JP2003525610A - 熱応答に関連する遺伝子ｇ１２ｌ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ここで記載されているのは、ポリペプチドをコードする新規ヒト及びマウス核酸配列である。また、開示されているのは、これら核酸によってコードされているポリペプチド、ポリペプチドと免疫特異的に結合する抗体と同様に、前出のポリペプチドの誘導体、変異体、突然変異体、又は断片である。本発明は、さらに、これら新規の核酸及びタンパク質の任意の一つが関与している疾患の診断、治療及び予防に関する治療的、診断的及び研究方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （関連適用） 本出願は、ここで参考文献としてすべてが取り入れられている２０００年３月
２日に出願の米国仮出願番号第６０／１８６，５１３号に対して優先権を主張す
る。

【０００２】 （発明の分野） この発明は、概して、核酸及びそれにコードされているポリペプチドに関する
。より具体的には、には、この発明は、ベクター、宿主細胞、抗体だけでなく、
新規ポリペプチドをコードする核酸、そしてこれら核酸及びポリペプチドを生産
するための組み換え方法に関する。

【０００３】 （発明の背景） 肥満 肥満は、合衆国において最もありふれた代謝疾患であり、成人の３５％が患っ
ており、推定３００，０００人の犠牲者に７００億の直接及び間接な負担を与え
ている。超過体重又は肥満と考えることのできる子供の数が増加しているために
、肥満は流行病として増加している。肥満は、体脂肪の超過と定義されており、
頻繁に健康の顕著な障害を引き起こす。肥満は、ヒトの体での脂肪細胞の大きさ
又は数が、一つ又は複数の身体的及び生理学的疾患を生じ得るレベルに増加する
場合に起こる。正常な大きさのヒトは、３００から３５０億の間の脂肪細胞を有
する。ヒトの体重が増加すると、最初にこれら脂肪細胞の大きさが増加し、後に
数が増加する。肥満は、遺伝的、代謝的、生化学的、生理学的、そして行動の要
因によって影響される。従って、永続的な見通しのある臨床治療効果を達成する
ために、幾つかの分野で取り組むべき複合疾患である。

【０００４】 個々の肥満は、II型糖尿病（ＮＩＤＤＭ），高血圧、冠状動脈性心臓病、高コ
レステロール血症、変形性関節症、胆石症、生殖器官の癌、及び睡眠時無呼吸が
含まれる病気に罹りやすい。睡眠時無呼吸は、睡眠の間に呼吸をしない発症であ
り、発作及び心臓発作のより高い発生に関連しており、２つの他の因子は、臨床
的な肥満に含まれる肥満関連の罹患率及び死亡率の一因となっている。 非製薬的から製薬的な処置にわたる、幾つかの良く確立された治療方法がある
。非製薬的処置には、ダイエット、運動、精神医学的処置、そして食物消費を減
じる、又は脂肪を取り除く外科的処置、脂肪吸引法が含まれる。食欲抑制及びエ
ネルギー消費／栄養改良剤は、薬学的処置の中心である。デックスフェンフルラ
ミン（REDUX（登録商標））及び シブトラミン（MERIDIA（登録商標））は前者
であり、ベータ３-アドレナリンアゴニスト及びオーリスタット（XENICAL（登録
商標）)が後者を代表する。

【０００５】 動物モデルは、遺伝的性質が、肥満の性質及び程度を決定するのに影響を及ぼ
すという強力な証拠を提供する。動物で本当であることがヒトでは本当ではない
が、肥満度指数（ＢＭＩ、体重と身長に関連する肥満の測定）の４０−８０％の
変動は，遺伝的因子に起因する。ヒトの肥満が、概してメンデル性遺伝のパター
ンに従わない一方で、それに従う幾つかのげっ歯類のモデルがある（Spiegelman
, Cell. 1996 Nov 1; 87(3): 377-89；Weigle, Bioessays. 1996 Nov; 18(11):8
67-74）。ヒトの肥満は複合的特徴があるので、げっ歯類に見出されたのに類似
の遺伝的障害がヒトにも数例あるものの、げっ歯類における一つの変異が多数の
肥満のヒトでの主な原因ではないことは驚くことではない（Montague, Nature.
1997 Jun 26；387(6636)：903-8；Clement, Nature. 1998 Mar 26；392(6674):3
98-401）。興味あることには、高血圧及び発作などの複合表現型の動物モデルも
肥満である。これは、これら動物が、ヒト肥満の複雑さを理解するより手応えの
あるモデルを示し得ることを示唆する。

【０００６】 一つの遺伝的障害の遺伝なる、幾つかの肥満のげっ歯類モデルがある。良く特
徴付けられているものの希であるマウスの単源性肥満は、あるとしても、ヒトに
観察されることがあり：満腹因子レプチンの翻訳の異常停止であるobese(ob)を
含む。レプチン受容体の変異は、肥満糖尿病性マウス（db）を引き起こす。アグ
ーチ（Ay）は、肥満の毛色変異体である。通常は肌のみに発現し、変異動物では
偏在的に発現していて、メラニン形成細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）と拮抗し得る
。ＭＳＨは、プロホルモンであるプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）のタン
パク質分解プロセッシングによって生じる主要な下垂体ホルモンである副腎皮質
刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）から誘導される。太った表現型は、視床下部プロホル
モン変換酵素カルボキシペプチダーゼＥの変異の結果である。最も良く特徴付け
られていない肥満マウス変異体はtubである。tubは、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ、
食欲刺激ホルモン）及びＰＯＭＣのような，視床下部神経ペプチドホルモンのプ
ロセッシングに影響を与え得る細胞質基質タンパク質をコードしている。最近、
ＰＯＭＣノックアウトマウスが肥満に関する幾つかのマウスモデルに対する表現
型類似体、特にそのAyを有することが報告されている。ＰＯＭＣノックアウトは
早発性肥満を有し、その副腎の明白な形態学的な欠如のため、副腎機能障害のみ
ならず黄色を有する。これら動物には検出可能なコルチコステロン、並びにコル
チコステロンによる食物摂取の増加がないことから、これら動物が肥満であるこ
とは驚きである。肥満表現型は、ＰＯＭＣから誘導されるペプチドホルモンであ
る、アルファ-ＭＳＨで治療することが可能である（Yaswen, Nat Med. 1999 Sep
; 5(9): 1066-70）。

【０００７】 他の動物モデルには、上記で論じたob/ob及びdb/dbマウスと多くの類似性を生
じるfa/fa（太った）ラットが含まれる。一つ異なる点は、fa/faラットが寒さに
対して非常に敏感であるのに対して、それらの非ふるえ熱産生は正常である。熱
産生と代謝が内分泌学的に密接に関連していることは，はっきりと確立されてい
る。冬眠と昏睡に類似した症状である無感覚状態は、マウス変異体よりもfa/fa
ラットにおける肥満の維持においてより大きな役割を果たすと思われる。更には
、幾つかの砂漠のげっ歯類、例えばトゲマウスは自然の生息地では肥満にはなら
ないが、標準的な研究室の食餌では肥満になる。

【０００８】 （褐色脂肪細胞組織） 多房性脂肪組織としても知られている褐色脂肪細胞組織（ＢＡＴ）は、この組
織を形成している多くの毛細血管とミトコンドリアの色が原因のために、そのよ
うに呼ばれている。ＢＡＴは、肩の部分、ヒト胚と新生児の脇腹に主に見出され
、生後１ヶ月して消失する。動物、特に冬眠する動物及びげっ歯類では、更に豊
富に存在する。ＢＡＴは、毛細血管によって血管が発達するという点で内分泌器
官の特徴を有し、交感神経による支配を直接に受けることができる。交感神経神
経伝達は、ホルモン感受性リパーゼの活性化を引き起こすノルアドレナリン及び
アドレナリンのカテコールアミンの放出につながる。これは脂肪酸及びグリセロ
ールへのトリグリセリドの加水分解という結果となり、脱共役タンパク質（ＵＣ
Ｐ）の活性を介するＡＴＰの形成によるミトコンドリアプロトン勾配の脱共役に
よる酸素消費及び熱産生の増加につながる。カテコールアミンによるＢＡＴ刺激
は、結果として非ふるえ熱産生を引き起こす。

【０００９】 内分泌器官としてのＢＡＴの証拠は、１９６０年代後半におこなわれたHimms-
Hagenの研究に由来する。異なる気温に順応させたラットからＢＡＴを取り除き
、カテコールアミンに対する熱産生応答への効果に関わる実験は、次の知見につ
ながる。ｉ）寒さに順応させたラットからの肩甲骨間ＢＡＴ（ＩＢＡＴ）の除去
は、カテコールアミンに対するラットの熱産生応答への直接の効果を有しない。
重要性は、ＢＡＴがこの刺激に対して直接に応答する器官ではないことである。
ｉｉ）経時的（日）に、ＩＢＡＴを取り除かれたラットによる増大したカテコー
ルアミン応答の進行喪失があり、このことは、ＢＡＴがカテコールアミン誘導に
よる発熱性応答の長期にわたる維持を担っていることを示唆している。興味ある
ことに、増大した応答を維持するＩＢＡＴの能力は、寒さへの曝露の期間に相関
した。これは、ＢＡＴが、順応に対する短期及び長期の効果を有することを示唆
している。長期間の寒さへの順応では、ＩＢＡＴで占有されている以外の領域へ
のＢＡＴの拡散がある可能性があり、従ってカテコールアミン応答が維持される
。他の研究は、通常はＢＡＴの内分泌的性質をも支えない条件下で、寒さへ順応
させた動物のＩＢＡＴの暖かい中で生育させた動物への移植が、発熱性応答を与
えることができることを示す。

【００１０】 熱発生だけでなく体重の維持におけるこの内分泌器官の役割は、この組織の発
生の間のジフテリアトキシンの発現を制御するＢＡＴ-特異的プロモーター（Ｕ
ＰＣ１）を使用し、トランスジェニックマウスモデルでのＢＡＴの除去によって
示された。動物は、寒さに曝されると深部体温を維持できくなることが見出され
、過食、レプチン耐性、そして肥満であった。これら後者の知見の重要性は、Ｂ
ＡＴが無いと、ＢＡＴ熱発生及び／又はＢＡＴ誘導ホルモンの損失のために、マ
ウスが代謝効率を高めるということである。すなわち、ＢＡＴ及びＵＣＰが無い
と、脂肪の形で貯蔵されているエネルギーの純蓄積がある。最終的には、単に一
時的なＢＡＴの切除を伴うマウスの一系統では、代謝の欠陥は、ＢＡＴの再出現
によって回復する［Lowell, Nature. 1993 Dec 23-30; 366(6457): 740-2；Frie
dman, Nature. 1993 Dec 23-30；366(6457): 720-1]。ともに取得されたこれら
のデータは、ＢＡＴは、それが観察された生物の代謝状況において中心的役割を
果たす独特な熱発生及び内分泌性器官であるという論点を支持する。

【００１１】 内分泌性器官が代謝を制御し、そうすることが否応なしに遺伝子発現を制御し
なければならないことは、はっきりと確立されたことである。ＢＡＴが内分泌及
び熱発生活性を提供する機構を理解することによって、代謝の制御への洞察が得
られる。ＢＡＴ熱発生、増殖、又は分化に関連する遺伝子及びタンパク質は、代
謝又は他の疾患を治療又は診断するための新規な手法を提供する。さらには、そ
れらは、代謝及び他の疾患を治療するための医薬又は分子を発見するためのスク
リーニングの試みに用いられてもよく、薬理ゲノム学などで使用される価値ある
マーカーとなれる。

【００１２】 （発明の概要） 本発明は、ＢＡＴが環境因子へ応答する際の機構で理解されていることを示す
。これら動物の中温区域以下でのマウスの管理に応じて調節した遺伝子は、代謝
応答の重要なマーカー、又はそれを欠くと代謝疾患のための潜在的な薬剤の標的
、及び／又は分泌／内在性膜タンパク質の場合は、薬剤そのものに相当する。 この発明は、新規ポリペプチドをコードする新規核酸配列の発見に部分的に基
づいている。本発明で開示されたポリペプチドをコードする核酸、並びにその誘
導体及び断片は、以下において、「ｇ１２Ｌ」核酸又はポリペプチド配列として
まとめて命名されている。

【００１３】 一側面では、本発明は、配列番号：１又は３に開示された核酸と同一性を有す
る核酸配列を含む、ｇ１２Ｌポリペプチドをコードする単離されたｇ１２Ｌ核酸
分子を提供する。幾つかの実施態様では、ｇ１２Ｌ核酸分子は、緊縮条件下で、
ｇ１２Ｌ核酸配列のタンパク質コード化配列を含む核酸分子と相補的な核酸配列
とハイブリダイズすることができる。又、本発明は、ｇ１２Ｌポリペプチド、又
はその断片、相同体類似体又はその誘導体をコードする単離された核酸を含む。
例えば、この核酸は、配列番号：２又は４のアミノ酸配列を含んでなるポリペプ
チドに対して、少なくとも８０％の同一性のあるポリペプチドをコードすること
ができる。例えば、この核酸は、配列番号：１又は３の何れかの核酸配列を含む
ゲノムＤＮＡ断片又はｃＤＮＡ分子であり得る。

【００１４】 また、本発明に含まれるのは、オリゴヌクレオチド、例えば、ｇ１２Ｌ核酸（
例えば、配列番号：１又は３）の少なくとも６連続ヌクレオチド、或いは前記オ
リゴヌクレオチドの相補鎖を含むオリゴヌクレオチドである。 また、本発明に含まれるのは、十分に精製されたｇ１２Ｌポリペプチド（配列
番号：２又は４）である。ある実施態様では、ｇ１２Ｌポリペプチドには、ヒト
ｇ１２Ｌポリペプチドのアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列が含ま
れる。 また、本発明には、ｇ１２Ｌポリペプチドと免疫選択的に結合する抗体を主と
している。 その他の側面では、本発明は、治療的及び製薬的に許容可能な担体の治療的又
は予防的に有効な量のを含む、製薬的組成物を含む。治療は、例えばｇ１２Ｌ核
酸、ｇ１２Ｌポリペプチド、或いはｇ１２Ｌポリペプチドに対して特異的な抗体
とすることがきる。更なる側面では、本発明は、一つ又は複数の容器、この製薬
的組成物の治療的又は予防的有効量を含む。

【００１５】 更なる側面では、本発明には、ＤＮＡによってコードされているｇ１２Ｌポリ
ペプチドの発現を可能にする条件下で、ｇ１２Ｌ核酸を含む細胞を培養すること
によってポリペプチドを生産する方法が含まれる。所望するならば、次いでｇ１
２Ｌポリペプチドを回収できる。 その他の側面では、本発明には、試料中のｇ１２Ｌポリペプチドの存在を検出
する方法が含まれる。この方法では、ポリペプチドと化合物との間の複合体の形
成が可能となる条件下で、試料をポリペプチドと選択的に結合する化合物と接触
させる。この複合体は検出され、もし存在するならば、その結果に従って試料中
のｇ１２Ｌポリペプチドを同定する。 また、本発明には、ｇ１２Ｌの発現に基づく特定の細胞又は組織型を同定する
方法が含まれる。

【００１６】 また、本発明に含まれているのは、試料をｇ１２Ｌ核酸プローブ又はプライマ
ーと接触させことによって、試料中のｇ１２Ｌ核酸分子の存在を検出する方法、
並びに核酸プローブ又はプライマーが試料中のｇ１２Ｌ核酸分子と結合している
かどうかを検出することである。 さらなる側面では、本発明は、ｇ１２Ｌポリペプチドを含む細胞試料を、この
ポリペプチドの活性を調節するのに十分な量のｇ１２Ｌポリペプチドと結合する
化合物と接触させることによって、ｇ１２Ｌポリペプチドの活性を調節するため
の方法を示す。この化合物は、例えば、ここでさらに記載されているような、核
酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質又は他の有機炭
素含有又は無機分子等の小分子であることができる。

【００１７】 また、本発明の範囲内には、疾患又は症候群の治療又は予防のための薬剤の製
造における治療剤の使用があり、これら疾患又は症候群には、例えば、肥満、糖
尿病、及び悪液質等の代謝疾患及び疾病；過形成、癌、及び再狭窄等の細胞増殖
疾患及び疾病；アルツハイマー病、多発性硬化症及びパーキンソン病等の神経変
性疾患及び疾病；ＡＩＤＳ、炎症、及び自己免疫疾患等の免疫疾患及び疾病；Ｓ
ＣＩＤ、周期性好中球減少症、及び血小板血症等の造血性疾患及び疾病が含まれ
る。好ましい実施態様では、治療剤は、肥満及び肥満関連疾患治療のための薬剤
の製造に使用される。限定されるものではないが、肥満関連疾患には、II型糖尿
病（ＮＩＤＤＭ）、高血圧、冠状動脈性心臓病、高コレステロール血症、変形性
関節症、胆石、生殖器官の癌、及び睡眠時無呼吸が含まれる。治療剤は、例えば
、ｇ１２Ｌ核酸、ｇ１２Ｌポリペプチド、又はｇ１２Ｌ-特異的抗体、又は生物
学的に活性な誘導体又はその断片であることができる。

【００１８】 更に、本発明には、疾患又は症候群のモジュレーターのスクリーニング方法が
含まれ、これら疾患又は症候群には、例えば、肥満、糖尿病、及び悪液質等の代
謝疾患及び疾病；過形成、癌、及び再狭窄等の細胞増殖疾患及び疾病；アルツハ
イマー病、及びパーキンソン病等の神経変性疾患及び疾病；ＡＩＤＳ、炎症、及
び自己免疫疾患等の免疫疾患及び疾病；ＳＣＩＤ、周期性好中球減少症、及び血
小板血症等の造血性疾患及び疾病が含まれる。好ましい実施態様では、方法は、
肥満及び肥満関連疾患のモジュレーターをスクリーニングする。この方法には、
被験化合物とｇ１２Ｌポリペプチドを接触させ、被験化合物がｇ１２Ｌポリペプ
チドと結合するか否かを決定することが含まれる。被験化合物のｇ１２Ｌポリペ
プチドとの結合は、被験化合物が活性、又は前出の疾患又は症候群の潜在性又は
素因のモジュレーターであることを示す。

【００１９】 また、本発明の範囲内にあるのは、活性、又は例えば肥満、糖尿病、及び悪液
質等の代謝疾患及び疾病；過形成、癌、及び再狭窄等の細胞増殖疾患及び疾病；
アルツハイマー病、及びパーキンソン病等の神経変性疾患及び疾病；ＡＩＤＳ、
炎症、及び自己免疫疾患等の免疫疾患及び疾病；ＳＣＩＤ、周期性好中球減少症
、及び血小板血症等の造血性疾患及び疾病が含まれる疾患又は症候群の潜在性又
は素因のモジュレーターのスクリーニング方法であり、被験化合物を前出の疾患
又は症候群の増大した危険性がある被験動物へ投与することによる。好ましい実
施態様では、被験動物は、肥満及び肥満関連疾患の増大した危険性を有する。被
験動物は、ｇ１２Ｌ核酸によってコードされる組み換えポリペプチドを発現する
。次いで、組み換え的にｇ１２Ｌポリペプチドを発現するコントロールの動物の
タンパク質の発現又は活性のように、ｇ１２Ｌポリペプチドの発現又は活性が被
験動物において測定され、疾患又は症候群の増大した危険性ではない。次に、被
験動物とコントロールの動物の双方におけるｇ１２Ｌポリペプチドの発現を比較
する。コントロールの動物に関連した被験動物のｇ１２Ｌポリペプチドの活性の
変化は、疾患又は症候群の潜在性のモジュレーターであることを示す。

【００２０】 更にその他の側面では、本発明には、被検体（例えばヒト被検者）での、ｇ１
２Ｌポリペプチド、ｇ１２Ｌ核酸、又は双方の改変レベルに関連した疾患の存在
、又はその疾患にかかりやすい素因を決定する方法が含まれる。この方法には、
被検体からの被験試料中のｇ１２Ｌポリペプチドの量を測定し、被験試料中のポ
リペプチドの量をコントロールの試料中に存在するｇ１２Ｌポリペプチドの量を
比較することが含まれる。コントロールの試料と比較した、被験試料中のｇ１２
Ｌポリぺプチドのレベルの変化は、被検体中の疾患の存在、又はこの疾患へのへ
のかかりやすい素因を示す。好ましくは、かかりやすい疾患には、例えば、肥満
、糖尿病、及び悪液質等の代謝疾患及び疾病；過形成、癌、及び再狭窄等の細胞
増殖疾患及び疾病；アルツハイマー病、及びパーキンソン病等の神経変性疾患及
び疾病；ＡＩＤＳ、炎症、及び自己免疫疾患等の免疫疾患及び疾病；ＳＣＩＤ、
周期性好中球減少症、及び血小板血症等の造血性疾患及び疾病が含まれる。より
好ましい実施態様では、本発明の新しいポリペプチドは、肥満及び肥満に関連し
た疾患の存在、又はこれら疾患にかかりやすい素因をスクリーニングする方法で
使用される。また、本発明の新しいポリペプチドの発現レベルは、種々の癌、例
えば乳癌の存在又はその疾患にかかりやすい素因をスクリーニングするための方
法で使用できる。

【００２１】 更なる側面では、本発明には、病的症状を和らげる、又は予防するために十分
な量のｇ１２Ｌポリペプチド、ｇ１２Ｌ核酸、又はｇ１２Ｌ特異的抗体を被検体
（例えば、ヒト被検者）へ投与することによって、哺乳動物の疾患に関連した病
的症状を治療又は予防する方法が含まれる。好ましい実施態様では、疾患には、
肥満、糖尿病、及び悪液質等の代謝疾患及び疾病；過形成、癌、及び再狭窄等の
細胞増殖疾患及び疾病；アルツハイマー病、及びパーキンソン病等の神経変性疾
患及び疾病；ＡＩＤＳ、炎症、及び自己免疫疾患等の免疫疾患及び疾病；ＳＣＩ
Ｄ、周期性好中球減少症、及び血小板血症等の造血性疾患及び疾病が含まれる。
より好ましい実施態様では、投与とは、肥満又は肥満関連疾患で苦しんでいると
思われる被検体に対するものである。

【００２２】 更にその他の側面では、本発明は、当該分野で共通に用いられている多数の技
術のどれか一つによって、ｇ１２Ｌ核酸及びポリペプチドと相互作用をする細胞
性レセプター及び下流のエフェクターを含む細胞性組成物を同定する方法に使用
できる。２-ハイブリッドシステムに限定されるものではないが、これらには、
アフィニティー精製、抗体又は他の特異的相互作用分子による共沈殿を含む。 ここに記載のものと類似又は同等の方法及び材料は本発明の実行又は試験に使
用できるが、適切な方法及び材料は下記に記載されている。すべての出版物、特
許出願、特許、並びにここで言及されている他の参考文献が、その全てが参考文
献として取り入れられている。抵触する場合は、定義を含む本明細書がコントロ
ールする。加えて、材料、方法、及び実施例は、単に例示的であり、限定するこ
とを意図していない。

【００２３】 （詳細な説明） 褐色脂肪細胞組織（ＢＡＴ）の代謝活性と増殖状態に影響を与える条件下でＢ
ＡＴで発現する遺伝子を同定することによって、発明者らは，既知の核酸及びタ
ンパク質に対して相当な相同性を有する新規核酸及びポリペプチドを単離した。
そのような相同性のあるタンパク質の一つはSpot14である。

【００２４】 ヒト、マウス、及びラットのSpot14は、およそ〜１８ｋＤの核に位置するタン
パク質であり、マウス、ラット、及びヒトで高頻度で保存されている。ヒト遺伝
子は、ラットSpot14遺伝子に対するアミノ酸レベルで８１％の同一性があり、マ
ウスホモログは、ラット遺伝子産物に対して９４％の同一性である（Grillasca,
FEBS Lett. 1997 Jan 13; 401(1): 32-42）。ラットSpot14は、相対的に良く研
究されており、ＷＡＴ（白色脂肪組織）、ＢＡＴ（インシュリン、レチノイン酸
、ｃＡＭＰ）、及び肝臓での代謝制御に関連する多くの条件下で、その発現が調
節されていることが示されている。それは、インシュリン、炭水化物、及び甲状
腺ホルモン（ＴＨ）によって上方制御されている。この後者で観察された調節は
、肝臓においてそれがＴＨ応答遺伝子として同定されることにつながる。インシ
ュリン、ＴＨ、及び炭水化物がSpot14の発現を上方制御する一方で、食事性脂肪
及びポリ不飽和脂肪酸は下方制御を引き起こす（Clarke, J Nutr. 1990 Feb；12
0(2): 225-31；Jump, Proc Natl Acad Sci USA. 1993 Sep 15；90(18): 8454-8
）。代謝作用化合物に応答してその発現パターンと調節を示すSpot14は、正常及
び疾患症状の下で、脂質生合成及び／又は脂質生合成組織の発生／増殖にとって
重要な役割を果たす（Grillasca, FEBS Lett. 1997 Jan 13; 401(1): 38-42）。

【００２５】 Spot14の増幅は癌と関連している。、腫瘍の成長と弱い予後の予想にとって必
要な増大した長鎖脂肪酸合成は、乳癌で起こり得る。Spot14タンパク質は、脂肪
酸合成の酵素をコードしている遺伝子を活性化する機能がある。ヒトSpot14遺伝
子がある染色体領域１１ｑ１３の増幅は、同じく乳癌の弱い予後を予言する。ヒ
トSpot14遺伝子は、１１ｑ１３の増幅領域のテロメア末端のマーカーＤ１１Ｓ９
０６とＤ１１Ｓ９３７の間に位置し、乳癌由来細胞株で増幅し発現していること
が見出された。腫瘍代謝の決定因子としてのタンパク質の役割が他の発見で支持
された。Spot14の発現は、乳癌の２つの予後インジケータの間の病理生理学的な
関連を示した：増大した脂質生合成と１１ｑ１３増幅（Moncur, Cytogenet Cell
Genet. 1997; 78(2): 131-2；Cunningham, Thyroid. 1998 Sep; 8(9): 815-25
；Moncuri, Proc Natl Acad Sci USA. 1998 Jun 9; 95(12): 6989-94）。

【００２６】 Spot14タンパク質は、哺乳動物ホモログである小さなゼブラフィッシュ（Dani
o reio）原腸陥入特異的タンパク質によって、ｇ１２だと考えられる（Grillasc
a, FEBS Lett. 1997 Jan 13; 401(1): 38-42）。Spot14は、ｇ１２に対して高頻
度のホモロジーを有する。Spotタンパク質及び密接に関連したタンパク質は、ｇ
１２様タンパク質のより大きなファミリーとして、正常及び疾患の状況下で、脂
質生合成（及び他）組織の発生及び／増殖の間の分化の役割を担う。推定上のフ
ァミリーメンバーは、幾つかの共通の特徴を有する：低分子量である「spot box
」、及び恐らくは高アスパラギン酸及びグルタミン酸量を有する１０−２０アミ
ノ酸のカルボキシ末端の高酸性領域が存在することによる酸性ｐI（Grillasca,
FEBS Lett. 1997 Jan 13; 401(1): 38-42）。 本発明は、部分的に、マウス、ラット、及びヒトのSpot14タンパク質よりもｇ
１２に類似している新規ポリペプチドをコードする新規のマウス遺伝子のヒトホ
モログのみならず、新規マウス遺伝子の発見に基づいている。これら新規遺伝子
及びポリペプチドは、ここでまとめて「ｇ１２様」（ｇ１２Ｌ）と命名されてい
る。

【００２７】 本発明の新規ｇ１２Ｌ核酸には、表１Ａ及び２Ａに示されている配列の核酸、
又はその断片が含まれる。また、発明には、突然変異体又は変異体ｇ１２Ｌ核酸
が含まれていて、その任意の塩基は表１Ａ及び２Ａに示された対応する塩基から
変化し得るが、突然変異体又は変異体ｇ１２Ｌ核酸は、まだｇ１２Ｌタンパク質
断片、又はそのような核酸の断片の活性及び生理学的機能を維持するタンパク質
をコードする。更に、本発明には、相補的核酸断片を含む、丁度記載したものと
配列が相補的である核酸を更に含む。本発明には、更に、構造に化学的に修飾し
たものを含む、核酸又は核酸断片、或いはその相補鎖が含まれる。限定しない例
によって、そのような修飾物には、修飾塩基、並びに糖リン酸骨格が修飾又は誘
導体化されている核酸が含まれる。これらの修飾は、少なくとも部分的におこな
われ、修飾核酸の化学的安定性を増し、例えば、それらがアンチセンス結合核酸
として被検体への治療上の用途に使用でき得るようにする。突然変異体又は変異
体核酸、及び核酸相補鎖では、２０％まで又はさらに多くの塩基がそのように変
化し得る。

【００２８】 本発明の新規ｇ１２Ｌタンパク質には、表１Ｂ及び２Ｂに示す配列のタンパク
質断片が含まれる。また、発明には、ｇ１２Ｌ突然変異体又は変異体タンパク質
が含まれていて、その任意の塩基は表１Ｂ及び２Ｂに示された対応する塩基から
変化し得るが、ｇ１２Ｌ突然変異体又は変異体タンパク質は、まだその天然活性
及び生理学的機能、或いはその機能断片を維持するタンパク質をコードする。突
然変異体又は変異体ｇ１２Ｌタンパク質では、２０％まで、又はそれより多い残
基がそのように変化し得る。本発明には、更に、本発明の任意のｇ１２Ｌタンパ
ク質と免疫特異的に結合するＦ_ａｂ又は（Ｆ_ａｂ）_２のような抗体及び抗体断片
が含まれる。

【００２９】 ヒトｇ１２Ｌ 表１Ａは、ヒトｇ１２Ｌタンパク質をコードするヌクレオチド断片の核酸配列
を表している。推定上のＡＴＧ開始コドンは、太字の下線タイプで標識されてい
る。推定上の終止コドンは、太字のイタリック下線タイプである。配列は、ライ
ン当たり４５文字で表されている。

【００３０】 表１Ａ．ヒトｇ１２Ｌヌクレオチド断片（配列番号：１）

【００３１】 配列番号：１によってコードされているポリペプチドは、表１Ｂにおいて一文
字コードを使用して表されている。

【００３２】 表１Ｂ．ヒトｇ１２Ｌポリペプチド配列（配列番号：２）

【００３３】 マウスｇ１２Ｌ 表２Ａは、マウスｇ１２Ｌタンパク質をコードするヌクレオチド断片の核酸配
列を表す。推定上のＡＴＧ開始コドンは、太字下線タイプで標識されている。推
定上の終止コドンは、太字のイタリック下線タイプである。推定上のポリアデニ
ル化部位は、イタリックの下線タイプである。配列は、ライン当たり４５文字で
表している。

