JP2004514404A - 血管形成関連タンパク質及びこれをコードする核酸 - Google Patents

血管形成関連タンパク質及びこれをコードする核酸 Download PDF

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Abstract

配列番号：２，４，６，８，１０，１２，１４又は１６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する単離されたポリペプチド、及び同ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、血管形成を調節するために有用である。

Description

【０００１】
（関連出願）
この出願は、２０００年３月２２日に出願された米国仮出願番号６０／１９１，１３４号に対して優先権を主張する。
【０００２】
（背景）
町には道路と小道、植物には木部と師部、そして人には動脈、静脈そしてリンパ腺がある。これらの側道がなければ、脊椎動物細胞は、それらの代謝拒絶によって餓死又は病気に罹ってしまう。血管は食物及び酸素そして代謝廃棄物を運びさるが、それらは、また、細胞へそれらには遠いが、それらが応答する必要がある状況を知らせるシグナリング基質を輸送する。ホルモンメッセージは、良く知られているシグナルである。
全ての血管は、基底膜及びルーメン壁を裏打ちする顕著に柔軟な内皮細胞の精巧な単層による外筒で覆われている。位置と機能に依存し、平滑筋及び結合組織もまた存在し得る。
【０００３】
健康な細胞は循環系によって輸送される血液源に依存するだけでなく、所望されない細胞：腫瘍形成及び悪性細胞にも依存する。これらの細胞は、これら自身へ血液源を転送することができれば、コロニーを形成して増殖する。新しい血管が、すでに存在している血管の増殖からおこる、血管形成の型である血管形成（Ｒｉｓａｕ， １９９５； Ｒｉｓａｕ及びＦｌａｍｍｅ， １９９５）は、創傷治癒又は心筋梗塞回復における等のような通常のプロセスによってだけでなく、腫瘍そのもの、及び癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、乾癬、そしてリウマチ様関節炎によっても利用される。このプロセスにも関わらず、病的又は正常な生理学的状態の何れかにおいて、内皮細胞は、複数段階の様式で血管形成を媒介する：（１）内皮が細胞外からの手がかりを受ける、（２）シグナルを受けた細胞は、それが分泌するプロテアーゼによって扇動される基底外筒を破る、（３）次いで、細胞はシグナルへ向かって移動して増殖し、そして最後には、（４）細胞は、形態形成である管を形成する（Ａｌｂｅｒｔｓら．， １９９４）。このプロセスの複雑さは、細胞性生理学、形態形成、遺伝子発現、そしてシグナリングにおける複雑な変化を示す。手がかりである血管形成共犯者には、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、アンジオポイエチンス（例えばＡＮＧ１）及び種々の形態の血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）が含まれる。
【０００４】
分子事象及びそれらが起こる順序、そしてこのプロセスに必要とされる経路は、血管形成を理解するために基本的に重要なことである。インビトロモデルは、血管形成の間に起こる遺伝子発現の変化を同定することにとって有用である。特に実り豊かなモデル系には、三次元Ｉ型コラーゲンゲル及び種々の刺激、例えばホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、及びＶＥＧＦが含まれる。この刺激及びコラーゲンゲルの組み合わせは、相互連結しているルーメン構造をともなう内皮細胞の三次元管状ネットワークの形成を生じる。このモデルでは、管状様構造への内皮の分化は、新しいｍＲＮＡ又はタンパク質合成のインヒビターによって完全に阻止される。さらには、細胞は、調和及び同時発生様式で分化を通して進行し、それによって遺伝子発現の側面を最適化する（Ｋａｈｎら．， ２０００；Ｙａｎｇら．， １９９９）。
腫瘍細胞は、腫瘍の成長を促進するために血管形成を利用する。血管形成に関連する遺伝子及びタンパク質の活性又は発現をコントロールすることによる血管形成のコントロールは、腫瘍細胞成長を防ぐ方法、又は腫瘍を破壊する方法さえも提供する。
【０００５】
（要約）
本発明は、新規ポリペプチドをコードする新規核酸配列の発見に一部分が基づいている。本発明で開示されているポリペプチドをコードする核酸、及びその誘導体と断片は、以下において、集約的に「ＡＡＰ」核酸又はポリペプチド配列として命名された。ＡＡＰ、又は血管形成関連ポリペプチド（ＡＡＰ）は、ケルヒ様ポリペプチド（ＫＬＰ）、マウスＢＡＺＦ（ｈＢＡＺＦ）のヒトオーソログ、ｈｍｔ−伸長因子Ｇ（ｈＥＦ−Ｇ）、ラットＴＲＧ（ｈＴＲＧ）のヒトオーソログ、ヒトミオシンＸ（ｈＭＸ１）及びそのスプライス変異体（ｈＭＸ２）、核酸ホルモンレセプター（ＮＨＲ）、及びヒトミトコンドリアタンパク質（ｈＭＰ）を含む。
【０００６】
本発明は、新規ポリヌクレオチドをコードする新規核酸配列の発見に一部基づいている。本発明において開示されているポリペプチドをコードする核酸、その誘導体及び断片は、以下において集約的に、「ＡＡＰ」核酸又はポリペプチド配列として命名されている。
最初の側面では、本発明は、配列番号：２，４，６，８，１０，１２，１４又は１６と少なくとも８０％配列同一性を有する単離されたポリペプチド、これと同じものをコードするポリヌクレオチド、そして同じものと特異的に結合する抗体である。
第二番目の側面では、本発明は、配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３又は１５の配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する単離されたポリヌクレオチド、又はその相補鎖である。
【０００７】
３番目の側面では、本発明は、破壊されたＡＡＰ遺伝子を有する遺伝子導入非ヒト動物、又は配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３又は１５の配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドの相補鎖を発現する遺伝子導入非ヒト動物を有する。
４番目の側面では、本発明は、ＡＡＰ遺伝子の変異に関する試料をスクリーニングする方法である。
５番目の側面では、本発明は、少なくとも一つのＡＡＰポリペプチドの活性を調節することを含む、血管形成を調節する方法である。
６番目の側面では、本発明は、少なくとも一つのＡＡＰポリペプチドの活性を調節することを含む、血管形成を減少させるだけでなく、増加させる方法である。ＡＡＰポリペプチドの活性調節は、遺伝子の過剰発現又はその発現を取り除くこと、又は抗体又はアプタマーのような特定のアンタゴニスト又はアゴニストと接触させることによって、ＡＡＰポリペプチド機能を弱めることであってもよい。
【０００８】
７番目の側面では、本発明は、腫瘍、癌、心筋梗塞などを含む種々の病状を治療する方法である。
８番目の側面では、本発明は、化合物のＡＡＰ転写及び翻訳上方制御又は下方制御活性を測定する方法である。
９番目の側面では、本発明は、腫瘍形成の潜在力に関する組織試料をスクリーニングする方法である。
１０番目の側面では、本発明は、試料中の少なくとも一つのＡＡＰの発現を、コントロール試料中の前記の少なくとも一つの遺伝子の発現と比較する、腫瘍の臨床段階を決定する方法である。
【０００９】
ここに記載のものと類似又は同等の方法及び物質が、本発明において実用的又は試験的であることが可能ではあるが、適切な方法及び物質が以下に記載されている。加えて、物質、方法、及び例は単に例示的であり、限定されることを意図されていない。
【００１０】
（発明の詳細な説明）
種々の刺激をともなう、コラーゲンＩ型ゲル中の血管形成のモデル−内皮細胞の懸濁物は、増幅及びＧｅｎｅ Ｃａｌｌｉｎｇ（Ｓｈｉｍｋｅｔｓら．， １９９９）と呼ばれる画像化法を使用して、管状構造への内皮の分化の分子フィンガープリント又は転写プロフィールを同定するために使用された。この方法は、以前に、既知及び新規遺伝子の双方に関するｍＲＮＡ発生量の定量的相違の感度のある検出との組み合わせによる、ｃＤＮＡ集団の包括的なサンプリングを提供することが示された。多くの異なって発現されたｃＤＮＡ断片が見出された。これら遺伝子の同定及び差次的発現は、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を用いる第二番目の独立した方法によって確かめられた。同定されたｃＤＮＡ断片の幾つかが血管形成において幾つかの役割を担うことは知られていたが、多くの他の差次的に発現した遺伝子は予想されていなかった。本発明者は、集約的に血管形成関連ポリペプチド（ＡＡＰ）と呼ばれ、血管形成のこのモデルに応答して発現する予想されていなかった遺伝子及びポリペプチドを同定した。ＡＡＰは、ケルヒ様ポリペプチド（ＫＬＰ）、マウスＢＡＺＦ（ｈＢＡＺＦ）のヒトオーソログ、ｈｍｔ−伸長因子Ｇ（ｈＥＦ−Ｇ）、ラットＴＲＧ（ｈＴＲＧ）のヒトオーソログ、ヒトミオシンＸ（ｈＭＸ１）及びそのスプライス変異体（ｈＭＸ２）、核酸ホルモンレセプター（ＮＨＲ）、及びヒトミトコンドリアタンパク質（ｈＭＰ）である。
【００１１】
（定義）
別段の定義がない限り、全ての技術及び科学的用語は、本発明が属する当該分野の熟練者によって共通に理解されているのと同じ意味を有する。以下の定義は、明瞭さのために示されている。
これらが遺伝学と関連しているという勧告は（Ｄｅｍｅｒｅｃら．， １９６６）、ここにおいて適用されている。遺伝子（及び関連核酸）とタンパク質との間を区別するために、遺伝子の省略形はイタリック文字（又は下線部）で、タンパク質の省略形は大文字で始まり、イタリックでは示さない。従って、ＡＡＰ又はＡＡＰは、ＡＡＰコードをするヌクレオチド配列を指す。
【００１２】
分子に言及する「単離」とは、天然環境の成分から同定及び分離及び／又は回収された分子を指す。その天然環境の汚染成分は、診断又は治療用途を妨害する物質である。
「容器」とは、広く、物質又は薬剤を保持するための任意の容器を意味する。容器は、ガラス、プラスチック、セラミックス、金属、又は薬剤を保持することが可能な任意の他の物質の加工品であってもよい。許容可能な物質は、内容物とは逆に反応しない。
【００１３】
１．核酸関連の定義
（ａ）コントロール配列
「コントロール配列」は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列である。原核生物コントロール配列には、プロモーター、オペレータ配列、及びリボソーム結合部位が含まれる。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用する。
（ｂ）作用可能に連結
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合」している。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード化配列に作用可能に結合し、又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード化配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。連結は、簡便な組み換えＤＮＡ法によって完成される。
（ｃ）単離された核酸
「単離された」核酸分子とは、天然に見出される環境から精製され、少なくとも１つの夾雑核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたＡＡＰ分子は、細胞内に存在する特定のＡＡＰ分子とは区別される。しかし、単離されたＡＡＰ分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体上の位置に存在し、普通にＡＡＰを発現している細胞内に含まれるＡＡＰ分子を含む。
【００１４】
２．タンパク質に関連した定義
（ａ）精製ポリペプチド
分子が精製されたポリペプチドである場合、そのポリペプチドを、（１）配列決定装置を使用してＮ−末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために、又は（２）クーマシーブルー又は銀染色を用いる非還元又は還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一となるように精製する。単離されたポリペプチドには、ＡＡＰ天然環境の少なくとも一つの成分が存在していないために、単離されたポリペプチドには、遺伝的に操作した細胞で非相同的に発現する、又はインビトロで発現するものが含まれる。通常は、単離されたポリペプチドは、少なくとも一つの精製段階によって調製される。
（ｂ）活性ポリペプチド
活性ＡＡＰ又はＡＡＰ断片は、天然又は天然発生ＡＡＰの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持している。免疫学的活性とは、天然ＡＡＰによって保持されている抗原エピトープに対する抗体の生産を誘導する能力を意味する；生物学的活性とは、免疫学的活性を排除する天然ＡＡＰによる阻害性又は刺激性のいずれかの機能を指す。ＡＡＰの生物学的活性には、例えば、血管形成を調節することが含まれる。
【００１５】
（ｃ）Ａｂｓ
抗体とは、単一の抗−ＡＡＰモノクローナルＡｂｓ（アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和Ａｂｓ）、ポリエピトピックな特異性を有する抗−ＡＡＰ抗体組成物、一本鎖抗−ＡＡＰ Ａｂｓ、そして抗−ＡＡＰ Ａｂｓの断片であり得る。「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一なＡｂｓ、すなわち、最小量で存在し得る天然に発生する変異を除いて同一である集団を含む個々のＡｂｓを意味する。
（ｄ）エピトープタッグ
エピトープタッグ化ポリペプチドとは、「タッグポリペプチド」と融合したキメラポリペプチドを意味する。そのようなタッグは、ポリペプチド活性を妨害しないが、Ａｂｓが作製できる、又は入手可能なエピトープを提供する。内在性エピトープとの抗−タッグ抗体の反応性を減じるために、タッグポリペプチドは、好ましくは独特である。適切なタッグポリペプチドは、一般的には、少なくとも６アミノ酸残基有し、通常は、約８と５０アミノ酸残基の間であり、好ましくは、８と２０アミノ酸残基の間である。エピトープタッグ配列の例には、インフルエンザＡウイルス及びＦＬＡＧのＨＡが含まれる。
【００１６】
本発明の新規ＡＡＰには、その配列が表１，３，５，７，９，１１，１３及び１５に提供されている核酸、又はその断片が含まれる。また、本発明には、ＡＡＰ断片の活性及び生理学的機能を維持するタンパク質をなおコードする一方で、表１、３，５，７，９，１１，１３及び１５に示すのと一致する塩基から変化した任意の塩基である突然変異体、又は変異体ＡＡＰ、又はそのような核酸の断片が含まれる。本発明には、さらに、相補性核酸断片を含む、ちょうど記載したものと相補的な配列である核酸が含まれる。本発明には、加えて、核酸又は核酸断片、その相補鎖で、その構造が化学修飾されているものを含む。そのような修飾物には、限定されない例として、修飾塩基、及び糖リン酸骨格が修飾又は誘導化されている核酸が含まれる。これら修飾は、少なくとも部分的に、修飾核酸の化学的安定性を高めるためにおこなわれ、例えば、それらは、被検体での治療的用途におけるアンチセンス結合核酸として使用され得る。成熟又は変異体核酸、及びそれらの相補鎖では、２０％まで又はそれ以上の塩基がそのように変化し得る。
【００１７】
本発明の新規ＡＡＰには、表２，４，６，８，１０，１２，１４，及び１６に提供されている配列のタンパク質断片が含まれる。本発明は、また、ＡＡＰ突然変異体又は変異体タンパク質が含まれ、その任意の残基は、表２，４，６，８，１０，１２、１４及び１６に示されているのに一致する残基から変化し、その一方で、その天然活性及び生理学的機能、又はその機能断片を維持するタンパク質をいまだコードする。突然変異体又は変異体ＡＡＰでは、２０％まで又はそれ以上の残基がそのように変化し得る。本発明は、さらに、本発明の任意のＡＡＰと免疫特異的に結合するＦａｂ又は（Ｆａｂ）’２ のようなＡｂｓ及び抗体断片を含む。
【００１８】
ＡＡＰ核酸は、表１，３，５，７，９，１１，１３及び１５に示されており、それに一致するポリペプチドは、表２，４，６，８，１０，１２，１４及び１６にそれぞれ示されている。ポリヌクレオチド配列の開始及び終止コドンは、太字及び下線部で示されている。配列番号：３は、終止コドンを欠く。ｈＭＸ１及びｈＭＸ２の配列は、開始コドンを欠き（表１７を参照せよ）；結果として、ｈＭＸ１及びｈＭＸ２ポリペプチドは、メチオニンから開始しない。任意の欠損しているポリヌクレオチド配列に関し、当該分野に熟練した者は、例えば、この発明の配列に従って設計されたプローブでプローブしたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリによる完全長配列を回収することができる。
【００１９】
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【００２０】
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【００２１】
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【００２２】
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【００２３】
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【００２４】
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【００２５】
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【００２６】
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【００２７】
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【００２８】
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【００２９】
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【００３０】
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【００３１】
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【００３２】
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【００３３】
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【００３４】
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【００３５】
表１７は、ｈＭＸ１、ｈＭＸ２とヒトミオシン（配列番号：３１；ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ２４７４５７）（Ｂｅｒｇら．， ２０００）のアライメントを示す。このアライメントで見られるように、ｈＭＸ１及びｈＭＸ２は、ＭＮＤ残基のＮ−末端に類似のものを有する。当該分野に熟練した者は、完全長ポリヌクレオチド配列を得るためのｃＤＮＡ又はゲノムヒトライブラリをプローブすること、又はＰＣＲ技術によって、この観察を容易に確かめることができる。
【００３６】
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【００３７】
また、本発明は、配列番号：１−１６に対して、８１，８２，８３，８４，８５，８６，８７，８８，８９，９０，９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８及び９９％を含む、８０−１００％の配列同一性を有するポリペプチド及びヌクレオチドと同時に、これら任意のポリペプチドをコードするヌクレオチド、そしてこれらヌクレオチドの任意ものの相補鎖を含む。代わりの実施態様では、配列番号：１−１６の任意、又は複数のものと同一なポリペプチド及び／又はヌクレオチド（及びその相補鎖）は除かれる。さらにその他の実施態様では、配列番号：１−１６に対して、８２，８３，８４，８５，８６，８７，８８，８９，９０，９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８及び９９％を含む、８１−１００％の同一性を有するポリペプチド及び／又はヌクレオチド（及びその相補鎖）は除かれる。
【００３８】
本発明の核酸及びタンパク質は、例えば臓器移植後の創傷治癒の促進にとって、又は心筋梗塞の治療にとって、そしてまた腫瘍、癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、乾癬、及びリウマチ様関節炎の治療にとって潜在的に有用である。例えば、ＡＡＰをコードするｃＤＮＡは遺伝子治療にとって有用であり、そしてＡＡＰタンパク質は、それを必要としている被検体へ投与する場合に有用である。ＡＡＰ、そして本発明のＡＡＰタンパク質、又はその断片をコードする新規核酸は、核酸又はタンパク質の存在又は量を見積もる、診断的用途にとってさらに有用である。これらの物質は、治療的又は診断的方法の用途のための本発明の新規物質と免疫特異的に結合するＡｂｓの生成にとってさらに有用である。
【００３９】
ケルヒ様タンパク質（ＫＬＰ）
ＫＬＰによってコードされる推定タンパク質は、１つの推定ＢＴＢドメイン及び４つの推定ケルヒモチーフを含む。ＢＴＢ（ｂｒｏａｄ ｃｏｍｐｌｅｘ， ｔｒａｍｔｒａｃｋ， ｂｒｉｃ−ａ−ｂｒａｃ）／ＰＯＺ（ポックスウイルス、ジンクフィンガー）ドメインは、タンパク質−タンパク質相互作用に関与している。ケルヒモチーフは、ＢＴＢをも含むショウジョウバエケルヒＯＲＦ１タンパク質の配列中の６倍タンデムエレメントである。ケルヒＯＲＦ１は、卵室の環状管に位置し、Ｆ−アクチン細胞骨格を組織化することを助ける（Ａｄａｍｓら．， ２０００）。繰り返しケルヒモチーフは、保存三次構造であるβ−プロペラを予言する。このモジュールは、多くの異なるポリペプチドコンテクストに現れ、そして多機能タンパク質−タンパク質相互作用部位を含む。この増大するスーパーファミリーのメンバーは、細胞の全体に渡って、そして細胞外に存在し、多様な活性を有する（Ａｄａｍｓら．， ２０００）。このような活性には、他の形態学的なプロセス、遺伝子発現、ウイルスとの相互作用、細胞拡散のような種々の細胞外事象と同時に、細胞骨格の組織化が含まれる。
【００４０】
ショウジョウバエケルヒ及び他のケルヒ様タンパク質、ヒトケルヒ様タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＦ２０９３８（配列番号：１７））、仮定上のシー・エレガンス（ＧｅｎＢａｎｋ Ｏ６１７９５（配列番号：１８）及び骨格筋特異的サルコシン（ＧｅｎＢａｎｋ Ｏ６０６６２（配列番号：１９）；（Ｔａｙｌｏｒら．， １９９８））とのアライメントは、開示されたタンパク質（配列番号：２）が新しいサブファミリーのメンバーであることを明らかにする。
ＫＬＰは、実施例１の血管形成のインビトロモデルにおいて上方制御されているために、管形成及び血管形成に関連している。ケルヒは、細胞骨格集合を媒介し、細胞骨格形成及びシグナリングに依存する、管形成のような形態形成プロセスに関わっている。ＫＬＰは、小分子薬物治療にとって魅力ある標的の代表である。
【００４１】
マウスＢＡＺＦ（ｈＢＡＺＦ）のヒトオーソログ
ｈＢＡＺＦ（配列番号：４）は、マウスＢＡＺＦ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢ０１１６６５；配列番号：２０）のヒトオーソログであり、ＢＡＺＦは、胚中心形成、及びＴ細胞依存性免疫応答を制御する転写リプレッサーであるＢｃｌ−６（ＬＡＺ３）ホモログである。Ｂｃｌ−６の発現は、ネガティブに細胞性増殖と関連している：Ｂｃｌ−６は、障害のある有糸分裂Ｓ期行程及びアポトーシスに関連している成長を抑制する（Ａｌｂａｇｌｉら．， １９９９）。
ＢＡＺＦは、６つのＢｃｌ−６に代わって、ＢＴＢ／ＰＯＺドメイン及び５繰り返しのクリュッペル−様ジンクフィンガーモチーフを含む（Ｏｋａｂｅら．， １９９８）。ＢＡＺＦ ｍＲＮＡの発現は、Ｂｃｌ−６ｍＲＮＡとは異なり、心臓及び肺に追いやられているが、活性化リンパ球では、Ｂｃｌ−６のような前初期遺伝子として誘導される（Ｏｋａｂｅら．， １９９８）。
【００４２】
ｈＢＡＺＦ配列は、ホモサピエンス第１７染色体のクローンである、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣ０１５９１８（配列番号：２２）と相同性を有するマウスタンパク質配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｏ８８２８２；配列番号：２１）で、ｔｂｌａｓｔｎ（タンパク質クイアリー翻訳データベース）を使用して誘導された（Ａｌｔｓｃｈｕｌら．， １９９７）。ヒトＢＡＺＦは、５つのクリュッペル−様ジンクフィンガーモチーフリピート及びＢＴＢ／ＰＯＺドメインを含む。
ヒト配列に存在する「ＲＳＱ．．．ＰＱＶ」というペプチド配列は、遺伝子の選択的スプライス型に示されている。マウスＢＡＺＦとのアライメント、そしてマウス及びヒトＢｃｌ−６とのアラインメントは、この領域では、４つのタンパク質が殆ど同一であることを示すが、ヒトＢＡＺＦのみが、この挿入配列を有する。
【００４３】
ｈＢＡＺＦは、コラーゲン上に単層で生育したのではなく、コラーゲンゲル上に埋め込まれて生育したＨＵＶＥ細胞中で上方制御されている。ＨＵＶＥ細胞がコラーゲンに懸濁されると、それらは増殖しない。ｍＢＡＺＦの役割と類似するものは、細胞増殖を制御する役割を担い（Ｏｋａｂｅら．， １９９８）、ｈＢＡＺＦは、コラーゲンに懸濁したＨＵＶＥでの細胞増殖の役割を担う。血管形態形成の間のその高い発現のために、ｈＢＡＺＦは、血管形成を阻害するための種々の治療の魅力的標的であると同時に、優れた分子マーカーの代表である。
【００４４】
ｈｍｔ−伸長因子Ｇ（ｈＥＦ−Ｇ）
ｈＥＦ−Ｇ（配列番号：６）の元の単離物は、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）核コードミトコンドリア伸長因子Ｇ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｌ１４６８４（配列番号：２３））と８４％の同一性があり、同一線形順序に並んでいる；（Ｂａｒｋｅｒら．， １９９３）。ＧｅｎＢａｎｋには、ヒト遺伝子が示されていない。しかしながら、ＥＳＴデータベースを検索すると、ヒト遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣ０１０９３６（配列番号：２４）の内部にある、第３染色体クローンに含まれている。ｈＥＦ−ＧとラットｍｔＥＦ−Ｇ及び酵母ＥＦ−Ｇ１のアラインメントは、ラット核コードミトコンドリア伸長因子Ｇのオーソログであることを示す。
【００４５】
細菌性伸長因子Ｇ（ＥＦ−Ｇ）は、トランスロケーションコンピテントリボゾームと物理的に関連し、ＧＴＰの等位結合及び加水分解を通して次のコドンへの転位を促進する。ｈｍｔ−ＥＦ−Ｇの推定アミノ酸配列は、全てのＧＴＰ結合タンパク質によって共有されている特徴的なモチーフを明らかにする。それ故に、他の伸長因子と同じように、ｈｍｔ−ＥＦ−Ｇの酵素機能は、ＧＴＰ結合及び加水分解に依存することが予想される。
