JP2010004892A - 新規なヒトデルタ３組成物ならびにそれらの治療および診断への使用方法 - Google Patents

新規なヒトデルタ３組成物ならびにそれらの治療および診断への使用方法 Download PDF

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Abstract

【課題】新規なデルタタンパク質をコードしているヒト遺伝子を提供する。
【解決手段】本発明は、デルタ３タンパク質をコードしている核酸に関する。また、本発明は、デルタ３核酸の誘導体、それらによってコードされているポリペプチドおよび抗体に関する。デルタ３の生物活性に対するアンタゴニストまたはアゴニストのいずれかであり、加えて、細胞、例えば、内皮細胞などの成長および／もしくは分化を調節することができるようなデルタ３治療剤も開示している。さらに、デルタ３活性の異常が関連している、ならびに／または細胞の成長および／もしくは分化の異常が関連している疾患、例えば、末梢神経病を伴う脳梁無発育（ACCPN）などのような神経性疾患または血管の疾患などを治療する方法、およびこのような疾患を検出するための診断方法も開示している。
【選択図】なし

Description

本発明は、デルタ３タンパク質をコードしている核酸に関する。また、本発明は、デルタ３核酸の誘導体、それらによってコードされているポリペプチドおよび抗体に関する。
先進国においては、卒中は死因の第３位であり、後天的な身体または認識障害の主因である。血管性痴呆は、アルツハイマー病に次いで痴呆の原因の第２位である。CADASIL（Cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy：皮質下梗塞および白質の脳炎を伴う脳の常染色体優性動脈疾患）は一種の卒中および痴呆の原因となり、この疾患の主要な特徴は、皮質の虚血性事象の再燃、進行性の血管性痴呆、頭蓋顔面の麻痺、片頭痛および重篤な欝病を伴う気分の変調が挙げられる（非特許文献１）。これらの徴候は通常45才頃に現れはじめ、一般的には患者は65才までに死亡する。診断を受けていないケースが多いと考えられるため、罹患率は正確にはわかっていない。
CADASILは、神経結像に現れる汎発性の白質異常と関連がある（非特許文献２）。病理学的試験から、小さいが深部に至る複数の脳梗塞、白質脳炎および主に細い脳動脈を含む非アテローム性動脈硬化性で非アミロイド性の血管内層障害が明らかになっている（非特許文献３）。超微構造解析により、血管平滑筋細胞の重篤な変性が示されている（非特許文献４）。
最近、CADASILの患者においては、19番染色体上に位置するヒトのノッチ３（Notch 3）遺伝子が突然変異を起こしていることが示された（非特許文献５）。この突然変異の多くは、細胞外ドメイン内でアミノ酸の変化を引き起こす。従って、ノッチ（Notch）シグナル経路の破壊がCADASIL卒中および痴呆に関与していると考えられる。
ノッチシグナル経路の損傷は、他の神経性疾患、例えば、アルツハイマー病などにも関連があると思われる。実際、アルツハイマー病のおよそ10％のケースにおいては、アミロイド前駆体タンパク質であるプレセニリン（presenilin）１(PS1)およびプレセニリン（presenilin）２(PS2)をコードしている遺伝子の突然変異が関与している。約25％の初期発症家族性アルツハイマー病には、PS1の突然変異が関与している。PS1およびPS2は膜透過タンパク質であり、sel-12遺伝子によってコードされているＣ．エレガンス（C. elegans）のタンパク質と相同性を有し、このsel-12遺伝子は、ノッチ遺伝子群のレセプターをコードしているＣ．エレガンス（C.elegans）のlin-12遺伝子と遺伝子結合することができること示されている（非特許文献６）。PS1およびPS2については特許文献１にも記載されており、Sel2については特許文献２にも記載されている。さらに、PS1を破壊したマウスにおいては、対照マウスと比較すると、ノッチ１および中胚葉の前原節内に存在する脊椎動物のノッチリガンドであるデルタ様遺伝子１（Dll1）をコードしているmRNAの発現が減少している（非特許文献７）。このことは、ノッチシグナル経路に関与する遺伝子の時空的発現に対してPS1が必須であることを示唆している。
ノッチシグナル経路には膜タンパク質であるノッチタンパク質、およびノッチタンパク質に相互作用するタンパク質であって、デルタ（Delta）タンパク質と呼ばれるタンパク質が含まれる。リガンドとして作用するデルタ遺伝子の産物およびレセプターとして作用するノッチ遺伝子の産物は、ショウジョウバエにおける多数の異なる組織の詳細なパターン形成を制御する側方阻害シグナル経路内の主要構成要素である（非特許文献８〜１５）。特に神経発生の間は、神経前駆体はデルタを発現することにより、近隣のノッチ発現性細胞が神経細胞になるのを抑制している。側方抑制を起こさせない突然変異は、ニューロンの過剰産生を引き起こし、ショウジョウバエにおける「神経原性表現型」と呼ばれる表現型が現れる。例えば、ノッチ１の消失により、マウスにおいては体節の欠失および胎児の死亡が起こるが、ノッチ１の構成活性なノッチ１の突然変異体は、アフリカツメガエルおよび培養哺乳類細胞において細胞の分化を阻害すると思われる（非特許文献１６〜１９）。同様に、Ｘ−デルタ１の活性を減弱するとより多くの細胞が一次ニューロンになるが、活性を増強すると一次ニューロンになるものは少なくなる（非特許文献２０）。さらに、マウスにおけるDll1機能の消失は、過量のニューロンの分化を引き起こし、近軸中胚葉の重篤なパターン形成障害および中枢神経系（CNS）の過形成を招く（非特許文献２１）。このように、ノッチシグナル経路、中でも特にデルタタンパク質は、神経発生の間、側方抑制を仲介しており、それにより、ニューロンになる可能性のある細胞の内のごく限られた一部が実際にニューロンに分化するのである。
ノッチタンパク質群（ファミリー）は、数個の保存されたペプチドモチーフを有する膜透過レセプターである。細胞外ドメインは、上皮成長因子（表皮増殖因子）（EGF）様モチーフの多数のタンデム繰り返しコピーを含んでいる。細胞内ドメインは、Cdc10アンキリンリピートと呼ばれる別の保存されたモチーフのコピーを６個含んでいる。EGFモチーフおよびアンキリンリピートモチーフはどちらも多くの異なるタンパク質において見出されており、少なくともいくつかの場合においては、タンパク質−タンパク質相互作用に関与していることが示されている。
ショウジョウバエのノッチタンパク質は、分子量が350KDのグリコシル化した膜透過レセプターをコードしており、これは、発生過程において細胞運命の特定に関与している（非特許文献２２および２３）。ショウジョウバエの突然変異体の分析により、ノッチは、正常タンパク質をシグナルに変換する固有の活性を有する細胞内ドメインおよび活性を制御する細胞外ドメインという作用機作の異なるドメインを有するレセプターであると考えられている（非特許文献２４）。
脊椎動物において、いくつかのノッチ相同体（ホモログ）が確認されている（非特許文献２５）。ヒトにおいては、３個のノッチタンパク質（TAN1とも呼ばれるノッチ１、ノッチ２およびノッチ３）の特徴が明らかになっている（非特許文献２６および２７）。ノッチ１遺伝子の転座は、患者数の少ないＴ細胞リンパ芽球性白血病に関連しており（非特許文献２８）、ノッチ３はCADASILに関与している。
ノッチと相互作用するタンパク質はショウジョウバエにおいて最初に発見され、デルタタンパク質と呼ばれている。このタンパク質は膜透過タンパク質リガンドをコードしており、細胞外ドメイン中に上皮成長因子（EGF）様リピートのタンデム配列を含んでいる。デルタタンパク質およびノッチタンパク質は互いに直接結合することができ、この結合には、特異的なEGF様リピートの存在が必要十分条件である（非特許文献２９〜３１）。
ショウジョウバエのデルタタンパク質に加えて、ニワトリデルタ相同体であるＣ−デルタタンパク質（非特許文献３２、およびジーンバンク（GenBank）受託番号U26590）、２個のアフリカツメガエルの相同体であるＸ−デルタ１およびＸ−デルタ２（非特許文献３３、ならびにGenBank受託番号Nos.L42229およびU70843）、マウスの相同体（GenBank受託番号X80903）、デルタ様ヒト遺伝子１（Dlk）（非特許文献３４）、ラットの相同体（GenBank受託番号U78889）、およびゼブラフィッシュの相同体（GenBank受託番号Y11760）が確認されている。アフリカツメガエル、ニワトリおよびマウスのデルタ遺伝子については、特許文献３（国際特許出願番号PCT/US96/11178）にも開示されている。この特許出願には、部分的かつ誤りの多いヒトデルタ相同体（hD1）も開示している。ヒトノッチ遺伝子のヌクレオチド配列は、特許文献４（国際特許出願番号PCT/US92/03651）および特許文献５（国際特許出願番号PCT/US93/09338）に開示されている。
国際公開第96/34099号パンフレット 国際公開第97/11956号パンフレット 国際公開第97/01571号パンフレット 国際公開第92/19734号パンフレット 国際公開第94/07474号パンフレット
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デルタ／ノッチシグナル経路を調節する（アゴニストまたはアンタゴニストとして）治療は、神経性および血管の障害を含む様々な疾患および障害の予防および処置に有用である。さらに、疾患の存在または疾患の進行の素因と相関しているデルタ遺伝子内の突然変異は、診断に役立てることができる。
本発明は、少なくとも部分的には、これまでに明らかにされていたデルタタンパク質とは本質的に異なる新規なデルタタンパク質をコードしているヒト遺伝子の発見に基づくものである。従って、本発明の新規なデルタタンパク質を本明細書においてはデルタ３（Delta3）と称する。すなわち、本発明はデルタ３タンパク質およびデルタ３タンパク質をコードしている核酸を提供する。典型的なｈデルタ３はプラスミド内に組み込み、1997年３月５日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection: ATCC）に寄託しており、ATCC受託番号は98348である。
多数のヒトの組織から調製したRNAのノーザンブロット分析から、胎児の脳、肺、肝および腎、ならびに成人の心臓、胎盤、肺、骨格筋、腎、膵臓、脾、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸および結腸において3.5kbのメッセージが発現された。さらに、少なくともいくつかの腫瘍細胞（例えば、結腸癌など）内において、ｈデルタ３が比較的高レベルで発現したことが見出されており、種々の成長因子（例えば、bFGFおよびVEGFなど）に応答してその発現が高くなるように制御されていた。また、内皮細胞のシグナル誘導による分化に応答してｈデルタ３の発現が増加し、このことは、細胞、特に内皮細胞の成長および／分化を調節するというｈデルタ３の役割を示すものである。
本明細書に記載しているように、ｈデルタ３遺伝子はヒト15番染色体上に存在しており、これはフレームワークマーカー（framework marker）であるD15S1244およびD15S144の近傍にあり、神経性疾患である末梢神経病を伴う脳梁無発育（ACCPN）に関与する染色体領域である（カソーボン（Casaubon）ら、(1996) Am. J. Hum.Genet. 58: 28）。従って、デルタ３の多形性がこの神経性疾患に関係していると考えられる。さらに本明細書に記載しているように、デルタ３は他の神経性疾患および非神経性疾患にも関係していると考えられる。
ひとつの面からみると、本発明の特徴は、単離されたデルタ３核酸分子、例えば、ヒトデルタ３核酸を提供することにある。開示している分子は、非コード（non-coding）分子（例えば、プローブ、アンチセンス、またはリボザイム分子など）または機能性のデルタ３ポリペプチドをコードすることができるもの（例えば、デルタ３ポリペプチドの少なくともひとつの生物活性を制御することができるポリペプチドなど）である。ひとつの実施態様においては、本発明の核酸分子は、ATCC受託番号98348であるプラスミド内に含まれているデルタ３遺伝子とハイブリダイゼーションすることができるものである。。別の実施態様においては、本発明の核酸は、配列番号1および／もしくは配列番号3に記載している、またはそれらと相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションすることができるものである。好ましい実施態様においては、ストリンジェンシーが緩和または高い条件下でハイブリダイゼーションを行う。
さらなる実施態様においては、本発明の核酸分子はデルタ３核酸分子であって、
配列番号1および／もしくは配列番号3に示している核酸配列、または配列番号1および／もしくは配列番号3に示している核酸配列と相補的な核酸配列と少なくとも約50％、60％、70％、好ましくは80％、より好ましくは85％、さらに好ましくは少なくとも約95％の相同性（ホモロジー）を有するものである。別の実施態様においては、本発明の核酸分子は、配列番号2に示しているポリペプチドとの類似性または一致性が少なくとも約50％、60％、70％、好ましくは80％、より好ましくは85％、さらに好ましくは少なくとも約90％または95％であるポリペプチドをコードしている。また別の実施態様においては、本発明の核酸分子は、ATCC受託番号98348であるプラスミド内に含まれているｈデルタ３遺伝子の配列との類似性が少なくとも約70％、好ましくは80％、より好ましくは85％、さらに好ましくは少なくとも約90％または95％である。
本発明の好ましい核酸は、デルタ３タンパク質の少なくとも１つのドメインまたはモチーフ、すなわち、シグナルペプチド、デルタ類似性（ＤＳＬ：Delta similarity）ドメイン、上皮成長因子（ＥＧＦ：Epidermal Growth Factor）様リピート１、ＥＧＦ様リピート２、ＥＧＦ様リピート３、ＥＧＦ様リピート４、ＥＧＦ様リピート５、ＥＧＦ様リピート６、ＥＧＦ様リピート７およびＥＧＦ様リピート８、膜透過（ＴＭ：transmembrane）ドメイン、ならびに細胞質ドメインから成る群から選ばれるドメインまたはモチーフをコードするヌクレオチド配列を含む。他の好ましい核酸は、可溶性のデルタ３タンパク質、例えば、デルタ３タンパク質の細胞外ドメインの少なくとも一部を含むようなデルタ３タンパク質をコードするものである。このような可溶性ペプチドはシグナルペプチドを含んでいる場合もあれば、含んでいない場合もある。さらに好ましい核酸は、デルタ３タンパク質と異種ペプチド（例えばイムノグロブリン定常部）とから成る可溶性融合タンパク質をコードするものである。
本発明は、さらに、実質的に精製された（純化された）オリゴヌクレオチドから成るプローブまたはプライマーであって、配列番号1もしくは3の配列または配列番号1または3の配列の相補的配列またはそれらの天然に存在する突然変位体の少なくとも約６個の連続したヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド領域に相当するオリゴヌクレオチドを提供する。好ましい態様においては、該プローブ／プライマーは、ラベルを追有して検出可能となっている。
本発明のデルタ３核酸は、発現に供されるように、転写調節配列、例えば、転写プロモーター（例えば、構成的発現もしくは誘導的発現用）または転写エンハンサー配列の少なくとも１種を含むようにすることができ、該調節配列はデルタ３遺伝子と作用結合される。デルタ３核酸分子と連結されたそのような調節配列は、ベクターに使用されて遺伝子発現に供することができる。本発明は、前記の発現ベクターでトランスフェクションされた宿主細胞（原核細胞または真核細胞）も開示し、さらに、そのような発現ベクターを使用することによりデルタ３タンパク質を産生するインビトロの方法（例えば、細胞培養）またはインビボの方法（例えばトランスジェニック法）を開示する。
他の側面として本発明の特徴は、単離されたデルタ３ポリペプチド、好ましくは実質的に精製（純化）された調製物、例えば血漿由来または組換えにより産生されたポリペプチドを提供することにある。好ましい態様においては、本発明のポリペプチドは、デルタ３ポリペプチドの活性、例えば細胞成長および／または分化あるいはアポトーシスの誘導を調節することができるものである。好ましい態様においては、本発明のデルタ３ポリペプチドは、神経（組織）形成を調節する（例えば、ノッチ発現性細胞が神経細胞になるのを抑制することにより）ことができる。さらに、本発明は天然のデルタ３ポリペプチドの活性を特異的に中和させるデルタ３ペプチド（例えば、端部切除（トランケーション）突然変位体または他のドミナントネガティブ突然変位体によって得られる）を提供する。
１つの態様として本発明のポリペプチドは、配列番号2で表わされるデルタ３タンパク質に同一または類似しているものである。好ましい態様として本発明に従うデルタ３ポリペプチドは、配列番号2で表わされるポリペプチドに、少なくとも約５０％、６０％、７０％、好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、そしてそれよりもさらに好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有するか同一であるものである。１つの好ましい態様として該デルタ３ポリペプチドは、配列番号1もしくは3のいずれかによって表わされる核酸配列またはＡＴＣＣ受託番号９８３４８のプラスミドに含有されている核酸配列にハイブリダイズする核酸によりコードされている。さらに、本発明に従うデルタ３タンパク質として、変性タンパク質、すなわち、翻訳後変性に抵抗性を有するもの（例えば、チロシン、スレオニン、セリンまたはアスパラギン残基のような変性サイトを変更する突然変異に因る）、タンパク質のグリコシル化を妨げるもの、あるいは、シグナル伝達に関与する細胞内タンパク質とのタンパク質相互作用を妨げるものが含まれる。
本発明に従うデルタ３ポリペプチドは、配列番号2で表わされるような全長タンパク質であってもよく、あるいは、特定のモチーフ／ドメインの１種以上に相当するフラグメントまたは任意のサイズ、例えば、少なくとも５、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００もしくは６５０個のアミノ酸から成る長さに相当するフラグメントから成るものでもよい。
本発明の別の特徴として、本発明はデルタ３タンパク質を含むキメラ分子（例えば、融合タンパク質）を提供する。例えば、本発明に従うデルタ３タンパク質は、第２のポリペプチド部分、例えば、デルタ３ポリペプチドとは無関係の（異種の）アミノ酸配列を有する第２のポリペプチドを含む組換え融合タンパク質として得ることができる（例えば、第２のポリペプチド部分としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、アルカルホスファターゼのような酵素活性のあるもの、またはエピトープタグがある）。
好ましい融合タンパク質は、デルタ３−免疫グロブリン（Delta3-Ig）融合タンパク質である。例えば、デルタ３タンパク質の細胞外部分を免疫グロブリン分子の定常部と融合したデルタ３融合タンパク質である。好ましい細胞外部分は、デルタ３のシグナルペプチド、ＤＳＬドメイン、および８つのＥＧＦ様リピートから成る群より選ばれる少なくとも１つのドメインを含むものである。さらに好ましい細胞外ドメインは、配列番号2のアミノ酸番号１付近からアミノ酸番号５２９番付近のアミノ酸配列を含むものである。別の好ましいデルタ３融合タンパク質は、第２のタンパク質（例えば、ノッチタンパク質）に結合するのに充分なデルタ３タンパク質の一部を含むものである。
本発明は、さらに別の側面として、免疫原性調製物（調剤）としてデルタ３ポリペプチドから成る免疫原を提供する。ここで、免疫原とは、デルタ３ポリペプチドに特異的な免疫応答、例えば、体液性応答、抗体応答および／または細胞性応答を誘導することができるものである。好ましい態様においては、免疫原は、配列番号2で表わされるタンパク質由来の抗原決定基、例えばユニーク決定基から成るものである。
本発明のさらに別の特徴として、本発明は、デルタ３タンパク質のエピトープに特異的に反応する抗体または抗体調製物を提供する。好ましい態様においては、該抗体は、配列番号2で表わされるエピトープに特異的に結合するものである。
本発明は、さらに、トランスジェニック非ヒト動物、すなわち、本発明により開示するデルタ３遺伝子の異種形態を含む（そして好ましくは発現する）トランスジェニック動物、または、内因性デルタ３遺伝子を誤発現するトランスジェニック動物（例えば、本発明に従うデルタ３タンパク質の１種またはそれ以上の発現が破壊される動物）に関する。そのようなトランスジェニック動物は、突然変異または誤発現したデルタ３アレル（対立遺伝子）から成る細胞または組織障害を研究用あるいは薬剤スクリーニング用の動物モデルとして機能することができる。例えば、本発明のトランスジェニック動物は、ＡＣＣＰＮのような神経疾病を研究する動物モデルとして用いることができる。別の手段として、そのような動物は、組換えポリペプチドを発現させるのにも有用である。
さらに、別の側面から本発明は、アッセイ（分析方法）、例えば試験化合物をスクリーニングして、或る生物活性のアゴニスト（作動薬）またはアンタゴニスト（拮抗薬）を同定するアッセイを提供する。例えば、試験化合物としては、デルタ３タンパク質とデルタ３の標的分子（例えばノッチタンパク質）との相互作用に正または負の影響を与え得るものがある。例示として、そのような方法は、（ｉ）デルタ３ポリペプチドまたはその生物活性な断片（フラグメント）、デルタ３標的分子（例えばノッチ）および試験化合物を、例えば、試験化合物がなければ該デルタ３タンパク質と該標的分子とが相互作用することができるような条件下で混合する工程；および（ii）該デルタ３タンパク質と該標的タンパク質を含むコンプレックス（複合体）の形成を検出する、例えば、該コンプレックスを直接的に定量するか、デルタ３タンパク質の誘導効果を測定するか、または、基質の場合には生成物への転化を測定することにより検出する工程を含む。試験化合物の存在下におけるデルタ３と標的分子との相互作用が（試験化合物の非存在下における検出結果に比べて）統計学的に有意に変化（例えば増大）していれば、調節（例えば、デルタ３タンパク質と標的分子との相互作用の抑制または増強）が生じたことを示す。
本発明は、さらに、デルタ活性を調節する化合物を同定する方法も提供する。例えば、デルタ３タンパク質と相互作用する化合物を同定するために、試験化合物にデルタ３タンパク質を接触させる。試験化合物もしくはデルタ３タンパク質のいずれかにラベル（標識）を施し、または必要に応じて固相支持体に固定してもよい。次に、デルタ３タンパク質に対する試験化合物の結合性を、例えば、ラベルの量を測定することにより測定する。そのようなデルタ３結合性分子はアゴニストの場合もあればアンタゴニストの場合もある。１つの実施態様においては、デルタ３タンパク質を含有する細胞を試験化合物と接触させ、そして、デルタ３活性（例えば、ノッチタンパク質のようなタンパク質がデルタ３に結合することにより調節される遺伝子の発現）を測定することによりデルタ３活性のアゴニストを確認することができる。試験化合物の併存下で細胞を培養したときに、試験化合物の非存在下での培養に比べて、遺伝子の発現が増加していれば、該試験化合物はデルタ３のアゴニストであることを示唆する。細胞にトランスフェクションされたレポーター遺伝子をモニターすることもできる。ここで、レポーター遺伝子は、デルタ３によって調節される遺伝子のプロモーターの制御下にあるものである。
さらに、本発明は、デルタ３活性の異常、例えば、異常な細胞増殖、変性または分化が原因であるかまたは関与している疾患または症状を治療する方法であって、デルタ３のアゴニストまたはアンタゴニストの有効量を患者に投与する方法を提供する。１つの実施態様として、アゴニストまたはアンタゴニストが、例えば、デルタ３遺伝子の発現を調節することにより、デルタ３タンパク質のレベルを調節することができる。例えば、デルタ３アゴニストから成る治療剤を投与することは、神経障害、神経変性疾患または神経発達障害（末梢神経病、例えば、ＡＣＣＰＮ、卒中、デメンチア、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病等が挙げられるが、これらに限られるものではない）、ならびに脊髄変性を効率的に治療するのに必要な組織再生または修復に有用である。別の態様として、デルタ３アンタゴニストを投与して、腫瘍形成または過形成疾患（特に、内皮細胞組織における）を効果的に治療することもできる。
本発明は、さらに、１種またはそれ以上の特定のデルタアレル（対立遺伝子）、例えば突然変異アレルに関連する疾患または症状を治療する方法であって、有効量の治療化合物を患者に投与することから成る方法を提供する。１つの実施態様として、該治療化合物は、特定のデルタアレルの効果を補う能力のあるものである。他の態様においては、デルタ３の活性を調節することのできるものが治療化合物とする。好ましい態様においては、デルタアレルはデルタ３のアレルである。さらに好ましい態様においては、対象とする疾患または症状は、神経性疾患、例えば、ＡＣＣＰＮである。
さらに、本発明は、被験者において、デルタ３の生物活性の異常が原因であるまたは関与している疾患または症状（例えば、異常な細胞増殖、変性または分化）が進行する危険性を確認（判断）する方法を提供する。好ましい態様として、対象となる疾患または症状は神経性疾患（例えばＡＣＣＰＮ）である。該方法は、被験者の組織内における（ｉ）デルタ３タンパク質をコードする遺伝子（例えば、配列番号1もしくは３またはそのホモログ）の変異、または（ii）デルタ３遺伝子の誤発現のうちの少なくとも一方を特徴とする遺伝子的損傷の有無を検出することを含む。好ましい態様として、遺伝子的損傷の検出は、以下の少なくとも一つを確認することを含む：デルタ３遺伝子からの１個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失；該遺伝子への１個またはそれ以上のヌクレオチドの付加；該遺伝子の1個またはそれ以上のヌクレオチドの置換；該遺伝子の全体的な損色泰再編成；該遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写産物レベルの変化；該遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写産物の非野生型スプライシングパターンの存在；および／またはタンパク質の非野生型レベル。
好ましい態様として、本発明は、被験者において特定のデルタアレルに関係する疾患または症状が進行する危険性を確認する（判断する）方法であって、該被験者のデルタアレルを同定することから成る方法を提供する。好ましいデルタアレルはデルタ３アレルである。更に好ましい態様においては、対象となる疾患または症状は神経性疾患（例えばＡＣＣＰＮ）である。別の好ましい態様においては、疾患は血管障害である。
例えば、遺伝子的損傷の検出またはデルタアレル（例えばデルタ３アレル）の同定は、（ｉ）デルタ３遺伝子もしくは天然に存在するその突然変異体、またはデルタ３遺伝子に接して結合している５’もしくは３’側の配列（フランキング配列）のセンスまたはアンチセンス配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドから成るプローブ／プライマーを提供し；（ii）該プローブ／プライマーを、目的とする適当な核酸を含有するサンプルと接触させ；そして（iii）該核酸への前記プローブ／プライマーのハイブリダイゼーションにより、遺伝子的損傷の有無を検出することを含み、ここで、該損傷の検出には該プローブ／プライマーを利用してデルタ３遺伝子の配列および必要に応じてフランキング核酸配列の配列決定を行う。例えば、プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または連結連鎖反応（ＬＣＲ）を行い、そして、増幅産物を分析して損傷の存在を調べることができる。
本発明に従う他の診断方法においては、被験者のデルタ３遺伝子の少なくとも一部について配列分析を行い、野生型デルタ３の配列と比較して、遺伝子的損傷の存在を判定する。本発明の別の好ましい診断方法は、一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）を利用するものであり、突然変異体の核酸と野生型核酸との間の電気泳動移動度の差を検出する。
別の態様として、本発明の診断方法は、野生型または突然変異体のデルタ３タンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を用いるイムノアッセイ（免疫検定）によりデルタ３タンパク質のレベルを測定することを含む。
本発明のその他の特徴や効果は、以下の詳細な説明および請求の範囲から明らかであろう。
５’側および３’側の非コード配列を含むヒトデルタ３遺伝子のDNA配列（配列番号1）、ならびにこのヒトデルタ３タンパク質の推定アミノ酸配列を示す（配列番号2）。図には該タンパク質の各種ドメインの存在が示されている。 図１Ａの続き 図１Ｂの続き 複数の配列を一列に並列して示したものであり、本発明の新規なヒトデルタ３タンパク質（ｈ−デルタ３）（配列番号2）、ならびにマウスデルタ１タンパク質（ｍ−デルタ１）（配列番号4）、ラットデルタ１タンパク質（ｒ−デルタ１）（配列番号5）、ヒトデルタ１のタンパク質の一部（WO/97/01571）（配列番号6）、アフリカツメガエルデルタ１タンパク質（ｘ−デルタ１）（配列番号7）、ニワトリデルタ１タンパク質（ｃ−デルタ１）（配列番号8）、ゼブラフィッシュデルタ１タンパク質（ｚ−デルタ１）（配列番号9）、アフリカツメガエルデルタ２タンパク質（ｘ−デルタ２）（配列番号10）およびショウジョウバエデルタ１タンパク質（ｄ−デルタ１）（配列番号11）を表している。デルタ３類似性（DSL：Delta3 similarity）ドメイン、上皮成長因子様（EGF：epidermal growth factor-like）リピートおよび膜透過（TM：transmembrene）ドメインが保存されていることが示されている。これらのデルタタンパク質の個々のGenBank受託番号（ただしヒトの部分配列を除く、これはGenBankに寄託されていない）は、表１に示している。 図２Ａの続き 図２Ｂの続き 図３は、ヒトデルタ１タンパク質の一部（WO/97/01571）、マウスデルタ１タンパク質（ｍ−デルタ１）、ラットデルタ１タンパク質（ｒ−デルタ１）、アフリカツメガエルデルタ１タンパク質（ｘ−デルタ１）、ニワトリデルタ１タンパク質（ｃ−デルタ１）、アフリカツメガエルデルタ２タンパク質（ｘ−デルタ２）ゼブラフィッシュデルタ１タンパク質（ｚ−デルタ１）およびショウジョウバエデルタ１タンパク質（ｄ−デルタ１）とのｈデルタ３との関係を表す系統樹図を示す。これらのデルタタンパク質の個々のGenBank受託番号（ただしヒトの部分配列を除く、これはGenBankに寄託されていない）は、表１に示している。
4.1 一般的説明
本発明は、少なくとも部分的には、本明細書中で「ｈデルタ３（hDelta3）」ポリペプチドと呼んでいるヒトのデルタタンパク質をコードしている新規な遺伝子の発見に基づくものである。典型的なｈデルタ３は、1997年３月５日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection: ATCC）に寄託しており、ATCC受託番号は98348である。ヒトデルタ３遺伝子はヒトの15番染色体上に存在する。
図１は、５’側および３’側の非コード配列を含むヒトデルタ３のDNA配列（配列番号1）、コード配列（配列番号3）、ならびにヒトデルタ３タンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号2）を示す。
ヒトデルタ３は内皮細胞内で発現するものであり、実際に、ヒトの微小血管（MV）内皮細胞ライブラリーからクローニングされた。ヒトの多数の異なる組織から調製したRNAのノーザンブロット分析から、胎児の脳、肺、肝および腎、ならびに成人の心臓、胎盤、肺、骨格筋、腎、膵臓、脾、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸および結腸において3.5kbのデルタ３mRNAの転写物の存在が示唆された。成人の脳および成人の肝においても低レベルのデルタ３mRNAが検出された。しかしながら、末梢血白血球中にはデルタ３mRNAは検出されなかった。これらの結果は、デルタ３が組織特異的に発現されることを示唆している。さらに、ヒトMV内皮細胞における発現は、ある種の成長因子（例えば、塩基性繊維芽細胞成長因子（bFGF）または血管内皮細胞成長因子（VEGF）など）を用いて刺激した細胞内におけるよりも高くなるように制御されている（約２〜３倍）ことがわかった。さらに、結腸直腸腫瘍細胞系であるSW480においては、ヒトデルタ３の強力な発現が観察されている。さらに、増殖および分化のシグナルに応答してｈデルタ３の発現が誘導されることが示された（実施例参照）。このように、ｈデルタ３遺伝子は、増殖および／または分化の段階に応じてその細胞内発現が変化する遺伝子である。
ｈデルタ３をコードしている核酸から構成されるヌクレオチド配列から予測されるように、デルタ３ポリペプチドの全長は685個のアミノ酸からなっており、他の生物から得られたデルタタンパク質とその配列および構造は類似している（図２および以下を参照）ヒトデルタ３タンパク質のアミノ酸配列分析から、このタンパク質が少なくとも次のような構造ドメインを含んでいることが予測される：配列番号2のアミノ酸番号１番付近〜アミノ酸番号17番付近に対応するシグナルペプチド、配列番号2のアミノ酸番号173番付近〜アミノ酸番号217番付近に対応するデルタ類似（DSL）モチーフ（図２）、図２に示されている配列に基本的に対応する８個の上皮成長因子（EGF）様リピート、配列番号2のアミノ酸番号530番付近〜アミノ酸番号553番付近に対応する膜透過ドメイン（図２）、および配列番号2のアミノ酸番号554番付近〜アミノ酸番号685番付近に対応する細胞質性ドメイン（図２）。従って、ｈデルタ３のアミノ酸配列から、このタンパク質は細胞外ドメインを有する膜透過タンパク質であると推定され、このドメインは、DSLモチーフ、EGF様リピート、膜透過ドメイン、および細胞質ドメインを含む配列番号2のアミノ酸番号１番または18番付近〜アミノ酸番号529番付近に対応している（図２）。アミノ酸番号１番からアミノ酸番号20番付近までの領域は疎水性領域であることから、シグナルペプチはが配列番号2のアミノ酸を17個以上含むものと考えられる。
このタンパク質の可溶体（soluble forms）が存在していることも考えられる。そのような可溶性の同型体（イソフォーム）は、デルタ３遺伝子の様々なスプライシングにより、または、膜性の同型体のタンパク質分解の結果として生じ得る。事実、ニワトリデルタタンパク質のスプライス変異体が、PCT出願PCT/US96/11178（公報番号WO 97/01571）に記載されている。さらに、ヒトデルタ様ポリペプチドであるDlkは可溶性タンパク質である（ヤンセン（Jansen）ら、(1994) Eur. J. Biochem. 225: 83-92）。
ヒトデルタ３タンパク質は、ショウジョウバエ、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ、ニワトリ、ラット、マウスおよびヒトにおいて確認されているデルタタンパク質と構造および配列が類似している。今日までに明らかになっているデルタタンパク質のアミノ酸配列を並べたものを図２に示す。この並びには、表１にGenBank受託番号を示している遺伝子によってコードされている以下のデルタタンパク質を含んでいる：マウスデルタ１タンパク質（ｍ−デルタ１）、ラットデルタ１タンパク質（ｒ−デルタ１）、ヒトデルタ１タンパク質（ｈ−デルタ１）、アフリカツメガエルデルタ１タンパク質（ｘ−デルタ１）、ニワトリデルタ１タンパク質（ｃ−デルタ１）、ゼブラフィッシュデルタ１タンパク質（ｚ−デルタ１）、第二のアフリカツメガエルデルタタンパク質（ｘ−デルタ２）、ヒトデルタ３タンパク質（ｈ−デルタ３）およびショウジョウバエデルタ１タンパク質（ｄ−デルタ１）。ｈ−デルタ１のアミノ酸配列は、PCT出願WO 97/01571に公表されているアミノ酸配列であるが、該出願中に記述しているように、この配列は不完全であり多くの誤りを含むものである。アミノ酸配列の並置比較はパイルアップコンピュータープログラム（GCGパッケージ（GCG Package））を用いて行ったが、図中のアミノ酸配列の順番は、異なるデルタタンパク質間の相同性（ホモロジー）を反映している。
従って、並びの一番下であるショウジョウバエのタンパク質は、他のデルタタンパク質から最も離れている。従って、図２は、図２の下から２番目に挙げられているｈデルタ３が、これまでに確認されているマウス、ラット、ヒト、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュおよびニワトリのデルタタンパク質から２番目に離れたデルタタンパク質であることを示している。従って、ｈデルタ３タンパク質は、これまでに記載されているヒトデルタタンパク質および他の属由来のデルタタンパク質とは明らかに異なっている。興味のあることに、ｈデルタ３タンパク質は、アフリカツメガエルの２つのタンパク質、すなわち、デルタ１およびデルタ２から同程度離れたアミノ酸配列を有しており、このことは、ｈデルタ３がアフリカツメガエルのデルタタンパク質のいずれにも対応していないことを示唆している。かくして、このたび新規に単離されたポリペプチドをｈデルタ３と名付け、これまでに確認されているマウス、ラット、ヒト、ゼブラフィッシュおよびアフリカツメガエルのデルタタンパク質を本明細書中ではデルタ１と名付け、２個のアフリカツメガエルのデルタタンパク質をデルタ１およびデルタ２タンパク質と名付けた。ｈデルタ３タンパク質とこれまでに単離されたデルタタンパク質との間の差異は、ｈデルタ３タンパク質とこれまでに確認されているデルタ１およびデルタ２タンパク質との間の相同性（homology）または同一性（identity）のパーセントを比較する（表Ｉ）ことにより、また、他のデルタ１およびデルタ２タンパク質とのデルタ１タンパク質の相同性または同一性のパーセントを比較する（表II）ことによって明らかにすることができる。
Figure 2010004892
表IIは、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／１１１７８（公開番号ＷＯ９７／０１５７１）に開示されたヒトデルタ１と非ヒトデルタ１タンパク質の相同性および同一性のパーセントを示す。このＰＣＴ出願に開示されているヒトデルタ１タンパク質のアミノ酸配列は不完全であるので、ヒトデルタ１アミノ酸配列のうち最も信頼性があると思われる部分を用いて類似性および同一性パーセントを判定した。用いたアミノ酸の一部分は、該ＰＣＴ出願の第１４Ａ図に示されたヒトデルタアミノ酸配列のアミノ酸番号２１４〜３７０番に相当するものである。
Figure 2010004892
したがって、表Iに示されるように、ヒトデルタ３（ｈDelta3）はヒトデルタ１に対する類似性は約６６％であり；マウスデルタ１タンパク質に対する類似性は約７０％であり；ラットデルタ１タンパク質に対する類似性は約７０％であり；ニワトリデルタ１タンパク質に対する類似性は６８％であり；アフリカツメガエルデルタ１タンパク質に対する類似性は約６８％であり；アフリカツメガエルデルタ２に対する類似性は約７０％であり、そしてショウジョウバエデルタ１タンパク質に対する類似性は約５８％であるにすぎない。しかしながら、表IIに示されるように、ヒトデルタ１タンパク質は、マウス、ラット、ニワトリ、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ、およびショウジョウバエのデルタ１、ならびにアフリカツメガエルデルタ２タンパク質に非常に類似している。さらに、マウスとラットのデルタ１タンパク質は約９５％類似している。このように、デルタ１タンパク質は、本発明のデルタ３タンパク質に対するよりも互いにホモロジーを共有しており、デルタタンパク質には少なくとも２つの群（ファミリー）が存在することを示唆している。
このたび新たに単利されたｈデルタ３タンパク質とこれまでに確認されていたデルタ１およびデルタ２タンパク質との相違は、Growtree Phylogramコンピュータプログラム（ＧＣＧパッケージ）を用いて系統樹を構築することによっても認められる。この分析の結果が示す（図３参照）ところによれば、ｈデルタは系統樹において他のデルタタンパク質とは異なる「枝（ブランチ）」上にあり、他のデルタ１タンパク質とデルタ２タンパク質とが互いに離れている度合いよりも、それらのデルタ１およびデルタ２タンパク質から隔離していることが確認される。この分析により、さらに配列の並置比較から予測されるように、相関関係上、ｈデルタ３よりも、これまでに明らかにされているマウス、ラット、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュおよびヒトのデルタタンパク質から隔離しているのはショウジョウバエデルタタンパク質のみである。このように、このたび新規に単利されたｈデルタ３タンパク質は、デルタタンパク質群（ファミリー）の別異の亜種（subspecies）の一員である。
各動物種には少なくとも２つまたは３つのメンバー（例えば、デルタ１、デルタ２およびデルタ３）が存在するが、図２から分かるように、ＤＳＬ領域、８個のＥＧＦリピートおよびＴＭは、それらの種を通して高度に保存されている。しかしながら、図２から理解されるように、ｈデルタ３タンパク質のこれらのドメインが他のデルタタンパク質の対応ドメインと相違する程度は、それらの他のデルタタンパク質の対応ドメインが互いに相違する程度よりも大きい。
ＤＳＬ領域またはモチーフは、ノッチ様タンパク質の推定リガンドのファミリーに属する全ての既知メンバーに存在する（ショウジョウバエにおけるデルタ１およびSerrate；セノラブディティスエレガンスにおけるＬａｇ−２およびＡｐｘ−１）（Henderson他、(1994) Development 120:2913 ; Tax他、(1994) Nature 368:150 ; Fleming他、(1990) Genes Dev. 4;2188 ; Thomas他、(1991) Development 11:749 ; Mello他、(1994) Cell 77:95）。このＤＳＬモチーフは、ショウジョウバエの対応ドメインに非常に類似しているタンパク質であって、ノッチにインビトロ結合するのに必要且つ充分なタンパク質として明らかにされたタンパク質のアミノ末端部に存在する（Henrique他、(1995) Nature 375:787 ; Muskavitch (1994) Dev. Biol. 166:415）。
さらに、実施例５．５に記述するように、デルタ３は、ヒトの第１５染色体においてフレームワークマーカーＤ１５Ｓ２４４およびＤ１５Ｓ１４４に近接する領域に位置する。興味深いことに、第１５染色体においてマーカーＤ１５Ｓ１０４０およびＤ１５Ｓ１１８によって狭まれた領域が、ＡＣＣＰＮ（Ageneis of the Corpus Callosum with Peripheral Neuropathy：末梢性神経病を伴う脳梁無発育）と称される病気と遺伝子的に関係していることが示されている（Casaubon他による既述の文献参照）。この疾患に関係する特定の遺伝子はこれまで未だ明らかにされていない。したがって、デルタ３遺伝子がＡＣＣＰＮに遺伝子的に関係のある染色体領域に存在し且つデルタ３はノッチシグナル経路（その欠損は多くの神経症疾患や症状に関与する）のメンバーであることから、デルタ３の欠損がＡＣＣＰＮを生じさせるのであろう。
ＡＣＣＰＮ（アンダーマン（Andermann）症候群（ＭＩＭ２１８００）と称されることもある）は、ケベック（Quebec）のCharlevoixおよびSaguenay-Lac St Jean地域のフランス系カナダ人に多発するアウトゾーム劣性疾患である。この疾患は、アクソンの変質および中枢神経系（ＣＮＳ）の変形によって引き起こされる進行性の抹消神経病であり、その特徴は脳梁の形成不全が存在しないことである。この病気は若い頃に出現し、次第に進行して３０代で死をもたらす。
かくして、本発明は、デルタ３タンパク質、デルタ３タンパク質をコードする核酸、デルタ３タンパク質に対して免疫反応性の抗体、およびそれらの調製にも関する。さらに、デルタタンパク質（例えばデルタ３タンパク質）の生物学的機能を調節する作用物質（薬剤）を同定する薬剤探索アッセイも提供する。そのような作用物質は、例えば、デルタ３に結合したり、または、デルタ／ノッチシグナル伝達経路の上流もしくは下流の成分とデルタ３との相互作用を変化させる（例えば、デルタ３とデルタ３結合性タンパク質との相互作用を変化させる）ことにより、デルタタンパク質の生物学的機能を調節するものである。それらの作用物質（薬剤）は、治療に有用であり、例えば、細胞増殖および／または分化、さらにはアポトーシスの誘導を変化させるのに用いられる。さらに、本発明は、デルタ３活性の異常、例えばデルタ３遺伝子の異常発現（またはその喪失）、あるいは特定の遺伝子アレル（例えばデルタ３アレル）が関与している疾患を検出し治療するための診断および治療用アッセイおよび試薬を提供する。本発明のその他の側面は以下に記述しており、また、本明細書の開示から当業者には明らかであろう。
4.2 定義
本明細書、実施例および請求の範囲において使用されている幾つかの用語および字句の意味について、便宜上、以下に説明する。
「アレル（対立遺伝子）」という語は、「アレリック変異体（対立遺伝子変異体）」と互換的に用いており、ある遺伝子またはその一部分の変形体を指称する。ある被験者が１つの遺伝子の２つの同一のアレルを有する場合、該被験者はその遺伝子についてホモ接合（同型接合）であると言われる。ある被験者が１つの遺伝子の２つの異なるアレルを有する場合、該被験者はその遺伝子についてヘテロ接合（異型接合）であると言われる。ある特定の遺伝子の（複数の）アレルは、単一のヌクレオチドまたは数種のヌクレオチドで互いに相違し、そして、ヌクレオチドの置換、欠失および挿入から成る。また、ある１つの遺伝子の１つのアレルが突然変異を含有する遺伝子の形態をとることもある。
