができる。該パックまたはディスペンサーデバイスは投与の指示
によって達成することができる。

【０２２３】 ４．８ 予測される医薬 本発明は、さらに、対象におけるコードされたミオシリン蛋白質の発現レベル
および／または機能に影響する、新規ＧＬＣｌＡ遺伝子の同一性および遺伝子お
よび関連経路遺伝子における改変に部分的に基づく予測される医薬をその要旨と
する。

【０２２４】 例えば、（単独または、同一病気に寄与するもう１つの遺伝子欠陥に対する情
報と組み合わせた）ここに記載された診断アッセイを用いて得られた情報は、兆
候のある対象（例えば、緑内障についての兆候的対象）が緑内障を引き起こすま
たはそれに寄与する（例えば、ＧＬＣｌＡ遺伝子における、またはＧＬＣｌＡ遺
伝子の発現を調節する遺伝子における）遺伝子欠陥を有することを診断するのに
またはそれを確認するのに有用である。別法として、（単独または同一病気に寄
与するもう１つの遺伝子欠陥についての常法と組み合わせた）常法は、非兆候対
象が緑内障を発症するようであるか否かを予測するのに予後的に用いることがで
きる。予後情報に基づいて、医師は、個体における緑内障の開始を防止しまたは
延長するのに有用な、推奨される療法または治療プロトコルを推奨することがで
きる。

【０２２５】 加えて、単独または緑内障に寄与する他の遺伝子欠陥に対する情報と組み合わ
せて、特定の改変または個体における欠陥もしくは欠損ＧＬＣｌＡ遺伝子または
蛋白質の結果となる改変の知識は、個体の遺伝子プロフィール、「ファルマコゲ
ノミックス」の目標に対する治療のあつらえを可能とする。例えば、個体のＧＬ
ＣｌＡ遺伝子プロフィールまたは緑内障の遺伝子プロフィールは医師が１）緑内
障の分子的基礎にアドレスする薬物をより効果的に記載する；および２）特定の
薬物の適当な用量を良好に決定するのを可能とする。例えば、単独または緑内障
に寄与することが知られている他の遺伝子の発現レベルと組み合わせた、ミオシ
リン蛋白質の発現レベルは、緑内障の転写または発現プロフィールを創製する病
気の種々の段階で多くの患者で測定することができる。次いで、個体患者の発現
パターンを適当な薬剤および患者に投与される用量を決定する緑内障の発現プロ
フィールと比較することができる。

【０２２６】 ＧＬＣｌＡまたは緑内障遺伝子プロフィールに基づいた最高の臨床利点を示す
ことが予測される標的集団の能力は１）失望するマーケット結果を持つ市販薬物
を再配置し；２）その臨床開発が、患者亜群−特異的である安全または効率制限
の結果として中断される薬物候補の救済；および３）薬物候補およびより最適な
薬物標識についての加速されより安価な開発を可能とすることができる（例えば
、マーカーとしてのＧＬＣｌＡの使用は効果的な用量を最適化するのに有用であ
る）。

【０２２７】 これらのおよび他の方法は以下のセクションでさらに詳細に記載される。

【０２２８】 ４．８．１ 予後および診断アッセイ 対象が（予後的）緑内障を有するか（診断的）またはそれを発症する危険性が
あるかを決定するための手段を本発明の方法は提供する。

【０２２９】 １つの具体例において、該方法は、対象がノーザンブロット分析、逆転写酵素
−ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、イン・サイチュハイブリダイゼーショ
ン、免疫沈殿、ウェスタンブロットハイブリダイゼーション、または免疫組織何
学のごとき、異常ＧＬＣｌＡ ｍＲＮＡおよび／またはミオシリン蛋白質レベル
を有するか否かを判断することを含む。該方法によると、対象から細胞を得、Ｇ
ＬＣｌＡ ｍＲＮＡのレベルまたはミオシリンレベルを測定し、健康な対象にお
いてｍＲＮＡまたは蛋白質レベルと比較する。ＧＬＣｌＡ ｍＲＮＡまたはその
ためのミオシリンの異常レベルは異常ミオシリン生物活性の指標である。

【０２３０】 もう１つの具体例において、該方法は、ミオシリンのすくなくとも１つの活性
を測定することを含む。同様に、対象のミオシリン蛋白質の結合パートナーとの
親和性の定数を測定することができる。得られた結果と健康対象からのミオシリ
ン蛋白質で行った同様の分析での結果との比較は、対象が異常ミオシリン活性を
有するか否かの指標である。

【０２３１】 好ましい具体例において、対象が緑内障を有するかまたはそれを発症する危険
性を有するかを決定する方法は、対象からの細胞の試料において、（ｉ）ミオシ
リンポリペプチドをコードする遺伝子の統合に影響する改変、または（ｉｉ）Ｇ
ＬＣｌＡ遺伝子の誤発現のうちの少なくとも１つによって特徴付けられる遺伝子
改変の存在または不存在を検出することを含むことを特徴とする。例えば、かか
る遺伝子改変は、（ｉ）ＧＬＣｌＡ遺伝子からの１以上のヌクレオチドの検出、
（ｉｉ）ＧＬＣｌＡ遺伝子に対する１以上のヌクレオチドの付加、（ｉｉｉ）Ｇ
ＬＣｌＡ遺伝子の１以上のヌクレオチドの置換、（ｉｖ）ＧＬＣｌＡ遺伝子の大
きな染色体再配置、（ｖ）ＧＬＣｌＡ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写体のレ
ベルの大きな改変、（ｖｉ）ゲノムＤＮＡのメチル化パターンのもののごときＧ
ＬＣｌＡ遺伝子の異常修飾、（ｖｉｉ）ＧＬＣｌＡ遺伝子のメッセンジャーＲＮ
Ａ転写体の非野生型スプライシングパターンの存在、（ｖｉｉｉ）ミオシリンポ
リペプチドの非野生型レベル、（ｉｘ）ＧＬＣｌＡ遺伝子の対立遺伝子喪失およ
び／または（ｘ）ミオシリンポリペプチドの不適切な翻訳後修飾のうちの少なく
とも１つの存在を確認することによって検出することができる。後記するごとく
、本発明は、ＧＬＣｌＡ遺伝子において改変を検出するための種々のアッセイ技
術を提供する。これらの方法は、限定されるものではないが、配列分析、サザー
ンブロットハイブリダイゼーション、制限酵素部位マッピングを含む方法、およ
び分析されるべき核酸およびプローブとの間のヌクレオチド対合の不存在の検出
を含む方法を含む。さらにこれらの方法や他の方法を記載する。

【０２３２】 特別の病気または障害、例えば、遺伝病または障害は、必ずしも突然変異した
蛋白質をコードしないある種の遺伝子の多形領域の特異的対立遺伝子変異体に関
連する。かくして、対象における、単一ヌクレオチド多形（「ＳＮＰ」）のごと
き、遺伝子の多形領域の特異的対立遺伝子変異体の存在は、対象が特異的病気ま
たは障害を発症するのに感受性とすることができる。ＧＬＣｌＡ遺伝子における
多形領域は、個体の集団における遺伝子のヌクレオチド配列を測定することによ
って同定することができる。多形領域、例えば、ＳＮＰが同定されるならば、特
異的病気とのリンクは、個体、例えば、緑内障を発症した個体の特異的集団を調
べることによって決定することができる。多形領域は、エクソン、イントロン、
およびプロモーター領域のコーディングまたは非コーディング領域においていず
れかの領域に位置することができる。

【０２３３】 ＧＬＣｌＡ遺伝子は、その特異的対立遺伝子が特異的病気または疾患に、また
はかかる病気または疾患を発症する増大した確率と関連し得る多形領域を含む。
かくして、該発明は、対象におけるＧＬＣｌＡ遺伝子の対立遺伝子またはその多
形領域り対立遺伝子変異体の同定を測定して、それにより、多形領域の特異的対
立遺伝子変異体に関連した病気または障害を対象が有するまたはそれを発症する
危険性があるかを判断する方法を提供する。

【０２３４】 例示的具体例において、ＧＬＣｌＡ遺伝子またはその天然に生じる突然変異体
のセンスもしくはアンチセンス配列、または対象のＧＬＣｌＡ遺伝子またはその
天然に生じる変異体に天然で関連する５’もしくは３’フランキング配列または
イントロン配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列の領域を含
めた核酸プローブを含む核酸組成物が提供される。細胞の核酸はハイブリダイゼ
ーションのために接近可能とされ、プローブを試料の核酸と接触させ、プローブ
の試料核酸へのハイブリダイゼーションが検出される。かかる技術を用いて、欠
失、置換等を含めたゲノムまたはｍＲＮＡレベルにおける改変または対立遺伝子
変異体を検出してｍＲＮＡ転写体レベルを決定することができる。

【０２３５】 好ましい検出方法は、突然変異または多形部位と重複する、および突然変異ま
たは多形領域の回りに約５、１０、２０、２５または３０ヌクレオチドを有する
対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションである。本発明の好ましい具体例にお
いて、単一ヌクレオチド多形のごとき対立遺伝子変異体に特異的にハイブリダイ
ズできるいくつかのプローブを固相支持体、例えば、「チップ」に付着させる。
リソグラフィーを含めた種々のプロセスによってオリゴヌクレオチドを個体支持
体に結合させることができる。例えば、チップは２５０，０００オリゴヌクレオ
チドを保有することができる。「ＤＮＡプローブアッセイ」とも言う、オリゴヌ
クレオチドを含むこれらのチップを用いる突然変異検出分析は、例えば、Ｃｒｏ
ｎｉｎら（１９９６） Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ７：２４４に記載され
ている。１つの具体例において、チップは遺伝子の少なくとも１つの多形領域の
全ての対立遺伝子変異体を含む。次いで、固相支持体をテスト核酸ハイブリダイ
ゼーションと接触させ、特異的プローブを検出する。従って、１以上の遺伝子の
多数の対立遺伝子変異体の同一性は、単純なハイブリダイゼーション実験で同定
することができる。