Ｈｍｔ−ＥＦ−Ｇは、血管形成のインビトロモデルにおいて強力に誘導され（３０倍）（実施例１）、そのために、ｈｍｔ−ＥＦ−Ｇは、血管形成にとって優れた分子マーカーの代表である。ミトコンドリアでの、その推定的ローカリゼーションのために、ｈｍｔ−ＥＦ−Ｇは、ミトコンドリア機能障害に関連する疾患症状を治療するための魅力的な治療標的でもある。
【００４６】
ヒト甲状腺制御転写（ｈＴＲＧ）
ｈＴＲＧ（配列番号：８）は、ＴＳＨ（ＧｅｎＢａｎｋ ＫＩＡＡ１０５８（配列番号：２５））によってネガティブに制御されている新規甲状腺転写物である、ラットＴＲＧのヒトオーソログである；（Ｂｏｎａｐａｃｅら．， １９９０）。
配列番号：２５は、２０００残基のシー・エレガンス相同タンパク質があるために、部分的にペプチドであると思われる。ゲノム配列に対してｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら．， １９９７）を使用すると、ｈＴＲＧ配列（配列番号：８）が構築できる。
シー・エレガンスでは、相同タンパク質は、原形質膜又はミトコンドリア内膜の何れかに位置する。部分的配列であるＫＩＡＡ０６９４（配列番号：２６）もミトコンドリアマトリックスに位置する。ｈＴＲＧは、ＰＨドメインを有し、細胞外フィブロネクチン結合タンパク質前駆体に対して弱い相同性を有する。配列番号：２６は、ショウジョウバエＤＯＳ及びマウスＧａｂ−２タンパク質に対して相同性を有する；双方は、シグナル伝達機構に関与し、レセプターとキナーゼ様Ｒａｓ１の間のアダプタータンパク質としての作用をする（Ｈｉｂｉ及びＨｉｒａｎｏ， ２０００）。
【００４７】
ｈＴＲＧが、血管形成のインビトロモデルの間に上方制御されているために（実施例１）、そして、そのアダプタータンパク質との相同性のために、ｈＴＲＧは、レセプターとキナーゼの間のシグナル伝達機構に関与しているようである。従って、ｈＴＲＧは、血管形成を調節し、血管形成関連疾患を治療するための小分子薬物として優れた候補である。加えて、その甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）へ応答する推定上の能力のために、ｈＴＲＧの調節は、ＴＳＨ不均衡に関連する疾患を治療するために有用である。
【００４８】
ヒトミオシンＸ（ｈＭＸ１（配列番号：１０）及びｈＭＸ２（配列番号：１２）
ｈＭＸタンパク質は、ウシミオシンＸのヒトオーソログを表す（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＢ３９４８６； 配列番号：２７）。ｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら．，　１９９７）及びウシ配列を使用して、ヒト第５染色体からの一連のゲノムクローンが同定された；ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣ０１０３１０（配列番号：２８）は、全ての配列を含むと思われる。興味あることには、マウスからの部分的ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ１８４１５３；配列番号：２９）は、多型マイクロサテライトマーカーＤ５Ｓ４１６とＤ５Ｓ２１１４の間である、第５染色体の短腕上に０．８ｃＭ間隔で位置している。この領域には、家族性軟骨石灰化（ＣＣＡＬ２）に関する遺伝子がある（Ｒｏｊａｓら．， １９９９）。
【００４９】
その他のＧｅｎＢａｎｋエントリーである、ｈＭＸの３’領域を表すＡＢ０１８３４２（配列番号：３０）は、選択的スプライス型をコードすると思われる。注目すべきは、この変異体（ｈＭＸ２）は、非常に疎水的なカルボキシ末端であるが、より一般的な型（ｈＭＸ１）は、親水性であり、それがＨＭＧ群ボックス及びリボゾームタンパク質と相同性を有するために、潜在的にＤＮＡ／ＲＮＡと相互作用する。さらには、ミオシンヘッドドメインは、ミオシンタリンドメイン、２つのカルモジュリン結合ドメイン、４つのプレックストリンドメイン及びバンド４．１ドメインのみならず、ＮＨ末端に見出された。
【００５０】
バンド４．１ドメインは、細胞骨格形成とシグナル伝達機構の間の交差路を表す。このドメインは、最初に、赤血球細胞タンパク質バンド４．１で示されている。ＥＲＭタンパク質、エズリン、ラディキシン、及びモエシンそして異例のミオシンＶＩＩａ及びＸのすべては、バンド４．１ドメインを有する（Ｌｏｕｖｅｔ−Ｖａｌｌｅｅ， ２０００）。バンド４．１ドメインは、Ｃ末端細胞質内尾部の膜近傍領域の単一の膜貫通タンパク質と結合する。
ＨＭＸは、インビトロモデルの血管形成の間に上方制御される（実施例１）。ｈＭＸがタンパク質−タンパク質相互作用ドメインＰＨ及びバンド４．１ドメインを含むために、ｈＭＸ１及びｈＭＸ２は血管形成に関与し、血管形成因子からシグナルを伝達する傾向にあり、恐らくは細胞骨格を調節する。
【００５１】
ヒトミトコンドリアタンパク質（ｈＭＰ）
ｈＭＰ（配列番号：１４）の分析は、膜横断輸送に関わるタンパク質であるＫ＋ＡＴＰａｓｅα及びγ鎖と相同的である幾つかのサブドメインを明らかにする。更なる分析は、ｈＭＰが、特に塩基領域に加えてロイシンジッパードメインを有するヒストン及び転写因子と相同的であるために、ｈＭＰがＤＮＡ及び又はＲＮＡと結合し得ることを示す。
ＰＳＯＲＴ分析（Ｎａｋａｉ及びＨｏｒｔｏｎ， １９９９）によって核局在化が予想できるが（Ｐ＝．６）、ｈＭＰは、実際には、核コードミトコンドリアタンパク質である。殆どの細菌性タンパク質との相同性、そしてミトコンドリアマトリックススペース局在化のＰＳＯＲＴ予測（Ｐ＝０．４４７８）は、この論点を強く支持する。
【００５２】
ｈＭＰが，血管形成のインビトロモデルにおいて上方制御され（実施例１）、そしてそのミトコンドリア及び核局在化ポリペプチドとの相同性のために、ｈＭＰは、血管形態形成、特に細胞分化−細分化プロセスを押し進める、及び／又は全体的な遺伝子発現を変化させる核マトリックスでの変化に影響を与えることのいずれかを通して重要である。あるいは、ｈＭＰは、核又はミトコンドリアゲノムのいずれかにとって転写因子であり得る。
【００５３】
核ホルモンレセプター（ＮＨＲ）
ＮＨＲ（配列番号：１６）は、２つのドメインを有する：（１）ＮＨ領域は、Ｓｗｉ３（酵母ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体が、クロマチン再構築によって転写を制御する）に類似し、転写制御での役割を示し、そして（２）ＣＯＯＨ領域が、副甲状腺ホルモンに結合する副甲状腺ホルモン関連タンパク質に類似する。ＰＳＯＲＴ（Ｎａｋａｉ及びＨｏｒｔｏｎ， １９９９）では、核に局在化するタンパク質を予測するＰ＝０．９６００。
この新しい推定上のホルモンレセプター−転写レギュレーターの同定、及びｈＢＡＺＦの同定は、ある程度においてＢｃｌ−６のものと類似する新規ヒト転写経路を示唆する。
【００５４】
Ｂｃｌ−６は、ＳＭＲＴ、レチノイド甲状腺ホルモンレセプター、核レセプターコリプレッサー（Ｎ−ＣｏＲ）、哺乳動物Ｓｉｎ３Ａ、及びヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を含む複合体を補強するＢＴＢドメインを介して転写を抑制する。ＢＴＢドメインも有するｈＢＡＺＦは、デアセチラーゼを含む類似の複合体を補強し得る。発現データーは、ｈＢＡＺＦが上方制御される一方で、ＮＨＲが下方制御されていることを示す。これらのデーターは、管形成に関連する他の証拠と一致する。テストステロン（ステロイド）及びデキサメタゾン（ステロイド様分子）は、血管形成を強く阻害し、そしてオールトランスレチノイン酸（ａｔ−ＲＡ）及び９−シスレチノイン酸（９−シスＲＡ）は、毛細管様の管状構造を刺激する（Ｌａｎｓｉｎｋら．， １９９８）。
血管形成に関しては、内皮細胞は、ホルモンを隔離すること及び転写を抑制することの二重機構を利用することで、ホルモンによって媒介される抗−血管形成応答へ反応できなくなり得る。ｎＨＲが、インビトロ血管形成の間に下方制御されているために（実施例１）、このポリペプチドは、おそらく、非血管形成特異的遺伝子転写に関わっている。ｎＨＲは、特に血管新生を防ぐための治療にとって、魅力ある治療上の標的である。
【００５５】
ＡＡＰポリヌクレオチド
本発明の一側面は、ＡＡＰ又はその生物学的に活性な部分をコードする単離された核酸分子に関する。また、本発明に含まれるのは、ＡＡＰ−コード化核酸（例えば、ＡＡＰ ｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとしての用途に十分な核酸断片、及びＡＡＰ分子の増幅及び／又は変異のためのポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）プライマーとしての用途のための核酸断片である。「核酸分子」には、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体を使用して生成されたＤＮＡ又はＲＮＡの類似体、及び誘導体、断片そして相同体である。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であるが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００５６】
１．プローブ
プローブは可変な長さの核酸配列であり、好ましくは特定の使用に依存して、少なくとも約１０ヌクレオチド（ｎｔ）、１００ｎｔ、又は多数（例えば、６，０００ｎｔ）の間である。プローブは同一、類似又は相補的核酸配列を検出するために使用される。より長いプローブは天然又は組換体の原料から得ることが可能で、非常に特異的であって、より短い長さのオリゴマープローブよりハイブリダイズするのが遅い。プローブは一本又は二本鎖であり、ＰＣＲ、メンブレンを用いたハイブリダイゼーション技術、又はエライザのような技術において特異性を持つようにデザインされる。プローブは、少なくとも至適には配列番号：１，３，５，７，９、１１，１３，又は１５の１２，２５，５０，１００，１５０，２００，２５０，３００，３５０，又は４００の連続した；又はこれら配列のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；又はこれらの配列の天然に生じる突然変異体と緊縮性の条件下においてハイブリダイズするであろう実質的に精製されたオリゴヌクレオチドである。
【００５７】
全体又は部分的長さの天然配列ＡＡＰは、；（１）何れかの種（例えば、ヒト、マウス、ネコ、イヌ、バクテリア、ウィルス、レトロウィルス、酵母）に由来するｃＤＮＡライブラリーからのＡＡＰ ｃＤＮＡの全長又は断片、（２）細胞又は組織に由来する、（３）種内の変異体、及び（４）他の種由来の相同体及び変異体などの類似な（相同な）配列を「取り出す」ために使用される（Ａｕｓｕｂｅｌら， １９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ， １９８９）。関連遺伝子をコードする関連配列を見出すために、プローブはユニークな配列又は縮重配列をコードするようにデザインされている。また、配列は天然配列ＡＡＰのプロモーター、エンハンサーエレメント及びイントロンを含むゲノム配列であってもよい。
【００５８】
例えば、他の種におけるＡＡＰコード化領域はそのようなプローブを用いて単離することが可能である。約４０ベースのプローブは、ＡＡＰに基づいてデザインされ、作製される。ハイブリダイゼーションを検出するために、プローブは、例えば、３２Ｐ又は３５Ｓなどの放射ヌクレオチド、又はプローブにアルカリホスファターゼを結合させたアビジン−ビオチンシステムによるような酵素ラベルを用いて標識される。標識化プローブは、所望の種のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー又はｍＲＮＡにおいて、ＡＡＰの配列と相補的な配列を持つ核酸を検出するために使用される。
そのようなプローブは、患者由来の細胞サンプル中のＡＡＰのレベルを測定することにより、例えば、ＡＡＰｍＲＮＡレベルを検出し又はゲノムＡＡＰが変異を起こしているか又は欠失しているかどうかを決定することにより、ＡＡＰを間違って発現させている細胞又は組織を同定するための診断テストキットの構成として使用することができる。
【００５９】
２．単離された核酸
単離された核酸分子は、核酸の天然原料中に存在する他の核酸分子から分離される。好ましくは、単離された核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中の核酸（と元来隣接する配列即ち、該酸の５’−及び３’−末端に位置する配列）が除かれ得る。例えば、種々の実施態様において、単離されたＡＡＰ分子は、核酸が由来する細胞／組織（例えば、脳、心臓、肝臓、脾臓、等）のゲノムＤＮＡ中の核酸分子と元来隣接するヌクレオチド配列の約５ｋｂ，４ｋｂ，３ｋｂ，２ｋｂ，１ｋｂ，０．５ｋｂ又は０．１ｋｂ未満を包含することができる。さらに、ｃＤＮＡ分子などの単離された核酸分子は、組換体技術によって生産される場合の他の細胞内物質又は培地、又は化学的に合成される場合の化学的前駆体または他の化学物質が実質的に除かれ得る。
【００６０】
本発明の核酸分子、例えば、配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３又は１５のヌクレオチド配列又は当該前述のヌクレオチド配列の相補鎖を有する核酸分子などは、標準的な分子生物学的技術及び提示される配列情報を用いて単離することができる。配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３又は１５の核酸配列の全て又は部分をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、ＡＡＰ分子を標準的ハイブリダイゼーション及びクローニング技術（Ａｕｓｕｂｅｌら， １９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ， １９８９）を用いて単離することができる。
ＰＣＲ増幅技術はｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又は或いはゲノムＤＮＡをテンプレート及び適当なオリゴヌクレオチドプライマーとして用いて、ＡＡＰを増幅するために使用することができる。そのような核酸は適当なベクター中にクローン化することができ、ＤＮＡ配列解析によって性質決定を行うことができる。さらに、ＡＡＰ配列に相当するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術、例えば、自動ＤＮＡ合成装置などによって調製することができる。
【００６１】
３．オリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチドは、一連の連結されたヌクレオチド残基を含み、オリゴヌクレオチドはＰＣＲ反応又は他の適用において使用されるのに十分な数のヌクレオチドベースを有する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム又はｃＤＮＡ配列に基づき又はデザインされ、特定の細胞又は組織中の同一、類似又は相補的なＤＮＡ又はＲＮＡの存在を増幅し、確証し、又は明らかにするために用いられる。オリゴヌクレオチドは長さが約１０ｎｔ、５０ｎｔ、又は１００ｎｔで、好ましくは長さが約１５ｎｔから３０ｎｔである核酸の部分を含む。本発明の一実施態様において、長さが１００ｎｔ未満の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドがさらに配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３又は１５又はその相補鎖の少なくとも６つの連続するヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは化学的に合成され、プローブとして使用されてもよい。
【００６２】
４．相補的核酸配列；結合
他の実施態様において、本発明の単離された核酸分子は配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３又は１５に示されるヌクレオチド配列、又はこのヌクレオチド配列の一部（例えば、プローブ又はプライマー又はＡＡＰの生物学的に活性な部分をコードする断片として使用され得る断片）と相補的である核酸分子を含む。配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３又は１５に示されるヌクレオチド配列と相補的な核酸分子は、配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３又は１５に示されるヌクレオチド配列と十分相補的であるもの、つまり配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３又は１５に示されるヌクレオチド配列と殆ど又は全くミスマッチな水素結合を形成せず、それにより安定な二重鎖を形成する。
【００６３】
「相補的」とは、核酸分子のヌクレオチドユニット間のワトソン−クリック又はフーグスチンベース対形成のことを指し、「結合」という用語は、２つのポリペプチド、化合物又は関連するポリペプチド又は化合物又はそれらの組み合わせ間の物理的又は化学的相互作用を意味する。結合には、イオン的、非イオン的、ファンデルワールス的、疎水的、相互作用及びこれに類似するものが含まれる。物理的相互作用は直接的又は間接的のどちらかである可能性がある。間接的相互作用は、他のポリペプチド又は化合物の効果を通じ又は依存する可能性がある。直接的結合とは、他のポリペプチド又は化合物の効果を通じて又はその結果として起こらず、その代わりに他の実質的な化学的中間体無しでは起こらない相互作用のことを意味する。
核酸断片は少なくとも６（連続した）の核酸又は少なくとも４（連続した）のアミノ酸であって、核酸配列の場合には特異的なハイブリダイゼーション、又はアミノ酸の場合にはエピトープの特異的な認識をそれぞれ可能ならしめるのに十分な長さであり、長くても全長配列未満のある部分である。断片は選択された核酸又はアミノ酸配列の何れかの連続する部分に由来する。
【００６４】
５．誘導体、及び類似体
誘導体は、天然化合物から直接、又は修飾により、又は部分置換によって形成される核酸配列又はアミノ酸配列である。類似体は、天然配列と同一ではないが構造類似性を持ち、ある構成成分又は側鎖に関して異なる核酸配列又はアミノ酸配列である。類似体は、合成されるか又は異なる進化的起源に由来し、野生型と比較して類似の又は逆の代謝活性を持つ。相同体は異なる種から派生する特定の遺伝子の核酸配列又はアミノ酸配列のことである。
【００６５】
誘導体及び類似体は全長であり、又は誘導体又は類似体が以下に記述されるような修飾された核酸又はアミノ酸を含むならば、全長ではない。本発明の核酸又はタンパク質の誘導体又は類似体には、限定はしないが、本発明の核酸又はタンパク質と、種々の実施態様において、同じサイズの核酸又はアミノ酸配列に対して少なくとも７０％，８０％，又は９５％の同一性（好ましい同一性８０−９５％を有し）により、又はアライメントが当該技術分野において既知のコンピューターホモロジープログラムによって行われる整列配列と比較される場合、又はそのコード化核酸が緊縮性、又は中程度の緊縮性又は低い緊縮性の条件下で前述のタンパク質をコードする配列の相補鎖とハイブリダイズ化することができるような（Ａｕｓｕｂｅｌら， １９８７）、実質的に相同である領域を含む分子が含まれる。
【００６６】
６．相同性
「相同な核酸配列」又は「相同なアミノ酸配列」又はその変異は、上述のようなヌクレオチドレベル又はアミノ酸レベルでの相同性によって特徴付けられる配列のことを指す。相同なヌクレオチド配列はＡＡＰのアイソフォームをコードする配列をコードする。アイソフォームは、例えば、ＲＮＡの選択的スプライシングの結果同一の生物の異なる組織において発現し得る。或いは、異なる遺伝子がアイソフォームをコードすることもあり得る。本発明において、相同なヌクレオチド配列は、限定はしないが：脊椎動物、従って、例えば、カエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、及び他の生物を含むヒト以外の種のＡＡＰをコードするヌクレオチド配列を含む。また、相同なヌクレオチド配列には、限定はしないが、天然に生じる対立遺伝子の変異及びここで記載した核酸配列の突然変異も含まれる。しかしながら、相同なヌクレオチド配列にはヒトＡＡＰをコードするヌクレオチド配列そのものは含まれない。相同な核酸配列には配列番号：２、４，６，８，１０，１２，１４又は１６中の保存的なアミノ酸置換（以下を参照）、並びにＡＡＰの生物学的活性を持つポリペプチドをコードするこれらの核酸配列が含まれる。ＡＡＰの種々の生物学的活性は以下に記載する。
【００６７】
７．オープンリーディングフレーム
ＡＡＰ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）はＡＡＰをコードする。ＯＲＦは開始コドン（ＡＴＧ）を持ち、３つの「ストップ」コドン（ＴＡＡ，ＴＡＧ，又はＴＧＡ）の一つによって終結する。しかしながら、本発明において、ＯＲＦは開始コドン及びストップコドンを含むか又は含まないコード化配列の何れかの部分であり得る。ユニークな配列を達成するために、好ましいＡＡＰ ＯＲＦｓは少なくとも５０アミノ酸をコードする。
【００６８】
ＡＡＰポリペプチド
１．成熟
ＡＡＰは成熟ＡＡＰをコードする。当該発明で開示されるポリペプチド又はタンパク質の「成熟」形態は、天然に生じるポリペプチド又は前駆体形態又はプロタンパク質である。天然に生じるポリペプチド、前駆体又はプロタンパク質には、非限定的な例として、対応する遺伝子によってコードされる全長遺伝子産物が含まれる。或いは、ここで記載されるオープンリーディングフレームによってコードされるポリペプチド、前駆体又はプロタンパク質として定義される。「成熟」形態産物は、再度非限定的な例示によると、その遺伝子産物が生じる細胞又は宿主細胞内で起こる一又は複数の天然に発生するプロセッシングのステップの結果生じる。そのようなポリペプチド又はタンパク質の「成熟」形態へと誘導するプロセッシングステップの例には、オープンリーディングフレームの開始コドンによってコードされるＮ末端メチオニン残基の切断、又はシグナルペプチドもしくはリーダー配列のタンパク質分解性の切断が含まれる。従って、残基１がＮ末端のメチオニンである残基１〜Ｎからなる前駆体ポリペプチド又はタンパク質から生じる成熟形態は、Ｎ末端メチオニンを除去した残りの残基２〜Ｎを持つ。或いは、残基１〜残基Ｍに由来するＮ末端シグナル配列が切断される残基１〜Ｎを持つ前駆体ポリペプチド又はタンパク質から生じる成熟形態は、残りの残基Ｍ＋１〜残基Ｎに由来する残基を持つであろう。さらに、ここで使用されるように、ポリペプチド又はタンパク質の「成熟」形態は、タンパク質分解性切断よりもむしろ翻訳後修飾のステップから生じる可能性がある。このような更なるプロセスには、非限定的な例示によるが、グリコシル化、ミリストイル化又はリン酸化が含まれる。一般に、成熟ポリペプチド又はタンパク質はこれらのプロセスの一つだけ、又はそれらの何れかの組み合わせによる操作の結果生じる。
【００６９】
２．活性な
活性なＡＡＰポリペプチド又はＡＡＰポリペプチド断片は、成熟形態を含む本発明の天然に生じる（野生型）ＡＡＰポリペプチドの活性と必ずしも同一ではないが類似の生物学的及び／又は免疫学的活性を保持する。容量依存性を持つ又は持たない特定の生物学的アッセイは、ＡＡＰ活性を決定するのに用いることができる。ＡＡＰの生物学的に活性な部分をコードする核酸断片は、ＡＡＰの生物学的活性（ＡＡＰの生物学的活性は以下に記載されている）を持つポリペプチドをコードする配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３又は１５の部分を単離し、ＡＡＰのコード化部分（例えば、インビトロにおける組換体発現）を発現し、ＡＡＰのコードされる部分の活性を評価することによって調製することができる。免疫学的活性とは、天然のＡＡＰによって保持される抗原性エピトープに対する抗体の産生を誘導するための能力を指し；生物学的活性とは、免疫学的活性を除く天然ＡＡＰによって誘起される、阻害性又は刺激性のいずれかの機能のことを指す。
【００７０】
ＡＡＰ核酸変異体及びハイブリダイゼーション
１．変異体ポリヌクレオチド、遺伝子及び組換体遺伝子
さらに本発明は、遺伝子コードの縮重によって配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３又は１５に示されるヌクレオチド配列とは異なるが、配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３又は１５に示される核酸配列によってコードされるものと同一のＡＡＰをコードする核酸分子をも包含する。本発明の単離された核酸分子は、配列番号：２、４，６，８，１０，１２，１４又は１６に示されるアミノ酸配列を持つタンパク質をコードする核酸配列を有する。
【００７１】
配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３又は１５に示されるＡＡＰ配列に加えて、ＡＡＰのアミノ酸配列を変化させるＤＮＡ配列の多型が集団の中に存在する。例えば、個々の対立遺伝子変異がＡＡＰ中の遺伝的多型を示すであろう。「遺伝子」及び「組換遺伝子」という用語は、ＡＡＰ、好ましくは脊椎動物のＡＡＰをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子のことを意味する。このような天然の対立遺伝子の変異は、典型的にはＡＡＰ中に１−５％の変動が生じる可能性がある。ＡＡＰ中のこのような何れか及び全てのヌクレオチド変異と結果的に生じるアミノ酸多型は、天然の対立遺伝子変異の結果であり、ＡＡＰの機能的活性を変更しないものであって、本発明の範囲内のものである。
【００７２】
さらに、配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３又は１５のヒト配列とは異なるヌクレオチド配列を持つ他の種由来のＡＡＰが考慮される。本発明のＡＡＰｃＤＮＡの天然の対立遺伝子変異及び相同体に相当する核酸分子は、緊縮性の条件下で相同なＡＡＰ配列とハイブリダイズするｃＤＮＡ由来のプローブを用いて配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３又は１５のＡＡＰとの相同性に基づいて単離することができる。
【００７３】
「ＡＡＰ変異体ポリヌクレオチド」又は「ＡＡＰ変異体核酸配列」とは、（１）全長の天然ＡＡＰ、（２）シグナル配列を欠く全長天然ＡＡＰ、（３）シグナルペプチドを持つか又は持たないＡＡＰの細胞外ドメイン、又は（４）全長ＡＡＰの他の何れかの断片をコードする核酸配列と少なくとも約８０％の核酸配列同一性を持つ活性なＡＡＰをコードする核酸分子を意味する。一般に、ＡＡＰ変異体ポリヌクレオチドは、全長の天然ＡＡＰをコードする核酸配列と少なくとも約８０％核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％の核酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を持つであろう。ＡＡＰ変異体ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドを欠く全長天然ＡＡＰ、シグナル配列を持つか又は持たないＡＡＰの細胞外ドメイン、又は全長ＡＡＰの他の何れかの断片をコードする可能性がある。変異体は天然ヌクレオチド配列を包含しない。
【００７４】
一般に、ＡＡＰ変異体ポリヌクレオチドは少なくと長さが約３０ヌクレオチドであり、しばしば少なくとも長さが約６０，９０，１２０，１５０，１８０，２１０，２４０，２７０，３００，４５０，６００ヌクレオチドであり、さらにしばしば少なくとも長さが約９００ヌクレオチド又はそれより長い。
ここで同定されるＡＡＰコード化核酸配列に対する「パーセント（％）核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、対象のＡＡＰ配列中のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【００７５】