「デルタ遺伝子の多形成領域のアレリック変異体」という語は、他の固体における当該遺伝子の当該領域に見出された幾つかのヌクレオチド配列のうちの１つを有するデルタ遺伝子の１つの領域を指称する。
本明細書で用いる「アゴニスト」という語は、デルタ３の生物活性を大きくするように調節する（例えば、増強または補充する）作用物質（薬剤）を意味する。デルタ３アゴニストとは、例えば、デルタ３遺伝子の発現を増すように調節する化合物である。あるいは、デルタ３アゴニストは、デルタ３タンパク質からのシグナル伝達を強める化合物、例えば、刺激形態にあるトポリズムタンパク質（toporythmic protein）や小分子のようにデルタ３に結合した化合物である。さらに、デルタ３の下流に存在するタンパク質またはデルタ３と相互作用するタンパク質の発現または活性を調節するような化合物もデルタ３のアゴニストとなる。
本明細書で用いる「アンタゴニスト」という語は、デルタ３の生物活性を小さくするように調節する（例えば、抑制または阻害する）作用物質（薬剤）を意味する。デルタ３アンタゴニストは、例えば、デルタ３遺伝子の発現を低くするように調節する化合物である。あるいは、デルタ３アンタゴニストは、デルタ３タンパク質からのシグナル伝達を減少させる化合物、例えば、抑制形態にあるトポリズムタンパク質や小分子のようにデルタ３に結合する化合物である。好ましいデルタ３アンタゴニストは、デルタ３タンパク質と他の分子（例えば、トポリズムタンパク質）との間の相互作用を抑制するものである。さらに、デルタ３の下流にあるタンパク質またはデルタ３と相互作用するタンパク質の発現または活性を調節するような化合物もデルタ３のアンタゴニストとなる。
「生物学的活性」という語は「生物活性」または「活性」という語と互換的に使用しており、デルタ３ポリペプチド（天然の形態または変性形態を問わない）により、またはそのサブ配列によって直接的または間接的に発揮されるエフェクター機能または抗原性機能を意味する。エフェクター機能としては、レセプターの結合または活性化、分化の誘導、マイトジェンまたは成長促進活性、アポトーシスの誘導、シグナル伝達、免疫調整、ＤＮＡ調節機能およびその他の類似機能（既知または内在する機能を問わない）が挙げられる。抗原性機能としては、天然に存在するかもしくは変性されたデルタ３ポリペプチドまたはそのフラグメント（断片）に対して惹起された抗体と交差反応することができるエピトープまたは抗原部位の取得が挙げられる。したがって、デルタ３タンパク質の生物学的活性にはレセプター（例えば、ノッチ）へ結合することが含まれる。さらに、細胞の増殖および／もしくは分化、または適当なレセプターを有する標的細胞内での細胞死の調節もデルタ３タンパク質の生物学的活性に含まれる。標的細胞は、例えば、神経細胞、内皮細胞、または癌細胞である。
生物学的に活性なデルタ３ポリペプチドは、エフェクター機能と抗原性機能の両方を有するもの、またはそれらの機能の一方のみを有するポリペプチドのいずれでもよい。デルタ３は、アンタゴニストポリペプチドおよび天然のデルタ３を含むが、この場合は、該アンタゴニストは、天然のデルタ３のエピトープを含むか、または、天然のデルタ３の生物学的活性を拮抗する。
「異常なデルタ３活性（デルタ３活性の異常）」という語は、健康な被験者におけるデルタ３活性とは異なるデルタ３の活性を意味する。デルタ３活性の異常は、例えば、デルタ３タンパク質の変異に由来し、例えばレセプターに対する結合親和性の低下または上昇をもたらす。また、異常なデルタ３活性は、デルタ３遺伝子の転写、スプライシングまたは翻訳などに由来してデルタ３のレベル（濃度）が低くなったり高くなったりすることも原因となる。例えば、異常なデルタ３活性はプロモーター活性の異常に由来する。さらに、異常なデルタ３活性は、デルタ３の細胞質ドメインを介するシグナル伝達の異常、例えば、異常なシグナルが伝達されることにも由来する。異常なシグナル伝達は、デルタ３の細胞質ドメインの変異に由来し、あるいは、異常な細胞質タンパク質と接触することによっても起こる。さらに、異常なデルタ３活性は、デルタ３タンパク質が異常なレセプター(例えば、異常なノッチタンパク質)と接触することも原因となる。
「細胞」、「宿主細胞」または「組換え宿主細胞」という語は互換的に使用している。これらの語は、特定の細胞を指称するのみならず、そのような細胞の子孫細胞または子孫細胞に成り得るものも指称する。変異または環境の影響により後の世代にも変性は起こり得るので、そのような子孫細胞は、実際には、親細胞と同一でない場合もあり、それらも本明細書で用いているそれらの術語の範囲に包含されるものとする。
「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」とは、対象とするデルタ３ポリペプチドの１種をコードする第１のアミノ酸が、該デルタ３タンパク質の１種の任意のドメインと異種（外来性）であり実質的に相同でないドメインを定める第２のアミノ酸と融合しているものである。キメラタンパク質は、やはり第１のタンパク質を発現する生物に存在する異種ドメインを提供する（異なるタンパク質であるが）ことができるものであり、あるいは、異なる種類の生物によって発現されるタンパク質の「種間」または「遺伝子間」融合体とみなすことができる。一般的には、融合タンパク質は一般式Ｘ−Delta３−Ｙで表わすことができる。ここで、Delta３（デルタ３）はタンパク質の１種由来のタンパク質の一部分を表わし、そして、ＸおよびＹは、互いに独立して、ある生物のデルタ３配列の１種（天然に存在する突然変異体を含む）とは無関係のアミノ酸配列を表わすか、該配列を欠いている。好ましいデルタ３融合タンパク質の１つはデルタ３−Ｉｇ融合タンパク質である。
「相補的」配列とは、ハイブリダイズして安定な２本鎖を形成することができるような充分な相補性を有する配列を指称する。
「デリバリーコンプレックス」とは、標的手段（例えば、標的細胞表面に遺伝子、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを高親和性結合させたり、および／または標的細胞による細胞取り込みを増大させる分子）を意味する。標的手段の例としては、ステロール（例えば、コレステロール）、脂質（例えば、カチオン性油脂、ビロソームもしくはリポソーム）、ウイルス（アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレトロウイルス）または標的細胞に特異的な結合性物質（例えば、標的細胞特異的レセプターによって認識されるリガンド）が挙げられる。好ましいコンプレックスは、インビボで充分に安定であり、標的細胞による吸収の前に分離を起こさないようにするものである。しかしながら、該コンプレックスは、適当な条件下では分解可能であることにより、遺伝子、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが機能形態で放出されるようにするものである。
よく知られているように、ある特定のポリペプチドの遺伝子は、個体のゲノム内で単一または複数のコピーとして存在する。そのような複製遺伝子は、同一である場合もあれば、変性、例えばヌクレオチド置換、付加または欠失を受けているが、いずれも実質的に同じ活性を有するペプチドをコードしている。したがって、「デルタ３ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列」という語は、特定の個体内の1種またはそれ以上の遺伝子を指称する。さらに、個々の生物間には、アレル（対立遺伝子）と呼ばれるヌクレオチド配列の相違が存在することがある。そのようなアレリックな相違は、コードするポリペプチドのアミノ酸配列の相違をもたらすこともあれば、そうでない場合もあり、同じ生物学的活性を有するタンパク質をコードすることがある。
「デルタ３治療剤」という語は、デルタ３ポリペプチドから成る各種の組成物、ならびにペプチドミメチック、小分子および核酸であって、天然に存在するデルタ３タンパク質の効果を模倣しまたは増強し（アゴナイズし）または抑制する（拮抗する）ことのできるものを指称する。野生型のデルタ３タンパク質の活性を模倣しまたは増強するデルタ３治療剤は「デルタ３アゴニスト」である。逆に、野生型のデルタ３タンパク質の活性を抑制するデルタ３治療剤は「デルタ３アンタゴニスト」である。
「デルタ３ポリペプチド」および「デルタ３タンパク質」という語は、少なくとも１つの生物学的活性を有するデルタ３ポリペプチド、例えば、天然のデルタ３ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性と拮抗する活性を有するものを包含する。
デルタ３に関して本明細書において用いる「遺伝子」または「組換え遺伝子」という語は、エクソン配列および（随時的に）イントロン配列の両方を含む本発明のデルタ３ポリペプチドの１種をコードするオープンリーディングフレームから成る核酸分子を指称する。「組換えデルタ３遺伝子」とは、デルタ３ポリペプチドをコードする核酸を指称し、該核酸はデルタをコードするエクソン配列から成るものであるが、染色体デルタ３遺伝子由来または非関連染色体由来のイントロン配列を含むこともある。本発明に関係するデルタ３ポリペプチドをコードする組換え遺伝子の例は配列表に示している。「イントロン」という語は、所与のデルタ３遺伝子内に存在するＤＮＡ配列であって、タンパク質に翻訳されず一般にエクソン間に存在するものを指称する。
細胞の「成長状態」という語は、細胞の増殖状態を指称するとともに、その分化状態も指称する。すなわち、この語は、細胞が例えば、Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、前期、中期、終期にあるような細胞周期の段階を指称するとともに、細胞の分化の状態、例えば、未分化、部分分化、または完全な分化状態を指称する。細胞の分化は、通常、細胞の増殖速度の減少を伴うが、この場合に限定するものではない。
「相同性（ホモロジー）」または「同一性」または「類似性」とは、２つのペプチドまたは２つの核酸分子間の配列の類似度を指称する。相同性は、比較目的で並べた（整合させた）各配列の１つの位置を比較することにより定めることができる。比較しようとする配列の或る位置が同一の塩基またはアミノ酸で占められていれば、それらの分子はその位置において同一である。相同性または類似性または同一性の程度は、（複数の）核酸配列に共通の位置において同一であるまたはマッチングするヌクレオチドの数の関数である。アミノ酸配列の同一性の程度は、（複数の）アミノ酸配列に共通の位置において同一であるアミノ酸の数の関数である。アミノ酸配列の相同性または類似性の程度は、（複数の）アミノ酸配列に共通の位置において保存されているアミノ酸配列の数の関数である。本発明のヒトデルタ３配列の１種に「非関連」または「非相同」な配列とは、４０％より低い同一性を有する配列であるが、好ましくは、本発明のヒトデルタ３配列に対して２５％より低い同一性を有するものである。
本明細書中で用いる「相互作用」という語は、分子間の検出可能な相互作用、例えば酵母のツーハイブリッドアッセイを用いて検出することができるような相互作用を含む。相互作用という語は、さらに、分子間の「結合性」相互作用も含むものとする。相互作用は、例えば、タンパク質−タンパク質、タンパク質−核酸、タンパク質−小分子、または核酸−小分子間で起こる。
本明細書において、ＤＮＡやＲＮＡのような核酸に関して用いる「単離された」という語は、巨大分子（マクロ分子）として天然源に存在するＤＮＡまたはＲＮＡから分離された分子を指称する。例えば、本発明のデルタ３ポリペプチドの１つをコードする単離された核酸は、好ましくは、ゲノムＤＮＡのデルタ３遺伝子を挟む（フランキングする）１０キロベース（ｋｂ）以下の核酸配列を含むものであり、より好ましくは、そのような天然に存在するフランキング配列の５ｋｂ以下、もっとも好ましくは、そのような天然に存在するフランキング配列の１．５ｋｂ以下を含むものである。本明細書において用いる「単離された」という語は、さらに、組換えＤＮＡ技術により産生された場合には細胞物質、ウイルス物質または培地を実質的に含まず、あるいは、化学合成された場合には前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まない核酸またはペプチドも指称する。さらに、「単離された」という語は、組換えＤＮＡ技術により産生された場合には細胞物質、ウイルス物質または培地を実質的に含まず、あるいは、化学合成された場合には前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まない核酸またはペプチドも指称する。さらに、「単離された核酸」とは、フラグメント（断片）としては天然には存在せず、また、天然状態では見出されないような核酸フラグメントを意味する。「単離された」という語は、さらに、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドを指称し、精製されたポリペプチドおよび組換えポリペプチドの両者を包含する。
本明細書において用いる「調節」という語は、上方調節、すなわち、応答の刺激、および下方調節、すなわち、応答の抑制の両方を指称する。
「（突然）変異（した）遺伝子」という語は、或る遺伝子のアレリック体を指称し、当該変異遺伝子を有しない対象に対し当該変異遺伝子を有する対象の表現型を変化させることができるものである。対象が表現型を変化させる突然変異についてホモ接合であるときは、該突然変異は劣性であると言われている。変異遺伝子のコピーが対象の遺伝子型を変えるのに充分である場合には、突然変異は優性であると言われる。対象が変異遺伝子のコピーを有し、ホモ接合な対象の表現型とヘテロ接合な対象の表現型の中間にあるような表現型を有する場合には突然変異は共優性であると言われる。
本発明の「非ヒト動物」とは、囓歯類、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシのような哺乳動物、ニワトリ、両生類、はちゅう類などを含む。好ましい非ヒト動物は、ラットおよびマウスを含む囓歯類から選ばれ、好ましいのはマウスであるが、ツメガエル属のようなトランスジェニック両生類やトランスジェニックニワトリも重要なツールであり、胚形成や組織形成などに影響を薬剤（作用物質）を調べ同定するのに用いられる。“キメラ動物”という語は、組換え遺伝子が存在するか、または、全ての細胞ではないが幾つかの細胞内で組換え体が発現される動物を指称する。「組織特異的キメラ動物」とは、或る組織内で組換えデルタ３遺伝子の１種が存在するかおよび／もしくは発現されるかまたは分解されるが、その他の組織ではそのようなことが行われないことを指す。
本明細書において用いる「核酸」という語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、そして、該当する場合にはリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドを指称する。さらに、この語は、等価物として、ヌクレオチドアナログから得られるＲＮＡまたはＤＮＡのアナログも指称し、そして、記述している具体例に応じて、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖のポリヌクレオチドを指称する。
「多形（態）性」という語は、或る遺伝子またはその一部分について１つより多くの形態が共存することを指称する。少なくとも２つの異なる形態、すなわち、２つの異なるヌクレオチド配列が存在する遺伝子の一部分は、「遺伝子の多形（態）領域」と呼ばれる。多形（態）領域は一本鎖ヌクレオチドのこともあり、アレルが異なることにより相違する。さらに、多形（態）領域は数ヌクレオチドの長さのものについても存在し得る。
「多形（態）遺伝子」とは、少なくとも１つの多形（態）領域を有する遺伝子を指称する。
遺伝子産物に言及している場合、「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という語は互換的に用いている。
「組換えタンパク質」という語は、組換えＤＮＡ技術により産生される本発明のポリペプチドを指称し、一般的には、デルタ３ポリペプチドが適当な発現ベクターに挿入され、該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換して異種（外来）タンパク質を産生するようにしたものである。さらに、組換えデルタ３遺伝子に関して「〜由来」という語は、「組換えタンパク質」の意味の範囲内で、天然のデルタ３タンパク質のアミノ酸配列、または、天然に存在する形態のタンパク質の置換や欠失（端部切断を含む）などによる突然変異により産生された類似アミノ酸配列を有するものを包含することを意味する。
本明細書において用いる「特異的にハイブリダイズする」または「特異的に検出する」という語は、配列番号1または3に示されるデルタ３配列、またはそれに相補的な配列、または天然に存在するそれらの突然変異体のような脊椎動物（好ましくは哺乳動物）のデルタ３遺伝子の少なくとも約６、１２、２０、３０、５０、１００、１５０、２００、３００、３５０、４００または４２５個の連続したヌクレオチドに本発明の核酸分子がハイブリダイズする、すなわち、脊椎動物の他のタンパク質（好ましくはデルタ３タンパク質以外のタンパク質）をコードする細胞性核酸（例えばｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）に対するよりも１０倍以上、好ましくは１００倍以上のハイブリダイゼーション能力を有することを指称する。
本明細書において用いる「組織特異的プロモーター」という語は、プロモーターとして機能する、すなわち、該プロモーターに作用連結された特定のＤＮＡ配列の発現を調節し、且つ、或る組織の特定の細胞（例えば、肝臓または膵臓由来の細胞、神経細胞、または免疫細胞）内で該ＤＮＡ配列の発現に影響を与えるようなＤＮＡ配列を意味する。この語は、さらに、「リーキー」プロモーター、すなわち、専ら１つの組織における特定のＤＮＡの発現を調節するが、他の組織における発現を引き起こすプロモーターも包含する。
「転写調節配列」とは、開始シグナル、エンハンサーおよびプロモーターのように、該配列が作用連結されているタンパク質コード配列の転写を誘導したり制御するＤＮＡ配列を指称する総称として本明細書では使われている。好ましい態様においては、組換えデルタ３遺伝子の１種の転写は、発現が意図されている細胞系で該組換え遺伝子の発現を制御するプロモーター配列（または他の転写調節配列）の下に行われている。さらに、該組換え遺伝子は、天然に存在する形態のデルタ３タンパク質の転写を制御する配列と同一または異なる転写調節配列の下に置くこともできる。
本明細書で用いる「トランスフェクション」という語は、核酸を介する遺伝子の移転によりレシピエント（受容）細胞中に核酸（例えば発現ベクター）を導入することを意味する。本明細書中で用いる「トランスフォーメーション（形質転換）」とは、細胞が外来性ＤＮＡやＲＮＡを取り込むことにより細胞の遺伝子型が変化させられることを指称し、例えば、形質転換された細胞は組換え型のデルタ３ポリペプチドを発現し、あるいは、移転された遺伝子由来のアンチセンス発現の場合は、天然型のデルタ３タンパク質の発現が行われなくなる。
「トランスジーン（導入遺伝子）」という語は、（例えばデルタ３ポリペプチドの１種またはそれに対するアンチセンス転写体をコードする）核酸であって、該核酸を導入しようとするトランスジェニック動物もしくは細胞に対して部分的もしくは完全に異種（すなわち、外来性）であるか、または、該核酸を導入しようとするトランスジェニック動物もしくは細胞の内因性遺伝子と相同であるが、動物のゲノム内に挿入されて挿入細胞のゲノムを変化させるものを意味する（例えば、天然の遺伝子の位置と異なる位置に挿入され、あるいは挿入によりノックアウトが生じる）。トランスジーンは、１種またはそれ以上の転写調節配列および選択した核酸の最適発現に必要なその他の核酸を含むことがある。
「トランスジェニック動物」とは、人間が介在することにより（例えば当該技術分野でよく知られたトランスジェニック技術により）１種またはそれ以上の細胞が異種の核酸を含有する任意の動物、好ましくは非ヒト哺乳動物、鳥類または両生類を指称する。該核酸は、綿密な遺伝子操作（例えば、マイクロインジェクションまたは組換えウイルスの感染による）により細胞の前駆体内に直接的または間接的に細胞に導入される。ここで遺伝子操作という語は古典的な交配やインビトロ受精ではなく、組換えＤＮＡ分子を導入することを目的とするものである。該分子は、染色体内に組み込まれるものや、染色体外複製ＤＮＡなどである。本明細書で記述する典型的なトランスジェニック動物においては、トランスジーンにより細胞が組換え型のデルタ３タンパク質（例えば、アゴニストまたはアンタゴニストとして）を発現するようになる。しかし、組換えデルタ３遺伝子がサイレントであるようなトランスジェニック動物も意図しており、これには、例えば、後述するＦＬＰまたはＣＲＥリコンビナーゼ依存性構造体（コンストラクト）がある。さらに、「トランスジェニック動物」には、人間が介存すること（組換えおよびアンチセンス技術の双方を含む）により１種またはそれ以上のデルタ３遺伝子の遺伝子崩壊が引き起こされる動物も包含される。
本明細書で用いる「ベクター」という語は、それに連結された他の核酸を輸送する能力を有する核酸を指称する。好ましいベクターの１種は、エピソーム、すなわち、染色体外複製を行なうことのできる核酸である。好ましいベクターは、それに連結された核酸の自律的複製および／または複製を行うことができるものである。作用連結された遺伝子の発現を行なうことのできるベクターをここでは「発現ベクター」と指称する。一般に、組換えＤＮＡ技術に用いられている発現ベクターは、「プラスミド」の形態を成していることが多い。プラスミドとは一般に二本鎖ＤＮＡのループを指すが、ベクターと成るときは染色体に結合されない。プラスミドは最も一般的に用いられるベクターであるので、本明細書中では「プラスミド」と「ベクター」を互換的に使用する。しかしながら、本発明は、等価の機能を発揮し当該分野で知られる他の種類のベクターも包含するものとする。
本明細書で用いる「治療」という語は、治癒することのみならず、異常や病気の少なくとも１つの症状を改善することを含むものとする。
4.3 本発明の核酸
後述するように、本発明は、１つの側面として、デルタ３ポリペプチドをコードするヌクレオチドから成る単離された核酸、および／またはそのようなポリペプチドもしくは核酸の同等物（等価物）に関する。ここで同等物（等価物）という語は、本明細書に記述するように、機能的に同等なデルタ３ポリペプチドまたはデルタ３タンパク質の活性の１つを有する機能的に同等なペプチドを含むものとする。同等（等価）なヌクレオチド配列は、１個またはそれ以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失により異なるような配列を含み（例えば、アレル変異体）、したがって、遺伝子コードの縮重に因り、配列番号1〜3のいずれかに示すデルタ３のヌクレオチド配列と異なる配列を含む。
好ましいデルタ３核酸は、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％同一または類似であるポリペプチドをコードするものである。配列番号2に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、好ましくは、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一または類似であるポリペプチドをコードする核酸も本発明の範囲内にある。特に好ましい態様においては、本発明の核酸は、に示されるアミノ酸配列に対してアミノ酸全体として少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のホモロジー（相同性）または同一性を有するポリペプチドをコードするものである。好ましい態様においては、（本発明の）核酸は、配列番号2に記載のアミノ酸から成るタンパク質をコードするものである。好ましくは、（本発明の）核酸は、配列番号1または3のコード領域に対応するヌクレオチド配列の全部または一部を含むものである。
本発明の核酸は、昆虫類を含む任意の種由来のデルタ３タンパク質をコードすることができる。好ましい核酸は、脊椎動物のデルタ３タンパク質をコードするものである。さらに好ましい核酸は、哺乳動物のデルタ３タンパク質（例えば、ヒトのデルタ３タンパク質）を含む霊長類のデルタ３をコードするものである。本発明の他の核酸として、トリ、ウマ、イヌ、ネコ、ウシまたはブタのデルタ３タンパク質をコードするものが含まれる。
本発明の好ましい態様においては、核酸は、デルタ３の細胞外ドメイン、例えば配列番号2を有するデルタ３から成るポリヌクレオチドをコードするものである。したがって、好ましい核酸は、配列番号2のアミノ酸番号１番付近からアミノ酸番号５２９番付近から成るポリペプチドコードするものである。他の好ましい核酸は、実質的にシグナルペプチドを欠如するデルタ３の細胞外ドメインに対応するポリペプチド、例えば、配列番号2のアミノ酸番号１８番付近からアミノ酸番号５２９番付近から成るポリペプチドをコードするものである。別の好ましい核酸は、デルタ３の細胞外ドメインにおける少なくとも１つの保存モチーフ、例えば、図２（配列番号2）に示されているようなＤＳＬモチーフまたはＥＧＦ様（ＥＧＦ−like）モチーフから成るポリペプチドをコードするものである。１つの態様として、核酸は少なくとも１つのＥＧＦ様モチーフを有するタンパク質をコードするものである。他の態様においては、核酸は、図２（配列番号2）に示されるような少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つのＥＧＦ様リピートを有するタンパク質をコードするものである。これらの数のＥＧＦ様リピートのいずれをコードする核酸によってコードされているポリペプチドは、ＤＳＬモチーフをコードするアミノ酸配列を追有することもできる。
上述の核酸のいずれかによってコードされたポリペプチドは、可溶性になり得る。好ましい可溶性ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸番号１番付近からアミノ酸番号５２９番付近に対応するアミノ酸配列またはそのホモログから成るものである。さらに別の好ましい可溶性デルタ３ポリペプチドは、少なくとも１つのＥＧＦ様リピートを含むものである。そのようなポリペプチドは、ＤＳＬを追有してもよく、また、随意的にシグナルペプチドを含んでいてもよい。
さらに好ましい核酸は、融合タンパク質であるデルタ３ポリペプチドをコードするものである。そのような融合タンパク質に、デルタ３タンパク質の細胞外ドメインの少なくとも一部が含まれていることもある。その一部とは、例えば、上述したようなもののうちの少なくとも約１０個のアミノ酸から成る部分である。そのような融合タンパク質をコードする核酸は、米国特許第５，４３４，１３１号の記載に従って調製することができる。
別の態様として、本発明の核酸によりコードされるポリペプチドは膜結合型とすることもできる。本発明の膜結合型ポリペプチドは、好ましくは、トランスメンブレン（膜貫通）ドメインを有するものである。膜貫通ドメインは、デルタ３タンパク質由来のものとすることができ、例えば、図２に示される配列番号2のアミノ酸番号５３０番付近からアミノ酸番号５５３番付近から成る膜貫通ドメインである。この代わりに、膜貫通ドメインとして他の膜タンパク質由来のものを用いて、例えば、キメラのデルタ３膜タンパク質が産生されるようにしてもよい。さらに、本発明に属する他のポリペプチドは、細胞内タンパク質であってもよい。すなわち、膜貫通ドメインを構成しないタンパク質も本発明の範囲に包含されている。本発明に属する他のタンパク質は細胞外ドメインを有しないものである。本発明に属する更に別のタンパク質は、細胞外ドメインも膜貫通ドメインも有しないものである。
本発明の核酸によってコードされるポリペプチドは、細胞質ドメインを含むこともできる。好ましい態様においては、本発明の核酸は、デルタ３の細胞質ドメインを含むポリペプチドをコードするものである。さらに好ましい態様においては、該細胞質ドメインは、配列番号2（図２）のアミノ酸番号５５４番付近からアミノ酸番号６８５番付近のアミノ酸配列またはその一部を有するものである。
さらに別の好ましい態様として、本発明の核酸は、次の群から選ばれるデルタ３タンパク質の少なくとも１つのドメインを含むポリペプチドをコードする：シグナルペプチド、ＤＳＬモチーフ、ＥＧＦ様モチーフ、膜貫通（トランスメンブレン）ドメイン、および細胞質ドメイン。本発明のポリペプチドは、デルタ３タンパク質由来のこれらのドメインの幾つかを含むようにすることができる。この代わりに、本発明のポリペプチドをキメラタンパク質、すなわち、これらの保存されたドメインの幾つかで構成され、その少なくとも幾つかがデルタ３タンパク質以外由来のものから構成されるようにすることもできる。したがって、１つの態様においては、本発明の核酸は、デルタ３以外のデルタ３タンパク質由来のアミノ酸配列を有するＤＳＬモチーフを含むポリペプチドをコードするものである。そのようなアミノ酸配列には、ＤＳＬモチーフとして図２に示されているような任意の配列を用いることができる。さらに別の態様として、本発明の核酸は、デルタ３タンパク質以外のタンパク質由来のシグナルペプチドを有するデルタ３タンパク質をコードするものである。さらに、デルタ３タンパク質以外のタンパク質由来の細胞質ドメインを有するデルタ３ポリペプチドをコードする核酸ならびにデルタ３タンパク質以外のタンパク質由来のデルタ３細胞質ドメインおよび細胞外ドメインをコードする核酸も本発明の範囲に包含される。デルタ３以外のタンパク質としては、例えば、トポリズムタンパク質が可能である。「トポリズムタンパク質」とは、ノッチ（Notch）、デルタ（Delta）、セラテ（Serrate）、スプリット（Split）のエンハンサー、デルテック（Deltex）、および構造的類似性を有するこのファミリーに属する他のタンパク質を包含するものである（例えば、既述の国際特許出願ＷＯ９７／０１５７１；ＷＯ９２／１９７３４；およびＷＯ９４／０７４７４参照）。
配列番号2の上述した部分に相同性（ホモロジー）を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸も本発明の範囲に包含される。本発明に属する好ましい核酸は、図２に示されるデルタ３ドメインのうちの任意のドメインのアミノ酸配列に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするものである。本発明の更に好ましい核酸は、図２に示されるデルタ３ドメインのうちの任意のドメインのアミノ酸配列に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするものである。
一つの態様として、（本発明の）核酸、例えばｃＤＮＡは、デルタ３ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性、例えばデルタ３レセプター（例えばノッチ）に結合する能力を有するペプチドをコードする。デルタ３タンパク質またはその断片（フラグメント）に相互作用することができるタンパク質またはペプチドの同定は、各種の方法、例えば結合アッセイに基づく方法によって行うことができる。例えば、デルタ３タンパク質またはその一部分を用いて、いろいろな種類の発現ライブラリー系を用いて、デルタ３の細胞質ドメインと相互作用する細胞質タンパク質を単離することができる。デルタ３タンパク質のうちリガンドと相互作用することのできる部分の判定は、デルタ３タンパク質の幾つかのフラグメント（断片）を調製し、リガンドと相互作用する能力のあるフラグメントをスクリーニングすることにより行うことができる。ショウジョウバエデルタタンパク質（これはＤＳＬドメインおよびＥＧＦ様ドメインを含有する）のＮ末端部分がノッチに対するインビトロ結合に必要且つ充分である（Henrique他、上述；Muskavitch他、上述）という事実に少なくとも部分的に基づき、或るリガンドに相互作用することのできるデルタ３のドメインはＤＳＬドメインおよび／または少なくともＥＧＦ様ドメインの少なくとも一部を含むものと考えられる。しかしながら、デルタ３の細胞外ドメインの他の部分が、少なくとも幾つかのデルタ３リガンドへの結合には必要なのであろう。
他の好ましい態様においては、本発明のデルタ３ポリペプチドが、特定の標的細胞（例えば、神経細胞または内皮細胞）の増殖および／もしくは分化または細胞死を調節することができる。デルタ３ポリペプチドが少なくとも１つのデルタ３タンパク質の生物学的活性を有していることを測定する方法は後述する。
本発明の更に別の好ましい核酸は、配列番号2のアミノ酸残基の全てまたは一部、例えば、該領域の少なくとも２、５、１０、２５、５０、１００、１５０または２００個のアミノ酸残基に対応するポリペプチド配列を含むデルタ３ポリペプチドをコードするものである。好ましい核酸は、配列番号2に記載されているアミノ酸配列のアミノ酸番号１番付近からアミノ酸番号５７０番付近のうちの少なくとも２個の連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドをコードするものである。さらに別の好ましい核酸は、配列番号2に記載されているアミノ酸番号１番付近からアミノ酸番号５７５番付近の少なくとも３、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続したアミノ酸を含むポリペプチドをコードするものである。本発明は、さらに、配列番号2に記載されたアミノ酸の少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、そして最も好ましくは約９０％、または配列番号2の一部分由来の少なくとも１０個の連続したアミノ酸を有するポリペプチドをコードする核酸を提供する。１つの態様として、該一部分は、配列番号2のアミノ酸番号１番付近からアミノ酸番号５７５番付近に対応するものである。本発明のコード領域における分子は、好ましくは、少なくとも約２００、２５０、３００、３５０、４００、４１０、４２０、４３０、４３５または４４０の塩基対を含むものである。
本発明は、さらに、プローブ／プライマーまたはアンチセンス分子として用いられる核酸分子（すなわち、非コード核酸分子）であって、少なくとも約６、１２、２０、３０、５０、１００、１２５、１５０または２００のヌクレオチドまたは塩基対を含む核酸分子に関する。本発明のさらに別の好ましい核酸は、配列番号1または3の少なくとも約３００、少なくとも約３５０、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、少なくとも約５００、または少なくとも約６００のヌクレオチドを含む。１つの態様として、本発明の核酸は、配列番号1の核酸配列の５’側部分に相応する。例えば、本発明の核酸は、核酸配列配列番号1のヌクレオチド番号１番付近からヌクレオチド番号２０００番付近から成る部分に相応する。
本発明の方法に従いプローブとして用いられるのに好ましい核酸は、配列番号1由来（またはその一部分由来）の少なくとも約６、好ましくは少なくとも約９、より好ましくは少なくとも約１２、そして最も好ましくは少なくとも約１５個の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含むものである。好ましい態様においては、前記一部分とは、配列番号1のヌクレオチド番号約１番から約２０６０番に対応する部分である。別の例として、該部分は、ヒトデルタ３タンパク質の保存モチーフをコードするヌクレオチド配列である。さらに別の例として、該部分が、ヒトデルタ３タンパク質の保存モチーフをコードする核酸配列間に存在するヌクレオチド配列であってもよい。
本発明は、さらに、配列番号1またはそのホモログの少なくとも一部分に相当する少なくとも２種類の核酸の組み合わせも提供する。すなわち、１つの態様として、配列番号1由来（またはその一部分由来）の少なくとも約６、好ましくは少なくと約９、より好ましくは約１２、そして最も好ましくは約１５個の連続したヌクレオチドから２種類の核酸の組合せを提供する。好ましい態様においては、それらの核酸の少なくとも一方をラベル（標識）する。
本発明は、さらに別の側面として、配列番号1または3のいずれか一方で表される核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進する好適なストリンジェンシー条件（例えば、約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）の後、５０℃で２．０×ＳＳＣで洗浄）は、当業者には既知であり、「Current Protocols in Molecular Biology」（John Wiley & Sons発行、N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）に記述されている。例えば、洗浄工程における塩濃度は、５０℃で約２．０×ＳＳＣという低ストリンジェンシーから、５０℃または６５℃で約０．２×ＳＳＣという高ストリンジェンシーのように選択することができる。さらに、洗浄工程における温度を、室温（約２２℃）での低ストリンジェンシーから約６５℃での高ストリンジェンシーというように上昇させることもできる。温度と塩の両方を変化させることもできるが、温度または塩濃度を一定に保ち、その他の変数を変化させることもできる。好ましい態様においては、本発明の保存された核酸は、温和なストリンジェント条件下（例えば、約２．０×ＳＳＣ、約４０℃）で配列番号1または3のいずれか一方に結合する。特に好ましい態様においては、本発明のデルタ３核酸は、高ストリンジェンシー条件下で配列番号1または3の一方に結合する。
好ましい核酸は、ヒトデルタ３遺伝子のようなデルタ３遺伝子の核酸配列（例えば、配列番号1および3の一方に示されるような配列）に対して少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、そして最も好ましくは少なくとも約８５％の相同性（ホモロジー）を有する配列を含むものである。配列番号1および3の一方に示される核酸配列に対して少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、そして最も好ましくは少なくとも約９８〜９９％の相同性を有する核酸も勿論本発明に包含される。好ましい態様においては、核酸は、ヒトデルタ３遺伝子であり、そして特に好ましい態様においては、配列番号1または3の一方のコード領域に対応するヌクレオチド配列の全部または一部を含むものである。
遺伝子コードの縮重に因り配列番号1または3のいずれかに示されるヌクレオチド配列と相違する配列を有する核酸も本発明の範囲に包含される。そのような核酸は、機能的に等価なペプチド（すなわち、デルタ３ポリペプチドの生物学的活性を有するペプチド）をコードするが、配列表に示される配列とは遺伝子コードの縮重に因り配列が異なっている。例えば、多くのアミノ酸が複数のトリプレットにより表される。同一のアミノ酸を特定するコドン、すなわち同義コドン〔例えば、ＣＡＵとＣＡＣ（いずれもヒスチジンをコードする）〕は、デルタ３ポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えない「サイレント」変異を生じることがある。しかし、デルタ３ポリペプチドのアミノ酸配列の変化をもたらすようなＤＮＡ配列の多形性も存在すると考えられる。当業者であれば、自然のアレル変化に因り所与の種の個体間に、或るデルタ３ポリペプチドの活性を有するポリペプチドをコードする核酸の１個またはそれ以上の変化（例えば、ヌクレオチドの約３〜５％の変化）が存在し得ることが理解されるであろう。
後述の実施例によって示されるように、デルタ３タンパク質をコードする核酸は、多くの真核細胞のいずれかに存在するｍＲＮＡから入手することができる。さらに、本発明のデルタ３ポリペプチドをコードする核酸は、オトナおよび胎児のいずれのゲノムＤＮＡから入手することもできる。例えば、デルタ３タンパク質をコードする遺伝子は、本明細書に記述するプロトコール、あるいは当該技術分野の当業者に一般的に知られている方法に従ってｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーのいずれかからクローニングすることができる。本発明の核酸を単離するのに好適な組織および／またはライブラリーの例には、とりわけ、内皮細胞ライブラリーが挙げられる。デルタ３タンパク質をコードするｃＤＮＡは、細胞、例えば、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞またはヒト細胞（胎児細胞を含む）から全ｍＲＮＡを単離することにより入手することができる。次に、この全ｍＲＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを調製した後、多くの既知の手法のいずれかを用いて適当なプラスミドまたはバクテリオファージ内に挿入する。さらに、本発明によって与えられるヌクレオチド配列の情報に従ってポリメラーゼ連鎖反応法を用いて、デルタ３タンパク質をコードする遺伝子をクローニングすることもできる。本発明の核酸は、ＤＮＡのこともあれば、ＲＮＡのこともある。好ましい核酸は、配列番号1および3から成る群より選ばれる配列によって表されるｃＤＮＡである。
4.3.1 ベクター
本発明は、さらに、デルタ３タンパク質をコードし、少なくとも１つの転写調節配列に作用連結された核酸を含有する発現ベクターを提供する。「作用連結され（operably linked）」とは、ヌクレオチド配列が、該ヌクレオチド配列の発現が可能となるように調節配列に連結されていることを意味するものとする。調節配列は、当該分野で認められたものであり、本発明のデルタ３タンパク質を発現を導くものから選ばれる。すなわち、「転写調節配列」とは、プロモーター、エンハンサーおよびその他の発現制御エレメントを含む。そのような調節配列は、Goeddelの「Gene Expression Technology : Methods in Enzymology 185」（米国カリフォルニア州San DiegoのAcademic Press発行、1990年）に記述されている。１つの態様として、発現ベクターは、デルタ３ポリペプチドに対するアゴニスト活性を有するペプチドをコードするか、または、デルタ３タンパク質のアンタゴニストであるペプチドをコードする組換え遺伝子である。そのような発現ベクターを用いて細胞をトランスフェクションし、これによって、本明細書中に記述するような核酸によりコードされたタンパク質（融合タンパク質を含む）ポリペプチドを産生させることができる。さらに、本発明の遺伝子構造体を遺伝子治療法の一部として用いて、デルタ３タンパク質のいずれかのアゴニスト体またはアンタゴニスト体をコードする核酸を供給することもできる。すなわち、本発明の別の特徴として、本発明は、インビボまたはインビトロでトランスフェクションを行い、特定の細胞系でデルタ３ポリペプチドを発現させることにより、組織内でのデルタ誘導によるシグナル伝達の機能を再構築したり、または、該機能を排除するような発現ベクターに関する。これは、例えば、該タンパク質の天然型が誤発現されるような場合、あるいは、組織の分化を変形させるような形態のタンパク質を供給する目的には、望ましいことになるであろう。さらに、発現ベクターを用いて腫瘍性転化を抑制することもできる。
上述したようなウイルスを用いる移送法の他に、非ウイルス性の方法を用いて動物組織内にデルタ３ポリペプチドの発現を引き起こすようにすることもできる。多くの非ウイルス性遺伝子移送法は、哺乳動物細胞がマクロ分子（巨大分子）を取り込み分子内輸送する機構に基づくものである。好ましい態様として、本発明の非ウイルス性標的法は、標的細胞によりデルタ３ポリペプチド遺伝子が取り込まれるエンドシトーシス経路を利用するものである。このような標的法の例としては、リポソーム誘導系、ポリリジンコンジュゲートおよび人工のウイルスエンベロープを用いるものが挙げられる。
4.3.2 プローブおよびプライマー
さらに、ｈデルタ３遺伝子のクローニングによって決定されたヌクレオチド配列から、他の細胞型（例えば、他の組織由来など）のデルタ３相同体（ホモログ）、および他の哺乳類の器官由来のデルタ３相同体の確認および／またはクローニングに使用するために設計されたプローブおよびプライマーを作出することができる。本発明のプローブおよびプライマーを用いて、デルタ３アレル（対立遺伝子）の同定ならびに／または被験者のデルタ３遺伝子内に１個もしくはそれ以上の突然変異が存在するか否かを確認することができる。好ましい実施態様においては、本発明のプローブまたはプライマーを用いて、被験者が特定のデルタ３アレル（突然変異を有しているアレルなど）に関連した疾病および症状が進行する危険性を有しているまたは危険性があるか否かを判断することができる。
好ましい実施態様においては、本発明は、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマーも提供し、このオリゴヌクレオチドは、配列番号1もしくは3、またはそれらの天然に生じた突然変異からなる群より選択された少なくとも約12個、好ましくは約25個、より好ましくは約40、50、もしくは75個の連続したヌクレオチドによって構成されているセンス配列またはアンチセンス配列にストリンジェント条件下においてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。例えば、配列番号1もしくは3で表される核酸に基づくプライマーをPCR反応に使用し、特異的デルタ３アレルなどのようなデルタ３相同体をクローンすることができる。そのようなプライマーは、他の遺伝子（例えば、他のデルタ遺伝子など）と顕著なホモロジーを有しない領域内において選択することが好ましい。本発明の好ましいプライマーは以下の配列番号4-8に示している：

