JP2003511076A - 大動脈カルボキシペプチダーゼ様タンパク質およびそれをコードする核酸 - Google Patents

大動脈カルボキシペプチダーゼ様タンパク質およびそれをコードする核酸

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JP2003511076A JP2001530493A JP2001530493A JP2003511076A JP 2003511076 A JP2003511076 A JP 2003511076A JP 2001530493 A JP2001530493 A JP 2001530493A JP 2001530493 A JP2001530493 A JP 2001530493A JP 2003511076 A JP2003511076 A JP 2003511076A
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Abstract

(57)【要約】 大動脈カルボキシペプチダーゼ関連ポリペプチドをコードする核酸、これらの核酸によってコードされるポリペプチド、およびこれらの核酸およびポリペプチドを用いる方法が開示される。１つの実施形態において、ＡＣＰＬＸタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、ＡＣＰＬＸタンパク質は、配列番号２に実質的に相同であり、そして以下に詳細に議論されるように、天然の対立遺伝子改変体または変異誘発に起因してアミノ酸配列が異なるが、配列番号２のタンパク質の機能的活性を保持する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、該してポリヌクレオチドおよびそれらによりコードされるポリペプ
チドに関する。本発明は、より具体的には、ヒト大動脈カルボキシペプチダーゼ
に関連するポリペプチドをコードするヌクレオチドに関する。
【０００２】 （発明の背景） カルボキシペプチダーゼは、ポリペプチド鎖の遊離カルボキシ（Ｃ）末端にお
いてアミノ酸を除去するヒドロラーゼ酵素のファミリーである。カルボキシペプ
チダーゼファミリーのメンバーは、複数の生物学的活性に関与している。
【０００３】 カルボキシペプチダーゼは、メタロカルボキシペプチダーゼの少なくとも２つ
のサブファミリーに分けることができる。１つのサブファミリーとしては、カル
ボキシペプチダーゼ様サブファミリーが挙げられる。そのメンバーとしては、例
えば、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＡ２、カルボキシペ
プチダーゼＢおよびカルボキシペプチダーゼＢ２が挙げられる。
【０００４】 第２のサブファミリーとしては、調節Ｂ型カルボキシペプチダーゼが挙げられ
る。このメンバーとしては、例えば、カルボキシペプチダーゼＨ、カルボキシペ
プチダーゼＭ、カルボキシペプチダーゼＮ、カルボキシペプチダーゼＶ、ＡＥＢ
Ｐ１、ＡＣＰＬＸ、Ｍｓ ＣＰＸ１およびＭｓＣＰＸが挙げられる。このサブフ
ァミリーのメンバーは、ポリペプチドホルモンプロセシング活性およびカルボキ
シ末端アルギニン残基を有する細胞性ペプチドのプロセシングを含む活性に関与
する。さらに、血管平滑筋細胞（例えば、大動脈滑筋細胞）の表面に存在するカ
ルボキシペプチダーゼは、生物学的に活性な血管作用性ペプチド（例えば、血管
の正常状態（ｔｏｎｅ）および管腔の直径に影響を及ぼす、ブラジキニン、アン
ギオテンシンＩＩ）のレベルに複雑な影響を与えることが報告されている。カル
ボキシペプチダーゼはまた、血管作用性ペプチドの異化不活性化を担うことが報
告されている。
【０００５】 本発明は、カルボキシペプチダーゼの上記されたメンバーに類似の配列を有す
るポリペプチドをコードする新規ヒト核酸配列の発見に基づく。本明細書中に記
載される、この大動脈カルボキシペプチダーゼ様核酸、ポリヌクレオチド、タン
パク質およびポリペプチドまたはそれらのフラグメントは、ＡＣＰＬＸ核酸およ
びポリペプチドと集合的にいわれる。ＡＣＰＬＸ核酸としては、配列番号１に見
出される核酸を含み、そしてポリペプチドは配列番号２によりコードされる。
【０００６】 従って、本発明の１つの局面は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された大動脈カルボキシペプチダー
ゼ様核酸分子を含む。種々の実施形態では、この核酸分子は、配列番号１を含む
ヌクレオチド配列を含み得る。あるいは、コードされる大動脈カルボキシペプチ
ダーゼ様タンパク質（ＡＣＰＬＸ）は、改変体アミノ酸配列を保有し得、これに
より開示されたアミノ酸配列に対して１００％未満の同一性または類似性を有し
得る。
【０００７】 本発明はさらに、配列番号２のアミノ酸を含む単離されたポリペプチドを含む
。配列番号２により提供される、アミノ酸配列の成熟形態の改変体、またはその
アミノ酸の改変体もまた含まれる。種々の実施形態では、配列中の１５％、１０
％、９％、８％、５％、３％、２％または１％以下のアミノ酸残基が、異なるア
ミノ酸に変更される。