【００３４】 表２Ａ．マウスｇ１２Ｌヌクレオチド断片（配列番号：３）

【００３５】 配列番号：３によってコードされたポリペプチドは、表２Ｂにおいて、一文字
コードを使用して表されている。

【００３６】 表２Ｂ．マウスｇ１２Ｌポリペプチド配列（配列番号：４）

【００３７】 ｇ１２Ｌポリペプチドとゼブラフィッシュｇ１２、及びマウス、ラット、そし
てヒトSpot14ポリペプチドのアライメントが図１に示されている。 本発明のｇ１２Ｌ核酸及びタンパク質は、例えば、肥満、糖尿病、及び悪液質
等の代謝疾患及び疾病；過形成、癌、及び再狭窄等の細胞増殖疾患及び疾病；ア
ルツハイマー病、多発性硬化症及びパーキンソン病等の神経変性疾患及び疾病；
ＡＩＤＳ、炎症、及び自己免疫疾患等の免疫疾患及び疾病；ＳＣＩＤ、周期性好
中球減少症、及び血小板血症等の造血性疾患及び疾病に関連する強力な治療上の
用途において有用である。好ましい実施態様では、本発明の核酸及びタンパク質
は、肥満関連疾患、他の代謝疾患、増殖疾患，及び他の疾患に対する治療上の用
途に使用されている。限定されるものではないが、肥満関連疾患には、II型糖尿
病（ＮＩＤＤＭ）、高血圧、冠状動脈性心臓病、高コレステロール血症、変形性
関節症、胆石、生殖器官の癌、及び睡眠時無呼吸が含まれる。例えば、ヒトｇ１
２ＬをコードするｃＤＮＡは遺伝子治療において有用であり得るし、ヒトｇ１２
Ｌタンパク質は、それを必要とする被検体へ投与する場合に有用であり得る。本
発明のヒトｇ１２Ｌタンパク質をコードする新規核酸、又はその断片は、核酸又
はタンパク質の存在又は量を評価する診断用途、一塩基多型、又は他の変異にと
って更に有用であり得る。これらの材料は、治療上又は診断上の方法での使用に
関する本発明の新規物質と免疫特異的に結合する抗体の生成にとって更に有用で
ある。

【００３８】 ｇ１２L核酸及びポリペプチド 本発明の一側面は、ｇ１２Lポリペプチド又はその生物学的に活性な部分をコ
ードする単離された核酸に関する。また、本発明に含まれるのは、ｇ１２Ｌコー
ド化核酸（例えば、ｇ１２ＬｍＲＮＡｓ）及び断片を同定するためのハイブリダ
イゼーションプローブとしての用途が十分な核酸断片であって、ｇ１２Ｌ核酸分
子の増幅及び／又は変異ためのＰＣＲプライマーとして使用するものである。こ
こで使用されているように、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（例えば、
ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド
類似体を使用して生成したＤＮＡ又はＲＮＡの類似体、及び誘導体、断片及びそ
のホモログを意図する。核酸分子は、一本鎖又は二重鎖であってもよいが、好ま
しくは二重鎖ＤＮＡからなる。

【００３９】 ｇ１２Ｌ核酸は、成熟したｇ１２Ｌポリペプチドをコードすることができる。
ここで使用されているように、本発明で開示されているポリペプチド又はタンパ
ク質の「成熟」型とは、天然発生ポリペプチド、又は前駆体型、又はプロタンパ
ク質の産物である。天然発生ポリぺプチド、前駆体又はプロタンパク質には、限
定しない例によって、対応する遺伝子によってコードされた完全長遺伝子産物が
含まれる。あるいは、ここで示されているオープンリーディングフレームによっ
てコードされたポリペプチド、前駆体又はプロタンパク質として定義され得る。
再び制限しない例のために、産物の「成熟」型は、遺伝子産物が生じる細胞、又
は宿主細胞内で発生し得るように、一つ又は複数の天然発生プロッセッシングス
テップの結果として生じる。ポリペプチド又はタンパク質の「成熟」型につなが
るそのようなプロッセッシングステップの例には、オープンリーディングフレー
ムの開始コドンによってコードされるＮ末端メチオニン残基の切断、或いはシグ
ナルペプチド又はリーダー配列のタンパク質分解が含まれる。従って、残基１が
Ｎ末端メチオニンである残基１からＮを有する前駆体ポリペプチド又はタンパク
質はから生じた成熟型は、Ｎ末端メチオニンの除去後に残る残基２からＮを有す
る。或いは、Ｎ末端シグナル配列の残基１から残基Ｍが切断された、残基１から
Ｎを有する前駆体ポリペプチド又はタンパク質から生じる成熟型は、残基Ｍ＋１
から残りの残基Ｎまでの残基を有する。更にここで使用されているように、ポリ
ペプチド又はタンパク質の「成熟」型は、タンパク分解性切断以外の翻訳後修飾
の段階より生じ得る。このような付加的プロセスには、制限しない例のために、
グリコシル化、ミリストイル化又はリン酸化が含まれる。一般的に、成熟ポリペ
プチド又はタンパク質は、単にこれらプロセスの一つ、又はこれらの何れかの組
み合わせの作動によって生じる。

【００４０】 ここで使用されるような「プローブ」という用語は、特定的用法に依存し、核
酸配列の種々の長さ、好ましくは、少なくとも約１０ヌクレオチド（ｎｔ）、１
００ｎｔ、或いはおよそ例えば６，０００ｎｔほどに一致する。プローブは、同
一性、類似性、又は相補的核酸配列の検出に使用される。より長いプローブは、
一般的に天然又は組み換えソースから得られ、高い特異性があり、より短いオリ
ゴマープローブよりもより遅くハイブリダイズする。プローブは一本鎖又は二本
鎖であってもよく、ＰＣＲ、膜に基づくハイブリダイゼーション技術、又はＥＬ
ＩＳＡのような技術において特異性を有するように設計されている。

【００４１】 ここで使用されている「単離された」核酸分子という用語は、核酸の天然ソー
スに存在する他の核酸分子から分離されたものである。好ましくは、「単離され
た」核酸は、核酸が得られる生物のゲノムＤＮＡの核酸（すなわち、核酸の５'-
及び３'-末端に位置する配列）と天然に隣接する配列を有しない。例えば、種々
の実施例では、単離されたｇ１２Ｌ核酸分子は、核酸が得られる細胞／組織（例
えば、脳、心臓、肝臓、脾臓等）のゲノムＤＮＡの核酸分子と天然に隣接する、
約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ又は０．１ｋｂより低
いヌクレオチド配列を含むことができる。更には、ｃＤＮＡ分子のような「単離
された」核酸分子には、組み換え技術によって生産された場合には、実質上他の
細胞物質又は培養培地がなく、化学的に合成された場合には、化学前駆体又は他
の化学物質がない。

【００４２】 本発明の核酸分子、例えば、配列番号：１又は３のヌクレオチド配列、又はこ
の前出のヌクレオチド配列の相補鎖は、標準的な分子生物学的技術及びここで提
供される配列情報を用いることで単離することができる。ハイブリダイゼーショ
ンプローブとして配列番号：１又は３の核酸配列のすべて又は一部分を使用して
、標準的ハイブリダイゼーション及びクローニング技術を使用して、ｇ１２Ｌ分
子を単離することができる（例えば、Sambrookら., に記載のように（編集者）
、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 第２版., Cold Spring Harbor Lab
oratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989；及びAusubel,ら., （編集者）
， CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New Yorks,
NY, 1993）。 本発明の核酸は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又は代わりにゲノムＤＮＡをテンプレー
トとして、並びに標準的なＰＣＲ増幅技術による適切なオリゴヌクレオチドプラ
イマーを使用することで増幅することができる。そのようにして増幅させた核酸
は、適切なベクターへクローニングし、ＤＮＡ配列分析によって特徴付けること
ができる。さらには、ｇ１２Ｌヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチド
は、例えば自動化ＤＮＡシンセサイザーを使用するなど、標準的な合成技術によ
って調製することができる。

【００４３】 ここで使用されているように、「オリゴヌクレオチド」という用語は、連続し
て連結しているヌクレオチド残基を指し、そのオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反
応に使用する十分な数のヌクレオチド塩基を有する。短いオリゴヌクレオチド配
列は、ゲノム又はｃＤＮＡ配列に基づいている、又はそれから設計され、特定の
細胞又は組織での同一、類似又は相補的ＤＮＡ又はＲＮＡの存在を増幅、確認、
又は明かにするために使用される。オリゴヌクレオチドは、約１０ｎｔ、５０ｎ
ｔ、又は１００ｎｔ長を有する核酸配列の一部分、好ましくは、約１５ｎｔから
３０ｎｔ長である。本発明の一つの実施態様では、１００ｎｔ長より短い核酸分
子からなるオリゴヌクレオチドは、更に、配列番号：１又は３の少なくとも６連
続ヌクレオチド、或いはその相補鎖を含む。オリゴヌクレオチドは、化学的に合
成してもよく、プローブとしても使用されてよい。

【００４４】 その他の実施態様では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号：１又は３
に示すヌクレオチド配列の相補鎖である核酸分子、又はこのヌクレオチド配列の
一部分（例えば、プローブ又はプライマー、或いはｇ１２Ｌポリペプチドの生物
学的に活性な部分をコードする断片）を含む。配列番号：１又は３に示すヌクレ
オチド配列と相補的な核酸分子は、配列番号：１又は３に示すヌクレオチド配列
と実質的に相補的なものであって、それは配列番号：１又は３に示すヌクレオチ
ド配列と殆どのミスマッチがなく水素結合でき、それによって安定な二重鎖を形
成する。

【００４５】 ここで使用されるように、「相補的な」という用語は、核酸分子のヌクレオチ
ド単位の間のワトソン-クリック又はフーグスティーン塩基対を指し、「結合」
という用語は、２つのポリペプチド、又は化合物、又は結合ポリペプチド、又は
化合物、又はその組み合わせの間の物理的又は化学的相互作用を意味する。結合
には、イオン性、非イオン性、ファンデルワールス、疎水性相互作用等が含まれ
る。物理的相互作用は、直接又は間接の何れかであってよい。間接相互作用は、
その他のポリペプチド又は化合物の作用を介した、又はそれに起因するものであ
る得る。直接結合とは、その他のポリペプチド又は化合物の作用を介して、又は
それに起因して生じる相互作用ではないが、その代替は、他の実質的な化学相互
作用を含まない。

【００４６】 ここで提供されているのは、少なくとも６（連続）核酸又は少なくとも４（連
続）アミノ酸の配列として定義され、それぞれ、核酸の場合は特異的なハイブリ
ダイゼーション、アミノ酸の場合においてはエピトープの特異的認識を可能にす
る十分な長さであり、殆どの幾つかの部分が完全長配列より短い。断片は、選択
した核酸又はアミノ酸配列の任意の連続した部分から誘導される。誘導体は、核
酸配列又はアミノ酸配列であって、直接、或いは修飾又は部分置換によるの何れ
かで、天然化合物から形成される。類似体は、同一ではないが、天然化合物と構
造的な類似性を有する核酸配列又はアミノ酸配列であるが、所定の成分又は側鎖
に関して天然化合物と異なる。類似体は、合成又は異なる進化的起源からのもで
あり得て、野生型と比較して類似又は反対の代謝活性を有し得る。ホモログは、
異なる種から誘導された特定の遺伝子の核酸配列又はアミノ酸配列である。

【００４７】 下記に記載のように、誘導体又は類似体が修飾核酸又はアミノ酸を含む場合、
誘導体及び類似体は完全長又は完全長以外であり得る。本発明の核酸又はタンパ
ク質の誘導体又は類似体には、限定されるものではないが、種々の実施態様にお
いて、同じ大きさの核酸又はアミノ酸配列に対して、或いは当該分野で知られて
いるコンピューターホモロジープログラムによってアライメントした配列と比較
した場合、或いはコード化核酸が、緊縮性、中程度に緊縮性、又は低い程度の緊
縮性の条件下で前出のタンパク質をコードする配列の相補鎖とハイブリダイズす
ることができるならば、少なくとも約７０％、８０％、又は９５％同一性（好ま
しい同一性は８０−９５％）で本発明の核酸又はタンパク質と実質的に相同的で
ある領域を含む分子が含まれる。Ausubelら., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR
BIOLOGY, John Wily & Sons, New York, NY, 1993, 及び以下。

【００４８】 「相同的核酸配列」又は「相同的アミノ酸配列」、又はその変異体とは、上記
で論じたように、ヌクレオチドレベル又はアミノ酸レベルでの相同性によって特
徴付けられる配列を指す。相同的ヌクレオチド配列は、ｇ１２Ｌポリペプチドの
イソ型をコードする配列をコードする。イソ型は、例えばＲＮＡの選択的スプラ
イシングの結果として、同じ生物の異なる組織で発現できる。或いは、イソ型は
、異なる遺伝子によってコードされている。本発明では、相同的ヌクレオチド配
列には、限定されるものではないが脊椎動物を含むヒト以外の種のｇ１２Ｌポリ
ペプチドをコードするヌクレオチド配列が含まれ、従って、このヒト以外の種に
は、例えば、カエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、そし
て他の生物が含まれることが可能である。また、相同的ヌクレオチド配列には、
限定されるものではないが、ここで示したヌクレオチド配列の天然発生の対立遺
伝子変異体及び突然変異が含まれる。しかしながら、相同的ヌクレオチド配列に
は、ヒトｇ１２Ｌタンパク質をコードする正確なヌクレオチド配列が含まれない
。相同的核酸配列には、ｇ１２Ｌの生物学的活性を有するポリペプチドとともに
、配列番号：２又は４の保存的アミノ酸置換（下記を参照）をコードする核酸配
列が含まれる。ｇ１２Ｌタンパク質の種々の生物学的活性は、下記に示されてい
る。

【００４９】 ｇ１２Ｌポリペプチドは、ｇ１２Ｌ核酸のオープンリーディングフレーム（「
ＯＲＦ」）によってコードされている。ＯＲＦは、潜在的にポリペプチドへ翻訳
されるヌクレオチド配列に相当する。ＯＲＦを含む核酸の一続きには、終止コド
ンによる妨害がない。全タンパク質に関するコード化配列を表すＯＲＦは、ＡＴ
Ｇ「開始」コドンで始まり、すなわちＴＡＡ、ＴＡＧ、又はＴＧＡの３つの「終
止」コドンのうちの一つで終止する。この発明の目的のためには、ＯＲＦは、開
始コドン、終止コドン、或いは双方を有する又は有しないコード化配列の何れの
部分でもよい。正真正銘のタンパク質をコードする良い候補として考えられるＯ
ＲＦのためには、最小の大きさの必修条件がしばしば設定され、それは例えば、
５０又はそれより多いアミノ酸のタンパク質をコードするＤＮＡの一続きである
。

【００５０】 ヒトｇ１２Ｌ遺伝子のクローニングから決定されたヌクレオチド配列は、他の
脊椎動物のｇ１２Ｌホモログのみならず、他の細胞型、例えば他の組織のｇ１２
Ｌホモログを同定し及び／又はクローニングするために設計されたプローブとプ
ライマーの生成を可能にする。プローブ／プライマーは、典型的には、十分に精
製されたオリゴヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチドは、典型的には、
緊縮性の条件下で、配列番号：１又は３の少なくとも約１２、２５、５０、１０
０、１５０、２００、２５０、３００、３５０又は４００連続センスヌクレオチ
ド配列；配列番号：１又は３のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；或いは配列番
号：１又は３の天然発生変異とハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含
む。

【００５１】 ヒトｇ１２Ｌヌクレオチド配列に基づいたプローブは、同じ又は相同的なタン
パク質をコードする転写物又はゲノム配列を検出するために使用できる。種々の
実施例では、このプローブは、さらに、それへ結合した標識基を含み、例えば標
識基は、ラジオアイソトープ、蛍光化合物、酵素、又は酵素の補因子とすること
ができる。そのようなプローブは、ｇ１２Ｌタンパク質を間違って発現する細胞
又は組織を同定する診断試験キットの一部として使用でき、それは例えば、被検
体の細胞の試料中のｇ１２Ｌコード化核酸のレベルを測定すること、例えば、ｇ
１２Ｌ ｍＲＮＡレベルを検出する、或いはゲノムｇ１２Ｌ遺伝子が変異してい
る、又は削除されたかどうかを決定することである。

【００５２】 「ｇ１２Ｌポリペプチドの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」とは
、必ずしも同一ではないが、本発明のポリペプチドの活性と同じような活性を示
すポリペプチドを指し、特定の生物学的アッセイで測定されるような用量依存性
を有する又は有しない成熟型を含む。「ｇ１２Ｌの生物学的に活性な部分」をコ
ードする核酸断片は、ｇ１２Ｌの生物学的活性を有するポリペプチドをコードす
る（ｇ１２Ｌタンパク質の生物学的活性は下記に記載）配列番号：１又は３の一
部分を単離すること、ｇ１２Ｌタンパク質のコードされた部分を発現させること
（例えば、インビトロで組み換え発現による）、そしてｇ１２Ｌのコードされた
部分の活性を評価することで調製できる。

【００５３】 ｇ１２Ｌ核酸及びポリペプチド変異体 遺伝子コードの縮重のために、本発明は更に配列番号：１又は３に示すヌクレ
オチド配列とは異なる核酸分子を含み、それ故に配列番号：１又は３に示すヌク
レオチド配列によってコードされているのと同じようなｇ１２Ｌタンパク質をコ
ードする。その他の実施態様では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号：
２又は４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列
を有する。

【００５４】 配列番号：１に示すヒトｇ１２Ｌヌクレオチド配列に加えて、ｇ１２Ｌポリペ
プチドのアミノ酸配列の変化につながるＤＮＡ配列多型が個体群（例えば、ヒト
個体群）の中に存在し得ることは、当該分野に熟練した者によって評価されてい
る。そのようなｇ１２Ｌ遺伝子の遺伝的多型は、天然対立遺伝子の変異の結果、
個体集団の中の個人の中に存在し得る。ここで使用されているように、「遺伝子
」及び「組み換え遺伝子」とは、ｇ１２Ｌタンパク質をコードするオープンリー
ディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子、好ましくは脊椎動物のｇ１２Ｌタ
ンパク質を含む核酸分子を指す。このような天然対立遺伝子の変異は、ｇ１２Ｌ
遺伝子のヌクレオチド配列において１−５％の変動を生じる。天然対立遺伝子の
変異の結果であり、ｇ１２Ｌポリペプチドの機能的活性に変化をもたらさない、
ｇ１２Ｌポリペプチドの任意及びすべてのそのようなヌクレオチド変異体、及び
結果として生じるアミノ酸多型は、本発明の範囲内にあるよう意図されている。

【００５５】 更に、他の種のｇ１２Ｌタンパク質をコードし、そしてそれ故に配列番号：１
のヒト配列とは異なるヌクレオチド配列を有するする核酸分子は、本発明の範囲
内にあるよう意図されている。天然対立遺伝子の変異体、並びに本発明のｇ１２
ＬｃＤＮＡｓのホモログに相当する核酸は、それらのヒトｇ１２Ｌ核酸に対する
相同性を基に、緊縮性のハイブリダイゼーション条件下で標準ハイブリダイゼー
ション技術に従ってヒトｃＤＮＡｓ、又はその一部分をハイブリダイゼーション
プローブとして使用することで単離することができる。

【００５６】 従って、その他の実施態様では、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも
６ヌクレオチド長であり、配列番号：１又は３のヌクレオチド配列を含む核酸分
子と、緊縮性条件下でハイブリダイズする。その他の実施態様では、核酸は少な
くとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５０
０、又は２０００、或いはより長いヌクレオチドである。更なるその他の実施態
様では、本発明の単離された核酸分子はコーディング領域とハイブリダイズする
。ここで使用されているように、「緊縮性条件下でのハイブリダイズ」という用
語は、少なくとも互いに対して６０％の相同的なヌクレオチド配列が大体が、互
いにハイブリダイズしたままとなるハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を表
すように意図されている。 ホモログ（すなわち、ヒト以外の種に由来するｇ１２Ｌタンパク質をコードす
る核酸）、又は他の関連する配列（例えば、パラログ）は、核酸ハイブリダイゼ
ーション及びクローニングに関する分野において良く知られている方法を使用し
、特定のヒト配列のすべて又は一部分をプローブとし、低度、中程度、高度の緊
縮性ハイブリダイゼーションによって得ることができる。

【００５７】 ここで使用されているように、「緊縮性ハイブリダイゼーション条件」という
成句は、プローブ、プライマー又はオリゴヌクレオチドが、他の配列ではなく、
その標的配列とハイブリダイズする条件を指す。緊縮性条件は配列依存性であり
、異なった環境では違ったものである。より長い配列は、より短い配列に比べて
、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般的に、緊縮性条件は、限定
されたイオン強度とｐＨでの特異的配列の熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低く選
択される。Ｔｍとは、標的配列に対して相補的なプローブの５０％が、平衡持に
で標的配列とハイブリダイズする温度（限定されたイオン強度、ｐＨそして核酸
濃度）である。標的配列は、一般的に過度に存在するので、Ｔｍでは、平衡時に
５０％のプローブが占められる。典型的には、緊縮性条件とは、塩濃度が約１．
０Ｍ未満のナトリウムイオン、一般的には、ｐＨ７．０から８．３で約０．０１
から１．０Ｍ ナトリウムイオン（又は他の塩）、そして温度は、短いプローブ
、プライマー、又はオリゴヌクレオチド（例えば、１０ｎｔから５０ｎｔ）のた
めには少なくとも約３０℃、並びにより長いプローブ、プライマー及びオリゴヌ
クレオチドのためには少なくとも約６０℃である。また、緊縮性条件は、ホルム
アルデヒドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。

【００５８】 緊縮性条件下は、当該分野に熟練している者には知られており、Ausubel等,(
編集者)CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons (1989),
6.3.1-6.3.6に見出すことができる。好ましくは、条件は、少なくとも相互に約
６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の相同性の配列
が、大体は互いにハイブリダイズしたままのものである。緊縮性ハイブリダイゼ
ーション条件の限定されない例とは、６５℃で６Ｘ ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ ＰＶＰ、０．０２％フ
ィコール、０．０２％ ＢＳＡ、及び５００ｍｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡを含
む高塩バッファーでハイブリダイゼーションし、続いて０．２Ｘ ＳＳＣ、０．
０１％ ＢＳＡで５０℃で１又は複数回洗浄することである。緊縮性条件下で、
配列番号：１又は３の配列とハイブリダイズする本発明の単離された核酸は、天
然発生の核酸分子に相当する。ここで使用されているように、「天然発生」核酸
分子とは、天然で生じるヌクレオチド配列を有するＲＮＡ又はＤＮＡ分子を指す
（例えば、天然タンパク質をコードする）。

【００５９】 二番目の実施態様では、中程度の緊縮性の条件下で、配列番号：１又は３のヌ
クレオチド配列、又はその断片、類似体、又は誘導体を含む核酸分子とハイブリ
ダイズする核酸配列が提供される。中程度の緊縮性ハイブリダイゼーション条件
の限定されない例とは、５５℃で６Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ デンハート液、０．５％
ＳＤＳ及び１００ｍｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡでハイブリダイゼーションし
、続いて３７℃で１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１又は複数回洗浄することで
ある。使用され得る他の中程度の緊縮性の条件は、当該分野で良く知られている
。例えば、Ausubel等,(編集者)1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY
, John Wiley & Sons, NY,及びKriegler, 1990; GENE TRANSFER AND EXPRESSION
, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NYを参照のこと。

【００６０】 三番目の実施例では、低度の緊縮性の条件下で、配列番号：１又は３のヌクレ
オチド配列、又はその断片、類似体、又は誘導体を含む核酸分子とハイブリダイ
ズする核酸配列が提供される。低度の緊縮性ハイブリダイゼーション条件の限定
されない例とは、４０℃で３５％ホルムアルデヒド、５Ｘ ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ ＰＶＰ、０．０
２％フィコール、０．２％ ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡ、１
０％（ｗｔ／ｖｏｌ）硫酸デキストランでハイブリダイゼーションし、続いて５
０℃で２Ｘ ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、及び０．１％ ＳＤＳで１又は複数回洗浄することである。使用され得る他
の低度の緊縮性の条件は、当該分野で良く知られている（例えば、異種間ハイブ
リダイゼーション）。例えば、Ausubel等,(編集者)1993, CURRENT PROTOCOLS IN
MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, 及びKriegler, 1990; GENE TRAN
SFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY；Shilo及びW
einberg, 1981. Proc Natl Acad Sci USA 78: 6789-6792。

【００６１】 保存的変異 個体群の中に存在し得るｇ１２Ｌ配列の天然発生対立遺伝子の変異体に加えて
、突然変異によって、配列番号：１又は３のヌクレオチド配列へ変化を導入する
ことができ、それによってｇ１２Ｌタンパク質の機能を変えること無しに、コー
ドされたｇ１２Ｌタンパク質のアミノ酸配列を変化させることにつながことを、
熟練者は更に理解している。例えば、「非必須」アミノ酸残基のアミノ酸置換に
つながるヌクレオチド置換は、配列番号：２又は４の配列において作成すること
ができる。「非必須」アミノ酸残基とは、ｇ１２Ｌタンパク質の生物学的活性を
変えることなしに、ｇ１２Ｌタンパク質の野生型配列で変えることができる残基
であり、一方で、「必須」アミノ酸残基とは、そのような生物学的活性にとって
必要であるものである。例えば、本発明のｇ１２Ｌタンパク質中に保存されたア
ミノ酸残基は、特に変化に対して非感受性であると予測される。保存的置換され
ることが可能なアミノ酸は、当該分野において良く知られている。

【００６２】 本発明のその他の側面は、活性にとって必須ではないアミノ酸残基の変化を含
むｇ１２Ｌタンパク質をコードする核酸分子に関する。そのようなｇ１２Ｌタン
パク質は、アミノ酸配列に関して、配列番号：２又は４とは異なり、更には生物
学的活性を保持する。一実施態様では、単離された核酸分子はタンパク質をコー
ドするヌクレオチド配列を含み、そのタンパク質は、配列番号：２又は４のアミ
ノ酸配列に対して少なくとも約４５％相同的なアミノ酸配列を含む。好ましくは
、この核酸分子によってコードされたタンパク質は、配列番号：２又は４に対し
て少なくとも約６０％相同的であり；より好ましくは、配列番号：２又は４に対
して少なくとも約７０％相同的であり；さらにより好ましくは、配列番号：２又
は４に対して少なくとも約８０％相同的であり；なおよりこのましくは、配列番
号：２又は４に対して少なくとも約９０％相同的であり；そして最も好ましくは
、配列番号：２又は４に対して少なくとも約９５％相同的である。 配列番号：２又は４のタンパク質に対して相同的なｇ１２Ｌタンパクをコード
する単離された核酸分子は、一つ又は複数のヌクレオチド置換、付加、又は削除
を配列番号：１又は３のヌクレオチド配列へ導入することで生成が可能であるの
で、一つ又は複数のアミノ酸置換、付加又は削除をコードしているタンパク質へ
導入する。

【００６３】 部位特異的突然変異誘発、及びＰＣＲ媒介突然変異誘発のような標準的技術に
よって、配列番号：２又は４へ突然変異を導入することができる。好ましくは、
保存的アミノ酸置換は、一つ又は複数の予想された非必須アミノ酸残基において
なされる。「保存的アミノ産置換」とは、アミノ酸残基を類似の側鎖を有するア
ミノ酸残基で置換することをである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミ
リーは、当該分野において定義されている。これらファミリーには、塩基性側鎖
（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギ
ン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グ
ルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば
、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン。フェニルアラニン、
メチオニン、トリプトファン）、ベーター分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリ
ン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、ト
リプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。従って、ｇ１２Ｌタ
ンパク質中の予測される非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーのその他の
アミノ酸残基によって置換される。あるいは、その他の実施態様では、例えば飽
和突然変異誘発によって、ｇ１２Ｌコード化配列のすべて又は一部分に沿ってラ
ンダムに変異を導入することができ、その結果生じた変異体を、活性を保持する
変異体を同定するために、ｇ１２Ｌ生物学的活性についてスクリーニングするこ
とができる。配列番号：２又は４の突然変異誘発に続いて、当該分野で知られて
いる任意の組み換え技術によって、コードされているタンパク質を発現させるこ
とができ、そしてそのタンパク質の活性を測定することができる。

【００６４】 また、アミノ酸ファミリーの関連性は、側鎖の相互作用によって決定すること
が可能である。置換されたアミノ酸は、完全に保存された「強い」な残基、又は
完全に保存された「弱い」残基である。保存されたアミノ酸残基の「強い」群は
、次の群の中の何れかである：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＮＤＥ
Ｑ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷで、一文字アミノ酸コードは
、互いに置換しあえるアミノ酸とグループ化されている。同様に、保存された残
基の「弱い」群は、次の群の中の何れかである：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴ
ＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＶＬ
ＩＭ、ＨＦＹで、各群の文字は、一文字アミノ酸コードを表す。 一実施態様では、脂肪組織の分化又は発生に作用する能力に関して、変異体ｇ
１２Ｌタンパク質をアッセイすることができる。更にその他の実施態様では、よ
り一般的な生物学的機能（例えば、動物の代謝）を制御する能力に関して、変異
体ｇ１２Ｌタンパク質をアッセイすることができる。

【００６５】 アンチセンス核酸 本発明のその他の側面は、配列番号：１又は３のヌクレオチド配列、又はその
断片、類似体又は誘導体を含む核酸分子に対して、ハイブリダイスすることがで
きる、又は相補的な単離されたアンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス
」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に対して相補的なヌクレオチ
ド配列を含む（例えば、二重鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に対して相補的、又はｍ
ＲＮＡ配列に対して相補的）。特定の側面では、少なくとも約１０、２５、５０
、１００、２５０又は５００ヌクレオチド或いは全ｇ１２Ｌコード鎖に対して、
或いは単にその一部分に対して相補的な配列を含むように、アンチセンス核酸分
子が提供されている。配列番号：２又は４の断片、ホモログ、誘導体及びｇ１２
Ｌタンパク質の類似体；或いは配列番号：１又は３のｇ１２Ｌ核酸配列に対して
相補的なアンチセンス核酸がさらに提供されている。

【００６６】 一実施態様では、アンチセンス核酸分子は、ｇ１２Ｌタンパク質をコードする
ヌクレオチド配列のコード鎖の「コーディング領域」に対してアンチセンスであ
る。「コーディング領域」という用語は、アミノ酸残基へ翻訳されるコドンを含
むヌクレオチド配列の領域を指す。その他の実施態様では、アンチセンス核酸分
子とは、ｇ１２Ｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コ
ーディング領域」に対するアンチセンスである。「非コーディング領域」という
用語は、アミノ酸へ翻訳されないコーディング領域に隣接する５’及び３’配列
を指す（すなわち、５’及び３’非翻訳領域とも呼ぶ）。