５’末端プライマー：
5’AGCGCCTCTGGCTGGGCGCT 3’
（配列番号12；配列番号1のヌクレオチド番号356番〜375番に対応）
5’CGGCCAGAGGCCTTGCCACC 3’
（配列番号13；配列番号1のヌクレオチド番号725番〜744番に対応）

３’末端プライマー
5’TTGCGCTCCCGGCTGGAGCC 3’
（配列番号14；配列番号1のヌクレオチド番号1460番〜1479番に対応）
5’ATGCGGCTTGGACCTCGGTT 3’
（配列番号15；配列番号1のヌクレオチド番号1592番〜2611番に対応）

同様に、被験者のデルタ３配列に基づくプローブを用いて、同一または相同なタンパク質をコードしている転写体またはゲノム性配列を検出することができる。好ましい実施態様においては、プローブはさらに、それらに結合し、検出可能なラベルを有している。このラベルは例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素および酵素補因子から選択される。
以下により詳細に記載しているが、そのようなプローブを、デルタ３タンパク質を誤発現している細胞または組織の確認のための診断試験キットの一部として用いることも可能である。これは例えば、患者由来の細胞サンプル内のデルタをコードしている核酸のレベルを測定することによって実施することができ、具体的には、デルタ３のmRNAレベルを検出したり、ゲノムのデルタ３遺伝子が突然変異を起こしているか否か、または欠失しているか否かを確認することなどがある。端的に述べると、被験者のデルタ３遺伝子から非処理組織または組織サンプルを組織学的にスクリーニングすることができるヌクレオチドプローブを作出して、デルタをコードしている転写体の存在（または不在）を調べることができる。抗デルタ３抗体の診断における使用と同様に、デルタ３メッセージまたはゲノム性デルタ３配列に対するプローブを使用することにより、例えば、腫瘍新生物もしくは過形成性疾患（例えば、望まない細胞増殖など）または組織の異常分化などとして現れるアレルの突然変異の予測および治療評価の両方を行うことができる。本明細書に記載しているように、イムノアッセイと共に使用した場合、オリゴヌクレオチドプローブは、デルタ３タンパク質の発現（またはそれらの欠除）が関連しているいくらかの異常を含む進行性の疾患に対して分子に基づく判断を下す助けとなる。例えば、コード配列内の突然変異に応じて、ポリペプチド合成の多様性に差異を生じる。
本発明の範ちゅうには、デルタ３生物活性の異常が原因である、もしくは関与している、ならびに／またはひとつもしくはそれ以上の特異的デルタ３アレルが関連している疾病または症状が進行する危険性があるか否かを判断するキットも含まれる。好ましい実施態様においては、このキットは、末梢神経病などの神経性疾患または疾病（例えば、ACCPNなど）の進行の危険性があるか否かを判断するために使用することができる。
4.3.3 アンチセンス、リボザイムおよび三重らせん技術
本発明をひとつの側面からみると、「アンチセンス」治療における単離された核酸の使用に関する。本明細書において使用している「アンチセンス」治療とは、被験者のひとつもしくはそれ以上のデルタ３タンパク質をコードしている細胞性mRNAおよび／またはゲノム性DNAと細胞性条件下において特異的にハイブリダイズ（例えば、結合）するオリゴヌクレオチド分子またはそれらの誘導体を投与またはインサイチュ（in situ）産生し、そのようなタンパク質の発現を（例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって）阻害することをさす。結合は、従来からの塩基対相補性に基づいて、または例えばDNA二重らせんへの結合の場合には、二重らせんの主要な空隙内における特異的相互作用を介して行われる。一般的に、「アンチセンス」治療とは当該分野において通常用いられる技術の範囲であり、オリゴヌクレオチド配列に対する特異的結合に基づく任意の治療を含む。
本発明のアンチセンス構築体（コンストラクト）は、例えば、発現プラスミドとして輸送することができる。このプラスミドは、細胞内において転写した場合に、デルタ３タンパク質をコードしている細胞性mRNAの特異的部分に対しては少なくとも相補的であるRNAを産生する。別の態様では、アンチセンス構築体は、半ビボ（ex vivo）において産生され、また、細胞内に導入した場合には、mRNAおよび／またはデルタ３遺伝子のゲノム性配列とハイブリダイズすることによって発現阻害を引き起こすオリゴヌクレオチドプローブである。そのようなオリゴヌクレオチドプローブは、内因性のヌクレアーゼ（例えば、エクソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼなど）に抵抗性であり、従ってインビボ（in vivo）において安定な変形オリゴヌクレオチドであることが好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いられる核酸分子の例としては、ホスホルアミデートホスホルチオエート、およびDNAのメチルホスホネートアナログ（米国特許第5,176,996号、5,264,564号、および5,256,775号も参照のこと）などがある。さらに、アンチセンス治療において有用なオリゴマーを構築する一般的な手法に関しては、例えば、ヴァン・デル・クロル（Van der Krol）ら、(1988) Biotechniques 6: 958-976；およびステイン（Stein）ら、(1988) Cancer Res 48: 2659-2668によって記述されている。アンチセンスDNAに関しては、翻訳開始部位、例えば、デルタ３ヌクレオチド配列の−10番〜＋10番の領域の間などに由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。特に好ましいアンチセンス分子を以下に示す：

5’TGCCGCCATCCCTCGGGGCGT 3’(配列番号16)
（配列番号１のヌクレオチド番号326番〜346番に対応）
5’GGACGCTGCCGCCATCCCCT 3’(配列番号17)
（配列番号１のヌクレオチド番号333番〜352番に対応）
5’GGACGCTGCCGCCATCCCCTCGGGGCGT3’(配列番号18)
（配列番号１のヌクレオチド番号326番〜352番に対応）

アンチセンス法には、デルタ３のmRNAに相補的なオリゴヌクレオチド（DNAまたはRNAのいずれも）の設計が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドはデルタ３のmRNA転写体と結合し、翻訳を阻止する。完全に相補的であることが好ましいが、必須ではない。本明細書において使用している、RNAのある部分に対して配列が「相補的である」とは、そのRNAとハイブリダイズするのに十分な相補性を有し、安定な二本鎖を形成する配列をさしており、二重らせんアンチセンス核酸の場合には、二本鎖DNAのうちの一本を調べることができ、または、三本鎖の形成をアッセイすることができる。ハイブリダイズ能力は、相補性の度合いおよびアンチセンス核酸の長さの両方によって定まる。一般的には、ハイブリダイズする核酸が長くなればなるほどRNAにおける塩基のミスマッチは増えるが、安定な二本鎖（場合によっては三本鎖）を形成する。当業者であれば、ハイブリダイズしたコンプレックスの融点を測定するという標準的な方法によって許容できるミスマッチの割合を確認することができる。
メッセージの５’末端（例えば、５’非翻訳配列までおよびＡＵＧ開始コドンを含むものなど）に相補的なオリゴヌクレオチドが翻訳の阻害に最も有効に作用する。しかしながら、最近、mRNAの３’非翻訳配列に相補的な配列もまたmRNAの翻訳の阻害に有効であることが示されている（ワグナー（Wagner）, R. Nature 372: 333）。故に、デルタ３遺伝子の非翻訳、非コード領域の５’末端または３’末端のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドをアンチセンス法に使用して外来性のデルタ３ mRNAの翻訳を阻害することができる。mRNAの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補体を含んでいなければならない。mRNAのコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドはそれほど有効な翻訳阻害剤ではないが、本発明に従って使用することができる。デルタ３ mRNAの５’末端、３’末端、またはコード領域のいずれかにハイブリダイズするように設計するには、アンチセンス核酸の長さが少なくとも６ヌクレオチドとなるようにし、好ましくはオリゴヌクレオチドの長さの範囲は６〜50である。特定の実施態様においては、オリゴヌクレオチドは少なくとも10、少なくとも17、少なくとも25、または少なくとも50である。
標的配列の選択とは無関係に、最初にアンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロ（in vitro）試験を行い、遺伝子の発現を阻害する能力を測定することが好ましい。これらの試験を対照として、アンチセンス遺伝子阻害とオリゴヌクレオチドの非特異的生物学的効果との区別をすることが好ましい。また、これらの試験について、標的RNAまたはタンパク質のレベルを内部標準RNAまたはタンパク質のレベルと比較することが好ましい。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて得られた結果を対照オリゴヌクレオチドを用いていられた結果と比較することも考えられる。対照オリゴヌクレオチドは試験オリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さであることが好ましく、オリゴヌクレオチドを構成しているヌクレオチド配列は、標的配列に対する特異的ハイブリダイゼーションを阻害しない程度にアンチセンス配列とは異なっていることが好ましい。
オリゴヌクレオチドとしては、DNAもしくはRNA、またはそれらのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは変形を用いることができ、一本鎖または二本鎖である。オリゴヌクレオチドは、例えば、分子の安定性の向上、ハイブリダイゼーションの向上などの目的で塩基部位、糖部位、またはリン酸基本骨格を変形することができる。オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、インビボ（in vivo）において宿主細胞のレセプターを標的とするためなど）または細胞膜透過輸送を促進する物質（例えば、レシンガー（Letsinger）ら、1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6553-6556；レマイター（Lemaitre）ら、1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 648-652；PCT公報WO88/09810、1988年12月15日発行などを参照）もしくは脳血管関門の透過輸送を促進する物質（例えば、PCT公報WO89/10134、1988年４月25日発行などを参照）、ハイブリダイゼーション起因性解裂剤（例えば、クロル（Krol）ら、1988, Bio Techniques 6: 958-976などを参照）、もしくはインターカレート剤（ゾン（Zon）、1988, Pharm. Res. 5:539-549などを参照）などのような追加基を含んでいることがある。この目的のために、オリゴヌクレオチドと他の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション起因性の交差結合剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション起因性解裂剤などとのコンジュゲートを形成する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、次の群から選択される少なくともひとつの変形塩基部位を有している：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキシン、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（acp3）w、および２，６−ジアミノプリンが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、次の群から選択される少なくともひとつの変形糖部位も有する：アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースなどが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
さらに別の実施態様においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくともひとつの変形リン酸骨格を有する：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステルおよびホルムアセタール、またはそれらのアナログが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
また別の実施態様においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドはα−アノメリックオリゴヌクレオチドである。αアノメリックオリゴヌクレオチドは、相補的RNAと特異的な二重らせんハイブリッドを形成し、これは、通常のβ−ユニットとは対照的に、螺旋が互いに平行になっている（ガウティエ（Gautier）ら、1987, Nucl. Acids Res. 15: 6625-6641）。このオリゴヌクレオチドは、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（イノウエ（Inoue）ら、1987, Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148）またはRNA−DNAアナログのキメラ（イノウエ（Inoue）ら、1987, FEBS Lett. 215: 327-330）である。
本発明のオリゴヌクレオチドは、当該分野において既知の標準的な方法、例えば、自動DNA合成装置（バイオサーチ（Biosearch）社、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社などから購入可能）の使用などによって合成することができる。具体的には、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはステイン（Stein）らの方法（1988, Nucl. Acids Res. 16: 3209）によって合成することができ、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、多孔度を調整したガラス支持体を用いることによって調製することができる（サリン（Sarin）ら、1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 7448-7451）。
コード領域の配列に相補的なアンチセンス核酸配列を使用するが、これらが転写された非翻訳領域に相補的であることが好ましい。翻訳開始部位にオーバーラップしたアンチセンス核酸がなお好ましい。例えば、以下に示すアンチセンスオリゴヌクレオチドを本発明に従って用いることができる：

5’TCAATCTGGCTCTGTTCGCG 3’（配列番号19）
（配列番号１のヌクレオチド番号284番〜303番に対応）
5’CGCTCTCTCCACCCGCGGGCCCTCAA 3’（配列番号20）
（配列番号1のヌクレオチド番号300番〜325番に対応）