【０００８】 本発明はまた、ＡＣＰＬＸに免疫特異的に結合する抗体をさらに含む。好まし
い実施形態では、モノクローナルであり、かつヒト起源である。このような抗体
は、被検体における病理学的状態を処置する際に最も有用であり、ここでこの処
置は、被検体に抗体を投与することを含む。
【０００９】 本明細書中に記載される、核酸分子が発現される条件下で、大動脈カルボキシ
ペプチダーゼ様核酸を発現する宿主細胞を培養することによりＡＣＰＬＸを産生
する方法もまた、本発明に含まれる。
【００１０】 本発明はまた、ペプチドの１つに免疫特異的に結合する抗体を哺乳動物由来の
サンプルを導入し、次いでそのサンプル中の抗体およびポリペプチドを含む反応
複合体の形成を検出することにより、哺乳動物（例えば、ヒト）由来のサンプル
中の大動脈カルボキシペプチダーゼ様ポリペプチドの存在を検出する方法をさら
に含む。サンプル中の複合体の形成を検出することは、このサンプル中のポリペ
プチドの存在を示す。
【００１１】 本発明はまた、核酸に選択的に結合する核酸プローブを哺乳動物由来のサンプ
ルに導入し、次いでその核酸がサンプル中の核酸分子に結合するか否かを決定す
ることにより、哺乳動物（例えば、ヒト）由来のサンプル中の大動脈カルボキシ
ペプチダーゼ様ポリペプチドの存在を検出する方法をさらに含む。サンプル中の
複合体の形成を検出することは、このサンプル中のポリペプチドの存在を示す。
核酸プローブの結合は、その核酸分子がサンプル中に存在することを示す。
【００１２】 本発明はまたさらに、哺乳動物（例えば、ヒト）由来の大動脈カルボキシペプ
チダーゼ様核酸の変更されたレベルと関連する病理の処置における使用のための
潜在的な治療剤を同定する方法をなお含む。この方法は、治療剤の候補物質であ
る化合物をこのポリペプチドを発現する細胞へ導入することを含む。候補物質の
特性または機能が細胞の存在下で変更される場合、この物質は、潜在的な治療剤
として同定される。
【００１３】 本発明はまた、病理学的状態を緩和するに十分な量で、ＡＣＰＬＸを被検体へ
投与することにより、本明細書中に記載されるポリペプチドに関連する、哺乳動
物（例えば、ヒト）における病理学的状態を処置または予防する方法を含む。あ
るいは、哺乳動物は、本明細書中に記載される抗体を、病理学的状態を緩和する
に十分な量で投与することにより処置し得る。
【００１４】 本発明の処置の方法が想定される病理学的状態としては、例えば、癌（乳癌お
よび卵巣癌）、高血圧障害、血管内皮障害（例えば、アテローム性動脈硬化症）
、バソプレシン−ニューロフィシン プレ−ホルモン産物のプロセシングおよび
／または輸送が挙げられる。
【００１５】 他に規定されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および化学用
語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する
。本明細書中に記載される方法および材料と類似するかまたは等価な方法および
材料が、本発明を実施するかまたは試験するために使用され得るが、適切な方法
および材料が、以下に記載される。本明細書中に記載される全ての刊行物、特許
出願、特許および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。コンフリ
クトの場合、本明細書（定義を含む）は制御される。さらに、材料、方法および
実施例は、例示のみであり、そして限定することは意図されない。
【００１６】 本発明の他の特色および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から
明らかである。
【００１７】 （発明の詳細な説明） 本発明は、大動脈カルボキシペプチダーゼ様タンパク質ファミリーの新規メン
バーをコードする核酸を提供する。新規大動脈カルボキシペプチダーゼに関する
核酸およびポリペプチドは、本明細書中で該して、ＡＣＰＬＸ核酸およびポリペ
プチドといわれる。２３８２ヌクレオチド長の核酸（配列番号１）が、本発明の
含まれる。この配列は、図１に示され、そしてまた本明細書中でＡＬ０３５４６
０Ａといわれる。
【００１８】 １０１〜２３０５の２，２０５ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム
（「ＯＲＦ」）は、図１に示される核酸配列中に存在する。このＯＲＦは、ヌク
レオチド１０１におけるａｔｇ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド２３０
５において始まるｔｇａコドンで終結する。開始コドンから上流の推定非翻訳領
域は、図１において下線を付される。開始コドンおよび終結コドンは、太字であ
る。ＯＲＦは、７３４アミノ酸残基のポリペプチド（配列番号２）（「ＡＬＯ３
５４６０＿ＧＥＮＥＳＣＡＮ＿ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ＿ｐｅｐ」）をコードする。
コードされるポリペプチドの配列は、図２に示される。