【００６７】 ここで開示されているｇ１２Ｌタンパク質をコードするコード鎖配列を考える
と、本発明のアンチセンス核酸は、ワトソン及びクリック、又はフーグスティン
塩基対則に従って設計できる。アンチセンス核酸分子は、ｇ１２Ｌ ｍＲＮＡの
全コーディング領域に対して相補的となることができるが、より好ましいのは、
ｇ１２Ｌ ｍＲＮＡのコーディング又は非コーディング領域の一部のみに対して
アンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌ
クレオチドは、ｇ１２Ｌ ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周辺領域に対して相補的と
なることができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約５，１０、
１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド長である。本発
明のアンチセンス核酸は、当該分野で知られている手法を用いる化学合成又は酵
素ライゲーション反応を利用して構築できる。例えば、アンチセンス核酸（例え
ば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を、分子の生物学的安定性を増す、或い
はアンチセンスとセンス核酸の間に形成される二重鎖の物理的安定性を増すよう
に設計された天然発生ヌクレオチド又は種々の修飾ヌクレオチドを用いて、化学
的に合成することができる（例えば、ホスホロチオネート誘導体とアクリジン置
換ヌクレオチドを用いることができる）。

【００６８】 アンチセンス核酸の生成に利用できる修飾ヌクレオチドの例には、５-フルオ
ロウラシル、５-ブロモウラシル、５-クロロウラシル、５-ヨードウラシル、ヒ
ポキサンチン、キサンチン、４-アセチルシトシン、５-（カルボキシヒドロキシ
メチル）ウラシル、５-カルボキシメチルアミノメチル-２-チオウリジン、５-カ
ルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ-Ｄ-ガラクト
シルキュェオシン、イノシン、Ｎ６-イソペンテニルアデニン、１-メチルグアニ
ン、１-メチルイノシン、２，２-ジメチルグアニン、２-メチルアデニン、２-メ
チルグアニン、３-メチルシトシン、５-メチルシトシン、Ｎ６-アデニン、７-メ
チルグアニン、５-メチルアミノメチルウラシル、５-メトキシアミノメチル-２-
チオウラシル、ベータ-Ｄ-マンノシルキュェオシン、５'-メトキシカルボキシル
メチルウラシル、５-メトキシウラシル、２-メチルチオ-Ｎ６-イソペンテニルア
デニン、ウラシル-５-オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル
、キュェオシン、２-チオシトシン、５-メチル-２-チオウラシル、２-チオウラ
シル、４-チオウラシル、５-メチルウラシル、ウラシル-５-オキシ酢酸メチルエ
ステル、ウラシル-５-オキシ酢酸（ｖ）、５-メチル-２-チオウラシル、３-（３
-アミノ-３-Ｎ-カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６-
ジアミノプリンが含まれる。或いは、核酸をアンチセンス方向にサブクローンし
た発現ベクターを用いて、アンチセンス核酸を生物学的に生成することができる
（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、対象である標的核酸に対
してアンチセンス方向にあり、下記の小節に更に記載されている）。

【００６９】 本発明のアンチセンス核酸分子は、大体において被検体へ投与される、或いは
インサイツで生成され、ｇ１２Ｌタンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡ及び／
又はゲノムＤＮＡとハイブリダイズ又は結合して、それによってタンパク質の発
現を阻害する（例えば、転写及び／又は翻訳を阻害するこよによって）。安定な
二重鎖を形成する相補的な従来型のヌクレオチドによって、或いは、例えばＤＮ
Ａ二重鎖と結合するアンチセンス核酸の場合は、二重らせんの主溝における特異
的相互作用を通して、ハイブリダイゼーションは可能である。本発明のアンチセ
ンス核酸分子の投与経路の例には、組織部位での直接注入が含まれる。或いは、
アンチセンス核酸分子を選択した細胞を標的とするように修飾し、全身投与する
ことができる。例えば、全身投与のためには、選択した細胞の表層上に発現する
レセプター又は抗原と特異的に結合するように、アンチセンス分子を修飾するこ
とができる（例えば、アンチセンス核酸を、細胞表層のレセプター又は抗原と結
合するペプチド又は抗原と結合させる）。また、アンチセンス核酸分子を、ここ
に記載のベクターを用いて、細胞へ送達することができる。十分な核酸分子を実
現するために、アンチセンス核酸分子を強力なｐｏｌII又はｐｏｌIIIプロモー
ターの制御下に配したベクター作成物が好まれる。

【００７０】 更にその他の実施態様では、本発明のアンチセンス核酸分子は、α-アノマー
核酸分子である。α-アノマー核酸分子は、通常のβ-ユニットとは逆で、ストラ
ンドが互いに平行である相補的ＲＮＡと特異的な二重鎖ハイブリッドを形成する
。Gaaultier, ら., 1987. Nucl. Acids Res. 15: 6625-6641を参照せよ。アンチ
センス核酸分子は、同じく２'-ｏ-メチルリボヌクレオチド（例えば、Inoue, ら
. 1987. Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148を参照せよ）、又はキメラＲＮＡ-Ｄ
ＮＡアナログ（Inoue,ら., 1987. FEBS Lett. 215: 327-330）を含むことができ
る。

【００７１】 リボザイム及びＰＮＡ部分 制限のない例として、核酸修飾には、修飾塩基、並びに糖リン酸骨格が修飾又
は誘導された核酸が含まれる。これらの修飾は、それらが、例えば、被検体での
治療的用途においてアンチセンス結合核酸としてとして使用し得るように、修飾
核酸の化学的安定性を増ように少なくとも部分的におこなわれる。

【００７２】 一つの実施態様では、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザ
イムとは、例えばｍＲＮＡのような、相補性領域を有する一本鎖核酸を切断する
ことができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子である。従って、リ
ボザイム（例えば、Haselhoff及びGerlach 1988. Nature 334: 585-591に記載の
ようなハンマーヘッドリボザイム）を、ｇ１２Ｌ ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切
断することに用ることができ、それによってｇ１２Ｌ ｍＲＮＡの翻訳を阻害で
きる。１２Ｌ-コード化核酸に対して特異性を有するリボザイムを、ここで開示
されたｇ１２Ｌ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいて設計することができる
（すなわち、配列番号：１又は３）。例えば、テトラヒメナＬ-１９ ＩＶＳ Ｒ
ＮＡの誘導体は、ｇ１２Ｌ-コード化ｍＲＮＡの切断されるヌクレオチド配列に
対して相補的である活性部位のヌクレオチド配列で構築できる。例えば、Cech,
らへの米国特許第４，９８７，０７１号、及びCech,らへの米国特許第５，１１
６，７４２号を参照せよ。また、ｇ１２Ｌ ｍＲＮＡは、ＲＮＡ分子のプールか
ら特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択するために用いること
ができる。例えば、Bartelら., (1993) Science 261: 1411-1418を参照せよ。

【００７３】 或いは、ｇ１２Ｌ遺伝子発現は、標的細胞のｇ１２Ｌ遺伝子の転写を妨げる三
重らせん構造を形成するよう、ｇ１２Ｌ核酸の制御領域（例えば、ｇ１２Ｌプロ
モーター及び／又はエンハンサー）に対して相補的なヌクレオチド配列を標的化
することによって阻害することができる。Helene, 1991. Anticancer Drug Des.
6: 569-84; Helene, ら. 1992. Ann. N.Y. Acad. Sci. 660: 27-36; Maher, 19
92. Bioassays 14: 807-15を参照のこと。

【００７４】 種々の実施態様では、分子の安定性、ハイブリダイゼーション、又は溶解性を
向上させるために、ｇ１２Ｌ核酸は、塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格を修飾
することができる。例えば、ペプチド核酸を生成するために、核酸のデオキシリ
ボースリン酸骨格を修飾することができる。例えば、Hyrup, ら., 1996. Bioorg
Med Chem 4: 5-23を参照せよ。ここで用いられているように、デオキシリボー
スリン酸骨格がシュードペプチド骨格で置換され、４つの核酸塩基のみが保持さ
れているという点で、「ペプチド核酸」又は「ＰＮＡｓ」という用語は、核酸模
倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）を指す。ＰＮＡｓの天然骨格は、低イオン強度の
下で、ＤＮＡ及びＲＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションが可能であるこ
とが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Hyrup,ら., 1996. 上掲; Perry
-O'Keefe,ら., 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670-14675に記載のよ
うに、標準的固相ペプチド合成プロトコールを用いておこなうことができる。

【００７５】 ｇ１２ＬのＰＮＡｓは、治療的及び診断的用途に用いることができる。例えば
、ＰＮＡｓは、例えば、転写又は翻訳停止、又は複製の阻害を含むことによって
、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンス又は抗遺伝子剤として使用
することができる。また、ｇ１２ＬのＰＮＡｓは、例えば、遺伝子の単一塩基置
換の分析において使用することができる（例えば、ＰＮＡ定方向ＰＣＲクランピ
ング；例えばＳ_１ヌクレアーゼ等、他の酵素との組み合わせで使用される人工制
限酵素として（Hyrup,ら., 1996上掲を参照せよ）；又はＤＮＡ配列及びハイブ
リダイゼーションのためのプローブ又はプライマー（Hyrup,ら., 1996, 上掲；P
erry-O'Keefe, ら., 1996.上掲を参照せよ）。

【００７６】 その他の実施態様では、親油性又は他のヘルパー基をＰＮＡへ結合させること
によって、ＰＮＡ-ＤＮＡキメラの形成によって、或いはリポソーム又は当該分
野で知られている薬物送達の他の技術によって、ｇ１２ＬのＰＮＡｓを、その安
定性又は細胞性取り込みを高めるために修飾することができる。例えば、ｇ１２
ＬのＰＮＡ-ＤＮＡキメラを、ＰＮＡ及びＤＮＡの有利な特性を組み合わせるよ
うに生成することができる。そのようなキメラは、ＰＮＡ部分が高い結合親和性
及び特異性を示す一方で、ＤＮＡ認識酵素（例えば、RNase H及びDNAポリメラー
ゼ）がＤＮＡ部分と相互作用することを可能にする。塩基スタッキング、核酸塩
基間の結合数、及び配向性によって選択されるリンカーの適切な長さを用いて、
ＰＮＡ-ＤＮＡキメラを結合させることができる（Hyrup,ら., 1996.上掲）。Ｐ
ＮＡ-ＤＮＡキメラの合成は、Hyrup,ら., 1996. 上掲及びFinn, ら., 1996. Nuc
l Acids Res 24: 3357-3363に記載されているようにおこなうことができる。例
えば、ＤＮＡ鎖は、標準ホスホラミダイトカップリング化学法を用いて固体支持
体上で合成することができ、修飾ヌクレオシド類似体、例えば５'-（４-メトキ
シトリチル）アミノ-５'-デオキシ-チミジンホスホラミダイトは、ＰＮＡとＤＮ
Ａの５'末端の間で使用することができる。Mag, ら., 1989. Nucl Acid Res 17:
5973-5988を参照せよ。次いで、ＰＮＡモノマーは段階的に連結し、５'ＰＮＡ
部分及び３'ＤＮＡ部分によってキメラ分子を生成する。例えば、Finnら.,上掲
を参照せよ。あるいは、キメラ分子は、５'ＤＮＡ部分及び３'ＰＮＡ部分によっ
て合成できる。例えば、Petersenら., 1975. Bioorg. Med. Chem. Lett. 5: 111
9-11124を参照せよ。

【００７７】 他の実施態様では、オリゴヌクレオチドには、例えば、ペプチド（例えば、イ
ンビトロで宿主細胞のレセプターを標的化）、或いは細胞膜（Letsinger,ら., 1
989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6553-6556；Lemaitreら., 1987. Pro
c. Natl. Acad. Sci. 84: 648-652；ＰＣＴ公報ＷＯ８８／０９８１０を参照せ
よ）又は血液脳関門（例えば，ＰＣＴ公報ＷＯ８９／１０１３４を参照せよ）を
横断する輸送を促進する薬剤などの他の付加的グループが含まれる。加えて、オ
リゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーショントリガー切断剤（Krol,ら.,1988.
BioTechniques 6:958-976）、又は挿入剤（Zon, 1988. Pharm. Res. 5: 539-54
9を参照せよ）によって修飾できる。この最後までに、例えば、ペプチド、ハイ
ブリダイゼーショントリガー架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーショントリガー
切断剤等のその他の分子と、オリゴヌクレオチドは結合し得る。

【００７８】 ｇ１２Ｌポリペプチド 本発明のポリペプチドのポリペプチドには、配列番号：２又は４に示すｇ１２
Ｌポリペプチドのアミノ酸配列を包含するポリペプチドを含む。本発明は、ｇ１
２Ｌ活性及び生理学的機能、又はその機能断片を維持するタンパク質を依然とし
てコードするが、任意の残基が配列番号：２又は４に示すものに対応する残基か
ら変化し得る、突然変異又は変異体タンパク質をも含む。 一般的に、ｇ１２Ｌ-様機能を維持するｇ１２Ｌ変異体には、配列中の特定の
位置の残基が他のアミノ酸によって置換されている任意の変異体が含まれ、そし
て更には、親配列から一つ又は複数の残基を削除する可能性のみならず、親タン
パク質の２残基間に付加的な残基又は複数の残基を挿入する可能性を含む。任意
のアミノ酸置換、挿入、又は欠失は、本発明に含まれる。好ましい状況では、上
記にて定義したように、置換とは保存的置換である。

【００７９】 本発明の一側面は、単離されたｇ１２Ｌタンパク質、及びその生物学的に活性
な部分、又は誘導体、断片、類似体又はそのホモログに関する。さらに示されて
いることは、抗-ｇ１２Ｌ抗体を産生するための免疫原として適したポリペプチ
ド断片である。一実施態様では、標準的なタンパク質精製技術を用いた適切な精
製スキームによって、天然ｇ１２Ｌタンパク質を細胞又は組織ソースから単離す
ることができる。その他の実施態様では、ｇ１２Ｌタンパク質は、組み換えＤＮ
Ａ技術によって生産される。組み換え発現に代わって、ｇ１２Ｌタンパク質又は
ポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を用いて化学的に合成することがで
きる。

【００８０】 「単離された」又は「精製された」ポリペプチド又はタンパク質、或いはその
生物学的に活性な部分には、ｇ１２Ｌタンパク質が誘導された細胞又は組織ソー
スからの細胞性材料又は他の汚染タンパク質が殆ど無い、或いは化学的に合成さ
れた場合には、化学前駆体又は他の化学物質が殆ど無い。「細胞性材料が殆ど無
い」という言葉には、細胞の細胞性成分から単離又は組み換え的に生産されたタ
ンパク質で、その細胞の細胞性成分から分離したタンパク質であるｇ１２Ｌタン
パク質の調整品が含まれる。一実施態様では、「細胞性材料が殆ど無い」という
言葉には、約３０％（乾燥重量で）よりも少ない非ｇ１２Ｌタンパク質（ここで
は、「汚染タンパク質」としても呼ばれている）を有するｇ１２Ｌタンパク質の
調整品が含まれ、より好ましくは約２０％の非ｇ１２Ｌタンパク質より少なく、
さらにより好ましくは約１０％の非ｇ１２Ｌタンパク質より少なく、そして最も
好ましくは約５％の非ｇ１２Ｌタンパク質より少ない。ｇ１２Ｌタンパク質又は
その生物学的に活性な部分が組み換え的に生産された場合、又、それは、好まし
くは殆ど培養培地がない、すなわち、培養培地は、約２０％より少ない、より好
ましくは約１０％より少ない、そして最も好ましくは約５％のｇ１２Ｌタンパク
質調製品の容量より少ない。

【００８１】 「化学前駆体又は他の化学物質が殆ど無い」という言葉には、タンパク質の合
成に関与している化学前駆体又は他の化学物質から分離したタンパク質である、
ｇ１２Ｌタンパク質の調整品が含まれる。一実施態様では、「化学前駆体又は他
の化学物質が殆ど無い」という言葉には、約３０％（乾燥重量による）の化学前
駆体又は非ｇ１２Ｌ化学物質より少ない、より好ましくは約２０％の化学前駆体
又は非ｇ１２Ｌ化学物質より少ない、さらに好ましくは約１０％の化学前駆体又
は非ｇ１２Ｌ化学物質より少ない、そして最も好ましくは約５％の化学前駆体又
は非ｇ１２Ｌ化学物質より少ないｇ１２Ｌタンパク質の調整品が含まれる。 ｇ１２Ｌタンパク質の生物学的に活性な部分には、全長ｇ１２Ｌタンパク質よ
り僅かのアミノ酸を含むｇ１２Ｌタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号
：２又は４に示したアミノ酸配列）に対して十分に相同的、或いはそれから誘導
されたアミノ酸を含むペプチドが含まれ、そしてｇ１２Ｌタンパク質の少なくと
も一つの活性を示す。通常は、生物学的に活性な部分は、ｇ１２Ｌタンパク質の
少なくとも一つの活性を有するドメイン又はモチーフを含む。ｇ１２Ｌタンパク
質の生物学的に活性な部分は、例えば、１０、２５、５０、１００又はより多い
アミノ酸残基長であるポリペプチドであることが可能である。

【００８２】 さらには、タンパク質の他の領域が欠失した他の生物学的に活性な部分は、組
み換え技術によって調製、そして天然ｇ１２Ｌタンパク質の機能活性の一つ又は
複数で評価することができる。 ある実施態様では、ｇ１２Ｌタンパク質は、配列番号：２又は４に示したアミ
ノ酸配列を有する。他の実施態様では、ｇ１２Ｌタンパク質は、配列番号：２又
は４に対して殆ど相同的であり、配列番号：２又は４のタンパク質の機能活性を
保持し、更に下記において詳細に示すように、天然対立遺伝子変異又は突然変異
誘発のために、アミノ酸配列が異なる。従って、その他の実施態様では、ｇ１２
Ｌタンパク質は、配列番号：２又は４のアミノ酸配列に対して、少なくとも約４
５％の相同性のあるアミノ酸配列を含むタンパク質であり、配列番号：２又は４
のｇ１２Ｌタンパク質の機能活性を保持する。

【００８３】 二つ又はそれより多い配列間のホモロジーの決定 二つのアミノ酸配列、又は二つの核酸のパーセントホモロジーを決定するため
に、配列を最適比較を目的として配列させた（例えば、二番目のアミノ又は核酸
配列との最適アラインメントのために、ギャップを一番目のアミノ酸又は核酸配
列へ導入することができる）。対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のア
ミノ酸又はヌクレオチドを、次に比較した。二番目の対応する位置のように、一
番目の配列の位置が同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占められた場合、分子
はその位置で相同的である（すなわち、ここで用いられているように、アミノ酸
又は核酸「ホモロジー」とは、アミノ酸又は核酸「同一性」と同等である）。

【００８４】 核酸配列のホモロジーは、二つの配列間の同一性の程度として決定され得る。
ホモロジーは、例えばＧＣＧプログラムパッケージにおいて提供されているＧＡ
Ｐソフトウエア等の、当該分野で知られているコンピュータープログラムを用い
て決定し得る。Needleman及びWunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48: 443-453を参照
せよ。核酸配列比較のために、次の設定とともにＧＣＧ ＧＡＰソフトウウエア
を用いた： ５．０のＧＡＰクリエーションペナルティー、及び０．３のＧＡＰ
エクステンションペナルティー、前記の類似核酸配列のコード化領域は、配列番
号：１又は３に示したＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード化）部分と、好ましくは少な
くとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％
の程度の同一性を示す。

【００８５】 「配列同一性」という用語は、比較した特定の領域において残基を並列させる
ことを基礎として、二つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の同一性の程
度を指す。「配列同一性のパーセンテージ」という用語は、比較の領域にわたっ
て最適に整列させた二つの配列を比較すること、同一の核酸塩基（例えば、核酸
の場合は、Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ，Ｕ又はＩ）が両配列で生じて一致する位置の数がお
こる位置の数を確定すること、一致した位置の数を比較の領域における位置の総
数によって割ること（すなわちウインドウサイズ）、そして結果を１００倍して
配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。ここで使用されて
いる「殆ど同一」という用語は、ポリヌクレオチドの特徴を示し、そのポリヌク
レオチドは、比較領域にわたって参考の配列と比較し、少なくとも８０パーセン
トの配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、及びしばしば９０
から９５パーセントの配列同一性、より通常には少なくとも９９パーセントの配
列同一性を有する。

【００８６】 キメラ及び融合タンパク質 本発明は、ｇ１２Ｌキメラ又は融合タンパク質をも提供する。ここで用いられ
ているように、ｇ１２Ｌ「キメラタンパク質」又は「融合タンパク質」は、非ｇ
１２Ｌポリペプチドと作用可能に連結しているｇ１２Ｌポリペプチドを含む。「
ｇ１２Ｌポリペプチド」とは、ｇ１２Ｌタンパク質（配列番号：２又は４）に対
応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指し、「非ｇ１２Ｌポリペプチド」
とは、例えばｇ１２Ｌタンパク質とは異なり、同じ又は異なる生物に由来するタ
ンパク質など、ｇ１２Ｌタンパク質とは殆ど相同的ではないタンパク質に対応す
るアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。ｇ１２Ｌ融合タンパク質内では、
ｇ１２Ｌポリペプチドは、ｇ１２Ｌタンパク質のすべて又は一部分に相当するこ
とができる。一実施態様では、ｇ１２Ｌ融合タンパク質は、少なくともｇ１２Ｌ
タンパク質の一つの生物学的に活性な部分を含む。その他の実施態様では、ｇ１
２Ｌ融合タンパク質は、少なくともｇ１２Ｌタンパク質の二つの生物学的に活性
な部分を含む。更にその他の実施態様では、ｇ１２Ｌ融合タンパク質は、少なく
ともｇ１２Ｌタンパク質の三つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質
内では、「作用可能に連結した」という用語は、ｇ１２Ｌポリペプチドと非ｇ１
２Ｌポリペプチドが互いにフレーム単位で融合していることを示すために意図さ
れている。非ｇ１２Ｌポリペプチドは、ｇ１２ＬポリペプチドのＮ末端又はＣ末
端と融合することができる。

【００８７】 一実施態様では、融合タンパク質は、ｇ１２Ｌ配列がＧＳＴ（グルタチオンＳ
-トランスフェラーゼ）配列のＣ末端と融合したＧＳＴ-ｇ１２Ｌ融合タンパク質
である。そのような融合タンパク質は、組み換えｇ１２Ｌポリペプチドの精製を
促進する。 その他の実施態様では、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を
有するｇ１２Ｌタンパク質である。特定の宿主細胞（例えば哺乳動物宿主細胞）
では、ｇ１２Ｌの発現及び／又は分泌は、異種シグナル配列を用いることで増大
する。

【００８８】 さらにその他の実施態様では、融合タンパク質は、ｇ１２Ｌ配列が免疫グロブ
リンタンパク質ファミリーのメンバーから誘導された配列と融合したｇ１２Ｌ免
疫グロブリン融合タンパク質である。本発明のｇ１２Ｌ免疫グロブリン融合タン
パク質を製薬的組成物へ取り込ませ、被検体へ投与してｇ１２Ｌリガンドとｇ１
２Ｌタンパク質の間の相互作用を阻害し、それによってインビボでのｇ１２Ｌ媒
介シグナル伝達機構を抑制することができる。ｇ１２Ｌ免疫グロブリン融合タン
パク質は、ｇ１２Ｌ同系リガンドの生物学的利用能を作用するのに用いることが
できる。ｇ１２Ｌリガンド／ｇ１２Ｌ相互作用の阻害は、細胞生存の調整（例え
ば、促進したり、又は阻害したり）することと同時に増殖性及び分化性疾患の双
方の治療にとって治療的に有用であり得る。さらには、本発明のｇ１２Ｌ免疫グ
ロブリン融合タンパク質は、被検体において抗-ｇ１２Ｌ抗体を産生するため、
ｇ１２Ｌリガンドを精製するための免疫原として、そしてスクリーニングアッセ
イにおいてｇ１２Ｌとｇ１２Ｌリガンドの相互作用を阻害する分子を同定するた
めに使用することができる。

【００８９】 本発明のｇ１２Ｌキメラ又は融合タンパク質は、標準的な組み換えＤＮＡ技術
によって生産することができる。例えば、異なるポリペプチド配列をコードする
ＤＮＡ断片は、例えば、ライゲーションに平滑末端又は付着末端を用いる、適切
な末端を提供するための酵素消化、適切なものとして付着末端の埋め合わせ、望
ましくない結合、及び酵素ライゲーションを避けるためのアルカリフォスファタ
ーゼ処理によって、常套的技術にしたがってフレーム単位でライゲーションされ
る。その他の実施態様では、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡシンセサイザーを含む
常套的な技術によって合成できる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、キメ
ラ遺伝子配列を作成するために、後にアニール化し、再増幅してすることができ
る二つの連続遺伝子の間の相補的オーバーハングを生じるアンカープライマーを
使用しておこなうことができる（Ausubelら.（編）CURRENT PROTOCOLS IN MOLEC
ULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992）。さらには、すでに融合部分をコー
ドしている多くの発現ベクターは、商業的に入手可能である（例えば、ＧＳＴポ
リペプチド）。ｇ１２Ｌコード化核酸は、そのような発現ベクターへクローンす
ることが可能であり、その融合部分はフレーム単位でｇ１２Ｌタンパク質と結合
している。

【００９０】 ｇ１２Ｌアゴニスト及びアンタゴニスト ｇ１２Ｌ活性を増加させる、又は減少させる特性を有する化合物に関する試験
は有用である。活性の増加は、例えば：（１）細胞の遺伝子のコピーを増加又は
減少させることによって（アンプリファイア及びデアンプリファイア）；（２）
ｇ１２Ｌ遺伝子の転写を増加又は減少させることによって（転写上方制御及び下
方制御）；（３）ｇ１２ＬｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を増加又は減少させる
ことによって（翻訳の上方制御及び下方制御）；又は（４）ｇ１２Ｌそのものの
活性を増加又は減少させることによって（アゴニスト及びアンタゴニスト）の種
々の方法で生じ得る。

【００９１】 アンプリファイア及びデアンプリファイアである化合物は、細胞又は生物を化
合物と接触させること、次いでｇ１２Ｌをコードする現存のＤＮＡの量を測定す
ることによって同定し得る（Ausubel, Brentら．1987）。転写の上方制御因子及
び下方制御因子である化合物は、細胞又は生物をその化合物と接触させ、次いで
ｇ１２Ｌをコードする生成されたｍＲＮＡの量を測定することによって同定し得
る（Ausubel, Brentら. 1987）。翻訳の上方制御因子及び下方制御因子である化
合物は、細胞又は生物をその化合物と接触させ、次いで生成したｇ１２Ｌポリペ
プチドの量を測定することによって同定し得る（Ausubel, Brentら. 1987）。ア
ゴニスト又はアンタゴニストである化合物は、細胞又は生物をその化合物と接触
させ、次いでｇ１２Ｌ活性を測定することによって測定される；これもインビボ
でおこなわれる。

【００９２】 また、本発明は、ｇ１２Ｌアゴニスト（すなわち模倣物）又はｇ１２Ｌアンタ
ゴニストのいずれかとして機能するｇ１２Ｌタンパク質の変異体に関する。ｇ１
２Ｌタンパク質の変異体は、突然変異誘発によって生成することができる（例え
ば、ｇ１２Ｌタンパク質の個々の点変異又は切断）。ｇ１２Ｌタンパク質のアゴ
ニストは、殆ど同じ、又はサブセットの、ｇ１２Ｌタンパク質の天然発生型の生
物学的活性を保持する。ｇ１２Ｌタンパク質のアンタゴニストは、例えば、ｇ１
２Ｌタンパク質を含む細胞性シグナリングカスケードの下流又は上流のメンバー
に競合して結合することで、ｇ１２Ｌタンパク質の天然発生型の一つ又は複数の
活性を阻害することができる。従って、特定の生物学的効果は、限定された機能
の変異体の処置によって誘発することができる。一つの実施態様では、タンパク
質の天然発生型の生物学的活性のサブセットを有する変異体で被検体を処置する
ことは、ｇ１２Ｌタンパク質の天然発生型で処置した場合と対比して、被検体に
は僅かの副作用がある。

【００９３】 ｇ１２Ｌアゴニスト（すなわち模倣物）又はｇ１２Ｌアンタゴニストのいずれ
かとして機能するｇ１２Ｌタンパク質の突然変異体は、ｇ１２Ｌタンパク質アゴ
ニスト又はアンタゴニスト活性に関して、ｇ１２Ｌタンパク質の突然変異体（例
えば切断突然変異体）のコンビナトリアル・ライブラリをスクリーニングするこ
とによって同定することができる。一実施態様では、ｇ１２Ｌ変異体の斑入りの
ライブラリは、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発によって作成され
、斑入りの遺伝子ライブラリによってコードされている。ｇ１２Ｌ変異体の多様
化したライブラリは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列へ
酵素的にライゲーションし、縮重な潜在的なｇ１２Ｌ配列の一組が、個々のポリ
ペプチドのように或いは代わって、その中にｇ１２Ｌ配列の一組を含むより大き
な融合タンパク質の一組（例えば、ファージディスプレイのために）のように表
現できる。縮重オリゴヌクレオチド配列から、潜在的ｇ１２Ｌ変異体のライブラ
リを生成することができる種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成は、自
動化ＤＮＡシンセサイザーによっておこなうことができ、次いで合成遺伝子は、
適切な発現ベクターへライゲーションすることができる。縮重な遺伝子の一組の
使用は、一つの混合物において、所望される潜在的ｇ１２Ｌ配列の一組をコード
するすべての配列の供給を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法
は、当該分野において良く知れている。Narang, 1983. Tetrahedron 39: 3; Ita
kura, ら., 1984. Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura, ら., 1984. Scienc
e 198: 1056; Ike, ら., 1983. Nucl. Acids Res. 11:477。

【００９４】 ポリペプチドライブラリ 加えて、ｇ１２Ｌタンパク質コード化配列の断片のライブラリは、ｇ１２Ｌタ
ンパク質の変異体のスクリーニング及び後に続く選択のために、ｇ１２Ｌ断片の
多様化した集団を作成するために使用できる。一実施態様では、ニッキングが分
子辺り約一回のみおこる条件下でｇ１２Ｌコード化配列の二重鎖ＰＣＲ断片をヌ
クレアーゼで処理すること、二重鎖ＤＮＡを変性させること、異なるニック産物
のセンス／アンチセンス対を含むことができる二重鎖ＤＮＡを形成するようにＤ
ＮＡを再生すること、Ｓ_１ヌクレアーゼによる処理によって再形成された二重鎖
から一本鎖部分を取り除くこと、そして結果として生じた断片のライブラリを発
現ベクターへライゲーションすることによって、コード化配列断片のライブラリ
を作成することができる。この方法によると、発現ライブラリは、どれがＮ末端
及びｇ１２Ｌタンパク質の種々の大きさの内部断片をコードするのかを導き出す
ことができる。