アンチセンス分子は、インビボ（in vivo）でデルタ３を発現する細胞に輸送されなければならない。アンチセンスDNAまたはRNAを細胞に輸送するための多くの方法が開発されている；例えば、アンチセンス分子を直接組織部位に注入する、または所望する細胞を標的とするように設計された変形アンチセンス分子（例えば、特異的にレセプターに結合するペプチドもしくは抗体、または標的細胞表面において発現される抗原を連結したアンチセンスなど）を全身投与することなどがある。
しかしながら、外来性mRNAの翻訳を抑制するのに十分な細胞内アンチセンス濃度に到達させることはしばしば困難である。従って、好ましい方法としては、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なpol IIIまたはpol IIプロモーターの制御下におかれている組換えDNA構築体を使用することである。そのような構築体を用いて患者の標的細胞内にトランスフェクトすることにより、外因性のデルタ３転写体と相補的な塩基対を形成する一本鎖RNAの十分量の転写が得られ、これによって、デルタ３ mRNAの翻訳を阻止することになる。例えば、ベクターが細胞によって取り込まれ、アンチセンスRNAの転写に作用するように、インビボ（in vivo）においてベクターを導入することができる。そのようなベクターは、転写されて所望するアンチセンスRNAを産生している限り、エピソームとして存在し、または染色体に組み込まれている。そのようなベクターは、当該分野において標準的な組換えDNA操作方法によって構築することができる。ベクターは、プラスミド、ウイルス、またはその他当該分野において既知のものであって、哺乳類細胞内における複製および発現に使用されるものを用いることができる。アンチセンスRNAをコードしている配列の発現は、哺乳類、好ましくはヒト細胞内において作用する当該分野において既知の任意のプロモーターによって行うことができる。そのようなプロモーターは誘導性または構成性である。そのようなプロモーターとしては次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：SV40初期プロモーター領域（ベルノイスト（Bernoist）およびシャンボン（Chambon）、1981, Nature 290: 304-310）、ラウス家鶏肉腫（Rous Ssarcoma）ウイルスの長い３’末端反復配列を含むプロモーター（ヤマモト（Yamamoto）ら、1980, Cell 22: 787-797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（ワグナー（Wagner）ら、1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1441-1445）、メタロチオネイン遺伝子の制御性配列（ブリンスター（Brinster）ら、1982, Nature 296: 39-42）など。
任意の型のプラスミド、コスミド、YACまたはウイルス性ベクターを用いて組織部位（例えば、脈絡叢または視床下部など）に直接導入することができる組換えDNA構築体を調製することができる。別の方法としては、所望する組織（たとえば、脳に対してはヘルペスウイルスベクターを用いることができる）に選択的に感染するウイルス性のベクターを用いることができ、この場合には、投与は別の経路（例えば、全身など）によって行うことができる。
同様に、本発明のアンチセンス構築体は、デルタ３タンパク質の内のひとつの正常な生物学的活性に拮抗することによって、インビボ（in vivo）および半ビボ（ex vivo）での組織培養において細胞活性の調節に使用することができる。
さらに、アンチセンス技術（例えば、アンチセンス分子の微量注入（マイクロインジェクション）、またはデルタ３ mRNAもしくは遺伝子配列に関して転写体がアンチセンスであるようなプラスミドのトランスフェクションなど）を用いて、発生段階におけるデルタ３の役割、および生体の組織におけるデルタ３の正常細胞機能を探索することができる。そのような技術は細胞培養において使用することができるが、以下に記載しているようなトランスジェニック動物の作出にも使用することができる。
触媒的にデルタ３ mRNA転写体を解裂するように設計されたリボザイム分子を用いて、mRNAの翻訳およびデルタ３の発現を阻止することもできる（例えば、PCT公報WO94/11364、1990年10月４日発行；サーヴァー（Sarver）ら、1990, Science 247: 1222-1225を参照のこと）。リボザイムとは、RNAの特異的解裂を触媒することができる酵素様RNA分子である。リボザイムの作用メカニズムとしては、相補的な標的RNAに対してリボザイム分子が配列特異的ハイブリダイゼーションをし、続いてエンドヌクレアーゼ様解裂を起こすことが含まれる。リボザイム分子の組成には、標的遺伝子mRNAに相補的なひとつもしくはそれ以上の配列を含んでいることが必要であり、mRNAの解裂に関与する既知の触媒様配列を含んでいることが必要である。このような配列としては、米国特許第5,093,246号を参照とし、本明細書においてその全体を取り入れておく。本発明の範ちゅうには、デルタ３タンパク質をコードしているRNA配列のエンドヌクレアーゼ様解裂を特異的かつ効率的に触媒する人工ハンマーヘッド型リボザイムなどがある。
任意のRNA標的候補内の特異的リボザイム解裂部位は、ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣといった配列を含むリボザイム解裂部位に関して対象分子をスキャンすることによってまず確認する。いったん確認したら、解裂部位を含む標的遺伝子領域に対応する15〜20リボヌクレオチドから構成される短いRNA配列について、オリゴヌクレオチド配列を不適切なものとする可能性のある予測される構造的特徴（例えば、二次構造など）を評価する。候補配列の適合性は、リボヌクレアーゼ防御アッセイを用い、相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションを起こし得るかということを調べることによっても評価することができる。
部位特異的認識配列においてmRNAを解裂するリボザイムを用いてデルタ３ mRNAを破壊することもできるが、ハンマーヘッド型リボザイムを用いることが好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的mRNAと相補的塩基対を形成する側部領域（フランキング領域）によって指示される位置においてmRNAを解裂する。唯一の要件は、標的mRNAが５’−ＵＧ−３’の二塩基からなる配列を有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および産生は当該分野において既知であり、ハセロフ（Haseloff）およびジャーラック（Gerlach）によってより詳細に記載されている（1988, Nature, 334: 585-591）。ヒトデルタ３のcDNAのヌクレオチド配列内には、多数のハンマーヘッド型リボザイムの解裂部位が存在している可能性がある（図１）。好ましくは、解裂認識部位がデルタ３ mRNAの５’末端付近に存在するようにリボザイムを処理する；これは、効率を上げ、細胞内における非機能性mRNA転写体の蓄積を最小限に抑えるためである。
本発明のリボザイムには、テトラヒメナ・サーモフィラ（Tetrahymena Thermophila）の体内に天然に存在するような（IVSまたはL-19 IVS RNAとして知られている）RNAエンドリボヌクレアーゼ類（本明細書においては、以後「チェック型リボザイム（Cech-type ribozyme）」と称する）も含まれ、これらに関してトーマス・チェックとその共同研究者らによって詳細に記載されている（ザウ（Zaug）ら、1984, Science, 224: 574-578；ザウ（Zaug）およびチェック（Cech）、1986, Science, 231: 470-475；ザウ（Zaug）ら、1986, Nature, 324: 429-433；ユニヴァーシティ・パテント（University Patents）社による国際特許出願公報WO88/04300；ビーン（Been）およびチェック（Cech）、1986, Cell, 47: 207-216）。チェック型リボザイムは、８塩基対からなる活性部位を有し、これは、標的RNAにハイブリダイズし、その後標的RNAの解裂を起こす。本発明は、デルタ３内に存在する８塩基対からなる活性部位配列を標的とするチェック型リボザイムも包含している。
アンチセンス法の場合のように、リボザイムは変形オリゴヌクレオチドから構成されているものを用い（例えば、安定性、標的性などの向上のため）、インビボ（in vivo）においてデルタ３を発現する細胞（例えば、視床下部および／または脈絡叢など）に輸送される必要がある。好ましい輸送方法としては、強力な構成性pol IIIおよびpol IIプロモーターの制御下にあるリボゾームを「コードしている」DNA構築体を用いることが挙げられ、これによってトランスフェクトされた細胞は十分量のリボザイムを産生し、外因性のデルタ３メッセージを破壊し、翻訳を阻害する。リボザイムは、アンチセンス分子とは異なり触媒性であるので、効果発現に必要な細胞内濃度は低くてよい。
外因性のデルタ３遺伝子の発現は、標的化した相同性組換え体を用いてデルタ３遺伝子またはそのプロモーターを不活化または「ノックアウト」することによっても減少させることができる（例えば、スミシーズ（Sumithies）ら、1985, Nature, 317: 230-234；トーマス（Thomas）およびカペッチ（Capecchi）、1987, Cell, 51: 503-512；トンプソン（Thompson）ら、1989, Cell, 5: 313-321などを参照のこと。これら各々の全体を参照として本明細書中に取り入れておく）。例えば、外因性のデルタ３遺伝子（デルタ３遺伝子のコード領域または制御領域のいずれか）に相同なDNAが隣に連結している突然変異または非機能性のデルタ３（または全く無関連のDNA）を用い、選択マーカーおよび／または負の選択マーカーを伴う／または伴わない状態で、インビボ（in vivo）においてデルタ３を発現する細胞にトランスフェクトすることができる。標的化した相同な組換え体を介してDNA構築体を挿入することにより、デルタ３遺伝子を不活化することができる。そのような方法は特に農業分野に適しており、変形を行ったES（胚性幹）細胞を使用することによってデルタ３不活性な動物の子孫を得ることができる（例えば、トーマス（Thomas）およびカペッチ（Capecchi）、トンプソン（Thompson）、1989、同上を参照）。しかしながら、この方法は、適切なウイルスベクター（例えば、ヘルペスウイルスベクターなど）を用い、組換えDNA構築体を直接投与する、またはインビボ（in vivo）における必要部位に標的投与することによって、ヒトにおける使用に適合させることができる。
別の方法としては、デルタ３遺伝子の調節領域（すなわち、デルタ３プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的な標的化リボヌクレオチド配列を用い、体内の標的細胞内におけるデルタ３遺伝子の転写を阻止する三重らせん構造を形成することによって、外因性のデルタ３遺伝子の発現を減少させることができる（一般的なものとしては、ヘレン（Helen）, C.、1991, Anticancer Drug Res., 6(6): 569-84；ヘレン（Helen）,C.ら、1992, Ann. N.Y. Acad. Sci., 660: 27-36；マーハー（Maher）, L. J.、1992, Bioassays 14(12): 807-15を参照）。
転写阻害のための三重らせん形成に使用する核酸分子は、一本鎖およびデオキシリボヌクレオチドから構成されているものが好ましい。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、フーグスティーン（Hoogsteen）型塩基対則に則って三重らせん形成を促進するものでなければならず、この場合、一般的に、プリンまたはピリミジンが適切な長さを有して、二重らせんのうちの一本鎖上に存在していることが必要である。ヌクレオチド配列はピリミジン塩基からなり、これによって三重らせんを形成する３本の関連する鎖にＴＡＴおよびＣＧＣのトリプレット（三つ組コドン）が生じている。ピリミジンに富む分子は、二重らせんのうちの一本鎖のプリンに富む領域に対して、その鎖に平行方向な相補的な塩基を提供する。さらに核酸分子は、プリンに富んだ、例えば、Ｇ残基が伸長したものから選択することができる。これらの分子は、ＧＣ対に富むDNA二本鎖と三重らせんを形成し、そのプリン残基の大部分は標的二重らせんの一本鎖に存在しており、その結果、三重らせん内の三本鎖にＣＧＣトリプレットが生じる。
別の方法としては、三重らせん形成を標的とする可能性のある配列は、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を作出することによって増やすことができる。スイッチバック分子は、５’→３’方向と３’→５’方向に交互に合成され、これによって、はじめに塩基対を形成している二本鎖のうちの一本と次の一本とが塩基対を形成し、二重らせんの一本鎖に存在するプリンまたはピリミジンの適切な伸長が不要になる。
本発明のアンチセンスRNA、DNA、リボザイムおよび三重らせん分子は、DNAおよびRNA分子の合成に関する当該分野において既知の任意の方法を用いて調製することができる。これらには、例えば、固相ホスホルアミデート化学合成などのような当該分野において既知のオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドの化学合成技術が含まれる。別の方法としては、アンチセンスRNA分子をコードしているDNA配列のインビトロ（in vitro）およびインビボ（in vivo）での転写に因ってRNA分子を作出することができる。そのようなDNA配列には、適切なRNAポリメラーゼプロモーター（例えば、T7またはSP6ポリメラーゼプロモーターなど）を含む広範なベクターが含まれる。別の方法としては、使用するプロモーターに応じてアンチセンスRNAを構成的にまたは誘導的に合成するアンチセンスcDNA構築体を安定的に細胞系に導入することができる。
さらに、細胞内安定性を増し、半減期を延ばす手段として、様々な既知の変形を核酸分子に導入することができる。可能な変形としては次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：分子の５’および／または３’末端にリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの側部配列（フランキング配列）を付加する、あるいは、オリゴデオキシリボヌクレオチド骨格内部において、ホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチルを使用する。
4.4 本発明のポリペプチド
本発明によれば、他の細胞性タンパク質、とりわけ、通常はデルタ３ポリペプチドと結合している他のシグナル伝達因子および／または転写因子から単離された、あるいは実質的にそのようなタンパク質を含まないデルタ３ポリペプチドの入手が可能である。「他の細胞性タンパク質（本明細書においては、「混入タンパク質」とも記載している）を実質的に含まない」または「実質的に純粋または精製された調製物」とは、混入タンパク質の量が乾燥重量で約20％以下、好ましくは混入タンパク質の量が乾燥重量で約５％以下であるデルタ３ポリペプチドの調製物を含むものとして定義される。はじめに、本明細書に記載しているようにクローニングされた遺伝子を用いて精製した調製物と同様に、このポリペプチドを機能的な形態に製することができる。「精製された」とは、ペプチド配列またはDNA配列またはRNA配列に関して、対象となる分子中に他のタンパク質などの他の生物学的巨大分子（マクロ分子）を実質的に含まないことを意味している。本明細書で用いている「精製された」という語は、存在する生物学的マクロ分子の量が、好ましくは乾燥重量で少なくとも80％、より好ましくは95〜99重量％の範囲、最も好ましくは少なくとも99.8重量％であることを意味している（しかし、水、緩衝液、および他の低分子、特に分子量が約5000以下の分子は存在している可能性がある）。本明細書で使用している「純粋」とは、好ましくは上述の「精製された」と同様の数値的制限を有する。「単離された」および「精製された」とは、天然の状態における天然の材料を包含するものでもアクリルアミドゲルなどによって成分に分離された天然の材料を包含するものでもなく、純粋な（例えば、混入タンパク質、または変性剤およびポリマー（例えば、アクリルアミドまたはアガロースなど）などのようなクロマトグラフィー試薬などを含まない）物質または溶液として得られるものでもない。好ましい実施態様においては、精製されたデルタ３調製物は、通常デルタ３を産生する動物由来の如何なる混入タンパク質をも含まず、これは、ヒト以外の細胞内において、組換え体に例えば、ヒトデルタ３タンパク質などを発現させることによって行うことができる。
タンパク質の全長、あるいはひとつもしくはそれ以上の特定のモチーフおよび／もしくはドメインに対応するまたは任意の大きさ（例えば、アミノ酸長が少なくとも約５、10、25、50、75、100、125、150など）の断片（フラグメント）は本発明の範ちゅうに含まれる。本発明は、本発明の核酸について記載している上述の章に記述している核酸によってコードされた全てのタンパク質を包含する。
例えば、単離されたデルタ３ポリペプチドは、配列番号2で表されるデルタ３ポリペプチドに対応するアミノ酸配列の全てまたは一部を含む。デルタ３タンパク質の単離されたペプチド部分は、そのようなペプチドをコードしている核酸から構成される対応する断片から組換えによって産生されたペプチドをスクリーニングすることによって得ることができる。さらに、当該分野において既知である簡便なメリフィールド（Merrifield）固相f-Mocまたはt-Boc化学などの技術を用いて断片を化学的に合成することができる。具体的には、本発明のデルタ３ポリペプチドを断片に重なり（オーバーラップ）がないように所望する長さの断片に任意に分けることができ、または好ましくは、重なりを有する所望する長さの断片に分けることができる。組換えまたは化学合成によって断片を作出し、試験を行って、これらのペプチド断片が野生型（例えば、「真性の」）のデルタ３タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストのいずれとして機能することができるかを確認する。
別の面からみると、本発明はデルタ３タンパク質の組換え体に関する。好ましくは本発明による組換えポリペプチドは、天然のデルタ３タンパク質に加えて、配列番号2で表されるアミノ酸配列との相同性が少なくとも約95％、より好ましくは少なくとも約92または94％、最も好ましくは少なくとも約95％、96％、97％、98％または99％である。ひとつの実施態様においては、本発明のデルタポリペプチドは、配列番号2で表されるアミノ酸配列とのアミノ酸配列全体としての相同性または一致性が少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、または少なくとも約99である。特に好ましい実施態様においては、デルタ３タンパク質は配列番号2で表されるアミノ酸配列を有する。別の特に好ましい実施態様においては、デルタ３タンパク質はデルタ３生物活性を有する。
本発明はさらに、哺乳類の器官由来の遺伝子によってコードされており、配列番号2で表されるデルタ３タンパク質に進化上関連のあるアミノ酸配列を有しているデルタ３ポリペプチドの内のひとつの組換え体に関する。そのようなデルタ３ポリペプチドは、後述の配列表に列挙している野生型（「真性の」）デルタ３タンパク質の生物活性の内の少なくともひとつに対するアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかの役割を果たすことができることが好ましい。ヒトデルタ３タンパク質のアミノ酸配列に関して「進化上関連がある」とは、天然に生じたアミノ酸配列を有するポリペプチド、および組み合わせ突然変異誘発などによるデルタポリペプチドの突然変異性変種の両方をさす。進化に由来する本発明のそのようなデルタ３ポリペプチドは、デルタ３生物活性を有し、また、配列番号2で表されるアミノ酸配列との相同性が少なくとも80％、より好ましくは少なくとも85％、最も好ましくは少なくとも90％である。特に好ましい実施態様においては、デルタ３タンパク質は配列番号2をコードしているアミノ酸を含む。
一般的には、本明細書においてデルタ３タンパク質の活性（例えば、「生物活性」など）を有すると称されているポリペプチドは、配列番号2に示されているデルタ３タンパク質のアミノ酸配列の全てもしくは一部に対応する（例えば、一致しているまたは実質的に一致している）アミノ酸配列を含み、ならびに天然に存在するデルタ３タンパク質の生物／化学活性の全てもしくは一部を模擬もしくはアンタゴナイズするポリペプチドと定義される。好ましい実施態様においては、本発明のデルタ３タンパク質は特にノッチポリペプチドと特異的に相互作用する。
本発明は種々の形態のデルタ３タンパク質を提供し、中でも、本発明の核酸に関連する4.3項に記載されている全てのデルタ３タンパク質を含む。
本発明はさらに、そのようなデルタ３ポリペプチドを産生する方法に関する。例えば、目的とするポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の発現を指示する核酸ベクターをトランスフェクトした宿主細胞は、適切な条件下において培養し、ペプチドの発現をさせることができる。細胞を回収し、溶解してタンパク質を単離する。細胞培養には、宿主細胞、培地および他の副生成物を含む。細胞培養に適した培地は当該分野において既知である。タンパク質生成に関する当該分野において既知の技術を用い、組換えデルタ３ポリペプチドは、細胞培養培地、宿主細胞、またはそれらの両方から単離することができる。そのような技術としては、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、限外ろ過、電気泳動、およびそのようなペプチドに対して特異的な抗体を用いたイムノアフィニティー精製が挙げられる。好ましい実施態様においては、組換えデルタ３ポリペプチドは、精製に役立つドメインを含む融合タンパク質、例えば、GST融合タンパク質またはポリ（ヒスチジン（His））融合タンパク質である。
さらに、特殊な状況下においては、天然存在型のタンパク質の生物活性の一部のみを促進または阻害するために、機能がデルタ３のアゴニスト（模擬）、またはデルタ３のアンタゴニストのいずれかひとつに限定されているデルタ３ポリペプチドの内のひとつの変種を作出することが有効であると考えられる。このようにして、限定された機能を有する変種に処置を施すことによって特定の生物学的効果を誘起することができ、天然に生じる型のデルタ３タンパク質の生物学的活性の全てを発生させるようなアゴニストまたはアンタゴニストを用いた処置に関連した副作用はほとんど生じない。
目的のデルタ３タンパク質の各々についての変種および／または突然変異体は、個別の部位での突然変異（点突然変異）または切断（トランケーション）などのような突然変異誘発によって作出することができる。例えば、突然変異は、もとになっているデルタ３ポリペプチドと生物学的活性が実質的に同一である、または単に一部を保持しているホモログに生じやすい。これとは別に、アンタゴニスト型のタンパク質は、例えば、デルタ３タンパク質を含むデルタ３カスケードの上流または下流の化合物に競合結合することによるなどして、天然型のタンパク質の機能を阻害できるようにすることが可能である。さらに、構造的に活性なアゴニスト型のタンパク質を作出することもできる。
本発明の組換えデルタ３ポリペプチドは、真性のデルタ３タンパク質のホモログ、例えば、遍在性またはタンパク質に関連する酵素標的を変更する突然変異体などによるタンパク質分解性の解裂に抵抗性であるようなタンパク質なども含む。
デルタ３ポリペプチドを化学的に変形して、他の化学的部位、例えば、グリコシル基、脂質、リン酸塩、アセチル基などと共有結合または凝集コンジュゲートを形成することによってデルタ３誘導体を作出することもできる。デルタ３タンパク質の共有結合誘導体は、タンパク質のアミノ酸側鎖またはポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端の官能基に化学的部位を連結することによって調製することができる。
デルタ３ポリペプチドの構造の変形は、治療または予防効果、安定性（例えば、半ビボ（ex vivo）での貯蔵保存性およびインビボ（in vivo）でのタンパク質分解耐性など）、または翻訳後の変形（例えば、タンパク質のリン酸化パターンの変更など）といった目的で行うことができる。天然に存在する型のタンパク質の活性の少なくともひとつを保持している、またはそれらの特定のアンタゴニストを産生するように設計されている場合には、そのような変形ペプチドは、本明細書に詳細に記載しているデルタ３ポリペプチドと機能的に等価であると考えられる。そのような変形ペプチドは例えば、アミノ酸の置換、欠失、または付加によって産生することができる。
例えば、ロイシンからイソロイシンまたはバリン、アスパラギン酸からグルタミン酸、スレオニンからセリンへの単独置換、またはあるアミノ酸から構造的に関連性のあるアミノ酸への同様の置換（すなわち、アイソスター的突然変異体および／または等電性突然変異体）は、得られた分子の生物学的活性に大きな影響を与えないと考えられる。保存性の置換は、側鎖において関連のあるアミノ酸族内部で行われる。遺伝子にコードされているアミノ酸は４つの属に分けられる：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非電荷極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。同様に、全てのアミノ酸は次のように分けることができる：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）脂肪族＝グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、ここで、セリンおよびスレオニンはさらに水酸基を有する脂肪族に分けられる；（４）芳香族＝フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン；（５）アミド＝アスパラギン、グルタミン；および（６）含硫＝システインおよびメチオニン（例えば、『生化学（Biochemistry）第２版』（L. ストリヤー（Stryer）編、）、WH フリーマン（Freeman）社、1981年などを参照）。ペプチドを構成しているアミノ酸配列の変化によって機能性のデルタ３ホモログが得られたか否かは、野生型のタンパク質と同様の条件下において変種ペプチドが細胞内で応答する能力を測定する、またはそのような応答を競合阻害することによって容易に判断することができる。１個以上の置換が起こっているポリペプチドも同様に調べることができる。
本発明はさらに、目的のデルタ３タンパク質の一連の組み合わせ突然変異体および切断（トランケーション）突然変異体を作出する方法に関し、これは特に機能性の変種配列（例えば、ホモログなど）の確認に有用である。そのような組み合わせライブラリ−をスクリーニングする目的は、例えば、アゴニストもしくはアンタゴニストとして作用することができる、またはこれとは別に、新規な活性を有している新規なデルタ３のホモログを作出することである。
ひとつの実施態様においては、デルタ３の変種の多様なライブラリーは、核酸レベルの組み合わせ突然変異によって作出され、多様な遺伝子ライブラリーによってコードされている。例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、酵素を利用して遺伝子配列内に結合し、一連の縮退したデルタ３配列がそれぞれのポリペプチドを発現し、また別の方法として、一連のデルタ３配列を含む一連の大きな融合タンパク質（例えば、ファージによる展示タンパク質（ディスプレイタンパク質）など）を発現できるようにする。
縮退したオリゴヌクレオチド配列からデルタ３のホモログまたは変種のそのようなライブラリーを作成するにあたっては多くの方法がある。自動DNA合成機を用いて縮退遺伝子配列の化学的合成を行い、次にこの合成遺伝子を適切な発現ベクターに結合する。遺伝子の縮退したセットを用いる目的は、ひとつの混合物内で、所望するデルタ３配列のセットをコードしている配列の全てを得るためである。縮退オリゴヌクレオチドの合成は当該分野において既知である（例えば、ナラン（Narang）, SA、(1983) Tetrahedron 39: 3；イタクラ（Itakura）ら、(1981) 『組換えDNA、第３回クリーブランドシンポジウム要旨集、高分子（Recombinant DNA, Proc 3rd Cleveland Sympos. Maclomolecules）』、AG ウォルトン（Walton）編、アムステルダム：エリスヴィール（Elsevier） ppg. 273-289；イタクラ（Itakura）ら、(1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323；イタクラ（Itakura）ら、(1984) Science 198: 1056；イケ（Ike）ら、(1983) Nucleic Acid Res 11:477を参照）。そのような技術は他のタンパク質の方向性をもった発展に用いられている（例えば、スコット（Scott）ら、(1990) Science 249: 386-390；ロバーツ（Roberts）ら、(1992) PNAS 89: 2429-2433；デヴリン（Devlin）ら、(1990) Science 249: 404-406；クゥイルラ（Cwirla）ら、(1990) PNAS 87: 6378-6382；また、米国特許第5,223,409号、5,198,346号および5,096,815号を参照）。
同様に、スクリーニングおよびそれに続く生物活性断片の選択のためにデルタ３断片の多様な集団を作出する目的で、デルタ３クローンのコード配列断片（フラグメント）のライブラリーを作出することができる。そのようなライブラリーを作出するための化学合成を含む様々な技術が当該分野において知られている。ひとつの実施態様においては、（ｉ）ニックが１分子あたり約１回しか起こらない条件下において、デルタ３をコードしている配列の２本鎖PCR断片をヌクレアーゼで処理し；（ｉｉ）２本鎖DNAを変性し；（ｉｉｉ）DNAをもとの状態に戻して２本鎖DNAを形成し（このとき、このDNAはいろいろなニック産物に由来するセンス／アンチセンス対を含む）；（ｉｖ）S1ヌクレアーゼで処理することにより、再形成した２本鎖から１本鎖のものを除去し；（ｖ）得られた断片のライブラリーを発現ベクターに連結する、ことによってコード配列断片（フラグメント）のライブラリーを得ることができる。この例示方法によれば、Ｎ末端、Ｃ末端および様々な大きさの内部断片をコードしている発現ライブラリーを得ることができる。
点突然変異または切断（トランケーション）によって作出された組み合わせライブラリーからの遺伝子産物をスクリーニングし、また、ある種の特性を有する遺伝子産物を得るためのcDNAライブラリーをスクリーニングするための広範な技術が当該分野において既知である。そのような技術は一般的に、デルタ３ホモログの組み合わせ突然変異によって作出された遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適している。大きな遺伝子ライブラリーのスクリーニングに最も広範に使用されている技術は、一般的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングし、得られたベクターのライブラリーを適切な細胞に形質転換し、所望する活性が比較的容易に検出できるような条件下において組み合わせ遺伝子を発現させ、発現産物が検出された遺伝子をコードしているベクターを単離する、各段階を含む。以下に記載しているそれぞれの例示アッセイは、組み合わせ突然変異誘発技術によって作出された多数の変性デルタ３配列をスクリーニングするために必要な大量分析が可能である。組み合わせ突然変異誘発は、突然変異タンパク質の非常に大きなライブラリー、例えば、10２６分子程度のものを作出する可能性がある。この大きさの組み合わせライブラリーは、大量スクリーニングアッセイをもってしても技術的に困難である。この問題を克服するため、最近、再発アンサンブル突然変異誘発（recrusive ensemble mutagenesis: REM）という新しい技術が開発され、これは、ランダムライブラリー内の非機能性タンパク質の大部分を回避し、機能性タンパク質の発生頻度を単に上昇することによって、配列間隔の有効なサンプリングを行うのに必要とされる複雑性が緩和される。REMは、適切な選択法またはスクリーニング法を用いた場合には、ライブラリー内の機能性突然変異体の発生頻度が増すアルゴリズムである（アーキン（Arkin）およびユールヴァン（Yourvan）、1992, PNAS USA 89: 7811-7815；ユールヴァン（Yourvan）ら、『自然界の類似問題の解法（Parallel Problem Solving from Nature）』、マナー（Maenner）およびマンデリック（Manderick）編、エリスヴィール（Elsevier）出版社、アムステルダム、pp401-410；デルグレーヴ（Delgrave）ら、1993, Protein Engineering 6(3): 327-331）。
本発明はまた、デルタ３タンパク質を削減して、例えば、ペプチド作用物質または非ペプチド作用物質などの疑態物質（ミメチック）を作出することを提供する。このような物質は、本発明のデルタ３タンパク質へ結合することができ、および／または本発明のデルタ３ポリペプチドとデルタ／ノッチシグナル経路の上流または下流の構成物質（例えば、結合タンパク質または相互作用物質など）との結合を解裂することができる。従って、上述しているような突然変異誘発技術は、タンパク質−タンパク質相互作用に関与するデルタ３タンパク質の決定因子のマッピングにも有用であり、そのような相互作用には例えば、目的のデルタ３ポリペプチドの上流で機能するタンパク質（その活性の活性化因子および抑制因子の両方を含む）への結合、またはデルタポリペプチドの下流で機能するタンパク質もしくは核酸への結合などがあるが、いずれも例えば、ノッチなどによって正または負の制御を受けている。具体的には、分子（例えば、ノッチ遺伝子産物またはデルタ３遺伝子の上流もしくは下流のその他の構成成分など）の認識に必要なデルタ３ポリペプチドの必須残基を決定することができ、その部位において本来のデルタ３タンパク質の結合を競合的に阻害するデルタ由来のペプチドミメチックの産生に使用することができる。例えば、突然変異誘発をスキャニングして、他の細胞外タンパク質、ペプチドミメチック化合物を含む目的のデルタ３タンパク質の各々のアミノ酸残基をマッピングすることにより、機能発揮するまたは相互作用する、デルタ３タンパク質のこれらの残基のミメチックを作出することができる。そのようなミメチックはデルタ３タンパク質の正常な機能を干渉するために使用される。例えば、そのような残基の非加水分解性ペプチドアナログは、ベンゾジアゼピン（例えば、フライディンガー（Freidinger）ら、『ペプチド：化学および生物学（Peptides: Chemistry and Biology）』、G.R.マーシャル（Marshall）編、ESCOM出版社：オランダ・ライデン(1988)などを参照）、アゼピン（例えば、ハフマン（Huffman）ら、『ペプチド：化学および生物学（Peptides: Chemistry and Biology）』、G.R.マーシャル（Marshall）編、ESCOM出版社：オランダ・ライデン(1988)などを参照）、置換γラクタム環類（ガーヴェイ（Garvey）ら、『ペプチド：化学および生物学（Peptides: Chemistry and Biology）』、G.R.マーシャル（Marshall）編、ESCOM出版社：オランダ・ライデン（1988）などを参照）、ケトメチレンプソイドペプチド類（エヴェンソン（Ewenson）ら、(1986) J Med Chem 29: 295；およびエヴェンソン（Ewenson）ら、『ペプチド：構造および機能（Peptides: Structure and Function）』（第９回アメリカペプチドシンポジウム（9th American Peptide Symposium）要旨集）、ピアス・ケミカル（Pierce Chemical）社、イリノイ州ロックランド（1985）などを参照）β−ターン ジペプチドコア類（ナガイ（Nagai）ら、(1985) Tetrahedron Lett 26: 647；およびサトウ（Sato）ら、(1986) J Chem Soc Perkin Trans 1: 1231）、およびβ−アミノアルコール類（ゴードン（Gordon）ら、(1985) Biochem Biophys Res Commun 126: 419；およびダン（Dann）ら、(1986) Biochem Biophys Res Commun 124: 71）を用いて作出することができる。
4.4.1 組換えデルタ３ポリペプチドを発現する細胞
本発明はまた、トランスフェクションによって目的のデルタ３ポリペプチドの組換え型を発現する宿主細胞に関する。この宿主細胞は原核細胞であっても真核細胞であってもよい。かくして、デルタ３タンパク質のクローニングに由来し、全長タンパク質の全てまたは選択された一部をコードしているヌクレオチド配列を用いて、微生物または真核細胞での工程を経てデルタ３ポリペプチドの組換え型を産生することができる。発現ベクターのような遺伝子構築体内にポリヌクレオチド配列を連結し、真核細胞（酵母、鳥類、昆虫または哺乳類）または原核細胞（バクテリア）のいずれかの宿主に形質転換またはトランスフェクトする方法は、その他の既知のタンパク質（例えば、MAPキナーゼ、pg53、WT1、PTPホスファターゼ類、SRCなど）の産生においても用いられる標準的な手法である。同様の手法またはそれらの変形を用いて、微生物による方法または本発明に従う組織培養工学によって組換えデルタ３ポリペプチドを調製することができる。
真核細胞、原核細胞またはその両方のいずれにおける発現にも適したベクター内に、デルタ３タンパク質またはその一部をコードしている核酸を連結することによって組換えデルタ３遺伝子を産生することができる。目的のデルタ３ポリペプチドの組換え型産生のための発現ベクターは、プラスミドおよび他のベクターを含む。例えば、デルタ３ポリペプチドの発現に適したベクターは、次のような型のプラスミドを含む：pBR322由来のプラスミド、pEMBL由来のプラスミド、pEX由来のプラスミド、pBTac由来のプラスミドおよび大腸菌（E. coli）などの原核細胞内で発現するpUC由来のプラスミド。
酵母内で組換えタンパク質を発現するベクターは多数存在する。例えば、YEP24、YIP5、YEP51、pYES2およびYRP17がクローニングされており、ビール酵母菌（S.cerevisiae）内に遺伝子構築体を導入するのに有用な発現ビヒクル（vehicle）も存在する（例えば、ブローチ（Broach）ら、『遺伝子発現の実験操作（Experimental Manipulationof Gene Expression）』、M.イノウエ（Inoue）編、アカデミック・プレス（Academic Press）社、p.83などを参照、本明細書中に参考として取り入れておく）。これらのベクターは、pBR322 oriの存在下で大腸菌（E. coli）内において、および、酵母の２ミクロンのプラスミドの複製決定因子の存在下においてビール酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）内において複製することができる。さらに、アンピシリンなどの薬剤耐性マーカーを用いることができる。ひとつの実施例においては、配列番号1で表されるデルタ３遺伝子のサブクローニングによって作出された発現ベクターを用い、デルタ３ポリペプチドを組換えによって産生する。
好ましい哺乳類の発現ベクターは、バクテリア内においてベクターの増殖を促進するための原核細胞由来の配列と真核細胞内で発現する１個またはそれ以上の真核細胞由来の転写ユニットとの両方を有する。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pREVneo、pMSG、pSVT7、pko-neoおよびpHyg由来のベクターは、真核細胞のトランスフェクションに適した哺乳類の発現ベクターの例である。pBR322などのようなバクテリアのプラスミド由来の配列を用いてこれらのベクターのいくつかを変形し、原核細胞および真核細胞の両方において複製を行い薬剤耐性選択ができるようにする。別の方法としては、ウシパピローマウイルス（BPV-1）またはエプステイン・バー（Epstein-Barr）ウイルス（pHEBo、pREP由来およびp205）などのようなウイルスの誘導体を用いて真核細胞内においてタンパク質を一過性に発現することもできる。プラスミドの調製および宿主微生物の形質転換に用いられる種々の方法は当該分野において既知である。原核細胞および真核細胞の両方に適したその他の発現系、ならびに一般的な組換え手法については、『分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）第２版』、サンブルック（Sambrook）、フリッシュ（Fritsch）およびマニアティス（Maniatis）編、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）社（1989）、第16章および17章を参照。
いくつかの例においては、組換えデルタ３ポリペプチドはバキュロウイルス発現系を用いて発現することが望ましい。そのようなバキュロウイルス発現系の例としては、pVL由来のベクター（pVL1392、pVL1393およびpVL941など）、pAcUW由来のベクター（pAcUW1など）、およびpBlueBac由来のベクター（β−ガラクトースを含むpBlueBacIIIなど）が挙げられる。
Ｎ末端部分が欠けている、すなわち、シグナルペプチドを欠いた切断（トランケーション）突然変異体などのようなデルタ３タンパク質の一部のみを発現することが所望される場合には、発現が所望されている配列を含むオリゴヌクレオチド断片に開始コドン（ＡＴＧ）を加える必要がある。Ｎ末端に存在するメチオニンは、メチオニンアミノペプチダーゼ（MAP）という酵素を用いることによって酵素解裂することができることは、当該分野において既知である。MAPは大腸菌（E. coli）（ベン−バサー（Ben-Bassat）ら、(1987) J. Bacteriol. 169: 751-757）およびネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）からクローニングされており、その組換えタンパク質に対するインビトロ（in vitro）活性は明らかにされている（ミラー（Miller）ら、(1987) PNAS 84: 1718-1722）。故に、所望に応じて、インビボ（in vivo）においてはMAPを産生する宿主（例えば、大腸菌（E. coli）またはCM89またはビール酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）など）内でデルタ由来のポリペプチドを発現させることによって、あるいはインビトロ（in vitro）においては精製MAPを用いて（例えば、ミラー（Miller）らの方法（同上）など）、Ｎ末端のメチオニンを除去することができる。
その他の実施態様としては、以下に詳述しているトランスジェニック動物を用いて組換えタンパク質を産生することができる。
4.4.2 融合タンパク質および免疫原
別の実施態様においては、異なるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む融合遺伝子の一部として、ポリペプチドをコードしている配列を組み込むことができる。
好ましい実施態様においては、デルタ３ポリペプチドはデルタ３−Igポリペプチドである。デルタ３−Igポリペプチドは、デルタ３の全細胞外ドメイン、例えば、ヒトデルタ３またはその変種などを含むようにすることができる。例えば、デルタ３−Igポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸番号１番付近〜アミノ酸番号529番付近のアミノ酸配列を含むようにすることができる。その他の好ましいデルタ３−Igタンパク質はシグナルペプチドを含んでおらず、従って、配列番号2のアミノ酸番号１番付近〜アミノ酸番号17番付近を含まないことが好ましい。これとは別に、デルタ３−Ig融合タンパク質は、デルタ３タンパク質の細胞外ドメインの一部、またはデルタ３タンパク質の細胞外ドメインの一部の変種を含むようにすることができる。細胞外ドメインとして好ましい部分は、図２に示している少なくとも１個のモチーフを有する部分を含む。例えば、デルタ３−Ig融合タンパク質は少なくとも１個のEGF様リピートを有する。デルタ３−Ig融合タンパク質はさらに、DSLドメインを有する。さらにデルタ３−Ig融合タンパク質はシグナルペプチドも含む。デルタ３−Ig融合タンパク質は、例えば米国特許第5,434,131号などの記載に従って調製することができる。
このタイプの発現系は、デルタ３タンパク質の免疫原性断片の産生が所望される条件下において有用である。例えば、ロタウイルスのVP6キャプシドタンパク質は、単量体またはウイルス粒子の形のいずれにおいても、デルタ３ポリペプチドの一部に対する免疫性キャリヤータンパク質として用いることができる。抗体を誘起するような目的のデルタ３タンパク質の一部に対応する核酸配列を融合遺伝子構築体に組み込み、後期ワクシニアウイルス構造タンパク質をコードする配列を含み、ビリオンの一部としてデルタ３エピトープを有する融合タンパク質を発現する一連の組換えウイルスを産生するようにすることができる。Ｂ型肝炎表面抗原融合タンパク質を用いた免疫原性融合タンパク質の使用が行われており、組換えＢ型肝炎ビリオンもこの役割に用いることができる。同様に、デルタ３タンパク質およびポリオウイルスキャプシドタンパク質を含む融合タンパク質をコードしているキメラ構築体を作出し、一連のポリペプチド抗原に対する免疫原性を増強することができる（例えば、EP公報第025149号；エヴァンス（Evans）ら、(1989) Nature 339: 385；ハン（Huang）ら、(1988) J. Viol. 62: 3855；およびシュリーンガー（Schlienger）ら、(1992) J. Viol. 66: 2を参照）。
ペプチドに基づく免疫を付与する多抗原性ペプチド法（Multiple Antigen Peputide system）を用いて免疫原を作出することもでき、この場合、デルタ３ポリペプチドの所望する部分は、オリゴマー分岐を有するリジンコア上にペプチドを有機化学合成することによって直接得られる（例えば、ポスネット（Posnett）ら、(1988) JBC 263: 1719およびナルデリ（Nardelli）ら、(1992) J. Immunol. 148: 914を参照）。デルタ３タンパク質の抗原決定因子もバクテリア細胞によって発現、呈示することができる。
融合タンパク質を用いて免疫原性を増強することに加えて、融合タンパク質はタンパク質の発現を促進することができ、従って、本発明のデルタ３ポリペプチドの発現に用いることができる。例えば、デルタ３ポリペプチドはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GST融合）タンパク質として作出することができる。そのようなGST融合タンパク質は、例えば、グルタチオン誘導体のマトリックスを用いることにより、デルタ３ポリペプチドの簡易精製を可能にする（例えば、『分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）』、アウスベル（Ausubel）ら編、ジョン・ウィレー＆サンズ（John Wiley & Sons）社、ニューヨークなどを参照）。
別の実施態様においては、（組換えタンパク質の所望する部位のＮ末端に存在するポリヒスチジン／エンテロキナーゼ解裂部位配列などのような）精製リーダー配列をコードしている融合遺伝子は、Ni２＋金属樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって発現融合タンパク質を精製することができる。精製リーダー配列は、後に、エンテロキナーゼを用いて処理することにより除去し、精製されたタンパク質を得ることができる（例えば、ホチュリ（Hochuli）ら、(1987) J. Chromatography 411: 177；およびジャンクネヒト（Janknecht）ら、PNAS 88: 8972などを参照）。
融合遺伝子を作成する技術は当業者において既知である。基本的には、異なるペプチド配列をコードしている種々のDNA断片の結合を従来の技術に従って行う。そのような技術としては、連結のための平滑末端または付着末端の使用、適切な末端を得るための制限酵素切断、付着末端の適切な補充、不要な結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素結合などがある。別の実施態様においては、自動DNA合成機を含む従来技術によって融合遺伝子を構成することができる。これとは別に、アニールしてキメラ遺伝子配列を作成するような２個の連続した断片間の相補的結合を促進するアンカープライマーを用いて遺伝子断片のPCR増幅を行うこともできる（例えば、『分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）』、アウスベル（Ausubel）ら編、ジョン・ウィレー＆サンズ（John Wiley & Sons）社 (1992)などを参照）。
4.4.3 抗体
本発明のもうひとつの面は、デルタ３タンパク質と特異的に反応する抗体に関する。（例えば、cDNA配列に基づき）、デルタ３タンパク質に由来する免疫原を用い、標準的なプロトコールに従って、抗タンパク質／抗ペプチド抗血清またはモノクローナル抗体を作製することができる（例えば、「抗体：実験室マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）」、ハーロウ（Harlow）およびレーン（Lane）編（コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）、1988年）などを参照のこと）。マウス、ハムスターまたはウサギなどの哺乳類について、免疫原性型のペプチド（例えば、抗体応答を誘起することができるデルタ３ポリペプチドもしくは抗原性断片、または上述の融合タンパク質など）を用いて免疫することができる。タンパク質またはペプチドに免疫原性を付与する技術としては、キャリアへのコンジュゲーションまたは当該分野において既知のその他の技術を含む。デルタ３タンパク質の免疫原性部分をアジュバントの存在下において投与することができる。免疫化の進行は、プラズマまたは血清内の抗体力価の検出によってモニターすることができる。免疫原を抗原とし、標準的なELISAまたはその他のイムノアッセイを用いて抗体のレベルを評価することができる。好ましい実施態様においては、哺乳類のデルタ３タンパク質の抗原決定因子（例えば、タンパク質の抗原決定因子は、配列番号2またはそれに非常に関連のあるホモログ（例えば、相同性が少なくとも92％、およびさらに好ましくは少なくとも94％）として表される）に対して該抗体は免疫特異的である。
デルタ３ポリペプチドの抗原性調製物を用いて動物を免疫した後、抗デルタ３抗血清が得られ、所望すれば、血清から単離したポリクローナル抗デルタ３抗体が得られる。モノクローナル抗体を産生するためには、免疫した動物から抗体産生細胞（リンパ球）を回収し、ミエローマ細胞などの不死化細胞を用い、標準的な体細胞融合手法によって融合し、ハイブリドーマ細胞を得る。そのような技術は当該分野において既知であり、例えば、ハイブリドーマ法（当初、コーラー（Kohler）とミルシュテイン（Milstein）によって開発されたもの、(1975) Nature, 256: 495-497）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（コツバー（Kozber）ら、(1983) Immunology Today, 4: 72）、およびヒトモノクローナル抗体抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ法（コール（Cole）ら、(1985) 「モノクローナル抗体と癌治療（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy）」（アラン・R.リス（Alan R. Liss）社、pp.77-96）などが挙げられる。本発明のデルタ３ポリペプチドと特異的に反応する抗体の産生についてハイブリドーマ細胞を免疫化学的にスクリーニングし、そのようなハイブリドーマ細胞を含む培養物からモノクローナル抗体を単離することができる。ひとつの実施態様においては、抗ヒトデルタ３抗体は、ATCC受託番号98348のDNAによってコードされているタンパク質と特異的に反応する。
本明細書で使用している抗体という語は、デルタ３ポリペプチドの内のひとつと特異的に反応する抗体の断片（フラグメント）を含むものをさしている。従来法を用いて抗体を断片化することができ、上記のような全抗体に対するものと同様の方法を用いて断片をスクリーニングした。例えば、抗体をペプシンで処理することにより、F(ab)２断片を得ることができる。得られたF(ab)２断片を処理してジスルフィド結合を除去し、Fab断片を作出した。本発明の抗体はさらに、抗体の少なくともひとつのCDR領域によって付与されたデルタ３タンパク質に対する親和性を有する二重特異性分子およびキメラ分子を包含する。
各デルタ３ポリペプチドの存在量および発現パターンを評価するために、デルタ３エピトープと特異的に結合する抗体を組織サンプルの免疫組織化学的染色に用いることもできる。臨床試験の手段の一部として、免疫沈降およびイムノブロットにおいて診断に役立つように抗デルタ３抗体を用い、組織内のデルタ３タンパク質のレベルを検出および評価することができる。例えば、そのような測定は、神経破壊性疾患、新生物（腫瘍）性疾患または過形成性疾患の発症または進行の予測評価に役立つ。同様に、個体内のデルタ３タンパク質レベルをモニターすることにより、そのような疾患に罹患している患者に対して施されている治療法の有効性を判断することができる。デルタ３ポリペプチドのレベルは、脳脊髄液もしくは羊水などのような体液中の細胞から、またはバイオプシーによって得られたような組織において測定することができる。抗デルタ３抗体を用いた診断アッセイには例えば、特に出生時から発症が明らかな神経破壊性疾患の初期診断を目的として企図されたイムノアッセイなどが含まれる。抗デルタ３抗体を用いた診断アッセイには、神経破壊性疾患、新生物（腫瘍）性疾患または過形成性疾患の初期診断および表現型分類を目的として企図されたイムノアッセイも含まれる。
本発明の抗デルタ３抗体の別の用途としては、λgt11、λgt18-23、λZAPおよびORF8などのような発現ベクターによって構築されたcDNAライブラリーの免疫学的スクリーニングがある。正しい読み枠および方向に挿入されたコード配列を有するこの型のメッセンジャーライブラリーは融合タンパク質を産生することができる。例えば、λgt11は、アミノ末端にβ−ガラクトシダーゼアミノ酸配列を有し、カルボキシ末端に外来性ペプチドを有する融合タンパク質を産生する。デルタ３タンパク質の抗原性のエピトープ（例えば、特定のデルタ３タンパク質の他のオーソログまたは同種由来の他のパラログなど）は、例えば、感染プレートから取り出したニトロセルロースフィルターを抗デルタ３抗体と反応させることなどにより、抗体を用いて検出することができる。次に、このアッセイによって検出された正のファージを感染プレートから単離することができる。このようにして、他の動物からデルタ３のホモログの存在を検出し、クローニングすることができ、同様に、ヒト由来の別のイソ体（スプライシングによる変異体を含む）に変更することもできる。
疾患を治療する方法