【０２３６】 ある具体例において、改変の検出は、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲ
、のごとき多形鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，１９５と４，６８３
，２０２号）において、あるいは別法として、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）（例え
ば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−
１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら（１９９４） ＰＮＡＳ ９１：３６０−
３６４）においてプローブ／プライマーを利用することを含み、この後者はＧＬ
ＣｌＡ遺伝子における点突然変異を検出するのに特に有用である（Ａｂｒａｖａ
ｙａら（１９９５） Ｎｕｃ． Ａｃｄ Ｒｅｓ ２３：６７５−６８２）。単
に例示的具体例において、該方法は、（ｉ）患者から細胞の試料を収集し、（ｉ
ｉ）試料の細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたは双方）を単離し、（
ｉｉｉ）ＧＬＣｌＡ遺伝子のハイブリダイゼーションおよび増幅が（もし存在す
れば）起こる条件下でＧＬＣｌＡ遺伝子に特異的にハイブリダイズする１以上の
プライマーと核酸試料を接触させ、次いで、（ｉｖ）増幅産物の存在または不存
在を検出し、あるいは増幅産物のサイズを検出し、または長さを対照試料と比較
する工程を含む。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、ここに記載された突然変異を
検出するのに使用される技術のうちのいずれかと組み合わせて予備的増幅工程と
して使用するのが望ましいと予測される。

【０２３７】 別の増幅方法は：自己保持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ， Ｊ．Ｃ．ら， １
９９０， Ｐｒｏｃ． ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ ８７：１
８７４−１８７８（転写増幅システム（Ｋｗｏｈ， Ｄ．Ｙ．ら， １９８９，
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：１１７３−
１１７７）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ， Ｐ．Ｍ．ら， １９
８８， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、またはいずれかの他
の核酸増幅方法、続いての当業者によく知られた技術を用いる増幅された分子の
検出を含む。これらの検出スキームは、かかる分子が非常に少ない数で存在すれ
ば、核酸分子の検出で特に有用である。

【０２３８】 主題のアッセイの好ましい具体例において、試料細胞からのＧＬＣｌＡ遺伝子
の対立遺伝子変異体における突然変異は、制限酵素切断パターンにおける改変に
よって同定される。例えば、試料および対照ＤＮＡを単離し、（所望により）増
幅し、１以上の制限エンドヌクレアーゼで消化し、断片長サイズをゲル電気泳動
によって測定する。さらに、配列特異的リボザイム（例えば、米国特許第５，４
９８，５３１号）の使用を用いて、リボザイム切断部位の発生または喪失によっ
て特異的突然変異の存在につきスコア取りすることができる。

【０２３９】 さらにもう１つの具体例において、当該分野で知られている種々の配列決定反
応のいずれかを用いて、ＧＬＣｌＡ遺伝子を直接的に配列決定し、試料ＧＬＣｌ
Ａの配列を対応する野生型（対照）配列と比較することによって突然変異を検出
することができる。例示的配列決定反応は、ＭａｘｉｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ
（Ｐｒｏｃ． Ａｃａｄ． Ｎａｔｌ． Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９７７） ７４：
５６０）またはＳａｎｇｅｒ（Ｓａｎｇｅｒら（１９７７） Ｐｒｏｃ． Ｎａ
ｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ７４：５４６３）によって開発された技術に基づく
ものを含む。また、種々の自動配列決定手法のうちのいずれかが、質量分析（例
えば、ＰＣＴ出願ＷＯ ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら（１９９６） Ａｄｖ
． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． ３６：１２７−１６２：およびＧｒｉｆｆｎら（
１９９３） Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３８：１
４７−１５９）を含めた、主題のアッセイを行う場合に利用することができる（
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （１９９５） １９：４４８）。以下のことは、
当業者には明らかである。ある具体例では、核酸塩基の１、２または３のみの出
現は配列決定反応で測定される必要がある。例えば、Ａ−トラック等が、例えば
、１つの核酸が検出される場合、それを行うことができる。

【０２４０】 さらなる具体例において、（ヌクレアーゼ、ヒドロキシルアミンまたは四酸化
オスミウムのごときまたはピペリジンでのごとき）切断剤からの保護はＲＮＡ／
ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＤＮＡヘテロデュプレックスにおけ
るミスマッチ塩基を検出するために用いることができる（Ｍｙｅｒｓら（１９８
５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２）。一般に、「ミスマッチ切断」の技
術は野生型ＧＬＣｌＡ配列を含むＲＮＡまたはＤＮＡを組織試料から得られた可
能な突然変異体ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることによって形成さ
れたヘテロデュプレックスを供することによって開始する。二本鎖デュプレック
スは、対照および試料ストランドの間の塩基対ミスマッチにより存在するごとく
デュプレックスの一本鎖領域を切断する剤で処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ
デュプレックスはＲＮａｓｅで処理し、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ１ヌク
レアーゼで処理して、ミスマッチした領域を酵素的に消化することができる。他
の具体例において、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスをヒド
ロキシルアミンまたは四酸化オスミウムで、およびピペリジンで処理して、ミス
マッチ領域を消化することができる。ミスマッチ領域の消化の後、次いで、得ら
れた物質を変性ポリアクリルアミドゲルでのサイズによって分離して突然変異を
測定することができる。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら（１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎ
ａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａら
（１９９２） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２１７：２８６−２９５。
好ましい具体例において、対照ＤＮＡまたはＲＮＡを検出のために標識すること
ができる。

【０２４１】 さらにもう１つの具体例において、ミスマッチ切断反応は、細胞の試料から得
られたＧＬＣｌＡ ｃＤＮＡにおける点突然変異を検出しマッピングするための
規定されたシステムにおいて、二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチ塩基対を認識す
る１以上の蛋白質を使用する（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」）。例えば、
Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素はＧ／ＡミスマッチでＡを切断し、ＨｅＬａ細胞か
らのチミジンＤＮＡグリコシダーゼはＧ／ＴミスマッチのＴを切断する（Ｈｓｕ
ら（１９９４） Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １５：１６５７−１６６２）
。例示的具体例によると、ＧＬＣｌＡ配列、例えば、野生型ＧＬＣｌＡ配列に基
づくプローブはテスト細胞からのｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物にハイブリダイ
ズする。デュプレックスをＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理し、切断産物は、も
し存在すれば、電気泳動プロトコル等から検出することができる。例えば、米国
特許第５，４５９，０３９号参照。

【０２４２】 他の具体例において、電気泳動移動度における改変を用いて、ＧＬＣｌＡ遺伝
子における多形領域の対立遺伝子変異体の突然変異または同一性を同定すること
ができる。例えば、一本鎖立体配座（ＳＳＣＰ）を用いて、突然変異体および野
生型核酸の間の電気泳動移動度の差異を検出することができる（Ｏｒｉｔａら，
（１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ， Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８
６：２７６６， またはＣｏｔｔｏｎ （１９９３） Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ ２
８５：１２５−１４４；およびＨａｙａｓｈｉ（１９９２） Ｇｅｎｅｔ Ａｎ
ａｌ ｔｅｃｈ Ａｐｐｌ ９：７３−７９）。試料および対照ＧＬＣｌＡ核酸
の一本鎖ＤＮＡ断片を変性し、再生させる。一本鎖核酸の二次構造は、配列に従
って変化し、電気泳動移動度で得られた改変は単一塩基変化でさえの検出を可能
とする。ＤＮＡ断片は標識プローブで標識または検出することができる。アッセ
イの感度は（ＤＮＡよりもむしろ）ＲＮＡを用いて増強るすことができ、ここに
、二次構造は配列の変化により敏感である。好ましい具体例において、主題の方
法は、電気泳動移動度の変化に基づいて二本鎖デュプレックスを分離するのに利
用する（Ｋｅｅｎら（１９９１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ ７：５）。

【０２４３】 さらにもう１つの具体例において、変性剤のグラジエントを含有するポリアク
リルアミドゲル中での突然変異体または野生型断片の移動は、変性グラジエント
電気泳動（ＤＧＧＥ）を用いてアッセイする（Ｍｅｙｒｓら（１９８５） Ｎａ
ｔｕｒｅ ３１３：４９５）。ＤＧＧＥを分析の方法として用いる場合、ＤＮＡ
を修飾して、それが、例えば、ＰＣＲによるほぼ４０ｂｐの高融解点ＧＣ−リッ
チＤＮＡのＧＣクランプを添加することによって完全に変性しないことを保証す
る。さらなる具体例において、温度グラジエントを、変性剤グラジエントの代わ
りに用いて、対照および試料ＤＮＡの移動度の差異を同定する（Ｒｏｓｅｎｂａ
ｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７） Ｂｉｏｐｙｓ Ｃｈｅｍ ２６５：
１２７５３）。

【０２４４】 多形領域の対立遺伝子変異体の点突然変異または同一性を検出するための他の
技術の例は、限定されるものではないが、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダ
イゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長を含む。例えば、（例
えば、対立遺伝子変異体における）公知の突然変異またはヌクレオチド差異を中
心的に置き換え、次いで、完全なマッチが見いだされる場合にのみハイブリダイ
ゼーションを可能とする条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズさせるオリゴヌク
レオチドプライマーを調製することができる（Ｓａｉｋｉら（１９８６） Ｎａ
ｔｕｒｅ ３２４：１６３）；Ｓａｉｋｉら（１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ
ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：６２３０）。かかる対立遺伝子特異
的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション技術を用いて、オリゴヌクレオチ
ドがＰＣＲ増幅標的ＤＮＡにハイブリダイズする場合は反応当たりの１つの突然
変異または多形領域を、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする膜に付着され
、標識標的ＤＮＡとハイブリダイズする場合は多形領域をテストすることができ
る。

【０２４５】 別法として、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術を本発明
と組み合わせて使用することができる。特異的増幅でプライマーとして使用され
るオリゴヌクレオチドは、（増幅が異なるハイブリダイゼーションに依存するよ
うに）分子の中心に、または適当に条件下で、多形伸長を防止しまたは減少させ
ることができる場合に１つのプライマーの極３’末端に注目する突然変異または
多形領域を担うことができる（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３） Ｔｉｂｔｅｃｈ
１１：２３８）。加えて、突然変異の領域における新規制限部位を導入して切
断ベースの検出を創製することができる（Ｇａｓｐａｒｉｎｉら（１９９２）
Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ６：１）。ある具体例において、増幅のた
めにＴａｑリガーゼを用いて増幅を行うことができる（Ｂａｒａｎｙ（１９９１
） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：１８９）。
かかる場合において、もし５’配列の３’末端に完全なマッチがあり、増幅の存
在または不存在を探すことによって特異的部位に公知の突然変異の存在を検出す
ることが可能となる場合にのみ連結が起こる。