【００９５】 点突然変異又は切断によって作られたコンビナトリアル・ライブラリの遺伝子
産物、並びに選択される特性を有する遺伝子産物に関するｃＤＮＡライブラリの
スクリーニングに関して、種々の技術が当該分野で知られている。そのような技
術は、ｇ１２Ｌタンパク質のコンビナトリアル突然変異誘発によって作成された
遺伝子ライブラリの迅速なスクリーニングに適用できる。 ハイスループット分
析を施すことができ、大きな遺伝子ライブラリのスクリーニングのために最も広
く用いられている技術には、通常は遺伝子ライブラリを複製可能な発現ベクター
へクローニングすること、適切な細胞を結果として生じたベクターのライブラリ
で形質転換すること、そして所望する活性を検出することが産物が検出された遺
伝子をコードするベクターの単離を促進することになる条件下で、コンビナトリ
アル遺伝子を発現させることが含まれる。ライブラリの帰納的突然変異の頻度を
高める新しい技術である帰納的アンサンブル突然変異誘発（ＲＥＭ）は、ｇ１２
Ｌ変異体を同定するためにスクリーニングアッセイと組み合わせて用いることが
できる。Arkin及びYourvan, 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815
；Delgrave, ら., 1993. Protein Engineering 6: 327-331を参照せよ。

【００９６】 抗-ｇ１２Ｌ抗体 本発明は、Ｆ_ａｂ又は（Ｆ_ａｂ）_２のような抗体及び抗体断片を含み、これら
は前記抗体の任意のｇ１２Ｌポリペプチドと免疫特異的に結合する。 ここで用いられる「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブ
リン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原と特異的に結合する
（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を指す。そのような抗体には、限定さ
れるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ、一本
鎖、Ｆ_ａｂ、Ｆ_ａｂ’及びＦ_{（ａｂ’）２}断片、そしてＦ_ａｂ発現ライブラリが
含まれる。一般的には、ヒトから得られた抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ
、ＩｇＥ及びＩｇＤクラスの任意のものに関連し、分子に存在する重鎖の性質に
よって互いに異なる。特定のクラスには、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２及び他のようなサ
ブクラスも有する。さらには、ヒトにおいては、軽鎖はカッパ鎖又はラムダ鎖で
あり得る。抗体に関するここでの参考文献には、そのようなクラス、サブクラス
、そしてヒト抗体種の型に関する参考文献が含まれる。

【００９７】 抗原、或いはその一部分又は断片として意図されている本発明の単離されたタ
ンパク質は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体調製に関する標準的な技術
を用いて、免疫特異的に抗原と結合する抗体を生成するための抗原として使用す
ることができる。完全長タンパク質を用いることができる、或いは、代わって、
本発明は、免疫原として用いる抗原の抗原性ペプチド断片を提供する。抗原性ペ
プチド断片は、配列番号：２又は４に示したアミノ酸配列のような、完全長タン
パク質のアミノ酸配列の少なくとも６アミノ酸残基を含み、そのエピトープを含
んでいて、ペプチドに対して産生させた抗体は、完全長タンパク質又はエピトー
プを含む任意の断片と特異的免疫複合体を形成する。好ましくは、抗原性ペプチ
ドは、少なくとも１０アミノ酸残基、又は少なくとも１５アミノ酸残基、又は少
なくとも２０アミノ酸残基、又は少なくとも３０アミノ酸残基を含む。好ましく
は、抗原性ペプチドによって含まれる好ましいエピトープは、表面に位置するタ
ンパク質の領域である；一般的に、これらは親水性領域である。

【００９８】 本発明の特定の実施態様では、抗原性ペプチドによって包含される少なくとも
一つのエピトープは、タンパク質の表面に位置するｇ１２Ｌの領域、例えば親水
性領域である。ｇ１２Ｌタンパク質配列の疎水性分析は、ｇ１２Ｌポリペプチド
のどの領域が特に親水性であり、それ故に抗体産生を標的にするために有用な表
面残基をコードする傾向があるのかを示す。抗体産生を標的するための手段とし
て、親水性及び疎水性の領域を示すハイドロパシープロットは、例えば、フーリ
エ変換を伴う又は伴わないの何れかであるKyte Doolittle又はHopp Woods法を含
む当該分野で良く知られた任意の方法によって作成され得る。例えば、そのすべ
てが参考文献として、ここで取り入れられている、Hopp及びWoods, 1981, Proc.
Nat. Acad. Sci. USA 78: 3824-3828；Kyte及びDoolittle 1982, J. Mol. Biol
. 157: 105-142を参照せよ。抗原タンパク質内の一つ又は複数のドメインに対し
て特異的である抗体、又は誘導体、断片、その類似体又はホモログも、ここで示
されている。

【００９９】 本発明のタンパク質、又はその誘導体、断片、類似体、ホモログ又はオーソロ
グは、これらタンパク質成分と免疫特異的に結合する抗体の生成において、免疫
原として用いられ得る。 当該分野で知られている種々の方法は、本発明のタンパク質、又はその誘導体
、断片、類似体ホモログ又はオーソロガスに対するポリクローナル又はモノクロ
ーナル抗体の産生のために用いられ得る（例えば、参考文献としてここで取り入
れられている、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, 及びLane D, 198
8, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,を参照せ
よ）。これら抗体の幾つかが下記において論じられている。

【０１００】 １．ポリクローナル抗体 ポリクローナル抗体の生産のために、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ
、ヤギ、マウス又は他の哺乳動物）を、天然タンパク質、その合成変異体、又は
前出の誘導体による一回又は複数回の注射によって免疫化してもよい。適切な免
疫原性調製物は、例えば、天然発生免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質に
相当する化学合成ポリペプチド、又は組み換え発現された免疫原性タンパク質を
含むことができる。さらには、タンパク質は、免疫化された哺乳動物にとって免
疫原性であることが知られている第二のタンパク質と結合して得る。キーホール
リンペットヘモシアニンに限定されるものではないが、そのような免疫原性タン
パク質の例としては、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、そして大豆トリ
プシンインヒビターが含まれる。調製物には、さらにアジュバンドを含めること
ができる。種々のアジュバンドには、限定されるものではないが、フロインド（
完全又は不完全）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、表面活性物
質（例えば、リゾレシチン、プルーロニックポリオール（pluronic polyols)、
ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、ジニトロフェノール、等）、カルメ
ット-ゲラン杆菌 (BCG)及びコリネバクテリウム・パルヴム、又は類似の免疫刺
激剤などのヒトに用いることが可能なアジュバンドなどが含まれる。用いること
が可能な更なるアジュバンドの例には、ＭＰＬ-ＴＤＭアジュバンド（モノホス
ホリルリピッドＡ，合成トレハロース，ジコリノミコレート(dicorynomycolate
）が含まれる。

【０１０１】 免疫原性タンパク質に対するポリクローナル抗体は、哺乳動物（例えば血液）
から単離し、例えば、免疫血清のＩｇＧ分画を与えるプロテインＡ又はプロテイ
ンＧを使用したアフィニティークロマトグラフィー等の良く知られた技術によっ
てさらに精製することができる。続いて、又は代わって、求めている免疫グロブ
リンの標的である特異的抗原、又はそのエピトープは、免疫アフィニティークロ
マトグラフィーによって免疫特異的抗体を精製するためのカラム上に固定化して
もよい。免疫グロブリンの精製は、例えば、D. Wilkinson（The Scientist, The
Scienntist, Inc., フィラデルフィア，ペンシルベニア, １４巻, ８号（２０
００年４月１７日）, pp. 25-28によって発行）において論じられている。

【０１０２】 ２．モノクローナル抗体 ここで用いられている「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）又は「モノクローナ
ル抗体組成物」という用語は、独特の軽鎖遺伝子産物、及び独特の重鎖遺伝子産
物からなる抗体分子の一つの分子種のみを含む抗体分子の集団を指す。特に、モ
ノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、個体群のすべての分子におい
て同一である。ＭＡｂｓは、従って、独特の結合親和性によって特徴付けられる
抗原の特定のエピトープとの免疫反応が可能な抗原結合部位を含む。 モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256: 495(1975)に記載
されているようなハイブリドーマ法を使用して調製することができる。ハイブリ
ドーマ法では、マウス、ハムスター、又は他の適切な宿主動物は、免疫剤と特異
的に結合する抗体を生産又は生産することができるリンパ球を誘発する免疫剤に
よって通常は免疫される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化される。

【０１０３】 免疫剤には、通常は、タンパク質抗原、その断片又はその融合タンパク質が含
まれる。一般的には、ヒト起源の細胞が所望される場合は末梢血リンパ球が使用
され、或いは非ヒト哺乳動物ソースが所望される場合は、脾臓細胞又はリンパ節
細胞が使用されるかのいずれかである。次いで、ポリエチレングリコールのよう
な安定な融合剤を使用して、リンパ球を不死化細胞株と融合させてハイブリドー
マ細胞を形成させる［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practi
ce, Academic Press, (1986)pp. 59-103］。不死化細胞株は、哺乳動物細胞、特
にげっ歯類、ウシ及びヒト起源のメラノーマ細胞、を典型的には形質転換する。
通常は、ラット又はマウスメラノーマ細胞株を用いる。ハイブリドーマ細胞を、
好ましくは、非融合、不死化細胞の成長又は生存を阻害する一つ又は複数の基質
を含む、適切な培養培地で培養することができる。例えば、親細胞が酵素ヒポキ
サンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ
）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的には、ヒポキサンチ
ン、アミノプテリン、及びチミジン（「ＨＡＴ培地」）を含み、これら物質はＨ
ＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻害する。

【０１０４】 好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安
定で高いレベルの抗体の発現を支え、そしてＨＡＴ培地のような培地に対して感
度がよい。より好ましい不死化細胞株とは、マウスメラノーマ株であり、例えば
、ソーク研究所細胞ディストリビューションセンター，サンディエゴ，カリフォ
ルニア、及びアメリカン タイプカルチャー コレクション，マナサス，バージニ
アから得ることができる。ヒトメラノーマ及びマウス-ヒトヘテロメラノーマ細
胞株も、ヒトモノクローナル抗体の生産のために記載されている［Kozbor, J. I
mmunol., 133: 3001(1984)；Brodeurら., Monoclonal Antibody Production Tec
hniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987)pp.51-63
］。

【０１０５】 次いで、抗原に対するモノクローナル抗体の存在に関して、ハイブリドーマ細
胞を培養する培養培地をアッセイすることができる。好ましくは、ハイブリドー
マ細胞によって生産されたモノクローナル抗体の結合特異性は、ラジオイムノア
ッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）のような免疫沈降
によって、又はインビトロ結合アッセイによって決定することができる。このよ
うな技術及びアッセイは、当該分野で知られている。モノクローナル抗体の結合
親和性は、例えば、Munson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220(1980)のスキ
ャッチャード分析によって決定することができる。それは、標的抗原に対して高
い特異性と高い結合親和性を有する抗体を同定するために、客観的であり、モノ
クローナル抗体の治療的用途において特に重要である。

【０１０６】 所望するハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限界希釈法でサブクロ
ーンすることができ、標準的な方法で生育させることができる（Goding, 1986）
。この目的のための適切な培養培地には、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地
及びＲＰＭＩ-１６４０培地が含まれる。或いは、ハイブリドーマ細胞を、イン
ビボを哺乳動物の腹水として、その中で生育させることができる。 サブクローンによって分泌するモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ
-セファロース、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、
透析、又はアフィニテークロマトグラフィーなどの常套的な免疫グロブリン精製
方法によって、培養培地又は腹水液から単離又は精製することができる。

【０１０７】 また、モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号に記載された
ような組み換えＤＮＡ法によって作成することができる。本発明のモノクローナ
ル抗体をコードするＤＮＡは、常套的方法（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖
をコードする遺伝子と特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプロー
ブを使用することによって）を用いて容易に単離及び並列決定することができる
。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましいソースとしての
役割を果たす。一度単離されると、このＤＮＡは発現ベクターへ配されることが
可能であり、次いで、このベクターを、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハム
スター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は別の方法では免疫グロブリンタンパク質を生産
しないメラノーマ細胞のような宿主細胞へ形質移入し、組み換え宿主細胞でのモ
ノクローナル抗体の合成を得ることができる。また、例えば、相同的なマウス配
列をヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列で置き換えることによって（
米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison, Nature 368, 812-13(1994)）、或
いは免疫グロブリンコード化配列へ非免疫グロブリンポリペプチドの全て又は一
部分を共有結合させることによって、ＤＮＡも修飾することができる。このよう
な非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインによって置換
されることができる、或いは本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメイン
によって置換されてキメラ二価抗体を生成することができる。

【０１０８】 ３．ヒト化抗体 本発明のタンパク質抗原に対する抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含
むことができる。投与された免疫グロブリンに対してヒトによって引き起こされ
た免疫応答がなく、これら抗体はヒトへの投与に関して適している。抗体のヒト
化形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片（例えば，Ｆ
ｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２又は抗体の他の抗原結合配列）で、主に
ヒト免疫グロブリンの配列で構成され、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最
小限の配列を含む。ヒト化は、Winte及び共同研究者の方法（Jonesら., Nature,
321: 522-525(1986)；Riechmannら., Nature, 332: 323-327(1988)；Verhoeyen
ら., Science, 239: 1534-1536(1988)）に従って、げっ歯類のＣＤＲ又はＣＤＲ
配列をヒト抗体に対応する配列で置換することによっておこなうことができる（
また、米国特許第５，２２５，５３９号を参照せよ）。幾つかの例では、ヒト免
疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換さ
れる。また、ヒト化抗体は、受容抗体或いは移入ＣＤＲ又はフレームワーク配列
のどちらにも見出されない残基を含むことができる。一般的には、ヒト化抗体は
、すべて又は殆どすべての非ヒト免疫グロブリンに対応するＣＤＲ領域、及びフ
レームワーク領域のすべて又は殆どすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配
列である、少なくとも一つの殆どすべて、及び通常は二つの可変領域を含む。ま
た、ヒト化抗体は、最適には、少なくとも免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の一
部分、通常はそれのヒト免疫グロブリンを含む（Jonesら., 1986 Riechmannら.,
1988；Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596(1992)）。

【０１０９】 ４．ヒト抗体 完全なヒト抗体は、ＣＤＲを含む、軽鎖及び重鎖の双方の全配列がヒト遺伝子
から生じる、抗体分子に基本的に関連している。このような抗体は、「ヒト抗体
」又は「完全ヒト抗体」とここで呼ばれている。ヒトモノクローナル抗体は、ト
リオマ（trioma）技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら., 1983 Immu
nol Today 4: 72）、並びにヒトモノクローナル抗体を生産させるためのＥＢＶ
ハイブリドーマ技術（Cole,ら., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER
THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）によって調製することができる。ヒ
トモノクローナル抗体は、本発明の実践することで用いられ得るし、ヒトハイブ
リドーマを使用すること（Coteら., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2
030）、或いはヒトＢ細胞をエプスタイン・バーウイルスで形質転換することによ
って生産され得る（Coleら., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THE
RAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）。

【０１１０】 加えて、ヒト抗体も、ファージディスプレイライブラリを含む付加的な技術を
使用して生産することができる（Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:
381(1991)；Marksら., J. Mol. Biol. 222: 581(1991)）。同様に、ヒト抗体は
、例えば内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されたマウス
のように、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物へ導入するこ
とによって作り出すことができる。この試みでは、ヒト抗体生産が観察され、そ
れは、遺伝子再構成、構築、そして抗体レパートリーを含む、すべての面でヒト
に見られることに極めて類似する。この方法は、例えば、米国特許第５，５４５
，８０７号；５，５４５，８０６号；５，５６９，８２５号；５，６２５，１２
６号；５，６３３，４２５号；５，６６１，０１６号，及びMarksら.（Bio/Tech
nology 10, 779-783(1992)）；Lonbergら. (Nature 368 856-859(1994)）；Morr
ison(Nature 368, 812-13(1994))；Fishwildら, (Nature Biotechnology 14, 84
5-51(1996))；Neuberger(Nature Biotechnology 14, 826(1996))；及びLonberg
及びHusza(Intern. Rev. Immunol. 13 65-93(1995))に記載されている。

【０１１１】 抗原の挑戦に対する応答による動物の内因性抗体よりも完全なヒト抗体を生産
するために、改良したトランスジェニック非ヒト動物を使用して、ヒト抗体を付
加的に生産してもよい（ＰＣＴ公報ＷＯ９４／０２６０２を参照せよ）。非ヒト
宿主の重鎖及び軽鎖免疫グロブリンをコードする内因性遺伝子は能力が失われて
おり、ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリンをコードする活性遺伝子座は、宿主ゲノ
ムへ挿入されている。例えば、必須のヒトＤＮＡセグメントを含む酵母人工染色
体を用いて、ヒト遺伝子は取り込まれる。すべての所望される修飾を提供する動
物は、次いで、修飾物のすべての相補鎖より少数を含む中間トランスジェニック
動物を交雑育種することによって子孫として得られる。このような非ヒト動物の
好ましい実施態様はマウスであり、ＰＣＴ公報ＷＯ９６／３３７３５及びＷＯ９
６／３４０９６に開示されているようにXenomouse（商品名）と名付けられてい
る。この動物は、完全なヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を生産する。抗体
は、例えば、ポリクローナル抗体の調製のように、対象である免疫原で免疫化し
た後で動物から直接に得るか、或いはそれに代わって、ハイブリドーマ産生モノ
クローナル抗体のように、動物に由来する不死化Ｂ細胞から得ることができる。
加えて、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子を、回収して
直接に抗体を得るために発現させることが可能であり、或いはさらに修飾して、
例えば一本鎖Ｆｖ分子のような抗体の類似体を得ることが可能である。

【０１１２】 マウスで実証された、内因性の免疫グロブリン重鎖の発現を欠く非ヒト宿主を
生産する方法の例は、米国特許第５，９３９，５９８号に開示されている。それ
は、胚幹細胞の少なくとも一つの内因性重鎖遺伝子座からＪセグメント遺伝子を
欠失させてその遺伝子座の再編成を防ぎ、そして再編成した免疫グロブリン重鎖
遺伝子座の転写物の形成を防ぎ、その欠失が、選択可能なマーカーをコードして
いる遺伝子を含むベクターを標的とすることによって作用されること；並びに体
細胞及び生殖細胞から選択可能なマーカーをコードする遺伝子を含むトランスジ
ェニックマウスを生産させることを含む方法によって得ることができる。

【０１１３】 ヒト抗体のような対象である抗体を生産させる方法が、米国特許第５，９１６
，７７１号に開示されている。それには、重鎖をコードするヌクレオチド配列を
含む発現ベクターを培養液のある哺乳動物宿主細胞に導入すること、軽鎖をコー
ドするヌクレオチド配列を含む発現ベクターをその他の哺乳動物宿主細胞へ導入
すること、そして二つの細胞を融合させてハイブリッド細胞を形成させることが
含まれている。このハイブリッド細胞は、重鎖及び軽鎖を含む抗体を発現する。 この方法の更なる改良では、免疫原上の臨床学的に関連するエピトープを同定
する方法、そして高い親和性によって関連するエピトープと免疫特異的に結合す
る抗体を選択する相関関係のある方法が、ＰＣＴ公報ＷＯ９９／５３０４９に開
示されている。

【０１１４】 ５．Ｆ_ａｂ断片及び一本鎖抗体 本発明によると、本発明の抗原性タンパク質に対して特異的な一本鎖抗体の生
産へ、技術を適用することができる（米国特許第４，９４６，７７８号）。加え
て、タンパク質又は誘導体、断片、類似体又はそのホモログに対する所望される
特異性を有するモノクローナル抗体Ｆ_ａｂ断片の迅速で効果的な同定を可能にす
るために、Ｆ_ａｂ発現ライブラリの構築（例えば、Huse,ら., 1989 Science 246
: 1275-1281）へ方法を適用することができる。タンパク質抗原に対するイディ
オタイプを含む抗体断片は、限定されるものではないが：（i）抗体分子のペプ
シン消化によって生産されたＦ_{（ａｂ’）２}断片；（ii）Ｆ_{（ａｂ’）２}断片の
ジスルフィド架橋を減らすことによって生成されたＦ_ａｂ断片；（iii）パパイ
ン及び還元剤での抗体分子の処理によって生成されたＦ_ａｂ、そして（iv）Ｆ_ｖ 断片を含む当該分野で知られている技術によって生産され得る。

【０１１５】 ６．二重特異性抗体 二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する
モノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合
においては、結合特異性の一方は本発明の抗原特性タンパク質に対してである。
第二の結合標的は任意の他の抗原であり、そして有利には、細胞表面タンパク質
又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。 二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的に
は、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免
疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく（Milstein及びCuello, Nature,
305:537-539 (1983)）。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため
、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合
物を生成し、その内の一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の
精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様
の手順が１９９３年５月１３日公開のＷＯ９３／０８８２９、及びTrauneckerら
, EMBO J.,10:3655-3659 (1991)に開示されている。

【０１１６】 所望の結合特異性(抗体−抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロ
ブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部
、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのもの
である。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常
領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードする
ＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入
し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更な
る詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を
参照されたい。

【０１１７】 ＷＯ９６／２７０１１に記載された他の方法によれば、一対の抗体分子間の界
面を操作して組換え細胞培養から回収される異種二量体の割合を最大にすること
ができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む
。この方法では、第１抗体分子の界面からの１つ又は複数の小さいアミノ酸側鎖
がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大き
な側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖
を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗
体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産
物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。

【０１１８】 二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ(ａｂ’)_２二重特異性
抗体）として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文
献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製するこ
とができる。Brennanら, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分
解性に切断してＦ(ａｂ’)_２断片を産生する手順を記述している。これらの断片
は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオール
を安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ’断片は
ついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ’-ＴＮＢ
誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’-チオー
ルに再転換し、他のＦａｂ’-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗
体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使
用することができる。

【０１１９】 大腸菌からＦａｂ’フラグメントを直接回収でき、これは化学的に結合して二
重特異性抗体を形成することができる。Shalabyら, J. Exp. Med., 175:217-225
(1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ’)_２分子の製造を記述し
ている。各Ｆａｂ’フラグメントは大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定
方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二
重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細
胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解
活性の誘因となる。

【０１２０】 組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法
もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して
生産されている。Kostelnyら, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及
びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの
異なった抗体のＦａｂ’部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還
元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。こ
の方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollinge
rら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイ
アボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断
片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカ
ーにより軽鎖可変ドメイン(Ｖ_Ｌ)に重鎖可変ドメイン(Ｖ_Ｈ)を結合してなる。従
って、一つの断片のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインは他の断片の相補的Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈドメ
インと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓ
Ｆｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告
されている。Gruberら, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。

【０１２１】 二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することがで
きる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。 例示的な二重特異性抗体は、ここに与えられたＰＲＯポリペプチドの２つの異
なるエピトープに結合しうる。あるいは、抗-ＰＲＯポリペプチドのアームは、
特定のＰＲＯポリペプチド発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、
Ｔ細胞レセプター分子(例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、又はＢ７)等の白血球
上のトリガー分子又はＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦｃ
γＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対するＦｃレセプターに結合する
アームと結合しうる。また、二重特異性抗体は特定のＰＲＯポリペプチドを発現
する細胞に細胞毒性薬を局在化させるためにも使用されうる。これらの抗体はＰ
ＲＯ結合アーム及び細胞毒性薬又は放射性キレート化剤、例えばＥＯＴＵＢＥ、
ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、又はＴＥＴＡと結合するアームを有する。興味の対象とな
る他の二重特異性抗体はＰＲＯポリペプチドに結合し、そしてさらに組織因子（
ＴＦ）に結合する。

【０１２２】 ７．ヘテロコンジュゲート抗体 ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロ抱合抗体は、２
つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要
な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第４，６７６，９８０号］
及びＨＩＶ感染の治療のために［ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７
３；ＥＰ０３０８９］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含
む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製すること
ができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエ
ーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的
に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチ
リミデート、及び例えば米国特許第４，６７６，９８０号に開示されたものが含
まれる。

【０１２３】 ８．エフェクター機能の加工 本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌治療における抗体
の有効性を向上させることが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導
入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよ
い。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上した内部移行能力及び／
又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を
有する可能性がある。Caronら, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShope
s, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を
持つ同種二量体抗体は、Wolffら, Cancer research 53: 2560-2565 (1993)に記
載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体
は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ
能力を向上させることもできる。Stevensonら, Anti-Cancer Drug Design 3: 21
9-230 (1989)参照。

【０１２４】 ９．免疫複合体 また、本発明は、化学治療薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来
の酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞毒性薬、あるいは放射性同位体（即
ち、放射性抱合）と抱合している抗体を含む免疫複合体に関する。 このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬を上に記載した。用いること
のできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非
結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデ
クシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleuri
tes fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメ
リカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡ
Ｐ-Ｓ）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、ク
ルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonari
a oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レ
ストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(e
nomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。放射性抱合抗体の生成に
は、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、^２１２Ｂｉ、^{１ ３１} Ｉ、^１３１Ｉｎ、^９０Ｙ及び^１８６Ｒｅが含まれる。

【０１２５】 抗体及び細胞毒性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、
例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオネート（Ｓ
ＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチ
ルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等
）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジ
ドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジ
アゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２
，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-
２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は
、Vitettaら, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製すること
ができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチ
レントリアミン五酢酸（ＭＸ-ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱
合のためのキレート剤の例である。ＷＯ９４／１１０２６参照。

【０１２６】 他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター
」（ストレプトアビジン等）に抱合されてもよく、抗体-レセプター複合体は患
者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細
胞毒性薬（例えば、放射性ヌクレオチド等）に抱合された「リガンド」（アビジ
ン等）を投与する。

【０１２７】 １０．免疫リポソーム また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を
含むリポソームは、Epsteinら, Proc. Natl. acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985)
；Hwangら, Proc. natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第４
，４８５，０４５号及び第４，５４４，５４５号に記載されたような、この分野
で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許
第５，０１３，５５６号に開示されている。 特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ
-誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ-ＰＥ）を含む脂質組成物での逆
相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して
押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ
’断片は、Martinら, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているよ
うに、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療薬（
ドキソルビシン等）は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizonら,
J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。

【０１２８】 １１．本発明のタンパク質に対する抗体の診断的用途 本発明のタンパク質に対する抗体は、このタンパク質の局在化及び／又は定量
化に関する当該分野で知られた方法によって使用される（例えば、適切な生理学
的試料内のこのタンパク質のレベルの測定における使用、診断方法での使用、タ
ンパク質のイメージングでの使用等）。所定の実施態様では、抗原結合ドメイン
を含有するタンパク質に対する抗体、又はその誘導体、断片、類似体又はホモロ
グを、薬理学的活性な化合物として使用した（下記を参照）。

【０１２９】 本発明のタンパク質に対する特異的な抗体は、免疫親和性クロマトグラフィー
又は免疫沈降のような標準的技術によってタンパク質を単離することに使用でき
る。そのような抗体は、宿主細胞で発現した細胞の天然タンパク質抗原及び組み
換えによって生産された抗原の精製を容易にする。さらには、抗原タンパク質の
発現の豊富さ及びパターンを評価するために、抗原性タンパク質（例えば、細胞
性可溶化液又は細胞上清）を検出するために使用することができる。タンパク質
に対する抗体は、例えば、所定の治療法の効力を決定するための臨床試験法の一
部として、組織におけるタンパク質レベルをモニターするために診断で用いるこ
とができる。抗体と検出可能な基質をカップリング（すなわち、物理的な結合）
させることによって、検出は促進される。検出可能な基質の例には、種々の酵素
、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、及び放射性物質が含まれる
。適切な酵素の例には、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ、β-ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ、適切な
補欠分子族複合体には、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチン
が含まれる；適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フ
ルオレセイン イソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジアミン フル
オレセイン、ダンジル クロライド又はフィコエリトリン；発光物質の例にはル
ミノールが含まれる；生物発光物質の例には、ルシフェリン、及びエクオリン、
並びに適切な放射活性物質の例には、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓ又は^３Ｈが含
まれる。

【０１３０】 １２．抗体療法 ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化及び完全ヒト抗体を含む本発明の抗
体は、治療薬として使用され得る。このような薬剤は、一般的に、被検体の疾患
又は病理を治療又は予防するために用いられる。抗体製剤、好ましくは標的抗原
に対して高い特異性と高い親和性を有する抗体の調製は、一般的に、その標的と
の結合に起因する効果を有する。所定の抗体分子と該当する標的間の相互作用の
特異的な性質によって、このような効果は、二種類のうちの一つであり得る。最
初の例では、抗体の投与は、自然に結合する標的と内因性リガンドの結合を抑止
又は阻害し得る。この場合には、抗体は標的と結合し、天然に発生するリガンド
の結合部位を遮蔽し、そのリガンドはエフェクター分子として機能する。従って
、レセプターは、リガンドが引き起こすシグナル伝達機構経路を媒介する。

【０１３１】 或いは、この効果は、標的分子上のエフェクター結合部位と結合することによ
って、抗体が誘発する生理学的結果の一つである得る。この場合、疾患又は病態
がない又は欠失しているであろう内因性リガンドを有するレセプターは、代理エ
フェクターリガンドとして抗体と結合し、レセプターによるレセプターを基礎と
するシグナル伝達機構を開始する。

【０１３２】 本発明の治療的に有効量の抗体は、一般的に、治療的目的を達成するのに必要
な量に関連する。上記において記載のように、これは抗体とその標的抗原との結
合相互作用である可能性があり、ある場合には標的の機能と妨害し、他の場合は
生理学的応答を促進する。投与に必要な量は、さらに、特異的抗原に対する抗体
の結合親和性に依存し、さらに投与された抗体が、抗体が投与される他の被検体
の空隙率から枯渇する速度に依存する。本発明の抗体又は抗体断片の治療的有効
量に関する通常範囲は、限定されない例によって、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重量か
ら約５０ｍｇ／ｋｇ体重量である。例えば、通常投与頻度は、１日２回から１週
間に１回の範囲である。

【０１３３】 １３．抗体の製薬的組成物 ここで開示したスクリーニングアッセイによって同定した他の分子と同様に、
本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体は、製薬的組成物の形態で種々の疾
患の治療のために投与できる。成分の選択ガイダンスと同様に、このような組成
物を調製することに関与する原理及び検討材料は、例えばRemingtonに示されて
いる：The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed.(Alfonso R. Gennaro,
ら., 編者) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995; Drug Absorption Enhancement
: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Pub
lishers, Langhorne, Pa., 1994; 及びPeptide And Protein Drug Delivery(Adv
ances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New York．