核酸配列を整列させる場合、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
％核酸配列同一性＝Ｗ／Ｚ・１００
ここで、
ＷはＣ及びＤの配列アラインメントプログラム又はアルゴリズムのアライメントによって同一に一致したコアされた核酸残基の数であり、
ＺはＤの全ヌクレオチド数である。
核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと等しくない場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なる。
【００７６】
２．緊縮性
相同体（即ち、ヒト以外の種に由来するＡＡＰをコードする核酸）又は他の関連配列（例えば、パラログ）は、核酸ハイブリダイゼーション及びクローニングに関する技術分野において周知の方法を用いて、プローブとして特定のヒト配列の全体又は部分を使用し、低い、中程度又は高い緊縮性のハイブリダイゼーションにより得ることができる。
相補性断片とハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡの特異性は、反応条件の「緊縮性」によって決められる。ＤＮＡ二重鎖を形成させる傾向が低下すると、ハイブリダイゼーションの緊縮性は増大する。核酸ハイブリダイゼーション反応において、緊縮性は、いずれかの好ましい特異性のハイブリダイゼーション（高い緊縮性）になるように選択することが可能であり、例えば、ライブラリーから全長クローンを同定するために用いることができる。より低い特異性のハイブリダイゼーション（低い緊縮性）は、関連性はあるが正確ではないＤＮＡ分子（相同体ではあるが同一ではない）又はセグメントを同定するために用いることができる。
【００７７】
ＤＮＡ二重鎖は、（１）相補的な塩基対の数、（２）塩基対のタイプ、（３）反応混合液の塩濃度（イオン強度）、（４）反応温度、及び（５）ＤＮＡ二重鎖の安定性を低下させるホルムアミドなどのある種の有機溶媒の存在によって安定化される。一般に、プローブが長くなれば、適切なアニーリングのためにより高い温度が必要である。通常のアプローチは温度を変化させることである：より高い相対温度はより緊縮性のある反応条件となる。（Ａｕｓｕｂｅｌら．， １９８７）には、ハイブリダイゼーション反応の緊縮性に関する優れた説明が提示されている。
【００７８】
「緊縮性の条件」下でハイブリダイズするとは、互いに少なくとも６０％の相同性を持つヌクレオチド配列がハイブリダイズした状態にあるようなハイブリダイズプロトコルのことである。一般に、緊縮性の条件は、設定されたイオン強度及びｐＨにおける特異的配列に対する熱融点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。Ｔｍは標的の配列と相補的なプローブの５０％が標的配列と平衡を保ってハイブリダイズする温度である（設定されたイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度）。標的配列は通常過剰に存在するため、Ｔｍではプローブの５０％が平衡状態となる。
【００７９】
（ａ）高い緊縮性
「緊縮性条件」条件では、プローブ、プライマー又はオリゴヌクレオチドがその標的配列にのみハイブリダイズすることができる。緊縮性条件は配列依存的で、相違する。「緊縮性条件」には、（１）低いイオン強度及び高い温度での洗浄（例えば、５０℃において、１５ｍＭの塩化ナトリウム、１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．１％のドデシル硫酸ナトリウム）；（２）ハイブリッド形成中に変性剤、（例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５；７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム、４２℃）；又は（３）５０％ホルムアミド。典型的には、洗浄にも、５ｘＳＳＣ（０．７５Ｍ　ＮａＣｌ、７５ｍＭ クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸が含まれ、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃でのホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘ　ＳＳＣからなる高い緊縮性洗浄が含まれる。好ましくは、条件は、少なくと約６５％，７０％，７５％，８５％，９０％，９５％，９８％，又は９９％の相同性を持つ配列が、典型的には互いにハイブリダイズした状態にあるような条件である。これらの条件は、実施例に示してあるが、限定することが意味されるものではない。
【００８０】
（ｂ）中程度の緊縮性
「中程度の緊縮性条件」は、ポリヌクレオチドが配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３，又は１５の全長、断片、誘導体又は類似体とハイブリダイズするような、より低い緊縮性の洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件を用いる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， １９８９）。一実施例には、５５℃において、６ＸＳＳＣ、５ｘデンハード液、０．５％ＳＤＳ及び１００ｍｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡ中でのハイブリダイゼーション、次いで３７℃において１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での一又は複数回の洗浄が含まれる。温度、イオン強度等は、プローブ長などの実験的要因を至適化させるように調整することができる。他の中程度の緊縮性条件は（Ａｕｓｕｂｅｌら， １９８７；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ， １９９０）中に記載されている。
【００８１】
（ｃ）低い緊縮性
「低い緊縮性条件」は、ポリヌクレオチドが配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３，又は１５の全長、断片、誘導体又は類似体とハイブリダイズするような、中程度の緊縮性よりも低い緊縮性の洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件を用いる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， １９８９）。低い緊縮性条件の非限定的な実施例は、４０℃において、３５％のホルムアミド、５ＸＳＳＣ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％フィコール、０．２％ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌ　変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）　硫酸デキストラン中でのハイブリダイゼーション、次いで５０℃において２ＸＳＳＣ、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．１％ＳＤＳ中での一又は複数回の洗浄である。種間ハイブリダイゼーションなどの他の低い緊縮性条件は、（Ａｕｓｕｂｅｌら， １９８７；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ， １９９０；Ｓｈｉｌｏ及びＷｅｉｎｂｅｒｇ， １９８１）中に記載されている。
【００８２】
３．保存的変異
天然に生じるＡＡＰの対立遺伝子変異に加えて、ＡＡＰをコードするアミノ酸配列中のＡＡＰの機能を変えない変更を受ける変化は配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３，又は１５の配列中に突然変異により導入することができる。例えば、「本質的でない」アミノ酸残基においてアミノ酸置換を誘起するヌクレオチド置換を、配列番号：２、４、６，８，１０，１２，１４又は１６の配列中に作製することができる。「本質的でない」アミノ酸残基とは、生物学的活性を変更することなくＡＡＰの野生型配列から変更され得る残基のことであり、「本質的な」アミノ酸残基は、そのような生物学的活性にとって必要である。例えば、本発明のＡＡＰ中で保存されるアミノ酸残基は、特に変更を受けいれ難いものであると予測される。保存的置換が行われ得るアミノ酸は当該技術において周知である。
【００８３】
有用な保存的置換は、表Ａの「好ましい置換」中に示される。１クラスのアミノ酸が同じタイプの他のアミノ酸と置換される保存的置換は、当該置換が物質的に化合物の生物学的活性を変更しない限りにおいて、当該発明の範囲内に入る。そのような置換によって生物学的活性に変化が生じる場合、その時は、例として表Ｂに示されるより本質的変化が導入されており、生成物はＡＡＰポリペプチドの生物学的活性に対してスクリーニングされる。
【００８４】
Figure 2004514404
【００８５】
（１）β−シート又はα−へリックスコンフォメーションなどのポリペプチド骨格の構造、（２）荷電又は（３）疎水性、又は（４）標的部位の側鎖部分に影響を与える非保存的な置換は、ＡＡＰポリペプチドの機能又は免疫学的同一性を修飾することができる。残基は、表Ｂ中に示される一般的な側鎖の特性に基づいてグループに分類される。非保存的置換は、必然的にこれらのクラスの１メンバーを他のクラスと置換えることを伴うものである。置換は、保存的置換部位又はより好ましくは非保存的部位へに導入される。
【００８６】
Figure 2004514404
【００８７】
変異体ポリペプチドはオリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異導入法、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異導入法などの当該技術分野において既知の方法を用いて行うことができる。部位特異的突然変異導入法（Ｃａｒｔｅｒ， １９８６；Ｚｏｌｌｅｒ及びＳｍｉｔｈ， １９８７）、カセット突然変異導入法、限定的選択突然変異導入法（Ｗｅｌｌｓら， １９８５）又は他の既知の技術は、ＡＡＰ変異ＤＮＡを生産するために、クローン化されたＤＮＡ上で実施することができる（Ａｕｓｂｅｌら， １９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ， １９８９）。
一実施態様において、単離された核酸分子には、タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、該タンパク質が配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３，又は１５と少なくとも約４５％、好ましくは６０％、より好ましくは７０％、８０％、９０％、及び最も好ましくは約９５％の相同なアミノ酸配列を含むタンパク質を包含する。
変異体ＡＡＰは、インビトロにおける血管形成をブロックすることに関してアッセイすることができる。
【００８８】
４．アンチセンス核酸
アンチセンス及びセンスＡＡＰオリゴヌクレオチドは、ＡＡＰポリペプチドの発現を阻止することができる。これらのオリゴヌクレオチドは標的核酸配列と結合し、二重鎖の分解を促進し、未成熟な転写又は翻訳を終結させ、又は他の方法によって標的配列の転写又は翻訳をブロックする二重鎖を形成する。
【００８９】
アンチセンス又はセンスのオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡどちらかの一本鎖核酸であり、標的ＡＡＰ ｍＲＮＡ（センス）又はＡＡＰ ＤＮＡ（アンチセンス）配列と結合することができる。アンチセンス核酸はワトソン−クリック又はフーグスチンの塩基対ルールに従ってデザインすることができる。アンチセンス核酸分子はＡＡＰ ｍＲＮＡの全コード化領域に対して相補的で、より好ましくは、ＡＡＰ ｍＲＮＡのコード化又は非コード化領域の一部分だけに相補であり得る。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＡＡＰ ｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲む領域に対して相補的であり得る。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４から３０ヌクレオチドのＡＡＰ ＤＮＡコード化領域の断片を含む可能性がある。一般に、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は少なくとも長さが５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０，５５，６０，６５，７０，７５，８０，８５，９０，９５，１００のベース又はそれより長いものを含む可能性がある。特に、（Ｓｔｅｉｎ及びＣｏｈｅｎ， １９８８；ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌら， １９８８ａ）には、任意のｃＤＮＡ配列からアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを誘導させる方法が記載されている。
【００９０】
アンチセンス核酸を生成するのに用いることができる修飾されたヌクレオチドの例として、：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（Ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キュエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（Ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６−ジアミノプリンが含まれる。或いは、アンチセンス核酸は、転写されたＲＮＡが対象の標的核酸に対して相補的になるようなアンチセンスの方向でサブクローン化された発現ベクターを用いて生物学的に発現させることができる。
【００９１】
アンチセンス又はセンスのオリゴヌクレオチドを標的細胞（標的核酸配列を含む細胞）中へ導入するためには、何らかの遺伝子導入法が用いられる。遺伝子導入法の例には、（１）エプステイン−バーウィルスなどの遺伝子導入ベクター、又は外来性のＤＮＡをリガンド結合分子に結合させることなどの、生物学的な、（２）エレクトロポレーション及びインジェクションなどの物理的な、（３）ＣａＰＯ４沈殿及びオリゴヌクレオチド−複合体などの化学的なものが含まれる。
【００９２】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは適切な遺伝子導入レトロウィルスベクター中へ挿入される。標的核酸配列を含む細胞を、インビボ又はエクスヴィボにおいて組換体レトロウィルスベクターと接触させる。適当なレトロウィルスベクターの例には、マウスレトロウィルス Ｍ−ＭｕＬＶ、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶに由来するレトロウィルス）、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと表される二重コピーベクターが含まれる（国際公開第 ９０／１３６４１号， １９９０）。十分な核酸分子の転写を達成するためには、アンチセンス核酸分子の転写が強力なｐｏｌ ＩＩ又はｐｏｌ ＩＩＩによってコントロールされるベクターコンストラクトが好ましい。
【００９３】
細胞の混合集団中の標的細胞を特定するために、標的細胞に対して特異的な細胞表面レセプターを開発することができる。アンチセンス及びセンスオリゴヌクレオチドを、（国際公開第９１／０４７５３号， １９９１）中に記載されるように、リガンド結合分子と結合させる。リガンドは標的細胞に特異的なレセプターに対して選択される。適切なリガンド結合分子の例には、細胞表面レセプター、成長因子、サイトカイン、又は細胞表面レセプター又は分子と結合する他のリガンドが含まれる。好ましくは、リガンド結合分子の結合は、実質的に、レセプター又は分子のリガンド結合分子結合体と結合する能力を妨害せず、又はセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその結合体形態の細胞内への侵入を阻止しない。
【００９４】
リポソームは効率的にセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞へ導入する（国際公開第９０／１０４４８号， １９９０）。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、内在性のリパーゼによって細胞内で好適に分離される。
本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子であってもよい。α−アノマー核酸分子は、通常のα−ユニットとは反対に、ストランドが互いに平行に走るように、相補的ＲＮＡと特異的な二重鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｔｉｅｒら， １９８７）。アンチセンス核酸分子は、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら， １９８７ａ）又はキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅら， １９８７ｂ）も含み得る。
【００９５】
一実施態様において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、相補的な領域を持つ、ｍＲＮＡなどの一本鎖核酸を切断することができるリボヌクレアーゼ活性を持つ触媒性のＲＮＡである。従って、ハンマーヘッドリボザイム（Ｈａｓｅｌｏｆｆ及びＧｅｒｌａｃｈ， １９８８）などのリボザイムは、ＡＡＰ ｍＲＮＡ転写産物を触媒的に切断するために用いることができ、その結果翻訳を阻害する。ＡＡＰ−コード化核酸に対して特異的なリボザイムは、ＡＡＰ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（即ち、配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３又は１５）に基づいてデザインすることができる。例えば、活性部位のヌクレオチド配列がＡＡＰコード化ｍＲＮＡ中で切断されるヌクレオチド配列と相補的であるテトラヒメナ Ｌ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築することができる（Ｃｅｃｈら， Ｕ． Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，１１６，７４２， １９９２；Ｃｅｃｈら， Ｕ． Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，９８７，０７１， １９９１）。また、ＡＡＰ ｍＲＮＡは、ＲＮＡ分子のプールから特異的なリボヌクレアーゼ活性を持つ触媒性ＲＮＡを選択するためにも使用することができる（Ｂａｒｔｅｌ及びＳｚｏｓｔａｋ， １９９３）。
【００９６】
或いは、ＡＡＰの発現は、標的細胞中でのＡＡＰの転写を阻害する三重らせん構造を形成するためのＡＡＰの制御領域（例えば、ＡＡＰプロモーター及び／又はエンハンサー）と相補的な標的ヌクレオチド配列によって阻害することもできる（Ｈｅｌｅｎｅ， １９９１；Ｈｅｌｅｎｅら， １９９２；Ｍａｈｅｒ， １９９２）。
アンチセンス及びセンスオリゴヌクレオチドの修飾は、それらの有効性を増大することができる。修飾された糖−ホスホジエステル結合又は他の糖連鎖（国際公開第９１／０６６２９号， １９９１）は、標的配列に対する結合特異性を損なうことなく内在性ヌクレアーゼに対する抵抗性を与えることによりインビボにおける安定性を増大させる。他の修飾は、標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増大することができ、例えば、共有結合性有機体部分（国際公開第９０／１０４４８号， １９９０）又はポリ−（Ｌ）−リジンなどである。他の結合は、標的に対するオリゴヌクレオチドの結合特異性を修飾し、金属複合体又はインターカレート（例えば、エリプチシン）及びアルキル化剤を含む。
【００９７】
例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格は、ペプチド核酸を生産するために修飾することができる（Ｈｙｒｕｐ及びＮｉｅｌｓｅｎ， １９９６）。「ペプチド核酸」又は「ＰＮＡｓ」は、デオキシリボースリン酸骨格が疑似ペプチド骨格によって置換され、４つの元来のヌクレオ塩基のみが保持される核酸模倣体（例えば、ＤＮＡ模倣体）を指す。ＰＮＡの中性の骨格は、低イオン強度条件下において、ＤＮＡ及びＲＮＡに対する特異的なハイブリダイゼーションを可能にする。ＰＮＡオリゴマーの合成は、標準的固相ペプチド合成手順を用いて実施することができる（Ｈｙｒｕｐ及びＮｉｅｌｓｅｎ， １９９６；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら， １９９６）。
【００９８】
ＡＡＰのＰＮＡｓは、治療的及び診断上の適用において使用することができる。例えば、ＰＮＡｓは、転写又は翻訳停止を誘導し、又は複製を阻害することにより遺伝子発現の配列特異的な修飾のためのアンチセンス又は抗遺伝子剤として使用することができる。ＡＡＰ ＰＮＡｓは、単一塩基対変異の解析（例えば、ＰＣＲクランピングによるＰＮＡにおいて；他の酵素、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ（Ｈｙｒｕｐ及びＮｉｅｌｓｅｎ， １９９６）と組合わせて使用するとき、人工的な制限酵素として；又はＤＮＡ配列及びハイブリダイゼーションのためのプローブ又はプライマーとして（Ｈｙｒｕｐ及びＮｉｅｌｓｅｎ， １９９６；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’ｋｅｅｆｅら， １９９６）用いることも可能であろう。
【００９９】
ＡＡＰのＰＮＡｓはそれらの安定性または細胞内への取込みを増強するために修飾することができる。親油性又は他のヘルパーグループがＰＮＡｓ、ＰＮＡ−ＤＮＡ二量体構造に付着してもよく、又はリポソーム又は他の薬剤デリバリー技術の使用でもよい。例えば、ＰＮＡとＤＮＡの有利な特性を兼ね備えるＰＮＡ−ＤＮＡキメラを生成することができる。このようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ及びＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用し、一方ＰＮＡ部分は高い結合親和性及び特異性を提供することを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基のスタッキング、ヌクレオ塩基間の結合数、及び配向性という観点から選択される適切な長さのリンカーを用いて連結することができる（Ｈｙｒｕｐ及びＮｉｅｌｓｅｎ， １９９６）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は実施可能である（Ｆｉｎｎら， １９９６；Ｈｙｒｕｐ及びＮｉｅｌｓｅｎ， １９９６）。例えば、ＤＮＡ鎖を固体支持体上で標準的なホスホラミダイト共役化学反応を用いて合成することができ、修飾されたヌクレオチド類似体、例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジン ホスホラミダイトなどはＰＮＡ及びＤＮＡの５’末端間で用いることができる（Ｆｉｎｎら．， １９９６； Ｈｙｒｕｐ及びＮｉｅｌｓｅｎ， １９９６）。その後、ＰＮＡ単量体は、５’ＰＮＡセグメントと３’ ＤＮＡセグメントとのキメラ分子を生成するために段階的な方法で共役される（Ｆｉｎｎ等， １９９６）。或いは、キメラ分子は５’ ＤＮＡセグメント及び３’ ＰＮＡセグメントにより合成することができる（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら， １９７６）。
【０１００】
オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、インビボにおいて宿主細胞レセプターを標的するために）、又は細胞膜（Ｌｅｍａｉｔｒｅら， １９８７；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら， １９８９）又はＰＣＴ発行 国際公開第８８／０９８１０号）若しくは脳血管関門（例えば、ＰＣＴ発行 国際公開第８９／１０１３４号）を越えた輸送を促進させる薬剤などの他の付加されたグループを含み得る。さらに、オリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーション トリガー切断剤（ｖａｎ Ｋｅｒ ｒｏｌら， １９８８ｂ）又はインターカレート剤（Ｚｏｎ，　１９８８）によって修飾することができる。オリゴヌクレオチドは他の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション トリガークロスリンク剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション トリガー切断剤、その他同種類の分子に結合させてもよい。
【０１０１】
ＡＡＰポリペプチド
本発明の一態様は、単離されたＡＡＰ、及びそれらの生物学的活性な部分の誘導体、断片、類似体、又は相同体に関する。また、抗ＡＡＰＡｂｓを作製するための免疫原としての使用に対して適するポリペプチド断片も提供される。一実施態様において、天然ＡＡＰは標準的なタンパク質精製技術を用いて適切な精製計画によって細胞又は組織源から単離することができる。他の実施態様において、ＡＡＰは組換体ＤＮＡ技術により生産される。組換体発現の代わりに、ＡＡＰは標準的なペプチド合成技術を用いて化学的に合成することができる。
【０１０２】
１．ポリペプチド
ＡＡＰポリペプチドには、配列が配列番号：２，４，６，８，１０，１２，１４又は１６に提供されるＡＡＰのアミノ酸配列が含まれる。また、本発明には、何れかの残基が配列番号：２，４，６，８，１０，１２，１４又は１６に示される対応する残基から変化しているが、依然としてそのＡＡＰ活性及び生理学的機能を維持するタンパク質又はその機能的断片をコードしている、突然変異体又は変異タンパク質が含まれる。
【０１０３】
２．変異体ＡＡＰポリペプチド
一般に、ＡＡＰ様機能を維持し、配列中の特定の位置の残基が他のアミノ酸によって置換されている何らかの変異を含み、さらに、親タンパク質の２残基間に更なる残基又は残基群を挿入する可能性、並びに親配列から位置又は複数の残基を欠失させる可能性を含むＡＡＰ変異体。いずれのアミノ酸置換、挿入又は欠失も本発明によって包含される。好ましい状況において、置換は上述した保存的置換である。
【０１０４】
「ＡＡＰポリペプチド変異体」とは、少なくとも：（１）全長天然配列ＡＡＰポリペプチド配列と約８０％のアミノ酸配列同一性、（２）シグナルペプチドを欠失したＡＡＰポリペプチドと、（３）シグナルペプチドを持つか又は持たないＡＡＰポリペプチドの細胞外ドメインと、又は（４）全長ＡＡＰポリペプチド配列の何れか他の配列を持つ活性なＡＡＰポリペプチドを意味する。例えば、ＡＡＰポリペプチド変異体には、一又は複数のアミノ酸残基が全長天然アミノ酸配列のＮ又はＣ末端で付加又は欠失したＡＡＰポリペプチド配列が含まれる。ＡＡＰポリペプチド変異体は、ＡＡＰポリペプチド配列の全長天然配列と少なくとも約８０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％のアミノ酸配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するであろう。ＡＡＰポリペプチド変異体は、シグナル配列を欠いた配列、シグナルペプチドを持つか又は持たないＡＡＰポリペプチドの細胞外ドメイン、又は全長ＡＡＰポリペプチド配列の何れか他の断片を有する。一般に、ＡＡＰ変異体ポリペプチドは少なくとも長さが約１０アミノ酸、しばしば少なくとも長さが約２０アミノ酸、さらにしばしば少なくとも長さが約３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，１５０，２００，又は３００アミノ酸、又はそれより長い。