【０２４６】 もう１つの具体例において、対立遺伝子変異体の同定は、例えば、米国特許第
４，９９８，６１７号およびＬａｎｄｅｇｒｅｎ、Ｕ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
４１：１０７７−１０８０（１９８８）に記載されているオリゴヌクレオチド連
結アッセイを用いて行われる。ＯＬＡプロトコルは、標的の一本鎖の配列に隣接
する配列にハイブリダイズすることができるように設計された２つのオリゴヌク
レオチドを用いる。オリゴヌクレオチドの１つは分離マーカー、例えば、ビオチ
ン化されたものに連結され、他のものは検出可能に標識される。もし正確な相補
的配列が標的分子に見いだされるならば、オリゴヌクレオチドは、その末端が隣
接するようにハイブリダイズし、連結基質を生じる。次いで、連結は標識オリゴ
ヌクレオチドがアビジン、またはもう１つのビオチンリガンドを用いて回収され
ることを可能とする。Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ， Ｄ．Ａ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａ
ｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ （Ｕ．Ｓ．Ａ．）８７：８９２３−８９２７（１
９９０）。この方法において、ＰＣＲを用いて、標的ＤＮＡの指数関数的増幅を
達成し、これを次いでＯＬＡを用いて検出する。

【０２４７】 このＯＬＡ方法に基づくいくつかの技術が開発されており、これを用いてＧＬ
ＣｌＡ遺伝子の多形領域の特異的対立遺伝子変異体を検出する。米国特許第５，
５９３，８２６号は、ホスホルアミデートを有するコンジュゲートを形成するた
めに３’−アミノ基および５’−リン酸化オリゴヌクレオチドを有するオリゴヌ
クレオチドを用いてＯＬＡを開示する。Ｔｏｂｅら（（１９９６） Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２４：３７２８）に記載されているＯＬＡのもう１
つの変異体において、ＰＣＲと組み合わせたＯＬＡは、単一マイクロタイターウ
ェルにおいて２つの対立遺伝子のタイプ分けを可能とする。ユニークなハプテン
、すなわち、ジゴキシゲニンおよびフルオレセインを持つ対立遺伝子−特異的プ
ライマーの各々を作成することによって、各ＯＬＡ反応は、異なる酵素レポータ
ー、アルカリ性ホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼで標
識されるハプテン特異的抗体を用いることによって検出することができる。この
系は、２つの異なる色彩の生産に導く高スループット様式を用いて２つの対立遺
伝子の検出を可能とする。

【０２４８】 本発明は、さらに、ＧＬＣｌＡ遺伝子において単一のヌクレオチド多形を検出
する方法を提供する。単一ヌクレオチド多形は非変異体配列の領域な近接挟まれ
た変異の部位を構成するので、その分析は、変異の部位に存在する単一ヌクレオ
チドの同一性の測定を必要とするに過ぎず、各患者につき完全な遺伝子配列を決
定する必要はない。いくつかの方法が、かかる単一ヌクレオチド多形の分析を容
易とするために開発されてきた。

【０２４９】 １つの具体例において、例えば、Ｍｕｎｄｙ，Ｃ．Ｒ．（米国特許第４，６５
６，１２７号）に開示されている特殊化されたエキソヌクレアーゼ−抵抗性ヌク
レオチドを用いて検出することができる。該方法によると、該多形の直ぐに３’
側の対立遺伝子配列に相補的なプライマーは、特定の動物またはヒトから得られ
た標的分子にハイブリダイズすることを可能とする。もし標的分子上の多形部位
が存在する特定のエキソヌクレアーゼ−抵抗性ヌクレオチド誘導体に相補的であ
るヌクレオチドを含有すれば、その誘導体はハイブリダイズしたプライマーの末
端に取り込まれるであろう。かかる取り込みはプライマーをエキソヌクレアーゼ
に対して抵抗性とし、それにより、その検出を可能とする。試料のエキソヌクレ
アーゼ−抵抗性誘導体の同一性は知られているので、プライマーがエキソヌクレ
アーゼに抵抗性となるという発見は、標的分子の多形部位に存在するヌクレオチ
ドは反応で使用されるヌクレオチド誘導体のそれと相同である。この方法は有利
である。というのは、それは大量の外来性配列の測定を必要としないからである
。

【０２５０】 本発明のもう１つの具体例において、溶液−ベースの方法は、多形部位のヌク
レオチドの同一性を測定するのに使用される、Ｃｏｈｅｎ，Ｄ．ら（フランス特
許第２，６５０，８４０号；ＰＣＴ出願番号ＷＯ９１／０２０８７）。米国特許
第４，６５６，１２７号のＭｕｎｄｙ方法におけるごとく、多形部位の直ぐに３
’側の対立遺伝子配列に相補的であるプライマーを用いる。該方法は、もし多形
部位のヌクレオチドに対する相補性がプライマーの末端に取り込まれるようにな
ると、標識されたジデオキシヌクレオチド誘導体を用いるその部位のヌクレオチ
ドの同一性を測定する。

【０２５１】 Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ ＡｎａｌｙｓｉｓまたはＧＢＡ^ＴＭとして知られて
いる別の方法は、Ｇｏｅｌｅｔ， Ｐ．ら（ＰＣＴ出願９２／１５７１２）によ
って記載されている。Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．らの方法は、標識されたターミネータ
ーおよび多形部位の３’側に相補的なプライマーの混合物を使用する。取り込ま
れた標識ターミネーターは、かくして、評価されるべき標識分子の多形部位に存
在するヌクレオチドによって、およびそれに対する相補性によって測定される。
Ｃｏｈｅｎらの方法（フランス特許第２，６５０，８４０号；ＰＣＴ出願番号Ｗ
Ｏ９１／０２０８７）の方法とは対照的に、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．らの方法は、好
ましくは、プライマーまたは標的分子が固相に固定化された異種相アッセイであ
る。

【０２５２】 最近、ＤＮＡ中の多形部位をアッセイするためのいくつかのプライマー−ガイ
ドヌクレオチド取り込み方法が記載されている（Ｋｏｍｈｅｒ， Ｊ．Ｓ．ら，
Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． １７：７７７９−７７８４（１９８９
）；Ｓｏｋｏｌｏｖ， Ｂ．Ｐ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８
：３６７１（１９９０）；Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．−Ｃら， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ
８：６８４−６９２（１９９０）；Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ， Ｍ．Ｎ．ら， Ｐ
ｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．）８８：１１４
３−１１４７（１９９１）；Ｐｒｅｚａｎｔ，Ｔ．Ｒ．ら， Ｈｕｍ． Ｍｕｔ
ａｔ． １：１５９−１６４（１９９２）；Ｕｇｏｚｚｏｌｉ， Ｌ．ら， Ｇ
ＡＴＡ ９：１０７−１１２（１９９２）；Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．ら， Ａｎａｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０８：１７１−１７５（１９９３））。これらの方法は、
それらが全て多形部位における塩基間を区別するための標識デオキシヌクレオチ
ドの取り込みに頼る点でＧＢＡ^ＴＭとは異なる。かかる様式において、シグナル
は取り込まれたデオキシヌクレオチドの数に比例するので、同一ヌクレオチドの
ランで起こる多形の結果、該ランの長さに比例したシグナルが得られる（Ｓｙｖ
ａｎｅｎ， Ａ．Ｃ．ら， Ａｍｅｒ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．５２：
４６−５９（１９９３））。

【０２５３】 蛋白質翻訳の未成熟終止を生じる突然変異については、蛋白質切形テスト（Ｐ
ＴＴ）は効果的な診断アプローチを供する（Ｒｏｅｓｔら， （１９９３） Ｈ
ｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． ２：１７１９−２１； ｖａｎ ｄｅｒ Ｌ
ｕｉｊｔら（１９９４） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０：１−４）。ＰＴＴでは、Ｒ
ＮＡをまず利用可能な組織および逆転写ＰＣＲから単離し、注目するセグメント
をＰＣＲによって増幅する。次いで、逆転写ＰＣＲの産物を、真核生物翻訳を開
始するためのＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよび配列を含有するプライマー
でのネステッドＰＣＲ増幅のための鋳型として用いる。注目する領域の増幅後、
プライマーに取り込まれたユニークなモチーフは順次のイン・ビトロ転写および
ＰＣＲ産物の翻訳を可能とする。翻訳産物のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動に際して、切形されたポリペプチドの出現は、翻訳の未
成熟終止を引き起こす成熟の存在をシグナルとする。この技術の変形において、
注目する標的領域が単一エクソンに由来する場合、（ＲＮＡとは反対に）ＤＮＡ
をＰＣＲ鋳型として使用する。

【０２５４】 本明細書に記載された方法を、例えば、臨床的状況で通常使用して緑内障の兆
候または家族履歴を呈する患者を診断することができる、少なくとも１つのプロ
ーブ核酸、プライマー組；および／またはここに記載される抗体試薬を含むプレ
パック診断キットを利用することによって行うことができる。

【０２５５】 いずれの細胞タイプまたは組織も後記する診断で利用することができる。好ま
しい具体例において、体液、例えば血液を対象から得て、ＧＬＣｌＡ遺伝子の多
形領域の対立遺伝子変異体の突然変異または同一性の存在を測定する。体液、例
えば、血液は、公知の技術（例えば、静脈穿刺）によって得ることができる。別
法として、核酸テストを乾燥試料（例えば、毛髪または皮膚）につき行うことが
できる。親診断のために、胎児核酸試料をＢｉａｎｃｈｉに対する国際出願番号
ＷＯ９１／０７６６０に記載された母親血液から得ることができる。別法として
、アミノサイクルまたは絨毛は親テストを行うのに得ることができる。

【０２５６】 ＧＬＣｌＡ遺伝子の多形領域の特異的対立遺伝子変異体の突然変異の存在を測
定するためのＲＮＡまたは蛋白質を使用する場合、利用することができる細胞ま
たは組織はＧＬＣｌＡ遺伝子を発現しなければならない。これらの方法で使用さ
れる好ましい細胞は、網膜の光受容体を含む。使用することができる別の細胞ま
たは組織は、ノーザンブロット分析のごとき、対象における特異的ＧＬＣｌＡ遺
伝子の発現パターンを測定することによって同定することができる。