ノッチシグナル経路は神経系の発達、特に神経の分化および血管系（例えば、CNS血管系など）の制御に関係するという事実の少なくとも一部に基づくと、広範な感染性疾患または状態に対して、デルタ３を用いた治療が効果的である。特に、PS1およびPS2についての観察の少なくとも一部に基づくと、アミロイド前駆体タンパク質をコードし、アルツハイマー病の約10％のケースにおいて突然変異を起こしている遺伝子は、ノッチシグナル経路に機能発揮できるように結合しており、ノッチシグナル経路における遺伝子（例えば、デルタ遺伝子など）の突然変異は、アルツハイマー病またはその他の神経破壊性疾患もしくは神経発達性疾患を招く。ノッチシグナル経路は血管系の発達において役割を有している。例えば、Dll1機能を消失している突然変異体においては、胚発生10日目に重篤な出血を起こす。さらに、ノッチ３の突然変異体は卒中を特徴とするCADASILを招く。加えて、PS1遺伝子が機能的に除去されているマウスは、胚発生11.5日後に脳および／または脊髄において出血を起こす（ワン（Wong）ら、同上）。さらにまた、ノッチシグナル経路は少なくとも神経系および内皮系において細胞運命の決定に関与していることから、ノッチシグナル経路、なかでも特にデルタ３は、さらなる生物学的系において細胞運命の決定に関与していると考えられる。従って、本発明は、神経系および血管系の細胞以外の細胞の異常増殖および／または分化によって起こる疾患または疾病を治療する方法も提供する。
本発明の方法に従って治療または予防することができる好ましい疾病としては、病理学的神経性症状、新生物（腫瘍）性症状または過形成性症状が挙げられる。神経変性疾患、神経分化性疾患および神経発達性疾患などの神経性疾患はこの方法によって治療効果が得られると考えられるが、これらに限定されるわけではなく、神経病（例えば、ACCPNなどの末梢神経病など）、卒中、痴呆（例えば、皮質下梗塞および白質の脳炎を伴う脳の常染色体優性動脈疾患、CADASIL）、変性性損傷（パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチングトン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳の変性）、脊髄発育不全疾患（複数の硬化症、ヒト免疫不全に関連する脊髄病、横経の脊髄病、進行性多焦点性の白質脳炎、脳橋髄鞘分解）、運動性神経の損傷、進行性脊髄筋萎縮、進行性延髄麻痺、原発性側索硬化症、乳児および若年性筋萎縮、小児における進行性延髄麻痺（ファチオ−ロンデ症候群）、灰白髄炎、遺伝性の運動感覚神経病（シャルコー・マリー・トゥース型疾患）、脊髄損傷、脳損傷、外科的手術による病変、虚血性病変、腫瘍性病変、感染性病変などが挙げられる。
本発明の方法に従って治療することができるより好ましい神経性疾患としては、末梢性神経病などの神経病（例えば、末梢神経病を伴う脳梁無発育（ACCPN）が挙げられる。実際、実施例5.5に記載しているように、ｈデルタ３は、フレームワークマーカーであるD12S1244およびD15S144に近いヒト15番染色体上に位置しており、この染色体領域は遺伝子的にACCPNに関連があることが示されている（カソーボン（Casaubon）ら、上述）。この疾患は、軸索変性によって生じる進行性末梢性神経病、および脳梁の形成不全が存在しないことを特徴とする中枢神経経（CNS）の形成不全を特徴とする。この疾病は初期に発病し、進行性であり、30代で死に至る。
神経病とは末梢神経の疾病を意味し、運動機能および感覚機能の両方を含む。これは、運動軸索と感覚軸索が同一神経内を通っているためである。神経病は慢性のものも急性のものもある。急性神経病のひとつの例として、ギラン・バレー症候群があり、呼吸器感染後に起こる。慢性神経病としては、例えば、間欠性ポルフィリン症、シャルコー・マリー・トゥース型疾患、糖尿病およびB12欠損、中毒、栄養障害などのような代謝性疾患が挙げられる。
CADASILおよび卒中に加えて、血管系の疾病、あるいは「血管の疾病」は本発明の方法に従って治療または予防することができ、これには、粥腫、腫瘍脈管形成、、傷の治癒、糖尿病性網膜症、血管腫、乾癬およびレステノシス（例えば、球状血管形成術によるレステノシスなど）が挙げられる。
ひとつの実施態様においては、デルタ活性の異常（デルタ３タンパク質レベルの異常または生物学的活性の異常など）が原因となっているもしくは関与している、またはひとつもしくはそれ以上の特異的なデルタ３アレル（例えば、デルタ３アレルの突然変異体）が関係している疾患または疾病は、デルタ３を用いた治療によって処置することができる。タンパク質レベルの異常は、例えば、遺伝子の異常発現によって起こる。そのような異常活性は、例えば、細胞増殖および／もしくは分化の異常、または細胞死を招く。例えば、デルタ３の異常活性によって、宿主内の特定の細胞の増殖が増加することがある。細胞増殖の異常を特徴とする疾病を有する個体は、そのような増殖を阻害または減少させるようなデルタ３の治療的投与によって治療することができる。特定のデルタ３の治療的使用は、異常増殖している細胞の型によって異なる。使用に適するデルタ３治療剤は、例えば、対象となる個体から得たそのような細胞のサンプルを該デルタ３治療剤の存在下および不在下においてインビトロ（in vitro）培養することによって決定することができる。
デルタ３治療剤によって治療または予防することができる異常細胞増殖が関連している疾患または症状としては、癌、悪性腫瘍症状、前悪性腫瘍症状、良性腫瘍症状が挙げられる。治療または予防できる症状とは、上皮組織内に生じた腫瘍などの充実性腫瘍である。例えば、結腸または子宮頚管癌などの癌である。事実、結腸および子宮頚管の癌においては、正常組織と比較してノッチの発現レベルが上昇していることが見出されている（PCT出願WO/07474号）。従って、そのような癌の治療は、デルタ３治療剤を投与してノッチとデルタ３との相互作用を減少させることを含む。デルタ３タンパク質を用いて治療または予防することができるその他の癌としては、肉腫および癌腫、例えば、肺癌、食道癌、メラノーマ（色素細胞腫）、精上皮腫および側頭鱗腺癌などが挙げられる。本発明の範ちゅうに含まれるさらなる充実性腫瘍としては、医学の教科書に記載されているものを含む。治療または予防できる症状としては、慢性または急性の白血病などの可溶性腫瘍も含まれ、例えば、慢性または急性の骨髄性白血病、慢性または急性のリンパ球性白血病、前骨髄性白血病、単球性白血病、骨髄性単球性白血病および赤血白血病が挙げられる。本発明のデルタ３治療剤で治療することができるその他の増殖性疾患としては、Ｈ鎖病、多発性骨髄腫、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫、ワルデンストーム高分子グロブリン血症など）、ならびに特に脳血管組織の繊維増殖性疾患が挙げられる。
充実性腫瘍または可溶性腫瘍として特徴づけられる疾患または症状は、異常増殖をする細胞の増殖を阻害または低下させるように、デルタ３治療剤を局所または全身投与することによって治療することができる。本発明の化合物を投与する方法は以下に記載している。
本発明は、腫瘍の形成および／または発達を阻止する方法も提供する。例えば、腫瘍の発達に先立って、前癌性病変（例えば、過血漿症、異形成および形成障害（ジスプラシー）など）のような特定の病変が存在する。そのような病変は上皮組織などに見出される。従って、本発明は、そのような病変が癌性病変に進行することを阻害する方法を提供し、その方法とは、前癌性病変を有する患者に、その前癌性病変が癌性病変に進行することを阻害するのに十分な量のデルタ３治療剤を投与することを含む。
好ましい実施態様においては、本発明は内皮細胞の増殖および／または分化を阻害する方法を提供し、この方法とは、内皮細胞が増殖している（例えば、腫瘍または過増殖性疾患、すなわち、細胞の異常増殖が関連した疾患が進行している）組織にデルタ３治療剤を接触させることを含む。内皮細胞の増殖を阻止することにより、内皮および血管での進行を阻害することができ、従って、腫瘍の発達に必要な化合物が腫瘍に到達するのを制限する。
本発明はまた、細胞増殖不全が関連する疾患または症状を治療または予防する方法を提供する。例えば、デルタ３治療剤は、組織の修復、再生および／もしくは、例えば、外科的手術後の神経組織などの傷の治癒の促進、または火傷からの組織の治癒の促進に用いることができる。細胞増殖が望まれるその他の疾患としては、低増殖性疾患、すなわち、特定の細胞の異常な増殖不良を特徴とする疾患がある。
さらに別の実施態様においては、本発明は、細胞の分化異常を特徴とする疾患または症状を治療または予防する方法を提供する。すなわち、本発明は、細胞の過剰増殖を伴う、または伴わない正常細胞の分化阻害によって特徴づけられる状態における細胞分化を刺激する方法方法を提供する。さらに、デルタ３治療剤は、特定の細胞の分化を阻害するのに使用することができる。
好ましい方法においては、異常増殖および／または分化をしている細胞は神経系に存在する細胞である。従って、本発明は、中枢神経系または末梢神経系が関連した疾患または症状を治療する方法を提供する。例えば、本発明は、ニューロン、シュワン細胞、神経膠（グリア）細胞またはその他の型の神経細胞内におけるデルタ３活性の異常が関与している神経系の損傷を治療する方法を提供する。神経系の疾病に関しては上述している。
別の実施態様においては、本発明は、インビトロ（in vitro）における細胞および組織の生存、ならびに／または増殖および／もしくは分化の刺激を促進する方法を提供する。例えば、被験体から組織を採取し、この組織細胞が刺激を受けて増殖および／または分化するように、デルタ３治療剤の存在下においてインビトロ（in vitro）増殖させることができる。この組織は被験者に再投与することができる。
疾患状態においては遺伝子の発現が高くなるように制御される場合もあれば、遺伝子の発現が低くなるように制御されている場合もあるが、本明細書に記載している技術、化合物および方法を用い、症状に応じてデルタ３の生物活性を活性化および／もしくは増強、または抑制および／もしくは低くなるように調節することが望ましい。ある種の疾患状態においては、いくつかの遺伝子の発現が低下していることがある。神経変性性疾患の症状の進行に伴って、デルタ３遺伝子産物の活性はいくらか損なわれている。デルタ３遺伝子発現のそのような抑制制御またはデルタ３タンパク質の活性の低下は、疾患状態が原因であるか、または悪化を引き起こしていると考えられる。
デルタ３遺伝子の誤発現を含む疾患症状を改善するのに用いることができる方法としては、例えば、上述のアンチセンス、リボザイム、および三重らせん分子などがある。デルタ／ノッチシグナルカスケード内の上流または下流の構成要素に結合するデルタ３タンパク質と競合する化合物はデルタ３タンパク質に拮抗し、したがって治療効果をもたらす。適切な化合物の例としては、これまでに詳述しているアンタゴニストまたはホモログなどが含まれる。その他の場合においては、デルタ３タンパク質の発現または生物活性の増加が望ましい場合があり、本明細書に記載しているような、例えばデルタ３のアゴニストもしくはミメチック、または遺伝子置換治療によって実施される。
また別のデルタ３治療剤は、ノッチレセプターなどのレセプターと結合することができるデルタ３ペプチドを含む第一のペプチドおよび細胞毒性を有する第二のペプチドを含む。そのような治療剤を用いて、デルタ３のレセプターを発現する、または過剰発現する細胞を特異的に標的とし、溶解することができる。例えば、細胞毒性ペプチドに融合させたデルタ３ペプチドを含む融合タンパク質を用いて、ノッチを過剰発現する腫瘍（例えば、結腸および子宮頚管の癌性腫瘍など）を排除する、または減少させることができる。別の方法としては、デルタ３を発現または過剰発現する細胞を溶解の標的とすることができ、例えば、細胞毒性ペプチドに連結したデルタ３タンパク質に特異的に結合する抗体によって細胞を標的とすることができる。
少なくとも部分的にはタンパク質構造の類似性に基づき、デルタ３治療剤を用いて、デルタ活性の異常（例えば、デルタ１活性またはデルタ２活性の異常など）が原因である、または関与している疾患または症状、あるいは１個またはそれ以上のデルタアレル（例えば、デルタ１アレルまたはデルタ２アレルなど）が関係している疾患または症状を治療することができる。そのような疾患または症状には、神経性疾患および癌が含まれる。同様に、デルタ治療剤、例えば、デルタ１治療剤またはデルタ２治療剤を用いて、デルタ３活性の異常が原因である、または関与している疾患または疾病、あるいは特定のデルタ３アレルが関係している疾患または症状を予防または治療することができる。デルタ３治療剤は、例えば、米国特許出願WO 97/01571号に開示されているヌクレオチドおよびタンパク質配列情報などを用いて調製することができ、デルタ３治療剤の試験には、本明細書に記載しているアッセイを用いて試験することができる。
デルタ３遺伝子発現またはタンパク質活性を上昇させるまたは減少させることが確認されている化合物の有効投与量を被験者に投与し、心血管性疾患を治療または改善することができる。有効治療投与量とは、特定の疾患に関連する症状を軽減するのに十分な化合物の量をさす。
4.5.1 有効投与量
そのような化合物の毒性および治療効果は、細胞培養または実験動物における標準的な薬剤学的手法、例えば、LD５０（全体の50％が死亡する投与量）およびED５０（全体の50％に治療効果がみられる投与量）の測定などによって決定することができる。毒性量と治療効果量との間の比が治療指数であり、これは、LD５０／ED５０で表される。治療指数の大きい化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物を用いることもあるが、そのような化合物が非感染細胞に損傷を与える可能性を最小限にするため、注意を払って薬物放出系を設計しなければならず、そうすることによって副作用を軽減することができる。
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータをヒトに使用する投与量の範囲の決定に用いることができる。そのような化合物の投与量は、ほとんどまたは全く毒性を示さないED５０を含む循環濃度の範囲内であることが好ましい。用いた投与剤形および使用した投与経路によって投与量はこの範囲内で変化するのが普通である。本発明の方法において用いられるいずれの化合物についても、まず、細胞培養アッセイによって治療有効濃度が確認される。投与量は動物モデルにおいて定められ、細胞培養において測定されたIC５０（すなわち、症状の半分を阻止することができる試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲に達するようにすることができる。そのような情報を用いてヒトにおける有効投与量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは高速液体クロマトグラフィーなどによって測定することができる。
4.5.2 製剤化および使用法
本発明に従って使用する薬剤学的組成物は、ひとつまたはそれ以上の身体的に許容できるキャリアまたは賦形剤を用い、従来法によって製剤化することができる。従って、注射、吸入もしくは通気法（口または鼻から）による投与、または経口、頬粘膜、非経口もしくは直腸投与などの投与用に、化合物ならびに身体的に許容できる塩および溶媒化合物を製剤化することができる。
そのような治療においては、全身性ならびに局所もしくは局在性投与を含む様々な投与法に合わせて本発明のオリゴマーを製剤化することができる。技術および製剤化については、『レミントン 製剤学（Remmington's Pharmaceutical Sciences）』（ミード出版社（Mead Publishing）、ペンシルバニア州イーストン）を参照することができる。全身投与には注射が好ましく、筋肉内、静脈内、腹腔内および皮下注射などが挙げられる。注射には、好ましくは、ハンク液またはリンゲル液などの身体的に等張な緩衝液内において、本発明のオリゴマーを液体溶液に調製することができる。さらに、オリゴマーを固体に製剤化し、使用直前に再溶解または懸濁することもできる。凍結乾燥製剤も含まれる。
経口投与については、薬剤学的組成物は、結合剤（例えば、ゲル化前のトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、充填剤（ラクトース、微晶性セルロースまたは亜リン酸カルシウムなど）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカなど）、崩壊剤（バレイショデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウムなど）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）などのような薬剤学的に許容される賦形剤を用いて従来法によって調製された錠剤またはカプセル剤などの剤形にすることができる。当該分野において既知の方法によって錠剤を被覆することができる。経口投与用の液体製剤は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の形にすることができ、あるいは、使用前に水またはその他の適切なキャリアに溶解する乾燥製剤とすることができる。そのような液体製剤は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または加水分解した可食性脂質など）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴムなど）、非水性キャリア（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分留ベジタブル油など）、および保存剤（例えば、メチル−もしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸など）などのような薬剤学的に許容される添加剤を用い、従来法によって調製することができる。この調製においては、必要に応じて緩衝塩、香料、着色料および甘味料を含むようにすることもできる。
経口投与用の製剤は、活性化合物の放出制御をすることができるように適切に製剤化することができる。
頬粘膜投与用には、従来法を用いて組成物を錠剤またはロゼンジの形に製剤化することができる。
吸入による投与用には、本発明に従って使用する化合物は、適切な抛射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素またはその他の適切な気体など）を用いて、加圧パックまたはネブライザーからエアロゾルスプレーの形で容易に射出することができる。 加圧エアロゾルの場合には、投与単位は一定量を放出するバルブを取り付けることによって決定することができる。吸入または通気に使用するゼラチンなどのカプセルまたはカートリッジは、化合物および適切な粉末キャリア（例えば、ラクトースやデンプンなど）の粉末混合物を含むように製剤化することができる。
化合物は注射（例えば、ボーラス注射または連続注入など）による非経口投与用に製剤化することができる。注射用の製剤は、保存剤を添加し、投与単位毎に、例えば、アンプルまたは複数回投与コンテナなどの形にすることができる。組成物は懸濁液、溶液または油性もしくは水性基剤中の乳化剤のような剤形にすることができ、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などのような補助剤を含んでいることがある。別の方法としては、活性成分を粉末の形にし、使用前に適切なキャリア（例えば、発熱性物質不含の滅菌水など）を用いて溶解するようにすることができる。
化合物は、坐薬または貯留性注腸（例えば、ココアバターまたはその他のグリセリド類のような従来から用いられている坐薬キャリアを含む）などのような直腸投与用組成物に製剤化することもできる。
上述した製剤に加え、化合物を蓄積性製剤とすることもできる。そのような長時間作用型製剤は、埋め込み（例えば、皮下または筋肉内など）または筋肉内注射によって投与することができる。このように、化合物は例えば、適切なポリマー材料もしくは疎水性材料（例えば、許容できる油中のエマルションとしてなど）もしくはイオン交換樹脂を用いて、または難溶性誘導体（例えば、難溶性の塩など）として製剤化することができる。
全身性投与は、経粘膜法または経皮法によって行うこともできる。経粘膜投与または経皮投与においては、製剤化に際して、浸透していこうとする障壁に応じた浸透剤を用いる。そのような浸透剤は一般的に当該分野において既知であり、例えば、経粘膜投与用胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体などが挙げられる。さらに、界面活性剤を用いて透過を促進することができる。経粘膜投与は鼻腔スプレーにより、または坐薬を用いて行うことができる。局所投与については、本発明のオリゴマーを軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームなどの当該分野において一般的に既知の剤形にすることができる。
臨床の場においては、当該分野において既知の多くの方法の中から任意の方法によって、デルタ３治療遺伝子の遺伝子デリバリー系を患者に導入することができる。例えば、遺伝子デリバリー系の薬剤学的製剤は、例えば静脈注射などによって全身に導入され、遺伝子デリバリービヒクル、レセプター遺伝子の発現を制御している転写制御配列による細胞型もしくは組織型の発現、またはそれらの組合せによってもたらされる特異的トランスフェクションにより、標的細胞内におけるタンパク質の特異的形質導入が起こる。別の実施態様においては、組換え遺伝子の初期デリバリーは、動物の極めて局所的な部分に導入する、限定的なものである。例えば、遺伝子デリバリービヒクルはカテーテル（米国特許第5,328,470号参照）または走触性注入（例えば、チェン（Chen）ら、(1994) PNAS 91: 3054-3057など）によって導入することができる。配列番号1もしくは3またはそれらと相同な配列からなる群で表される配列の内の任意のひとつなどのようなデルタ３遺伝子は、例えば、デヴ（Dev）ら（(1994) Cancer Treat Rev 20: 105-115）によって記載されている技術を用いたエレクトロポレーションによって遺伝子治療構築体内に送達することができる。
遺伝子治療構築体の薬剤学的製剤は、基本的には許容される希釈剤中に遺伝子デリバリー系が含まれているかまたは、遺伝デリバリービヒクルが埋め込まれている徐放性マトリックスを含む。別の方法としては、組換え細胞（例えば、レトロウイルスベクターなど）から完璧な遺伝子デリバリー系が完全な形で産生されるのであれば、薬剤学的製剤は、遺伝子送達系を産生する１個またはそれ以上の細胞を含むようにすることができる。
所望に応じて、該組成物は、活性成分を含有する単回または複数回の投与単位を含むパックまたはディスペンサー装置の形にすることができる。パックは例えば、金属箔またはプラスチック箔などからなり、ブリスターパックのようなものである。パックまたはディスペンサー装置には投与の指示を添付する。
4.6 診断および予後のアッセイ
本発明の方法は、細胞の増殖、変性および／または分化の異常などのようなデルタ３活性の異常を特徴とする疾病が進行し、神経変性性疾患または癌などに至る危険性があるか否かを判断する手段を提供する。本発明は、１個またはそれ以上のデルタ３遺伝子のアレルが関与している疾患または疾病の進行の危険性があるか否かを判断する方法をも提供する。実際のところ、特定のデルタ３遺伝子が特定の疾患または疾病に関与していると考えられている。例えば、少なくとも１個のｈデルタ３のアレルが神経性疾患であるACCPNに関与していると思われる。従って本発明は、神経性疾患（例えば、ACCPNなど）が進行する危険性を有している、または危険性があるか否かを判断する方法を提供する。別の実施態様においては、本発明は、血管性疾病または細胞運命決定因子が関与している疾病が進行する危険性を有している、または危険性があるか否かを判断する方法を提供する。ひとつの実施態様においては、本発明は、個体内のデルタ３アレルの特性を決定すること、および個体内のデルタ３遺伝子の分子構造を神経性疾患を有しない個体由来のデルタ３遺伝子の分子構造と比較することを含む。分子構造の決定は、例えば、少なくとも１個のヌクレオチドの特性を決定すること、ヌクレオチド組成物を決定すること、または遺伝子のメチル化パターンを決定することなどによって行うことができる。
ひとつの実施態様においては、本発明は、被験者がデルタ３遺伝子内に遺伝的損失を有しているか、またはデルタ３遺伝子内に多形性領域を構成する特定アレルの変種を有しているかを判断する方法を提供する。特定アレルとは突然変異アレルである。別の実施態様においては、本発明は、タンパク質の転写後の異常変形（ホスホロギュレーションまたはグリコシル化の異常など）による異常デルタ３タンパク質の有無を判断する方法を提供する。また、本発明の範ちゅうにはデルタ３タンパク質の発現レベルの異常の有無を判断する方法も含まれ、この異常は、デルタ３遺伝子内の遺伝的損失、またはデルタ３遺伝子の発現を制御しているタンパク質のレベルもしくは活性の異常によるものである。
好ましい実施態様においては、この方法は、被験者からの細胞サンプル内の遺伝子損傷の有無を検出する方法であって、（ｉ）デルタタンパク質をコードしている遺伝子の完全状態に影響を及ぼす変調、または（ｉｉ）デルタ３遺伝子の誤発現のうちの少なくともひとつによって特徴づけられる遺伝子の損失の在不在の検出を含むことを特徴とする。具体的に述べると、そのような遺伝子の損失は、次のうちの少なくともひとつの存在を確認することによって検出することができる：（ｉ）デルタ３遺伝子からの１個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失、（ｉｉ）デルタ３遺伝子への１個またはそれ以上のヌクレオチドの付加、（ｉｉｉ）デルタ３遺伝子の１個またはそれ以上の遺伝子の置換、（ｉｖ）デルタ３遺伝子の染色体の大量再配列、（ｖ）デルタ３遺伝子のメッセンジャーRNA転写物レベルの大量変化、（ｖｉ）ゲノムDNAのメチル化パターンの場合のようなデルタ３遺伝子の異常変形、（ｖｉｉ）デルタ３遺伝子のメッセンジャーRNA転写物内における非野生型スプライシングパターンの存在、（ｖｉｉｉ）デルタタンパク質の非野生型のレベル、（ｉｘ）デルタ３遺伝子の対立遺伝子の消失、および（ｘ）デルタタンパク質の翻訳後の不適切な変形。以下に記載しているように、本発明はデルタ３遺伝子内の損失を検出するための多数のアッセイ技術を提供し、重要なことは、デルタによる細胞の増殖および／または分化の異常の原因となる分子差異を見分けることができるようにすることである。
デルタ３遺伝子の特定のアレルが関与している疾患または症状の進行の危険性を有している、または危険性があるか否かを判断するためには、予備実験を行って、疾患に関与しているアレルの特性を決定する。例えば、ACCPNに関与しているｈデルタ３アレルの特性を決定するためには、ACCPNの進行の危険性の高いヒトの集団においてデルタ３遺伝子の突然変異体の検出試験を行う。例えば、ケベック州のシャルルボア（Charlevoix）およびサガネイ（Saguanay）川流域のセント・ジーン地域のフランス系カナダ人の集団においてゲノムDNAの突然変異体検出分析を行う（カソーボン（Casaubon）ら、同上）。そのような分析から、デルタ３アレルまたはACCPNに関与しているアレルの特性が明らかになる。ある個体のデルタ３アレルをこのアレルまたはACCPNに関与しているアレルと比較することにより、その個体がACCPNに関与しているデルタ３アレルを持っているか否か、また、この個体がACCPNを発症しているかもしくは発症しそうであるかを指摘することができる。同様に、突然変異体検出分析を行ってその他の疾患または症状に関与しているデルタ３アレルの特性を判断することもできる。
実施態様のひとつの例として、本発明は、デルタ３遺伝子（例えば、配列番号1もしくは3、それらのアレル、天然に存在するそれらの突然変異体、該デルタ３遺伝子に連結した５’もしくは３’フランキング配列またはイントロン配列、または天然に存在するそれらの突然変異体のうちの任意のもの）のセンス配列またはアンチセンス配列にハイブリダイゼーションすることができるヌクレオチド配列の領域を有する（精製された）オリゴヌクレオチドプローブを含む核酸組成物を提供する。細胞の核酸をハイブリダイゼーションが受けられるようにし、サンプルの核酸にプローブを接触させ、サンプルの核酸へのプローブのハイブリダイゼーションを検出する。そのような技術を用いて、欠失、置換などを含むゲノムレベルまたはmRNAレベルでのいずれの損傷も検出することができ、また、mRNA転写レベルを判断することもできる。
上述しているように、本発明は、患者から単離した細胞において、そのサンプル細胞のデルタ３遺伝子の１個またはそれ以上の中で突然変異が生じているか否かを判断するための診断アッセイに関する。本方法は、デルタ３活性（例えば、細胞の増殖および／または分化など）の異常を特徴とする疾病の危険性の有無を判断する方法を提供する。好ましい実施態様においては、この方法は、対象個体から得たサンプル細胞において、デルタタンパク質をコードしている遺伝子の完全状態に影響を与えることを特徴とする遺伝子の損傷の存否を検出することを特徴とする。詳述すると、そのような遺伝子の損傷は、次のうちの少なくともひとつの存在を確認することによって検出することができる：（ｉ）デルタ遺伝子からの１個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失、（ｉｉ）デルタ遺伝子への１個またはそれ以上のヌクレオチドの付加、（ｉｉｉ）デルタ遺伝子の１個またはそれ以上のヌクレオチドの置換、および（ｉｖ）デルタ遺伝子のメッセンジャーRNA転写物における非野生型スプライシングパターンの存在。以下に記載しているように、本発明はデルタ３遺伝子内の損傷を検出するための多数のアッセイ技術を提供し、そして重要なことは、デルタによる細胞の増殖および／または分化の異常の原因となる分子の差異を見分けることができるようにすることである。
ある実施態様においては、デルタ遺伝子内の損傷の検出またはデルタ遺伝子の多形領域のアレルの変種の確認は、プローブ／プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（例えば、米国特許第4,683,195号および4,683,202号などを参照）（例えば、アンカーPCRまたはRACE PCRなど）または別の方法としては、連結連鎖反応（LCR）（例えば、ランデグラン（Landegran）ら、(1988) Science 241: 1077-1080；およびナカザワ（Nakazawa）ら、(1994) PNAS 91: 360-364を参照）によって行うが、LCRはデルタ遺伝子内の点突然変異の検出に特に有用である（アブラバヤ（Abravaya）ら、(1995) Nuc Acid Res 23: 675-682を参照）。実施態様のひとつの例としては、本発明は、（ｉ）患者からサンプルを採取し、（ｉｉ）サンプルの細胞から核酸（例えば、ゲノム、mRNAまたはこれらの両方など）を単離し、（ｉｉｉ）デルタ遺伝子（もし存在していれば）のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こるような条件下で、核酸サンプルをデルタ遺伝子と特異的にハイブリダイズする１個またはそれ以上のプライマーと接触させ、（ｉｖ）増幅産物の存否を検出し、または増幅産物の大きさを検出し、対照サンプルの長さと比較する、各段階を含む。PCRおよび／またはLCRは、本明細書に記載している突然変異体を検出するために用いる任意の方法と組み合わせて、予備的な増幅段階として用いることが望ましいと考えられる。
別の増幅方法としては、自己持続性配列複製（self sustained sequence replication）（グアテリ（Guatelli）,J.C.ら、(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878）、転写増幅系（クゥオー（Kwoh）, D. Y.ら、(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177）、Ｑ−βレプリカーゼ（リザーディ（Lizardi）, P. M.ら、(1988) Bio/Technology 6: 1197）、またはその他任意の核酸増幅法があり、その後、増幅した分子を当業者において既知の技術を用いて検出する。このような検出手順は、そのような核酸分子が非常に少数しか存在しない場合において、検出に特に有用である。
アッセイについての好ましい実施態様として、サンプル細胞由来のデルタ３遺伝子またはデルタ３遺伝子の特定のアレル内の突然変異を制限酵素解裂パターンの変化によって確認する。例えば、サンプルDNAおよび対照DNAを単離し、増幅し（必要であれば）、１個またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて切断し、ゲル電気泳動によって断片の長さを測定する。さらに、配列特異的リボザイムを用いることにより（例えば、米国特許第5,498,531号などを参照）、リボザイム解裂部位の発生または消失による特異的突然変異の存在を明らかにすることができる。
さらに別の実施態様においては、当該分野において既知の多数のシークエンシング反応の内の任意のものを用いて直接デルタ３遺伝子をシークエンス（配列分析）し、また、対応する野生型（対照）配列とサンプルのデルタ３の配列を比較することによって突然変異または多形領域のアレルの変種を検出する。シークエンシング反応の例としては、マクサム（Maxam）およびギルバート（Gilbert）（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977) 74: 560）、またはサンガー（Sanger）（サンガー（Sanger）ら、(1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463）によって開発された技術に基づくものが挙げられる。アッセイを行う場合には、様々な自動シークエンシング装置の内の任意のものを用いることができ（Biotechniques (1955) 19: 448）、これらには、マススペクトロメトリーによるシークエンシング（例えば、PCT公報 WO 94/16101；コーエン（Cohen）ら、(1996) Adv Chromatogr 36: 127-162；およびグリフィン（Griffin）ら、 (1993) Appl Biochem Biotechnol 38: 147-159などを参照）が挙げられる。特定の実施態様に関しては、シークエンシング反応においてわずか１、２または３個の核酸の存在が必須であることは、当業者においては明かである。例えば、ほんの１個の核酸を検出するＡ経路（A tract）などのようなものを行うことができる。
さらに別の実施態様においては、解裂剤（ヌクレアーゼ、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム＋ピペリジンなど）に対する抵抗性を利用して、RNA／DNAまたはDNA／RNAの異種二本鎖における塩基のミスマッチを検出することができる（メイヤース（Myers）ら、(1985) Science 230: 1242）。概説すると、「ミスマッチ解裂」の技術は、野生型のデルタ３配列と組織サンプルから得た突然変異の可能性のあるRNAまたはDNAとを含む（ラベルした）RNAまたはDNAをハイブリダイズすることによって異種二本鎖を提供することに端を発している。対照鎖とサンプル鎖の間の塩基対のミスマッチによって生じたような、二本鎖の中の一重らせん領域を解裂する物質を用いて二重らせんを形成している二本鎖を処理する。例えば、RNA／DNA二本鎖をRNアーゼで処理し、DNA／DNAハイブリッドをSIヌクレアーゼで処理すると、ミスマッチ領域が酵素的に切断される。その他の実施態様においては、ミスマッチ領域を切断するために、DNA／DNA二本鎖またはRNA／DNA二本鎖をヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム＋ピペリジンで処理する。ミスマッチ領域の切断後、得られた材料を変性ポリアクリルアミドゲル上で大きさによって分け、突然変異部位を確認する。例えば、コットン（Cotton）ら、(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397；サレーバ（Saleeba）ら、(1992) Methods Enzymol 217: 286-295を参照のこと。好ましい実施態様においては、対照DNAまたは対照RNAをラベルして検出できるようにする。
また別の実施態様においては、ミスマッチ解裂反応に１個またはそれ以上のタンパク質を使用する。このタンパク質は、一定の系内において、二重らせんDNA中のミスマッチ塩基対を認識して、サンプル細胞から得られたデルタ３ cDNA内の点突然変異を検出およびマッピングする（「DNAミスマッチ修復」酵素と呼ばれる）。例えば、大腸菌（E. coli）のmutY酵素はＧ／ＡミスマッチのＡを解裂し、HeLa細胞由来のチミジンDNAグリコシラーゼはＧ／ＴミスマッチのＴを解裂する（ス（Hsu）ら、(1994) Carcinogenesis 15: 1657-1662）。実施態様の一例としては、デルタ３配列に基づくプローブ（例えば、野生型のデルタ３配列など）を試験細胞由来のcDNAまたはその他のDNA産物にハイブリダイズさせる。得られた二本鎖をDNAミスマッチ修復酵素で処理し、もし解裂産物が得られた場合には、電気泳動プロトコールなどに従って検出することができる。例えば、米国特許第5,459,039号などを参照のこと。
別の実施態様においては、電気泳動での移動度を用いてデルタ３遺伝子内の突然変異を確認し、またはデルタ３アレルを同定する。例えば、一本鎖立体配置多型（SSCP）を利用して突然変異体の核酸と野生型の核酸との間の電気泳動移動度の差を検出することができる（オリタ（Orita）ら、(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2766、また、コットン（Cotton）、(1993) Mutat Res 285: 125-144；およびハヤシ（Hayashi）、(1992) Genet Anal Tech Appl 9: 73-79を参照）。サンプルおよび対照のデルタ３核酸由来の一本鎖DNA断片は、変性し、またもとの状態に戻すことができる。一本鎖核酸の二次構造は配列に応じて異なり、従って、電気泳動移動度の変化により、わずか１個の塩基の変化でも検出可能なのである。アッセイの感度はDNAよりもむしろRNAを用いることによって上昇するが、これは、二次構造が配列の変化により敏感だからである。好ましい実施態様においては、本方法を異種二本鎖分析に用い、電気泳動移動度の変化に基づいて二重らせんを形成している異種二本鎖分子を分取する（キーン（Keen）ら、(1991) Trends Genet 7:5）。
また別の実施態様においては、変性濃度勾配ゲル電気泳動（DGGE）を用い、変性剤の濃度勾配を有するポリアクリルアミドゲル中で突然変異体断片または野生型断片の移動を分析する（メイヤース（Myers）ら、(1985) Nature 313: 495）。分析法としてDGGEを用いた場合には、DNAは変性されるが、例えば、PCRによって高温融解するＧＣに富むDNAの約40bpのＧＣクランプを付加するような完全な変性が行われるわけではない。さらに別の実施態様においては、変性剤の濃度勾配の代わりに温度勾配を用いて、対照DNAとサンプルDNAとの移動度の差異を確認する（ローゼンバウム（Rosenbaum）およびライスナー（Reissner）、(1987) Biophys Chem 265: 12753）。
点突然変異の検出に使用するその他の技術の例としては、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅または選択的プライマー伸長などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。例えば、既知の突然変異が中央に来るようにオリゴヌクレオチドプライマーを調製し、次に、完全に一致している場合にハイブリダイゼーションできるような条件下において、このプライマーを標的DNAにハイブリダイズする（サイキ（Saiki）ら、(1986) Nature 324: 163；サイキ（Saiki）ら、(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6230）。そのようなアレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション技術を用い、オリゴヌクレオチドがPCR増幅した標的DNAにハイブリダイズする場合には反応１回につき１個の突然変異を、あるいはオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ膜に接合し、ラベルした標的DNAとハイブリダイズする場合には多数の異なる突然変異を調べることができる。
別の方法としては、選択的PCR増幅に基づくアレル特異的な増幅法を本発明と組み合わせて使用することができる。特異的増幅用のプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、分子の中央に（従って、増幅はディファレンシャルハイブリダイゼーションに応じて起こる）、または、ひとつのプライマーの３’最末端（適切な条件下であれば、この位置は、ミスマッチを防ぐことができるか、またはポリメラーゼによる伸長を抑制することができる）に目的の突然変異を有するようにする（プロスナー（Prossner）ら、(1993) Tibtech 11: 238）。さらに、突然変異領域に新規な制限酵素部位を導入し、解裂に基づく検出を行うこともできる（ガスパリーニ（Gasparini）ら、(1992) Mol Cell Probes 6: 1）。特定の実施態様においては、増幅用にTaqリガーゼを用いて増幅を行うこともできると考えられる（バラニー（Barany ）、(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189）。このような場合においては、５’側配列の３’末端が完全に一致している場合にのみ連結が起こることから、増幅の有無を探すことによって特異的部位における既知の突然変異の存在を検出することができる。
本発明の別の実施態様においては、本発明は、（精製）オリゴヌクレオチドプローブを含む核酸組成物であって、このプローブには、デルタ遺伝子のセンスまたはアンチセンス配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列の内の一領域、もしくは天然に存在するそれらの突然変異、あるいは目的のデルタ遺伝子と連結している５’もしくは３’側フランキング配列またはイントロン性配列、または天然に存在するそれらの突然変異が含まれるようにした核酸組成物を提供する。細胞の核酸をハイブリダイゼーションできるように処理し、プローブをサンプルの核酸に露出し、サンプル核酸へのプローブのハイブリダイゼーションを検出する。そのような技術を用いて、ゲノムレベルまたはmRNAレベルのいずれの場合の損傷（欠失、置換などを含む）も検出することができ、また、mRNAの転写レベルを判断することもできる。そのようなオリゴヌクレオチドプローブは、例えば、神経変性性疾患、癌腫瘍性疾患または過増殖性疾患（例えば、細胞の異常増殖など）を呈するアレル突然変異の予測および治療評価に用いることができる。
本明細書に記載している方法は例えば、少なくとも１個のプローブ核酸または本明細書に記載している抗体試薬の内の少なくともひとつを含むパッケージされた診断キットを利用することによって行うことができ、この方法は、デルタ３遺伝子による症状、または疾患もしくは病気の家族歴を有する患者の医療現場での診断などに簡便に使用することができる。
任意の細胞型または組織、好ましくはデルタ３を発現する神経細胞または内皮細胞を以下に記載する診断に用いることができる。例えば、被験者の体内液（例えば、血液など）を既知の技術（例えば、静脈穿刺など）によって採取することができる。これとは別に、固体サンプル（例えば、毛髪または皮膚など）について核酸試験を行うこともできる。ビアンチ（Bianchi）による国際特許出願WO 91/07660に記載されているように、妊婦の血液から胎児の核酸サンプルを採取することができる。また、例えば、ACCPN（これは、通常30代において致命的となる疾患である）などの出生前試験を実施するために羊膜細胞または絨毛膜を採取することもできる。
診断手法は、生検または摘出によって得た患者の組織の組織片（固定および／または凍結したもの）上にインサイチュ（in situ）で直接的に行うこともでき、この場合には核酸の精製は不要である。このようなインサイチュ（in situ）手法においては、核酸試薬をプローブおよび／またはプライマーとして使用することができる（例えば、ヌオヴォ（Nuovo）, G. J.『PCRインサイチュ（in situ）ハイブリダイゼーション：プロトコールおよび応用（PCR in situ hybridization: protocols and application）』、ラヴェン・プレス（Raven Press）社、ニューヨークなどを参照）。
１個の核酸配列の検出に主眼をおく方法に加えて、そのような検出手順においてはプロファイルを評価することもできる。例えば、ノーザン分析および／またはRT-PCRなどのディファレンシャルディスプレイ法を用いてフィンガープリントプロファイルを得ることができる。
上述したような野生型または突然変異型のデルタ３に対する抗体も疾患の診断および予後に用いることができる。そのような診断法を用いて、デルタ３タンパク質の発現レベルの異常、あるいは構造および／もしくは組織、細胞、またはデルタ３タンパク質の細胞内の存在場所についての異常を検出することができる。構造的な異常には、例えば、大きさ、電気陰性度、または正常デルタ３タンパク質と比較した場合の突然変異デルタ３タンパク質の抗原性などが挙げられる。分析済みの組織または細胞型由来のタンパク質は、当業者において既知の技術を用いて容易に検出または単離することができ、そのような技術としてはウェスタンブロット分析などが挙げられるが、これに限定されるわけではない。ウェスタンブロット分析を行うにあたっての詳細な説明はサンブルック（Sambrook）ら、(1989)、同上、第18章を参照のこと。本発明において使用しているタンパク質の検出および単離法については、例えば、ハーロウ（Harlow）およびレーン（Lane）による記載（ハーロウ（Harlow）およびレーン（Lane）、(1988)『抗体：実験室マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）』、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）社、ニューヨーク）なども参照し、その全体を参考として本明細書中に取り入れておく。
これは例えば、蛍光ラベルした抗体（下記を参照）を光学顕微鏡、フローサイトメトリーまたは蛍光光度計と組み合わせた免疫蛍光法によって実施することができる。本発明において有用な抗体（またはそれらの断片）はさらに、デルタ３タンパク質のインサイチュ（in situ）検出の目的で、免疫蛍光または免疫電気顕微鏡において組織学的に用いられる。インサイチュ（in situ）検出は、患者から組織学的標本を採取し、それに本発明のラベルした抗体を加えることによって行う。抗体（またはその断片）は、生体サンプル上をラベルした抗体（またはその断片）で覆うように添加することが好ましい。そのような方法を用いることにより、デルタ３タンパク質の存在だけでなく、調査した組織内での分布も知ることができる。本発明を用いることによって、そのようなインサイチュ（in situ）検出を行うために、多数の組織学的方法（例えば、染色法など）の中の任意の方法を変形することができることは、当業者であれば自明である。
抗原または抗体を結合することができる支持体として、固相支持体または担体もしばしば用いられる。既知の支持体または担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ類、天然および変形セルロース類、ポリアクリルアミド類、ハンレイ岩、マグネタイトなどが挙げられる。担体の性質は、本発明の目的に応じて、ある程度溶解性のものまたは不溶性のもののいずれも用いることができる。支持された分子が抗原または抗体を結合させることができる限り、支持材料は実質上任意の立体構造をとることができる。すなわち、支持体の立体形状は、例えば、ビーズ内のような球状、または試験管の内表面もしくは棒の外表面のような円筒状である。別の方法としては、表面をシート、試験片のような平らな状態にすることもできる。好ましい支持体としてはポリスチレンビーズがある。当業者であれば、抗体または抗原の結合に適したその他多くの担体を知っており、日常の実験で使用することによって適した担体を確認することができる。
抗デルタ３タンパク質特異的抗体をラベルするひとつの手段は、酵素へ結合して、酵素免疫アッセイ（EIA）に使用することである（ヴォラー（Voller）、『酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）』、Diagnosric Horizons 2: 1-7 (1978)、微生物学会季刊出版（Microbiological Associates Quarterly Publication）、メリーランド州ウォーカーズビル；ヴォラー（Voller）ら、J. Clin. Pathol. 31: 507-520 (1987)；バトラー（Butler）、Meth. Enzymol. 73: 482-523 (1981)；マッジオ（Magio）編、『酵素免疫アッセイ（Enzyme Immunoassay）』、CRCプレス（CRC Press）社、フロリダ州ボカ・ラートン (1980)；イシカワ（Ishikawa）ら編、『酵素免疫アッセイ（Enzyme Immunoassay）』、化学書院（Kagaku shoin）、東京 (1981)）。抗体に結合する酵素は、例えば、吸光光度計、蛍光光度計または目視などによって検出可能な化学的部位を形成するように、適切な基質、好ましくは色素原物質と反応する。抗体に検出可能なラベルを施す酵素としては、リンゴ酸、デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。検出は、酵素に対して色素原基質を用いた比色計法によって行うことができる。検出は、基質の酵素反応の存在を同様に調製した標準と比較する目視比較によっても行うことができる。
検出は、その他の多数の免疫アッセイの内の任意のものを用いて行うこともできる。例えば、放射活性ラベルした抗体または抗体の断片により、ラジオイムノアッセイ（RIA）を利用してフィンガープリント遺伝子の野生型または突然変異ペプチドを検出することが可能である（例えば、ウエイントラウブ（Weintraub）,B.、『ラジオイムノアッセイの原理、放射リガンドアッセイ技術の７種のトレーニングコース（Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques）』、エンドクライン・ソサイエティー（The Endocrine Society）（1986年３月）を参照のこと、参考として本明細書に取り入れておく）。放射活性同位体は、γ−カウンターもしくはシンチレーションカウンター、またはオートラジオグラフィーなどの手段によって検出することができる。
抗体を蛍光化合物でラベルすることも可能である。蛍光ラベルした抗体に適切な波長の光を照射すると、蛍光によってその存在が検出できる。通常よく使用される蛍光ラベル用化合物としては、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミンが挙げられる。
抗体は、１５２Euまたはその他のランタニド類などのような発蛍光性金属を用いて検出可能なラベルを施すこともできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）またはエチレンジアミン四酢酸（EDTA）などのような金属キレート基を用いて抗体に結合させることができる。
抗体は、化学発光化合物にカップリングすることによって検出可能なラベルを施すこともできる。化学発光タグを付けた抗体は、化学反応の過程において生じる発光の存在を検出することによって確認される。特に有用な化学発光ラベル用化合物の例としては、ルミノール、イソルミノール、セロマチックアクリジニウムエステル、アクリジニウム塩およびオキザレートエステルなどが挙げられる。
同様に、生物発光化合物を用いて本発明の抗体をラベルすることもできる。生物発光は生体系内においてみられる化学発光の一種であり、触媒性タンパク質が化学発光反応の効率を上昇させる。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって確認される。ラベル用の重要な生物発光化合物としては、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンが挙げられる。
さらに、デルタ３遺伝子または遺伝子産物の変形を検出するための上述の方法の内の任意のものを用いて処置または治療の経過をモニターすることができることは自明である。
4.7 薬物スクリーニングアッセイ
本発明は、デルタ３活性の異常が原因となっている、または関与している疾患または症状を治療するための化合物、例えば、治療化合物などを提供する。この目的に使用される化合物としては任意の種類の化合物を用いることができ、タンパク質、ペプチド、ペプチドミメチック、小分子、および核酸などが含まれる。核酸としては例えば、遺伝子、アンチセンス核酸、リボゾームまたは三重らせん分子が挙げられる。本発明の化合物は、アゴニストまたはアンタゴニストのいずれであってもよい。化合物はデルタ遺伝子に作用し、例えば、発現を調節することができる。化合物はデルタ３タンパク質に作用し、例えば、レセプターからのシグナル伝達を調節することもできる。従って、本発明の化合物は、デルタ３に結合し、例えば、デルタ３活性を誘導するように、レセプターからのシグナル伝達を誘導する化合物である。別の見方をすれば、本発明の化合物は、デルタ３タンパク質とトポリズムクタンパク質（例えば、ノッチなど）との相互作用を阻害する化合物である。ひとつの実施態様においては、アゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとしてデルタ３タンパク質と相互作用する本発明の化合物は、トポリズムタンパク質またはデルタ３と相互作用するタンパク質である。例えば、可溶性アンタゴニスト性トポリズムタンパク質は、デルタ３への結合に関して野生型のトポリズムタンパク質と競合するタンパク質である。可溶性アゴニスト性トポリズムタンパク質は、基本的には野生型のトポリズムタンパク質と同様な方法でデルタ３タンパク質と結合し、少なくともひとつのデルタ３活性（例えば、デルタ３タンパク質からのシグナル誘導など）を誘導する。従って、その特定のトポリズムタンパク質がデルタ３活性を刺激するか阻害するかに応じて、可溶性トポリズムタンパク質は、トポリズムタンパク質の刺激型または阻害型をとることができる。
同様に、デルタ３−Igなどの可溶性デルタ３タンパク質を用いてノッチなどのトポリズムタンパク質の活性を調節することができる。例えば、可溶性デルタ３タンパク質は、デルタ３タンパク質の刺激型、すなわち、トポリズムタンパク質の活性を刺激することができるデルタ３タンパク質である。ひとつの実施態様においては、可溶性デルタ３タンパク質は、デルタ３タンパク質の阻害型、すなわち、トポリズムタンパク質の活性を阻害することができるデルタ３タンパク質である。例えば、そのようなデルタ３タンパク質は、野生型のデルタ３タンパク質とトポリズムタンパク質との相互作用を阻害することができる。好ましい実施態様においては、デルタ３タンパク質の阻害型は、例えば、その他の様々なタンパク質（例えば、その他のデルタタンパク質など）への結合部位でもあるトポリズムタンパク質の結合部位に結合することによって、正常であればトポリズムタンパク質と相互作用する数個のタンパク質の相互作用を阻害する。従って、一般的には、デルタ３治療剤は、様々なトポリズムタンパク質同士の相互作用に影響を与える。同様に、少なくとも部分的には、デルタタンパク質とデルタ３治療剤以外のデルタ治療剤との間の配列および構造の類似性を利用して、デルタ３タンパク質とデルタ３相互作用結合分子との間の相互作用を調節することもできる。
本発明の化合物は、化合物の種類や所望される化合物の活性に応じて、様々なアッセイを用いて確認することができる。以下に記載しているものは、デルタ３治療剤を確認するために使用するアッセイのごく一部である。デルタ治療剤（例えば、デルタ３治療剤など）の確認のための追加のアッセイを構築することは、当業者の知識の範囲内である。