【０１３４】 抗原性タンパク質が細胞内であり、すべての抗体が阻害剤として使用されるな
らば、内在化する抗体が好まれる。しかしながら、リポソームも抗体、又は抗体
断片を細胞へ送達することに使用することができる。抗体断片が使用される場合
、標的タンパク質の結合ドメインと特異的に結合する最も小さな阻害性断片が好
まれる。例えば、抗体の可変領域配列に基づき、標的タンパク質配列と結合する
能力を保持するように、ペプチド分子を設計することができる。このようはペプ
チドは、化学的に合成及び／又は組み換えＤＮＡ技術によって生産することがで
きる。例えば、Marascoら., Proc., Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893(199
3)を参照せよ。また、ここでの製剤形態は、治療される特定の徴候のために必要
な複数の活性化合物を含み、好ましくは互いに逆作用しない相補的な活性を含む
。或いは、又は加えて、組成物は、例えば細胞毒性剤、サイトカイン、化学療法
剤、又は成長阻害剤のような機能を高める薬剤を含むことができる。そのような
分子は、目的とする意図に対して効果的な量の組み合わせで適当に存在する。

【０１３５】 また、活性成分を、例えばコアセルベーション技術により、又は界面重合によ
り調製されたマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラ
チン-マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、
コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマル
ション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括す
ることができる。 インビボ投与に使用される製剤は無菌であることが大いに好まれる。これは、
滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。

【０１３６】 徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体
疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、
例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例は
、ポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレー
ト)又はポリ(ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第3,773,919号）
、Ｌ-グルタミン酸及びγ-エチル-Ｌ-グルタメート、非分解性エチレン-酢酸ビ
ニル、LUPRON DEPOT(商品名)（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロ
リドの注射可能な小球）などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-(Ｄ)
-(-)-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール
酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種の
ヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。

【０１３７】 ｇ１２Ｌ組み換え発現ベクター及び宿主細胞 本発明のその他の側面はベクター、好ましくは、ｇ１２Ｌタンパク質をコード
する核酸、又はその誘導体、断片、類似体又はホモログを含む発現ベクターであ
る。ここで使用されているように、「ベクター」という用語は、その他の核酸を
、それが連結している場所へ輸送することのできる核酸を指す。一つのタイプの
ベクターは「プラスミド」であり、付加的なＤＮＡセグメントをライゲーション
することができる環状二重鎖ＤＮＡループを指す。その他の型のベクターはウイ
ルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムへライゲーシ
ョンすることができる。所定のベクターは、それらが導入された宿主内において
自己複製することができる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクター、
及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳
動物ベクター）は、宿主細胞への導入によって宿主細胞のゲノムと一体化し、宿
主ゲノムに沿って複製する。さらには、所定のベクターは、それらが作用可能に
連結している遺伝子の発現を方向づける。このようなベクターは、ここでは、「
発現ベクター」と呼ばれている。一般的に、組み換えＤＮＡ技術での発現ベクタ
ーの用途は、しばしばプラスミドの形をとる。本明細書では、プラスミドが最も
広く使用されているベクターの形態であるので、「プラスミド」及び「ベクター
」は相互交換可能に使用することができる。しかしながら、本発明は、同等の機
能を果たす、ウイルスベクター（例えば、複製を欠いたレトロウイルス、アデノ
ウイルス及びアデノ関連ウイルス）のような他の形態の発現ベクターを含むよう
に意図されている。

【０１３８】 本発明の組み換え発現ベクターには、宿主細胞での核酸の発現に適した形態の
本発明の核酸が含まれ、この組み換え発現ベクターには、発現される核酸配列と
作用可能に連結していて、発現に使用される宿主細胞を基礎として選択される複
数の制御配列が含まれる。組み換え発現ベクターでは、「作用可能に連結し」と
は、対象であるヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現が可能となるよう
な様式で制御配列と連結していることを意味する（例えば、ベクターが宿主細胞
へ導入された場合のインビトロ転写／翻訳系、又は宿主細胞）。

【０１３９】 「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御エ
レメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むように意図されている。こ
のような制御配列は、例えば、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS
IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されて
いる。制御配列には、多くの型の宿主細胞でヌクレオチド配列の構成的発現を指
示し、所定の宿主細胞のみでヌクレオチド配列を指示する制御配列が含まれる（
例えば、組織特異的制御配列）。発現ベクターの設計が、形質転換されるべき宿
主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現レベル等のようなファクターに依存
することができることが当該分野に熟練している者によって認識されている。本
発明の発現ベクターは、従って、ここで記載されているような核酸によってコー
ドされた融合タンパク質又はペプチドを含むタンパク質又はペプチドを生産する
ために宿主細胞へ導入することができる（例えば、ｇ１２Ｌタンパク質、ｇ１２
Ｌタンパク質の変異体型、融合タンパク質等）。

【０１４０】 本発明の組み換え発現ベクターは、原核生物又は真核生物でのｇ１２Lタンパ
ク質の発現のために設計することができる。例えば、ｇ１２Lタンパク質は、大
腸菌のような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用して）
、酵母細胞又は哺乳動物細胞で発現することができる。適切な宿主細胞は、さら
にGoeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academ
ic Press, San Diego, Calif.(1990)。或いは、組み換え発現はベクターは、例
えばＴ７プロモーター制御配列及びＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転
写し翻訳することができる。

【０１４１】 原核生物でのタンパク質の発現は、融合又は非融合タンパク質の何れかの発現
を指示する構成性又は誘導性プロモーターを含有するベクターによって大腸菌で
最も頻繁におこなわれる。融合ベクターは、通常は組み換えタンパク質のアミノ
末端であるが、その中でコードされているタンパク質へ多くのアミノ酸を加える
。このような融合ベクターは、通常は三つの目的を担う：（i）組み換えタンパ
ク質の発現を高める；（ii）組み換えタンパク質の溶解性を高める；（iii）リ
ガンドとして作用することによって、組み換えタンパク質の精製をアフィニティ
精製において補助する。しばしば、融合発現ベクターにおいて、融合部分と組み
換えタンパク質の接合部にタンパク質加水分解部位を導入し、融合タンパク質の
精製の後で融合部分から組み換えタンパク質を分離できるようにする。このよう
な酵素、及びこれら同系の認識配列には、因子Ｘａ、トロンビン及びエンテロキ
ナーゼが含まれる。典型的な融合発現ベクターには、標的組み換えタンパク質へ
グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質
、又はプロテインＡのそれぞれが融合したｐＧＥＸ（Pharmacia Biotech Inc; S
mith 及びJohnson, 1988. Gene 67: 31-40），ｐＭＡＬ（New England Biolabs,
Beverly, Mass.）及びｐＲＩＴ５(Pharmacia, Piscataway, N.J.）が含まれる
。

【０１４２】 適切な誘導可能な非融合大腸菌発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Amrannら.,
(1988)Gene 69: 301-315）及びｐＥＴ１１ｄ（Studierら., GENE EXPRESSION TE
CHNOLOGY: METHOD IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1
990) 60-89）。 大腸菌での組み換えタンパク質発現を最大限にする一つの方法は、組み換えタ
ンパク質をタンパク質加水分解する能力正常に有しない宿主細菌内でタンパク質
を発現させることである。例えば、Gottesman, GENE EXPRESSION TECHOLOGY: ME
THODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif (1990) 119-128
を参照せよ。その他の戦略としては、発現ベクターに挿入されるべき核酸の核酸
配列を改良し、各アミノ酸の個々のコドンが好ましく大腸菌で利用されるように
することである（例えば、Wadaら., 1992. Nucl. Acids Res. 20: 2111-21118を
参照せよ）。そのような本発明の核酸配列の改良は、標準的なＤＮＡ合成技術に
よっておこなうことができる。

【０１４３】 その他の実施例では、ｇ１２Ｌ発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母
サッカロマイセス・セレビシエでの発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐ
Ｓｅｃ１（Baldari, ら., 1987. EMBO J. 6: 229-234）、ｐＭＦａ（Kurjan及び
Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943）、ｐＪＲＹ８８（Schultzら., 1987. Ge
ne 54: 113-123），ｐＹＥＳ２（Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.
），及びｐｉｃＺ（In Vitrogen Corp, San Diego, Calif）が含まれる。

【０１４４】 或いは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて、ｇ１２Ｌを昆虫細胞で発現
させることができる。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）でのタンパク質の発
現に役立つバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Smith, ら., 1983
. Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165）及びｐＶＬシリーズ（Lucklow及びSummers,
1989. Virology 170: 31-39）。 さらにその他の実施態様では、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを用い
て哺乳動物細胞で発現させることができる。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐ
ＣＤＭ８（Seed, 1987. Nature 329: 840）及びｐＭＴ２ＰＣ（Kaufman, ら., 1
987. EMBO J. 6: 187-195）が含まれる。哺乳動物細胞で使用された場合、発現
ベクターコントロール機能は、しばしばウイルス制御エレメントによって提供さ
れる。例えば、広く使われているプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス
２、サイトメガロウイルス、及びシミアン・ウイルス４０から誘導される。原核
生物と真核生物細胞の双方にとって適切な発現系については、例えばSambrook,
ら., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 第２版., Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.
Y., 1989の第１６章及び１７章を参照せよ。

【０１４５】 その他の実施態様では、組み換え哺乳動物発現ベクターは、好ましくは特定の
細胞型での核酸の発現を指示することができる（例えば、組織特異的制御エレメ
ントが核酸の発現に用いられる）。組織特異的制御エレメントは、当該分野にお
いて知られている。適切な組織特異的プロモーターの限定されない例には、アル
ブミンプロモーター（肝臓特異的；Pinkert, ら., 1987. Genes Dev. 1: 268-27
7）、リンパ球特異的プロモーター（Calame及びEaton, 1988. Adv. Immunol. 43
: 235-275）、Ｔ細胞レセプター（Winoto及びBaltimore, 89 EMBO J. 8: 729-73
3)及び免疫グロブリン（Banerji, ら., 1983. Cell 33: 729-740; Queen及びBal
timore, 1983. Cell 33: 741-748）の特定なプロモーター、神経細胞特異的プロ
モーター（例えば、神経細線維プロモーター；Byrne及びRuddle, 1989. Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477）、膵臓特異的プロモーター（Edlund,ら.,
1985. Science 230: 912-916）及び乳腺特異的プロモーター（例えば、乳漿プ
ロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号及び欧州出願公開第２６４，１６
６号）が含まれる。また、発生的に制御されたプロモーター、例えばマウスhox
プロモーター（Kessel及びGruss, 1990. Science 249: 374-379）及びα-胎児タ
ンパク質プロモーター（Campes及びTilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546）
が含まれる。

【０１４６】 さらに、本発明は、アンチセンスの方向で発現ベクターにクローンニングされ
た本発明のＤＮＡ分子を含む組み換え発現ベクターを提供する。すなわち、ＤＮ
Ａ分子は、ｇ１２ＬｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（Ｄ
ＮＡ分子の転写によって）を可能にするほどに制御配列と作用可能に連結してい
る。アンチセンス方向でクローン化された核酸と作用可能に連結している制御因
子、例えばウイルスプロモーター及び／又はエンハンサーを、種々の細胞型のア
ンチセンスＲＮＡ分子の連続発現を指示する点から選択することができ、或いは
制御配列は、アンチセンスＲＮＡの構成性、組織特異的又は細胞型特異的発現を
指示するという点から選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、高
効率の制御領域のコントロールの下でアンチセンス核酸が生産され、その活性が
ベクターが導入されている細胞型によって決定することができる、組み換えプラ
スミド、ファージミド又弱毒化ウイルスであることが可能である。アンチセンス
遺伝子を用いる遺伝子発現の制御に関する議論については、例えば、Weintraub
ら., 「遺伝子分析のための分子ツールとしてのアンチセンスＲＮＡ」Reviiews-
Trends in Genetics, 第１巻（１）１９８６を参照せよ。

【０１４７】 本発明のその他の側面は、本発明の組み換え発現ベクターが導入された宿主細
胞に関する。「宿主細胞」及び「組み換え宿主細胞」は、ここでは相互交換が可
能に使用されている。このような用語は、特定の被検細胞にだけでなく、そのよ
うな細胞の子孫又は潜在的な子孫をも指すことが知られている。変異又は環境の
影響の何れかに起因して所定の修飾が次世代に起こり得るために、そのような子
孫は、実際には親細胞とは同一ではあり得ないが、ここで使用されている用語の
範囲内に含まれる。 宿主細胞は、任意の原核細胞又は真核細胞である可能性がある。例えば、ｇ１
２Ｌタンパク質は、大腸菌のような細菌細胞、酵母又は哺乳動物細胞（例えば、
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はＣＯＳ細胞）で発現させること
が可能である。他の適切な宿主細胞が、当該分野に熟練した者に知られている。

【０１４８】 常套的な形質転換又は形質導入技術によって、ベクターＤＮＡを原核生物又は
真核生物細胞へ導入することができる。ここで使用されているように、「形質転
換」及び「形質導入」という用語は、リン酸カルシュウム又は塩化カルシュウム
共沈殿、ＤＥＡＥ-デキストラン媒介形質導入、リポフェクション、又はエレク
トロポレーションを含む、宿主細胞へ外来核酸（例えばＤＮＡ）を導入するため
の種々の当該分野で認識された技術を指すことを意図している。宿主細胞を形質
転換又は形質導入するのに適した方法は、Sambrookら（Molecular Cloning：A L
aboratory Manual. 第２版., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York
1989）及び研究室マニュアルに見出すことができる。

【０１４９】 哺乳動物細胞の安定な形質導入のためには、用いられる発現ベクター及び形質
導入技術に依存するが、細胞の小さな分画のみが外来ＤＮＡをそれらのゲノムへ
一体化させ得る。これら成分を同定して選択するためには、一般的には、選択可
能なマーカー（例えば、抗体に対する耐性）を対象としている遺伝子とともに宿
主細胞へ導入する。種々の選択可能なマーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシ
ン及びメトトレキサートのような薬剤に対する耐性を付与するものが含まれる。
選択可能なマーカーをコードする核酸を、ｇ１２Ｌをコードするような宿主細胞
の同じベクター上へ導入する、又は宿主細胞とは別に存在するベクターへ導入す
ることができる。導入された核酸で安定に形質導入された細胞は、薬剤選択によ
って同定することができる（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を取り込ませた
細胞は生存し、一方で他の細胞は死滅する）。

【０１５０】 培養中の原核生物又は真核生物宿主細胞のような、本発明の宿主細胞を、ｇ１
２Ｌタンパク質の生産（すなわち発現）のために使用することができる。従って
、本発明は、本発明の宿主細胞を使用してｇ１２Ｌタンパク質を生産するための
方法を提供する。一実施態様では、この方法は、本発明の宿主細胞（ｇ１２Ｌタ
ンパク質をコードする組み換え発現ベクターが導入されている）を適切な培地で
培養してｇ１２Ｌタンパク質を生産させるを含む。その他の実施態様では、この
方法は、さらに培地又は宿主細胞からｇ１２Ｌタンパク質を単離することを含む
。

【０１５１】 トラスジェニックｇ１２Ｌ動物 また、本発明の宿主細胞は、非ヒトトランスジェニック動物を生産するために
使用できる。例えば、一実施態様では、本発明の宿主細胞は授精卵母細胞、又は
ｇ１２Lタンパク質コード化配列が導入された胚幹細胞である。このような宿主
細胞は、次いで、外来性ｇ１２L配列がゲノムに導入されている、或いは内在性
ｇ１２L配列が改変された相同組み換え動物である非ヒトトランスジェニック動
物を作製するために用いることができる。このような動物は、ｇ１２Lタンパク
質の機能及び／又は活性、並びにｇ１２Lタンパク質活性のモジュレーターを同
定及び／又は評価するのに有用である。ここで使用されているように、「トラン
スジェニック動物」とは、非ヒト動物、好ましくは動物、より好ましくはラット
又はマウスのようなゲッ歯類であって、その動物の一つ又は複数の細胞は導入遺
伝子を含む。トランスジェニック動物の他の例には、非ヒト霊長類、羊、犬、牛
、ヤギ、ニワトリ、両生類等が含まれる。導入遺伝子とは、トランスジェニック
動物が発生した細胞のゲノムへ一体化して、成熟動物のゲノムにとどまっている
外来性ＤＮＡであり、一つ又は複数の細胞型又はトランスジェニック動物の組織
でのコードされた遺伝子産物の発現を指示する。ここで使用されているように、
「相同組み換え動物」とは非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物、より好まし
くはマウスであって、動物の発生の前に、その内在性ｇ１２Ｌ遺伝子は、例えば
動物の胚幹性細胞などの動物の細胞へ導入された外来性ＤＮＡ分子と内在性遺伝
子との間の相同組み換えによって改変されている。

【０１５２】 本発明のトランスジェニック動物は、ｇ１２Ｌコード化核酸を授精卵母細胞の
雄性前核に導入し（例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染）
、卵母細胞を偽妊娠雌養育動物で発育するさせることによって作製できる。配列
番号：１のヒトｇ１２ＬｃＤＮＡ配列は、導入遺伝子として非ヒト動物のゲノム
へ導入することができる。或いは、マウスｇ１２Ｌ遺伝子（配列番号：３）のよ
うなヒトｇ１２Ｌ遺伝子の非ヒトホモログは、導入遺伝子として使用することが
できる。また、イントロン性配列及びポリアデニル化シグナルは、導入遺伝子の
発現の効率を高めるために、導入遺伝子へ含めることができる。組織特異的制御
配列は、特定の細胞へｇ１２Ｌタンパク質の発現を指示するために、ｇ１２Ｌ導
入遺伝子と作用可能に連結させることができる。特に、マウスのような動物で、
胚操作及びマイクロインジェクションを介してトランスジェニック動物を作製す
る方法は、当該分野において常套手段となっており、例えば、米国特許第４，７
３６，８６６号；４，８７０，００９；及び４，８７３，１９１；並びにHogan,
1986. In: MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載されている。同様な方法を他のトラン
スジェニック動物の生産に使用する。トランスジェニック創始動物は、そのゲノ
ムでのｇ１２Ｌ導入遺伝子の存在、及び／又は動物の組織又は細胞でのｇ１２Ｌ
ｍＲＮＡの発現に基づいて同定できる。トランスジェニック創始動物は、次いで
導入遺伝子を有する付加的な動物を生育させるために使用できる。さらには、導
入遺伝子コード化ｇ１２Ｌタンパク質を有する導入遺伝子動物は、さらに、他の
導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物を生育することができる。

【０１５３】 相同組み換え動物を作製するためには、欠失、付加又は置換がｇ１２Ｌ遺伝子
を改変、例えば機能的に崩壊させるように導入された、少なくともｇ１２Ｌ遺伝
子の一部分を含むベクターを調製する。ｇ１２Ｌ遺伝子はヒト遺伝子（例えば，
配列番号：１のｃＤＮＡ）であることが可能であるが、より好ましくはヒトｇ１
２Ｌ遺伝子の非ヒトホモログである。例えば、マウスホモログ（配列番号：３）
は、マウスゲノムでの内在性ｇ１２Ｌ遺伝子を改変するのに適切な相同組み換え
ベクターを構築するために使用できる。一つの実施態様では、ベクターは相同組
み換えによって設計され、内在性ｇ１２Ｌ遺伝子は機能的に破壊されている（す
なわち、もはや機能性タンパク質をコードしない；また「ノックアウト」ベクタ
ーと呼ばれている）。

【０１５４】 或いは、ベクターは相同組み換えによって設計されることができ、内因性ｇ１
２Ｌ遺伝子は変異を受け、さもなければ改変されているが、機能性タンパク質を
コードしたままである（例えば、上流制御領域は改変され、それによって内因性
ｇ１２Ｌタンパク質の発現が改良されている）。相同組み換えベクターでは、ｇ
１２Ｌ遺伝子の改変部分は、ベクターが有する外来性ｇ１２Ｌ遺伝子と胚幹細胞
の内在性ｇ１２Ｌ遺伝子の間で相同組み換えが可能となるよう、ｇ１２Ｌ遺伝子
の付加的な核酸によってその５'-及び３'-末端で隣接している。付加的な隣接ｇ
１２Ｌ核酸は、内因性遺伝子との相同組み換えが成功するのに十分な長さである
。典型的には、数キロベースの隣接ＤＮＡ（５'-及び３'-末端）がベクターに含
まれる。例えば、Thomasら., 1987. Cell 51: 503を相同組み換えベクターの説
明として参照せよ。このベクターは、胚幹性細胞株へ１０が導入され（例えば、
エレクトロポレーションによって）、導入されたｇ１２Ｌ遺伝子が内因性ｇ１２
Ｌ遺伝子と相同的に組み換えられている細胞が選択される。Li, ら., 1992. Cel
l 69: 915を参照せよ。

【０１５５】 次いで、選択された細胞を動物（例えばマウス）の胚盤胞に注入し、凝集キメ
ラを形成する。例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells
: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 11
3-152を参照せよ。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、出
産させた。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は、導入遺伝子の
生殖系伝達によって、動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を
繁殖させることができる。相同組み換えベクター及び相同組み換え動物を構築す
る方法は、さらに、Bradley, 1991. Curr. Opin. Biotechnol. 2: 823-829；PCT
国際公開第ＷＯ９０／１１３５４；ＷＯ９１／０１１４０；ＷＯ９２／０９６８
；及びＷＯ９３／０４１６９に記載されている。

【０１５６】 その他の実施態様では、トランスジェニック非ヒト動物を、導入遺伝子の制御
発現が可能となるような選択系を含むように生産させることができる。そのよう
な一例は、バクテリオファージＰ１のcre/loxPリコンビナーゼ系である。バクテ
リオファージＰ１のcre/loxPリコンビナーゼ系の説明については、例えば、Laks
o., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236を参照せよ。リコンビナ
ーゼ系のその他の例としては、サッカロマイセス・セレビシエのＦＬＰリコンビ
ナーゼ系がある。O'Gorman, ら., 1991. Science 251: 1351-1355を参照せよ。
cre/loxPリコンビナーゼ系が導入遺伝子の発現を制御するために使用される場合
、Creリコンビナーゼと選択されたタンパク質の双方をコードする導入遺伝子を
含有する動物が必要とされる。そのような動物は、例えば、選択されたタンパク
質をコードする導入遺伝子を含有するトランスジェニック動物と、リコンビナー
ゼをコードする導入遺伝子を含有する他のトランスジェニック動物を交配させる
ことによる、「二重」トランスジェニッ動物の構築を介して提供することができ
る。

【０１５７】 ここで記載されている非ヒトトランスジェニック動物のクローンは、Wilmut,
ら., 1997. Nature 385：810-813に記載されている方法に従っても生産できる。
要約すると、トランスジェニック動物の細胞（例えば、体細胞）を単離し、成長
周期から抜け出て、Ｇ_０期に入るように誘導することができる。次に、例えば、
電気パルスの使用を介して、静止細胞が単離された同種の動物の卵母細胞を除核
することで、静止細胞を融合することができる。次に、再構築した卵母細胞を培
養して、桑実胚又は未分化胚芽細胞に発育させ、次に偽妊娠雌乳母動物へ移植す
る。この雌乳母動物の生まれた子孫は、細胞（例えば、体細胞）が単離された動
物のクローンである。

【０１５８】 製薬的組成物 本発明のｇ１２Ｌ核酸分子、ｇ１２Ｌタンパク質、及び抗-ｇ１２Ｌ抗体（ま
た、ここでは「活性化合物」と呼ぶ）、並びに誘導体、断片、その類似体及びホ
モログは、投与に適した薬学的組成物に取り入れることができる。そのような組
成物は、典型的には、核酸分子、タンパク質、又は抗体及び薬学的に許容可能な
担体を含む。ここで使用されているように、「薬学的に許容可能な担体」には、
薬学的な投与と合致するどんなすべての溶剤、分散媒、被膜剤、抗細菌及び抗真
菌剤、等張及び吸収遅延剤等を含むように意図されている。適切な担体は、この
分野で標準的な参考文献である、ここで参考文献としても取り入れられている最
新版のRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。そのような担
体又は希釈剤の好ましい例としては、限定されるものではないが、水、生理的食
塩水、フィンガース溶液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが
含まれる。リポソームと不揮発性油のような非水溶性溶媒も使用してもよい。そ
のような媒体と薬剤を薬学的に活性な物質としての使用は、当該分野で良く知ら
れている。何れの常套的培地又は薬剤が活性化合物と相容れない範囲にあること
を除いて、組成物におけるその用途が考慮される。補助的な活性化合物も組成物
へ取り込ませることができる。

【０１５９】 本発明の薬学的組成物は、その意図された投与経路と両立するように定式化さ
れている。投与経路の例には、非経口、例えば静脈注射、皮内、皮下、経口（例
えば吸入）、経皮（すなわち、局所的）、経粘膜、そして直腸投与が含まれる。
非経口、皮内、又は皮下用途に使用される溶液又は懸濁液には、次の成分を含め
ることができる：注射のための水のような無菌希釈液、生理的食塩水、不揮発性
油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成
溶剤；ベンジルアルコール又はメチルパラバンのような抗細菌薬剤、アスコルビ
ン酸又は亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）のようなキレート剤、酢酸塩、クエン酸又はリン酸のようなバッファー
、そして塩化ナトリウム又はデキストロースのような弾力性を調製する薬剤。ｐ
Ｈは、塩酸又は水酸化ナトリウムのような酸又は塩基によって調整できる。非経
口調製物は、ガラス又はプラスチックで作られたアンプル、使い捨て注射器又は
複数回投与バイアルに入れることができる。

【０１６０】 注射の用途に適した薬学的な組成物には、及び無菌注射用溶液又は分散物の即
席調製のための無菌水溶液（水溶性）又は分散物、及び無菌パウダーが含まれる
。静脈投与のためには、適切な担体には、生理学的食塩水、静菌性水、Cremopho
r EL（商品名）（ＢＡＳＦ，Parsippany, N.J.）又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ
）が含まれる。すべての場合、その組成物は無菌であり、容易に注射器を通過で
きるほどの流動性を有するべきである。それは、製造と貯蔵の条件下で安定であ
るべきであり、細菌及び真菌のような微生物の汚染作用から守られなければなら
ない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プ
ロピレン、グリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びその適切な
混合を含む溶媒又は分散媒培地であってよい。適切な流動性は、例えばレシチン
のような被覆剤の使用によって、分散の際に必要とされる粒子の維持によって、
そして界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の活動の防止は
、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロ
サール等の種々の抗細菌及び抗真菌剤によって達成することができる。多くの場
合、例えば、糖、組成物にマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムなどを
含むポリアルコールの等張剤を含むことが好ましい。注入した組成物の長期吸収
は、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンのような吸収を遅らせる
薬剤を組成物に含めることによって生じせしめることができる。

【０１６１】 無菌の注射用溶液は、適当な溶媒中の必修量の活性化合物（例えば、ｇ１２Ｌ
タンパク質又は抗-ｇ１２Ｌ抗体）へ必修である上記に列挙されている成分の一
つ又は組み合わせを加えることによって調製できる。一般的には、分散液は、基
礎的な分散培地及び必修である上記に列挙した他の成分を含む無菌溶媒へ、活性
化合物を加えることで調製される。無菌の注射用溶液の調製のための無菌パウダ
ーの場合には、調製の方法とは、前もって無菌濾過された溶液の任意の付加的な
所望の成分が加わった活性成分が加わった活性成分のパウダーを、真空乾燥及び
凍結乾燥することである。

【０１６２】 経口組成物には、一般的に、不活性な希釈液又は食用担体が含まれる。それら
は、ゼラチンカプセルに入れる又は錠剤に圧縮することができる。経口治療投与
の目的のためには、活性化合物を、賦形剤に加え、錠剤、トローチ、又はカプセ
ルの形態で使用することが可能である。また、経口組成物は、うがい薬としての
用途のために、液体担体を使用して調製することができ、その液体担体中の化合
物は経口的に適用され、ヒュッと音をたて、そして痰で吐かれる又は飲み込まれ
る。製薬的に適合する結合剤、及び／又はアジュバンド物質は、組成物の一部分
として含めることができる。錠剤、ピル、カプセル、トローチ等は、次の成分の
何れか、又は類似の性質の化合物を含むことができる：結合剤、例えば微結晶性
セルロース、トラガカント又はゼラチン；賦形剤、例えば澱粉又はラクトース、
崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲル、又はトウモロコシ澱粉；滑沢剤、例え
ばステアリン酸マグネシウム、又はステロテス；流動促進剤、例えばコロイド状
二酸化ケイ素；甘味剤、例えばシュークロース又はサッカリン；又は香料添加剤
、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジ香料。

【０１６３】 吸入による投与のためには、化合物は、例えば二酸化炭素のようなガスである
適切な噴霧剤を含む圧力容器又はディスペンサーの噴霧器スプレー、又は噴霧器
の形態から送達される。 また、全身投与は、経粘膜又は経皮的手法による。経粘膜又は経皮的投与のた
めには、浸透されるべきバリヤーに対する適切な浸透剤が製剤として用いられる
。そのような浸透剤には、一般的に当該分野で知られており、例えば経粘膜投与
のために、界面活性剤、胆汁酸、及びフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与
は、鼻内噴霧又は座薬の使用を介して達成される。経皮的投与のためには、活性
化合物が、当該分野で知られているような軟膏剤、軟膏、ゲル、又はクリームへ
製剤化される。

【０１６４】 化合物は、直腸送達のための座薬（例えば、ココアバター及び他のグリセリド
のような簡便な基礎座薬とともに）又は保持浣腸剤の形態で調製することもでき
る。 一実地態様では、活性化合物は、移植片及びマイクロカプセル送達システムを
含む放出制御型製剤のような、体内からの迅速な放出に対する化合物を保護する
担体とともに調製される。エチレン酢酸ビニール、ポリ無水物、ポリグリコール
酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの生分解性、生体適合
性ポリマーを使用することができる。このような製剤の調製方法は、当該分野に
熟練者にとって明かである。その材料は、Alza Corporation及びNova Pharmaceu
ticals, Incから商業的に得ることができる。リポソーム懸濁（ウイルス抗原に
対するモノクローナル抗体とともに感染細胞を標的としたリポソームを含む）も
製薬的に許容される担体として使用される。これらは、例えば、米国特許第４，
５２２，８１１号に示されているような当該分野に熟練した者に知られた方法に
よって調製することができる。

【０１６５】 投与の容易さと服用量の均一性のために、経口又は非経口組成物を服用量単位
の形態で製剤化することは特に有益である。ここで使用されている服用量単位と
は、治療すべき被検体のための単位服用量として適した物理的に別々の単位；必
修の製薬的担体と関連する所望される治療効果を生産するために計算された、活
性な化合物の予定量を含有する各単位を指す。本発明の服用量単位形態に関する
明細書は、活性化合物の独特の特徴、及び達成されるべき特定の治療的効果、そ
して個体の治療のためのそのような活性化合物を混合する当該分野に固有の限界
によって指示され、直接に依存している。