【０２５７】 診断手法は、核酸精製が必要ではないように、バイオプシーまたはリセクショ
ンから得られた患者組織の組織セクション（固定および／または凍結）に際して
イン・サイチュで直接的に行うことができる。核酸試薬は、かかるイン・サイチ
ュ手法のためのプローブおよび／またはプライマーとして用いることができる（
例えば、Ｎｕｏｖｏ， Ｇ．Ｊ．， １９９２， ＰＣＲ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈ
ｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ）。

【０２５８】 １つの核酸配列の検出に主として焦点を当てる方法に加えて、かかる検出スキ
ームでプロフィールを創製することができる。フィンガープリントを、例えば、
異なるディスプレイ手法、ノーザン分析および／またはＲＴ−ＰＣＲを利用する
ことによって創製することができる。

【０２５９】 前記で議論した野生型または突然変異体ミオシリンポリペプチドまたはその対
立遺伝子変異体に対する抗体を病気診断および予後で使用することができる。か
かる診断方法を用いて、ミオシリンポリペプチド発現のレベル、またはミオシリ
ンポリペプチドの構造および／または細胞または細胞下位置の異常を検出するこ
とができる。構造的差異は、例えば、正常ミオシリンポリペプチドに対する突然
変異体ミオシリンポリペプチドのサイズ、電気陰性度、または抗原性の差異を含
むことができる。分析すべき組織または細胞タイプからの蛋白質は、限定される
ものではないがウェスタンブロット分析を含めた当該分野でよく知られた技術を
用いて容易に検出することができ、あるいは単離することができる。ウェスタン
ブロット分析を行うための方法の詳細な説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，
１９８９， 前掲，第１８章参照。ここに使用される蛋白質検出および単離方
法は、出典明示して本明細書の一部とみなす例えばＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ
， （Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ．およびＬａｎｅ， Ｄ． １９８８， 「Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」， Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されているもののご
ときであり得る。

【０２６０】 これは、例えば、顕微鏡、フローサイトメトリー、または蛍光検出とカップリ
ングさせた蛍光標識抗体（後記参照）を使用する免疫蛍光技術によって達成する
ことができる。本発明で有用に抗体（またはその断片）は、加えて、ミオシリン
ポリペプチドのイン・サイチュ検出のために、免疫蛍光または免疫電子顕微鏡に
おけるごとく、組織学的に使用することができる。イン・サイチュ検出は、患者
からの組織学的検体を取り出し、本発明の標識抗体をそれに適用することによっ
て達成することができる。抗体（または断片）は、好ましくは、生物学的試料へ
標識抗体（または断片）を重複することによって適用される。かかる手法の使用
を通じて、ミオシリンポリペプチドの存在のみならず、調べた組織におけるその
分布も測定することが可能である。本発明を用い、当業者であれば、（染色手法
のごとき）非常に種々の組織学的方法のいずれかを修飾してかかるイン・サイチ
ュ検出を達成することができる。

【０２６１】 しばしば、固相支持体または担体を抗原または抗体を結合することができる支
持体として使用する。よく知られた支持体または担体はガラス、ポリスチレン、
ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然お
よび修飾セルロース、ポリアクリルアミドゲル、ガブロス、およびマグネタイト
を含む。担体の性質は、本発明の目的では、ある程度可溶性であるか、または不
溶性である。支持体物質は、カップリングした分子が抗原または抗体に結合する
ことができる限り、実質的にいずれかの可能な構造立体配座を有することができ
る。かくして、支持体立体配座は、ビーズ、または円筒におけるごとく、テスト
チューブの内部表面、またはロッドの外部表面におけるごとく、球形であり得る
。別法として、表面はシート、テスト片等のごとき平坦であり得る。好ましい支
持体はポリスチレンビーズを含む。当業者であれば、抗体または抗原を結合させ
るための多くの他の適当な担体を知っているか、あるいはルーチン的実験の使用
によってそれを確認できるであろう。

【０２６２】 抗−ミオシリンポリペプチド特異的抗体を標識する１つの手段は、酵素への連
結および酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）での使用を介する（Ｖｏｌｌｅｒ， 「
Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋａｇｅ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓ
ａｙ （ＥＬＩＳＡ）」， Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｈｏｒｉｚｏｎｓ ２：１
−７， １９７８， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ
Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ
， ＭＤ；Ｖｏｌｌｅｒら， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈｏｌ， ３１：５０
７−５２０（１９７８）； Ｂｕｔｌｅｒ， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．
７３：４８２−５２３（１９８１）； Ｍａｇｇｉｏ（編） Ｅｎｚｙｍｅ Ｉ
ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆ
Ｌ， １９８０；Ｉｓｈｉｋａｗａら（編） Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓ
ｓａｙ， Ｋｇａｋｕ Ｓｈｏｉｎ， Ｔｏｋｙｏ， １９８１）。抗体に結合
した酵素は、例えば、分光法、蛍光法によって、または可視手段によって検出す
ることができる化学的部位を生じるように、適当な基質、好ましくは、色原体基
質と反応するであろう。検出可能に抗体を標識するのに使用できる酵素は、限定
されるものではないが、マレートデヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレ
アーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナー
ゼ、アルファ−グリセロホスフェート、デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イ
ソメラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ
、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リ
ボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを含む。検出は、
酵素のための色原体基質を使用する発色方法によって達成することができる。検
出は同様に調製された標準と比較して基質の酵素反応の程度の可視的比較によっ
て達成することができる。

【０２６３】 また、検出は、種々の他のイムノアッセイのいずれかを用いて達成することが
できる。例えば、抗体または抗体断片を放射標識することによって、ラジオイム
ノアッセイ（ＲＩＡ）の使用を通じてフィンガープリント遺伝子野生型または突
然変異体ペプチドを検出するのが可能である（例えば、出典明示して本明細書の
一部とみなすＷｅｉｎｔｒａｕｂ， Ｂ． Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｒａ
ｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ， Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｃｏ
ｕｒｓｅ ｏｎ Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
， Ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ， １９８６， ３月参照）
。放射活性同位体はガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターの使用
のごとき手段によって検出することができる。

【０２６４】 また、抗体を蛍光化合物で標識することもできる。蛍光的に標識された抗体を
適当な波長の光に暴露する場合、その存在は蛍光により検出することができる。
最も通常に使用される蛍光標識化合物の中には、フルオレセインイソチオシアネ
ート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、
ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミンがある。

【０２６５】 抗体は^１５２Ｅｕまたはランタニド系列の他のもののごとき蛍光発光金属を用
いて検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン
四酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のごとき金属キ
レート基を用いて抗体に付着させることができる。

【０２６６】 また、抗体は、それをケミルミネセンス化合物にカップリングさせることによ
って検出可能に標識することができる。次いで、ケミルミネセンス−タグド抗体
の存在は、化学反応の間に生起するルミネセンスの存在を検出することによって
測定することができる。特に有用なケミルミネセンス標識化合物の例はルミナー
ル、イソルミナール、テロマチィックアクリジニウムエステル、イミダゾール、
アクリジニウム塩およびオキサレートエステルである。

【０２６７】 同様に、バイオルミネセンス化合物を用いて、本発明の抗体を標識することが
できる。バイオルミネセンスは、触媒蛋白質が化学ルミネセンス反応の効率を増
加させる生物学的系で見いだされるケミルミネセンスのタイプである。バイオル
ミネセンス蛋白質の存在は、ルミネセンスの存在を検出することによって測定さ
れる。標識の目的の重要なバイオルミネセンス化合物はルシフェリン、ルシフェ
ラーゼおよびエコリンである。

【０２６８】 さらに、遺伝子または遺伝子産物または多形変異体における改変を検出するた
めの前記方法のいずれかを用いて治療または療法の進行をモニターすることがで
きる。

【０２６９】 ４．８．２ ファルマコゲノミィックス 単独または緑内障に寄与する他の遺伝的欠陥についての情報と組み合わせて、
個体における欠陥または欠失ＧＬＣｌＡ遺伝子または蛋白質の結果となる（ＧＬ
ＣｌＡ遺伝子プロフィール）の結果となる、特定の改変または複数改変の知識は
、個体の遺伝子プロフィールに対する緑内障についての治療についてのあつらえ
、「ファルマコゲノミィックス」の目標を可能とする。例えば、ＧＬＣｌＡ遺伝
子の特異的対立遺伝子を有する対象は緑内障の兆候を呈することができるか、ま
たは呈することができない、あるいは兆候緑内障を発症する素因がある。さらに
、それらの対象が兆候的であれば、それらはある種の薬物、例えば、特異的ＧＬ
ＣｌＡ治療剤に応答することができるかまたはできず、しかしもう１つのものに
は応答できる。かくして、緑内障について兆候的である対象の集団からのＧＬＣ
ｌＡ遺伝子的プロフィールの創製（例えば、緑内障の発症に関連したＧＬＣｌＡ
遺伝子の改変のカテゴリー化）および個体のＧＬＣｌＡプロフィールの集団プロ
フィールに対する個体ＧＬＣｌＡプロフィールの比較は、特定の患者または患者
集団（すなわち、同一遺伝子改変を有する患者の群）にとってより安全またはよ
り効果的であるべきである薬物の選択またはデザインを可能とする。

【０２７０】 例えば、ＧＬＣｌＡ集団プロフィールは、ＧＬＣｌＡプロフィール、例えば、
緑内障を有する患者集団におけるＧＬＣｌＡ遺伝子の同一性を測定することによ
って行うことができる。所望により、ＧＬＣｌＡ集団プロフィールは、さらに、
１）ＧＬＣｌＡ関連病気に関連した兆候の重症度、２）ＧＬＣｌＡ遺伝子発現レ
ベル、３）ＧＬＣｌＡ ｍＲＮＡ、および／または４）ＧＬＣｌＡ蛋白質レベル
をモニターすることを含めた種々の方法のいずれかを用い、（ｉｉｉ）ＧＬＣｌ
Ａ遺伝子またはＧＬＣｌＡ経路遺伝子に存在する特定の遺伝的改変または複数改
変に基づいて集団を分割するまたはカテゴリー分けし、ＧＬＣｌＡ治療剤に対す
る集団の応答に関する情報を含むことができる。また、ＧＬＣｌＡ遺伝子集団プ
ロフィールは、所望により、患者が特定の治療剤に応答性または非応答性であり
得る特定の改変を示す。従って、この情報または集団プロフィールは、いずれの
個体がそれらの個々のＧＬＣｌＡプロフィールに基づいて、特定の薬物に応答す
べきかを予測するのに有用である。