【０１０５】
「パーセント（％）核酸配列同一性」は、２つの配列を整列させるとき、開示されるＡＡＰポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸同一性を決定するために、配列を整列させ、必要ならば、最大の％配列同一性を達成するためにギャップが導入され；保存的置換は配列同一性の一部として考慮されない。パーセント同一性を決定するためのアミノ酸アライメント方法は、当業者にとって周知である。ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアなどの公に入手可能なコンピュータソフトウエアが、しばしばペプチド配列をアラインするために使用される。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【０１０６】
アミノ酸配列を整列させる場合、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
％アミノ酸配列同一性＝Ｘ／Ｙ・１００
ここで、
ＸはＡ及びＢの配列アラインメントプログラム又はアルゴリズムのアライメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、
ＹはＢの全アミノ酸残基数である。
アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なる。
【０１０７】
３．単離された／精製されたポリペプチド
「単離された」又は「精製された」ポリペプチド、タンパク質又は生物学的に活性な断片は、その自然環境の成分から分離され及び／又は回収される。夾雑成分には、ポリペプチドに対する診断又は治療上の使用を典型的に阻害する物質が含まれ、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましくは、ポリペプチドは
少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分な程度にまで精製される。実質的に単離されるためには、乾燥重量で３０％未満の非ＡＡＰ夾雑物質（夾雑物）、より好ましくは２０％未満、１０％未満、及び最も好ましくは５％未満の夾雑物を有する標品である。単離された組換体として生産されたＡＡＰ又は生物学的に活性な部分は、好ましくは実質的に、培地からフリーである、即ち、培地がＡＡＰ標品の体積の２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満である。夾雑物の例には、細胞壊死片、培地、及びＡＡＰのインビトロにおける合成の間に使用され、生産された物質が含まれる。
【０１０８】
４．生物学的に活性な
ＡＡＰの生物学的に活性な部分には、全長ＡＡＰの配列より少ないアミノ酸を含み、少なくともＡＡＰの１の活性を示すＡＡＰアミノ酸配列（配列番号：２，４，６，８，１０，１２，１４，又は１６）と十分相同であるか、これから誘導されたアミノ酸配列を含むペプチドを包含する。生物学的に活性な部分は天然ＡＡＰの少なくとも１の活性を持つドメイン又はモチーフを含む。ＡＡＰの生物学的に活性な部分は、例えば、長さが１０，２５，５０，１００又はそれより長いアミノ酸残基であるポリペプチドであり得る。他の生物学的に活性な部分は、タンパク質の他の領域が欠失されており、組換え技術により調製することができ、天然のＡＡＰの一又は複数の機能的活性に関して評価することができる。
【０１０９】
ＡＡＰの生物学的に活性な部分は、配列番号：２，４，６，８，１０，１２，１４，又は１６，又は配列番号：２，４，６，８，１０，１２，１４，又は１６に実質的に相同な配列中に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号：２，４，６，８，１０，１２，１４，又は１６のタンパク質の機能的活性を保持するが、天然の対立遺伝子変異又は突然変異導入によるアミノ酸配列とは異なる。他の生物学的に活性なＡＡＰは、配列番号：２，４，６，８，１０，１２，１４，又は１６のアミノ酸配列と少なくとも４５％相同なアミノ酸配列を含み、天然ＡＡＰの機能的活性を保持する。
【０１１０】
５．２又は複数配列間の相同性の決定
「ＡＡＰ変異体」とは、少なくとも：（１）全長天然配列ＡＡＰ配列と約８０％のアミノ酸配列同一性、（２）シグナルペプチドを欠失したＡＡＰと、（３）シグナルペプチドを持つか又は持たないＡＡＰの細胞外ドメインと、又は（４）全長ＡＡＰ配列の何れか他の配列を持つ活性なＡＡＰを意味する。例えば、ＡＡＰ変異体には、一又は複数のアミノ酸残基が全長天然アミノ酸配列のＮ又はＣ末端で付加又は欠失したＡＡＰ配列が含まれる。ＡＡＰ変異体は、ＡＡＰ配列の全長天然配列と少なくとも約８０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％のアミノ酸配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するであろう。ＡＡＰ変異体は、シグナルペプチド配列を欠いた配列、シグナルペプチドを持つか又は持たないＡＡＰポリペプチドの細胞外ドメイン、又は全長ＡＡＰ配列の何れか他の断片を有する。一般に、ＡＡＰ変異体ポリペプチドは少なくとも長さが約１０アミノ酸、しばしば少なくとも長さが約２０アミノ酸、さらにしばしば少なくとも長さが約３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，１５０，２００，又は３００アミノ酸、又はそれより長い。
【０１１１】
「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、２つの配列を整列させるとき、開示されるＡＡＰ配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸同一性を決定するために、配列を整列させ、必要ならば、最大の％配列同一性を達成するためにギャップが導入され；保存的置換は配列同一性の一部として考慮されない。パーセント同一性を決定するためのアミノ酸アライメント方法は、当業者にとって周知である。ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアなどの公に入手可能なコンピュータソフトウエアが、しばしばペプチド配列をアラインするために使用される。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【０１１２】
アミノ酸配列を整列させる場合、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
％アミノ酸配列同一性＝Ｘ／Ｙ・１００
ここで、
ＸはＡ及びＢの配列アラインメントプログラム又はアルゴリズムのアライメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、
ＹはＢの全アミノ酸残基数である。
アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なる。
【０１１３】
６．キメラ及び融合タンパク質
融合ポリペプチドは、発現研究、細胞内局在、バイオアッセイ、及びＡＡＰの精製において有用である。ＡＡＰ「キメラタンパク質」又は「融合タンパク質」には、非ＡＡＰポリペプチドに融合したＡＡＰが含まれる。非ＡＡＰポリペプチドは実質的にＡＡＰと相同ではない（配列番号：２，４，６，８，１０，１２，１４，又は１６）。ＡＡＰ融合タンパク質は、幾つかの生物学的に活性な部分を含む、ＡＡＰ全長の何れかの部分を含む。ＡＡＰはＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合される。このような融合タンパク質は、組換体ＡＡＰの精製を促進する。ある宿主細胞において、（例えば、哺乳類）異種結合性シグナル配列融合体は、ＡＡＰ発現及び／又は分泌を改善する。更なる例示的な融合が表Ｃ中に示される。
【０１１４】
他の融合相手が、治療上、ＡＡＰに適用することが可能である。イムノグロブリン（Ｉｇ）タンパク質ファミリーのメンバーとの融合は、ＡＡＰリガンド又は基質の相互作用を阻害し、結果的に、インビボにおけるＡＡＰ媒介シグナル伝達を抑制するような治療において有用である。このような薬剤組成物中に取り込まれた融合体は、増殖及び分化障害を治療するため、並びに細胞の生存を調製するために使用することができる。ＡＡＰ−Ｉｇ融合ポリペプチドも、患者中で抗ＡＡＰ Ａｂｓを生産させ、ＡＡＰリガンドを精製し、及び他の分子とＡＡＰの相互作用を阻害する分子をスクリーニングするための抗原としても使用可能である。
【０１１５】
融合タンパク質は、組換え法を用いることで容易に作り出すことができる。ＡＡＰをコードする核酸は、ＡＡＰのＮＨ２−もしくはＣＯＯ−末端、又は内部に対して非ＡＡＰコード化核酸をインフレームにて融合させることができる。また、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術により合成してもよい。また、引き続いてキメラ遺伝子配列を生成させるためにアニール及び再増幅され得る２つの連続的な遺伝子断片間に、相補的なオーバーハングを生じさせるアンカープライマーを用いたＰＣＲ増幅（Ａｕｓｕｂｅｌら， １９８７）も有用である。ＡＡＰを融合部分とインフレームでサブクローニングすることを促進させる多くのベクターは購入可能である。
【０１１６】
Figure 2004514404
【０１１７】
ＡＡＰの治療的適用
１．アゴニスト及びアンタゴニスト
「アンタゴニスト」には、内在性ＡＡＰの生物学的活性を一部又は完全に阻害し又は中和させる分子の何れもが含まれる。同様に、「アゴニスト」には、内在性ＡＡＰの生物学的活性を模倣する分子の何れもが含まれる。アゴニスト又はアンタゴストとして作用し得る分子には、Ａｂｓ又は抗体断片、内在性ＡＡＰの断片又は変異体、ペプチド、アンチセンス、オリゴヌクレオチド、小有機分子、などが含まれる。
【０１１８】
２．アンタゴニスト及びアゴニストの同定
アンタゴニストをアッセイするために、ＡＡＰ特定の活性に対してスクリーニングされる化合物と共に細胞に添加され、又は細胞中で発現される。ＡＡＰの存在下において、対象活性を化合物が阻害する場合、その化合物は、ＡＡＰに対するアンタゴニストである；ＡＡＰ活性が促進される場合、該化合物はアゴニストである。
【０１１９】
（ａ）潜在的アンタゴニスト及びアゴニストの特異的な例
ＡＡＰの細胞内での効果を変更する何れかの分子は、アンタゴニスト又はアゴニストの候補である。当業者にとって周知のスクリーニング技術により、これらの分子を同定することができる。アンタゴニスト及びアゴニストの例には：（１）小有機及び無機化合物、（２）小ペプチド、（３）Ａｂｓ及び誘導体、（４）ＡＡＰに極めて関連性の強いポリペプチド、（５）アンチセンスＤＮＡ及びＲＮＡ、（６）リボザイム、（７）三重鎖ＤＮＡらせん、及び（８）核酸アプタマー、が含まれる。
ＡＡＰの活性部位又は該ペプチドの他の関連部分に結合し、及びＡＡＰの生物学的活性を阻害する小分子は、アンタゴニストである。小分子アンタゴニストの例には、小ペプチド、ペプチド様分子、好ましくは可溶であり、及び合成非ペプチジル有機もしくは無機化合物が含まれる。もしこれらがＡＡＰ活性を促進するならば、これらと同一の分子がアゴニストの例となる。
【０１２０】
ＡＡＰ機能に影響を及ぼす何れかの抗体のほとんどが、アンタゴニストの候補であり、時にはアゴニストの候補である。抗体アンタゴニストの例には、ポリクローナル、モノクローナル、単一鎖、抗イディオタイプ、キメラＡｂｓ、又はこのようなＡｂｓ又は断片のヒト化型が含まれる。Ａｂｓは免疫応答が生じ得る何れかの種由来である。また、ヒト化Ａｂｓも考慮される。
或いは、潜在的アンタゴニスト又はアゴニストは、極めて関連性のあるタンパク質、例えば、ＡＡＰ相互作用タンパク質を認識するＡＡＰの突然変異型であるが、なんら効果を示さず、そのためＡＡＰの作用を競合的に阻害するものである。或いは、突然変異ＡＡＰは構成的に活性化され、アゴニストとして作用するかもしれない。
【０１２１】
アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡコンストラクトは有効なアンタゴニストであり得る。アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は標的のｍＲＮＡに対してハイブリダイズして翻訳を阻害することにより機能を阻止する。アンチセンス技術は、三重鎖へリックス形態、又は共にＤＮＡ又はＲＮＡに対するポリヌクレオチド結合に依存するようなアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通じて遺伝子発現のコントロールをするために使用することができる。例えば、ＡＡＰ配列の５’コード化部分は、長さが約１０から４０塩基対であるアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドをデザインするために使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子領域に対して相補的であり（三重鎖へリックス）（Ｂｅａｌ及びＤｅｒｖａｎ， １９９１； Ｃｏｏｎｅｙら， １９８８；Ｌｅｅら， １９７９）そのため、転写及びＡＡＰの生産を阻害するようにデザインされる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボにおいてｍＲＮＡとハイブリダイズし、ｍＲＮＡのＡＡＰへの翻訳を阻止する（アンチセンス）（Ｃｏｈｅｎ， １９８９；Ｏｋａｎｏら， １９９１）。また、これらのオリゴヌクレオチドもアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡがＡＡＰの生産を阻害するようにインビボにおいて発現し得るように細胞へ導入することができる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の約−１０と＋１０の間の位置から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０１２２】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的な切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡに対する配列特異的ハイブリダイゼーション、次いで、ヌクレオチド内的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的における特異的リボザイム切断部位は、既知の技術によって同定され得る（国際公開第９７／３３５５１号， １９９７；Ｒｏｓｓｉ， １９９４）。
転写を阻害するために、一本鎖化される、デオキシヌクレオチドを含む三重鎖へリックス核酸は有用なアンタゴニストである。これらのオリゴヌクレオチドはフーグスチン塩基対ルールを介した三重鎖へリックスが促進されるようにデザインされ、一般に、プリン又はピリミジンのストレッチを必要とする（国際公開第９７／３３５５１号， １９９７）。
【０１２３】
アプタマーは、ほぼ如何なる分子も認識し、特異的に結合するように用いることができる短いオリゴヌクレオチド配列である。指数関数的濃縮によるリガンドの体系的進化（ＳＥＬＥＸ）過程（Ａｕｓｕｂｅｌら， １９８７；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ及びＳｚｏｓｔａｋ， １９９０；Ｔｕｅｒｋ及びＧｏｌｄ， １９９０）は強力で、そのようなアプタマーを見つけるために使用可能である。アプタマーは多くの診断及び臨床的な使用を有する；臨床上、診断上使用されてきたほぼ全ての使用であって、アプタマーも使用され得るもの。さらに、一度同定されれば、より安価に作製され、製薬的な組成物、バイオアッセイ、診断テストにおいての投与を含む様々な形式において容易に適用することができる（Ｊａｙａｓｅｎａ， １９９９）。
【０１２４】
抗−ＡＡＰ Ａｂｓ
本発明は、何れかのＡＡＰエピトープと免疫特異的に結合するＦａｂ又は（Ｆａｂ）２などのようなＡｂｓ及び抗体断片を含む。
「抗体」（Ａｂ）はＡＡＰ（抗ＡＡＰ Ａｂ；アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和Ａｂｓを含む）に対する単一ＡＡＰ Ａｂｓ、ポリエピトープ特異的な抗ＡＡＰ Ａｂ組成物、単一鎖抗Ａｂｓ、及び抗ＡＡＰ Ａｂｓ断片を含む。「モノクローナル抗体」は、実質的に均一なＡｂｓの集団から得られる、即ち、該集団を含む個々のＡｂｓは少量存在するであろう起こりえる自然発生的な突然変異を除いて同一である。例として、Ａｂｓには、ポリクローナル（ｐＡｂ）、モノクローナル（ｍＡｂ）、ヒト化、二重特異的な（ｂｓＡｂ）、及び異種結合性Ａｂｓが含まれる。
【０１２５】
１．ポリクローナル Ａｂｓ（ｐＡｂｓ）
ポリクローナルＡｂｓは哺乳類ホスト中で、例えば、免疫原、及び所望であればアジュバントの一又は複数回のインジェクションによって生産される。典型的には、免疫原及び／又はアジュバントは複数回の皮下又は腹腔内へのインジェクションによってインジェクトされる。免疫原は、ＡＡＰ又は融合タンパク質を含む。アジュバントの例には、完全フロイト及びモノホスホリル脂質Ａ合成−トレハロース　ジコリノミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）が含まれる。免疫応答を改善するために、免疫原は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシチログロブリン、及び大豆トリプシンインヒビターなどのホスト中での免疫原性のタンパク質に結合させてもよい。抗体産生のためのプロトコールは、（Ａｕｓｕｂｅｌら， １９８７；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ， １９８８）によって記述されている。或いは、ｐＡｂｓは、ＩｇＹ分子を生産するチキン中で作製されてもよい（Ｓｃｈａｄｅら， １９９６）。
【０１２６】
２．モノクローナルＡｂｓ（ｍＡｂｓ）
抗ＡＡＰ ｍＡｂｓは、ハイブリドーマ法を用いて調製される（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びＣｕｅｌｌｏ， １９８３）。ハイブリドーマ法は少なくとも４段階を含む：（１）ホストまたは、ホスト由来のリンパ球を免疫する；（２）ｍＡｂ分泌性（又は潜在的に分泌性）のリンパ球を収集し（３）リンパ球を不死化した細胞に融合させ、及び（４）所望のｍＡｂ（抗ＡＡＰ）を分泌させる細胞を選択する。
マウス、ラット、モルモット、ハムスター、又は他の適当なホストが、免疫原に特異的に結合するはずのＡｂｓを生産し又は生産することができるリンパ球を誘発させるために免疫される。或いは、リンパ球はインビトロで免疫化してもよい。ヒト細胞が所望の場合、末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）が一般に使用される；しかしながら、他の哺乳類ソース由来の脾臓細胞又はリンパ球が好ましい。免疫原は典型的にはＡＡＰ又は融合タンパク質を含む。
【０１２７】
その後、リンパ球はハイブリドーマ細胞を樹立するために不死化細胞株と融合されるが、ポリエチレングリコールなどの融合剤によって促進される（Ｇｏｄｉｎｇ， １９９６）。トランスフォーメーションによって不死化された齧歯類、ウシ、又はヒトのミエローマ細胞が使用されるか、ラットもしくはマウスのミエローマ細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞及び非融合不死化細胞ではない純粋な集団が好ましいため、融合後、非融合、不死化細胞の成長又は生存を阻害する一又は複数の基質を含む適切な培地中で、細胞を成長させる。通常の技術では、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く親細胞を使用する。この場合、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンがＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻害し、ハイブリドーマの成長を許容する培地（ＨＡＴ培地）に添加される。
【０１２８】
好ましい不死化細胞は効率よく融合し、ＨＡＴなどの培地中で選択することにより混合集団から単離することができ、融合後、安定で高レベルの抗体の発現をサポートする。好ましい不死化細胞株はマウスミエローマ株で、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）より入手可能である。ヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株についても、ヒトｍＡｂｓ産生に関し記述されている（Ｋｏｚｂｏｒら， １９８４；Ｓｃｈｏｏｋ， １９８７）。
ハイブリドーマ細胞は細胞外に抗体を分泌するため、ＡＡＰに対するｍＡｂｓ（抗ＡＡＰ ｍＡｂｓ）の存在をアッセイすることが可能である。ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの免疫沈降又はインビトロでの結合アッセイは、ｍＡｂｓの結合特異性を測定し（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ， １９８８；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ， １９９９）、スキャッチャード解析を含む（Ｍｕｎｓｏｎ及びＲｏｄｂａｒｄ， １９８０）。
【０１２９】
抗−ＡＡＰ ｍＡｂ分泌性ハイブリドーマ細胞は限界希釈法及びサブカルチャーにより単一クローンとして単離され得る（Ｇｏｄｉｎｇ， １９９６）。適切な培地にはダルベッコ改変イーグル培地、ＲＰＭＩ−１６４０、又は所望ならば、タンパク質−フリー又は−低減又は血清−フリー培地が含まれる（例えば、Ｕｌｔｒａ ＤＯＭＡ ＰＦ 又はＨＬ−１；Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ；Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， ＭＤ）。ハイブリドーマ細胞は、腹水中でのインビボにおいて増殖させてもよい。
ｍＡｂｓは培地又は腹水からプロテインＡセファロース、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、硫安沈殿又はアフィニティークロマトグラフィー（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ， １９８８；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ， １９９９）などの従来のＩｇ精製方法によって単離又は精製される。
【０１３０】
また、ｍＡｂｓは組換え技術によっても作製される（米国特許第４１６６４５２号， １９７９）。ＤＮＡコード化抗−ＡＡＰｍＡｂｓは、抗ＡＡＰ分泌ｍＡｂハイブリドーマ細胞株から好ましいＤＮＡをプローブするために、従来の方法、例えば、マウスの重及び軽鎖抗体遺伝子と特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより容易に単離され、配列決定することができる。一度単離されると、単離されたＤＮＡ断片は、ｍＡｂｓを発現させるために、他にＩｇタンパク質を生産しないシミアンＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はミエローマ細胞などのホスト細胞中へトランスフェクトさせる発現ベクター中へサブクローニングされる。単離されたＤＮＡ断片は、例えば、ヒト重及び軽鎖定常ドメインに対するコード化配列を相同なマウス配列の代わりに置換することにより（米国特許第４８１６５６７号， １９８９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら， １９８７）、又は非Ｉｇポリペプチドをコードする配列の全て又は一部に対するＩｇコード化配列を融合することにより、修飾することができる。そのような非Ｉｇポリペプチドは、キメラ二価抗体を創作するために、抗体の定常ドメインと置換することが可能であり、又は一抗原結合部位の定常ドメインと置換することができる。
【０１３１】
３．一価Ａｂｓ
Ａｂｓはお互いに結果的にはクロスリンクしない一価Ａｂｓでもよい。例えば、ある方法には、Ｉｇ軽鎖及び修飾された重鎖の組換体発現が関与する。Ｆｃ領域中の何れかのポイントにおける通常の重鎖切断は、重鎖のクロスリンクを妨げる。或いは、それに関わるシステイン残基が他のアミノ酸残基で置換されるか又は除去され、クロスリンクするのを妨げる。インビトロの方法も、一価Ａｂｓの調製に適する。ＡｂｓはＦａｂ断片などの断片を生産するように消化することができる（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ， １９８８；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ， １９９９）。
【０１３２】
４．ヒト化及びヒトＡｂｓ
抗ＡＡＰ Ａｂｓにはさらにヒト化又はヒトＡｂｓが含まれる。非ヒトＡｂｓのヒト化形態は、非ヒトＩｇ由来の最小配列を含むキメラＩｇｓ、Ｉｇ鎖又は断片（Ｆｖ，Ｆａｂ，Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ’）２又は他のＡｂｓの抗原結合サブ配列など）である。
一般に、ヒト化抗体は非ヒト由来から導入された一又は複数のアミノ酸残基を持つ。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「移入」残基と称され、典型的には「移入」可変ドメインから選ばれる。ヒト化は齧歯類のＣＤＲｓ又はＣＤＲ配列と対応するヒト抗体配列とを置換することにより達成される（Ｊｏｎｅｓら， １９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら， １９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら， １９８８）。そのような「ヒト化」ＡｂｓはキメラＡｂｓであり（米国特許第４８１６５６７号， １９８９）、実質的に無傷のヒト可変ドメインより少ない部分が非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化Ａｂｓは、典型的には、あるＣＤＲ残基及びおそらくあるＦＲ残基が齧歯類Ａｂｓ中の類似部位由来の残基と置換されているヒトＡｂｓである。ヒト化Ａｂｓには、マウス、ラット又はウサギなどの非ヒト種のＣＤＲ（供与抗体）であって、所望の特異的な親和性及び能力を持つ残基により、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が置換されるヒトＩｇｓ（レシピエント抗体）が含まれる。ある場合には、対応する非ヒト残基がヒトＩｇのＦｖフレームワーク残基を置換する。ヒト化Ａｂｓは、レシピエント抗体中にも移入ＣＤＲ又はフレームワーク配列中にも見出されない残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体には、全てではないがＣＤＲ領域のほとんどが非ヒトＩｇのものに対応し、全てではないがＦＲ領域のほとんどがヒトＩｇコンセンサス配列のものに対応する、少なくとも１つ、及び典型的には２つの可変領域が含まれる。また、ヒト化抗体には少なくともＩｇ定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的には、ヒトＩｇの一部分も、最適に含まれる（Ｊｏｎｅｓら， １９８６；Ｐｒｅｓｔａ， １９９２；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら， １９８８）。