【００１９】 開示されるＡＣＰＬＸ核酸配列は、２３７９ｂｐのＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ メタロカルボキシペプチダーゼＣＰＸ−１ ｍＲＮＡ（ＧＥＮＥＢＡＮＫ−Ｉ
Ｄ：ＡＦ０７７７３８）に対して２１２９塩基のうち１７６０において同一（８
２％同一性）である。この相同性は、ＡＬ０３５４６０Ａの配列の塩基７３と２
２０１との間、ならびにＡＦ０７７７３８の配列の塩基１１２と２２３６との間
に存在する。
【００２０】 コードされるアミノ酸配列はまた、７２２残基のポリペプチドである、マウス
メタロカルボキシペプチダーゼＣＰＸ−１（ＳＰＴＲＥＭＢＬ ＡＣＣ：Ｑ９Ｚ
１００）に関する。コードされるＡＣＰＬＸポリペプチドの７３３残基のうち６
２２（８４％）は、マウスメタロカルボキシペプチダーゼＣＰＸ−１ポリペプチ
ドに同一であり、７７３残基のうち６６１（９０％）ポジティブである。開示さ
れるＡＣＰＬＸポリペプチド配列は、ＡＣＣ：Ｑ９Ｚ１００において見出されな
いさらなる残基を含む。開示されるＡＣＰＬＸポリペプチドはまた、７４６残基
のマウスカルボキシペプチダーゼＸ２（ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ５４８６
０）に関する配列を含む。開示されるＡＣＰＬＸポリペプチドの領域４１〜７３
３およびマウスカルボキシペプチダーゼＸ２の残基６１〜７５９について、６９
８残基のうち３７７（５４％）は、同一であり、そして６９８残基のうち４８６
（６９％）はポジティブである。
【００２１】 開示されるＡＣＰＬＸポリペプチドと他のカルボキシペプチダーゼファミリー
のメンバーとの間の多重配列整列は、図３Ａおよび３Ｂに示される。マウスＡＥ
ＢＰ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号＿）（「Ｑ６１２８１」）、（「
Ｑ１４１１３」）、マウス大動脈カルボキシペプチダーゼ様２ポリペプチド（配
列番号＿）（「Ｏ８８４４２」）、マウスカルボキシペプチダーゼＸ２ポリペプ
チド（配列番号＿）（「Ｏ５４８６０」）および本発明のＡＣＰＬＸポリペプチ
ド（配列番号２）の比較が示される。
【００２２】 開示されるＡＣＰＬＸポリペプチドは、Ｑ６１２８１タンパク質に対して、３
６６残基のうち２０２（５５％）で同一であり、そしてそれと３６６残基のうち
２６０（７１％）でポジティブである。Ｑ６１２８１タンパク質は、Ｎａｔｕｒ
ｅ３７８：９２〜９６，１９９５に記載される。
【００２３】 開示されるＡＣＰＬＸポリペプチドは、Ｑ１４１１３タンパク質に対して、４
０８残基のうち２８６（５４％）で同一であり、そしてそれと４０８残基のうち
２８６（７０％）でポジティブである。Ｑ１４１１３タンパク質は、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２２８：４４１〜１４，１９９６に記載される。
【００２４】 開示されるＡＣＰＬＸポリペプチドは、Ｏ８８４４２タンパク質に対して、６
２３残基のうち３３４（５３％）で同一であり、そしてそれと６２３残基のうち
４３３（６９％）でポジティブである。Ｑ８８４４２タンパク質は、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１５６５４〜６０，１９９８に記載される。
【００２５】 開示されるＡＣＰＬＸポリペプチドは、Ｏ５４８６０タンパク質に対して、６
９８残基のうち３７７（５４％）で同一であり、そしてそれと６９８残基のうち
４８６（６９％）でポジティブである。
【００２６】 図４は、開示されるＡＣＰＬＸポリペプチドがまた、マウスＣＰＸ−１に高度
に類似することを示す。マウスＣＰＰＸ１ポリペプチド（ＡＦＯ７７７３８）お
よびＡＣＰＬＸポリペプチド（配列番号２）（「ＡＬＯ３５４６０＿ＧＥＮＥＳ
ＣＡＮ＿ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ＿ｐｅｐ」）のアミノ酸配列中の同一の領域および
保存的アミノ酸置換の領域を示す比較が示される。
【００２７】 開示されるＡＣＰＬＸポリペプチド配列は、複数のドメインを含む。これらの
ドメインは、図２に示される。これらは、アミノ末端シグナルペプチド様配列、
１６１−残基ジスコイジンドメインおよび亜鉛結合残基を有する２つのカルボキ
シペプチダーゼ（ＣＰ）触媒切断ドメインを含む。この第１のＣＰドメインは、
残基２９９から４０９に存在し、そして第２のＣＰドメインは、残基４２１〜６
８９にわたる。開示されるＡＣＰＬＸポリペプチドがメタロカルボキシペプチダ
ーゼファミリーメンバーの間で高度に保存されるカルシウム結合部位である。
【００２８】 この配列相同性は、ＡＣＰＬＸが、調節Ｂ型カルボキシペプチダーゼサブファ
ミリーのメンバーであり、そして例えば、マウスＣＰＸ−１に対するヒトオルソ
ログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）と考えられ得る。新規ポリペプチドと他の調節Ｂ型カ
ルボキシペプチダーゼとの間の関係は、表Ｉに示される。
【００２９】