【０２７１】 好ましい具体例において、ＧＬＣｌＡプロフィールは、転写または発現レベル
プロフィールであり、工程（ｉ）は、単独または同病気に寄与することが知られ
ている他の遺伝子の発現レベルと組み合わせて、ＧＬＣｌＡ蛋白質の発現レベル
を測定することよりなる。ＧＬＣｌＡプロフィールは病気の種々の段階において
多くの患者で測定することができる。

【０２７２】 ファルマコゲノミィックス実験は、トランスジェニック動物を用いて行うこと
ができる。例えば、ＧＬＣｌＡ遺伝子の特異的対立遺伝子変異体を含有する、例
えばここに記載されたトランスジェニックマウスを生産することができる。これ
らのマウスは、例えば、その野生型ＧＬＣｌＡ遺伝子をヒトＧＬＣｌＡ遺伝子の
対立遺伝子で置き換えることによって創製することができる。これらのマウスの
特異的ＧＬＣｌＡ治療剤に対する応答を測定することができる。

【０２７３】 ４．８．３ 臨床試験の間のＧＬＣｌＡ治療剤の効果のモニタリング ＧＬＣｌＡまたは病気遺伝子プロフィールに基づく、最高臨床利点を示すこと
が予測される標的集団の能力は、１）失望するマーケット結果を持つ市販薬物の
置き換え；２）その臨床的発症が患者亜群特異的である、安全性または効率限定
の結果として中断された薬物の救済、および３）（例えば、マーカーとしてＧＬ
ＣｌＡの使用は効果的用量を最適化するのに有用であるので）薬物候補およびよ
り最適に薬物標識についての加速されたおよびより少ない価格の開発を可能とす
る。

【０２７４】 個体のＧＬＣｌＡ治療剤での治療は、ミオシリン蛋白質レベルもしくは活性、
ＧＬＣｌＡ ｍＲＮＡレベル、および／または転写レベルのごとき、ＧＬＣｌＡ
特徴を測定することによってモニターすることができる。この測定は、治療が効
果的であるか否か、あるいはそれが調整されるかまたは最適化することができる
か否かを示す。かくして、ＧＬＣｌＡは臨床試験の間の薬物の効率についてのマ
ーカーとして使用することができる。

【０２７５】 好ましい具体例において、本発明は、（ｉ）剤の投与に先立って、対象から予
備投与試料を得、（ｉｉ）予備投与試料におけるミオシリン蛋白質、ｍＲＮＡ、
またはゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出し、（ｉｉｉ）対象から１以上の投与
後試料を得、（ｉｖ）投与後試料中のミオシリン蛋白質、ｍＲＮＡ、またはゲノ
ムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出し、（ｖ）予備投与試料中のミオシリ
ン蛋白質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを投与後試
料または複数試料中のミオシリン蛋白質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡと比較
し、（ｖｉ）該剤の対象への投与をそれに従って改変する工程を含む剤（例えば
、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティックス、蛋白質、ペプチド、
核酸、小分子、または他の薬物候補、例えば、ここに記載するスクリーニングア
ッセイによって同定された薬物候補）での対象の治療の効果をモニターする方法
を含む。例えば、該剤の増大した投与は、野生型ＧＬＣｌＡ遺伝子の発現または
野生型ミオシリン蛋白質の発現を検出されるより高いレベルまで増加させるのが
望ましいであろう。別法として、該剤の減少した投与は、突然変異体ミオシリン
遺伝子の発現または突然変異体ＧＬＣｌＡ蛋白質の発現を検出されるよりも低い
レベルまで減少させるのが望ましいであろう。

【０２７６】 対象の細胞を、ＧＬＣｌＡ治療剤の投与の前後に得て、ＧＬＣｌＡ以外の発現
のレベルを検出し、ＧＬＣｌＡ治療剤が有害であり得る遺伝子の発現を増加また
は減少しないことを証明することもできる。これは、例えば、転写プロファイリ
ングの方法を用いることによってなすことができる。かくして、イン・ビボでＧ
ＬＣｌＡ治療剤に暴露された細胞からのｍＲＮＡおよびＧＬＣｌＡ治療剤に暴露
されなかった同一タイプの細胞からのｍＲＮＡは逆転写し、多数の遺伝子からの
ＤＮＡを含有するチップにハイブリダイズさせ、それにより、ＧＬＣｌＡ治療剤
で処理したまたは処理しなかった細胞における遺伝子の発現を比較できる。もし
、例えば、ＧＬＣｌＡ治療剤が個体におけるプロトオンコジーンの発現にスイッ
チを入れるならば、この特定のＧＬＣｌＡ治療剤の使用は望ましくないであろう
。

【０２７７】 本発明は、さらに、断じて限定するものとは解釈されるべきではない以下の例
によって説明される。（本出願を通じて引用された文献、発行された特許、公開
された特許出願を含めた）全ての引用文献の内容は、明示的に、出典明示して本
明細書の一部とみなす。特記しない限り、本発明の実施は、当業者の技量内にあ
る細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、
組換えＤＮＡ、および免疫学の通常の技術を使用する。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，
Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ （Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；
ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｖｏｌｕｍｅｓ ＩおよびＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖ
ｅｒ編，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
（Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｔ編， １９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら， 米国特許第４，
６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
（Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４）；Ｔｒ
ａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅ
ｓ ＆ Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａ
ｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ （Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌ
ｉｓｓ， Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎ
ｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ
， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ （１９８４）； ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．，
Ｎ．Ｙ．）； Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍ
ｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ （Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ
編，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４巻および１５５巻（
Ｗｕら編）， Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌ
ｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗ
ａｌｋｅｒ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， １９８７）
；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ； Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ， Ｉ−ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，１
９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ （
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８６）。

【０２７８】 本発明を、さらに、断じて限定的なものと解釈されるべきではない以下の実施
例によって説明する。本出願を通じて引用された（文献、発行された特許、公開
された特許出願、および同時係属特許出願を含めた）全ての引用文献の内容は、
出典明示して本明細書の一部とみなす。

【０２７９】 ５．１ 家族性開放角緑内障の染色体１ｑ２１−ｑ３１への遺伝連鎖 材料および方法 家系 虹彩角膜角異常なくして若年開始解放角緑内障に罹った５つの連続世代が同定
された家族。該家族は、１８００年代の後期の中部西部米国にドイツ国から移住
した婦人の子孫からなる。罹患家族メンバーにおける病気状態は寿命の最初の３
０年の間の開始、正常後室角、高眼内圧力、全身または他の眼異常、および罹患
個体における緑内障を制御する外科手術の必要性を含んだ。緑内障の５０％危険
性の合計３５家族メンバーは、屈折に関する可視的激烈、スリット−ランプバイ
オ顕微鏡、圧平トモメトリー、ゴニオスコピー、ステレオディスク写真術および
Ｈｕｍｐｈｒｅｙ， ＧｏｌｄｍａｎｎまたはＯｃｔｏｐｕｓ視野測定を含めた
完全な眼調査を有した。２つの他の罹患患者は他の眼科医の記録をレビューする
ことによって確認した。患者は、もし彼らが３０ｍｍＨｇよりも大きな圧力およ
び視覚神経または視野損傷の証拠を書き残しているならば、あるいは彼らが２２
ｍｍＨｇを超える眼内圧力および明白に罹患した子供を有するならば、連鎖につ
き罹患されていると考えられる。罹患家族メンバーは、診断の初期年齢、正常な
出現小柱メッシュワーク、非常に高い眼内圧力（しばしば５０ｍｍＨｇを超える
）、および比較的圧力−抵抗性の視神経によって特徴付けられる。図１は家系の
絵表示である。

【０２８０】 ＤＮＡタイピング 血液試料は、全ての生存する罹患家族メンバーならびに子供を持つ罹患患者の
６人の配偶者から得た。１０ｍｌ血液をＥＤＴＡ−含有ガラスチューブにおける
各患者から得た。ＤＮＡは非有機抽出手法を用いて血液から調製した（Ｇｒｉｍ
ｂｅｒｇ， Ｊ．ら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． １７， ８３９
０（１９８９））。全常染色体ゲノムを横切って分布した短いタンデムリピート
多形（ＳＴＲＰＳ）は文献またはＪ．Ｌ．Ｗｅｂｅｒによって親切にも供された
ものから選択した。大部分は［ｄＣ−ｄＡ］−［ｄＧ−ｄＴ］ジヌクレオチドリ
ピートであった。各ＳＴＲＰを近接挟むオリゴヌクレオチドプライマーを、標準
的なホスホルアミダイト化学を用いて合成した（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓモデル３９１ＤＮＡ合成器）。各ＳＴＲＰの増幅は、以下の：１．２５
１ １０×緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．８，５００ｍＭ ＫＣ
ｌ， １５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．０１％ｗ／ｖゼラチン）、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
ＰおよびｄＴＴＰの各３００Ｍ、３７Ｍ ｄＡＴＰ、５０ピコモルの各プライマ
ー、０．２５１−^３５Ｓ−ｄＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ＞１０００Ｃｉミリモル ^−１ ）、および０．２５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／
Ｃｅｔｕｓ）のうちの各々を含有する８．３５Ｉ ＰＣＲ中の５０ｎｇの各患者
のＤＮＡで行った。試料は以下の条件：３０秒間の９４Ｃ、３０秒間の５５Ｃ、
および３０秒間の７２Ｃ下で３５サイクルの間、ＤＮＡサーモサイクラー（Ｐｅ
ｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ）中でインキュベートした。増幅に続き、５
リットルの停止溶液（９５％ホルムアミド、１０ｍＭ ＮａＯＨ、０．０５％ブ
ロモフェノールブルー、０．０５％キシレンシアノール）を各試料に添加した。
９５Ｃにおける３分間の変性に続き、各試料は直ちに予め加温したポリアクリル
アミドゲル（６％ポリアクリルアミド、７Ｍ尿素）に負荷し、３−４時間電気泳
動に付した。次いで、ゲルをワットマン３ｍｍペーパー上に置き、スラブゲル乾
燥機で乾燥した。オートラジオグラフィーをＫｏｄａｋ Ｘｏｍａｔ ＡＲフイ
ルムを乾燥したゲルに２４−３６時間暴露することによって創製した。