【０１３３】
また、ヒトＡｂｓは、ファージディスプレイライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら， １９９１；Ｍａｒｋｓら， １９９１）及びヒトｍＡｂｓの調製（Ｂｏｅｒｎｅｒら， １９９１；Ｒｅｉｓｆｅｌｄ及びＳｅｌｌ， １９８５）を含む、種々の技術を使用しても生産できる。同様に、内在性Ｉｇ遺伝子が部分的に又は完全に不活性化された遺伝子導入動物へヒトＩｇ遺伝子を導入することが、ヒトＡｂｓを合成するために利用される。チャレンジすると、ヒト抗体産生が観察され、遺伝子再編成、構築、及び抗体レパートリーを含む全ての面においてヒトにおいて見られるような状況に酷似している（米国特許第５５４５８０７号， １９９６；米国特許第５５４５８０６号， １９９６；米国特許第５５６９８２５号， １９９６；米国特許第５６３３４２５号， １９９７；米国特許第５６６１０１６号， １９９７；米国特許第５６２５１２６号， １９９７；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら， １９９６；Ｌｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚｅｒ， １９９５；Ｌｏｎｂｅｒｇら， １９９４；Ｍａｒｋｓら， １９９２）。
【０１３４】
５．二重特異的ｍＡｂｓ
二重特異的Ａｂｓは、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を持つモノクローナルであり、好ましくはヒト又はヒト化である。例えば、結合特異性は、ＡＡＰ；他は選択された何れかの抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニット。
伝統的には、二重特異的Ａｂｓの組換体産生は、２つのＩｇ重鎖／軽鎖対の共発現に基づいており、２つの重鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びＣｕｅｌｌｏ， １９８３）。Ｉｇ重鎖及び軽鎖のランダムな一揃いにより、生じるハイブリドーマ（クアドローマ）は１０の異なる抗体分子の潜在的混合物を生産し、その内の一つだけが所望の二重特異的構造を持つ。所望の抗体は親和性クロマトグラフィー又は他の技術を用いて精製することができる（国際公開第９３／０８８２９号，１９９３；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら， １９９１）。
【０１３５】
二重特異的抗体（Ｓｕｒｅｓｈら， １９８６）を製造するために、所望の抗体−抗原結合部位を持つ可変ドメインをＩｇの定常ドメイン配列と融合させる。融合は好ましくは、ヒンジの少なくとも一部分、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＩｇ重鎖定常ドメインと行われる。好ましくは、軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）は、少なくとも融合体の一つの中に存在する。Ｉｇ重鎖融合体をコードするＤＮＡ及び、所望であれば、Ｉｇ軽鎖は別々の発現ベクター中に挿入され、適切なホスト生物へ同時形質移入される。
【０１３６】
抗体分子対間の接点は、組換体細胞培養から回収されるヘテロ二量体の割合を最大にするように設計される（国際公開第９６／２７０１１号， １９９６）。好ましい接点には少なくとも抗体定常ドメインのＣＨ３領域の一部が含まれる。この方法において、第一の抗体分子の接点に由来する一又は複数の小アミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置換される。大きな側鎖と同一又は類似のサイズの代償性の「空洞」が、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えば、アラニン又はスレオニン）で置換することにより第二の抗体分子の接点上に創られる。このメカニズムは、ホモ二量体のような望まれない最終産物以上にヘテロ二量体の収量を増大させる。
【０１３７】
二重特異的なＡｂｓは全長Ａｂｓ又は抗体断片として調製される（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異的Ａｂｓ）。二重特異的Ａｂｓを生産するための技術の一つは、化学結合を利用する。無傷のＡｂｓは、Ｆ（ａｂ’）２断片を生産するためにタンパク質分解的に切断され得る（Ｂｒｅｎｎａｎら， １９８５）。近接するジチオールを安定化させ、分子間のジスルフィド形成を妨げるために、亜ヒ酸塩ナトリウムなどのジチオール複合化剤により断片を還元させる。その後、生じたＦａｂ’断片はチオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体へ変換される。その後、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一つは、メルカプトエチルアミンによる還元によってＦａｂ’−チオールへ再変換され、二重特異的抗体を作るために他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と等モル量で混合される。生産された二重特異的Ａｂｓは酵素の選択的固定化に対する薬剤として使用することができる。
【０１３８】
Ｆａｂ ’断片は大腸菌から直接回収され、二重特異的Ａｂｓを作るために化学的にカップルされる。例えば、完全にヒト化された二重特異的Ｆ（ａｂ’）２Ａｂｓを生産することができる（Ｓｈａｌａｂｙら， １９９２）。各Ｆａｂ’断片は、大腸菌から別々に分泌され、インビトロにおいて直接化学的にカップルされ、二重特異的抗体を作る。
【０１３９】
組換体細胞培養に直接由来する二重特異的抗体断片を作製し単離するための様々な技術も記述されている。例えば、ロイシンジッパーモチーフを利用することができる（Ｋｏｓｔｅｌｎｙら， １９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質由来のペプチドは、遺伝子融合により２つの異なるＡｂｓのＦａｂ’部分と連結される。抗体のホモ二量体は、ヒンジ領域において、モノマーを形成させた後抗体ヘテロ二量体を形成させるために再び酸化される。この方法も抗体ホモ二量体を作り得る。「ダイアボディー」技術（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら， １９９３）は二重特異的抗体断片を生産するための代わりの方法を提供する。断片には、短すぎて同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を許容しないリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合された重鎖可変領域（ＶＨ）が含まれる。一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは、他の断片の相補的なＶＨ及びＶＬドメインとの対形成を余儀なくされ、２つの抗原結合部位を形成する。二重特異的抗体を調製するための他の方策は、単一鎖ＦＶ（ｓＦＶ）ダイマーの使用である（Ｇｒｕｂｅｒら， １９９４）。三重特異的Ａｂｓなどの二価以上のＡｂｓも考慮される（Ｔｕｔｔら， １９９１）。
【０１４０】
典型例である二重特異的Ａｂｓは、任意のＡＡＰ上の２つの異なるエピトープに結合する。或いは、細胞防御機構を、特定のＡＡＰを発現する特定の細胞に限定することができる：抗ＡＡＰのアームは、Ｔ細胞レセプター分子（例えば、ＣＤ２，ＣＤ３，ＣＤ２８，又はＢ７）などの白血球が誘因する分子、又はＦＣγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦＣγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦＣγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）などのＩｇＧ（ＦＣγＲ）に対するＦＣレセプターと結合するアームと組合わされる。また、二重特異的Ａｂｓは、特定のＡＡＰを発現させる細胞に対して細胞毒性剤を標的するためにも使用される。これらのＡｂｓはＡＡＰ結合アーム及び細胞毒性剤又は放射性核種キレーターと結合するアームを持つ。
【０１４１】
６．ヘテロ結合性Ａｂｓ
ヘテロ結合性Ａｂｓは、２つの共有結合性Ａｂｓから構成され、免疫系細胞を不要な細胞にターゲットさせること（４，６７６，９８０， １９８７）及びヒト免疫欠損ウィルス（ＨＩＶ）感染の治療（国際公開第９１／００３６０号， １９９１；国際公開第９２／２０３７３号， １９９２）のために提唱されてきた。クロスリンク剤に関与することを含む合成タンパク質化学方法を用いてインビトロにおいて調製されるＡｂｓが考慮される。例えば、免疫毒は、ジスルフィド交換反応を使用し、又はチオエーテル結合を形成させることにより構築される。適切な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチリミデートが含まれる（４，６７６，９８０， １９８７）。
【０１４２】
７．免疫複合体
免疫複合体は、化学療法剤などの細胞毒性剤、毒素（例えば、バクテリア、真菌、植物、又は動物起源の酵素学的に活性な毒素又は断片）、又は放射活性アイソトープ（即ち、放射結合体）を含み得る。
有用な酵素学的に活性な毒素及び断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、緑膿菌由来のエクソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンシン（Ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質、ツルレイシインヒビター、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）及びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）が含まれる。２１２Ｂｉ，１３１Ｉ，１３１Ｉｎ，９０Ｙ，及び１８６Ｒｅなどの様々な放射性ヌクレオチドが放射性結合Ａｂｓの生成に利用可能である。
【０１４３】
抗体及び細胞障害薬の結合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣｌ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６−ジイソシアネート等）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素を、調製することができる（Ｖｉｔｅｔｔａ等， １９８７）。１４Ｃ−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性核種の抗体への結合のためのキレート剤の例である（国際公開第９４／１１０２６号， １９９４）。
【０１４４】
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」（ストレプタビジン等）に結合されてもよく、抗体−レセプター結合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合結合体を循環から除去し、次に細胞障害薬（放射性核種等）に結合されたストレプタビジン「リガンド」（ビオチン等）を投与する。
【０１４５】
８．エフェクター機能の設計
本抗体は、癌などの疾病の治療における抗体の有効性を向上させるために改変することができる。例えば、システイン残基をＦＣ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させるようにしてもよい。そのようなホモダイマーＡｂｓは、増強した内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有しうる（Ｃａｒｏｎ， １９９２；Ｓｈｏｐｅｓ， １９９２）。向上した抗腫瘍活性を持つホモダイマーＡｂｓは、異種二官能性架橋を用いても調製しうる（Ｗｏｌｆｆら， １９９３）。あるいは、抗体は、２つのＦＣ領域を有するように設計し、補体溶解を向上させることもできる（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら， １９８９）。
【０１４６】
９．免疫リポソーム
また、抗体を含むリポソームが調製されてもよい（米国特許第４４８５０４５号， １９８４；米国特許第４５４４５４５号， １９８５；米国特許第５０１３５５６号， １９９１；Ｅｐｓｔｅｉｎら， １９８５；Ｈｗａｎｇら， １９８０）。有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ−誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。このような調製物は、所望の径を有するリポソームが生成されるように定められた孔サイズのフィルターを通して押し出される。抗体のＦａｂ’断片は、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに結合され得る（Ｍａｒｔｉｎ及びＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ， １９８２）。また、ドキソルビシンなどの化学療法剤もリポソーム中に含まれてもよい（Ｇａｂｉｚｏｎら， １９８９）。他に異なる組成の有用なリポソームが考慮される。
【０１４７】
１０．ＡＡＰへのＡｂｓの診断上の用途
抗−ＡＡＰ Ａｂｓは、ＡＡＰを限局化させ及び／又は定量するために使用することができる（例えば、組織サンプル中のＡＡＰレベルの測定における使用のため又は診断上の方法における使用のため等）。抗ＡＡＰエピトープＡｂｓは薬剤的に活性な化合物として利用することができる。
抗−ＡＡＰ Ａｂｓは、イムノアフィニティークロマトグラフィー又は免疫沈降などの標準的な技術によりＡＡＰを単離するために使用することができる。これらのアプローチは、細胞及び組織から内在性のＡＡＰ抗原を含むポリペプチドの精製を促進する。これらのアプローチ並びに他のアプローチは、抗原性タンパク質の発現の量及びパターンを評価するためにサンプル中のＡＡＰを検出するために使用することができる。抗−ＡＡＰ Ａｂｓは臨床的なテスト手順の一部として組織中のタンパク質レベルをモニターするのに使用することができる；例えば、任意の治療計画の有効性を決定するため。抗体を検出可能な基質（標識）とカップリングさせることにより、Ａｂ−抗原複合体の検出が可能となる。標識のクラスには、蛍光性、発光性、生物発光性、及び放射活性物質、酵素、及び補欠分子族が含まれる。有用な標識には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ストレプタビジン／ビオチン、アビジン／ビオチン、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイン　イソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン　フルオレセイン、ダンシル　クロライド、フィコエリスリン、ルミノール、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン、及び１２５Ｉ，１３１Ｉ，３５Ｓ又は３Ｈが含まれる。
【０１４８】
１１．抗体治療
本発明のＡｂｓには、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化及び完全体ヒトＡｂｓが含まれ、治療上使用され得る。このような薬剤は、一般に、患者の疾病又は病態を治療又は予防するために用いられるであろう。抗体調製物は、好ましくは高い抗原特異性及び親和性を有しており、一般に標的エピトープ（群）に結合することにより効果を媒介する。一般に、そのようなＡｂｓの投与は２つの効果のうち１つを媒介する：（１）抗体はリガンドの結合を妨げ、内在性のリガンド結合及びそれに続くシグナル伝達を除去する、又は（２）抗体が標的分子のエフェクター部位に結合することによる生理学的な結果を誘発し、シグナル伝達を開始させる。
治療上有効な量の抗体は、一般に、治療目的を達成するのに必要な量、エピトープ結合親和性、投与速度、及び患者からの抗体の除去速度と関係する。治療上有効な用量に関する通常の範囲は、限定はしないが、例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重である。投薬頻度は、例えば、一日二回から週に一回である。
【０１４９】
１２．Ａｂｓの薬剤的組成
抗ＡＡＰ Ａｂｓ並びに他のアッセイで同定されたＡＡＰ相互作用分子（アプタマーなど）は、種々の障害を治療するための薬剤的組成物中にて投与される。そのような組成物を調製することに関与する原則及び考慮並びに構成成分の選択における指針は（ｄｅ Ｂｏｅｒ， １９９４；Ｇｅｎｎａｒｏ， ２０００；Ｌｅｅ， １９９０）中に見出すことができる。
ＡＡＰは細胞内に存在するため、Ａｂｓの完全体がインヒビターとして用いられる場合、細胞内移行するＡｂｓが好ましい。また、リポソームが細胞内への導入のための送達媒体として使用されてもよい。抗体断片が使用される場合、エピトープと特異的に結合する最小の阻害断片が好ましい。例えば、有用な抗体の可変領域配列に基づいて好適なエピトープに結合するペプチド分子を設計することができる。このようなペプチドは、化学的に合成し、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって合成することができる（Ｍａｒａｓｃｏら， １９９３）。また、製剤には、１より多い特定の治療のための活性な化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない活性を伴うものも含まれる。組成物には、細胞毒性剤、サイトカイン、化学療法剤、又は成長阻害剤などの機能を増強させる薬剤が含まれる。
【０１５０】
また、活性成分は、コアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル中に包括させることもできる；例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマクロエマルション中。
インビボ投与に使用される製剤は無菌であることが極めて好ましい。これは、滅菌濾過膜を通した濾過又は多くの何れかの技術により容易に達成される。
【０１５１】
抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスを含み、マトリクスが成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状であるような、徐放性製剤を調製してもよい。徐放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリアクチド（Ｂｏｓｗｅｌｌ及びＳｃｒｉｂｎｅｒ， 米国特許第３，７７３，９１９号， １９７３）、Ｌ−グルタミン酸及びγ−エチル−Ｌ−グルタメート、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、及びポリ−（Ｄ）−（−）−３−ヒドロキシブチル酸酢から構成される注射可能な小球などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマーを含む。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。
【０１５２】
ＡＡＰ組換体発現ベクター及び宿主細胞
ベクターは宿主細胞間でＤＮＡをシャトルするため、又はヌクレオチド配列を発現させる方法として用いられる道具である。幾つかのベクターは原核生物でのみ機能するが、他は原核生物と真核生物の両方で機能し、真核生物中での発現のために原核生物からの大規模ＤＮＡ調製を可能にする。対象のＤＮＡ、ＡＡＰ核酸配列又は断片などの挿入は、ライゲーション技術及び／又は当業者において周知の接合方法により達成される。そのようなＤＮＡは、その組み込みがベクターの何れか必要な構成成分を破壊しないように挿入される。挿入されたＤＮＡをタンパク質に発現させるために使用されるベクターの場合、導入されたＤＮＡは、その転写及び翻訳を支配するベクターエレメントに作用可能に連結される。
【０１５３】
ベクターは、２つの一般的なクラスに分配される：クローニングベクターは、適切な宿主細胞中での伝播には必須ではなく、外来のＤＮＡを挿入し得る領域を持つ複製可能なプラスミド又はファージである；外来ＤＮＡは、まるでベクターの構成成分であるかの如く、複製され、伝播される。発現ベクター（プラスミド、酵母、又は動物ウィルスゲノムなど）は、外来ＤＮＡを転写及び翻訳するために外来性の遺伝学的物質を宿主細胞又は組織中へ導入するために用いられる。発現ベクターにおいて、導入されたＤＮＡは、挿入ＤＮＡを転写するために宿主細胞へシグナルを送るためのプロモーターのようなエレメントに作用可能に連結される。特異的な因子に応答して遺伝子の転写をコントロールする誘導可能なプロモーターのような幾つかのプロモーターは非常に有用である。作用可能に連結するＡＡＰ又はアンチセンスコンストラクトは、ＡＡＰ又は断片、又はアンチセンスコンストラクトの発現をコントロールすることができる。古典的な誘導可能なプロモーターの例には、α−インターフェロン、ヒートショック、重金属イオン、及びグルココルチコイドなどのステロイド（Ｋａｕｆｍａｎ， １９９０）及びテトラサイクリンに応答するものが含まれる。他の望ましい誘導可能なプロモーターには、コンストラクトが存在する細胞には内在しないものではあるが、誘導剤が外から供給された場合には細胞内で応答するものが含まれる。
【０１５４】
ベクターは、多くの異なる徴候を持つ。「プラスミド」は、付加的なＤＮＡセグメントが導入され得る環状二重鎖ＤＮＡ分子のことである。ウィルスベクターは、付加的なＤＮＡセグメントをウィルスゲノム中に受け入れることができる。ある種のベクターは宿主細胞中で自律複製することができる（例えば、バクテリアの複製起点を持つバクテリアのベクターと、エピソームである哺乳類のベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳類ベクター）は宿主細胞中に導入されると宿主細胞中のゲノムに組込まれ、それにより宿主ゲノムと一緒に複製される。一般的には、有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドである。しかしながら、発現ベクターの他の形態、ウィルスベクター（例えば、複製欠損レトロウィルス、アデノウィルス及びアデノ関連ウィルス）などが考慮される。
【０１５５】
ＡＡＰ（又は断片）を含む組換体発現ベクターは、ＡＡＰと作用可能に結合された一又は複数の宿主細胞応答（又はインビトロで操作可能な）制御配列を利用することにより、ＡＡＰの転写を制御する。「作用可能に結合された」とは、対象のヌクレオチド配列がヌクレオチド配列の発現が達成されるように制御配列と結合されていることを意味する。
ベクターを種々の生物及び／又は細胞中に導入することができる（表Ｄ）。或いは、該ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター制御配列とＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写及び翻訳することができる。
【０１５６】
Figure 2004514404
Figure 2004514404
【０１５７】
ベクターの選択は、用いられる生物又は細胞及びベクターの望まれる運命によって影響される。ベクターは、標的細胞中で一度複製するか、又は「自殺」ベクターであり得る。一般に、ベクターはシグナル配列、複製起点、マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらのエレメントの選択は、ベクターが使用される生物に依存して、容易に決定される。これらのエレメントの幾つかは、誘導可能又は条件が整うと「オン」になる条件的プロモーターのような、条件的なものである。誘導可能なプロモーターの例には、組織特異的で、ある種の細胞型に対しては発現を低下させるもの、ステロイド応答性のもの、又はヒートショックに反応するものが含まれる。ｌａｃオペロンなどのある種のバクテリアの抑制システムは、哺乳類細胞及び遺伝子操作動物中で利用される（Ｆｉｅｃｋら， １９９２；Ｗｙｂｏｒｓｋｉら， １９９６；Ｗｙｂｏｒｓｋｉ及びＳｈｏｒｔ， １９９１）。ベクターはベクターが取り込まれた細胞の同定を促進するためにしばしば選択マーカーを使用する。多くの選択マーカーは原核生物の使用に関する技術において周知であり、通常、抗生物質耐性遺伝子又は独立栄養性及び栄養要求性突然変異である。
【０１５８】
アンチセンス及びセンスのＡＡＰオリゴヌクレオチドを用いると、ＡＡＰポリペプチド発現を妨げることができる。これらのオリゴヌクレオチドは標的核酸配列に結合し、二重鎖の分解を増強し、未成熟な転写又は翻訳を終結させること、又はその他の方法によって標的配列の転写又は翻訳を阻止する二重鎖を形成する。
アンチセンス又はセンスのオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡの何れかである単一鎖核酸であり、標的ＡＡＰ ｍＲＮＡ（センス）又はＡＡＰ ＤＮＡ（アンチセンス）配列と結合することができる。当該発明によると、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４から３０ヌクレオチドのＡＡＰ ＤＮＡのコード化領域の断片を含む。一般に、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、少なくとも５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０，５５，６０，６５，７０，７５，８０，８５，９０，９５，１００塩基の長さ又はそれより長い塩基をを含み得る。特に、（Ｓｔｅｉｎ及びＣｏｈｅｎ， １９８８；ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌら， １９８８ａ）は任意のｃＤＮＡ配列に由来するアンチセンスまたはセンスのオリゴヌクレオチドを導き出す方法を記述する。
【０１５９】
アンチセンス及びセンスのオリゴヌクレオチドの修飾は、それらの効果を増大させる。修飾された糖−リン酸ジエステル結合又は他の糖結合（国際公開第９１／０６６２９号， １９９１）は、標的配列に対する結合特異性は破壊せずに内在性のヌクレアーゼに対する耐性を付与することにより、インビボにおける安定性を増加させる。共有結合された有機的部分（国際公開第９０／１０４４８号， １９９０）又はポリ−（Ｌ）−リジンのような他の修飾は、標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増加させることができる。他の吸着物は標的に対するオリゴヌクレオチドの結合特異性を修飾し、金属複合体又はインターカレート化（例えば、エリプチシン）又はアルキル化剤が含まれる。
アンチセンス又はセンスのオリゴヌクレオチドを標的細胞（標的核酸配列を含む細胞）中へ導入するために、何れかの遺伝子転移法が使用され、当業者において周知である。遺伝子転移法の例には、１）エプステイン−バーウィルス様遺伝子転移ベクター又は外来性のＤＮＡをリガンド結合分子に結合させる（国際公開第９１／０４７５３号， １９９１）などの、生物学的方法、２）エレクトロポレーションのような物理的な方法、及び３）ＣａＰＯ４沈殿及びオリゴヌクレオチド−脂質複合体（国際公開第９０／１０４４８号， １９９０）などの化学的な方法が含まれる。
【０１６０】