精製組換えデルタ３ポリペプチドが入手できることにより、本発明は、デルタ３の変種を含む薬物（デルタ３ポリペプチドの正常な細胞機能、あるいは細胞の分化および／もしくは増殖の発病性、ならびにそれらが関係している疾病についてのアゴニストまたはアンタゴニスト）のスクリーニングに用いることができるアッセイの開発を可能にした。ひとつの実施態様においては、このアッセイによって、ある化合物が、デルタ３ポリペプチドと分子（タンパク質またはDNAであって、デルタ／ノッチシグナル経路の上流または下流において相互作用する）との結合を調節する能力を評価する。多くのアッセイ系を使用することができ、このことは本発明に照らし合わせれば、当業者にとっては自明であろう。
4.7.1 無細胞アッセイ
無細胞系を用いてデルタ３タンパク質と相互作用する化合物を確認することができる。そのようなアッセイは、タンパク質化合物（例えば、トポリズムタンパク質またはそれらの変種など）、またペプチドミメチック、小分子または核酸のような化合物を試験する目的で利用できる。これらの化合物を試験するために用いられる特定のアッセイは化合物の種類によって異なる。
ひとつの実施例においては、デルタ３タンパク質と相互作用する化合物は、例えば、化合物ライブラリーなどについて、組換えもしくは精製デルタ３タンパク質またはそれらの少なくとも一部に結合するものをスクリーニングすることによって確認される。そのようなアッセイには、１ヶ所または２ヶ所をラベルし、例えば、その１個または２個のラベルのレベルを測定するなどによってそれらの相互作用の有無を測定することを含む。これらのアッセイにおいては、デルタ３タンパク質を固相表面に固定することが好ましい。このアッセイを行う方法については以下に詳細に記載している。ひとつの実施例においては、化合物のライブラリーは小分子のライブラリーである。別の実施態様においては、化合物のライブラリーは、以下に記載している方法に従って産生されるデルタ３の変種のライブラリーである。
デルタ３タンパク質とトポリズムタンパク質との間の相互作用を阻害する化合物の確認は、例えば、フェホン（Fehon）ら（Cell 61: 523-534 (1990)）によって記載されている凝集アッセイを用いて化合物をスクリーニングすることによっても行うことができる。
別の実施態様においては、本発明は、デルタ３と分子（例えば、トポリズムタンパク質またはデルタ３タンパク質の細胞質性ドメインと相互作用するタンパク質など）との相互作用を阻害する化合物を確認する方法を提供する。そのような方法、好ましくは大量アッセイに用いられる方法は次のように行うことができる。
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいては、一定時間内に調査する化合物の数を可及的に多くするために、大量アッセイであることが望ましい。精製されたまたは準精製されたタンパク質に基づくような無細胞系において行われるアッセイは、「一次」スクリーニングとして適しており、これは、試験化合物による分子標的の変化が迅速に起こり、比較的容易に検出できるためである。さらに、試験化合物の細胞毒性および／または生物学的活性の影響はインビトロ（in vitro）系では一般に無視することができ、アッセイの焦点は主として、上流または下流の因子との結合親和性の変化として現れる、分子標的における薬物の影響に向けられる。従って、本発明のスクリーニングアッセイの一例においては、対象化合物を上流（活性の賦活剤および抑圧剤を含む）で作用するタンパク質、またはデルタ３ポリペプチドの下流で作用するタンパク質もしくは核酸（これらが対象化合物によって正または負のいずれの制御を受けるものであっても）に接触させる。例えば、デルタ３ポリペプチドの上流に作用するタンパク質は、デルタ３分子の細胞外部分と相互作用する化合物である。デルタ３ポリペプチドの下流で作用するタンパク質は、デルタ３の細胞性ドメインと相互作用するタンパク質であり、例えば、核にシグナルを伝達する。次に、この化合物と上流の因子または下流の因子との混合物にデルタ３ポリペプチドを含有する組成物を加える。デルタ３とその上流因子または下流因子とのコンプレックスを検出および測定することにより、該化合物によるデルタ３とデルタ３結合因子との間のコンプレックス形成の阻害（または促進）の効率を測定する手段を提供することになる。該化合物の効率は、種々の濃度の試験化合物を用いて得られたデータから投与量依存曲線を作成することによって評価することができる。さらに、対照アッセイを行って比較のベースラインを求めることもできる。対照アッセイにおいては、デルタ結合因子を含有する組成物に単離精製されたデルタ３ポリペプチドを添加し、試験化合物不存在の状態でコンプレックスの形成を定量する。
デルタ３ポリペプチドとデルタ３結合因子との間のコンプレックスの形成は、様々な技術によって検出することができる。コンプレックス形成の調節は、例えば、検出可能なラベルしたタンパク質（放射ラベル、蛍光ラベルまたは酵素ラベルしたデルタ３ポリペプチドなど）を免疫アッセイまたはクロマトグラフィー検出することによって定量することができる。
一般的には、デルタ３またはその結合タンパク質を不動化して、タンパク質の一方または両方によるコンプレックス非形成型からコンプレックスを分離できるようにし、さらに、アッセイの自動化が行えるようにすることが望ましい。候補化合物の存在下または不在下におけるデルタ３の上流因子または下流因子への結合は、反応物質を入れるのに適した任意の容器内で行うことができる。そのような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、および微量遠心分離管などが挙げられる。ひとつの実施例においては、融合タンパク質を用いて、タンパク質がマトリックスに結合することができるようなドメインを加える。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／デルタ３（GST／デルタ）融合タンパク質はグルタチオンセファロースビーズ（シグマ・ケミカル（Sigma Chemical）社、ミズーリ州セント・ルイス）またはグルタチオン誘導マイクロタイタープレートに吸着することができ、次に、例えば３５Ｓラベルした細胞溶解物と試験化合物とを混合し、コンプレックス形成を誘導するような条件（例えば、塩濃度およびpHに関する生理学的条件）下において混合物をインキュベートするが、よりストリンジェントな条件の方が望ましい。インキュベーション後、ビーズを洗浄して未結合のラベルを除去し、マトリックスを不動化し、放射ラベルを直接測定（例えば、ビーズをシンチレーションカウンターに入れるなどして）するかまたは、コンプレックスを解離させた後の上清を測定する。別の方法としては、コンプレックスをマトリックスから解離し、SDS-PAGEによって分離し、以下の実施例に記載しているような標準的な電気泳動法を用いて、ビーズフラクションに見出されるデルタ結合タンパク質のレベルをゲルから定量する。
マトリックス状にタンパク質を不動化するその他の技術もアッセイにおいて用いることができる。例えば、デルタ３またはそれと同種の結合タンパク質は、ビオチンおよびストレプトアビジンのコンジュゲートを用いて不動化することができる。例えば、ビオチニル化デルタ３分子は、当該分野において既知の技術（例えば、ビオチニル化キット（ピアス・ケミカル（Pierce Chemica1l）社、イリノイ州ロックフォードなど）を用いて、ビオチン−NHSから調製することができ、ストレプトアビジンでコートした96穴プレート（ピアス・ケミカル（Pierce Chemica1l）社）のウェル内に不動化する。別の方法としては、デルタ３とは反応するが、上流因子または下流因子との結合を干渉しない抗体をプレートのウェルに導入し、抗体コンジュゲーションによってデルタ３をウェル内に捕獲する。上述しているように、デルタ結合タンパク質および試験化合物の調製は、プレートのデルタ存在ウェル内においてインキュベートすることによって行い、ウェルに捕獲されたコンプレックスの量を定量することができる。上述したGST不動化コンプレックス法に加えて、そのようなコンプレックスを検出する方法の例としては、デルタ３結合因子と反応する、またはデルタ３タンパク質と反応し、結合因子と競合する抗体を用いたコンプレックスの免疫検出、また、結合因子が関与している酵素活性（内因活性または外因活性のいずれか）を検出することによる酵素連結アッセイなどが挙げられる。後者の場合においては、酵素は、デルタ−BPと化学的にコンジュゲートするかまたは融合タンパク質として得られる。具体的に説明すると、デルタ−BPをホースラディッシュパーオキシダーゼと化学的に連結させるか、または遺伝子的に融合させ、コンプレックス内に捕獲されたペプチドの量は、酵素の発色性基質（例えば、３，３’−ジアミノ−ベンザディン テトラヒドロクロリドまたは４−アルコール−１−ナフトールなど）を用いて評価することができる。同様に、ポリペプチドとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとを含む融合タンパク質を作出することができ、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンを用いてGST活性を検出することによってコンプレックスの形成を定量することができる（ハビック（Habig）ら、(1974) J Biol Chem 249: 7130）。
コンプレックスに捕獲されているタンパク質の内のひとつを定量するための免疫検出に基づく方法においては、タンパク質に対する抗体（例えば、抗デルタ３抗体など）を用いることができる。別の方法としては、コンプレックス内の検出しようとするタンパク質は、融合タンパク質の「エピトープタグ」型をとることができ、これは、デルタ３配列に加えて、既成の抗体（例えば、メーカーから購入するなどして）が入手可能な第二のペプチドを含んでいる。例えば、上述のGST融合タンパク質は、GST部位に対する抗体を利用した結合の定量に用いることができる。その他の有用なエピトープタグとしては、c-myc由来の10残基配列を含むmyc-エピトープ（例えば、エリソン（Ellison）ら、(1991) J Biol Chem 266: 21150-21157などを参照）、ならびに、pFLAG系（インターナショナル・バイオテクノロジー（International Biotechnology）社）またはpEZZタンパク質A系（ファルマシア（Pharmacia）社、ニュージャージー州）が挙げられる。
4.7.2 細胞に基づくアッセイ
上述したような無細胞系アッセイに加えて、本発明によって提供される入手容易なデルタ３タンパク質源は、小分子アゴニスト／アンタゴニストおよびそれに類似するものを確認するための細胞に基づくアッセイも可能にする。例えば、bFGF／VEGFまたはマトリゲルに感受性の細胞は、対象試験物質の存在下または不在下において組換えデルタ３タンパク質の過剰発現を起こし、試験物質を介しての標的細胞によるデルタ３応答の調節を評価するアッセイとなる。無細胞系アッセイの場合と同様に、デルタによる応答における変化（阻害性または増強性）が統計学的に顕著な物質を確認することができる。実施態様のひとつの例としては、デルタ３の発現または活性は胚または細胞内において調節されており、対象となる事象（組織の分化、増殖、腫瘍化など）についての対象化合物の効果を測定する。具体的には、デルタ依存性シグナルカスケードに対する応答が高くなるように、または低くなるように制御されている遺伝子の発現をアッセイすることなどが挙げられる。好ましい実施態様においては、そのような遺伝子の制御領域（例えば、５’フランキングプロモーターおよびエンハンサー領域など）は、容易に検出できる遺伝子産物をコードしている検出可能なマーカー（ルシフェラーゼなど）に機能発揮できるように連結する。
細胞系の例としては、MVECおよびウシ大動脈上皮細胞（BAEC）などの上皮細胞ならびにHeLa細胞およびCOS細胞（例えば、COS-7（ATCC番号 CRL-1651）など）などの一般的な哺乳類細胞が挙げられる。さらに、本明細書に記載しているトランスジェニック動物を用いて細胞系を確立することもでき、これは、心血管系疾患に関与しているひとつまたはそれ以上の細胞型を含んでおり、このような疾患の細胞培養モデルとして用いることができる。本発明のトランスジェニック動物由来の一次培養細胞を使用することはできるが、連続継代した細胞系の方が好ましい。トランスジェニック動物から連続した細胞系を得る方法の例としては、スモール（Small）ら（1985, Mol. Cell Biol. 5: 642-648）を参照のこと。
ひとつの実施態様においては、デルタ３活性を変化させる試験化合物を確認するには、デルタ３タンパク質を含んだ細胞を該試験化合物とインキュベートし、デルタ３タンパク質からのシグナル伝達を測定する。試験化合物の有無の場合、インキュベートした細胞内のシグナル伝達を比較することによって、試験化合物がデルタ３治療性であるか否かが明らかになる。同様に、デルタ３活性を変化させる試験化合物の確認には、デルタ３リガンドを有する細胞を試験化合物（例えば、デルタ３由来の化合物など）とインキュベートし、デルタ３リガンドからのシグナル伝達を測定する。試験化合物の有無に応じてインキュベートした細胞内のシグナル伝達を比較することによって、試験化合物がデルタ３治療性であるか否かが明らかになる。
デルタ３タンパク質が単独で、または他のタンパク質とのコンプレックスとして、DNAと結合することができ、および／または遺伝子の転写を変化させることができる場合には、転写に基づくアッセイを用いることができ、この場合には例えば、デルタ３応答性調節配列を検出可能なマーカー遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子など）に機能発揮できるように連結する。同様に、細胞上のデルタ３リガンドへのデルタ３タンパク質の結合によって調節されている遺伝子の発現をモニターするようなアッセイを用いて、デルタ３治療剤を確認することも可能である。デルタ３タンパク質またはデルタ３リガンドとの相互作用に応答する遺伝子は、当該分野において既知の方法（例えば、ディファレンシャルハイブリダイゼーションまたはディファレンシャルディスプレイなど）に従って確認することができる。
別の実施態様においては、マイクロフィジオメーター（microphysiometer）と呼ばれるシリコンに基づく装置を用いて、デルタ３タンパク質を有する細胞の試験化合物に対する応答を検出、測定することによってデルタ３治療剤を確認することができる。この装置は、細胞の成長および／または分化を示す細胞の周囲環境の酸性化の割合を測定する装置である（マクコネル（McConnel）ら、(1992) Science 257: 1906）。
細胞に対する化合物の影響をモニターすることは、基礎的な薬物スクリーニングのみならず、臨床試験にも応用することができる。そのような臨床試験においては、一連の遺伝子の発現を特定の薬物の治療効果の「読み出し（リードアウト）」として用いることができる。
本発明を別の観点からみると、デルタ３ポリペプチドを用いて「ツーハイブリッド」アッセイ（例えば、米国特許第5,283,317号；ザーヴォス（Zervos）ら、(1993) Cell 72: 223-232；マドゥラ（Madura）ら、(1993) J Biol Chem 268: 12046-12054；バーテル（Bartel）ら、(1993) Biotechniques 14: 920-924；イワブチ（Iwabuchi）ら、(1993) Oncogene 8: 1693-1696；およびBrent WO 94/10300）を構築することができ、これによって、デルタ３に結合する、またはデルタ３と相互作用する（「デルタ結合タンパク質」または「デルタ−bp」と呼ばれる）ノッチなどのようなその他の細胞性タンパク質をコードしている配列を単離することができる。概説すると、ツーハイブリッドアッセイは、２個の別異の融合タンパク質由来の機能性転写アクチベータータンパク質をインビボ（in vivo）において再構成することに基づいている。特に、この方法は、ハイブリッドタンパク質を発現するキメラ遺伝子の作成に用いられる。具体的に述べると、第一のハイブリッド遺伝子はデルタ３ポリペプチドをコードしている配列のフレーム内に融合した転写アクチベーターのDNA結合ドメインをコードしている配列を有する。第二のハイブリッドタンパク質は、cDNAライブラリー由来のサンプル遺伝子のフレーム内に融合した転写アクチベータードメインをコードしている。この転写アクチベーターとサンプルのハイブリッドタンパク質が相互作用することができる（例えば、デルタ依存性コンプレックスを形成する）と、転写アクチベーターの２つのドメインは互いに接近する。この接近は、転写アクチベーターに反応する転写制御部位に機能発揮できるように連結されているレポーター遺伝子の転写を開始させるのに十分なものであり、レポーター遺伝子の発現は測定可能であり、デルタ３とサンプルタンパク質との相互作用の評価に用いることができる。この系を用いて、１個の試験化合物を上述のプラスミドを含有する細胞に添加することにより、例えば、デルタ３タンパク質と他のタンパク質との間の相互作用を阻害するなどの変形を行う化合物を確認することができる。レポーター遺伝子の発現に関する試験化合物の効果を確認し、次に、相互作用に対する試験化合物の効果を確認した。
別の実施態様においては、本発明は、デルタ３タンパク質を介して細胞のアポトーシスを誘導する化合物を認識するためのアレイを提供する。アポトーシスのアレイは当該分野において既知であり、グリム（Grimm）ら（(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10923）によって記載されている。
4.8 トランスジェニック動物
これらの系は様々に応用することができる。例えば、細胞に基づくモデル系および動物に基づくモデル系を用いて、デルタ３遺伝子およびタンパク質の特徴ををさらに明らかにすることができる。さらに、そのようなアッセイは、疾患の症状を改善することができきる化合物を確認するために組み立てられたスクリーニング法の一部として利用することができる。 このようにして、細胞に基づくモデル系および動物に基づくモデル系を用いて、薬剤、製剤、治療および疾患の治療に有効な介在物を確認することができる。
4.8.1 動物に基づく系
ひとつの観点からみると、本発明は、本発明のトランスジーン（導入遺伝子）を含む細胞を有し、好ましくは（追加として）動物の体内の１個またはそれ以上の細胞が外来性のデルタ３タンパク質を発現するトランスジェニック動物に関する。デルタ３トランスジーンは野生型のタンパク質をコードすることができ、あるいはデルタ３遺伝子の両方のアレル（アゴニストおよびアンタゴニスト）ならびにアンチセンス構築体を含むそれらのホモログをコードすることができる。好ましい実施態様においては、トランスジーンの発現は、特定の細胞の集合、組織、または用いる発達の段階（例えば、所望するパターンの発現を制御するシス作用配列など）に制限されている。本発明においては、デルタ３タンパク質のそのようなモザイク発現は、多くの直接分析において必須であり、さらに、例えば、デルタ３の発現の欠如などの効果を評価する手段を提供する。例えば、デルタ３の発現が欠如すると、正常な胚ではあるが、その中の組織の小部分の発達が大きく変化することになる。好ましい実施態様においては、本発明は、ACCPNに関連のあるｈデルタ３遺伝子のアレルを有するトランスジェニックマウスを提供し、そのマウスを用いて例えば、この特定のｈデルタ３アレルの影響を測定する。このために、組織特異的調節配列および条件調節配列を用いて、ある空間パターンにおける導入遺伝子の発現を調節することができる。さらに、例えば、条件組換え系または原核細胞性転写制御配列などによって一次的な発現パターンがもたらされる。
インビボ（in vivo）における部位特異的な遺伝子操作を介して調節することができるトランスジーンを発現させる遺伝子技術は当業者において既知である。例えば、標的遺伝子の遺伝子組換えを触媒する組換え酵素を調節しながら発現させるような遺伝子系が可能である。本明細書において使用している「標的配列」とは、組換え酵素によって遺伝的に組換えられたヌクレオチド配列をさす。標的配列は、組換え酵素認識配列に挟まれており、一般的には、組換え酵素活性を発現する細胞内において切除されるかまたは転化される。組換え酵素によって触媒される組換えを設計して、標的遺伝子の組換えがデルタ３タンパク質の内のひとつの発現を活性化または抑制されるようにする。例えば、組換えデルタ３遺伝子の発現を妨害する標的配列（例えば、アンタゴニストホモログまたはアンチセンス転写物をコードしている遺伝子など）が切除されるように設計して、デルタ３遺伝子の発現を活性化することができる。タンパク質の発現に対するこのような妨害は、プロモーター因子または内部停止コドンからデルタ３遺伝子が空間的に分離していることなどといった様々なメカニズムによるものである。さらに、遺伝子のコード配列が組換え酵素認識配列によって挟まれるようにし、当初は、プロモーター因子に関して３’→５’方向になるように細胞にトランスフェクションすることによってトランスジーンを作成することもできる。そのような場合には、標的配列の転置によって目的の遺伝子の向きが再び変えられる。すなわち、コード配列の５’端がプロモーターの向きにあわせられることにより、プロモーターによって導かれる転写活性化が可能となる。
本発明のトランスジェニック動物は、該動物の多数の細胞内に本発明のトランスジーンを全て含んでおり、このトランスジーンは、細胞の増殖、死亡および／または分化の制御に関して「宿主細胞」の表現型を変化させる。本明細書に記載されている１個またはそれ以上のトランスジーン構築体を用いて、本発明のトランスジェニック生物を作出することが可能であることから、外因性の遺伝子材料について言及することにより、トランスジェニック生物の作出についての一般的な説明を行う。当業者であれば、この一般的な説明を適合させて、以下に記載している方法および材料を利用し、生物に特定のトランスジーン配列を組み込むことができるであろう。
実施態様の例としては、バクテリオファージP1のcre/loxP組換え酵素系（ラクソ（Lakso）ら、(1992) PNAS 89: 6232-6236：オーバン（Orban）ら、(1992) PNAS 89: 6861-6865）またはビール酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）のFLP組換え酵素系（オゴーマン（O'Gorman）ら、(1991) Science 251: 1351-1355；PCT公報 WO 92/15694）のいずれかを用い、インビボ（in vivo）において部位特異的遺伝子組換え系を作出することができる。Cre組換え酵素は、loxP配列内に存在している干渉標的配列の部位特異的組換えを触媒する。loxP配列は、34塩基対のヌクレオチド反復配列であり、ここにCre組換え酵素が結合し、遺伝子組換えを仲介するCre組換え酵素には必須である。Cre組換え酵素が存在している場合には、loxP配列の方向によって、干渉標的配列が切除されるか方向転換されるかが決まる（アブレムスキ（Abremski）ら、(1984) J. Biol. Chem. 259: 1509-1514）。loxP配列が直接反復方向をとっている場合には、標的配列を切除するように触媒し、loxP配列が逆反復方向をとっている場合には、標的配列を方向転換するように触媒する。
すなわち、標的遺伝子の遺伝子組換えは、Cre組換え酵素の発現に依存するものである。組換え酵素の発現はプロモーター因子によって制御することができ、このプロモーター因子とは、例えば、組織特異的、発達段階特異的、外部からの添加物質による誘導または抑制などを制御調節するものである。この制御調節は、組換え酵素の発現がプロモーター因子によって仲介されている細胞内においてのみ、標的配列の遺伝子組換えを起こす。従って、組換えデルタ３タンパク質の発現の活性化は、組換え酵素の発現を調節することによって制御することができる。
cre/loxP組換え酵素系を用いて組換えデルタ３タンパク質の発現を制御するためには、Cre組換え酵素および目的とするタンパク質の両方をコードしているトランスジーンを有するトランスジェニック動物の構築が必要である。Cre組換え酵素および組換えデルタ３遺伝子の両方を有する動物は、「ダブル」トランスジェニック動物を構築することによって得られる。そのような動物を得るための簡便な方法は、それぞれひとつのトランスジーン、例えば、デルタ３遺伝子および組換え酵素遺伝子などを有する二種のトランスジェニック動物を交配することである。
組換え酵素を介する発現様式でデルタ３トランスジーンを含有するトランスジェニック動物を最初に構築することのひとつの利点は、目的のタンパク質（アゴニストまたはアンタゴニストのいずれであっても）がトランスジェニック動物内で発現に際して有害なものになり得るという可能性に由来する。そのような場合には、全組織において目的のトランスジーンがサイレントである基礎集団を増殖、維持できることである。この基礎集団の中のそれぞれの個体を、例えば、ひとつもしくはそれ以上の組織ならびに／または所望する一時的なパターンで組換え酵素を発現する動物と交配することができる。従って、例えば、アンタゴニスト性デルタ３トランスジーンがサイレントであるような基礎集団を確立することによって、特定の組織または特定の発達段階においてデルタ３を介した誘導が破壊されていることにより、例えば、致死的表現型を発現するような基礎集団からの子孫を調べることができる。
同様な条件付トランスジーンは原核細胞性プロモーター配列、すなわち、デルタ３トランスジーンを発現するためには、同時に発現する原核細胞性タンパク質を必要とする配列を用いることによって提供することもできる。プロモーターの例および対応するトランス活性原核細胞性タンパク質については、米国特許第4,833,080号に記載されている。
さらに、条件付トランスジーンの発現は、遺伝子治療に類似した方法によって誘導することができ、この場合、例えば、組換え酵素または原核細胞性タンパク質などのトランス活性タンパク質をコードしている遺伝子を、細胞型に特異的な方法などによって組織に輸送し、発現を起こさせる。この方法によれば、トランスアクチベーターの導入によって「スイッチが入れられる」まで、デルタ３トランスはサイレントのまま成体になる。
実施態様のひとつの例としては、本発明の「ヒト以外のトランスジェニック動物」は、ヒト以外の動物の生殖細胞系列にトランスジーンを導入することによって産生される。様々な発達段階にある胚の標的細胞を用いることによって、トランスジーンを導入することができる。胚の標的細胞の発達段階に応じて異なる方法を用いる。本発明の実施に使用する任意の動物の特定の細胞系は、一般的に、健康で、胚の収量が多く、胚内において前核がよく見え、再生適合性がよいことを基準として選択する。それに加えて、ハプロタイプも重要な因子である。例えば、トランスジェニックマウスを作出する場合には、C57BL/6またはFVBなどの系統がよく用いられる（ジャクソン・ラボラトリー（Jackson Laboratory）社、メイン州バーハーバー）。好ましい系統は、C57BL/6またはDBA/1などのH-2ｂ、H-2ｄ、またはH-2ｑといったハプロタイプを有するものである。本発明の実施に使用する系統は、それ自身がトランスジェニック体であり、および／またはノックアウト体（すなわち、ひとつまたはそれ以上の遺伝子が部分的にまたは完全に抑制されている動物から得られたもの）である。
ひとつの実施態様においては、トランスジーン構築体を単一段階の胚に導入する。接合子はマイクロインジェクションの最適の標的である。マウスにおいては、雄の前核は直径およそ20μｍになり、これは、１〜２plのDNA溶液の注入によって再生可能である。トランスジーンの標的として接合子を使用することには大きな利点があり、それは、ほとんどの場合において、注入されたDNAは第１回目の分裂の前に宿主遺伝子に取り込まれることである（ブリンスター（Brinster）ら、(1985) PNAS 82: 4438-4442）。つまり、トランスジェニック動物の全ての細胞が組み込まれたトランスジーンを有していることになる。生殖細胞の50％がトランスジーンを保持していることから、一般的にこのことは、基礎集団の子孫へのトランスジーンの効率的な伝達としても現れている。
通常、受精した胚は、前核が現れるまで適切な培地内でインキュベートする。この時期になると、トランスジーンを有するヌクレオチド配列は、以下に記載しているように、雌または雄の前核に導入される。マウスなどのようないくつかの種においては雄の前核が好ましい。最も好ましくは、卵細胞核または接合子雌前核が形成される前に接合子の雄のDNA補体に外因性遺伝子材料を添加する。卵細胞核または雌の前核は、雄のDNA補体に作用する分子を放出すると考えられ、これはおそらく、雄のDNAのプロタミンがヒストンと入れ替わることにより、雌および雄のDNA補体が組み合わさって二倍体接合子を形成するためである。
従って、雌の前核によって影響を受ける前に、DNAの雄の補体またはその他任意のDNAの補体に外因性の遺伝子材料を添加することが好ましい。例えば、雄の前核の形成−これは、雄および雌の前核が完全に分離し、両者が細胞膜の近辺に存在している時である−後できる限り早期に、初期の雄の前核へ外因性の遺伝子材料を添加する。別の方法としては、脱縮合が誘導された後に、精子の前核に外因性の遺伝子物質を添加することができる。次に、外因性の遺伝子材料を有する精子を卵細胞に添加するか、または、脱縮合した精子を卵細胞に添加し、その後できる限り早くトランスジーン構築体を添加する。
胚への導入遺伝子ヌクレオチド配列の導入は、例えば、マイクロインジェクション（微量注入）、エレクトロポレーション（電気穿孔）またはリポフェクションなどのような当該分野において既知の任意の方法によって行うことができる。胚への導入遺伝子ヌクレオチド配列の導入後、胚はインビトロ（in vitro）において様々な期間インキュベートし、または代理宿主へ再移植し、またはこの両方を行う。インビトロ（in vitro）インキュベーションによって成熟させることは本発明の範ちゅうに含まれる。一般的なひとつの方法としては、種に応じて、胚をインビトロ（in vitro）において約１〜７日間インキュベートし、次に代理宿主に再移植する。
本発明の目的のためには、接合子は、完全な成体に発達することができる二倍体細胞の形成に必須である。一般的には、接合子は卵子を有しており、この卵子は、ひとつのまたは複数の配偶子に由来する２個の半数体の核の融合によって、自然にまたは人工的に形成される核を有する。配偶子核は、本来、和合性、すなわち、機能することができる成体に分化、発達することができる生育性の接合子になるものである。一般的には、倍数体の接合子が好ましい。もし異数倍数体の接合子が得られた場合には、染色体数は、いずれかの配偶子が由来している成体の倍数体の数に関して、１に変化してはならない。
同様の生物学的配慮に加えて、物理的な配慮によっても外因性の遺伝子材料の量（例えば、容量など）が左右される。この外因性遺伝子材料とは、接合体の核または接合体の核の一部を形成する遺伝子材料に添加されるものである。遺伝子材料を除去しない場合には、添加することができる外因性の遺伝子材料の量は、物理的に破壊されることなく吸収されるであろう量によって制限される。一般的には、挿入する外因性遺伝子材料の容量は10ピコリットルを超えない。添加による物理的影響は、接合子の生育性を物理的に破壊するほど大きいものであってはならない。DNA配列の数および種類に関する生物学的限度は、特定の接合子および外因性遺伝子材料に応じて異なり、当業者においては自明であるが、これは、得られた接合子の外因性遺伝子材料を含む遺伝子材料が、接合子の分化および発達を開始および持続して機能性の生体に至る生物学的能力を有しているからである。 接合子に添加したトランスジーン構築体のコピー数は、添加した外因性遺伝子材料の総量によって決まり、遺伝子の形質転換を起こし得る量である。理論的には、１個のコピーを機能発揮させるためには、１個のコピーのみを必要とするが、通常は、多数のコピー、例えば、1,000−20,000個のトランスジーン構築体のコピーを使用する。本発明においては、挿入した外因性DNA配列の各々が１個以上の機能性のコピーを有していることが好ましく、それよって外因性DNA配列の表現型の発現が増強される。
細胞、核膜、またはその他存在する細胞性または遺伝子構造体を破壊しない限りは、外因性遺伝子材料を核の遺伝子材料に添加することができる任意の技術を用いることができる。外因性遺伝子材料は、マイクロインジェクションによって核の遺伝子材料内に挿入することが好ましい。細胞および細胞の構造体へのマイクロインジェクションは当該分野において既知であり、利用されている。
再移植は、標準的な方法によって行うことができる。通常、代理宿主に麻酔をかけ、卵管に胚を挿入する。特定の宿主に移植する胚の数は種によって異なるが、一般的には、その種が自然に出産する子孫の数に対応する。
任意の適切な方法によって、代理宿主のトランスジェニック子孫をスクリーニングして、トランスジーンの存在および／または発現を調べる。スクリーニングは、トランスジーンの少なくとも一部に相補的なプローブを用い、サザンブロット分析またはノーザンブロット分析によって行うことが多い。トランスジーン産物の存在をスクリーニングする別のまたは追加の方法として、トランスジーンによってコードされたタンパク質に対する抗体を用いたウェスタンブロット分析も用いられる。一般的には、DNAは尾の組織から調製し、サザン分析またはトランスジーンについてのPCRによって分析する。別の方法としては、サザン分析またはPCRを用いて、トランスジーンを最も高レベルで発現していると考えられる組織または細胞について、トランスジーンの存在または発現を調べるが、この分析には任意の組織または細胞型を用いることができる。
トランスジーンの存在を評価する別のまたは追加の方法としては次のようなものが挙げられるが、これに限定されるわけではない：酵素および／または免疫学的アッセイなどのような適切な生化学アッセイ、特定のマーカーまたは酵素活性の組織学的染色、フローサイトメトリー分析など。血液の分析も血液中のトランスジーン産物の存在の検出に有用であり、また、様々な種類の血液細胞およびその他の血液構成成分のレベルに与えるトランスジーンの影響を評価するのにも有用である。
トランスジェニック動物の子孫は、トランスジェニック動物を適切な相手と交配させることにより、または、トランスジェニック動物から得られた卵子および／もしくは精子のインビトロ（in vitro）受精によって得ることができる。相手との交配を行う場合には、その相手はトランスジェニックおよび／もしくはノックアウトであるものもそうでないものも用いることができ、トランスジェニックの場合には、同じもしくは異なるトランスジーン、またはその両方を含んでいるものを用いることができる。別の方法としては、相手は親系統（parental line）を用いることができる。インビトロ（in vitro）受精を行う場合には、受精した胚を代理宿主に移植するかもしくはインビトロ（in vitro）でインキュベートする、またはこの両方を行う。いずれの方法を用いる場合にも、上述した方法またはその他の適切な方法を用いて、子孫についてトランスジーンの存在を評価することができる。
本発明に従って作成されたトランスジェニック動物は、外因性の遺伝子材料を含んでいる。上述しているように、ある実施態様においては、外因性の遺伝子材料は、デルタ３タンパク質（アゴニスト性またはアンタゴニスト性のいずれか）およびアンチセンス転写物またはデルタ３突然変異体を産生するDNA配列である。さらに、そのような実施態様においては、該配列は転写調節因子（例えば、プロモーターなど）に連結しており、この転写調節因子が特定の細胞においてトランスジーン産物を発現させる。
レトロウイルス感染を用い、ヒト以外の動物に導入遺伝子を導入することもできる。発生中のヒト以外の胚をインビトロ（in vitro）で培養して胞胚段階まで成長させることができる。この間、割球がレトロウイルス感染の標的となる（イェニッヒ（Jaenich）, R.、(1976) PNAS 73: 1260-1264）。割球に対する効率的な感染は、酵素処理をして透明体を除去することによって行うことができる（『マウス胚の操作（Manipulating the Mouse Embryo）』、ホーガン（Hogan）編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）社、コールド・スプリング・ハーバー、(1986)）。トランスジーンの導入に使用するウイルスベクター系は、一般的には、トランスジーンを有する複製欠損レトロウイルスである（ヤーナー（Jahner）ら、(1985) PNAS 82: 6927-6931；ヴァン・デル・パッテン（Van der Putten）ら、(1985) PNAS 82: 6148-6152）。トランスフェクションは、単層のウイルス産生細胞上で割球を培養することによって容易かつ効率的に行うことができる（ヴァン・デル・パッテン（Van der Putten）ら、同上；スチュワート（Stewart）ら、(1987) EMBO J. 6: 383-388）。別の方法としては、後の段階において感染を行うことができる。ウイルスまたはウイルス産生細胞を胞胚腔内に注入することができる（ヤーナー（Jahner）ら、(1982) Nature 298: 623-628）。ほとんどの創始（founder）個体においてトランスジーンはモザイク状になるが、これは、ヒト以外のトランスジェニック動物を形成している細胞の一部にしか取り込みが起こらないためである。さらに、創始個体は、ゲノムの様々な位置においてトランスジーン内に種々のレトロウイルス性挿入部位を含んでいることがある。さらに、妊娠中期の胚を子宮内においてレトロウイルスに感染させることによって、生殖細胞系列にトランスジーンを導入することも可能である（ヤーナー（Jahner）ら、(1982)、同上）。
トランスジーン導入の三番目の標的細胞は胚性幹（ES）細胞である。ES細胞は、インビトロ（in vitro）で培養し、胚と融合した移植前の胚から得られる（エヴァンス（Evans）ら、(1981) Nature 292: 154-156；ブラッドレー（Bradley）ら、(1984) Nature 309: 255-258；ゴスラー（Gossler）ら、(1986) PNAS 83: 9065-9069；およびロバートソン（Robertson）ら、(1986) Nature 322: 445-448）。DNAトランスフェクションまたはレトロウイルスを介した導入によってトランスジーンを効率的にES細胞に導入することができる。そのような形質転換したES細胞をヒト以外の動物由来の胞胚と組み合わせることができる。その後ES細胞は胚に入り込み、形成されるキメラ動物の生殖細胞系列に関与する、総説として、イェニッヒ（Jaenich）, R.、Science 240: 1468-1474を参照のこと。
ひとつの実施態様においては、相同組換えを用いて動物のゲノムを変化させる方法による遺伝子ターゲッティングを利用して、培養胚性幹細胞に変化をもたらすことができる。ES細胞内のデルタ３遺伝子をターゲッティングすることにより、これらの変化を動物の生殖細胞系列に導入し、キメラを作出することができる。遺伝子ターゲッティング法は、組織培養細胞内に標的デルタ３遺伝子座と相同なセグメントを含み、またデルタ３のゲノム配列を変形（例えば、挿入、欠失、点突然変異など）した目的の配列も含むDNAターゲッティング構築体を導入することによって実施することができる。処理した細胞について正確にターゲッティングされているかをスクリーニングし、正しくターゲッティングされているものを確認、単離する。
実際、胚性幹細胞についての遺伝子ターゲッティングは、ターゲッティングトランスジーン構築体を利用したデルタ２遺伝子機能の破壊手段として本発明によって企図された方法であり、このターゲッティングトランスジーン構築体は、１個またはそれ以上のデルタ３のゲノム配列と相同な組換えを行うように設計されている。ターゲッティング構築体は、デルタ３遺伝子の構成成分と組換えを行うときに標的とされるデルタ３遺伝子のコード配列に正の選択マーカーを挿入する（または置き換える）ように組み立てることができる。挿入された配列は機能的にデルタ３遺伝子を破壊すると共に、正の選択性を提供する。デルタ３ターゲッティング構築体の例については以下により詳しく記載している。
一般的には、ノックアウト動物の作出に使用する胚性幹細胞（ES細胞）は、作出すべきノックアウト動物と同じ種のものである。故に例えば、ノックアウトマウスの発生には通常マウスの胚性幹細胞を使用する。
胚性幹細胞は、当業者に既知の方法（例えば、デシュマン（Doetschman）ら、(1985) J. Embryol. Exp. Morphol. 87: 27-45など）を用いて発生させ、維持する。任意の系統のES細胞を用いることができるが、系統の選択は、通常、細胞が発達している胚の生殖細胞系列に組み込み、その一部となる能力に基づいて選択し、ノックアウト構築体の生殖細胞系列の形質遺伝が行われるようにする。従って、本発明における使用に適しているのは、このような能力を有すると考えられる任意のES細胞系である。一般的にES細胞の産生に使用されるマウスの系統は129Jである。別のES細胞系はマウス細胞系D3（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）、カタログ番号CKL1934）である。また別の好ましいES細胞系はWW6細胞系である（イオフェ（Ioffe）ら、(1995) PNAS 92: 7357-7361）。当業者において既知の方法を用いてノックアウト構築体を挿入するため、細胞を培養、調製する。そのような方法としては、例えば、ロバートソン（Robertson）による『奇形癌および胚性幹細胞：実験的アプローチ（Teratodcarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach）』、E. J. ロバートソン（Robertson）編、IRLプレス（IRL Press）社、ワシントンD.C.(1987)；ブラッドレー（Bradley）ら、(1986) Current Topics in Devel. Biol. 20: 357-371；およびホーガン（Hogan）ら、『マウス胚の操作：実験室マニュアル（Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual）』、編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）社、コールド・スプリング・ハーバー、(1986)などがある。
ES細胞へのノックアウト構築体の挿入は、当該分野において既知の様々な方法、例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションおよびリン酸カルシウム処理などを用いて行うことができる。好ましい挿入方法はエレクトロポレーションである。
細胞内に挿入された各々のノックアウト構築体は、最初は直線状である。それ故、ノックアウト構築体をベクター内に挿入した場合（以下に記載）には、ベクター配列内のみを切断し、ノックアウト構築体配列内は切断しないように選択した適切な制限エンドヌクレアーゼを用いてDNAを切断することによって直線状にする。
挿入に際しては、選択した挿入方法に応じた適切な条件下においてノックアウト構築体をES細胞に添加するが、そのような条件は当業者において既知である。１個以上の構築体をES細胞に導入する場合には、各ノックアウト体を同時に、または一度に一個ずつ導入することができる。
ES細胞にエレクトロポレーションを行う場合には、エレクトロポレーション装置を使用してES細胞およびノックアウト構築体DNAに電気パルスをあて、使用にあたってはメーカーの説明書に従う。エレクトロポレーション後、一般的には、適切なインキュベーション条件下においてES細胞を回復させる。次に、細胞をスクリーニングして、ノックアウト構築体の存在するものを選ぶ。
スクリーニングは様々な方法を用いて行うことができる。例えば、マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子である場合には、耐性遺伝子が存在しなければ致死的な濃度の抗生物質の中でES細胞を培養する。生存したES細胞はノックアウト構築体が組み込まれているものと考えられる。マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子以外のものである場合には、マーカー配列にのみハイブリダイズするように設計されたDNA配列を用いたES細胞ゲノムDNAのサザンブロットによって調べることができる。別の方法としては、PCRを用いることができる。最後に、マーカー遺伝子が活性が検出可能な酵素をコードしている遺伝子である場合には、適切な条件下で酵素の基質を細胞に添加し、その酵素活性を分析する。当業者であれば、その他の有用なマーカーおよび与えられた細胞内においてその存在を検出する方法は既知である。そのような全てのマーカーは、本発明の教示の範ちゅうに含まれるものと考える。
ノックアウト構築体は、ES細胞ゲノム内の数カ所に組み込まれ、また、ランダム挿入が起こることから、ES細胞の各ゲノムの異なる位置にも組み込まれている可能性がある。挿入の所望される位置とは、ノックアウトのDNA配列に対して相補的な位置内（たとえば、デルタ３コード領域、転写制御配列など）である。一般的には、実際にES細胞が所望される位置にノックアウト構築体を取り込んでいるのは、ノックアウト構築体を取り込んだ細胞の内の約１〜５％以下である。ノックアウト構築体を正しく組み込んでいるこれらのES細胞を確認するため、標準的な方法を用いてES細胞から総DNAを抽出する。次に、特定の制限酵素を用いて切断したゲノムDNAに対して特異的パターンでハイブリダイズするように設計されたプローブまたはプローブ群を用いたサザンブロットによってDNAを調べる。別の方法としては、または追加として、特定の大きさおよび配列のDNA断片を増幅するように特別に設計されたをプローブまたはプローブ群を用いたPCRによってゲノムDNAを増幅する（すなわち、正しい位置にノックアウト構築体を含む細胞のみにおいて正しい大きさのDNA断片が得られる）。
正しい位置にノックアウト構築体を含む適切なES細胞を確認した後、細胞を胚内に挿入する。挿入は当業者において既知の様々な方法を用いて行うことができるが、好ましい方法はマイクロインジェクションである。マイクロインジェクションに際しては、約10〜30個の細胞をマイクロピペットに集め、適切な発生段階にあって、発生中の胚にノックアウト構築体を有する外来性のES細胞を取り込むことができるような胚内に注入する。例えば、以下の実施例に記載しているように、形質転換したES細胞を胞胚にマイクロインジェクションすることができる。
ES細胞の挿入に用いる胚の適切な発生段階は種によって異なるが、マウスでは約3.5日である。胚は、妊娠している雌の子宮を潅流することによって得る。これを実施する適切な方法は当業者において既知であり、例えば、ブラッドレー（Bradley）らなどによって記載されている。
発生の正しい段階にあるいずれの細胞も使用に適しているが、好ましい胚は雄である。マウスにおいては、好ましい胚は、ES細胞遺伝子によってコードされている毛色とは異なる毛色をコードしている遺伝子を有する。このようにして、モザイクの毛色（これは、発生中の胚内にES細胞が組み込まれたことを示している）を探すことによって、子孫に関してノックアウト構築体の存在を容易にスクリーニングすることができる。従って、例えば、ES細胞系が白色の毛皮に対する遺伝子を持っている場合には、選択される胚は黒色または茶色の毛皮に対する遺伝子を有するものである。
ES細胞を胚に導入した後、偽妊娠した養母の子宮内に胚を移植して懐胎させる。如何なる養母を用いてもよいが、出産、繁殖能力および子を保育する能力によって選択するのが一般的である。そのような養母は、一般的には、精管切除した同種の雄と交配して得る。養母のこのような偽妊娠段階は移植の成功の鍵であり、種依存性である。マウスにおいては、この段階は偽妊娠２〜３日目である。
養母から生まれた子は、毛色選択法を用いた場合には（上述したように、また以下の実施例に記載しているように）、まずモザイクの毛色についてスクリーニングする。さらに、または別の方法としては、上述したように、子の尾の組織から採取したDNAについて、サザンブロットおよび／またはPCRを用いてノックアウト構築体の存在をスクリーニングする。次に、モザイクと思われる子は、生殖染色体内にノックアウト構築体を有すると考えられる場合には、互いに交配してホモ接合体ノックアウト動物を得る。子の交配によって得られたマウス、ならびにヘテロ接合体であることがわかっているマウスおよび野生型マウス由来のゲノムDNAの等価量を用いてサザンブロットを行うことにより、ホモ接合体を確認することができる。
ノックアウトの子孫を確認し、性質を明らかにするために、その他の方法を用いることもできる。例えば、ノックアウト遺伝子、マーカー遺伝子またはその両方をコードしている転写物の存否を確認するため、mRNAをプローブとするノーザンブロットを用いることができる。さらに、ウェスタンブロットを用いて子孫の様々な組織におけるデルタ３遺伝子ノックアウトの発現レベルを評価することができ、これは、特定のデルタ３タンパク質に対する抗体、またはマーカー遺伝子が発現する場合のマーカー遺伝子産物に対する抗体を用いてウェスタンブロットを行うことによる。最後に、子孫由来の様々な細胞についてインサイチュ（in situ）分析（細胞を固定し、抗体でラベルするなど）および／またはFACS（蛍光活性化セルソーティング）分析を行うことができ、これは、適切な抗体を使用してノックアウト構築体遺伝子産物の在不在を確認することによる。
ノックアウト動物またはその他の遺伝子破壊動物の作出法も一般的に知られている。例えば、『マウス胚の操作（Manipulating the Nouse Embryo）』（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）社、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー、(1986)）などを参照のこと。組換え酵素依存性ノックアウトの作出も可能であり、これは例えば、デルタ遺伝子の組織特異的および／または一時的な不活化の調節を組換え酵素配列によって調節することができるように、相同性組換え体を標的配列に挿入することになどにより行う（以下に記載）。
複数のノックアウト構築体および／または複数のトランスジーン発現構築体を有する動物は、いくつかの方法の任意のものを用いて調製することができる。好ましい調製方法は、一連の哺乳類を作出し、それぞれが所望するトランスジェニック表現型の内のひとつを有するようにすることである。一連の交配、戻し交配および選択を通してそのような動物を掛け合わせ、最終的に、所望する全てのノックアウト構築体および／または発現構築体を有する一匹の動物を作出するが、子の動物は、ノックアウト構築体および／またはトランスジーンを有すること以外は野生型とコンジェニック（遺伝的に同一）である。
本発明は以下の実施例によってさらに説明されるが、これは如何なる場合においても限定するためのものではない。全ての引用文献（本明細書を通して引用されている文献、特許、公開特許出願を含む）は参考として本明細書中に取り入れておく。特に指示していない場合には、本発明の実施にあたっては、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNAおよび免疫学における従来の技術を使用し、これらは当業者の技量の範ちゅうである。そのような技術は文献に全て説明がある。例えば、『分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Culoning: A Laboratory Manual）第２版』、サンブルック（Sambrook）、フリッシュ（Fritsch）およびマニアティス（Maniatis）編、（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）社、1989）；『DNAクローニング（DNA Cloning）１巻および２巻』、D. N. グローヴァー（Glover）編（1985）；『オリゴヌクレオチド合成（Oligonucleotide Synthesis）』、M. J. ガイト（Gait）編（1984）；ムリス（Mullis）ら、米国特許第4,685,195号；『核酸ハイブリダイゼーション（Nucleic Acid Hybridization）』、B. D. ハーメス（Hames）＆S. J. ヒギンス（Higgins）編（1984）；『転写および翻訳（Transcription And Translation）』、B. D. ハーメス（Hames）＆S. J. ヒギンス（Higgins）編（1984）；『動物細胞の培養（Culture oc Animal Cells）』、R. I. フレシュニー（Freshney）（アラン R. リス（Alan R. Liss）社、1987）；『不動化細胞および酵素（Immobilized Cells and Enzymes）』（IRLプレス（IRL Press）社、1986）；B. パーバル（Perbal）『分子クローニングの実験指針（A Practical Guide To Molecular Cloning ）』(1984)；論文『酵素学における方法（Methods in Enzymology）』（アカデミック・プレス（Academic Press）社、ニューヨーク）；『哺乳類細胞のための遺伝子転移ベクター（Gene Transfer Vectors For mammalian Cells）』、J. H. ミラー（Miller）およびM. P. カロス（Calos）編(1987)（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory ）社）；『酵素学における方法（Methods In Enzymology）第154巻および155巻』、ウー（Wu）ら編；『細胞および分子生物学における免疫化学法（Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology）』、メイヤー（Mayer）およびウォーカー（Walker）編（アカデミック・プレス（Academic Press）社、ロンドン、1987）；『実験免疫学ハンドブック（Handbook of Experimental Immunology）第Ｉ〜IV巻』、D. M. ウェイア（Weir）およびC. C. ブラックウェル（Blackwell）編(1986)；『マウス胚の操作（Manipulating the Mouse Embryo）』（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）社、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー、(1986)）などを参照のこと。
５．実施例
5.1 実施例１ ｈデルタ３をコードしているcDNAの全長の単離
ヒト微小血管内皮細胞（HMVEC カタログ番号#CC2543；クローンティクス（Clonetics）社、カリフォルニア州サンディエゴ）を４つの細胞サンプルに分け、以下のように処理した。第一のサンプルは未処理とした。第二のサンプルはヒトTGF−β１（hTGF−β１）（10ng/ml）（アップステート・バイオテクノロジー（Upstate Biotechnology）社、ニューヨーク州レークプラシッド、カタログ番号01-134）で処理した。第三のサンプルはbFGF（10ng/ml）／VEGF（25ng/ml）（アップステート・バイオテクノロジー（Upstate Biotechnology）社、ニューヨーク州レークプラシッド、カタログ番号はそれぞれ01-134および01-185）で処理した。第四のサンプルはマトリゲル（Matrigel）（コラボレーティブ・バイオメディカル・プロダクツ（Collaborative Biomedical Products）、ベクトン・ディッキンソン・ラブウェア（Becton Dickinson Labware）、マサチューセッツ州ベッドフォード）上で分化させた。指示に従って細胞を24時間処理し、４つのサンプルを集め、キアゲン・RNイージーキット（QUIGEN RNeasy kit）を用いて集めた細胞からRNAを抽出した。得られたcDNAライブラリーについて大量ランダムシークエンシングを行った。このことから、次の171個のヌクレオチドからなる配列を含むcDNA断片が確認できた：