【０２８１】 連鎖分析 オートラジオグラフィーからの遺伝子型データをマッキントッシュコンピュー
ターにエンターした。Ｈｙｐｅｒｃａｒｄ−ベースのプログラム（Ｎｉｃｈｏｌ
ｓ， ＢＥら， Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ５１ Ａ３６９（１９９２）
）を用いて、マーカーデータを貯蔵しレビューし、ならびにコンピュータープロ
グラムＬＩＮＫＡＧＥ（バージョン５．１）（Ｌａｔｈｒｏｐ， ＧＭおよびＬ
ａＬｏｕｅｌ， ＪＭ ３５９，７９４−８０１（１９９２））を備えた分析用
のＤＯＳ−コンパチブルマシーンにそれを輸送した。対立遺伝子頻度は各マーカ
ーで同等であると推定した。ＭＬＩＮＫルーチンは対分析で用いた。病気および
２つのマーカー（Ｄ１Ｓ１９１およびＤ１Ｓ１９４）の全ての可能な順序の相対
的オッズはＩＬＩＮＫプログラム下で行った。連鎖の有意性は標準的な基準を用
いて評価した（Ｚ_ｍａｘ＞３．０）。

【０２８２】 結果 臨床的知見 ３７の家族メンバーの全ては既知の罹患親または同胞のため病気を有する５０
％危険性であった。これらの患者のうちの１９人は、主題開放角緑内障の診断に
合致する上昇した眼内圧力および視野欠陥を有した。３人のさらなる患者は中程
度に上昇した眼内圧力および明白に罹患した子供を有した。

【０２８３】 連鎖分析 ９０を超える短いタンデムリピート多形をタイプ分けし、連鎖前の家族を染色
体１の長い腕にマップしたマーカーで検出した。全ての利用可能な家族メンバー
および３３の染色体１マーカーを用いる２点最大確率計算はそれらのうちの８つ
に対する有意な連鎖を明らかとした（表２）。Ｄ１Ｓ２１２は家族の全ての罹患
メンバーにつき情報的であり、対の連鎖分析は６．５のロッドスコアを生じた（
＝０）。多重点連鎖分析はピークにロッドスコアを与えなかった。従って、緑内
障遺伝子座は、Ｄ１Ｓ１９１およびＤ１Ｓ１９４の間のサイズが約２０センチモ
ルガン（ｃＭ）の領域に位置すると判断された。これらのマーカーの双方は、家
族中の罹患個体における複数組換え体（各々、２および３）を示した。順序Ｄ１
Ｓ１９１−緑内障−Ｄ１Ｓ１９４は他の２つの可能なオーダーよりも１，０００
倍大きいようであった。

【０２８４】

【表６】 ５．２ 若年初代開放角緑内障遺伝子座の遺伝微細マッピングおよび緑内障遺 伝子の同定および特徴付け 一旦初代連鎖が同定されたならば、クローニングを位置付けすることによって
いずれかの病気遺伝子を同定するにおける次の工程は、最小の可能な遺伝領域に
対する候補遺伝子座を狭くすることである。実施例５．１に記載された最初の実
験は、初代開放角緑内障遺伝子が染色体１ｑ上のマーカーＤ１Ｓ１９４およびＤ
１Ｓ１９１によって近接挟まれたほぼ２０ｃＭ領域内にある。さらなるマーカー
および家族を得、これを用いて、これらの家族のうちの２つを用い、２．５ｃＭ
領域に対して遺伝子座を精錬した。第３の家族は間隔をさらに狭くすることを可
能とする。

【０２８５】 家族源に加えて、多形ＤＮＡマーカーおよび遺伝子マップを用いて、１ｑ緑内
障遺伝子座を精錬した。ＳＴＲＰを用い、各家族の遺伝子型を測定した。以下の
プロトコルを用い、各ＳＴＲＰの増幅を行った： １）ゲノムＤＮＡ（約１ｇ／ｌ）を１／５０に希釈した、すなわち、２０１「
ストック」ＤＮＡおよび９８０ ｄｄ Ｈ_２Ｏ。

【０２８６】 ２）ＰＣＲについての鋳型としての「希薄」ＤＮＡの２．５１を使用。

【０２８７】 ３）以下のごとくＰＣＲ反応ミックスを調製 １．２５ｌ×緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） １．１２ｌの各プライマー（５０ピコモルの各プライマー） ０．５ｌ ｄＮＴＰ（５ｍＭ Ｃ、Ｔ＆Ｇおよび０．６２５ｍＭ Ａ「冷」
） ３．５ｌ ｄｄ Ｈ_２Ｏ ０．２５ｌ^３５Ｓ−ｄＡＴＰ ０．１ｌ Ｔａｑポリメラーゼ 油（１滴） ４）所与のプライマーについての最適条件でＰＣＲを行い（通常９４ ３０秒
、５５ ３０秒および７２ ３０秒）、３５サイクルを行う。

【０２８８】 ５）５ｌの停止溶液（９５％ホルムアミド、１０ｍＭ ＮａＯＨ、０．０５％
ブロモフェノールブルー、０．０５％キシレンシアノール）を各チューブに添加
する。

【０２８９】 ６）９５Ｃにおいて３分間試料を変性し、予め加温したポリアクリルアミドゲ
ルに直ちに負荷した。

【０２９０】 ７）ワットマンペーパー上でゲルを乾燥し、１〜２日間オートラジオグラフィ
ーフイルムに暴露した。

【０２９１】 可能な場合、ゲル上の異なるＳＴＲＰの多重負荷を行った。ゲル当たり６まで
のマーカーが成功して負荷された。加えて、ＰＣＲ増幅（３マーカーまで）が成
功して増幅された。若年緑内障遺伝子は調べた家族内の観察された組換えに基づ
いてＡＦＭ２３８およびＡＴ３（８センチモルガン間隔）の間に存在すると考え
られる。家族間のハプロタイプ分析は、さらに、この間隔をＤ１Ｓ２１０および
ＡＴ３の間の２センチメーター間隔まで狭くした。

【０２９２】 遺伝子間隔は有意に狭くなったので、物理的マッピング戦略を用いることがで
きる。注目する領域へのＹＡＣマッピングを同定するための全ヒトゲノム酵母人
工染色体（ＹＡＣ）ライブラリーをスクリーニングする最も親密なフランキング
マーカー。ＣＥＰＨおよびＣＥＰＨメガ−ＹＡＣライブラリーはこの目的で使用
することができる（Ｃｅｎｔｒｅ ｄ’Ｅｔｕｄｅ ｄｕ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈ
ｉｓｍｅ Ｈｕｍａｉｎ（ＣＥＰＨ）パリ、フランス国）。ＣＥＰＨメガ−ＹＡ
Ｃライブラリーにおけるクローンの４４％は５６０ｋｂの平均サイズを有し、さ
らなる２１％は８００ｋｂの平均サイズを有し、３５％は１２０ｋｂの平均サイ
ズを有する。このライブラリーは格子付マイクロ滴定プレートフォーマットで得
られるので、５０−２００ＰＣＲ反応が、ＳＴＳを含有するユニークなＹＡＣを
同定するのに特異的配列タグド部位（ＳＴＳ）を用いて行う必要がある。ＣＥＰ
Ｈによって同定されたＹＡＣ ｃｏｎｔｉｇを用いて、１ｑ候補領域を横切るｃ
ｏｎｔｉｇの構築を開始した（図１１参照）。ＹＡＣ末端を用いるＹＡＣｃｏｎ
ｔｉｇを構築して、さらなるＹＡＣを同定した。ＹＡＣ末端はアンカードＰＣＲ
を用いて救済でき（Ｒｉｌｅｙ， Ｊ．ら（１９９０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ． １８：２８８７−２８９０）、次いで、末端を配列決定し、
該配列を用いて配列タグド部位（ＳＴＳ）を開発することができる。該ＳＴＳを
用いてＹＡＣライリブラリーを再スクリーニングして重複する隣接ＹＡＣを得る
ことができる。

【０２９３】 いくつかのＹＡＣはキメラである、または欠失または再配置、特にメガＹＡＣ
ライブラリーからのものを含有することが示されているので、各ＹＡＣ ｃｏｎ
ｔｉｇの正確性は領域のパルスフィールドマップを構築することによって証明す
ることができる。加えて、キメラＹＡＣは、ＹＡＣが蛍光イン・サイチュハイブ
リダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって単一染色体にマップされ、２つのＹＡＣ
末端がモノ染色体細胞ハイブリッドを用いて同一染色体にマップされることを保
証することによって最小化される（ＮＩＧＭ パネル２）。加えて、ＹＡＣキメ
ラの問題は、所与の染色体セグメントにわたるいずれかの単一ＹＡＣに頼ること
によらず、むしろ少なくとも２つの独立したＹＡＣを得て所与の領域の被覆を保
証することによって最小化することができる。

【０２９４】 一旦候補領域にわたるＹＡＣ ｃｏｎｔｉｇが単離されれば、この領域を用い
て、潜在的により微細な遺伝子マッピングのためのさらなる遺伝子マーカーを創
製することができる。加えて、ＹＡＣを用いて、領域特異的ラムダおよびコスミ
ドクローンのごときより高い分解物理的マッピング試薬を作成することができる
。ラムダおよびコスミドクローンは、候補遺伝子の単離で用いることができる。
エクソン増幅（Ｂｕｃｋｌｅｒ， Ａ．Ｊ．（１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ
ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：４００５−４００９）として知ら
れている「エクソントラッピング」（Ｄｕｙｋ， Ｇ．Ｍ． （１９９０） Ｐ
ｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：８９９５−８９
９９）は、領域内の遺伝子からのエクソンを同定するのに使用することができる
。候補領域から補足されたエクソンは、ｃＤＮＡを単離するためにｃＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用いることができる。必要
であれば、コスミドにサブクローンされたＹＡＣ断片でのｃＤＮＡライブラリー
のスクリーニング、ズーブロット分析、ビオチン−ストレプトアビジンタグドコ
スミドクローンでのｃＤＮＡの直接的選択のごとき同時クローニング戦略（Ｍｏ
ｒｇａｎ， Ｊ．Ｇ．ら（１９９２） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｒｅｓ．
２０（１９）：５１７３−５１７９）、およびＨＴＦアイランド分析（Ｂｉｒｄ
， Ａ．Ｐ．（１９８７） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ ３：３４２−２４７）
を含めた他の戦略を利用して、ゲノムＤＮＡを同定することができる。有望な遺
伝子は、さらに、ＧＣ−クランプト変性グラジエントゲル電気泳動（Ｓｈｅｆｆ
ｉｅｌｄ， Ｖ．Ｃ．ら（１９８９） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １６：３２５−３３
２）、一本鎖立体配座多形（ＳＳＣＰ）分析（Ｏｒｉｔａ，Ｍ．ら（１９８９）
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：２７６６−
２７７０）および直接的配列決定を用いて突然変異をサーチすることによって評
価することができる。