「宿主細胞」及び「組換体宿主細胞」という用語は、互いに交換可能に使用される。これらの用語は、特定の対象細胞だけではなく、これらの細胞の子孫又は潜在的な子孫をも意味する。突然変異又は環境による影響のどちらかによりある種の修飾が、次の世代で生じるため、実際は、このような子孫は親細胞と同一ではない可能性があるが、やはり発明の範囲に含まれる。
真核細胞のトランスフェクション及び原核細胞のトランスフォーメーションは、当該技術において周知である。宿主細胞の選択は対象の核酸を導入するための好適な技術を決定する。表Ｅには、限定を意味するものではないが、当該技術において多くの周知技術をまとめてある。また、生物への核酸の導入、もしあれば特定の生物に対してインビトロのトランスフェクション技術、並びに確立された遺伝学的技術を用いるエキソビボの技術によっても行われる可能性がある。
【０１６１】
Figure 2004514404
Figure 2004514404
Figure 2004514404
【０１６２】
ベクターは、該ベクターが取り込まれた細胞の同定を促進するためにしばしば選択マーカーが用いられる。多くの選択マーカーは、原核生物の使用、通常は、抗生物質耐性遺伝子又は独立栄養性及び栄養要求性突然変異の使用に関する技術分野において周知である。表Ｆには哺乳動物細胞のトランスフェクションに対するしばしば利用される選択マーカーが列挙されている。
【０１６３】
表Ｆ　真核生物細胞トランスフェクションにとって有用な選択可能なマーカー
Figure 2004514404
【０１６４】
原核細胞の又は真核細胞の宿主培養細胞などの本発明における宿主細胞は、ＡＡＰを生産するために使用することができる。従って、本発明は本発明の宿主細胞を用いてＡＡＰを生産するための方法を提供する。一実施態様において、本方法は、ＡＡＰが発現されるような適切な培地中で、本発明の宿主細胞（ＡＡＰをコードする組換体発現ベクターが導入される）を培養することを含む。他の実施態様において、本方法には、さらにＡＡＰを培地又は宿主細胞から単離することが含まれる。
【０１６５】
遺伝子導入ＡＡＰ動物
遺伝子導入動物は、ＡＡＰの機能及び／又は活性を研究し、ＡＡＰ活性の修飾因子を同定し及び／又は評価するために有用である。「遺伝子導入動物」は、非ヒト動物であり、好ましくは、哺乳動物、更に好ましくは、ラット又はマウスなどの齧歯類であって、その細胞の一又は複数は導入遺伝子を包含する。他の遺伝子導入動物には、霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、チキン、両生類などが含まれる。「導入遺伝子」は遺伝子導入動物が発育する細胞のゲノム中に組込まれ、成熟した動物のゲノム中にも残存する外来性のＤＮＡである。遺伝子導入は、好ましくは一又は複数の細胞型又は組織中で天然にコードされる遺伝子産物の発現を妨げる（ノックアウト遺伝子導入動物）、又は組み込み、染色体上での配置、又は組換え領域のマーカー又は指示薬として役立つ（例えばｃｒｅ／ｌｏｘＰマウス）目的を持って、遺伝子導入動物の一又は複数の細胞型又は組織中でコードする遺伝子産物の発現を導く。「相同組換え動物」は、齧歯類のような非ヒト動物であり、動物を発育させる前に（例えば、胎児性の）細胞中で内在性のＡＡＰと相同的に組換わる外来性ＤＮＡ分子によって内在性ＡＡＰが変えられてきた。外来性のＡＡＰを持つ、ＡＡＰコード化配列が導入された受精後の卵母細胞又は胎児性の幹細胞などの宿主細胞は、非ヒト遺伝子導入動物を生産するために使用される。その後、このような宿主細胞は非ヒト遺伝子導入動物又は相同組換え動物を創造するために用いることができる。
【０１６６】
１．遺伝子導入動物の生産へのアプローチ
遺伝子導入動物は、ＡＡＰを受精後の卵母細胞を中のオスの前核中に導入し（例えば、マイクロインジェクション、レトロウィルス感染によって）、卵母細胞が疑似妊娠したメスの養育動物（ｐｆｆａ）中で発育することを可能にすることにより創り出すことができる。ＡＡＰ ｃＤＮＡ配列（配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３又は１５）は、非ヒト動物のゲノム中に導入遺伝子として導入することができる。或いは、ＡＡＰの天然に生じる変異体などのＡＡＰの相同体を導入遺伝子として用いることができる。また、介在配列及びポリアデニル化シグナルも導入遺伝子の発現を増加させるために導入遺伝子中に含まれることが可能である。組織特異的な制御配列は、特定の細胞でＡＡＰ の発現を導くようにＡＡＰ 導入遺伝子と作用可能に結合させることができる。胎児の操作及びマイクロインジェクションを介した遺伝子導入動物、特にマウスなどの動物を生産するための方法は、当該技術分野において通常の方法、例えば、（Ｅｖａｎｓら， 米国特許第４，８７０，００９号， １９８９；Ｈｏｇａｎ， ０８７９６９３８４３， １９９４；Ｌｅｄｅｒ及びＳｔｅｗａｒｔ， 米国特許第４，７３６，８６６号， １９８８；Ｗａｇｎｅｒ及びＨｏｐｐｅ， 米国特許第 ４，８７３，１９１号， １９８９）となっている。他の非マウス遺伝子導入マウスは、類似の方法によって作製され得る。遺伝子導入創出動物は、更なる遺伝子導入動物を繁殖させるために用いることができ、そのゲノム中での導入遺伝子の存在及び／又は動物の組織又は細胞中での導入ｍＲＮＡの発現に基づいて同定することができる。遺伝子導入動物は、他の導入遺伝子を保有する遺伝子導入動物を繁殖させることができる。
【０１６７】
２．遺伝子導入動物を作製するためのベクター
相同組換え動物を産み出すために、欠損、付加又は置換が、例えば、機能的にＡＡＰを破壊するような変更を行うように導入されたＡＡＰの少なくとも一部を含むベクター。ＡＡＰはマウス遺伝子、又は天然に生じる変異体などの他のＡＡＰ相同体であり得る。一つのアプローチは、ノックアウトベクターは、相同組換えによって、内在性ＡＡＰ遺伝子を機能的に破壊し、その結果、たとえあるにしても非機能的なＡＡＰタンパク質が発現される。
【０１６８】
或いは、ベクターは、相同組換えにおいて、内在性ＡＡＰが変異され、さもなくば変更されるが、依然として機能的なタンパク質をコードするように設計することができる（例えば、上流の制御領域は、結果的に内在性のＡＡＰの発現を変更するように変更することができる）。このタイプの相同組換えベクターにおいて、ＡＡＰの改変された部分は、ベクターによって運ばれる外来性のＡＡＰと胎児性幹細胞中の内在性ＡＡＰとの間に生じる相同組換えを可能ならしめるために、ＡＡＰの付加的な核酸によってその５’及び３’末端に隣接される。付加的な隣接するＡＡＰ核酸は、内在性ＡＡＰと相同組換えを引き起こすために十分なものである。典型的には、数キロベースの隣接ＤＮＡ（５’及び３’の両末端における）は、ベクター中に包含される（Ｔｈｏｍａｓ及びＣａｐｅｃｃｈｉ， １９８７）。その後、ベクターは、胎児性幹細胞株中に導入され（例えば、エレクトロポレーションにより）、導入されたＡＡＰが相同的に内在性のＡＡＰと組換わった細胞が選択される（Ｌｉら， １９９２）。
【０１６９】
３．ＡＡＰ導入遺伝子の発生中の細胞への導入
選択された細胞は、その後、集合キメラを形成させるために動物（例えば、マウス）の胚盤胞中へインジェクトされる（Ｂｒａｄｌｅｙ， １９８７）。その後、キメラ胎児は偽妊娠の雌性乳母中へ移植され、胎児には名前が付けられる。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は、導入遺伝子の生殖系列伝達によって相同的に組換えられたＤＮＡを動物の全細胞において含む動物を繁殖させるために使用される。相同組換えベクター及び相同組換え動物を構築するための方法が記述されている（Ｂｅｒｎｓら， 国際公開第９３／０４１６９号， １９９３；Ｂｒａｄｌｅｙ， １９９１；Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら， 国際公開第９１／０１１４０号， １９９１；Ｌｅ Ｍｏｕｅｌｌｉｃ及びＢｒｕｌｌｅｔ， 国際公開第９０／１１３５４号， １９９０）。
【０１７０】
或いは、導入遺伝子の制御された発現を可能ならしめるような選択された系を含む遺伝子導入動物が産み出され得る。そのような系の例として、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系がある（Ｌａｋｓｏら， １９９２）。他のリコンビナーゼの系は、出芽酵母のＦＬＰリコンビナーゼの系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら， １９９１）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が導入遺伝子の発現を制御するために用いられる場合、Ｃｒｅリコンビナーゼ及び選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を持った動物が必要となる。そのような動物は、選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を持つ動物と、リコンビナーゼをコードする導入遺伝子を持つ動物とを交尾させることによって、「二重」遺伝子導入動物として作製することが可能である。
【０１７１】
また、遺伝子導入動物のクローンも作製することができる（Ｗｉｌｍｕｔら， １９９７）。簡単に述べると、遺伝子導入動物由来の細胞は単離することができ、増殖サイクルを脱出してＧ０期に移行するように誘導することができる。その後、静止期の細胞は、該静止期細胞が単離された種と同一の動物由来の徐核卵母細胞と融合させることができる。再構成された卵母細胞は、その後、桑実胚又は未分化胚芽細胞に発生するまで培養し、次いで偽妊娠の雌性乳母中へ導入される。該雌の乳母から生まれた子孫は、「親」遺伝子導入動物のクローンとなる。
【０１７２】
薬剤的組成物
本発明のＡＡＰの核酸分子、ＡＡＰのポリペプチド及び抗−ＡＡＰ Ａｂｓ（活性化合物）、及びその誘導体、断片、類似体及び相同体は、薬剤的組成物中へ取り込まれ得る。典型的に、そのような組成物には、核酸分子、タンパク質又は抗体及び製薬的に受容可能な坦体が含まれる。「製薬的に受容可能な坦体」は、何れかの及び全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、アイソトニックで吸着を遅らせる薬剤、及びその類似物を含み、薬剤的投与に適合する（Ｇｅｎｎａｒｏ， ２０００）。そのような担体又は希釈剤の好ましい例には、限定はしないが、水、生理食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液、及び５％のヒト血清アルブミンが含まれる。リポソーム及び不揮発性油などの非水溶性媒体も用いられる。従来の培地又は薬剤が活性な化合物に適合しない場合以外は、これらの組成物の使用が考慮される。補充性の活性化合物も該組成物中に取り込まれる。
【０１７３】
１．一般的な検討事項
本発明の薬剤的な組成物は、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入など）、経皮性（即ち、局所的な）、経粘膜、及び直腸の投与を含む、意図された投与経路に適合するように製剤化される。非経口、皮内、又は皮下への適用のために使用される溶液又は懸濁液は：注射用の水などの滅菌的希釈液、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒；ベンジルアルコール又は他のメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩などのバッファー、及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの張性の調製のための薬剤を含み得る。ｐＨは塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調製され得る。非径口的標品はアンプル、ガラスもしくはプラスチック製の使い捨てシリンジ又は複数回投与用バイアル中に収納される。
【０１７４】
２．注射可能な製剤
注射に適する薬剤的組成物には、滅菌的な注射可能な溶液又は分散媒を即座に調製するための滅菌的水溶液（水溶性の）又は分散媒及び滅菌性のパウダーが含まれる。静脈内の投与に関し、適切な担体には生理食塩水、静菌水、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ ＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ， Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ， Ｎ．Ｊ．）、又はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合において、組成物は滅菌的であって、シリンジを用いて投与されるために流動的でなくてはならない。このような組成物は、調剤及び保存の間、安定であるべきで、バクテリア及び真菌などの微生物由来のコンタミネーションから保護されなくてはならない。担体は、例えば、水、エタノール、
ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及び適切な混合物を含む溶媒又は分散媒培地であり得る。例えば、レクチンなどのコーティング剤を用い、分散媒においては必要とされる粒子サイズを維持し、界面活性剤を用いることにより適度な流動性が維持される。種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、及びチメロサールなどは、微生物のコンタミネーションを含み得る。例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール及び塩化ナトリウムのような等張性を保つ薬剤が組成物中に含まれ得る。吸着を遅らせることができる組成物には、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの薬剤が含まれる。
【０１７５】
滅菌的な注射可能溶液は、必要な成分の一又は組み合わせとともに、適切な溶媒中に必要量の活性化合物（例えば、ＡＡＰ又は抗ＡＡＰ抗体）を取り込み、次に滅菌することで調製することができる。一般に、分散媒は、基本的な分散培地及び上述したその他の必要成分を含む滅菌的媒体中に活性化合物を取り込むことにより調製される。滅菌的な注射可能な溶液の調製のための滅菌的なパウダーの調製方法には、活性な成分及び滅菌溶液に由来する何れかの所望な成分を含むパウダーをもたらす真空乾燥及び凍結乾燥が含まれる。
【０１７６】
３．経口組成物
通常、経口組成物には、不活性な希釈剤又は食用に適する担体が含まれる。それらは、ゼラチンのカプセル中に包含されるか、加圧されて錠剤化される。経口治療的な投与の目的には、活性化合物は賦形剤と共に取り込まれ、錠剤、トローチ又はカプセルの形態で使用される。また、経口組成物は、うがい薬としての使用のための流動性担体を用いて調製することも可能であり、流動性担体中の該組成物は経口的に適用される。製薬的に適合する結合剤、及び／又はアジュバント物質が包含され得る。錠剤、丸薬、カプセル、トローチ及びその類似物は以下の成分又は類似の性質を持つ化合物の何れかを含み得る：微結晶性セルロース、ガム　トラガガント又はゼラチンなどの結合剤；スターチ又はラクトースなどの賦形剤、アルギン酸などの崩壊性剤、ＰＲＩＭＯＧＥＬ、又はコーンスターチ；ステアリン酸マグネシウム又はＳＴＥＲＯＴＥＳなどの潤滑剤；コロイド性シリコン二酸化物などの滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）；スクロース又はサッカリンなどの甘味剤；又はペパーミント、メチルサリシル酸又はオレンジフレイバーなどの香料添加剤。
【０１７７】
４．吸入用組成物
吸入による投与に対して、化合物は、例えば、二酸化炭素などのガスのような適切な噴霧剤を含むネブライザー又は加圧容器からのエアロゾルスプレーとして提供される。
【０１７８】
５．全身投与
また、全身投与は経粘膜的又は経皮的でもあり得る。経粘膜的又は経皮的投与について、標的のバリアー（群）を透過することができる浸透剤が選択される。経粘膜浸透剤は界面活性剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が含まれる。経鼻スプレー又は坐薬は経粘膜的な投与に対して使用することができる。経粘膜的投与に対して、活性化合物はオイントメント、軟膏、ジェル又はクリーム中へ製剤化される。
また、化合物は、直腸への送達に対して、坐薬（例えば、ココアバター及び他のグリセリドなどの基剤と共に）又は滞留性の浣腸の形態で調製することもできる。
【０１７９】
６．担体
一実施態様において、活性化合物は、植込錠及びマイクロカプセルに封入された送達システムを含む制御放出製剤などの、体内からすぐに除去されることから化合物を保護する担体で調製される。エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生物分解性、生物適合性ポリマーが使用され得る。このような材料は、ＡＬＺＡ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）及びＮＯＶＡ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅ Ｅｌｓｉｎｏｒｅ， ＣＡ）から入手可能であり、当業者によって調製されることが可能である。また、リポソームの懸濁液も製薬的に受容可能な坦体として使用することができる。これらは、（Ｅｐｐｓｔｅｉｎら， 米国特許第４，５２２，８１１号， １９８５）にあるように当業者にとって既知の方法に従って調製することができる。
【０１８０】
７．単位投与量
単位投与量の形での経口製剤又は非経口製剤は、投与及び投与量の均一性を促進するように作成される。単位投与量形態は、治療されるべき患者に対する一回の投与量に適した物理的に別個の単位であって、必要とされる製薬的な担体と共に活性化合物の治療上の有効量を含む単位を意味する。本発明の単位投与量形態に対する特定化は、活性化合物のユニークな特徴及び特に所望される治療上の効果、及び活性化合物を化合物化すること固有の限界によって影響され、直接依存する。
【０１８１】
８．遺伝子治療組成物
本発明の核酸分子は、ベクター中に挿入することができ、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、患者へ、例えば、静脈内注射、局所的投与（Ｎａｂｅｌ及びＮａｂｅｌ， 米国特許第５，３２８，４７０号， １９９４）又は定位的な注射（Ｃｈｅｎら， １９９４）によって送達させることができる。遺伝子治療ベクターの製薬的調剤物は、受容可能な希釈剤を包含することができ、又は遺伝子送達媒体が組込まれた緩徐放出マトリックスを含むことができる。或いは、完全な遺伝子送達ベクターは、例えばレトロウィルスベクターのように、組換え体細胞から無傷で生産されるが、製薬的な調剤には、遺伝子送達系を生み出す一又は複数の細胞を包含し得る。
【０１８２】
９．投与量
本発明の製薬的組成物及び方法は、更に、ここに記しているような、上述にて言及した病理的症状の治療に通常は応用される。
ＡＡＰ調節を必要とする症状の治療又は予防では、適切な投与量のレベルは、一般的には、単一又は複数投与で投与することができる、患者体重１ｋｇ当たり約０．０１〜５００ｍｇである。好ましくは、投与量レベルは、１日当たり約０．１〜約２５０ｍｇ／ｋｇである；より好ましくは、１日当たり約０．５〜約１００ｍｇ／ｋｇである。適切な投与量のレベルは、１日当たり約０．０１〜２５０ｍｇ／ｋｇ、１日当たり約０．０５〜１００ｍｇ／ｋｇ、又は１日当たり約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇであってよい。この範囲内では、投与量は、１日当たり０．０５〜０．５，０．５〜５又は５０ｍｇ／ｋｇである。経口投与のためには、組成物は、好ましくは錠剤の形態で提供され、１．０〜１０００ミリグラムの活性成分、特に、１．０，５．０，１０．０，１５．０，２０．０，２５．０，５０．０，７５．０，１００．０，１５０．０，２００．０，２５０．０，３００．０，４００．０，５００．０，６００．０，７５０．０，８００．０，９００．０，及び１０００．０ミリグラムの症候を調節するための活性成分の治療されるべき患者に対する投与量である。化合物は、投与計画に基づいて、１日当たり１〜４回、好ましくは１日当たり１回又は２回投与され得る。
しかしながら、任意の特定な患者に対する、特定の投与レベル及び投与量の頻度が変化してもよく、用いられる特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性及び作用の長さ、年齢、体重、身体全体の健康、性別、食事、投与の方法と時間、排泄速度、薬の組み合わせ、特定の症状の重症度、及び治療を受ける宿主を含む、種々の因子に依存するであろうことが理解されている。
【０１８３】
１０．製薬的組成物に関するキット
製薬的組成物はキット、容器、パック、又はディスペンサー中に投与の説明書と共に含めることができる。本発明はキットとして供給される場合、組成物の異なる構成成分が別々の容器中に包装され、使用直前に混合される。このように構成成分を別々に包装することは、活性構成成分の機能を失うことなく、長期間の貯蔵を可能にすることができる。
また、キットは診断テスト又は組織タイピングなどの特異的なテストの実施を促進するように、別々の容器中に試薬を包含する。例えば、ＡＡＰ ＤＮＡテンプレート及び適切なプライマーが内部コントロールとして供給される。
【０１８４】
（ａ）容器又は器（ｖｅｓｓｅｌ）
キット中に含まれる試薬は、異なる構成成分の寿命が持続され、容器の材質によって吸着されず、変化されないような何れかの種類の容器中に供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、凍結乾燥されたルシフェラーゼ又は窒素ガスのような中性で、不反応性ガスの下で包装されたバッファーを含む。アンプルは、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属、又は試薬を保持するために典型的に用いられる他の何れかの適切な材料など何れか適切な材質から構成される。他の適切な容器の例には、アンプルなどの類似の物質から作られる簡単なボトル、及びアルミニウム又は合金などのホイルで裏打ちされた内部によって構成される包装材が含まれる。他の容器には、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジ、又はその類似物がが含まれる。容器は、皮下用注射針で貫通可能でストッパを有するボトルなどの無菌のアクセスポートを有する。他の容器には、容易に除去可能で、除去することで区画を混合させるような膜によって分離された２つの区画を有する。除去可能な膜は、ガラス、プラスチック、ラバーなどである。
【０１８５】
（ｂ）使用説明書
また、キットには使用説明書も供給されている。指示は、紙又は他の材質上に印刷され、及び／又はフロッピーディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどの電気的に読み取り可能な媒体として供給されてもよい。詳細な指示は、キットに物理的に付随していないかもしれない；その代わりに、使用者はキットの製造者又は分配者によって指定され又は電子メールで供給されるウェッブサイトが案内されるであろう。
【０１８６】
スクリーニング及び検出方法
本発明の単離された核酸分子は、ＡＡＰを発現させ（例えば、遺伝子治療の適用における宿主細胞中での組換体発現ベクターを介して）、ＡＡＰ ｍＲＮＡ（例えば、生物学的サンプル中の）又はＡＡＰ中の遺伝的傷害を検出し、後述のようにＡＡＰの活性を調節するために使用される。さらに、ＡＡＰポリペプチドはＡＡＰ活性又は発現を調節する薬剤又は化合物をスクリーニングし、並びにＡＡＰの不十分な又は過剰な生産又は減少されたＡＡＰの生産又はＡＡＰの野生型タンパク質と比較すると異常である活性によって特徴付けられる疾患を治療し、又はＡＡＰが関与する生物学的機能を調節するために使用することができる。さらに、本発明の抗ＡＡＰＡｂｓは、ＡＡＰを検出し、単離し、及びＡＡＰ活性を調節するために使用することができる。
【０１８７】
１．スクリーニングアッセイ
本発明は、細胞中の遺伝子の翻訳、転写、活性又はコピーを含むＡＡＰへの刺激的又は阻害的な影響を与える様式、即ち、候補又はテスト化合物又は薬剤（例えば、ペプチド、ペプチドミメティクス、小分子、又は他の薬物）、食物、これらの組合わせなどを同定するための方法（スクリーニングアッセイ）を提供する。また、本発明は、スクリーニングアッセイにおいて同定される化合物も含む。
ＡＡＰ活性を増大又は減少させる化合物をテストすることが望ましい。化合物は：（１）細胞中の遺伝子のコピー数に影響を与えることにより（増幅因子及び減少因子）；（２）ＡＡＰの転写を増加又は減少させることにより（転写上方制御因子及び転写下方制御因子）；（３）タンパク質へのＡＡＰ ｍＲＮＡの翻訳を増大又は減少させることにより（翻訳上方制御因子及び翻訳下方制御因子）；又は（４）ＡＡＰそれ自体の活性を増大又は減少させることにより（アゴニスト及びアンタゴニスト）、ＡＡＰの活性を調節する。
【０１８８】
（ａ）化合物の影響
ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質レベルでＡＡＰに影響を与える化合物を同定するために、細胞又は生物体を候補化合物と接触させ、ＡＡＰ ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質における対応する変化を評価する（Ａｕｓｕｂｅｌら， １９８７）。ＤＮＡ増幅因子及び減少因子については、ＡＡＰ ＤＮＡの量が測定され、転写上方制御因子及び下方制御因子である化合物については、ＡＡＰ ｍＲＮＡの量が測定され；翻訳上方制御因子及び下方制御因子である化合物については、ＡＡＰポリペプチドの量が測定される。アゴニスト又はアンタゴニストである化合物は、細胞又は生物体を化合物に接触させ、その後、インビトロにおける脂肪細胞の分化を測定することにより同定される。
【０１８９】
一実施態様において、候補又はＡＡＰの活性又はポリペプチド又は生物学的に活性なタンパク質と結合又は調節するテスト化合物をスクリーニングするための多くのアッセイが利用可能である。テスト化合物は：生物学的ライブラリー；空間的アドレス可能固相又は液相ライブラリー；逆重畳積分を必要とする合成ライブラリー法；「一ビーズ一化合物」ライブラリー法；及びアフィニティークロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリー法を含む、コンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチの何れかを用いて得ることが可能である。生物学的ライブラリーによるアプローチは、ペプチドに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー又は化合物の小分子ライブラリーを包含する（Ｌａｍ， １９９７）。
【０１９０】
（ｂ）小分子
「小分子」とは約５ｋＤ未満の分子量を持つ組成物のことを指し、最も好ましくは約４ｋＤ未満、最も好ましくは０．６ｋＤ未満である。小分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティクス、炭水化物、脂質又は他の有機もしくは無機分子であり得る。化学及び／又は真菌、バクテリア、又は藻類の抽出物などの生物学的混合物のライブラリーは、当該技術分野において既知であり、本発明のアッセイの何れかによりスクリーニングすることができる。分子ライブラリーの合成のための方法の実例は：（Ｃａｒｅｌｌら， １９９４ａ；Ｃａｒｅｌｌら， １９９４ｂ；Ｃｈｏら， １９９３；ＤｅＷｉｔｔら， １９９３；Ｇａｌｌｏｐら， １９９４；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら， １９９４）中に見出すことができる。
【０１９１】