【表１】 ＣＰドメインは、触媒活性のために重要であるいくつかの活性部位を各マウス
ホモログである、ＣＰＸ−１と、各々９５および９１％のアミノ酸同一性（表２
を参照のこと）を有する（Ｌｅｉら，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１８：１７
５−８５，１９９９）。ＣＰＸ−１に存在せず、そして本発明のカルボキシペプ
チダーゼ様タンパク質にも存在しないこの触媒活性は、本発明に従うＡＬＣＬＰ
ＬＸポリペプチドが、酵素切断機能を欠き得ることを示す。しかし、亜鉛結合領
域（ほとんどのヒトメトロプロテイナーゼには存在しない）が、本発明のタンパ
ク質およびＣＰＸ−１の両方に存在する。この亜鉛結合領域は、各々、２つのポ
リペプチドのＨ４９８およびＨ４９１における第２の触媒ドメイン内に位置付け
られる。公知ではない、この過剰な亜鉛結合ドメインの機能は、分子上のさらな
る酵素部位として機能し得る。
【００３０】 メタロプロテイナーゼファミリーのメンバーと本発明のＡＬＣＬＰＬＸポリペ
プチドとの間の配列相同性の関係は、表ＩＩに示される。
【００３１】 （表ＩＩ．メタロカルボキシペプチダーゼファミリーのメンバーとＡＬ０３５
４６０＿Ａによってコードされるポリペプチドとの間のタンパク質ドメイン配列
相同性）
【００３２】
【表２】 Ｈｕ＝ヒト Ｍｓ＝マウス ＰＯＯＲ＝全長にわたって５０％以下の一致 Ｔｏｔａｌ＝全長タンパク質配列にわたる％同一性。 残りの値は、特定のドメイン内の％相同性として分類される。 Ｃａ＝カルシウム結合領域。 １stＣＰ＝第１のカルボキシペプチダーゼ触媒ドメイン（残基２９９〜４０９）
。 ２ndＣＰ＝第２のカルボキシペプチダーゼ触媒ドメイン（残基４２１〜６８９）
。 Ｚｅｎ＝第３の触媒亜鉛結合部位の存在（Ｙ）または非存在（Ｎ）。
【００３３】 本発明のタンパク質とヒトカルボキシペプチダーゼファミリーのメンバーとの
間の、第１および第２のＣＰドメインの比較に基づいて、開示されたＡＣＰＬＸ
ポリペプチド（ＡＬ０３５４６０Ａタンパク質）は、カルボキシペプチダーゼＥ
（ｈｕ＿ＣＢＰＨ（Ｅ））と最も配列同一性を共有する。第１および第２のＣＰ
領域に対するパーセント同一性は、それぞれ、７４％および６７％である。ＣＰ
Ｅは、プロホルモンプロセシング酵素であり、そしてその前駆体プロインスリン
からのインスリンの産生を担う。ＣＰＥの変異改変体を発現するマウスは、不都
合なインスリン調節を有し、外因性インスリンを用いた処理によって抑制され得
る肥満および高血糖症の表現型が生じることを伴う（Ｎａｇｇｅｒｔら、Ｎａｔ
ｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．１０：１３５−１４２、１９９５）。
【００３４】 開示されたＡＣＰＬＸポリペプチドは、触媒部位においてｈｕ＿ＣＰＥと同じ
類似性を示すが、開示されたＡＣＰＬＸポリペプチドは、アミノ末端において大
きく異なる。例えば、ジスコイジンドメインは、開示されたＡＣＰＬＸポリペプ
チド中に存在するが、ｈｕ＿ＣＰＥには存在しない。タンパク質上のジスコイジ
ンドメインは、そのタンパク質が、レセプターとリガンドとの間の細胞表面相互
作用を媒介する細胞表面上のコラーゲンと相互作用することを可能にする（Ｖｏ
ｇｅｌ、ＦＡＳＥＢ Ｊ．１３：Ｓ７７−８２、１９９９）。
【００３５】 従って、本発明のカルボキシペプチダーゼ様タンパク質は、細胞表面を媒介す
るプロホルモンプロセシングと相互作用する結合タンパク質として、および／ま
たはホルモンもしくは他のリガンドとそれらのレセプターとの相互作用として機
能し得る。ＡＬ０３５４６０Ａカルボキシペプチダーゼ核酸は、特定の癌（例え
ば、乳癌および卵巣癌）において差示的にダウンレギュレートされる。この配列
の発現分析は、実施例に提供される。従って、このＡＬ０３５４６０Ａ核酸また
はタンパク質は、正常細胞を癌性細胞と区別する際の差示的診断剤として、そし
てこれらの癌の処置における治療剤として使用され得る。
【００３６】 大動脈カルボキシペプチダーゼ様タンパク質をコードする本発明の新規核酸と
しては、その配列が図１に提供されるタンパク質またはそのフラグメントが挙げ
られる。本発明はまた、変異体核酸もしくは改変体核酸、またはこのような核酸
のフラグメントを含み、これらのいずれかの塩基は、図１に示される対応する塩
基から変更され得るが、その大動脈カルボキシペプチダーゼ様活性および生理学
的機能は維持するタンパク質をなおコードする。本発明はさらに、その配列がま
さに記載されたものに相補的である核酸を含む。変異体核酸または改変体核酸に
おいて、１８％まで、または１８％以上の塩基が、そのように変更され得る。
【００３７】 本発明の新規カルボキシペプチダーゼ様タンパク質としては、その配列が図２
に提供されるタンパク質が挙げられる。本発明はまた、変異体タンパク質もしく
は改変体タンパク質、またはこれらの機能フラグメントを含み、これらのいずれ
かの残基は、図２に示される対応する残基から変更され得るが、その大動脈カル
ボキシペプチダーゼ様活性および生理学的機能は維持するタンパク質をなおコー