GCCCAGGCNGACCCTGGTGTGGACTGTGAGCTGGAGCTCAGCGAGTGTGACA
GCAACCCCTGTCGCANTGGAGGCAGCTGTAAGGACCANGAGGATGGCTACCA
CTGCCTGTGTCCTCCGGGCTACTACGGCNTGCATCGTGAACACNGCACCTCTT
AGCTGNGCCGACTC（配列番号21）

BLASTプログラム（アルツシュル（Altschul）ら、(1990) J. Mol. Biol. 215: 403）を用いて、GenBankの配列とこの部分的cDNAのヌクレオチド配列とを比較したところ、該ヌクレオチド配列は、デルタタンパク質と顕著な相同性を有するタンパク質断片をコードしていることが明らかになった。事実、アミノ酸配列は、ニワトリデルタ１タンパク質（GenBank受託番号U26590）、アフリカツメガエルデルタ１タンパク質（GenBank受託番号L42229）、ラットデルタ１タンパク質（GenBank受託番号U78889）、アフリカツメガエルデルタ２タンパク質（GenBank受託番号U70843）、およびノッチタンパク質と顕著な相同性を有していた。
次に、cDNAの一部（配列番号21）を用いてヒト微小血管内皮細胞（HMVEC）のcDNAライブラリをスクリーニングすることによって約3.2kbのcDNAの全長を単離した。この核酸は、1997年３月５日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection: ATCC）に寄託しており、ATCC受託番号は98348である。単離したcDNAのヌクレオチド配列は図１に示しており、配列番号1である。
BLASTプログラム（アルツシュル（Altschul）ら、(1990) J. Mol. Biol. 215: 403）を用い、EST配列データベースに対して配列番号1の核酸配列の比較を行うと、５個のESTが配列番号1の一部に対して相同性を有していることが示唆された。これらの全ては、膜透過ドメイン、すなわち、配列番号1のヌクレオチド番号1996番より下流をコードしているヌクレオチド配列の３’側に存在している。これらのESTの内の３個（受託番号はT33770、T33811およびT07963）は、配列番号1のヌクレオチド番号2044番付近から始まるヌクレオチド配列を有している。しかしながら、これら３個のESTのヌクレオチド配列は、配列番号1のヌクレオチド番号2044番から３’側の約50ヌクレオチドに関して、ｈデルタ３のヌクレオチド配列とは明らかに異なっている。この３個のESTよりもさらに下流に２個のEST（受託番号は、R32717およびT07962）が位置している。
配列番号1を有する核酸は、配列番号2を有する685個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしている。BLASTP（アルツシュル（Altschul）ら、(1990) J. Mol. Biol. 215: 403）を用い、アミノ酸配列配列番号2をGenBankの配列と比較すると、このタンパク質が、これまでに記載されているデルタタンパク質とある程度の相同性を有していることが明らかになった。図２に配列番号2を含むヒトデルタ３タンパク質、ならびにマウスのデルタ１タンパク質（受託番号X80903）、ラットのデルタ１タンパク質（受託番号U78889）、鶏のデルタ１タンパク質（受託番号U26590）、２個のアフリカツメガエルのデルタ１タンパク質（受託番号L42229およびU70843）、およびショウジョウバエのデルタ１タンパク質（受託番号AA142228）のアミノ酸配列を並べて示している。配列の比較から、ヒトデルタ３タンパク質は、デルタ３タンパク質の一般的な構造を有していることがわかった。特に、ヒトデルタ３タンパク質は、配列番号2のアミノ酸番号１番付近〜１７番付近に対応するシグナルペプチド、アミノ酸番号173番付近〜217番付近に対応するDSLモチーフ、アミノ酸番号222番付近〜250番付近に対応する第一のEGF様リピート、アミノ酸番号253番付近〜281番付近に対応する第二のEGF様リピート、アミノ酸番号288番付近〜321番付近に対応する第三のEGF様リピート、アミノ酸番号328番付近〜359番付近に対応する第四のEGF様リピート、アミノ酸番号366番付近〜399番付近に対応する第五のEGF様リピート、アミノ酸番号411番付近〜437番付近に対応する第六のEGF様リピート、アミノ酸番号444番付近〜475番付近に対応する第七のEGF様リピート、アミノ酸番号484番付近〜517番付近に対応する第八のEGF様リピート、アミノ酸番号530番付近〜553番付近に対応する膜透過ドメイン、および配列番号2のアミノ酸番号554番付近〜685番付近に対応する細胞質ドメインを有している。
デルタ１およびデルタ３タンパク質ファミリーとヒトデルタ３との間、ならびにデルタ１ファミリー内のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を比較することにより、デルタ３ファミリー内の相同性は、ヒトデルタ３とデルタ１ファミリーのいずれのものとの相同性よりも強いことが明らかになった。例えば、ｈデルタ３は、ショウジョウバエのデルタ１タンパク質とは約58％しか類似しておらず、マウスデルタ１タンパク質とは約70％類似しており、ラットのデルタ１タンパク質とは約70％類似しており、ニワトリのデルタ１タンパク質とは約68％類似しており、アフリカツメガエルのデルタ１タンパク質とは約68％類似しているが、ショウジョウバエ、マウス、ラット、ニワトリおよびアフリカツメガエルのデルタ１タンパク質は互いに非常に類似している（例えば、マウスとラットとは約96％類似している）。公開されているPCT出願WO97/01571には、デルタ１ファミリーと顕著な相同性を有するタンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一部を開示しており、ヒトデルタ１タンパク質の１種である可能性を示唆している。ヒトデルタ１のアミノ酸の部分配列とヒトデルタ３のアミノ酸配列との間の相同性は表１に示しており、タンパク質は異なる遺伝子によってコードされていることを示している。これら全てのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の比較から、ヒトデルタ３は、デルタ１タンパク質と配列および構造についていくらかの相同性を有するデルタタンパク質の新たな種類であることが示唆される。
5.2 ｈデルタ３遺伝子の組織発現
本実施例は、配列番号1の３’末端に対応するｈデルタ３cDNAの1.6kbの断片を用いたノーザンブロットハイブリダイゼーションによって確認したデルタ３タンパク質の組織分布について記述するものである。
種々のRNAサンプルを用いたノーザンハイブリダイゼーションを標準的な条件下において行い、ストリンジェント条件下、すなわち65℃、0.2×SSCで洗浄した。各サンプルにおいて、プローブは、約3.5kbの単一のRNAとハイブリダイズした。種々のmRNAに対するプローブのハイブリダイゼーションの結果を以下に記載する。
胎児の脳、肺、肝および腎由来のRNAを含むクロンテック・胎児複数組織ノーザン（Clontech Fetal Multiple Tissue Northern: MTN）ブロット（クロンテック（Clontech）社、カリフォルニア州ラホーヤ）のハイブリダイゼーションから、これらの胎児の組織の各々においてデルタ３ RNAの存在が示唆された。発現は、胎児の脳および肝に比べて、胎児の肺および腎において著しく高かった。成人の心臓、脳、胎盤、肺、肝、骨格筋、腎、膵、脾、甲状腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸粘膜内壁、および末梢血白血球由来のRNAを含むクロンテックヒト複数組織ノーザンＩ（Clontech human Multiple Tissue Northern I: MTNI）ブロットおよび複数組織ノーザンＩＩ（Multiple Tissue Northern II: MTNII）ブロット（クロンテック（Clontech）社、カリフォルニア州ラホーヤ）のヒトの1.6kbのデルタ３プローブを用いたハイブリダイゼーションから、心臓、胎盤、肺、骨格筋、腎、膵、脾、甲状腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸および結腸における発現が示唆された。成人の心臓、胎盤、肺および骨格筋において特に発現が強かった。発現は成人の脳、肝および精巣においても見出された。しかしながら、成人の末梢結白血球内においては有意量のｈデルタ３mRNAは検出されなかった。
さらに、TGF−β１の10ng/mlで24時間、bFGFの10ng/ml／VEGFの25ng/mlで24時間処理した、または未処理で24時間のHMVEC細胞由来の総mRNAをノーザンブロットハイブリダイゼーションすることにより、デルタ３の発現は、bFGF／VEGFを用いた誘導により誘導されることが示唆された。このように、デルタ３の発現は、ある種の成長因子に反応して、HMV内皮細胞内において高くなるように制御される。
HL-60、HeLa、K562、MoLT4、Raji、SW480、A549およびG361細胞由来のRNAを含む「癌」ノーザンブロットのハイブリダイゼーションから、結腸直腸癌細胞系であるSW480においてデルタ３が高レベルで発現していることが明らかになった。このように、デルタ３の発現は少なくともある種の腫瘍細胞においては盛んである。
従って、本実施例は、デルタ３遺伝子は多数の組織において発現されているが、ある種の組織（例えば、末梢血白血球および成人の心臓組織など、少なくともノーザンブロットハイブリダイゼーションを用いた場合）においては検出できず、少なくともいくつかの腫瘍細胞（例えば、結腸癌細胞など）においては比較的高レベルで発現しており、その発現は、いくつかの成長因子（例えば、bFGFおよびVEGFなど）に反応して高くなるように制御することができることを示している。
5.3 ｈデルタ３遺伝子の染色体内の位置
ｈデルタ１ cDNAプローブを用い、一連のヒト／ハムスターの単染色体体細胞ハイブリッド由来のDNAを含むサザンブロットを行った。得られた結果から、ｈデルタ３遺伝子は、15番染色体上に存在していることがはっきりと示された。
5.4 分化中の内皮細胞中におけるｈデルタ３の発現の増加
本実施例においては、分化していない内皮細胞中に比べて、分化中の内皮細胞中においてはｈデルタ３遺伝子の発現が増加していることを示す。
HMVEC細胞を５つに分け、次のように処理した：（１）10％のウシ胎児血清（FCS）を含む内皮成長基本培地（EGM）（クロンテック（Clontech）社）中で、細胞の成長休止を誘導し；（２）10％のFCSおよび成長因子を含む内皮成長完全培地（EGM-MV）（クロンテック（Clontech）社、カタログ番号CC-3125）中で細胞を成長させ；（３）10ng/mlのbFGFおよび25ng/mlのVEGFを含むEGM-MV中で培養することによって細胞の増殖を刺激し；（４）10ng/mlのTGF−β１を含むEGM-MV中で培養することによって細胞の増殖を刺激し；ならびに（５）マトリゲル（Matrigel）上、EGM-MV中で培養することによって細胞の分化を刺激した。24時間培養後、細胞を回収し、RNAを抽出してノーザンブロット分析にかけた。上述したように、1.6kbのｈデルタ３プローブを用いてハイブリダイゼーションを行った。その結果、試験した培養条件の中では、静止細胞によるｈデルタ３の発現レベルが最も低い（ほとんど検出されないレベル）ことが示された。増殖している細胞は、より高レベルのｈデルタ３を発現した。興味のあることに、マトリゲル（Matrigel）上にまくことによって分化を誘導した細胞においては、ｈデルタ３のmRNAレベルが非常に上昇した。
このように、本実施例は、分化が誘導された細胞および増殖が誘導された細胞内において、ｈデルタ３の発現が非常に増加していることを明示する。
5.5 ｈデルタ３はACCPNに関連する染色体領域に存在している
ヒト15番染色体上におけるｈデルタ３の位置を放射線ハイブリッド（RH）マッピングを用いて決定した。
ヌクレオチド配列ＧＴＴＴＡＣＡＴＴＧＣＡＴＣＣＴＧＧＡＴ（配列番号22）を有する順方向のプライマーおよびヌクレオチド配列ＣＴＣＴＴＣＴＧＴＴＣＣＴＣＴＧＧＴＴＧ（配列番号23）を有する逆方向のプライマーを用いて、３’未翻訳領域の遺伝子から配列標識部位（STS）を作出した。STSを用いて、ジーンブリッジ４（Genebridge4）（ギヤペイ（Gyapay）ら、(1996) Human Molecular Genetics 5: 339）放射線ハイブリッドパネルおよびスタンフォードG3（Stanford G3）（スチュワート（Stewart）ら、(1997) Genome Res. 7: 422）放射線ハイブリッドパネルをスクリーニングした。これらのパネルは、放射線照射したヒトの供与細胞を齧歯類の受容細胞と融合することによって得られ（参照文献）、フレームワークマップ内のSTSマーカーの位置決定、目的領域内におけるマーカーの整列、ならびにマーカー間の距離の決定に用いることができる。
PCRによるRHマッピングは次のような条件下において行った：25ngのDNA／20μｌの反応溶液、0.5μＭの各プライマー、0.2mMの各ヌクレオチド、1.5mMのMgCl2、酵素のメーカーから提供された１×緩衝液 、１サイクルを94℃、55℃、72℃で各30秒とし、これを35サイクル繰り返した。
RHマッピングの結果から、15q12-15についてのｈデルタ３のマップは、スタンフォードG3（Stanford G3）パネルのフレームワークマーカーD15S1244に近く、また、ジーンブリッジ４（Genebridge4）パネルのフレームワークD15S144に近いことが示唆され、LODスコアは３以上であった。OMIMデータベース（ヒトにおけるメンデル性遺伝オンライン（Online mendelian Inheritence in Man）；http://www.ncbi.nlm.nih.gob/Omim/searchomim.html）の検索から、この領域は、末梢神経病を伴う脳梁無発育（ACCPN）と呼ばれる神経病に遺伝的に関連していることが示唆された（カソーボン（Casaubon）ら、(1996) Am. J. Hum. Genet 58: 28）。
5.6 デルタ治療剤の確認
本実施例においては、例えば、デルタ３治療剤などのデルタ治療剤（例えば、デルタ生物活性のアゴニストまたはアンタゴニストなど）を単離するための簡単なアッセイについて記述している。少なくとも部分的には、これまでの実施例において記載している結果に基づき、デルタ治療剤を使用して、神経性疾患ならびに／またくは増殖過剰もしくは抑制性疾患、さらに、血管系の欠損が関与している疾患もしくは症状を含む様々な疾患を治療することができる。またさらに、少なくとも部分的には、種々のデルタタンパク質間におけるアミノ酸配列および構造の類似性に基づき、デルタ３治療剤を使用して、デルタ３の異常活性またはデルタ３活性以外のデルタ異常活性が関与している疾患または症状を治療することができる。同様に、デルタ３治療剤、およびデルタ３治療剤以外のデルタ治療剤を使用して、デルタ３異常活性が関与している疾患または症状を治療することができる。以下に記載しているアッセイは、デルタ３タンパク質以外のデルタタンパク質にも応用することができる。
デルタ３治療剤はインビトロ（in vitro）アッセイを用いて確認することができ、このとき、デルタ３タンパク質とデルタ３結合タンパク質（例えば、ノッチタンパク質など）との間の相互作用を試験化合物の存在下または不在下において測定した。デルタ３タンパク質の可溶性の結合性断片は、当該分野において既知の方法に従い、大腸菌（E. coli）内でヒトデルタ３の細胞外部分（例えば、配列番号2のアミノ酸番号１番〜529番付近など）を発現することによって調製することができた。別の方法としては、デルタ３タンパク質の断片は、配列番号2のアミノ酸番号173番付近番〜517番付近を用いることもできる。同様に、デルタ３結合タンパク質のデルタ３結合性断片（すなわち、デルタ３結合性パートナー）は組換えによって産生することができた。デルタ３結合タンパク質としてはノッチタンパク質を用いることができ、また、例えば、そのタンパク質がデルタ３タンパク質に結合することができるか否かを判断することなどによって確認することができた。ノッチタンパク質をコードしている核酸は、例えば、ジーンバンクに寄託されている、またはPCT出願番号PCT/US92/03651もしくはPCT/US93/09338に開示されているノッチ遺伝子のヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列を有するプライマーを使用し、少なくともEGF様ドメインをコードしているノッチ遺伝子の一部をPCR増幅することによって得ることができた。
次に、ELISA系アッセイを用いて試験化合物の試験を行い、これらがデルタ３とデルタ３結合タンパク質との間の相互作用を阻害するか否かを確認した。すなわち、組換え産生されたデルタ３タンパク質とデルタ３結合タンパク質（例えば、ノッチタンパク質など）とを固相表面に結合させ、一方のタンパク質を例えば、タンパク質にエピトープのタグをつけることなどによってラベルした（そのような抗体は購入可能であり、例えば、インターナショナル・バイオテクノロジー（International Biotechnologies）社からFLAGエピトープが市販されている）。具体的には、デルタ３タンパク質をPBS中、10μg/mlの濃度でインキュベートすることによってデルタ３タンパク質をマイクロタイター（96穴）プレートのウェルに連結することができる。BSA溶液を用いて非結合部位をブロッキングした後、タンパク質間の特定の相互作用に適した緩衝液内に溶解した種々の濃度の試験化合物および組換え産生されたデルタ３結合タンパク質をウェルに添加した。数時間インキュベーションした後、ウェルを緩衝液で洗浄し、ウェルに結合したデルタ３結合タンパク質の量を測定した。結合しているタンパク質の量は、抗タグ（例えば、抗mycなど）抗体を加えたウェルをインキュベートすることによって確認でき、次に、酵素免疫アッセイによって検出した。結合しているタンパク質の量は、ELISAリーダーを用い、吸光度を測定することによって測定した。試験化合物を含むウェルにおけるデルタ３結合タンパク質の量が試験化合物を含まないウェルに比べて少ないということは、この試験化合物がデルタ３とデルタ３結合タンパク質との間の相互作用を阻害することを示唆している。
デルタ３治療剤は、レポーターアッセイを用いて確認することもでき、この場合は、デルタ３プロモーターの調節下におけるレポーター構築体の発現レベルを試験化合物の存在下または不在下において測定する。デルタ３プロモーターは、好ましくはcDNAの５’末端を含むデルタ３のcDNAを用いたゲノムライブラリーのスクリーニングによって単離することができた。次に、一般的には約50〜500bpの長さのデルタ３プロモーターの一部をプラスミド内のレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子など）の上流にクローニングした。このレポーター構築体を細胞（例えば、神経細胞または上皮細胞など）にトランスフェクションした。次に、トランスフェクションした細胞をマルチウェルプレートのウェルにまき、種々の濃度の試験化合物をウェルに添加した。数時間インキュベートした後、当該分野において既知の方法に従い、レポーター構築体の発現レベルを測定した。試験化合物を添加してインキュベートしたトランスフェクト細胞内におけるレポーター構築体の発現レベルが試験化合物を、添加せずにインキュベートしたトランスフェクト細胞内におけるそれと比較して異なる場合には、その試験化合物はデルタ３遺伝子の発現を調節することができることを示唆しており、従って、その化合物はデルタ３治療剤である。
微生物の寄託
ヒトのデルタタンパク質の全長をコードしている核酸を含むプラスミドは1997年３月５日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）に寄託しており、ATCC受託番号は98348である。
均等物
当業者であれば、単なる慣用的な実験を採用することにより、本明細書に記載されている本発明の特定の実施態様と均等な実施態様を認識し、確認することができる。そのような均等な実施態様も請求の範囲に含まれる。
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Claims (64)