【０２９５】 ５．３ 緑内障に対する病気素因を有する対象を同定するのに使用されるプラ イマー対 緑内障を引き起こす突然変異を保有するヒトゲノムＤＮＡからの１９０塩基対
配列を増幅するためのポリメラーゼ鎖反応と組み合わせて２つのプライマー対（
表７におけるプライマー１および２）を同定した。

【０２９６】

【表７】 これらのプライマー対を用いて、緑内障を持つ４１０人の患者および８１人の
正常個体をスクリーニングした。４アミノ酸改変配列変化を１２人の全緑内障患
者で検出した（２．９％）。アミノ酸改変配列変化は正常個体では観察されなか
った。

【０２９７】 これらのプライマー対によって増幅されたＤＮＡのセグメントにおける突然変
異の優性性は、適当な検出方法と組み合わせたこれらのプライマーの使用を用い
て、米国単独におけるほぼ１００，０００患者で緑内障に対する病気素因を同定
することができる。

【０２９８】 ５．４ さらなるプライマー対および緑内障に対する病気素因を有する対象を 同定するためのその使用 該実験はＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＩｏｗａのＨｕｍａｎ Ｓｕｂｊｅｃ
ｔｓ Ｒｅｖｉｅｗ Ｃｏｍｍｉｔｔeｅによって認可され、知らされた内容は 全ての実験参加者から得られた。初代開放角緑内障は、２１ｍｍＨｇを超える眼
内圧力の存在ならびに緑内障視神経頭部損傷の証拠として定義される。視神経頭
部損傷単独は、もし視神経頭部カップの記載された拡大があれば許容された。そ
うでなければ、薄い神経リムおよび特徴的視神経関連視野を持つ大きな視神経頭
部カップ双方が要求された。もし患者が緑内障の診断に先立って目の外科手術の
履歴または脱皮または色素分布のごとき、二次緑内障の証拠を有すれば、彼らは
排除された。正常ボランティアは４０歳の年齢を超え、２０ｍｍＨｇ下の眼内圧
力を有し、緑内障の家族または個人履歴を有しなかった。一次開放角緑内障（Ｐ
ＯＡＧ）に罹患した７１６人の無関係患者および９１人のボランティアを、ＧＬ
ＣｌＡ遺伝子のコーディング配列における突然変異につきスクリーニングした。
これは、一本鎖立体配座多形分析（ＳＳＣＰ）として知られている電気泳動手法
で達成された。ＧＬＣｌＡアッセイで使用されたオリゴヌクレオチドプライマー
の配列は表８に示す。

【０２９９】

【表８】 突然変異は自動ＤＮＡ配列決定で確認した。患者の２２７人（３２％）は緑内
障の陽性家族履歴のため確認され、他方、４０２人（５６％）は単一緑内障クリ
ニックで連続的に確認された（ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ
）。総じて、患者の５６３人はＩｏｗａ、オーストラリアでの９７人および米国
の他の場所からの残りで確認された。正常ボランティアの全てはＩｏｗａで収集
された。各群における患者の７５％を超えて白人であった。ＧＬＣｌＡ遺伝子の
一部は、これらの同一緑内障患者の３３０人および全ての９１人の正常ボランテ
ィアにおいて突然変異で従前に評価されている（前記参照）。しかしながら、こ
の研究では、全コーディング配列を評価した。未知の緑内障状態を持つさらなる
５０５人の無関係対照個体は配列変化につき評価した。これらの対照患者の３８
０人はエクソン３の一部における突然変異につき従前にスクリーニングされた。
これらの一般的集団対照の１８４人はＩｏｗａおよびおよびオーストラリアの１
３でコメクトされた。ＧＬＣｌＡ配列変化を保有することが見いだされたプロバ
ンドの家族メンバーは突然変異につき評価した。全ての分子的に罹患した家族メ
ンバーの医療記録を調べまたはレビューする努力がなされた。開始の年齢および
最高の記録された眼内圧力はＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ非パラメーター偏差
分析で評価された６つの異なる突然変異と関連付けられた。全てのｐ値は両側の
ものであった。４つの最大家族において、ＧＬＣｌＡ突然変異および病気表現型
の共分離は前記したごとくＬＯＤスコア方法で評価した。

【０３００】 ５．５ ヒトおよびマウスＧＬＣｌＡのクローニングおよび配列決定および発 現のノーザンブロット分析 ＢＡＣスクリーニング。ヒトＧＬＣｌＡ遺伝子を含有するＢＡＣクローンは、
ＰＣＲ−ベースのアッセイにて、ヒトＢＡＣライブラリープールをスクリーニン
グすることによって同定された（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｈｕ
ｎｔｓｖｉｌｌｅ， ＡＬ）。１マイクロリットルのＢＡＣプールＤＮＡを、１
．２５μｌの１０×緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５００ｍ
Ｍ Ｋｃｌ、１５ ｍＭ ＭｇＣｌ２）；デオキシヌクレオチドｄＣＴＰ、ｄＡ
ＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＧＴＰ（各々３００μＭ）；１ピコモルの各プライマ
ー；および０．２５ユニットのＴａｑポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｉｎｇｅｒ Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）を含有する８．３５μｌ
ＰＣＲ反応における鋳型として用いた。スクリーニングアッセイで使用したプ
ライマーはＧＬＣｌＡのエクソン３に特異的であった（ＦＷＤ：５’ＡＴＡＣＴ
ＧＣＣＴＡＧＧＣＣＡＣＴＧＧＡ３’（配列番号３４）およびＲＥＶ：５’ＣＡ
ＡＴＧＴＣＣＧＴＧＴＡＧＣＣＡＣＣ３’（配列番号３５））。試料を９４℃で
５分間変性し、ＤＮＡサーモサイクラー（Ｏｍｎｉｇｅｎｅ， Ｔｅｄｄｉｎｇ
ｔｏｎ， Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ， ＵＫ）にて９４℃３０秒、５５℃３０秒、７
２℃３０秒インキュベートした。増幅後、５μｌの停止溶液（９５％ホルムアミ
ド、１０ｍＭ ＮａＯｈ、０．５％ ブロモフェニルブルー、０．０５％キシレ
ンシアノール）を添加した。増幅産物を、５０Ｗでほぼ２時間、６％ポリアクリ
ルアミドゲル−５％グリセロールゲル上の電気泳動に付した。電気泳動後、ゲル
を硝酸銀（Ｂａｓｓａｍ １９９１）で染色した。マウスＧＬＣｌＡオルソログ
を含有するＢＡＣを、マウス１２９ＢＡＣライブラリープール（Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ ＡＬ）をスクリーニングする
ことによって同定した。前記したごとく、ヒトＧＬＣｌＡ遺伝子のエクソン３に
特異的なプライマー（ＦＷＤ：５’ＴＧＧＣＴＡＣＣＡＣＧＧＡＣＡＧＴＴＣ３
’（配列番号３６）およびＲＥＶ：５’ＣＡＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴ
ＴＡ３’（配列番号３７）を一次ＰＣＲ−ベースのスクリーニングで使用した。
一次スクリーニングはマウスＧＬＣｌＡ遺伝子を含有するＢＡＣのサブプールを
同定した。サブプールにおいてＢＡＣでブロットしたフィルター（Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ ， ＡＬ）は、Ｇｅｎｉｕ
ｓ Ｓｙｓｔｅｍハイブリダイゼーションキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ， インジアナポリス，ＩＮ）を用い、ジゴキシゲニンプローブで
のハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。ハイブリダイゼーショ
ンのためのジゴキシゲニン標識プローブは、３．７５μｌの１０×緩衝液、１．
５μｌの標識ｄＮＴＰ混合物（１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍＭ
ｄＧＴＰ ０．６５ ｍＭ ｄＴＴＰ、および０．３５ｍＭのジゴキシゲニンコ
ンジュゲーテッドｄＵＴＰ）；各７．６ピコモルのＦＷＤおよびＲＥＶプライマ
ー；および１．２５ユニットのＴａｑポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ，インジアナポリス、ＩＮ）を含有する２５μｌ反応中のマウス
１２９ＤＮＡの５０ｎｇを増幅するＰＣＲによって創製した。ＰＣＲ条件は前記
した通りであった。ハイブリダイゼーションは製造業者によって推奨されたごと
きであった。

【０３０１】 鋳型としてヒトおよびマウスゲノムＤＮＡ双方を用いる場合、ヒトＧＬＣｌＡ ｃＤＮＡ配列を用いて、同一サイズの増幅産物を生じたＰＣＲプライマーを選
択した。増幅産物を配列決定して、それらがヒトＧＬＣｌＡ遺伝子およびこの遺
伝子のマウスオルソログからのものであることを確認した。次いで、ＰＣＲ産物
を用いて、ヒトおよびマウスＢＡＣライブラリーをスクリーニングした。ＧＬＣ
ｌＡ遺伝子を含有するヒトおよびマウスＢＡＣ双方を同定し、プラスミドにサブ
クローン化し、各ＧＬＣｌＡ遺伝子をカバーするいくつかのクローンを同定した
。これらのサブクローンを用いて、ヒトおよびマウスゲノムＧＬＣｌＡ配列を創
製した。