化合物のライブラリーは溶液中（Ｈｏｕｇｈｔｅｎら， １９９２）又はビーズ上（Ｌａｍら， １９９１）、チップ上（Ｆｏｄｏｒら， １９９３）、バクテリア、胞子（Ｌａｄｎｅｒら， 米国特許第５，２２３，４０９号， １９９３）、プラスミド（Ｃｕｌｌら， １９９２）又はファージ（Ｃｗｉｒｌａら， １９９０；Ｄｅｖｌｉｎら， １９９０；Ｆｅｌｉｃｉら， １９９１；Ｌａｄｎｅｒら， 米国特許第５，２２３，４０９号， １９９３；Ｓｃｏｔｔ及びＳｍｉｔｈ， １９９０）上に提供されてもよい。無細胞アッセイには、アッセイ混合物を形成させるためにＡＡＰ又は生物学的に活性な断片にＡＡＰと結合する既知の化合物を接触させ、アッセイ混合物にテスト化合物を接触させ、テスト化合物がＡＡＰと相互作用する能力を決定することが含まれるが、テスト化合物がＡＡＰと相互作用する能力を決定することには、ＡＡＰがＡＡＰ標的分子と優先的に結合し、又はその活性を調節する能力を決定することを含む。
【０１９２】
（ｃ）無細胞アッセイ
本発明の無細胞アッセイはＡＡＰの可溶性又は膜結合形態のどちらを利用してもよい。膜結合形態を含む無細胞アッセイの場合、ＡＡＰを溶液中に保つために可溶化剤を要する。そのような可溶化剤の例には、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００及びＴＲＩＴＯＮ（登録商標）シリーズから選択されるその他のもの、ＴＨＥＳＩＴ（登録商標）、イソトリデシポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルフォン酸、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンミニオール−１−プロパンスルフォン酸（ＣＨＡＰＳ）、又は３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンミニオール−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルフォン酸（ＣＨＡＰＳＯ）が含まれる。
【０１９３】
（ｄ）スクリーニングを促進するための標的分子の固定化
アッセイ方法の２以上の実施態様において、ＡＡＰ又はそのパートナー分子の何れかを固定化することは、タンパク質の一方又は両方の複合化されていない形態から複合化されたものの分離を促進し、同時にハイスループットアッセイを適応化させる。ＡＡＰへのテスト化合物の結合、又は候補化合物の存在下及び非存在下におけるＡＡＰの標的分子との相互作用は、反応物を収納するのに適した、マイクロタイタープレート、試験管、及び微小遠心管などの何れかの容器中で達成される。タンパク質の一方又は両方がマトリックスに結合することを許容するドメインを付加するように、融合タンパク質が提供され得る。例えば、ＧＳＴ−ＡＡＰ融合タンパク質又はＧＳＴ−標的融合タンパク質は、後にテスト化合物又はテスト化合物及び非吸着標的タンパク質又はＡＡＰの何れかと混合されるグルタチオンセファロースビーズ（ＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）又はグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着され、その混合物は複合体形成に至る条件下（例えば、塩及びｐＨに関して生理学的な条件にて）でインキュベートされる。インキュベーションの後、ビーズ又はマイクロタイタープレートウェルは、いずれの非結合成分をも除去するために洗浄され、ビーズの場合はマトリックスが固定化され、複合体は例えば上述のように直接又は間接的に決定される。或いは、複合体はマトリックスから分離され、ＡＡＰの結合又は活性レベルが標準的な技術を用いて決定される。
【０１９４】
また、マトリックス上にタンパク質を固定化するためのその他の技術がスクリーニングアッセイにおいて用いられ得る。ＡＡＰ又はその標的分子のどちらかをビオチン−アビジン又はビオチン−ストレプタビジンシステムを用いて固定化させることができる。ビオチン化は、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド；ＰＩＥＲＣＥ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）などの多くの試薬によって達成され、ストレプタビジンでコートした９６ウェルプレート（ＰＩＥＲＣＥ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェル中に固定化され得る。或いは、ＡＡＰ又は標的分子に反応性のＡｂｓが、標的分子とＡＡＰとの結合を妨げることなく、プレートウェルに誘導体化され、非結合標的又はＡＡＰが抗体結合によってトラップされる。そのような複合体を検出する方法は、ＧＳＴ−固定化複合体に関して記載されているものに加えて、ＡＡＰ又はその標的と反応性のＡｂｓを用いる複合体の免疫的検出、並びにＡＡＰ又は標的分子に関連する酵素的活性の検出に基づく酵素共役アッセイを含む。
【０１９５】
（ｅ）調節因子を同定するためのスクリーニング
ＡＡＰ発現の調節因子は、細胞を候補化合物と接触する方法において同定することができ、細胞中でのＡＡＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現が決定される。候補化合物の存在下におけるＡＡＰ ｍＲＮＡの発現レベルが、候補化合物の非存在下におけるＡＡＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質レベルと比較される。次いで、候補化合物は、この比較に基づいて発現されるＡＡＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質のモジュレーターとして同定されることが可能である。例えば、ＡＡＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルが候補化合物の存在下において、その非存在下よりも多い（即ち、統計学的に有意に）場合、候補化合物は、ＡＡＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現の刺激因子として同定される。或いは、ＡＡＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現が候補化合物の存在下において、その非存在下よりも少ない（統計学的に有意に）場合、候補化合物は、ＡＡＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現の阻害因子として同定される。ＡＡＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現のレベルは、ＡＡＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質を検出するために記述された方法によって決定することができる。
【０１９６】
（ｉ）ハイブリッドアッセイ
本発明のさらに他の態様において、ＡＡＰは、ＡＡＰと結合もしくは相互作用してＡＡＰ活性を調節する他のタンパク質を同定するために、２ハイブリッド又は３ハイブリット（Ｂａｒｔｅｌら．， １９９３；Ｂｒｅｎｔら．， 国際公開第９４／１０３００号， １９９４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら．， １９９３；Ｍａｄｕｒａら．， １９９３；Ｓａｉｆｅｒら．， 米国特許第５，２８３，３１７号， １９９４；Ｚｅｒｖｏｓら．， １９９３）における「おとり」として使用され得る。また、そのようなＡＡＰ−ｂｐｓは、例えば、ＡＡＰ経路の上流又は下流エレメントとしてＡＡＰによるシグナル伝達にも関与する。
【０１９７】
２ハイブリッドシステムはほとんどの転写因子のモジュラー（ｍｏｄｕｌａｒ）的性質に基づいており、分離可能なＤＮＡ結合及び活性化ドメインから成る。簡単には、該アッセイは二つの異なるＤＮＡコンストラクトを利用する。一方のコンストラクトにおいて、ＡＡＰをコードする遺伝子は、既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子と融合される。他方のコンストラクトは、未同定タンパク質（「捕獲」又は「試料」）をコードするＤＮＡ配列のライブラリーに由来するＤＮＡ配列が、既知の転写因子の活性化ドメインと融合される。「おとり」及び「捕獲」タンパク質がインヴィボにおいて相互作用することができると、ＡＡＰ依存的複合体を形成し、転写因子のＤＮＡ結合及び活性化ドメインが極めて近傍に位置せられることになる。この接近により転写因子に反応性の転写制御部位と作用可能に結合されたレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写が許容される。レポーター遺伝子の発現が検出され、機能的な転写因子を含む細胞コロニーが単離され、ＡＡＰ相互作用タンパク質をコードするクローン化遺伝子を得るために使用することができる。
【０１９８】
さらに、本発明は上述のスクリーニングアッセイにより同定された新規薬剤及びここで上述した治療についてのその使用に関する。
２．検出アッセイ
ここで同定されるＡＡＰ ｃＤＮＡ配列の部分又は断片（及び完全なＡＡＰ遺伝子配列）は、それら自体有用である。非限定的な例として、これらの配列は：（１）極めて少ない生物学的試料から個人を同定したり（組織タイピング）；及び（２）生物学的試料の法医学的な同定における手がかりとするために使用することができる。
【０１９９】
（ａ）組織タイピング
本発明のＡＡＰ配列は、微少な生物学的試料から個人を同定するために使用され得る。この技術において、個人のゲノムＤＮＡは一又は複数の制限酵素によって消化され、ユニークなバンドを生じさせるようにサザンブロット上でプローブ化される。本発明の配列はさらに「制限酵素断片長多型」（ＲＦＬＰ；（Ｓｍｕｌｓｏｎら， 米国特許第５，２７２，０５７号， １９９３））に対するＤＮＡマーカーとして有用である。
さらに、ＡＡＰ配列は、個人のゲノムの標的部分の実際の塩基ごとのＤＮＡ配列を決定するために用いることができる。ＡＡＰ配列は、個人のゲノム由来の対応配列を増幅し、その後増幅された断片の配列を決定するために使用できる配列の５’末端及び３’末端由来の２つのＰＣＲプライマーを調製するために使用される。
【０２００】
各個人は、対立遺伝子の相違によるＤＮＡ配列のユニークなセットを持つであろうから、個人由来のＤＮＡ配列に対応するパネルは、ユニークな個人の同定を提供することができる。本発明の配列は、そのように同定された個人及び組織由来の配列を得るために使用することができる。本発明のＡＡＰ配列は個人のゲノムの部分を独自に表現する。対立遺伝子の変異は、これらの配列のコード化領域中にある程度生じ、かなりの程度が非コード化領域に生じる。個々のヒトの間における対立遺伝子の変異は、約５００塩基ごとの頻度で生じる。対立遺伝子変異の多くは、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）によるもので、ＲＦＬＰｓが含まれる。
ここで記載される各配列は、ある程度、個人に由来するＤＮＡが同定の目的で比較され得る標準として使用される。非常に多くの数の多型が非コード化領域に生じているため、個人を区別するのに非常に少ない配列しか必要とされない。非コード化配列は、各々が１００ベースの非コード化増幅配列を生み出す１０から１，０００のプライマーのパネルによって個人をポジティブに同定することができる。配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３，及び１５中に記載されるような予想されるコード化配列が使用される場合、ポジティブな個人の同定に関する、より適切な数のプライマーは５００−２，０００であろう。
【０２０１】
予測的医薬
また、本発明は、診断上のアッセイ、予後のアッセイ、薬理ゲノム学、及び臨床試験をモニターすることが、予防的に個人を治療する予後の（予測的）目的のために使用される予測的医薬の分野にも関する。従って、本発明の一態様は、個人が疾病又は疾患に冒されていないかどうか、又は疾患を進行させる危険にあるかどうか、癌を含む異常なＡＡＰの発現又は活性に関係しているかどうかを決定する生物学的試料（例えば、血液、血清、細胞、組織）との関連において、ＡＡＰ及び／又は核酸の発現並びにＡＡＰの活性を決定するための診断上のアッセイに関する。また、本発明は個人がＡＡＰ、核酸の発現又は活性に関連する疾患を進行させる危険に曝されているかどうかを決定するための予後の（予測的）アッセイにも関する。例えば、ＡＡＰの突然変異は生物学的試料においてアッセイされる。このようなアッセイは、ＡＡＰ、核酸発現、又は生物学的活性により特徴付けられ又は関連した疾患の発症よりも前に、予防的に個人を治療する診断上又は予測的目的のために使用され得る。
【０２０２】
本発明の他の態様は、そのような個人にとって適切な治療上又は予防的薬剤を選択するため（ここでは「薬理ゲノム学」と称される）、個人におけるＡＡＰ活性、又は核酸の発現を決定するための方法を提供する。薬理ゲノム学は、個人の遺伝子型（例えば、特定の薬剤に対して応答する個人の能力を決定するための個人の遺伝子型）に基づいた個人の治療的又は予防的処置のための様式（例えば、薬物、食物）の選択を可能にする。本発明のその他の態様は、臨床試験におけるＡＡＰの発現又は活性における様式（例えば、薬物、食物）の影響をモニターすることに関する。
【０２０３】
１．診断上のアッセイ
生物学的サンプル中のＡＡＰの存在又は非存在を検出するための例示的な方法は、患者から生物学的サンプルを得ること、サンプル中でＡＡＰの存在を確認するために生物学的サンプルをＡＡＰ又はＡＡＰ核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出することができる化合物又は薬剤と接触させることに関与する。ＡＡＰ ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを検出するための薬剤は、ＡＡＰ ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡをハイブリダイズすることができる標識化された核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３又は１５の核酸などの完全長ＡＡＰ核酸、又は少なくとも長さが１５，３０，５０，１００，２５０又は５００ヌクレオチドであって、緊縮性の条件下でＡＡＰ ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドなどのそれらの部分であり得る。
【０２０４】
ＡＡＰポリペプチドを検出するための薬剤は、ＡＡＰと結合することが可能な抗体であり、好ましくは検出可能な標識を持つ抗体である。Ａｂｓはポリクローナル抗体であり得、より好ましくはモノクローナル抗体である。無傷の抗体、又は断片（例えば、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２）を用いることができる。標識化プローブ又は抗体は、直接標識化される他の試薬との反応性によるプローブ又は抗体の間接的な検出と同様に、検出可能な基質と共役される（すなわち、物理的な共役）。間接的な標識の例には、蛍光標識した二次抗体を用いる一次抗体の検出、及び蛍光標識したストレプタビジンで検出することができるようなビオチンによるＤＮＡプローブの末端ラベルが含まれる。「生物学的サンプル」という用語には、患者から単離された組織、細胞及び生物学的体液、並びに患者中に存在する組織、細胞及び体液が含まれる。本発明の検出方法は、インビトロ並びにインビボでの生物学的サンプル中のＡＡＰ ｍＲＮＡ、タンパク質、又はゲノムＤＮＡを検出するために用いられ得る。例えば、インビトロにおけるＡＡＰ ｍＲＮＡの検出のための技術には、ノーザンハイブリダイゼーション及びインサイツハイブリダイゼーションが含まれる。ＡＡＰポリペプチドの検出のためのインビトロでの技術には、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡｓ）、ウェスタンブロット法、免疫沈降法、及び免疫蛍光法が含まれる。ＡＡＰゲノムＤＮＡの検出のためのインビトロでの技術には、サザンハイブリダイゼーション法及びインサイツハイブリダイゼーション蛍光法（ＦＩＳＨ）が含まれる。さらに、ＡＡＰを検出するためのインビボでの技術には、患者へ標識化された抗ＡＡＰ抗体を導入することが含まれる。例えば、抗体は、患者中における存在及び局在が標準的な画像化技術で検出することができる放射活性マーカーで標識化することができる。
【０２０５】
一実施態様において、患者由来の生物学的サンプルには、タンパク質分子、及び／又はｍＲＮＡ分子、及び／又はゲノムＤＮＡ分子が含まれる。好ましい生物学的サンプルは血液である。
他の実施態様において、さらにある方法が、コントロールを提供するために患者由来の生物学的サンプルを得ること、ＡＡＰ、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡを検出するために該サンプルを化合物又は薬剤と接触させること、及びテストサンプル中のＡＡＰ、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの存在と、コントロール中のＡＡＰ、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの存在を比較することに関与する。
【０２０６】
また、本発明は生物学的サンプル中のＡＡＰを検出するためのキットも包含する。例えば、キットには：サンプル中のＡＡＰ又はＡＡＰ ｍＲＮＡを検出することができる標識化化合物又は薬剤；サンプル中のＡＡＰの量を決定するための試薬及び／又は装置；及びサンプル中のＡＡＰの量を標準と比較するための試薬及び／又は装置が含まれる。化合物又は薬剤は適切な容器中に包装される。キットはさらにＡＡＰ又は核酸を検出するためにキットを使用するための使用説明書を含み得る。
【０２０７】
２．予後のアッセイ
ここで記載された診断上の方法は、さらに、異常なＡＡＰ発現又は活性に関連した疾病又は疾患の進行の危険性を持つ又は危険状態にある患者を同定するために利用され得る。例えば、ここで記載されたアッセイは、ＡＡＰ、核酸発現又は活性に関連した疾病又は疾患の進行の危険性を持つ又は危険状態にある患者を同定するために使用され得る。或いは、予後のアッセイは疾病又は疾患の進行に関する危険性を持ち又は危険状態にある患者を同定するために使用され得る。本発明は、異常なＡＡＰ発現又は活性と関連する疾病又は疾患であって、テストサンプルが患者から得られ、ＡＡＰ又は核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）が検出される疾病又は疾患を同定する方法を提供する。テストサンプルは患者由来の生物学的サンプルである。例えば、テストサンプルは生物学的体液（例えば、血清）、細胞サンプル、又は組織であり得る。
【０２０８】
予後のアッセイは、患者が異常なＡＡＰ発現又は活性と関連する疾病又は疾患を治療するための様式（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメチックス、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、食物など）を投与し得るかどうか決定するために使用することができる。そのような方法は、患者が疾患に対する薬剤で有効に治療され得るかどうか決定するために使用され得る。本発明は、テストサンプルが得られ、ＡＡＰ又は核酸が検出される患者が異常なＡＡＰ発現又は活性と関連した疾患のための薬剤によって効果的に治療され得るかどうかを決定するための方法（例えば、ＡＡＰ又は核酸の存在が、異常なＡＡＰ発現又は活性と関連した疾患を治療するための薬剤を投与し得る患者に対する診断）を提供する。
【０２０９】
また、本発明の方法は、遺伝的な損傷を持つ患者が異常な血管形成によって特徴付けられる疾患に対する危険性があるかどうか決定するためにＡＡＰにおける遺伝的な損傷を検出するために用いられ得る。患者由来のサンプル中において、変更位置におけるＡＡＰポリペプチドをコードする遺伝子の完全性に影響を与えることにより特徴付けられる遺伝的損傷、又はＡＡＰの異常発現の存在又は非存在を検出することが含まれる。そのような遺伝的損傷は、：（１）ＡＡＰ由来の一又は複数のヌクレオチドの欠損；（２）一又は複数のヌクレオチドのＡＡＰへの付加；（３）ＡＡＰ中での一又は複数のヌクレオチドの置換；（４）ＡＡＰ遺伝子の染色体再構成；（５）ＡＡＰ ｍＲＮＡ転写産物のレベルの変更、（６）ゲノムＤＮＡのメチル化の変化などのＡＡＰの異常な修飾、（７）ＡＡＰ ｍＲＮＡ転写産物の非野生型スプライシングパターンの存在、（８）ＡＡＰの非野生型タイプのレベル、（９）ＡＡＰの対立遺伝子の欠失、及び／又は（１０）ＡＡＰポリペプチドの不適切な翻訳後修飾、を確認することによって検出され得る。ＡＡＰにおける損傷を検出するために使用され得る多くの既知のアッセイ技術が存在する。有核細胞を含む何れの生物学的サンプルを使用してもよい。
【０２１０】
ある実施態様において、損傷の検出は、アンカーＰＣＲ又はｃＤＮＡ末端の迅速な増幅（ＲＡＣＥ）ＰＣＲなどのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、（Ｍｕｌｌｉｓ， 米国特許第４，６８３，２０２号， １９８７；Ｍｕｌｌｉｓら， 米国特許第４，６８３，１９５号， １９８７）において、或いは、ライゲーション鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら， １９８８；Ｎａｋａｚａｗａら， １９９４）においてプローブ／プライマーを用いてもよく、後者は特にＡＡＰ遺伝子群における点突然変異を検出するために有用である（Ａｂｒａｖａｙａら， １９９５）。この方法には患者からサンプルを収集すること、サンプルから核酸を単離すること、ＡＡＰ（存在するならば）のハイブリダイゼーション及び増幅が生じるような条件下で、ＡＡＰと特異的にハイブリダイズ化する一又は複数のプライマーと核酸とを接触させること、及び増幅産物の存在又は非存在を検出すること、又は増幅産物のサイズを検出すること、及び長さをコントロールサンプルと比較することが含まれる。ＰＣＲ及び／又はＬＣＲは、ここで記載された突然変異を検出するために使用される何れかの技術と共に、予備的な増幅ステップとして使用するのが望ましいと予想される。
【０２１１】
二者択一的増幅法には、：自己持続性配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら， １９９０）、転写増幅系（Ｋｗｏｈら， １９８９）；Ｑβ複製（Ｌｉｚａｒｄｉら， １９８８）、又はその他何れかの核酸増幅方法が含まれ、その後、当業者にとって周知の技術を用いて増幅された分子を検出する。これらの検出計画は特に低い存在量での核酸の存在の検出にとって有用である。
サンプルのＡＡＰ中の変異は、制限酵素の切断パターンの変化によって同定することができる。例えば、サンプル及びコントロールＤＮＡが単離され、増幅され（付加的に）、一又は複数の制限エンドヌクレアーゼによって切断され、断片の長さがゲル電気泳動によって決定され、比較される。サンプルとコントロールＤＮＡとの断片の長さにおける違いは、サンプルＤＮＡ中の変異を示す。さらに、配列特異的なリボザイムの配列の使用は、リボザイムの切断部位の発生又は喪失によって特異的突然変異の存在に関してスコアー化するために用いるいことができる。
【０２１２】
サンプル及びコントロール核酸、例えばＤＮＡ又はＲＮＡを数百又は数千ものオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイに対してハイブリダイズすることにより、ＡＡＰ中の遺伝的変異を同定することができる（Ｃｒｏｎｉｎら， １９９６；Ｋｏｚａｌら， １９９６）。例えば、ＡＡＰ中の遺伝的変異は、Ｃｒｏｎｉｎら， 上掲中に記載されるように、光産生ＤＮＡを含む２次元アレイ中で同定することができる。簡単には、プローブの第一のハイブリダイゼーションアレイは、配列間の塩基の変化を同定するため、連続的にオーバーラップするプローブの直線的なアレイを作製することにより、サンプル及びコントロール中のＤＮＡの長いストレッチを通してスキャンするために使用することができる。このステップは、点突然変異の同定を可能ならしめる。この次に、検出されるべき全ての変異又は突然変異と相補的な、より小さく、特定化されたプローブアレイを用いることによって第二のハイブリダイゼーションアレイが行われる。各突然変異アレイは、一方は野生型遺伝子に相補的で、他方は突然変異遺伝子に相補的である、対応するプローブセットによって構成される。
【０２１３】
さらに他の実施態様において、当該技術分野において知られている種々の配列決定反応の何れかが、ＡＡＰ配列を直接決定し、サンプルＡＡＰの配列を対応する野生型（コントロール）配列と比較することによって突然変異を決定するために使用することができる。配列決定反応の例には、古典的な技術に基づくものが含まれる（Ｍａｘａｍ及びＧｉｌｂｅｒｔ， １９７７；Ｓａｎｇｅｒら， １９７７）。種々の自動配列決定方法の何れかが、マススペクトロメーターによる配列決定（Ｃｏｈｅｎら， １９９６；Ｇｒｉｆｆｉｎ及びＧｒｉｆｆｉｎ， １９９３；Ｋｏｓｔｅｒ， 国際公開第９４／１６１０１号， １９９４）を含む予後的なアッセイ（Ｎａｅｖｅら， １９９５）を実施する場合に使用することができる。
【０２１４】
ＡＡＰ中の突然変異を検出するための他の方法には、切断剤からの保護がＲＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡのヘテロ二重鎖におけるミスマッチの塩基を検出するために用いられるような方法が含まれる（Ｍｙｅｒｓら， １９８５）。一般に、「ミスマッチ切断」の技術は、野生型ＡＡＰ配列を含む（標識化）ＲＮＡ又はＤＮＡをサンプル由来の潜在的に変異のあるＲＮＡ又はＤＮＡとハイブリダイズ化することによって形成されるヘテロ二重鎖を提供することにより開始する。二本鎖化二重鎖は、コントロールとサンプル鎖の間の塩基対ミスマッチから生じるような二重鎖の一本鎖領域を切断する薬剤によって処理される。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、ＲＮａｓｅで処理することができ、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ１ヌクレアーゼによってミスマッチ領域を酵素的に切断するために処理することができる。他の実施態様では、ＤＮＡ／ＤＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡのいずれかの二重鎖が、ミスマッチ領域を切断するためにヒドロキシルアミン、四酸化オスミウム及びピペリジンで処理することができる。切断された物は、その後、突然変異部位を決定するために変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズにより分離される（Ｇｒｏｍｐｅら， １９８９；Ｓａｌｅｅｂａ及びＣｏｔｔｏｎ， １９９３）。コントロールＤＮＡ又はＲＮＡは検出のための標識することができる。
【０２１５】
ミスマッチ切断反応は、細胞サンプル由来のＡＡＰ ｃＤＮＡ中で点突然変異を検出し、マッピングするために確定された系において二本鎖ＤＮＡ中にミスマッチ塩基対を認識する（ＤＮＡミスマッチ修復）一又は複数のタンパク質を用いてもよい。例えば、大腸菌のｍｕｔＹ酵素はＧ／ＡミスマッチにおいてＡを切断し、ＨｅＬａ細胞由来のチミジンＤＮＡグリコシル酵素はＧ／ＴミスマッチにおいてＴを切断する（Ｈｓｕら， １９９４）。典型的な実施態様に従うと、野生型ＡＡＰ配列に基づくプローブは、テスト細胞由来のｃＤＮＡ又は他のＤＮＡ産物とハイブリダイズ化する。二重鎖はＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理され、切断産物は、もしあれば、電気泳動法又は類似の方法で検出することができる（Ｍｏｄｒｉｃｈら， 米国特許第５，４５９，０３９， １９９５号）。
【０２１６】