【０１６６】 本発明の核酸分子は、ベクターに挿入して、遺伝子治療ベクターとして使用す
ることができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈注射、局所投与（例えば
、米国特許第５，３２８，４７０号を参照せよ）によって、又は定位注射（例え
ば、Chenら., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054-3057を参照せよ）
によって被検体へ送達することができる。遺伝子治療ベクターの製薬的な調製方
法には、許容可能な希釈剤中の遺伝子ベクター、又は遺伝子送達媒体が内臓され
たマトリックスの緩やかな遊離が含まれことが可能である。 あるいは、例えばレトロウイルスのような、完全な遺伝子送達ベクターを組み
換え細胞から無傷で生産することができ、製薬的調製物には、遺伝子送達系を生
産する一つ又は複数の細胞が含まれることが可能である。 製薬的組成物は、投与に関する指示書とともに、容器、パック、又はディスペ
ンサーに含めることができる。

【０１６７】 スクリーニング及び検出方法 本発明の単離された核酸分子は、ｇ１２Ｌタンパク質を発現させるために（例
えば、遺伝子治療用途における、宿主細胞での組み換え発現ベクターを介して）
、ｇ１２ＬｍＲＮＡ（例えば、生物学的試料）又はｇ１２Ｌ遺伝子の遺伝的損傷
を検出するために、そしてｇ１２Ｌ活性を調節するために、さらに下記に示して
いるように使用することができる。さらには、ｇ１２Ｌタンパク質は、ｇ１２Ｌ
タンパク質の不十分又は過度の生産、ｇ１２Ｌ野生型タンパク質と比較して減少
した又は異常な活性を有するｇ１２Ｌタンパク質形態の生産によって特徴付けら
れる疾患（例えば；肥満及び肥満関連障害、糖尿病、及び悪液質等の代謝障害及
び疾患；過形成、癌、及び再狭窄のような細胞増殖障害及び疾患；アルツハイマ
ー病及びパーキンソン病のような神経変性障害及び疾患；ＡＩＤＳ、炎症、及び
自己免疫疾患のような免疫障害及び疾患；ＳＣＩＤ、周期性好中球減少症、及び
血小板血症のような造血性障害及び疾患）を治療すると同様に、ｇ１２Ｌタンパ
ク質活性又は発現を調節するための薬剤又は化合物をスクリーニングするために
使用することができる。加えて、本発明の抗-ｇ１２Ｌ抗体は、ｇ１２Ｌタンパ
ク質及び検出し単離、そしてｇ１２Ｌ活性を調節するために使用することができ
る。 本発明は更に、ここで記載されているスクリーニングアッセイによって同定さ
れる新規薬剤、そして上掲に記載したような治療に関するその用途に関する。

【０１６８】 スクリーニングアッセイ 本発明は、モジュレーター、すなわち、ｇ１２Ｌタンパク質と結合する、又は
、例えばｇ１２Ｌタンパク質発現又はｇ１２Ｌタンパク質活性に対して刺激性又
は阻害性効果を有する候補又は被験化合物、又は薬剤（例えば、ペプチド、ペプ
チド模倣物、小分子又は他の薬剤）を同定する方法（ここで「スクリーニングア
ッセイ」としても呼ばれている）を提供する。また、本発明には、ここで記載さ
れているスクリーニングアッセイで同定された化合物を含む。 一実施態様では、本発明は、ｇ１２Ｌタンパク質又はポリペプチド、又はその
生物学的に活性な部分の膜結合形態の活性を調節又は結合する候補又は被験化合
物をスクリーニングするアッセイを提供する。本発明の被験化合物は、当該分野
で知られているコンビナトリアルライブラリ法の多くの手法の何れかを用いて得
ることができ、それらには含まれているのは：生物学的ライブラリ；空間的位置
決定可能な並列固相又は水溶液相ライブラリ；デコンヴォルーションを必要とす
る合成ライブラリ法；「１ビーズ、１化合物」ライブラリ法；そしてアフィニテ
ィークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリ法である。生物学的ライブ
ラリ手法はペプチドライブラリに限定され、一方では、他の４つの手法は、ペプ
チド、非ペプチドオリゴマー、又は化合物の小分子ライブラリに応用可能である
。例えば、Lam, 1997. Anticancer Drug Design 12: 145を参照せよ。

【０１６９】 ここで使用されている「小分子」とは、約５ｋＤより少なく、最も好ましくは
約４ｋＤより少ない分子量を有する組成物を指すことを意味している。小分子と
は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質
又は他の有機又は無機分子であることが可能である。真菌、細菌、又は藻類抽出
物のような化学及び／又は生物学的混合物のライブラリは当該分野で知られてお
り、本発明のアッセイの何れかによってスクリーニングされることが可能である
。 分子ライブラリの合成のための方法の例は、当該分野で見出されることが可能
であり、例えば、DeWitt, ら., 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 690
9；Erb,ら., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 11422；Zuckermann,ら
., 1994. J. Med. Chem. 37: 2678；Cho,ら., 1993. Science 261: 1303；Carre
ll,ら., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059；Carell,ら., 1994. An
gew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061；及びGallop,ら., 1994. J. Med. Chem.
37: 1233。

【０１７０】 化合物のライブラリは溶液（例えば、Houghten, 1992. Biotechniques 13: 41
2-421），又はビーズ（Lam, 1991. Nature 354: 82-84），チップ（Fodor, 1993
. Nature 364: 555-556），細菌（Ladner, 米国特許第５，２２３，４０９号）
，胞子（Ladner, 米国特許第５，２３３，４０９号），プラスミド（Cull,ら.,
1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869）又はファージ（Scott及びS
mith, 1990. Science 249: 386-390；Devlin, 1990. Science 249: 404-406；Cw
irla,ら., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 6378-6382；Felici, 199
1. J. Mol. Biol. 222: 301-310；Ladner, 米国特許第５，２３３，４０９号）
に表示され得る。

【０１７１】 一実施態様では、アッセイは細胞ベースアッセイであり、それは細胞表面でｇ
１２Ｌタンパク質の膜結合形態、又はその生物学的活性部分を発現する細胞を被
験化合物と接触させ、被験化合物のｇ１２Ｌタンパク質との結合の能力を測定す
ることである。例えば、細胞は、哺乳動物起源又は酵母細胞とすることができる
。ｇ１２Ｌタンパク質と結合する被験化合物の能力を測定することは、例えば、
被験化合物を放射性同位元素又は酵素標識とカップリングさせ、被験化合物のｇ
１２Ｌタンパク質又はその生物学的に活性な部分との結合が、複合体中の標識化
合物を検出することによる測定によって完遂できる。例えば、被験化合物は、^{１ ２５} Ｉ，^３５Ｓ，^１４Ｃ，^３Ｈによって直接又は間接的に標識することができ、
放射性同位元素は、放射発光の直接計測によって、又はシンチレーション計測に
よって検出することができる。あるいは、被験化合物は、例えば西洋わさびパル
オキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、又はルシェフェラーゼで酵素的に標
識でき、酵素標識は、適切な基質の産物への変換の測定によって検出できる。一
実施態様では、このアッセイは、ｇ１２Ｌタンパク質の膜結合形態を発現する細
胞、又はその生物学的活性部分を、ｇ１２Ｌに結合してアッセイ混合物を形成す
る既知の化合物とともに細胞表面に接触させ、このアッセイ混合物を被験化合物
と接触させ、そしてｇ１２Ｌタンパク質と相互作用する被験化合物の能力を測定
することを含む。ｇ１２Ｌタンパク質相互作用する被験化合物の能力を測定する
ことは、この被験化合物が、既知の化合物と比較して、優先的にｇ１２Ｌタンパ
ク質、又はその生物学的に活性な部分と結合する能力を測定するを含む。

【０１７２】 その他の実施態様では、アッセイは、細胞表面で被験化合物とｇ１２Ｌタンパ
ク質の膜結合形態を発現する細胞、又はその生物学的活性部分と接触させ、ｇ１
２Ｌタンパク質又はその生物学的活性部分の活性を調節する（例えば、刺激又は
阻害）被験化合物の能力を測定することである。ｇ１２Ｌタンパク質又はその生
物学的活性部分の活性を調節する被験化合物の能力を測定することは、例えば、
ｇ１２Ｌ標的分子と結合又は相互作用するｇ１２Ｌタンパク質の能力を測定する
ことによって達成できる。ここで使用されているように、「標的分子」とは、天
然において、ｇ１２Ｌタンパク質が結合又は相互作用する分子である。ｇ１２Ｌ
標的分子は、非ｇ１２Ｌ分子、又は本発明のｇ１２Ｌタンパク質又はポリペプチ
ドである。一実施態様では、ｇ１２Ｌ標的分子は、細胞膜を介して及び細胞への
細胞外シグナル（例えば、膜結合ｇ１２Ｌ分子との化合物の結合によって生じる
シグナル）の伝達を促進するシグナル伝達経路の成分である。例えば、標的は、
触媒活性を有する第２細胞間タンパク質、又は下流のシグナリング分子とｇ１２
Ｌの結合を促進するタンパク質である。

【０１７３】 ｇ１２Ｌ標的分子と結合又は相互作用するｇ１２Ｌタンパク質の能力を測定す
ることは、直接結合の測定することに関して上に記載した一つの方法によって完
遂することができる。一実施態様では、ｇ１２Ｌ標的分子と結合又は相互作用す
るｇ１２Ｌタンパク質の能力を測定することは、標的分子の活性を測定すること
によって完遂できる。例えば、標的分子の活性は、標的の細胞性セカンドメッセ
ンジャー（すなわち、細胞内Ｃａ^２＋，ジアシルグリセロール，ＩＰ_３，等）の
誘導を検出すること、標的の適切な基質の触媒／酵素活性を検出すること、レポ
ーター遺伝子（例えば、ルシェフェラーゼなどの検出可能なマーカーをコードす
る核酸と作用可能に連結しているｇ１２Ｌ応答性制御エレメントを含む）の誘導
の検出、又は細胞応答、例えば細胞生存、細胞性分化、又は細胞増殖を検出する
ことによって測定できる。

【０１７４】 さらにその他の実施態様では、本発明のアッセイは、ｇ１２Ｌタンパク質又は
その生物学的活性な部分を被験化合物と接触させること、そしてｇ１２Ｌタンパ
ク質又はその生物学的活性な部分と結合する被験化合物の能力を測定することを
含む無細胞アッセイである。ｇ１２Ｌタンパク質と被験化合物の結合は、上に記
載のように直接又は間接の何れかで測定することができる。一つのそのような実
施態様では、このアッセイは、ｇ１２Ｌタンパク質又はその生物学的に活性な部
分を、ｇ１２Ｌと結合してアッセイ混合物を形成する既知の化合物と接触させる
こと、アッセイ混合物と被験化合物を接触させること、そしてｇ１２Ｌタンパク
質と相互作用する被験化合物の能力を測定することを含み、ｇ１２Ｌタンパク質
と相互作用する被験化合物の能力は、既知の化合物と比較して、被験化合物が優
先的にｇ１２Ｌ又はその生物学的活性部分と結合する能力を測定することが含ま
れる。

【０１７５】 さらにその他の実施態様では、アッセイは無細胞アッセイであって、ｇ１２Ｌ
タンパク質又はその生物学的活性部分と被験化合物を接触させること、そしてｇ
１２Ｌタンパク質又はその生物学的活性部分の活性を調節する（例えば、刺激又
は阻害）被験化合物の能力を測定することを含む。ｇ１２Ｌの活性を調節する被
験化合物の能力を測定することは、例えば、直接結合を測定することに関して上
に記載した一つの方法によって、ｇ１２Ｌ標的分子と結合するｇ１２Ｌタンパク
質の能力を測定することによって達成できる。代わりの実施態様では、ｇ１２Ｌ
タンパク質の活性を調節する被験化合物の能力を測定することは、ｇ１２Ｌ標的
分子をさらに調節するｇ１２Ｌタンパク質の能力を測定することによって達成す
ることができる。例えば、適切な基質に対する標的分子の触媒／酵素活性は、上
掲に記載のように測定することができる。

【０１７６】 さらにその他の実施態様では、無細胞アッセイは、ｇ１２Ｌタンパク質又はそ
の生物学的に活性な部分を、ｇ１２Ｌタンパク質と結合してアッセイ混合物を形
成する既知の化合物と接触させ、このアッセイ混合物を被験化合物と接触させ、
そしてｇ１２Ｌタンパク質と相互作用する被験化合物の能力を測定することを含
み、ｇ１２Ｌタンパク質と相互作用する被験化合物の能力を測定することは、ｇ
１２Ｌ標的分子と優先的に結合、又はその活性を調節するｇ１２Ｌタンパク質の
能力を測定することを含む。

【０１７７】 本発明の無細胞アッセイは、ｇ１２Ｌタンパク質の可溶形態又は膜結合形態の
双方の用途の影響を受けやすい。ｇ１２Ｌタンパク質の膜結合形態を含む無細胞
アッセイの場合には、可溶化剤を用いることが望ましく、ｇ１２Ｌタンパク質の
膜結合形態は溶液中に維持される。そのような可溶化剤の例には、非イオン界面
活性剤、例えばｎ−オクチルグルコシド、ｎ-ドデシルグルコシド、ｎ-ドデシル
マルトシド、オクタノイル-Ｎ-メチルグルカミド、Triton（登録商標）X-100、T
riton（登録商標）X-114、Thesit（登録商標）、イソトリデシポリ（エチレング
リコールエーテル）_ｎ、Ｎ-ドデシル-Ｎ，Ｎ-ジメチル-３-アンモニオ-１-プロ
パンスルフォン酸、３-（３-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ)-1-プロパ
ンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、又は３-（３-コラミドプロピル)ジメチルアンモ
ニオ)-２-ヒドロキシ-１-プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）が含まれる。

【０１７８】 本発明の上記のアッセイ方法の複数の実施態様では、アッセイの自動化を施す
のと同じく、一つ又は双方のタンパク質の非複合形態から複合物の分離を促進す
るためにｇ１２Ｌタンパク質又はその標的分子の何れかを固定化することは望ま
しい。ｇ１２Ｌタンパク質との被験化合物の結合、又は候補化合物の存在及び非
存在下でのｇ１２Ｌタンパク質と標的分子の相互作用は、反応物を含有するのに
適した任意の容器で達成することができる。そのような容器の例としては、マイ
クロタイタープレート、試験管、そしてマイクロ遠心分離試験管が含まれる。一
実施態様では、一つ又は双方のタンパク質がマトリックスに結合することを可能
にするドメインを加えることを融合タンパク質は提供する。例えば、ＧＳＴ-ｇ
１２Ｌ融合タンパク質又はＧＳＴ-標的融合タンパク質は、グルタチオンセファ
ロースビーズ（Sigma Chemical, St. Louis, MO）又はグルタチオン誘導マイク
ロタイタープレート上に吸収させることができ、次にそれらを被験化合物又は被
験化合物、及び非吸収標的タンパク質又はｇ１２Ｌタンパク質の何れかと組み合
わせ、この混合物を複合体形成につながる条件下でインキュベーションする（例
えば、塩及びｐＨに関して生理学的条件）。インキュベーションの後で、ビーズ
又はマイクロタイタープレートウェルを洗浄し、すべての非結合成分、ビーズの
場合に固定化されたマトリックス、例えば上掲にて記載されていて、直接又は間
接的の何れかによって測定された複合体を取り除いた。あるいは、この複合体を
マトリックスから分離することができ、ｇ１２Ｌタンパク質結合又は活性のレベ
ルは、標準技術を用いて決定することができる。

【０１７９】 マトリックス上にタンパク質を固定化する他の技術は、本発明のスクリーニン
グアッセイでも使用することができる。例えば、ｇ１２Ｌタンパク質又はその標
的分子を、ビオチンとストレプトアビジンのコンジュゲイションを利用すること
で固定化できる。当該分野で知られた技術（例えば、ビオチン化キット、Pierce
Chemicals, Rockford, Ill.）を用いて、ビオチン化ｇ１２Ｌタンパク質又は標
的分子をビオチン-ＮＨＳ（Ｎ-ヒドロキシ-スクシニミド）から調製して、スト
レプトアビジン被膜９６ウェルプレートのウェルに固定化できる（Pierce Chemi
cal）。あるいは、ｇ１２Ｌタンパク質又は標的分子と反応性があり、ｇ１２Ｌ
タンパク質のその標的分子への結合を阻害しない抗体は、プレートのウェル、非
結合標的又は抗体コンジュゲイションによってウェルにトラップされたｇ１２Ｌ
タンパク質へ誘導体化することができる。このような複合体を検出する方法には
、ＧＳＴ-固定化複合体に関して上記にて記載してた内容に加えて、ｇ１２Ｌタ
ンパク質又は標的分子と関連する酵素活性を検出することに基礎をおく酵素結合
アッセイと同様に、ｇ１２Ｌタンパク質又は標的分子と反応性のある抗体を使用
した複合体の免疫検出が含まれる。

【０１８０】 その他の実施態様では、細胞を候補化合物と接触させ、そしてｇ１２Ｌ ｍＲ
ＮＡ又はタンパク質の発現を測定するという方法で、ｇ１２Ｌタンパク質発現の
モジュレーターを同定する。候補化合物の存在下でのｇ１２Ｌ ｍＲＮＡ又はタ
ンパク質の発現のレベルを、候補化合物が不存在下で、ｇ１２Ｌ ｍＲＮＡ又は
タンパク質の発現のレベルと比較する。次に、この比較に基づいて、候補化合物
をｇ１２Ｌ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現のモジュレーターとして同定すること
ができる。例えば、候補化合物が存在しない場合よりも存在する場合にｇ１２Ｌ
ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現がより高い場合（すなわち、統計的に顕著に高
い）、候補化合物は、ｇ１２Ｌ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現のスティミュレー
ターとして同定される。あるいは、候補化合物が無い場合よりも存在する場合に
ｇ１２Ｌ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現がより低い場合（統計的に顕著に低い
）、候補化合物は、ｇ１２Ｌ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現のインヒビターとし
て同定される。細胞におけるｇ１２Ｌ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現のレベルは
、ｇ１２Ｌ ｍＲＮＡ又はタンパク質の検出に関してここで記載されている方法
によって測定することができる。

【０１８１】 本発明の更にその他の側面では、ｇ１２Ｌタンパク質は、トゥーハイブリッド
アッセイ又はスリーハイブリッドアッセイ（例えば、米国特許第５，２８３，３
１７号；Zervos,ら., 1993. Cell 72: 223-232；Madura,ら., 1993. J. Biol. C
hem. 268: 12046-12054；Bartel,ら., 1993. Biotechniques 14: 920-924；Iwab
uchi,ら., 1993. Oncogene 8: 1693-1696；及びBrent ＷＯ９４／１０３００）
における「ベイトタンパク質」として、ｇ１２Ｌ（「ｇ１２Ｌ-結合タンパク質
」又は「ｇ１２Ｌ-ｂｐ」）と結合又は相互作用する他のタンパク質を同定する
ために使用することができる。そのようなｇ１２Ｌ-結合タンパク質は、また、
例えば、ｇ１２Ｌ経路の上流又は下流エレメントとしてのｇ１２Ｌタンパク質に
よるシグナルの増幅に関与する傾向にある。

【０１８２】 トゥーハイブリッドシステムは、殆どの転写因子のモジュレーターとしての性
質に基づいており、分離可能なＤＮＡ-結合及び活性化ドメインから成る。要約
すると、このアッセイは二つの異なるＤＮＡ構成物を利用する。一つの構成物で
は、ｇ１２Ｌをコードする遺伝子が、既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ-４）の
ＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子と融合している。他の構成物では、未同
定タンパク質（「プレイ」又は「試料」）をコードするＤＮＡ配列のライブラリ
からのＤＮＡ配列が、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子と融
合している。インビボでｇ１２Ｌ依存性複合体を形成するように「ベイト」及び
「プレイ」タンパク質が相互作用できるならば、転写因子のＤＮＡ結合及び活性
化ドメインは、近接しておかれる。この近さは、転写制御因子部位と作用可能に
連結しているレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写を、転写因子に対し
て応答性にする。レポーター遺伝子の発現は検出可能であり、機能性転写因子を
含有する細胞コロニーを単離し、ｇ１２Ｌと相互作用するタンパク質をコードす
るクローン遺伝子を得るために使用できる。 本発明は、更に、前出において言及したスクリーニングアッセイによって同定
した新規薬剤、及びここで記載されているそれを使用する治療に関する。

【０１８３】 検出アッセイ ここで同定されたｃＤＮＡ配列の一部分又は断片（及び対応する完全な遺伝子
配列）は、ポリヌクレオチド試薬として多くの方法において使用できる。例えば
、限定されるものではないが、これら配列は：（i）それらのそれぞれの遺伝子
染色体上にマッピングする；そしてそれによって遺伝疾患に関連している遺伝子
領域を位置付ける；（ii）最小量の生物学的試料からそれぞれを同定する（組織
適合試験）；そして（iii）生物学的試料の法医学的な同定を補助することに使
用できる。これら用途の幾つかは、以下の小節に示してある。

【０１８４】 クロモソームマッピング 一度、遺伝子の配列（又は配列の一部分）が同定されると，この配列は、染色
体上の遺伝子の位置をマッピングするために使用できる。この手法は、クロモソ
ームマッピングと呼ばれている。従って、ｇ１２L配列の一部分又は断片、配列
番号：１又は３、又はその断片又は誘導体は、それぞれ染色体上のｇ１２L遺伝
子の位置をマッピングするために使用できる。染色体へのｇ１２L配列のマッピ
ングは、これら配列と疾患に関連している遺伝子を相関させるための重要な第一
ステップである。 要約すると、ｇ１２L配列からＰＣＲプライマー（好ましくは１５−２５ｂｐ
長）を調製することによって、ｇ１２Ｌ遺伝子をクロモソームにマッピングする
ことができる。ｇ１２Ｌ配列ののコンピューター分析は、ゲノムＤＮＡに１エク
ソンよりも多く架けないプライマーを迅速に選択するために使用でき、それ故に
増幅プロセスを複雑にする。次に、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を
含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用できる。ｇ１２Ｌ配
列に一致するヒト遺伝子を含有するこれらハイブリッドのみが、増幅断片を産す
る。

【０１８５】 体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳動物（例えば、ヒト及びマウス細胞）の体
細胞を融合させることによって調製することができる。ヒト及びマウス細胞のハ
イブリッドが成長して分割するように、それらは、マウス染色体を保持するが、
次第にヒト染色体をランダムな順序で失う。ヒト細胞は成長するが、マウス細胞
が成長することのできない培地を使用することによって、それらが特定の酵素を
欠いているために、必要とする酵素をコードする遺伝子を含む一つのヒト染色体
は保持される。種々の培地を使用することによって、ハイブリッド細胞株のパネ
ルが確立される。パネルの各細胞株は、単一のヒト染色体又は僅かのヒト染色体
の何れか、そしてマウス染色体のフルセットを含み、特定のヒト染色体への個々
の遺伝子の容易なマッピングを可能にする。D'Eustachio,ら., 1983. Science 2
20: 919-924を参照せよ。ヒト染色体の唯一の断片を含む体細胞ハイブリッドは
、さらに、転座及び欠失をともなうヒト染色体を用いることによって生産される
。

【０１８６】 体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の配列を特定の染色体へ割り
当てる迅速な手法である。シングル熱サイクルを使用して、１日辺り３又はより
多い配列を割り当てることができる。設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
へｇ１２Ｌ配列を使用すると、特定の染色体の断片のパネルでサブローカライゼ
ーションが可能である。

【０１８７】 分散した分裂中期の染色体に対するＤＮＡ配列の蛍光インサイツハイブリダイ
ゼーション（ＦＩＳＨ）は、さらに、一段階で正確な染色体位置を提供するのに
使用できる。染色体の分散は、紡錘体を破壊するコルセミドのような化学物質に
よって、分裂が分裂中期でブロックされる細胞を使用して生成できる。染色体は
、トリプシンで手短に処理でき、次にギームザ染色で染色できる。明白な明と暗
のバンドが染色体上に現れ、これによって染色体が個々に同定される。このＦＩ
ＳＨ技術は、５００又は６００塩基の短いＤＮＡ配列で使用される。しかしなが
ら、１，０００塩基より大きなクローンは、単純な検出にとって十分なシグナル
強度で独特な染色体位置と結合するより高い傾向がある。好ましくは、１，００
０塩基、そしてより好ましくは２，０００塩基が、相応な時間でよい結果を得る
のに十分である。この技術の概説としては、Verm,ら., HUMAN CHROMOSOMES: A M
ANUAL OF BASIC TECHNIQUES（Pergamon Press, New York 1988）。

【０１８８】 クロモソームマッピングの試薬は、それぞれ、単一の染色体又はその染色体上
の単一部位を印すことに使用でき、試薬のパネルは、重複部位及び／又は染色体
を印すのに使用できる。遺伝子の非コード化領域に対応す試薬は、実際には、マ
ッピングの目的とって好ましい。コード化配列は、遺伝子ファミリー内で保存さ
れる傾向によりあり、従ってクロモソームマッピングの間のクロスハイブリダイ
ゼーションの機会を増す。 一度、配列が染色体の正確な位置にマッピングされると、染色体上の配列の物
理的な位置を遺伝的地図のデータと相関させることができる。そのようなデータ
は、例えば、オンラインでJohns Hopkins University Welch Medical Libraryを
介して入手可能なMcKusick MENDELIAN INHERITANCE IN MANに見出せる。同じ染
色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患の間の関係は、次に、例えばEgeland,
ら., 1987. Nature, 325: 783-787に記載されている連鎖解析を介して同定でき
る（物理的に近接した遺伝子の同一遺伝）。

【０１８９】 さらには、ｇ１２Ｌ遺伝子と関連する疾患によって影響又は影響受けていない
個体間のＤＮＡ配列の違いを決定することができる。任意の影響を受けていない
個体においてではなく、幾つか又は全ての影響を受けた個体に変異が観察される
場合、次いで、この変異は、特定の疾患の病因であり得る。影響を受けた、及び
受けていない個体には、一般的に、例えば、染色体分散から視覚化できる、又は
ＤＮＡ配列に基づいたＰＣＲを使用して検出可能な欠失又は転座のような、染色
体における構造変化が一見して含まれる。結局は、変異の存在を確認すること、
そして多型の変異を識別するために、幾つかの個体からの遺伝子の完全なシーク
エンシングをおこなうことができる。

【０１９０】 組織適合試験 また、本発明のｇ１２Ｌ配列は、最小量の生物学的試料から個体を同定するた
めに使用することができる。この技術では、個々のＤＮＡは一つ又は複数の制限
酵素で消化され、そしてサザンブロットにプローブされて同定のために独特なバ
ンドを産する。本発明の配列は、ＲＦＬＰにおける付加的なＤＮＡマーカーとし
て有用である（米国特許第５，２７２，０５７号に記載された「制限酵素断片長
多型」）。 さらには、本発明の配列は、個々のゲノムの選択部分の実際の塩基−塩基ＤＮ
Ａ配列を決定する選択的技術を提供するために使用される。従って、ここで記載
されたｇ１２Ｌ配列は、配列の５'-及び３'-末端からの二つのＰＣＲプライマー
を調製するために使用することができる。これらのプライマーは、次に、個々の
ＤＮＡを増幅し、その後でそれをシークエンシングするために使用できる。

【０１９１】 この方法で調製された、個体からの一致するＤＮＡ配列のパネルは、独特な個
々の同定を提供し、各個体は、対立遺伝子の違いに起因するそのようなＤＮＡ配
列の独特な一組を有する。本発明の配列は、個体及び組織からのそのような同定
配列を得るために使用できる。本発明のｇ１２Ｌ配列は、ヒトゲノムの一部分を
比類なく表す。対立遺伝子の変異は、これら配列のコード化領域においてある程
度生じ、非コード化領域ではより高い程度で生じる。個々のヒトの間の対立遺伝
子変異は、約５００塩基辺り１つの頻度で生じる。対立遺伝子変異の多くは一塩
基変異多型に起因し、それには制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰｓ）が含まれる。

【０１９２】 ここに記載の各配列は、個体からのＤＮＡが同定の目的のために比較できるの
に対して、ある程度は標準として使用できる。非コード領域においてより多くの
数の多型が生じることから、より僅かな配列が個体を識別するために必要である
。非コード配列は、楽に、ポジティブな個体の同定に、それぞれが１００塩基の
非コード化増幅配列を産する、恐らくは１０から１，０００プライマーのパネル
を提供する。配列番号：１又は３にあるような予想コード化配列が使用されたな
らば、ポジティブな個体の同定についてのより適切な数のプライマーは、５００
−２，０００である。

【０１９３】 予知医学 更に、本発明は、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノム学、そして臨床試
験のモニタリングが予後（予知）の目的に用いられ、それによって個体を予防的
に治療する、予知医学の分野に関する。従って、本発明の一側面は、生物学的試
料（例えば、血液、血清、細胞、組織）のからみで、ｇ１２Ｌ活性のみならず、
ｇ１２Ｌタンパク質及び／又は核酸発現に関する診断アッセイに関し、それによ
って、個体が、異常なｇ１２Ｌ発現又は活性に関連する、疾病又は疾患で冒され
ているのか、又は疾患の発達段階の危機にあるのかが決定できる。疾患には、代
謝疾患及び疾病、例えば肥満及び肥満関連疾患、糖尿病、及び悪液質；細胞増殖
疾患及び疾病、例えば過形成、癌、及び再狭窄；神経変性疾患及び疾病、例えば
アルツハイマー病及びパーキンソン病；免疫疾患及び疾病、例えばＡＩＤＳ、炎
症、及び自己免疫疾患；そして造血性疾患及び疾病、例えばＳＣＩＤ、周期性好
中球減少症、及び血小板血症が含まれる。更に、本発明は、個体が、ｇ１２Ｌタ
ンパク質、核酸発現又は活性と関連する疾患の発達段階の危機にあるのかどうか
を決定する予後（又は予知）アッセイを提供する。例えば、ｇ１２Ｌ遺伝子にお
ける変異は、生物学的試料でアッセイできる。そのようなアッセイは、予後又は
予知目的で使用することができ、それによって、ｇ１２Ｌタンパク質、核酸発現
、又は生物学的活性で特徴付けられる又は関連する疾患の発症の前に個体を予防
的に治療できる。