【０３０２】 サブクローニング。ＧＬＣｌＡ遺伝子を含有するマウスおよびヒトＢＡＣをＥ
ｃｏＲｌ、Ａｖａｌ、Ａｃｃｌ、またはＢａｍＨｌで消化し、ｐＴ７−ブルー（
Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）またはｐＵＣ１９いずれかに連
結した。

【０３０３】 配列決定。ＰＣＲ産物およびＢＡＣサブクローンを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ （ＡＢＩ）モデル３７３または３７７自動シーケンサーにて蛍
光ジデオキシヌクレオチドで配列決定した。

【０３０４】 ＧＬＣｌＡ ＣＡリピート多形。ＧＬＣｌＡ遺伝子の上流のＣＡリピート多形
をプライマー５’−ＴＴＣＣＴＴＣＡＧＧＴＴＧＧＧＡＧＡＴＧ−３’（配列番
号４２）および５’−ＧＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＴＧＧＡＧ−３’）配列
番号４３）でＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応条件はＢＡＣスクリーニングセクショ
ンに記載した通りである。上流多形についての対立遺伝子頻度は対立遺伝子１、
１．１％、対立遺伝子２、２．２％、対立遺伝子３、４８．９％、対立遺伝子４
、１．１％、対立遺伝子５、２１．１％、対立遺伝子６、２５．６％である。下
流多形についての対立遺伝子多形は対立遺伝子１、２５．３％、対立遺伝子２、
１３％、対立遺伝子３、６０．３％、対立遺伝子４、１．４％である。

【０３０５】 配列比較。ＤＮＡ配列を整列させ、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ ＤＮＡ分析パッケ
ージ（ＤＮＡ Ｃｏｄｅｓ， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ， ＭＩ）を用いて、ｃｏｎ
ｔｉｇを形成させた。インターネット源ＴＥＳＳ（ｈｔｔｐ：／／ａｇａｖｅ．
ｈｕｍｇｅｎ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ．ｕｔｅｓｓ／）および転写因子結合部位デ
ータセットＴＲＡＮＳＦＡＣｖ３．２を用いて推定エンハンサーおよびプロモー
ターエレメントを同定した。予測された蛋白質配列を、ＰＲＯＳＩＴＥ，Ｔｍｐ
ｒｅｄ，ＮｅｔＯｇｌｙ，および ｈｔｔｐ：ｅｘｐａｓｙ．ｈｃｕｇｅ．ｃｈｓｐｒｏｔ／ｐｒｏｓｉｔｅ．ｈ
ｔｍｌ； ｈｔｔｐ：／／ｕｌｒｅｃ３．ｕｎｉｌ．ｃｈ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＴＭＰＲ
Ｄ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ； ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｎ
ｅｔＯＧＬＹＣ／； ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／Ｓｉｇｎａｌ
Ｐ／． のインターネットで入手可能なＳｉｇｎａｌＰソフトウェアパッケージで分析し
た。ＧＬＣｌＡ遺伝子の発現のためのデータベースサーチは、ｈｔｔｐ：／／ｗ
ｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ／ｎｐ
ｈ−ｂｌａｓｔ？Ｊｆｏｒｍ＝０で入手可能なプログラムＢＬＡＳＴおよびデー
タベースｄｂｅｓｔおよびＮＲを用いた。

【０３０６】 ノーザンブロット分析。ヒト多重組織ノーザン（ＭＩＮ）ブロット（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ）を全ヒトＧＬＣｌＡ ｃＤ
ＮＡ配列で、または終止部位に対するコドン３１５に対応するヒトＧＬＣｌＡ遺
伝子のエクソン３のセクションでプローブした。Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ ＤＮ
Ａ標識ビーズ（−ｄＣＴＰ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓ
ｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いる^３２Ｐ−（ｄＣＴＰ）で標識した。ハイブリダ
イゼーションは５０％ホルムアミド、５×標準セーラインクエン酸塩（５×ＳＳ
Ｃ：０．７５Ｍ塩化ナトリウム、０．０７５Ｍ酢酸ナトリウム）、１×デンハル
トの溶液、２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）、１％ドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ）、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、および１０％デキストラン硫
酸中、４２℃における１６時間であった。ハイブリダイゼーションに続き、ブロ
ットを１×ＳＳＣ中室温で２回洗浄し、６５℃にて１×ＳＳＣ／１％ＳＤＳ中で
２回すすぎ、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回洗浄して、ハイブリダイ
ゼーションの特異性を確認した。Ｄｕｐｏｎｔ Ｃｒｏｎｅｘ Ｌｉｇｈｔｎｉ
ｎｇ Ｐｌｕｓ増感スクリーンで−７０℃にてＫｏｄａｋ ＸＡＲ−５フイルム
（ＤｕＰｏｎｔ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）でオートラジオグラフィーを
行った。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、エクソン１およびフランキングプロモーターおよびイントロン１配列
を 示す。

【図２】 図２は、図１の続きである。

【図３】 図３は、図２の続きである。

【図４】 図４は、図３の続きである。

【図５】 図５は、図４の続きである。

【図６】 図６は、エクソン２およびフランキングイントロン１およびイントロン２配列
を 示す。

【図７】 図７は、エクソン３およびフランキングイントロン２および下流配列を示す。

【図８】 図８は、図７の続きである。

【図９】 図９は、図８の続きである。

【図１０】 図１０はヒトおよびマウス・ミオシリン蛋白質の間で保存された推定モチーフ
の模式的表示である。

【図１１】 図１１はマウスおよびヒトＧＬＣｌＡ遺伝子によって予測された蛋白質の整列
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シェフィールド，ヴァル シー アメリカ合衆国 アイオワ州 52240 コ ーラルヴィル エヌイー オーク パーク プレイス 13 (72)発明者 オルワード，ウォレイス エル エム アメリカ合衆国 アイオワ州 52245 ア イオワ シティー リッジウェイ ドライ ヴ 2015 (72)発明者 フィンガート，ジョン アメリカ合衆国 アイオワ州 52246 ア イオワ シティー ウェットウィンズ ド ライヴ 481 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 CA01 CA03 CA04 CA09 CA12 CA20 HA13 HA14 4B063 QA01 QA13 QA17 QA19 QQ42 QQ43 QQ53 QR08 QR32 QR40 QR42 QR56 QR62 QR83 QS16 QS25 QS34 QX02 QX07

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３
   、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５
   、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２または４３のいずれかに記載され
   た核酸分子または核酸分子の相補体を含む単離された核酸分子。
2. 【請求項２】 配列番号１６および１７、配列番号１８および１９、配列番
   号２０および２１、配列番号２２および２３、配列番号２４および２５、配列番
   号２６および２７、配列番号２８および２９、配列番号３０および３１、配列番
   号３２および３３、配列番号３４および３５、配列番号３６および３７、配列番
   号３８および３９、配列番号４０および４１、配列番号４２および４３よりなる
   群から選択されるプライマー対でＧＬＣ１Ａ遺伝子を増幅させることによって得
   られた核酸分子または核酸分子の相補体を含む単離された核酸分子。
3. 【請求項３】 図１〜５のエクソン１内に出現するかまたはエクソン１内に
   出現する核酸分子の相補体であることを特徴とする請求項２記載の単離された核
   酸分子。
4. 【請求項４】 図６のエクソン２内に出現するかまたはエクソン２内に出現
   する核酸分子の相補体であることを特徴とする請求項２記載の単離された核酸分
   子。
5. 【請求項５】 図７〜９のエクソン３内に出現するかまたはエクソン３内に
   出現する核酸分子の相補体であることを特徴とする請求項２記載の単離された核
   酸分子。
6. 【請求項６】 前記プライマー対が配列番号１６および１７；配列番号１８
   および１９；配列番号２０および２１、配列番号２２および２３、配列番号２４
   および２５、配列番号２６および２７よりなる群から選択されるメンバーを含む
   ことを特徴とする請求項３記載の単離された核酸。
7. 【請求項７】 前記プライマー対が配列番号２８および２９を含むことを特
   徴とする請求項４記載の単離された核酸。
8. 【請求項８】 前記プライマー対が配列番号３０および３１、配列番号３２
   および３３、配列番号３４および３５、配列番号３６および３７、配列番号３８
   および３９、配列番号４０および４１を含むことを特徴とする請求項５記載の単
   離された核酸。
9. 【請求項９】 ＧＬＣ１Ａ遺伝子の上流にあって、配列番号４２および４３
   によって増幅されたことを特徴とする請求項２記載の核酸分子。
10. 【請求項１０】 対象が一次解放角緑内障を有するかまたはそれを発症する
    可能性を有するかを決定する方法であって； ａ）対象からゲノムＤＮＡまたはその相補体を含有する生物学的試料を得； ｂ）配列番号１６および１７、配列番号１８および１９、配列番号２０およ
    び２１、配列番号２２および２３、配列番号２４および２５、配列番号２６およ
    び２７、配列番号２８および２９、配列番号３０および３１、配列番号３２およ
    び３３、配列番号３４および３５、配列番号３６および３７、配列番号３８およ
    び３９、配列番号４０および４１、配列番号４２および４３よりなる群から選択
    されるプライマー対を用いてゲノムＤＮＡに対する増幅を行い、それにより、増
    幅産物が得られ；次いで、 ｃ）突然変異の存在につき増幅産物を分析し、ここに突然変異の存在が、対
    象が一次解放角緑内障を有するかまたはそれを発症する可能性を有するかを示す
    各工程を含むことを特徴とする方法。
11. 【請求項１１】 工程ｃ）において、一本鎖立体配座多形（ＳＳＣＰ）分析
    を用いて増幅産物を分析することを特徴とする請求項１０記載のスクリーニング
    方法。
12. 【請求項１２】 工程ｃ）において、配列決定によって増幅産物を決定する
    ことを特徴とする請求項１０記載のスクリーニング方法。
13. 【請求項１３】 ａ）配列番号１６および１７、配列番号１８および１９、
    配列番号２０および２１、配列番号２２および２３、配列番号２４および２５、
    配列番号２６および２７、配列番号２８および２９、配列番号３０および３１、
    配列番号３２および３３、配列番号３４および３５、配列番号３６および３７、
    配列番号３８および３９、配列番号４０および４１、配列番号４２および４３よ
    りなる群から選択されるプライマー対；および ｂ）増幅を行うためのプライマー対の使用についての指示書； を含むことを特徴とする一次解放角緑内障を有する対象を診断するためのキット
    。