  1. デルタ３ペプチドをコードしていることを特徴とする単離された核酸。
  2. 該ポリペプチドが、配列番号2に記載しているアミノ酸配列との相同性が全体として少なくとも約70％であるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１記載の単離された核酸。
  3. デルタ３ポリペプチドが可溶性であることを特徴とする請求項１記載の単離された核酸。
  4. デルタ３ポリペプチドが融合タンパク質であることを特徴とする請求項３記載の単離された核酸。
  5. デルタ３ポリペプチドが配列番号2のアミノ酸番号554番付近〜アミノ酸番号685番付近に由来する細胞質性ドメインを含んでいることを特徴とする請求項１記載の単離された核酸。
  6. デルタ３ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸番号１番付近〜アミノ酸番号529番付近と少なくとも約80％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでいることを特徴とする請求項１記載の単離された核酸。
  7. デルタ３ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸番号554番付近〜アミノ酸番号685番付近と少なくとも約80％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでいることを特徴とする請求項１記載の単離された核酸。
  8. デルタ３ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸配列の内の少なくとも19個の連続したアミノ酸からなるアミノ酸配列を含んでいることを特徴とする請求項１記載の単離された核酸。
  9. デルタ３ポリペプチドが、配列番号2に記載している少なくとも20個の連続したアミノ酸からなるアミノ酸配列との相同性が全体として少なくとも約90％であるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１記載の単離された核酸。
  10. デルタ３ポリペプチドが少なくともひとつの生物活性を有することを特徴とする請求項１記載の単離された核酸。
  11. GenBank受託番号がX80903、U78889、U26590、L42229、U70843、AA142228、X80903、T33770、T33811、T07963、R32717またはT07962である核酸配列中には存在せず、配列番号1内の少なくとも約20個のヌクレオチドからなる配列と少なくとも約90％一致するヌクレオチド配列を含むことを特徴とする単離された核酸。
  12. GenBank受託番号がX80903、U78889、U26590、L42229、U70843、AA142228、X80903、T33770、T33811、T07963、R32717またはT07962である核酸配列中には存在せず、配列番号1由来の少なくとも10個の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする単離された核酸。
  13. ストリンジェンシーの低いもしくは高い条件下において、配列番号1に記載されているヌクレオチド配列を有する核酸にハイブリダイゼーションする、またはATCC受託番号が98348であるプラスミドに含まれていることを特徴とする請求項１記載の単離された核酸。
  14. ラベルを追有することを特徴とする請求項１記載の単離された核酸。
  15. 請求項１記載の単離された核酸を含むことを特徴とするベクター。
  16. 請求項１５記載のベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
  17. 単離されていることを特徴とするデルタ３ポリペプチド。
  18. ポリペプチドが、配列番号2に記載しているアミノ酸配列との相同性が全体として少なくとも約90％であるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１７記載の単離されたデルタ３ポリペプチド。
  19. 該デルタ３ポリペプチドが、デルタ３タンパク質の細胞外ドメインの少なくとも一部を含んでいることを特徴とする請求項１７記載の単離されたデルタ３ポリペプチド。
  20. デルタ３タンパク質の細胞外ドメインの一部がデルタ３タンパク質のDSLドメインに基本的に対応していることを特徴とする請求項１９記載の単離されたデルタ３ポリペプチド。
  21. デルタ３ポリペプチドが融合タンパク質であることを特徴とする請求項２０記載の単離されたデルタ３ポリペプチド。
  22. デルタ３ポリペプチドが配列番号2のアミノ酸番号554番付近〜アミノ酸番号685番付近に由来する細胞質性ドメインを含んでいることを特徴とする請求項１７記載の単離されたデルタ３ポリペプチド。
  23. DSLドメインが、配列番号2のアミノ酸番号173番付近〜アミノ酸番号217番付近に由来するアミノ酸配列と少なくとも約90％の相同性を有するアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項２０記載の単離されたデルタ３ポリペプチド。
  24. デルタ３ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸番号１番付近〜アミノ酸番号529番付近と少なくとも約80％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでいることを特徴とする請求項１７記載の単離されたデルタ３ポリペプチド。
  25. デルタ３ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸番号554番付近〜アミノ酸番号685番付近に由来するアミノ酸配列と少なくとも約80％相同である少なくとも約20個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１７記載の単離されたデルタ３ポリペプチド。
  26. デルタ３ポリペプチドが配列番号2のアミノ酸配列の内の少なくとも19個の連続したアミノ酸からなるアミノ酸配列を含んでいることを特徴とする請求項１７記載の単離されたデルタ３ポリペプチド。
  27. デルタ３ポリペプチドが、配列番号2に記載している少なくとも20個の連続したアミノ酸からなるアミノ酸配列との相同性が全体として少なくとも約90％であるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１７記載の単離されたデルタ３ポリペプチド。
  28. デルタ３ポリペプチドが少なくともひとつの生物活性を有することを特徴とする請求項２９記載の単離されたデルタ３ポリペプチド。
  29. 29．ATCC受託番号が98348であるプラスミドに含まれている核酸によってコードされていることを特徴とする請求項１７記載の単離されたデルタ３ポリペプチド。
  30. 局所周期タンパク質へのデルタ３ポリペプチドの結合を調節する方法であって、局所周期タンパク質へのデルタ３ポリペプチドの結合を調節することができる化合物の適量をデルタ３ポリペプチドと接触させ、それによって局所周期タンパク質へのデルタ３ポリペプチドの結合を調節することを特徴とする方法。
  31. 該局所周期タンパク質がノッチタンパク質であることを特徴とする請求項３０記載の方法。
  32. 該化合物がポリペプチド、核酸、擬ペプチドおよび小分子を含む群から選択されることを特徴とする請求項３０記載の方法。
  33. 細胞の成長および／または分化段階を調節する方法であって、デルタ３の生物活性を調節する化合物の適量と細胞を接触させることによって細胞の成長および／または分化段階を調節することを含むことを特徴とする方法。
  34. 該細胞が内皮細胞であることを特徴とする請求項３３記載の方法。
  35. デルタ３の生物活性の異常が原因であるまたは関与している疾患または症状を治療または予防する方法であって、疾患を治療するまたは予防するように、デルタ３の生物活性を調節することができる化合物を含む薬剤学的組成物の有効量を投与することを含むことを特徴とする方法。
  36. 該疾患または症状が神経性疾患または症状であることを特徴とする請求項３５記載の方法。
  37. 該神経性疾患が末梢性神経病であることを特徴とする請求項３６記載の方法。
  38. 該末梢性神経病が末梢神経病を伴う脳梁無発育（ACCPN）であることを特徴とする請求項３７記載の方法。
  39. 細胞増殖の異常が原因であるまたは関与している疾患または症状を治療または予防する方法であって、疾患を治療するまたは予防するように、デルタ３治療性を有する薬剤学的組成物の有効量を投与することを含むことを特徴とする方法。
  40. 該細胞増殖の異常が過剰増殖であることを特徴とする請求項３９記載の方法。
  41. 該細胞が、癌細胞、自己免疫細胞、内皮細胞および神経経由来の細胞を含む群から選択されることを特徴とする請求項３９記載の方法。
  42. 該細胞増殖の異常が不全症増殖であることを特徴とする請求項３９記載の方法。
  43. ひとつまたはそれ以上の特定のデルタ３対立遺伝子が関与している神経性疾患または症状を治療する方法であって、神経性疾患を治療するまたは予防するように、デルタの生物活性を調節することができる化合物を含む薬剤学的組成物の有効量を投与することを含むことを特徴とする方法。
  44. 該デルタの生物学的活性がデルタ３の生物活性であることを特徴とする請求項４３記載の方法。
  45. 該疾患または症状が末梢性神経病であることを特徴とする請求項４３記載の方法。
  46. 該末梢性神経病が末梢神経病を伴う脳梁無発育（ACCPN）であることを特徴とする請求項４３記載の方法。
  47. 新しい組織の成長を抑制する方法であって、デルタ３の生物活性を調節することができる化合物を含む薬剤学的組成物の有効量と新しい組織を接触させることを特徴とする方法。
  48. 該新しい組織が腫瘍であることを特徴とする請求項４７記載の方法。
  49. 新しい組織の成長を抑制する、または新しい組織の量を減少させる方法であって、デルタ３タンパク質と相互作用することができる化合物を含む薬剤学的組成物の有効量と新しい組織を接触させることを特徴とする方法。
  50. 該化合物が抗体であることを特徴とする請求項４９記載の方法。
  51. 該化合物が細胞毒性を有する薬物を追有することを特徴とする請求項４９記載の方法。
  52. 新しい組織の成長を刺激する方法であって、デルタ３の生物活性を調節することができる化合物を含む薬剤学的組成物の有効量と新しい組織を接触させることを特徴とする方法。
  53. デルタ３の治療性を確認する方法であって、デルタ３タンパク質を試験化合物と接触させ、試験化合物がデルタ３タンパク質と特異的に結合するか否かを判断することを含むことを特徴とする方法。
  54. デルタ３の治療性を確認する方法であって、
    （ｉ）デルタ３タンパク質とデルタ３の結合相手とが相互作用することができるが試験化合物は相互作用できない条件下において、デルタ３タンパク質、デルタ３の結合相手および試験化合物を混合し、
    （ｉｉ）デルタ３タンパク質／デルタ３の結合相手のコンプレックスを検出し、試験化合物不在下でのデルタ３タンパク質／デルタ３の結合相手のコンプレックスの形成に対して試験化合物存在下でのそれに差異が認められた場合にこの試験化合物がデルタ３治療性であると判断する、
    各工程を含むことを特徴とする方法。
  55. デルタ３の治療性を確認する方法であって、デルタタンパク質を含む細胞を試験化合物と接触させ、試験化合物存在下でインキュベートした細胞内でのデルタ３活性を試験化合物不在下でインキュベートした細胞内でのデルタ３活性とを比較して、デルタ３活性に差異が認められた場合に、この試験化合物がデルタ３治療性であると判断することを含むことを特徴とする方法。
  56. デルタ３の生物活性の異常が原因であるまたは関与している疾患または症状が進行する危険性を確認する方法であって、個体または個体から得られたサンプル中のデルタ３の少なくともひとつの生物活性を測定し、正常個体中のデルタ３の生物活性と比較してデルタ３の生物活性に差異が認められた場合に、デルタ３の生物活性の異常が原因であるまたは関与している疾患が進行する危険性があると判断することを含むことを特徴とする方法。
  57. デルタ３遺伝子の発現を測定することによってデルタ３の生物活性を判断することを特徴とする請求項５６記載の方法。
  58. 該疾患または症状が神経性疾患であることを特徴とする請求項５６記載の方法。
  59. 該神経性疾患が末梢性神経病であることを特徴とする請求項５８記載の方法。
  60. 該末梢性神経病が末梢神経病を伴う脳梁無発育（ACCPN）であることを特徴とする請求項５９記載の方法。
  61. ひとつまたはそれ以上のデルタ３対立遺伝子が関与している神経性疾患または症状を有しているか否か、またはその進行の危険性があるか否かを判断する方法であって、個体中に存在するデルタ３対立遺伝子の特性を確認することを含むことを特徴とする方法。
  62. 該神経性疾患または症状が末梢性神経病であることを特徴とする請求項６１記載の方法。
  63. 末梢神経病を伴う脳梁無発育（ACCPN）を有しているか否か、またはその進行の危険性があるか否かを判断する方法であって、末梢神経病を伴う脳梁無発育（ACCPN）に関連しているデルタ３対立遺伝子が個体中に存在するか否かを確認することを含むことを特徴とする方法。
  64. デルタ３遺伝子が遺伝子的損傷を有しているか否かを判断する方法であって、
    （ｉ）個体由来のデルタ遺伝子の少なくとも一部を含む核酸を、野生型のデルタ３遺伝子と相互作用することができる少なくとも１個の核酸プローブと接触させ、ならびに
    （ｉｉ）個体由来のデルタ遺伝子の一部と少なくとも１個の核酸プローブとのハイブリッドの形成を検出して、個体由来のデルタ遺伝子の一部と少なくとも１個の核酸プローブとのハイブリッドの形成量によってデルタ３遺伝子が遺伝子的損傷を有しているか否かを示すようにする、
    各工程を含むことを特徴とする方法。
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