【０１９４】 本発明のその他の側面は、個体でのｇ１２Ｌタンパク質、核酸発現又は活性を
測定する方法を提供し、それによって、その個体にとって適切な治療又は予防的
な薬剤を選択する方法を提供する（ここでは、「ゲノム薬理学」と呼ばれる）。
ゲノム薬理学は、個体の遺伝子型に基づく治療的又は予防的治療に関する薬剤（
例えば、薬）の選択を可能にする（例えば、特定の薬剤への応答する個体の能力
を測定するために検査した個体の遺伝子型）。 本発明の更にその他の側面は、臨床試験でのｇ１２Ｌの発現又は活性における
薬剤（例えば、薬剤、化合物）の影響のモニタリングに関する。 これら及び他の薬剤は、下記の節において更に詳しく記載されている。

【０１９５】 診断アッセイ 生物学的試料中のｇ１２Ｌの存否を検出する例示的な方法には、被検体から生
物学的試料を得て、生物学的試料と化合物、又はｇ１２Ｌタンパク質又はｇ１２
Ｌタンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出する
ことが可能な薬剤を接触させ、生物学的試料におけるｇ１２Ｌの存在を検出する
ことが含まれる。ｇ１２Ｌタンパク質又はゲノムＤＮＡを検出するための薬剤は
、ｇ１２ＬｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡとハイブリダイズすることが可能な標識核
酸プローブである。例えば、核酸プローブは、完全長ｇ１２Ｌ核酸、例えば配列
番号：１又は３の核酸、又はその一部分、例えば少なくとも１５，３０，５０，
１００，２５０又は５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであって、緊縮
条件の下でｇ１２ＬｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするの
に十分なものである。本発明の診断アッセイの用途にとって適切な他のプローブ
が、ここに記載されている。

【０１９６】 ｇ１２Ｌタンパク質を検出するための薬剤は、ｇ１２Ｌタンパク質と結合する
ことが可能な抗体であり、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。抗体
は、ポリクローナル、より好ましくはモノクローナルである。無傷の抗体、又は
その断片（例えば、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ'）_２）を使用することができる。プロ
ーブ又は抗体に関する「標識」という用語は、直接に標識されたその他の試薬と
の反応性によるプローブ又は抗体の間接的な標識化だけでなく、検出可能な基質
をプローブ又は抗体へカップリング（すなわち、物理的な結合）によるプローブ
又は抗体の直接標識を包含することを意図している。間接標識の例には、蛍光性
標識二次抗体を使用した一次抗体の検出、及びビオチンによるＤＮＡプローブの
末端標識を使用し、それによってそれを蛍光性標識ストレプトアビジンで検出で
きるようにすることが含まれる。「生物学的試料」という用語は、被検体中に存
在する組織、細胞及び体液のみならず、被検体から単離した組織、細胞及び生物
学的体液を含めることが意図されている。すなわち、本発明の検出方法は、イン
ビボのみならずインビトロでの生物学的試料中のｇ１２L ｍＲＮＡ、タンパク質
、又はゲノムＤＮＡを検出するために使用できる。例えば、ｇ１２Ｌ ｍＲＮＡ
の検出に関するインビトロ技術には、ノーザンハイブリダイゼーション及びイン
サイツハイブリダイゼーションが含まれる。ｇ１２Ｌタンパク質の検出に関する
インビトロ技術には、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡｓ）、ウェスタンブ
ロット、免疫沈降、そして免疫蛍光が含まれる。ｇ１２ＬゲノムＤＮＡの検出に
関するインビトロ技術には、サザンハイブリダイゼーションが含まれる。さらに
は、ｇ１２Ｌタンパク質の検出に関するインビボ技術には、被検体へ標識抗-ｇ
１２Ｌ抗体を導入することが含まれる。例えば、抗体は、被検体におけるその存
在及び位置を標準画像化技術によって検出できる、放射活性マーカーで標識でき
る。

【０１９７】 一実施態様では、生物学的試料は、被験検体からのタンパク質分子を含む。あ
るいは、この生物学的試料は、被験検体又は被験検体のゲノムＤＮＡ分子からの
ｍＲＮＡ分子を含むことができる。好ましい生物学的試料は、脂肪組織、腫瘍生
検、又は血液試料である。 その他の実施態様では、この方法には、更に、コントロール被検体からコント
ロールの生物学的試料を得ること、コントロール試料とｇ１２Ｌタンパク質、ｍ
ＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡを検出することが可能な化合物又は薬剤と接触させ、
ｇ１２Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを生物学的試料から検出し、そ
してコントロール試料中のｇ１２Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡと、
被験試料中のｇ１２Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの存在を比較する
ことが含まれる。

【０１９８】 また、本発明には、生物学的試料中のｇ１２Ｌの存在を検出するためのキット
が含まれる。例えば、このキットは：生物学的試料中のｇ１２Ｌタンパク質又は
ｍＲＮＡを検出することができる標識化合物又は薬剤；試料中のｇ１２Ｌの量を
測定する手段；及び試料中のｇ１２Ｌの量を標準と比較するための手段を含む。
この化合物又は薬剤を、適切な容器に詰めることができる。このキットは、更に
、このキットをｇ１２Ｌタンパク質又は核酸を検出するために使用するための指
示書を含むことができる。

【０１９９】 予後アッセイ ここに記載の診断方法は、さらに、異常なｇ１２Ｌ発現又は活性と関連してい
る疾病又は疾患を有している又はその進行の危機にある被検体の同定のために使
用することができる。例えば、前述の診断アッセイ又は次のアッセイのような、
ここに記載されているアッセイは、ｇ１２Ｌタンパク質、核酸発現又は活性と関
連している疾患を有する又はその進行の危機ある被検体を同定するために使用す
ることができる。あるいは、予後アッセイは、疾病又は疾患を有する、又はその
進行の危機にある被検体を同定するために使用することができる。従って、本発
明は、異常なｇ１２Ｌ発現又は活性と関連する疾病又は疾患を同定する方法を提
供し、その被験試料は被検体から得られて、ｇ１２Ｌタンパク質又は核酸（例え
ば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）が検出され、ｇ１２Ｌタンパク質又は核酸の存在
は、異常なｇ１２Ｌ発現又は活性と関連する疾病又は疾患を有する又はその進行
の危機にある被検体に関する診断に用いられる。ここで使用されているように、
「被験試料」とは、対象である被検体から得られた生物学的試料を指す。例えば
、被験試料は、生物学的体液（例えば、血清）、細胞試料、又は組織である。

【０２００】 さらには、ここに記載の予後アッセイは、異常なｇ１２Ｌ発現又は活性に関連
している疾病又は疾患を治療するために、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴ
ニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、又は他の薬候
補物）を被検体へ投与してもよいかどうかを決定するために使用することができ
る。例えば、そのような方法は、疾患に対する薬剤によって被検体を効果的に治
療することができるかどうかを決定するために使用できる。従って、本方法は、
被験試料が得られて、ｇ１２Ｌタンパク質又は核酸を検出する、異常なｇ１２Ｌ
発現又は活性と関連する疾病に対する薬剤によって被検体が効果的に治療できる
かどうかを決定する方法を提供する（例えば、異常なｇ１２Ｌ発現又は活性と関
連する疾患を治療する薬剤を投与することができる被検体にとって、ｇ１２Ｌタ
ンパク質又は核酸の存在が診断上利用できる）。

【０２０１】 また、本発明の方法は、ｇ１２Ｌ遺伝子の遺伝的損傷を検出し、それによって
損傷した遺伝子を有する被検体が、異常な細胞増殖及び／又は分化によって特徴
付けられる疾患の危機にあるかどうかを決定することに使用できる。種々の実施
態様では、本方法には、被検体の細胞の試料において、ｇ１２Ｌタンパク質をコ
ードする遺伝子の整合性に影響する少なくとも一つの変化によって特徴付けられ
る遺伝的損傷の存否、又はｇ１２Ｌ遺伝子の誤発現を検出することが含まれる。
例えば、そのような遺伝的損傷は：（i）ｇ１２Ｌ遺伝子の一つ又は複数のヌク
レオチドの欠失；（ii）ｇ１２Ｌ遺伝子への一つ又は複数のヌクレオチドの付加
；（iii）ｇ１２Ｌ遺伝子の一つ又は複数の置換；（iv）ｇ１２Ｌ遺伝子の染色
体再編成；（v）ｇ１２Ｌ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写のレベルでの変化
，(vi)ｇ１２Ｌ遺伝子の異常な修飾，例えばゲノムＤＮＡのメチル化パターン，
（vii）ｇ１２Ｌ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写の非野生型スプライシング
パターンの存在，（viii）ｇ１２Ｌタンパク質の非野生型レベル，(ix)ｇ１２Ｌ
遺伝子の対立遺伝子損失，そして（x）ｇ１２Ｌタンパク質の不適切な翻訳後修
飾のうちの少なくとも一つの存在を確かなものにすることによって検出される。
ここに記載されているように、ｇ１２Ｌ遺伝子の損傷を検出するために使用でき
る、当該分野で知られている多くの数のアッセイ技術がある。好ましい生物学的
試料は、被検体から常套的な方法で単離された脂肪組織試料、腫瘍生検、又は血
液試料である。しかしながら、有核細胞を含有する生物学的試料が使用されても
よい。

【０２０２】 ある実施態様では、損傷の検出には、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）での
プローブ／プライマーの使用（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号及び４
，６８３，２０２号を参照せよ）、例えばアンカーＰＣＲ又はＲＡＣＥ ＰＣＲ
が含まれ、それに代わる方法としては、ライゲーション連鎖反応法（ＬＣＲ）（
例えば、Landegran,ら., 1988. Science 241: 1077-1080；及びNakazawa,ら., 1
994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 360-364）でのこれらプローブの使用が
含まれ、後者は、特にｇ１２Ｌ遺伝子の点変異を検出するために有用である（Ab
ravaya,ら., 1995. Nucl. Acids Res. 23: 675-682）。この方法には、患者から
細胞の試料を収集すること、試料の細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡ又
は双方）を単離すること、ｇ１２Ｌ遺伝子（存在していれば）のハイブリダイゼ
ーション及び増幅が起こる条件下で、核酸試料を一つ又は複数のｇ１２Ｌ遺伝子
と特異的にハイブリダイズするプライマーと接触させること、そして増幅産物の
存否を検出すること、又は増幅産物の大きさを検出してコントロール試料に対し
て長さを比較することの段階が含まれる。ここに記載の変異を検出するために使
用する任意の技術との組み合わせにおいて、ＰＣＲ及び／又はＬＣＲを予備的増
幅段階として使用することは所望され得ることであると期待される。

【０２０３】 代替的な増幅方法には：自己持続性配列複製（Guatelli,ら., 1990. Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878を参照せよ）；転写増幅系（Kwoh,ら., 1989
. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177）；Ｑβレプリカーゼ（Lizardi,
ら., 1988. BioTechnology 6: 1197）、又は任意の他の核酸増幅法と、これに続
く当該分野に熟練した者にとって良く知られた技術を用いた増幅分子の検出が含
まれる。これらの検出の基本構想は、核酸分子が極めて少なく存在しているなら
ば、特に核酸分子の検出にとって有用である。 これに代わる実施態様では、試料細胞のｇ１２Ｌ遺伝子の変異は、制限酵素切
断パターンの変化によって同定することができる。例えば、試料及びコントロー
ルＤＮＡが単離され、増幅され（選択）、一つ又は複数の制限エンドヌクレアー
ゼで消化され、断片長の大きさをゲル電気泳動によって決定して比較する。試料
とコントロールＤＮＡの間の断片長の大きさの違いは、試料ＤＮＡにおける変異
を表す。さらには、配列特異的リボザイム（例えば，米国特許第５，４９３，５
３１号を参照せよ）の使用は、リボザイム切断部位の発生又は損失による特異的
変異の存在に切り目を付けるために使用できる。

【０２０４】 他の実施態様では、ｇ１２Ｌの遺伝的変異は、試料と例えばＤＮＡ又はＲＮＡ
の核酸を、数百又は数千のオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレイ
へハイブリダイズさせることで同定できる。例えば、Cronin,ら., 1996. Human
Mutation 7: 244-255；Kozal, ら., 1996. Nat. Med. 2: 753-759を参照せよ。
例えば、ｇ１２Ｌの遺伝的変異は、Cronin,ら., 上掲に記載されているような、
光生成ＤＮＡプローブを含有する二次元アレイで同定することができる。要約す
ると、プローブの最初のハイブリダイゼーションアレイは、試料及びコントロー
ル中の長いストレッチをスキャンするために使用することができ、それによって
連続して重なり合っているプローブの線形アレイを作製して配列間の塩基の変化
を同定することができる。この段階は、点変異の同定を可能にする。これには、
すべての変異体又は検出された変異と相補的なより小さく、特化されたプローブ
を使用することで、特定の変異の特徴付けが可能となる二次ハイブリダイゼーシ
ョンが後に続く。各変異アレイは、一つが野生型遺伝子に対して相補的、そして
他が変異遺伝子に対して相補的な、並列するプローブのセットから構成される。

【０２０５】 さらにその他の実施態様では、当該分野で知られた任意の種々のシークエンシ
ング反応を、ｇ１２Ｌ遺伝子を直接にシークエンシングし、試料ｇ１２Ｌの配列
とこれに相当する野生型（コントロール）配列を比較することによって変異を検
出することに使用することができる。シークエンシング反応の例には、Maxim及
びGilbert, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560又はSanger, 1977. Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463によって開発された技術に基づいたものが含
まれる。また、任意の種々の自動化シークエンシング法を、質量分析法によるシ
ークエンシングを含めて（PCT国際公開ＷＯ９４／１６１０１；Cohen,ら., 1996
Adv. Chromatography 36: 127-162；及びGriffin,ら., 1993. Appl. Biochem.
Biotechnol. 38: 147-159）、診断的アッセイ（例えば、Naeve,ら., 1995. Biot
echniques 19: 448を参照せよ）をおこなう場合に利用することができる。

【０２０６】 ｇ１２Ｌ遺伝子の変異を検出するための他の方法には、切断剤からの保護がＲ
ＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖のミスマッチ塩基を検出するため
に使用されている方法が含まれる。例えば、Myers,ら., 1985. Science 230: 12
42を参照せよ。一般的には、「ミスマッチ切断」の技術は、組織試料から得られ
た変異ＲＮＡ又はＤＮＡを潜在的に有する野生型ｇ１２Ｌ配列を含有するＲＮＡ
又はＤＮＡをハイブリダイズ（標識された）することで形成されたヘテロ二重鎖
を提供することによって開始する。二本鎖二重鎖を、コントロールと試料鎖の間
の塩基対ミスマッチによって存在する二重鎖の一本鎖領域を切断する薬剤で処理
する。例えば、ミスマッチ領域を酵素的に消化するために、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重
鎖をＲＮａｓｅ、そしてＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドをＳ_１ヌクレアーゼで処理
することができる。他の実施態様では、ＤＮＡ／ＤＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡ二重
鎖の何れかを、ミスマッチ領域を消化するために、ヒドロキシアミン又は四酸化
オスミウム、そしてピペリジンで処理することができる。ミスマッチ領域の消化
の後、次に、この消化の結果で生じた物質を変性ポリアクリルアミドゲル上で大
きさによって分離し、変異の位置を決定した。例えば、Cotton,ら., 1988. Proc
. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397；Saleeba, ら., 1992. Methods Enzymol. 21
7: 286-295を参照せよ。ある実施態様では、検出のために、コントロールＤＮＡ
又はＲＮＡを標識することができる。

【０２０７】 更に、その他の実施態様では、ミスマッチ切断反応は、細胞の試料から得られ
たｇ１２Ｌ ｃＤＮＡの点変異を検出してマッピングするための定義されたシス
テムにおける二重鎖ＤＮＡのミスマッチ塩基対（「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素
と呼ばれる）のミスマッチ塩基対を認識する一つ又は複数のタンパク質を利用す
る。例えば、大腸菌のmutY酵素はＧ／ＡミスマッチのＡを切断し、HeLa細胞のチ
ミジンＤＮＡグリコシラーゼはＧ／ＴミスマッチのＴを切断する。例えば、Hsu,
ら., 1994. Carcinogenesis 15: 1657-1662を参照せよ。例示的な実施態様によ
ると、ｇ１２Ｌ配列に基づくプローブ、例えば野生型ｇ１２Ｌ配列は、被験細胞
のｃＤＮＡ又は他のＤＮＡ産物とハイブリダイズする。二重鎖はＤＮＡミスマッ
チ修復酵素で処理され、存在するならば、切断産物は電気泳動プロトコール等で
検出することができる。米国特許第５，４５９，０３９号を参照せよ。

【０２０８】 他の実施態様では、電気泳動的移動度の変化は、ｇ１２Ｌ遺伝子の変異を同定
するために使用することができる。例えば、１本鎖DNA高次構造多型（ＳＳＣＰ
）を、変異体と野生型核酸の間の電気泳動移動度の違いを検出するために使用で
きる。例えば、Orita,ら., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 86: 2766；Cot
ton, 1993. Mutat. Res. 285: 125-144；Hayashi, 1992. Genet. Anal. Tech. A
ppl. 9: 73-79を参照せよ。試料及びコントロールｇ１２Ｌ核酸の一本鎖ＤＮＡ
断片を変性し、再生させる。一本鎖核酸の二次構造は、配列によって変化し、電
気泳動移動度で生じた変化によって、一塩基変化でさえの検出が可能となる。Ｄ
ＮＡ断片を、標識プローブで標識又は検出してもよい。このアッセイの感度は、
その二次構造が配列の変化に対してより感度の高いＲＮＡ（ＤＮＡよりも）を使
用することによって増し得る。一実施態様では、この主題の方法は、電気泳動的
移動度における変化に基づく二本鎖ヘテロ二重鎖分子を分離するためのヘテロ二
重鎖分析を利用する。例えば、Keen,ら., 1991. Trends Genet. 7: 5を参照せよ
。

【０２０９】 更にその他の実施態様では、変性グラジェントゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使
用して、変性剤のグラジェントを含有するポリアクリルアミドゲルにおける変異
体又は野生型断片の移動をアッセイした。例えば、Myers,ら., 1985. Nature 31
3: 495を参照せよ。分析の方法としてＤＧＧＥを使用する場合、例えば、ＰＣＲ
により、およそ４０ｂｐの高融点ＧＣ高含有ＤＮＡのＧＣクランプを添加するこ
とによって、完全に変性しないことを確かなものにするために、ＤＮＡを修飾す
る。更なる実施態様では、コントロールと試料ＤＮＡの移動度の違いを同定する
ために、変性グラジェントに代わって温度グラジェントを使用する。例えば、Ro
senbaum及びReissner, 1987. Biophys. Chem. 265: 12753を参照せよ。

【０２１０】 点変異を検出するための他の例には、限定されるものではないが、選択性オリ
ゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択性増幅、又は選択性プライマー伸
張が含まれる。例えば、既知の変異を中心に配し、完全な一致が見出される場合
にのみにハイブリダイゼーションを許容する条件下で、標的ＤＮＡとハイブリダ
イズさせることで、オリゴヌクレオチドプライマーは調製され得る。例えば、Sa
iki,ら., 1986. Nature 324: 163；Saiki,ら., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86: 6230を参照せよ。オリゴヌクレオチドがハイブリダイズ化膜に結合して
標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズする場合、このような対立遺伝子特異的
オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅標的ＤＮＡ又は多くの異なる変異とハイブリ
ダイズする。

【０２１１】 あるいは、選択性ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子増幅技術は、本発明と組み
合わせて使用することができる。特定の増幅でプライマーとして使用されるオリ
ゴヌクレオチドは、適切な条件下で、ミスマッチが防げる、又はポリメラーゼ伸
張が減じられることが可能である、分子の中心（よって、増幅はディファレンシ
ャルハイブリダイゼーションによる；例えば、Gibbs,ら., 1989. Nucl. Acids R
es. 17: 2437-2448を参照せよ）又は一つのプライマーの極端な３'-末端に対象
である変異を有する（例えば、Prossner, 1993. Tibtech. 11: 238）。加えて、
切断を基礎とする検出を引き起こすために、変異の領域に新しい制限酵素部位を
導入することが所望されてもよい。例えば、Gasparini,ら., 1992. Mol. Cell P
robes 6: 1を参照せよ。また、所定の実施態様の増幅が、増幅のためのＴａｑリ
ガーゼを使用しておこなわれてもよい。例えば、Barany, 1991. Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 88: 189を参照せよ。そのような場合には、ライゲーションは、５
'配列の３'-末端で完全なる一致がある場合のみに起こり、増幅の存否を調べる
ことによって、特定部位での既知の変異の存在を検出することを可能にする。

【０２１２】 ここで記載されている方法は、例えば、少なくとも一つのここで記載されてい
る核酸又は抗体試薬を含むプリパッケージ診断キットを利用しておこなうことが
でき、それは、例えば、症状を示している患者、又は家族のｇ１２Ｌ遺伝子が関
与している疾病や病気の歴史を診断するための臨床的な条件において簡便に使用
され得る。 さらには、ｇ１２Ｌが発現している任意の細胞型又は組織は、ここで記載され
ている予後アッセイで利用され得る。

【０２１３】 薬理ゲノム学 ここで記載されているスクリーニングアッセイによって同定されたような、ｇ
１２Ｌ活性（例えば、ｇ１２Ｌ遺伝子発現）に対して刺激性又は阻害性効果を有
する薬剤、又はモジュレーターは、個体へ投与し、疾患（この疾患には、代謝疾
患及び疾病、例えば肥満及び肥満関連疾患、糖尿病、及び悪液質；細胞増殖疾患
及び疾病、例えば過形成、癌、及び再狭窄；神経変性疾患及び疾病、例えばアル
ツハイマー病及びパーキンソン病；免疫疾患及び疾病、例えばＡＩＤＳ、炎症、
及び自己免疫疾患；そして造血性疾患及び疾病、例えばＳＣＩＤ、周期性好中球
減少症、及び血小板血症が含まれる。）を治療（予防的又は治療的）することが
できる。このような治療と組み合わせて、個体のゲノム薬理学（すなわち、個体
の遺伝型とその個体の外来性化合物又は薬への応答の間の関係に関する研究）が
考慮されてもよい。治療薬の代謝の違いは、投与量と薬理学的活性剤の血中濃度
の間の関係を変化させることによって、重い毒性又は治療上の失敗につながる。
従って、個体のゲノム薬理学は、個体の遺伝子型の考慮に基づいた予防的又は治
療法のための有効な薬剤（例えば、薬）の選択を可能にする。このようなゲノム
薬理学は、更に、適切な投薬量及び治療法を決定するために使用できる。従って
、個体におけるｇ１２Ｌタンパク質の活性、ｇ１２Ｌ核酸の発現、又はｇ１２Ｌ
遺伝子の変異量は、個体の治療的又は予防的両方にとって適切な薬剤を選択する
ことで決定することができる。

【０２１４】 ゲノム薬理学は、改変された薬物移行性、及び病気に冒された人の異常な反応
に起因する、薬剤への応答における臨床学的に重要な遺伝的変化を扱う。例えば
、Eichelbaum, 1996. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 23: 983-985；Linder,
1997. Clin. Chem., 43: 254-266を参照せよ。一般的には、２つの型の薬理遺
伝的条件を区別することができる。遺伝的条件は、薬が体に作用する方法（変化
した薬の作用）を変化させる単一要因として伝達した、又は薬が体に作用する方
法を変化させる幾つかの単一要因として伝達した（変化した薬の代謝）。これら
薬理遺伝的条件は、希な欠損又は多型のいずれかとして起こる。例えば、グルコ
ース-６-リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）欠損は、よくある遺伝的酵素異常
症であり、主要な合併症は、酸化剤（抗-マラリア剤、サルファ剤、鎮痛剤、ニ
トロフラン）の吸収、及び空豆の消化の後の溶血反応である。

【０２１５】 例示的な実施態様としては、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度と期間の
双方の主要な決定要因である。薬物代謝酵素の遺伝的多型の発見（例えば、Ｎ-
アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）及びチトクロームＰ４５０酵素ＣＹ
Ｐ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｃ１９）は、なぜある患者が、標準で安全な投与量を摂取
した後に、期待される薬物効果を得られないのか、又は過大な薬物応答及び深刻
な毒性を示すかに関する説明を提供する。これら多型は、個体群の中の二つの表
現型である、迅速代謝型（ＥＭ）及び不全代謝型（PM）で発現される。ＰＭの有
病率は、異なる個体群では異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は
、高度に多型であり、幾つかの変異がＰＭで確認され、それらすべては機能的Ｃ
ＹＰ２Ｄ６の欠如につながる。ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｃ１９の代謝能が低い
型は、標準的な投与量を摂取した場合、極めて頻繁に過大な薬物応答と副作用を
経験する。代謝産物が活性な治療用成分ならば、ＰＭは、ＣＹＰ２Ｄ６形成代謝
産物モルヒネによって媒介されるコデインの鎮痛効果ために示されたように、治
療上の応答を示さない。他の極端なものとしては、標準的な投与量に対して応答
しない代謝能が超高速な型がある。最近、超高速代謝型の分子的機序が、ＣＹＰ
２Ｄ６遺伝子増幅のおかげで同定されている。

【０２１６】 従って、個体のｇ１２Ｌタンパク質の活性、ｇ１２Ｌ核酸の発現、又はｇ１２
Ｌ遺伝子の変異量は、個体の治療的又は予防的治療にとって適切な薬剤を選択す
ることによって決定することができる。加えて、薬理遺伝学研究は、薬物代謝酵
素をコードする多型対立遺伝子の遺伝子型を個体の薬物応答性表現型の同定へ応
用するために使用することができる。この知見が投薬又は薬物選択に応用される
と、ここで記載されている例示的スクリーニングアッセイの一つによって同定さ
れたモジュレーターのように、逆反応又は治療上の失敗を避けることができ、そ
れ故に、被検体をｇ１２Ｌモジュレーターで処理すると、治療的又は予防的効果
を高めることができる。

【０２１７】 臨床試験中の効果のモニタリング ｇ１２Ｌの発現又は活性（例えば、異常な細胞増殖及び／又は分化を調節する
能力）に対する薬剤（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることは
、基礎的な薬物スクリーニングだけでなく、臨床試験にも応用できる。例えば、
ｇ１２Ｌ遺伝子発現、タンパク質レベル、又はｇ１２Ｌ活性の上方制御を高める
、ここで記載のようなスクリーニングアッセイによって決定される薬剤の有効性
は、低下したｇ１２Ｌ遺伝子発現、タンパク質レベル、又は下方制御ｇ１２Ｌ活
性を示す被検体の臨床試験においてモニターすることができる。あるいは、ｇ１
２Ｌ遺伝子発現、タンパク質レベル、又はｇ１２Ｌ活性の下方制御を減じる、ス
クリーニングアッセイで決定された薬剤の有効性は、高まったｇ１２Ｌ遺伝子発
現、タンパク質レベル、又はｇ１２Ｌの上方制御を示す被検体の臨床試験におい
てモニターすることができる。そのような臨床試験では、ｇ１２Ｌの発現又は活
性、及び好ましくは、例えば、細胞性増殖又は免疫疾患に関連している他の遺伝
子が、特定の細胞の免疫応答性の「読み取り」又はマーカーとして使用すること
ができる。

【０２１８】 実施例として、限定されるものではないが、ｇ１２Ｌ活性（例えば、ここで記
載されているような、スクリーニングアッセイで同定された）を調節する薬剤（
例えば、化合物、薬物又は小分子）による処置によって細胞で調節されるｇ１２
Ｌを含む遺伝子を同定することができる。従って、細胞性増殖疾患に対する薬剤
の効果を研究するためには、例えば、臨床試験において、細胞を単離し、そして
ＲＮＡを調製し、ｇ１２Ｌの発現のレベル及び疾患に関与している他の遺伝子の
ために分析することができる。遺伝子発現（すなわち、遺伝子発現パターン）の
レベルは、ここで記載されているように、ノーザンブロット分析又はＲＴ−ＰＣ
Ｒによって、又は代わって生産されたタンパク質の量を測定することによって、
ここで記載の方法の一つによって、又はｇ１２Ｌ又は他の遺伝子の活性のレベル
を測定することによって定量化することができる。この方法では、遺伝子発現パ
ターンは、薬剤に対する細胞の生理学的応答を示すマーカーとしての機能を果た
すことができる。従って、この応答状況は、薬剤による個体の治療の前、そして
その最中の種々の地点で測定し得る。

【０２１９】 一実施態様では、本発明は、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タ
ンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、小分子、又はここに記載のスクリ
ーニングアッセイによって同定された他の薬物候補）による被検体の治療の有効
性をモニタリングするための方法を提供し、それには（i）薬剤の投与の前に、
被検体から前投与試料を得ること；（ii）前投与試料のｇ１２Lタンパク質、ｍ
ＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出すること；（iii）被検体から
一つ又は複数の投与後試料を得ること；（iv）投与後試料のｇ１２Lタンパク質
、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出すること；（v）前投与試
料のｇ１２Lタンパク質、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡの発現又は活性のレベル
を、投与後試料のｇ１２Lタンパク質、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡと比較する
こと；そして（vi）それに応じて、被検体への薬剤の投与を変えること、が含ま
れる。例えば、検出されたのよりもより高いレベルへｇ１２Ｌの発現又は活性を
高めるために、すなわち、薬剤の有効性を高めるためには、増加した薬剤の投与
が所望され得る。あるいは、検出されたのよりもより低いレベルのｇ１２Ｌの発
現又は活性を低下させるために、すなわち薬剤の有効性を低下させるためには、
低下した薬剤の投与が所望され得る。

【０２２０】 治療の方法 本発明は、疾患の危機（又は罹りやすい）にある、又は異常なｇ１２Ｌ発現又
は活性と関連している疾患を有する被検体を治療する予防的及び治療的方法の双
方を提供する。この疾患には、代謝疾患及び疾病、例えば肥満及び肥満関連疾患
、糖尿病、及び悪液質；細胞増殖疾患及び疾病、例えば過形成、癌、及び再狭窄
；神経変性疾患及び疾病、例えばアルツハイマー病及びパーキンソン病；免疫疾
患及び疾病、例えばＡＩＤＳ、炎症、及び自己免疫疾患；そして造血性疾患及び
疾病、例えばＳＣＩＤ、周期性好中球減少症、及び血小板血症が含まれる。これ
ら治療の方法は、下記においてより十分に論じられている。