ドする。変異体タンパク質または改変体タンパク質において、１８％まで、また
は１８％以上の残基が、そのように変更され得る。本発明はさらに、本発明のタ
ンパク質のいずれかに免疫特異的に結合する、抗体または抗体フラグメント（例
えば、Ｆabまたは（Ｆab）2）を含む。
【００３８】 カルボキシペプチダーゼ様タンパク質の核酸およびタンパク質ならびに本発明
のコード核酸は、種々の高血圧障害および／または血管内皮障害に関与する潜在
的な治療適用に有用である。さらなる治療適用は、このタンパク質に帰する推定
プロホルモンプロセシング機能と関連する。例えば、大動脈カルボキシペプチダ
ーゼ様タンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に有用であり得、そして
大動脈カルボキシペプチダーゼ様タンパク質は、その必要がある被験体に投与さ
れる場合、有用であり得る。非限定的な例として、本発明の組成物は、高血圧ま
たはアテローム性動脈硬化症の病態もしくは匹敵する血管病態を患う患者の処置
に対して効果を有する。さらに、本発明の組成物は、プロホルモンプロセシング
における機能不全と関連する状態を処置する際に有用であり得る。大動脈カルボ
キシペプチダーゼ様タンパク質をコードする新規核酸、および本発明のタンパク
質、またはこれらのフラグメントは、診断適用にさらに有用であり得、ここで、
この核酸もしくはタンパク質の存在または核酸もしくはタンパク質の量が、評価
される。これらの物質は、治療方法または診断方法に使用するための本発明の新
規物質に免疫特異的に結合する抗体の産生にさらに有用である。
【００３９】 ＡＬ０３５４６０Ａ中に存在するＡＬＣＬＰＸは、第２０番染色体から得られ
たゲノム配列から誘導された（２０ｐｌ２．３−１３：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ
．ＡＬ０３５４６０）。ＡＬ０３５４６０の遺伝子マッピングにより、ゲノム配
列に関して同じ位置にマップする以下の疾患が明らかになった。従って、ＡＬ０
３５４６０Ａの大動脈カルボキシペプチダーゼ様遺伝子産物が、１つ以上の疾患
：ハレルフォルデン−シュパッツ症候群、尿崩症および／または乳癌および卵巣
癌における腫瘍抑制に役割を果たす。
【００４０】 ハレルフォルデン−シュパッツ症候群（ＨＳＳ）（ＯＭＩＭ＃２３４２００）
は、顕著な知見としては、希有であり、脳の鉄蓄積を伴う常染色体の劣性神経変
性障害である。臨床特徴としては、錐体外路機能不全、小児期での発生、および
過酷な進行性の経過が挙げられる。組織学的研究によって、脳幹神経節における
重症の鉄沈着が明らかになる。全身性および脳脊髄の流動性鉄のレベルは、正常
であり、フェリチン、トランスフェリンおよびセルロプラスミンの血漿レベルも
同様である。逆に、全身性鉄過重の障害（例えば、ヘモクロマトーシス（ｈａｅ
ｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ））において、脳の鉄は、増加せず、これは、脳の
鉄代謝および鉄輸送と全身の鉄代謝および鉄輸送との間に根本的な差異が存在す
ることを示唆する。正常な脳において、非血液の鉄は、局所的に蓄積し、そして
脳幹神経節において最も高い。病的な脳の鉄蓄積は、一般的な障害（パーキンソ
ン病、アルツハイマー病およびハンティングトン病を含む）において見出される
。正常な脳および異常な脳の、鉄輸送、鉄代謝および鉄機能を洞察するために、
本発明者らのアプローチは、ＨＳＳに関して遺伝子をマップすることであった。
第１のゲノムスキャンが、大きな血族ファミリー（ＨＳ１）由来のサンプルを用
いて実行された。このファミリーは、マッピングに関して非常に力強かったが、
全ての影響されたメンバーにおいてホモ接合性を示す領域は、４ｃＭのみに広が
り、連鎖を検出するために非常に近接したマーカーを必要とする。このＨＳＳ遺
伝子は、染色体２０ｐ１２．３−ｐ１３上でＤ２０Ｓ９０６およびＤ２０Ｓ１１
６が隣接する間隔に対してマップされる。連鎖は、多様な民族背景のさらなる９
個のさらなるファミリーにおいて確認された。
【００４１】 尿崩症と関連して、アルギニンバソプレシンおよびその対応するニューロフィ
シンは、通常の前駆体形態で合成され、これは、タンパク質分解によって切断さ
れ、生物学的に機能的なペプチドを生じる（Ｓａｃｈｓら、Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒ
ｏｇ．Ｈｏｒｍ．Ｒｅｓ．２５：４４７−４９１，１９６９）。遺伝性尿崩症を
有するラットは、アルギニンバソプレシンおよびニューロフィシンの１種の両方
の合成を欠く（Ｓｕｎｄｅら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２４８：３
４５−３６４、１９７５）。
【００４２】 ペプチドホルモンアルギニンバソプレシンおよびオキシトシン（ＯＸＴ）の両
方は、そのそれぞれの「キャリア」タンパク質、ニューロフィシンと一緒に視床
下部の視索上核（ＳＯＮ）および室傍核（ＰＶＮ）で合成される（Ｂｒｏｗｎｓ