電気泳動上の移動度の変化は、ＡＡＰにおける突然変異を同定するために用いることができる。例えば、一本鎖構造多型（ＳＳＣＰ）は突然変異と野生型核酸との電気泳動上の移動度における差を検出するために用いてもよい（Ｃｏｔｔｏｎ， １９９３；Ｈａｙａｓｈｉ， １９９２；Ｏｒｉｔａら， １９８９）。サンプル及びコントロールＡＡＰ核酸の一本鎖ＤＮＡ断片は変性させた後再構成させる。一本鎖核酸変異体の二次構造は配列により変動する；電気泳動度において生じる変化により一塩基の変化でさえ検出可能である。ＤＮＡ断片は標識プローブにより標識され又は検出されてもよい。アッセイの感度はＲＮＡ（ＤＮＡよりはむしろ）を用いることにより増強され、この場合二次構造が配列変化に対してより感受性になる。対象の方法は、電気泳動上の移動度における変化に基づいて二本鎖のヘテロ二重鎖分子を分離するためにヘテロ二重鎖分析を用いることができる（Ｋｅｅｎら， １９９１）。
【０２１７】
突然変異又は野生型断片の移動度は、変性濃度勾配ゲル電気泳動を用いてアッセイすることができる（ＤＧＧＥ；（Ｍｙｅｒｓら， １９８５））。ＤＧＧＥにおいて、ＤＮＡは完全な変性を防ぐために、例えば約４０ｂｐの高融点ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプをＰＣＲによって付加することにより修飾される。また、コントロールとサンプルＤＮＡの移動度における差を同定するために変性濃度勾配の代わりに温度勾配を用いてもよい（Ｒｏｓｓｉｔｅｒ及びＣａｓｋｅｙ， １９９０）。
点突然変異を検出するための他の技術の例には、限定はしないが、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅法、又は選択的プライマー伸長法が含まれる。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、既知の突然変異が中心部分に引き起こされた後、完全にマッチが確認される場合にのみハイブリダイゼーションが可能となる条件下で標的ＤＮＡとハイブリダイズ化されるように調製される（Ｓａｉｋｉら， １９８６；Ｓａｉｋｉら， １９８９）。このような対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドがハイブリダイズメンブレンに付着されると、ＰＣＲ増幅標的ＤＮＡ又は多くの異なる突然変異に対してハイブリダイズし、標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズ化される。
【０２１８】
或いは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的な増幅技術が用いられてもよい。特異的増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーは、分子の中心部分に（増幅が差次的ハイブリダイゼーションに依存するように（Ｇｉｂｂｓら， １９８９））、又は適切な条件下においてミスマッチを防ぐか又はポリメラーゼの伸長を減少させるように一方のプライマーの３’末端に（Ｐｒｏｓｓｅｒ， １９９３）目的の突然変異を保持する。変異領域における新規制限酵素部位が、切断に基づく検出を引き起こすために導入されてもよい（Ｇａｓｐａｒｉｎｉら， １９９２）。また、特定の増幅は増幅に関してＴａｑリガーゼを用いて行ってもよい（Ｂａｒａｎｙ， １９９１）。このような場合において、ライゲーションは５’配列の３’端で完全にマッチする場合にのみ生じ、増幅をスコアー化することにより既知の突然変異の検出を可能にする。
上述の方法は、例えば、ＡＡＰに関する疾病又は病気の症状又は家族経歴を示す患者を診断するための臨床的な設定において用いられる少なくとも１つのプローブ（核酸又は抗体）を含むプレパックのキットを使用することにより実施してもよい。
さらに、ＡＡＰが発現されている任意の細胞型又は組織がここで記述された予後アッセイにおいて利用されてもよい。
【０２１９】
３．薬理ゲノム学
スクリーニングアッセイによって同定されるような、ＡＡＰ活性又は発現に対して刺激的又は阻害的な影響を及ぼす薬剤又は修飾因子を、血管形成に関与するものを含む疾患を予防的又は治療的に処置されるべき個人に対して投与することができる。このような治療に関して、薬理ゲノム学（即ち、患者の遺伝子型と、食物、化合物又は薬剤などの外来の様式に対する患者の反応との関連性に関する研究）が検討され得る。治療物上の代謝的相違は、薬理学的に活性な薬剤の投与量と血中濃度との関係を変更させることによって、重篤な毒性又は治療上の過誤を導く可能性がある。従って、個人の薬理ゲノム学は、個人の遺伝子型の考慮に基づき予防的又は治療的処置に対して有効な薬剤（例えば、薬物）の選択を可能ならしめる。さらに、薬理ゲノム学は適切な用量及び治療計画を決定するために使用することができる。従って、個人におけるＡＡＰの活性、ＡＡＰ核酸の発現、又はＡＡＰの突然変異群は、治療上又は予防上の処置に対して適切な薬剤の選択を導くために決定され得る。
【０２２０】
薬理ゲノム学は、病気に罹った人における様式の変化した性質及び異常な作用が原因である様式に対する反応における臨床的に有意な遺伝性の変異を扱う（Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ及びＥｖｅｒｔ， １９９６；Ｌｉｎｄｅｒら， １９９７）。一般に、２つの薬理ゲノム学的状態が区別される：（１）様式と身体との相互作用を変化させる単独の因子（変化した薬物作用）として伝達される遺伝的状態又は（２）身体が様式に対して反応する方法を変化させる単独の因子（変化した薬物代謝）として伝達される遺伝的状態。これらの薬理ゲノム学的状態は、希な欠損又は核酸多型として生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤ）の欠損は、主な臨床上の合併症が酸化的薬物（抗マラリア性薬、サルファ剤、鎮痛剤、ニトロフラン）の摂取及び空豆の消費後の溶血である一般的な遺伝性の酵素異常症である。
【０２２１】
例証となる実施態様として、薬物代謝酵素の活性は、薬物活性の強度及び持続時間の主な決定要因である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチル転移酵素２（ＮＡＴ２）及びチトクロームＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多型の発見により、標準的で安全な薬物用量を採用した後に過剰な薬物反応及び／又は重篤な毒性を示す患者達の現象が説明される。これらの多型は個体集団中の２つの表現型、多大な代謝型（ＥＭ）及び乏しい代謝型（ＰＭ）として発現される。ＰＭの有病率は異なる集団間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子は高度に多型を示し、幾つかの突然変異がＰＭにおいて同定されており、それら全てが機能的ＣＹＰ２Ｄ６ が存在しないことを導く。 突然変異体ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｃ１９による乏しい代謝型は、標準的な用量を摂取する場合において、過剰な薬物反応及び副作用を頻繁に経験する。代謝産物が活性な治療成分である場合、ＰＭはＣＹＰ２Ｄ６で形成される代謝産物のモルヒネによって介されるコデインの鎮痛効果に関して示されるような治療的反応はなんら示さない。他に極端な場合として、標準的な用量には反応しない、いわゆる超急速代謝型が挙げられる。最近、超急速代謝の分子的基礎がＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の増幅に原因することが同定されている。
【０２２２】
個体中でのＡＡＰの活性、ＡＡＰ核酸、又はＡＡＰの突然変異含有量が個人の治療的又は予防的処置に対する適切な薬剤を選択するために決定することができる。さらに、薬理ゲノム学研究は、薬物代謝酵素をコードする多型的な対立遺伝子の遺伝子型タイピングを個々の薬物反応表現型の同定に適用するために用いることができる。投薬又は薬物選択に適用する場合、この知識は有害な反応又は治療的過誤を避け、その結果、記述の典型的スクリーニングアッセイの一つにより同定される修飾因子のようなＡＡＰ修飾因子で患者を治療する場合、治療的又は予防的効果を増強させることができる。
【０２２３】
４．臨床的治験における効果のモニター
ＡＡＰの活性発現又は活性（例えば、異常な細胞増殖及び／又は分化を修飾する能力）に対する薬剤（例えば、薬物、化合物）の影響をモニターすることは、基本的な薬物スクリーニングのみならず、臨床的治験においても適用することができる。例えば、ＡＡＰ発現、タンパク質レベル、又は上方制御されたＡＡＰ活性を増大させるためのスクリーニングアッセイによって決定される薬剤の効果は、減少したＡＡＰ発現、タンパク質レベル、又は下方制御されたＡＡＰ活性を示す患者の臨床的治験においてモニターすることができる。或いは、ＡＡＰ発現、タンパク質レベル、又は下方制御されたＡＡＰ活性を減少させるためのスクリーニングアッセイによって決定される薬剤の効果は、増大したＡＡＰ発現、タンパク質レベル、又は上方制御されたＡＡＰ活性を示す患者の臨床的治験においてモニターすることができる。このような臨床的治験において、ＡＡＰ及び、好ましくは、例えば血管形成に関係する他の遺伝子の発現又は活性は、特定の細胞の反応性に対する「出力」又はマーカーとして用いることができる。
【０２２４】
例えば、様式（例えば、食物、化合物、薬物又は小分子）による治療により細胞中において調節されるＡＡＰを含む遺伝子が同定され得る。細胞増殖疾患に対する薬剤の影響を研究するために、例えば、臨床的治験において、細胞が単離され、ＲＮＡが調製され、ＡＡＰ及び該疾患に関係する他の遺伝子の発現レベルについて分析される。遺伝子の発現パターンは、ノーザンブロット分析、核ラン・オンアッセイ又はＲＴ−ＰＣＲ実験により、又はタンパク質の量を測定することにより、又はＡＡＰ又は他の遺伝子産物の活性レベルを測定することにより定量することができる。このように、遺伝子の発現パターン自体は、薬剤に対する細胞内の生理的反応を示すマーカーとして役立ち得る。従って、この反応状態は、薬剤で個人を治療する前、及び治療中の種々の時間点において決定される可能性がある。
【０２２５】
本発明は、（１）患者から投与前のサンプルを得る；（２）投与前のサンプル中のＡＡＰ、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡの発現レベルを検出する；（３）患者から一又は複数の投与後のサンプルを得る；（４）投与後のサンプル中のＡＡＰ、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡの発現又は活性のレベルを検出する；（５）投与前のサンプル中のＡＡＰ、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡと投与後のサンプル中のＡＡＰ、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡの発現又は活性のレベルとを比較する；及び（６）結果に応じて患者に対する薬剤の投与を変化させるステップを含む、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、小分子、食物又はここで記述のスクリーニングアッセイによって同定された他の薬物候補）による患者の治療の効果をモニターするための方法を提供する。例えば、薬剤の増大した投与により、検出されているレベルよりもさらに高いレベルにまでＡＡＰの発現又は活性を増大させること、即ち、薬剤の効果を増大させることが望ましい。或いは、薬剤の減少した投与により、検出されているレベルよりもさらに低いレベルにまでＡＡＰの発現又は活性を減少させること、即ち、薬剤の効果を減少させることが望ましい。
【０２２６】
５．治療方法
本発明は、異常なＡＡＰ発現又は活性と関係した疾患の危険性があり（又は感受性であり）又は疾患を有する患者を治療するための予防的及び治療的方法を提供する。さらに、これらと同じ治療方法を、ＡＡＰの発現又は活性レベルを変化させることにより、血管形成を誘導又は阻害するために用いてもよい。
【０２２７】
６．疾病及び疾患
増大したＡＡＰレベル又は生物学的活性によって特徴付けられる疾病及び疾患は、活性をアンタゴナイズする（即ち、減少又は阻害する）治療物によって治療される。アンタゴニストは治療的又は予防的方法で投与される。用いられる治療物は、：（１）ＡＡＰペプチド、又はその類似体、誘導体、断片又は相同体；（２）ＡＡＰペプチドに対するＡｂｓ；（３）ＡＡＰ核酸：（４）アンチセンス核酸及び相同組換えによって（Ｃａｐｅｃｃｈｉ， １９８９）内在性の機能を除去するために用いられる「機能障害性の」（即ち、コード化配列中における異種性の挿入による）核酸；又は（５）ＡＡＰとその結合相手との相互作用を変化させる修飾因子（即ち、阻害因子、アゴニスト及びアンタゴニストであって、本発明の更なるペプチドミメチック又はＡＡＰに特異的なＡｂｓを含む）などを含む。
【０２２８】
減少したＡＡＰレベル又は生物学的活性によって特徴付けられる疾病及び疾患は、活性を増大させる（即ち、アゴニストとなる）治療物によって治療される。活性を上方制御する治療物は、治療的又は予防的に投与される。用いられる治療物には、ペプチド、又はその類似体、誘導体、断片又は相同体；又は生物学的利用性を増大させるアゴニストが含まれる。
増大または減少したレベルは、ペプチド及び／又はＲＮＡを定量することにより、患者の組織サンプル（例えば、組織診からの）を得てインビトロでＲＮＡ又はペプチドレベル、構造及び／又は発現ペプチド（又はＡＡＰ ｍＲＮＡ）の活性をアッセイすることにより容易に検出することができる。限定はしないが、方法にはイムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット分析、免疫沈降後のドデシル硫酸（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、免役組織化学、など）及び／又はｍＲＮＡｓの発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイツハイブリダイゼーション及び類似した方法）が含まれる。
【０２２９】
７．予防的方法
本発明は、患者において、異常なＡＡＰ発現又は活性と関連する疾病又は状態を、ＡＡＰの発現又はＡＡＰ活性の少なくとも１つを修飾する薬剤を投与することにより防止するための方法を提供する。異常なＡＡＰ発現又は活性によって引き起こされ又は助長される疾病に対する危険のある患者は、例えば、診断上の又は予後的なアッセイの何れか又は組み合わせによって同定することができる。予防的薬剤の投与は、疾病又は疾患が防止され、或いは、その進行が遅れるように、ＡＡＰ異常性に特徴的な症状の出現前に行われる。ＡＡＰの異常性のタイプに依存して、例えば、ＡＡＰアゴニスト又はＡＡＰアンタゴニストが患者を治療するために用いられる。適切な薬剤は、スクリーニングアッセイに基づいて決定され得る。
【０２３０】
８．治療的方法
本発明の他の態様は、治療目的のためにＡＡＰ発現又は活性を調節するための方法に関する。本発明の修飾的方法には、細胞に関連する一又は複数のＡＡＰ活性を調節する薬剤と細胞を接触させることが含まれる。ＡＡＰ活性を調節する薬剤は、核酸又はタンパク質、天然に生じる同起源のＡＡＰリガンド、ペプチド、ＡＡＰペプチドミメチック、又は他の小分子であり得る。該薬剤はＡＡＰ活性を刺激する。そのような刺激性薬剤の例には、活性ＡＡＰ及び細胞中へ導入されるＡＡＰ核酸分子が含まれる。他の実施態様において、該薬剤はＡＡＰ活性を阻害する。阻害性薬剤の例には、アンチセンスＡＡＰ核酸及び抗ＡＡＰ Ａｂｓが含まれる。調節方法は、インビトロ（例えば、細胞を薬剤と共に培養することにより）で、又はインビボ（例えば、患者に薬剤を投与することにより）で実施することができる。このように、本発明はＡＡＰ又は核酸分子の異常な発現又は活性によって特徴付けられる疾病又は疾患に悩まされている個人を治療するための方法を提供する。一実施態様において、該方法は、薬剤（例えば、スクリーニングアッセイによって同定された薬剤）、又はＡＡＰ発現又は活性を調節する（例えば、上方制御又は下方制御）薬剤の組み合わせを投与することに関与する。他の実施態様において、該方法は、減少した又は異常なＡＡＰ発現又は活性を補償するための治療としてＡＡＰ又は核酸分子を投与することに関与する。
ＡＡＰ活性の刺激は、ＡＡＰが異常に下方制御され、及び／又は増大したＡＡＰ活性がおそらく有利な効果を有するような状況にあるのが望ましい。そのような刺激の一例は、患者が異常な血管形成（例えば、癌）によって特徴付けられる疾患を持つ場合である。
【０２３１】
９．治療上の生物学的影響の決定
インビトロ又はインビボでの適切なアッセイは、特異的な治療物の効果を決定し、その投与が発症した組織の治療に対して望ましいかどうかを決定するために実施され得る。
種々の特定の実施態様において、インビトロのアッセイは任意の治療物がその細胞タイプ（群）に所望の効果を発揮するかどうか決定するために、患者の疾患に関与するタイプ（群）の代表的な細胞を用いて行われる。治療における使用に対する様式は、ヒト患者での治療に先立ち、限定はしないが、ラット、マウス、チキン、ウシ、サル、ウサギ、その他同種類のものを含む適切な動物モデル系においてテストされる。同様に、インビボでのテストに対して、当該技術分野における動物モデル系の何れかがヒト患者への投与に先立ち用いられる。
【０２３２】
１０．本発明の組成物の予防的及び治療的使用
ＡＡＰ核酸及びタンパク質は、限定されないが、血管形成を含む様々な疾患に関わる潜在的な予防的及び治療的適用において有用である。
例として、ＡＡＰをコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり、タンパク質は、それが必要とされる患者へ投与される場合に有用である。
また、ＡＡＰ核酸又はその断片も診断上の適用において有用であって、核酸又はタンパク質の存在又は量が評価される。さらなる使用には、抗菌的分子（即ち、あるペプチドが抗菌的性質を有することが見出されている）としての使用がある。これらの物質は、治療的又は診断的方法における使用にとって、本発明の新規物質と免疫特異的に結合するＡｂｓの生産において有用である。
【０２３３】
次の実施例は限定されるものではない。
（実施例）
差次的に制御されている遺伝子の同定
包括的なｍＲＮＡプロファイリング技術（ＧｅｎＣａｌｌｉｎｇ）を、管状様構造へ分化するヒト内皮細胞の差次的遺伝子発現プロファイルを測定するために使用した（Ｋａｈｎら．， ２０００）。ＧｅｎＣａｌｌｉｎｇからの発現データーを確かめるために、遺伝子特異的ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対、及び５’末端を蛍光色素、そして３’末端を消光剤蛍光色素で標識したオリゴヌクレオチドプローブを使用する独立した実験に着手した。全ＲＮＡ（５０ｎｇ）を、５０μｌ ＲＴ−ＰＣＲ混合物に加えて実行した。
【０２３４】
次のデーターを収集した：
Figure 2004514404
【０２３５】
同等物
特定の実施態様が、ここにおいて詳細に開示されているが、このデーターは例示のみの目的の例としておこなわれたのであって、次に添付された請求項の範囲内に限定されるものではない。特に、本発明によって、種々の置換、改変、及び修飾が、請求項によって定義されているような本発明の精神と範囲から逸脱せずにおこなわれ得ることが考えられる。開始物質である核酸、対象となるクローン、又はライブラリ型の選択は、ここにおいて記載した実施態様の知識をともなう当該分野の通常の技術者にとっては日常的な問題であると考えられる。他の側面、利点、及び修飾が、次の請求項の範囲内において考慮された。
【０２３６】
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Claims (41)

  1. 配列番号：２，４，６，８，１０，１２，１４又は１６の配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
  2. 前記前記ポリペプチドが活性ＡＡＰポリペプチドである、請求項１のポリペプチド。
  3. 前記アミノ酸配列が、配列番号：２，４，６，８，１０，１２，１４又は１６の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項２のポリペプチド。
  4. 前記アミノ酸配列が、配列番号：２，４，６，８，１０，１２，１４又は１６の配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する、請求項２のポリペプチド。
  5. 請求項１−４のうちのいずれか１つポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドの相補鎖。
  6. 配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３又は１５の配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドの相補鎖。
  7. 前記ヌクレオチド配列が、配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３，又は１５の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する請求項６のポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドの相補鎖。
  8. 前記ヌクレオチド配列が、配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３又は１５の配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する請求項６のポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドの相補鎖である。
  9. 請求項１−４のいずれか１つのポリペプチドと特異的に結合する抗体。
  10. 少なくとも１つのＡＡＰの活性を調節することを含んでなる、血管形成を調節する方法。
  11. 前記の血管形成を調節することが血管形成を高めることであり、及び前記の活性を調節する方法が、ＫＬＰ、ｈＢＡＺＦ、ｈＴＲＧ、ｈＭＸ１、ｈＭＸ２、ｈＥＦ−Ｇ、及びｈＭＰから成る群から選択される少なくとも１つのポリペプチドの活性を高めることを含む、請求項１０の方法。
  12. 前記の血管形成を調節することが血管形成を低下させることであり、及び前記の活性を調節する方法が、少なくとも１つのポリペプチドの活性を高めることを含み、前記の少なくとも１つのポリペプチドがＮＨＲを含む、請求項１０の方法。
  13. 前記の血管形成を調節することが血管形成を低下させることであり、及び前記の活性を調節する方法が、ＫＬＰ、ｈＢＡＺＦ、ｈＴＲＧ、ｈＭＸ１、ｈＭＸ２、ｈＥＦ−Ｇ、及びｈＭＰから成る群から選択される少なくとも１つのポリペプチドの活性を低下させることを含む、請求項１０の方法。
  14. 前記の血管形成を調節することが血管形成を高めることであり、及び前記の活性を調節する方法が、少なくとも１つのポリペプチドの活性を低下させることを含み、前記の少なくとも１つのポリペプチドがＮＨＲを含む、請求項１０の方法。
  15. 前記の活性を高めることが、前記の少なくとも１つのポリペプチドの発現を高めることを含む、請求項１１又は１２の方法。
  16. 前記の活性を高めることが、前記の少なくとも１つのポリペプチドの発現を低下させることを含む、請求項１３又は１４の方法。
  17. 前記の発現を高めることが、細胞を形質転換し、前記の少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を高めることを含む、請求項１５の方法。
  18. 前記の発現を低下させることが、前記の少なくとも１つのポリヌクレオチドをコードする内因性のポリヌクレオチドの少なくとも一部分に対してアンチ−センスなポリヌクレオチドを発現させるために細胞を形質転換することを含む、請求項１６の方法。
  19. 前記の活性を低下させることが、細胞を形質転換し、前記の少なくとも１つのポリペプチドに対してアプタマーを発現させることを含む、請求項１３又は１４の方法。
  20. 前記の活性を低下させることが、前記の少なくとも１つのポリペプチドに対してアプタマーを細胞へ導入することを含む、請求項１３又は１４の方法。
  21. 前記の活性を低下させることが、前記の少なくとも１つのポリペプチドと選択的に結合する抗体を細胞へ投与することを含む、請求項１３又は１４の方法。
  22. 請求項１２又は１３の方法によって血管形成を低下させることを含んでなる、腫瘍を治療する方法。
  23. 請求項２２の方法によって癌牲腫瘍を治療することを含んでなる、腫瘍を治療する方法。
  24. 請求項１１又は１４の方法によって血管形成を高めることを含んでなる、心筋梗塞を治療する方法。
  25. 請求項１又は１４の方法によって血管形成を高めることを含んでなる、治癒を促進する方法。
  26. 化合物をＲＮＡポリメラーゼ及びＡＡＰ遺伝子を含んでなる組成物と接触させ、前記ＡＡＰ遺伝子の転写の量を測定することを含んでなる、前記化合物がＡＡＰ遺伝子の転写を上方制御又は下方制御するのかを決定する方法。
  27. 前記組成物が細胞にある、請求項２６の方法。
  28. 化合物をリボゾーム及びＡＡＰ遺伝子のｍＲＮＡに一致するポリヌクレオチドを含んでなる組成物と接触させ、そして前記ＡＡＰ遺伝子の翻訳の量を測定することを含んでなる、前記化合物がＡＡＰ遺伝子の翻訳を上方制御又は下方制御するのかを決定する方法。
  29. 前記組成物が細胞中にある、請求項２８の方法。
  30. 請求項５−８のいずれか１つのポリヌクレオチドを含むベクター。
  31. 請求項３０のベクターを含んでなる細胞。
  32. 組織試料中の少なくとも１つのＡＡＰ遺伝子の発現を測定することを含んでなる、腫瘍の可能性に関して前記組織試料をスクリーニングする方法。
  33. 前記の測定することが、前記の少なくとも１つのＡＡＰ遺伝子によってコードされているポリペプチドの量を測定することである、請求項３２の方法。
  34. 前記の発現を測定することが、前記の少なくとも１つのＡＡＰ遺伝子に一致するポリペプチドの量を測定することである、請求項３２の方法。
  35. 少なくとも１つの破壊されたＡＡＰ遺伝子を有する、遺伝子導入非ヒト動物。
  36. 非ヒト動物がマウスである、請求項３５の遺伝子導入非ヒト動物。
  37. 配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３又は１５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する外来性ポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドの相補鎖を含んでなる、遺伝子導入非ヒト動物。
  38. 前記外来性ポリヌクレオチドが、配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３又は１５に対して少なくとも９０％の配列同一性、又は前記ポリヌクレオチドの相補鎖を有する、請求項３７の遺伝子導入非ヒト動物。
  39. 前記外来性ポリヌクレオチドが、配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３又は１５に対して少なくとも９８％の配列同一性、又は前記ポリヌクレオチドの相補鎖を有する、請求項３７の遺伝子導入非ヒト動物。
  40. 試料中のＡＡＰヌクレオチド配列と配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３又は１５を比較することを含んでなる、ＡＡＰ遺伝子変異に関する試料をスクリーニングする方法。
  41. 試料中の少なくとも１つのＡＡＰ遺伝子の発現とコントロール試料中の前記の少なくとも１つの遺伝子の発現を比較することを含んでなる、腫瘍の臨床病期を決定する方法。
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