【０２２１】 疾病及び疾患 増大した（疾病又は疾患を罹っていない被検体に対して）レベル又は生物学的
活性によって特徴付けられる疾病及び疾患は、活性と拮抗する（すなわち、減少
させる又は阻害する）薬物療法で治療し得る。活性と拮抗する薬物療法は、治療
的又は予防的な方法で投与し得る。限定されるものではないが、利用され得る薬
物療法には：（i）前出のペプチド、又はその類似体、誘導体、断片又はホモロ
グ；（ii）前出のペプチドに対する抗体；（iii）前出のペプチドをコードする
核酸；（iv）相同組み換えによって前出のペプチドの内在性の機能を「ノックア
ウト」するために利用される「機能障害性」（すなわち、前出のペプチドに対す
るコード化配列のコード化配列内での非相同的な挿入）のアンチセンス核酸及び
核酸の投与（例えば、Capecchi, 1989. Science 244: 1288-1292）；又は（v）
前出のペプチドとその結合パートナーの間の相互作用を変化させるモジュレータ
ー（すなわち、阻害剤、アゴニスト及びアンタゴニストで、本発明の付加的ペプ
チド模倣物、又は本発明のペプチドに対して特異的な抗体）が含まれる。

【０２２２】 減少した（疾病又は疾患を罹っていない被検体に対して）レベル又は生物学的
活性によって特徴付けられる疾病及び疾患は、活性を高める（すなわち、それに
対してアゴニスト）薬物療法で治療し得る。活性を上方制御する薬物療法は、治
療的又は予防的な方法で投与し得る。限定されるものではないが、利用され得る
薬物療法には、前出のペプチド、又はその類似体、誘導体、断片又はホモログ；
又は生物学的利用能を高めるアゴニストが含まれる。

【０２２３】 増加した又は減少したレベルは、ペプチド及び／又はＲＮＡを定量化すること
によって、患者の組織試料（例えば、生検組織から）を得て、それをインビトロ
でＲＮＡ又はペプチドレベル、発現したペプチド（又は前出のペプチドのｍＲＮ
Ａ）の構造及び／又は活性をアッセイすることによって容易に検出することがで
きる。当該分野で良く知られた方法には、限定されるものではないが、免疫アッ
セイ（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気
泳動、免疫細胞化学などに続くウェスタンブロット分析、免疫沈降によって）及
び／又はｍＲＮＡｓの発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（
例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイツハイブリダイゼーショ
ン等）が含まれる。

【０２２４】 予防的な方法 一側面では、本発明は、ｇ１２Ｌ発現又は少なくとも一つのｇ１２Ｌ活性を調
節する薬剤を被検体へ投与することによって、被検体における、異常なｇ１２Ｌ
発現又は活性と関連する疾病又は症状を防ぐ方法を提供する。異常なｇ１２Ｌ発
現又は活性によって生じ又は貢献する疾病の危険のある被検体は、例えば、ここ
に記載の任意の又は診断又は予防的アッセイの組み合わせによって同定すること
ができる。予防剤の投与は、ｇ１２Ｌ異常の特徴である症状の現れの前におこな
うことができ、疾病又は疾患は予防される、又はそれに代わってその進行が遅ら
せられる。ｇ１２Ｌ異常の型によると、例えば、ｇ１２Ｌアゴニスト又はｇ１２
Ｌアンタゴニスト剤を、被検体を治療するために使用することができる。適した
薬剤は、ここに記載したスクリーニングアッセイに基づいて決定することができ
る。本発明の予防的方法は、以下の小節において更に論じられている。

【０２２５】 治療方法 本発明のその他の側面は、治療目的に関するｇ１２Ｌ発現又は活性を調節する
方法に関する。本発明の調節法には、細胞に関連するｇ１２Ｌタンパク質活性の
一つ又は複数の活性を調節する薬剤と細胞を接触させることが含まれる。ｇ１２
Ｌタンパク質活性を調節する薬剤は、ここで記載の薬剤であって、例えば核酸又
はタンパク質、ｇ１２Ｌタンパク質の天然発生の同族リガンド、ペプチド、ｇ１
２Ｌペプチド模倣物、又は他の小分子である。一実施態様では、この薬剤は、一
つ又は複数のｇ１２Ｌタンパク質活性を刺激する。そのような刺激性薬剤の例に
は、活性ｇ１２Ｌタンパク質及び細胞へ導入されたｇ１２Ｌをコードする核酸分
子が含まれる。その他の実施態様では、この薬剤はｇ１２Ｌタンパク質活性の一
つ又は複数を阻害する。そのような阻害剤には、アンチセンスｇ１２Ｌ核酸分子
及び抗-ｇ１２Ｌ抗体が含まれる。これら調節法は、インビトロ（例えば、細胞
を薬剤とともに培養する）、又はそれに代わってインビボ（例えば、被検体へ薬
剤を投与すること）でおこなうことができる。従って、本発明は、ｇ１２Ｌタン
パク質又は核酸分子の異常な発現又は活性によって特徴付けられる疾病又は疾患
に罹っている個体の治療方法を提供する。一実施態様では、この方法には、薬剤
（例えば、ここで記載されているスクリーニングアッセイによって同定される薬
剤）、又はｇ１２Ｌ発現又は活性を調節する（例えば、上方制御又は下方制御す
る）薬剤の組み合わせを投与することが含まれる。その他の実施態様では、この
方法には、減少した又は異常なｇ１２Ｌ発現又は活性を補う療法としてのｇ１２
Ｌタンパク質又は核酸分子の投与が含まれる。

【０２２６】 ｇ１２Ｌ活性の刺激は、ｇ１２Ｌが異常に下方制御されている、及び／又は増
大したｇ１２Ｌ活性が有益な効果を有する傾向にある状況において所望される。
そのような状況の一例は、被検体が異常な細胞増殖及び／又は分化（例えば、癌
又は免疫関連疾患）によって特徴付けられる疾患を有する。そのような状況のそ
の他の例は、被検体が妊娠病（例えば、子癇前症）を有する。

【０２２７】 療法の生物学的効果の決定 本発明の種々の実施態様では、適切なインビトロ又はインビボアッセイをおこ
ない、特定の療法の効果と、その投与が病気に冒された組織の治療にとって望ま
しいものなのかどうかを決定する。 種々の特定の実施態様では、所定の療法が、細胞型に対して所望される効果を
発揮するかどうかを決定するために、インビトロアッセイを、患者の疾患に関わ
っている代表的な細胞の型でおこなってもよい。療法で使用される化合物は、ヒ
トの被検者で試験する前に、限定されるものではないが、ラット、マウス、ニワ
トリ、ウシ、サル、ウサギ等を含む適切な動物モデル系で試験してもよい。同じ
ように、インビボ試験では、ヒト被検者へ投与する前に、当該分野で知られた任
意の動物モデル系を使用してもよい。

【０２２８】 本発明の組成物の予防的及び治療的用途 本発明のｇ１２Ｌ核酸及びタンパク質は、限定されるものではないが：代謝疾
患及び疾病、例えば肥満及び肥満関連疾患、糖尿病、及び悪液質；細胞増殖疾患
及び疾病、例えば過形成、癌、及び再狭窄；神経変性疾患及び疾病、例えばアル
ツハイマー病及びパーキンソン病；免疫疾患及び疾病、例えばＡＩＤＳ、炎症、
及び自己免疫疾患；そして造血性疾患及び疾病、例えばＳＣＩＤ、周期性好中球
減少症、及び血小板血症を含む種々の疾患に関する潜在的な予防的及び治療的用
途において有用である。

【０２２９】 例えば、本発明のｇ１２Ｌタンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に
おいて有用であり、そのタンパク質は、それを必要としている被検体へ投与する
場合に有用であり得る。限定されない例によると、本発明の組成物は、代謝疾患
及び疾病、例えば肥満及び肥満関連疾患、糖尿病、及び悪液質；細胞増殖疾患及
び疾病、例えば過形成、癌、及び再狭窄；神経変性疾患及び疾病、例えばアルツ
ハイマー病及びパーキンソン病；免疫疾患及び疾病、例えばＡＩＤＳ、炎症、及
び自己免疫疾患；そして造血性疾患及び疾病、例えばＳＣＩＤ、周期性好中球減
少症、及び血小板血症に苦しんでいる患者の治療に関して有効性を有する。

【０２３０】 ｇ１２Ｌタンパク質をコードする新規な核酸、及び本発明のｇ１２Ｌタンパク
質、又はその断片の双方は、核酸又はタンパク質の存在又は量が評価される、診
断的用途においても有用であり得る。さらなる用途は、抗-細菌分子（すなわち
、抗-細菌特性を有することが見出されている幾つかのペプチド）としてである
。これらの物質は、治療的又は診断的方法の用途のための本発明の新規物質と、
免疫特異的に結合する抗体の生成にとってさらに有用である。

【０２３１】 実施例 以下の実施例は、限定されない例によって、本発明の種々の側面を例示する。 ＢＡＴ分化の間の差次的に制御されているSpot14に関する場合のように、ＢＡ
Ｔの代謝活性及び増殖に影響を与える条件下で、マウスｇ１２ＬもＢＡＴにおい
て調節される。ＢＡＴにおける差次的に発現された遺伝子の同定に関する実験的
条件下では、ｃＤＮＡ（マウスｇ１２ＬをコードするｍＲＮＡを表す）の断片は
、低温度（４℃）に応答して調節された。上記にて示された実験的条件下で飼育
された動物のＢＡＴのｃＤＮＡ断片に関して観察された調節のパターンは、寒さ
順化対コントロールでは上方制御、暖かさ順化対コントロールでは変化はなく、
そして寒さ順化対暖かさ順化では上方制御であった。マウスｇ１２ＬのTaqMan誘
導組織分布は、暖かさに順化させた動物の同じ組織に対して、マウスタンパク質
発現が、ＷＡＴ及びＢＡＴにおいて、寒さに応答して顕著に上昇することを示し
た。

【０２３２】 調節された断片の同定は、予想分子量が２０３５５．６Ｄ，予想ｐＩ＝５．３
３、そして表３に示す予想物理的特性の１８２アミノ酸タンパク質（表２Ｂ；配
列番号：４）をコードする完全長マウスｃＤＮＡ（表２Ａ；配列番号：３）の同
定につながる。 ヒトタンパク質ホモログ（表１Ｂ；配列番号：２）も、１８３アミノ酸、２０
２３３．５Ｄ、予想ｐＩ＝５．５５，そして他の予想物理的特性（表４）として
同定された。最適ｃＤＮＡは、公的及び私的データベースからの８５ＥＳＴｓの
構築によって決定された（表１Ａ；配列番号：１）。マウスのｐＩ、ゼブラフィ
ッシュｇ１２タンパク質のヒトホモログ、及びゼブラフィッシュｇ１２（予想ｐ
Ｉ＝４．９３）タンパク質は、ｇ１２Ｌファミリーメンバーと比較すると、Spot
14（Grillasca, FEBS Lett. 1997 Jan 13; 401(1)38-42）のより多数の酸高含有
ドメインのために、Spot14ファミリータンパク質（ラットSpot14 pI=4.61, マウ
スSpot14 pI=4.76, ヒトSpot14 pI=4.64）より、よりアルカリ性が予測されるｐ
Ｉを有する。これと他のデータは、ここで記載の新規のマウス及びヒトｇ１２Ｌ
分子がゼブラフィッシュ原腸形成特異的タンパク質ｇ１２の本物のホモログであ
るという論点を支持する。

【０２３３】 配列分析は、ｇ１２ファミリーメンバーが、Spot14ファミリーメンバーのメン
バーに関して観察される「スポットボックス」及び「酸ボックス」を有すること
を示す（図．１）。ｇ１２ファミリーメンバーは、スポットボックスの直後に保
存された挿入部（ゼブラフィッシュの挿入部は、マウス及びヒトｇ１２Ｌの挿入
部よりも極めて小さい）を、そしてマウス配列のアミノ酸５４の直後に二番目に
高く保存されている挿入部を有する。ｇ１２ファミリーメンバーは、Spot14ファ
ミリーメンバーと比較して、いくらかより低い酸性の酸ボックス（マウスSpot14
ポリペプチドのアミノ酸８７−１１４）を有する（図．１）。この低下した酸ボ
ックスは、Spot14ファミリーメンバーと比較して、ｇ１２ファミリーメンバーの
相対的により高いｐＩの原因となる。 マウス及びヒトｇ１２Ｌは、タンパク質レベルとヌクレオチド配列のレベルの
双方において、Spot14のｇ１２よりもゼブラフィッシュのｇ１２により類似して
いる。 マウスｇ１２Ｌは、放射線ハイブリッドマッピングによって染色体Ｘの位置DX
Mit89に位置付けられている。ヒトｇ１２Ｌ遺伝子は、染色体Ｘ上に見出され、G
eneBank AK001428（DDBJ/EMBL/GenBankへ提出されている（16-FEB-2000））。

【０２３４】

【０２３５】

【０２３６】 要約すると、発明者は、代謝状態への応答において調節され、熱状態に応答性
の遺伝子を同定する手段としての熱中立帯で飼育した動物の熱状況に応答する新
規マウス及びヒト遺伝子を同定している。そのような分子は、ＢＡＴの内分泌性
の性質とその体温調節及び代謝における役割、及び体温調節及び代謝への応答性
に関連することが考慮されている。

【０２３７】 相当語句 特定の実施態様の詳細がここで開示されているが、これは、例示のみの目的の
ための例によってなされ、後の添付された請求項に関して限定することを意図し
ていない。特に、発明者によって、請求項によって定義される本発明の精神及び
目的から外れることなく、種々の置換、改変、及び修飾が発明に施される得るこ
とが考慮されている。核酸出発物質、対象のクローン、又はライブラリの型の選
択は、ここに記載の実施態様の知識を伴う当該分野で普通の技術を有する者にと
って日常的な問題である。他の側面、利点、及び修正点が、以下の請求項の範囲
内にあると考えられた。

【図面の簡単な説明】

【図１】 複数の配列分析によって、Spot 14's及びｇ１２'sは異なるが、関
連したタンパク質のファミリーであることを示す。囲いの領域は、「スポットボ
ックス」の位置であり、下線領域は、２つの遺伝子ファミリーの「酸性ボックス
」を示す。mSpot14＝マウスSpot 14（GenBank X95279；配列番号：５）、rnSpot
14＝rat Spot14（GenBank NM_003251；配列番号：６）、hsSpot 14＝ヒト Spot
14（GenBank Y08409；配列番号：７）、hsdrg 12like＝ヒトｇ１２Ｌ（配列番号
：２）、mmdrg12like＝マウスｇ１２Ｌ（配列番号：４）、及びdrg12＝ゼブラフ
ィッシュ ｇ１２（GenBank U27121；配列番号：８）。

【図２】 マウスｇ１２ＬモジュレーターのTaqManタイムコース。

【図３】 TaqMan分析による、４℃、２２℃及び３３℃で４８時間にわたって
順応させたマウスｇ１２Ｌの組織分布。

【図４】 Spot14's、ゼブラフィッシュｇ１２、並びにヒト及びマウスｇ１２
Ｌ'sの相対タンパク質ホモロジー。

【図５】 Spot14's、ゼブラフィッシュｇ１２、並びにヒト及びマウスｇ１２
Ｌ'sの相対ｃＤＮＡホモロジー。

【図６】 マウスｇ１２Ｌの放射線ハイブリッドマップ。マウス１２Ｌは、染
色体Ｘのセントロメア近傍に位置している。放射線ハイブリッドマップベクター
を、 １４のロッドスコアのカットオフで、米国マサチューセッツ工科大学ホワ
イトヘッド研究所Center for Genome Research's radiation hybrid map of the
mouse genomeへ提示した。データのフォーマットは、ホワイトヘッドの慣例に
よって、９３のハイブリッドを使用した（http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-b
in/mouse_rh/rhmap-auto/rhmapper.cgi.）。i0q0-90.5は、マウスｇ１２Ｌに関
する識別バンドである。Cybbはチトクロームｂ２４５（GenBank U43384）であり
、Ｘｋｈ（GenBank AF155511）は ＸＫ遺伝子のマウスホモログである。スケー
ルは７１．５ｃＲ／ｃＭ。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 3/04 ４Ｃ０８４ Ａ６１Ｐ 1/16 １０５ 3/06 ４Ｃ０８５ 3/04 3/10 ４Ｃ０８６ 3/06 7/00 ４Ｈ０４５ 3/10 9/10 7/00 １０３ 9/10 9/12 １０３ 11/16 9/12 19/02 11/16 25/16 19/02 25/28 25/16 29/00 25/28 31/18 29/00 35/00 31/18 37/02 35/00 43/00 １０５ 37/02 Ｃ０７Ｋ 14/46 43/00 １０５ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/46 16/18 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/21 1/48 Ｚ 5/10 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/48 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｍ 33/50 33/566 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 レビン，ディビッド，エイ． アメリカ合衆国 コネチカット 06511， ニューヘーブン，ローレンス ストリート 298 (72)発明者 アダムス，ショーン，エイチ． アメリカ合衆国 ニュージャージー 07869，ランドルフ タウンシップ，アル デバラン ドライブ 22 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA09 EA04 GA11 HA17 4B063 QA01 QA18 QQ03 QQ08 QQ13 QQ20 QQ42 QQ53 QQ79 QR08 QR32 QR55 QR77 QR80 QS34 QS38 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 4B065 AA26X AA80X AA90X AA90Y AA91X AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA02 AA03 AA07 AA13 BA35 BA44 CA53 MA13 MA17 MA22 MA23 MA24 MA28 MA31 MA35 MA36 MA37 MA38 MA52 MA57 MA59 MA60 MA63 MA66 NA14 ZA162 ZA222 ZA402 ZA422 ZA512 ZA702 ZA772 ZA962 ZB072 ZB112 ZB212 ZB262 ZC212 ZC332 ZC352 ZC412 ZC552 4C085 AA13 AA14 AA16 BB11 BB36 BB41 BB43 BB44 CC02 CC04 CC05 CC12 CC17 CC22 DD22 DD23 DD33 DD35 DD41 DD43 DD63 DD86 DD88 EE01 EE06 FF02 FF03 FF13 FF14 FF20 GG02 GG04 GG05 GG08 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 MA13 MA17 MA22 MA23 MA24 MA28 MA31 MA35 MA36 MA37 MA52 MA57 MA59 MA60 MA63 MA66 NA14 ZA16 ZA22 ZA36 ZA40 ZA42 ZA51 ZA70 ZA77 ZA96 ZB07 ZB09 ZB11 ZB21 ZB26 ZB33 ZC21 ZC33 ZC35 ZC41 ZC55 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 BA41 CA40 DA75 DA76 EA20 FA74

Claims (53)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）配列番号：２及び４から成る群から選択されたアミノ酸
   配列の成熟型； （ｂ）配列番号：２及び４から成る群から選択されたアミノ酸配列の成熟型の変
   異体であって、前記変異体が前記成熟型のアミノ酸配列とわずか１５％のアミノ
   酸残基が異なるという条件で、前記変異体の一つ又は複数のアミノ酸残基が、前
   記成熟型のアミノ酸配列と異なる変異体； （ｃ）配列番号：２及び４から成る群から選択されるアミノ酸配列；及び （ｄ）配列番号：２及び４から成る群から選択されるアミノ酸配列の変異体であ
   って、前記変異体が前記アミノ酸配列とわずか１５％のアミノ酸残基が異なると
   いう条件で、前記変異体の一つ又は複数のアミノ酸残基が成熟型のアミノ酸配列
   と異なる変異体：から成る群から選択されたアミノ酸配列を含んでなる単離され
   たポリペプチド。
2. 【請求項２】 ポリペプチドが配列番号：２及び４から成る群から選択される
   アミノ酸配列の天然発生対立遺伝子変異体のアミノ酸配列を含む、請求項１のポ
   リペプチド。
3. 【請求項３】 前記対立遺伝子変異体が、配列番号：１及び３から成る群から
   選択された核酸配列から一つヌクレオチドが異なる核酸配列の翻訳であるアミノ
   酸配列を含む、請求項２のポリペプチド。
4. 【請求項４】 前記変異体のアミノ酸配列が保存的アミノ酸置換を含む、請求
   項１のポリペプチド。
5. 【請求項５】 （ａ）配列番号：２及び４から成る群から選択されるアミノ酸
   配列の成熟型； （ｂ）配列番号：２及び４から成る群から選択されるアミノ酸配列の成熟型の変
   異体であって、前記変異体が前記成熟型のアミノ酸配列とわずか１５％のアミノ
   酸残基が異なるという条件で、前記変異体の一つ又は複数のアミノ酸残基が前記
   成熟型のアミノ酸配列と異なる変異体； （ｃ）配列番号：２及び４から成る群から選択されるアミノ酸配列； （ｄ）配列番号：２及び４から成る群から選択されるアミノ酸の変異体であって
   、前記変異体が前記アミノ酸配列とわずか１５％のアミノ酸残基が異なるという
   条件で、前記変異体の一つ又は複数のアミノ酸残基が、前記成熟型のアミノ酸配
   列と異なる変異体； （ｅ）少なくとも配列番号：２及び４から成る群から選択されるアミノ酸配列を
   含んでなるポリペプチドの少なくとも一部分、又は前記ポリペプチドの変異体を
   コードする核酸断片であって、前記変異体が前記アミノ酸配列とわずか１５％の
   アミノ酸残基が異なるという条件で、前記変異体の一つ又は複数のアミノ酸残基
   が、前記成熟型のアミノ酸配列と異なる変異体。 （ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）の相補鎖を含んでなる核酸分
   子。
6. 【請求項６】 核酸分子が天然発生対立遺伝子核酸変異体のヌクレオチド配列
   を含む、請求項５の核酸分子。
7. 【請求項７】 核酸分子が、天然発生ポリペプチド変異体のアミノ酸配列を含
   んでなるポリペプチドをコードする、請求項５の核酸分子。
8. 【請求項８】 核酸分子が、配列番号：１及び３から成る群から選択される核
   酸配列から一つのヌクレオチドが異なる、請求項５の核酸分子。
9. 【請求項９】 前記核酸分子が、 （ａ）配列番号：１及び３から成る群から選択されるヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号：１及び３から成る群から選択されるヌクレオチド配列と一つ又
   は複数のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列であって、前記ヌクレオチド配
   列とわずか２０％のヌクレオチドが異なるという条件で； （ｃ）（ａ）の核酸断片；及び （ｄ）（ｂ）の核酸断片：から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、
   請求項５の核酸分子。
10. 【請求項１０】 前記核酸分子が、緊縮な条件下で、配列番号：１及び３から
    成る群から選択されるヌクレオチド配列、又は前記ヌクレオチド配列の相補鎖と
    ハイブリダイズする、請求項５の核酸分子。
11. 【請求項１１】 核酸分子が、 （ａ）前記アミノ酸配列をコードするコード化配列から一つ又は複数のヌクレオ
    チドが異なっているコード化配列を含んでなる第一のヌクレオチドであって、前
    記第一のヌクレオチド配列のコード化配列のヌクレオチドのわずか２０％が前記
    コード化配列と異なる条件の前記第一のヌクレオチド配列、 （ｂ）第一のポリヌクレオチドの相補鎖である単離された第二のポリヌクレオチ
    ド；及び （ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸断片：から成る群から選択されるヌクレオチド配
    列を含む、請求項５の核酸分子。
12. 【請求項１２】 請求項１１の核酸分子を含んでなるベクター。
13. 【請求項１３】 前記核酸分子と作用可能に連結している、プロモーターをさ
    らに含んでなる請求項１２のベクター。
14. 【請求項１４】 請求項１２のベクターを含んでなる細胞。
15. 【請求項１５】 請求項１のポリペプチドと免疫特異的に結合する抗体。
16. 【請求項１６】 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１５の抗体。
17. 【請求項１７】 抗体がヒト化抗体である、請求項１５の抗体。
18. 【請求項１８】 試料中に請求項１のポリペプチドの存在又は量を測定する方
    法であって、（ａ）試料を提供し； （ｂ）ポリペプチドと免疫特異的に結合する抗体と試料を接触させ；及び （ｃ）前記ポリペプチドと結合する抗体の存在又は量を測定し、それによって前
    記試料中のポリペプチドの存在又は量を測定する方法：を含んでなる方法。
19. 【請求項１９】 試料中に請求項５の核酸分子の存在又は量を測定する方法で
    あって、（ａ）試料を提供し； （ｂ）前記核酸分子と結合するプローブと試料を接触させ；及び （ｃ）前記核酸分子と結合するプローブの存在又は量を測定し、それによって前
    記試料中の核酸分子の存在又は量を測定する方法：を含んでなる方法。
20. 【請求項２０】 核酸分子の存在又は量が、細胞又は組織型のマーカーとして
    使用される、請求項１９の方法。
21. 【請求項２１】 細胞及び組織型が癌牲である、請求項２０の方法。
22. 【請求項２２】 請求項１のポリペプチドと結合する薬剤を同定する方法であ
    って、 （ａ）前記ポリペプチドと前記薬剤を接触させ；及び （ｂ）前記薬剤が前記ポリペプチドと結合するか否かを決定すること：を含んで
    なる方法。
23. 【請求項２３】 薬剤が細胞性レセプター又は下流エフェクターである、請求
    項２２の方法。
24. 【請求項２４】 請求項１のポリペプチドの発現又は活性を調節する薬剤を同
    定する方法であって、 （ａ）前記ポリペプチドを発現する細胞を提供し； （ｂ）細胞を前記薬剤と接触させ、及び （ｃ）薬剤が前記ポリペプチドの発現又は活性を調節するかどうかを決定するこ
    と、 を含んでなり、それによって、前記ペプチドの発現又は活性の変化が、前記薬剤
    が前記ポリペプチドの発現又は活性を調節することを示す方法。
25. 【請求項２５】 請求項１のポリペプチドの活性を調節する方法であって、前
    記請求項のポリペプチドを発現している細胞試料を、ポリペプチドの活性を調節
    するために十分な量の前記ポリペプチドと結合する化合物と接触させることを含
    んでなる方法。
26. 【請求項２６】 ｇ１２Ｌ関連疾患を治療又は予防する方法であって、そのよ
    うな治療又は予防が所望される被検体へ、該被検体の該ｇ１２Ｌ関連疾患を治療
    し予防するために十分な量の請求項１のポリペプチドを投与することを含んでな
    る方法。
27. 【請求項２７】 疾患が、癌、肥満、肥満関連疾患、糖尿病、及び悪液質から
    成る群から選択される、請求項２６の方法。
28. 【請求項２８】 疾患が代謝に関連している、請求項２６の方法。
29. 【請求項２９】 前記被検体がヒトである、請求項２６の方法。
30. 【請求項３０】 ｇ１２Ｌ関連疾患を治療又は予防する方法であって、そのよ
    うな治療又は予防が所望される被検体へ、該被検体の該ｇ１２Ｌ関連疾患を治療
    又は予防するために十分な量の請求項５の核酸を投与することを含んでなる方法
    。
31. 【請求項３１】 疾患が、癌、肥満、肥満関連疾患、糖尿病、及び悪液質から
    成る群から選択される、請求項３０の方法。
32. 【請求項３２】 疾患が代謝に関連している、請求項３０の方法。
33. 【請求項３３】 前記被検体がヒトである、請求項３０の方法。
34. 【請求項３４】 ｇ１２Ｌ関連疾患を治療又は予防する方法であって、そのよ
    うな治療又は予防が所望される被検体へ、被検体のｇ１２Ｌ関連疾患を治療又は
    予防するために十分な量の請求項１５の抗体を投与することを含んでなる方法。
35. 【請求項３５】 疾患が、癌、肥満、肥満関連疾患、糖尿病、及び悪液質から
    成る群から選択される、請求項３４の方法。
36. 【請求項３６】 疾患が代謝に関連している、請求項３４の方法。
37. 【請求項３７】 被検体がヒトである、請求項３４の方法。
38. 【請求項３８】 請求項１のポリペプチド及び薬学的に許容可能な担体を含ん
    でなる、薬学的な組成物。
39. 【請求項３９】 請求項５の核酸分子及び薬学的に許容可能な担体を含んでな
    る、薬学的組成物。
40. 【請求項４０】 請求項１５の抗体及び薬学的に許容可能な担体を含んでなる
    、薬学的組成物。
41. 【請求項４１】 請求項３８の薬学的組成物を一つ又は複数の容器に含むキッ
    ト。
42. 【請求項４２】 請求項３９の薬学的組成物を一つ又は複数の容器に含むキッ
    ト。
43. 【請求項４３】 請求項４０の薬学的組成物を一つ又は複数の容器に含むキッ
    ト。
44. 【請求項４４】 第一の哺乳動物の被検体における、請求項１のポリペプチド
    の変化したレベルに関連する疾患の存在、又はその疾患の素因を決定する方法で
    あって、 （ａ）第一の哺乳動物被検体の試料中のポリペプチドの発現のレベルを測定し；
    及び （ｂ）段階（ａ）の試料中の前記ポリペプチドの量を、前記疾患を有しない、又
    はその疾患に罹りやすくないことが知られている第二の哺乳動物被検体のコント
    ロール試料に存在するポリペプチドの量と比較することを含んでなる、コントロ
    ール試料と比較した第一被検体のポリペプチドの発現レベルにおける変化が、前
    記疾患の存在、又はその疾患の素因を示す方法。
45. 【請求項４５】 素因が癌である、請求項４４の方法。
46. 【請求項４６】 第一の哺乳動物被検体における、請求項５の核酸分子の変化
    したレベルに関連する疾患の存在、又はその疾患の素因を決定する方法であって
    、 （ａ）第一の哺乳動物被検体からの試料の核酸の量を測定すること；及び （ｂ）段階（ａ）の試料中の前記核酸の量と、前記疾患を有しない、又はその疾
    患に罹りやすくないことが知られている第二の哺乳動物被検体のコントロール試
    料に存在する核酸の量と比較すること；を含んでなる、第一の被検体中の核酸の
    レベルの変化とコントロール試料との比較が、疾患の存在又はその疾患の素因を
    示す方法。
47. 【請求項４７】 素因が癌である、請求項４６の方法。
48. 【請求項４８】 哺乳動物における病的症状を治療する方法であって、ポリペ
    プチドが、配列番号：２及び４の少なくとも一つのアミノ酸配列を有するポリペ
    プチドに少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、又はその生物学的に
    活性な断片である、病的症状を緩和するために十分な量のポリペプチドを哺乳動
    物へ投与することを含んでなる方法。
49. 【請求項４９】 哺乳動物の病的症状を治療する方法であって、病的状態を緩
    和するのに十分な量の請求項１５の抗体を哺乳動物へ投与することを含んでなる
    方法。
50. 【請求項５０】 前記化合物のｇ１２Ｌ転写上流制御又は下流制御活性を測定
    する方法であって、前記化合物とＲＮＡポリメラーゼ及び請求項５のポリヌクレ
    オチドを含んでなる組成物を接触させることを含んでなる方法。
51. 【請求項５１】 前記組成物が細胞内にある、請求項５０の方法。
52. 【請求項５２】 化合物とリボゾーム及び請求項５のポリヌクレオチドを含ん
    でなる組成物を接触させることを含んでなる、前記化合物のｇ１２Ｌ転写上流制
    御又は下流制御活性を測定する方法。
53. 【請求項５３】 前記組成物が細胞内にある、請求項５２の方法。