ｔｅｉｎ，Ｍ．Ｊ．；Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｊ．Ｔ．；Ｇａｉｎｅｒ，Ｈ．Ｓｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ，ｔｒａｎｓｐｏｒｔ，ａｎｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｐｏｓｔｅ
ｒｉｏｒ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｈｏｒｍｏｎｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０７：
３７３−３７８，１９８０）。
【００４３】 バソプレシンおよびオキシトシンは、各核内で大型細胞ニューロンの別々の集
団によって産生される。ニューロフィシンと一緒に、これらは、神経分泌小胞に
パッケージングされ、そして神経下垂体中の神経終末に軸索的に輸送され、これ
らはここで、保存されるかまたは血流に分泌されるかのいずれかである。バソプ
レシンは、より大量の前駆体として合成され、この前駆体は、そのホルモンに加
えて、そのキャリアタンパク質、ニューロフィシン、および糖タンパク質を含む
。このタンパク質前駆体の機能ドメインは、２つのイントロンによって隔てられ
た３つのエキソンによってコードされる。最初のエキソンは、ホルモンをコード
し、そして第２のエキソンは、キャリアタンパク質の大部分をコードし、そして
第３のエキソンは、糖タンパク質をコードする。単一ヌクレオチド欠失は、尿崩
症を有するブラトルバロラット中の第２のエキソン中に見出される。（Ｓｃｈｍ
ａｌｅら、ＥＭＢＯ Ｊ．３：３２８９−９３、１９８４）。さらに、バソプレ
シン（ニューフィジン（ｎｅｕｐｈｙｓｉｎ））に対する結合タンパク質におけ
る単一アミノ酸変異が、常染色体優性神経下垂体尿崩症を有するヒト被験体中で
発見された（Ｒｅｐａｓｋｅら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔ
ａｂ ７９（２）：４２１−７、１９９４）。
【００４４】 上記のように、尿崩症は、バソプレシンニューロフィシン前駆体タンパク質中
の変異によって引き起こされ得、分泌小胞へのホルモンの不適切な標的化引き起
こす。結果として、前駆体タンパク質は、小胞体に蓄積し、そしてさらなるプロ
セシングためのゴルジには決して到達しない（Ｏｌｉａｓら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．１５：９２９−９３５、１９９６）。ＡＬ０３５４６０Ａからの遺
伝子産物は、バソプレシン−ニューロフィシンプレホルモン産物のプロセシング
および／または輸送に関与し得る。ＡＬＣＬＰＬＸ遺伝子（例えば、ＡＬ０３５
４６０Ａ）からの遺伝子産物の機能における欠損は、活性なバソプレシンの産生
および分泌に欠損を引き起こし得、これは、尿崩症の発生を導き得る。
【００４５】 癌に関連して、ＡＬ０３５４６０Ａ遺伝子は、この遺伝子が乳癌および卵巣癌
における腫瘍抑制遺伝子として作用する（すなわち、正常組織に対して腫瘍細胞
株における減少した発現）ことと一致する発現プロフィールを示すことが、実施
例において示される。従って、このような腫瘍細胞は、ＡＣＰＬＸ核酸（例えば
、ＡＬ０３５４６０Ａ）のトランスフェクションおよび発現の後に、インビトロ
およびインビボの両方で増殖速度に減少を示すことが推定される。
【００４６】 （ＡＣＰＬＸ核酸） 本発明の新規核酸は、ＡＣＰＬＸポリペプチドまたはＡＣＰＬＸタンパク質を
コードする核酸を含有する。本明細書において使用されるように、用語ポリペプ
チドおよびタンパク質は、交換可能である。
【００４７】 いくつかの実施形態において、ＡＬＣＰＬＸ核酸は、成熟ＡＣＰＬＸポリペプ
チドをコードする。本明細書中で使用される場合、本明細書中に記載されるポリ
ペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態は、天然に存在するポリペプチドある
いは前駆体形態またはプロタンパク質の産物に関係する。天然に存在するポリペ
プチド、前駆体またはプロタンパク質としては、非制限例として、対応する遺伝
子によってコードされる完全長遺伝子産物が挙げられる。あるいは、これは、本
明細書中で記載されるオープンリーディングフレームによってコードされる、ポ
リペプチド、前駆体またはプロタンパク質として規定され得る。産物「成熟」形
態は、さらに非制限例として、遺伝子産物が産生される細胞中で発生し得る、１
以上の天然に存在するプロセシング工程の結果として発生する。ポリペプチドま
たはタンパク質の「成熟」形態に導くこのようなプロセシング工程の例としては
、オープンリーディングフレームの開始コドンによってコードされる、Ｎ−末端
メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドもしくはリーダー配列のタンパ
ク分解性切断が挙げられる。従って、残基１〜Ｎ（ここで、残基１は、Ｎ−末端
メチオニンである）を有する、前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる
成熟形態は、Ｎ−末端メチオニンの除去後に残った残基２〜Ｎ末端を有する。あ
るいは、残基１〜Ｎを有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成
熟形態（ここで、残基１〜残基ＭのＮ末端シグナル配列が切断される）は、残っ
た残基Ｍ＋１〜残基Ｎを有する。本明細書中でさらに使用されるように、ポリペ
プチドまたはタンパク質の「成熟」形態は、タンパク質分解性切断事象以外の、
翻訳後修飾事象の工程から生じ得る。このようなさらなるプロセスとしては、非
制限例として、グリコシル化、ミリストイル化、またはリン酸化が挙げられる。
一般に、成熟ポリペプチドまたは成熟タンパク質は、これらのプロセスの１つの
みの作用、またはそれらの任意の組み合わせから得られ得る。
【００４８】 ＡＬＣＬＰＬＸ核酸の間は、配列番号１で提供される配列の核酸あるいはそれ
らのフラグメントである。さらに、本発明には、配列番号１の変異体核酸または
改変体核酸あるいはそれらのフラグメントが挙げられ、任意のこれらの塩基は、
配列番号１に示される対応する塩基から変化され得るが、ＡＣＰＬＸ様の活性お
よび生理学的機能の少なくとも１つを維持するタンパク質をなおコードする。本
発明には、配列番号１の核酸配列の相補体（それらのフラグメント、誘導体、ア
ナログおよびホモログを含む）がさらに挙げられる。本発明は、その構造が化学
的改変を含む、核酸または核酸フラグメントあるいはそれらの相補体をさらに含
む。
【００４９】 本発明の１つの局面は、ＡＣＰＬＸタンパク質またはそれらの生物学的に活性
な部分をコードする単離された核酸分子に関する。また、ＡＣＰＬＸをコードす
る核酸（例えば、ＡＣＰＬＸ ｍＲＮＡ）を同定するためにハイブリダイゼーシ
ョンプローブとして使用するための十分な核酸フラグメントおよびＡＣＰＬＸ核
酸分子の増幅または変異のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーと
して使用するためのフラグメントも含まれる。本明細書において使用されるよう
に、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）
、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを使用して産生され
るＤＮＡまたはＲＮＡのアナログ、ならびにそれらの誘導体、フラグメントおよ
びホモログを含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得
るが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。
【００５０】 「プローブ」とは、種々の長さの核酸配列をいい、好ましくは、使用に依存し
て、少なくとも約１０ヌクレオチド（ｎｔ）、１００ｎｔ、または例えば、約６
，０００ｎｔほどの大きさの間である。プローブは、同一、類似または相補的な
核酸配列の検出において使用される。より長いプローブは、通常、天然供給源ま
たは組換え供給源から入手され、非常に特異的であり、そしてオリゴマーよりも
はるかに遅くハイブリダイズする。プローブは、一本鎖または二本鎖であり得、
そしてＰＣＲ、メンブレンベースのハイブリダイゼーション技術またはＥＬＩＳ
Ａのような技術において特異性を有するように設計される。
【００５１】 「単離された」核酸分子は、この核酸の天然の供給源中に存在するその他の核
酸分子から分離されているものである。単離された核酸分子の例としては、ベク
ター中に含まれる組換えＤＮＡ分子、異種宿主細胞中に維持される組換えＤＮＡ
分子、部分的または実質的に精製された核酸分子、および合成ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ分子が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、「単離された」核
酸は、この核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中でこの核酸に天然に隣接する配
列（すなわち、この核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない
。例えば、種々の実施形態で、単離されたＡＣＰＬＸ核酸分子は、この核酸が由
来する細胞のゲノムＤＮＡ中でこの核酸分子に天然で隣接する、約５０ｋｂ、２
５ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１
ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含み得る。さらに、「単離された」核酸分子、例
えば、ｃＤＮＡ分子は、組換え技術により産生される場合、その他の細胞物質ま
たは培養培地を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合、化学物質
前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に含まないものであり得る。
【００５２】 本発明の核酸分子、例えば、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子
、またはこのヌクレオチド配列の任意の相補体は、標準的な分子生物学的技法お
よび本明細書で提供される配列情報を用いて単離され得る。ハイブリダイゼーシ
ョンプローブとして、配列番号１の核酸の全部または一部を使用して、ＡＣＰＬ
Ｘ核酸配列は、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術（例え
ば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ Ｌ
ＡＢＯＲＡＴＯＲＹＹ ＭＡＮＵＡＬ第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ、ＮＹ、１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌら、（編）、ＣＵＲＲＥＮＴ
ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３に記載される）を用
いて単離され得る。
【００５３】 本発明の核酸は、標準的なＰＣＲ増幅技法に従って、テンプレートとしてｃＤ
ＮＡ、ｍＲＮＡあるいはゲノムＤＮＡ、および適切なオリゴヌクレオチドプライ
マーを用いて増幅され得る。このように増幅された核酸は、適切なベクター中に
クローン化され、そしてＤＮＡ配列分析により特徴付けられ得る。さらに、ＡＣ
ＰＬＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術、
例えば、自動化ＤＮＡ合成機を用いることにより調製され得る。
【００５４】 本明細書で用いられる用語「オリゴヌクレオチド」は、一連の連結されたヌク
レオチド残基をいい、このオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応で用いられる十分
な数のヌクレオチド塩基を有する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム配列
もしくはｃＤＮＡ配列に基づき得るか、またはそれから設計され得、そして特定
の細胞もしくは組織において、同一、類似もしくは相補的ＤＮＡまたはＲＮＡを
増幅し、確認し、もしくはその存在を示すために用いられる。オリゴヌクレオチ
ドは、約１０ｎｔ、５０ｎｔ、または１００ｎｔの長さ、好ましくは約１５ｎｔ
〜３０ｎｔの長さを有する核酸配列の部分を含む。１つの実施形態では、１００
ｎｔより少ない長さの核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、さらに、配列番号
１の少なくとも６個連続するヌクレオチド、またはその相補体を含む。オリゴヌ
クレオチドは、化学的に合成され得、そしてプローブとして用いられ得る。
【００５５】 別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１に示されるヌ
クレオチド配列の相補体である核酸分子を含む。別の実施形態では、本発明の単
離された核酸分子は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列またはこのヌクレ
オチド配列の一部分の相補体である核酸分子を含む。配列番号１に示されるヌク
レオチド配列に相補的である核酸分子は、配列番号１に示されるヌクレオチド配
列に十分相補的である核酸分子であり、配列番号１に示される核酸配列に対しミ
スマッチがほとんどまたは全くなく水素結合し得、それによって安定な二本鎖を
形成する。
【００５６】 本明細書で用いる用語「相補的」は、核酸分子のヌクレオチド単位間のＷａｔ
ｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成をいい、そして用語「
結合」は、２つのポリペプチドまたは化合物または関連ポリペプチドまたは化合
物またはその組合せ間の物理的または化学的相互作用を意味する。結合は、イオ
ン性、非イオン性、ファンデルワールス性、疎水性相互作用などを含む。物理的
相互作用は直接的であるかまたは間接的であり得る。間接的相互作用は、別のポ
リペプチドまたは化合物を介するか、またはその効果に起因し得る。直接的結合
は、別のポリペプチドもしくは化合物を介して、またはその効果に起因して生じ
ない、その他の実質的な化学的中間体がない相互作用をいう。
【００５７】 さらに、本発明の核酸分子は、配列番号１の核酸配列の一部のみ（例えば、プ
ローブまたはプライマーとして使用され得るフラグメント、あるいはＡＣＰＬＸ
の生物学的に活性な部分をコードするフラグメント）を含み得る。本明細書中に
提供されるフラグメントは、少なくとも６個の（連続する）核酸配列または少な
くとも４個の（連続する）アミノ酸の配列（それぞれ、核酸の場合には、特異的
なハイブリダイゼーションを可能にし、またはアミノ酸の場合には、エピトープ
の特異的な認識を可能にするに十分な長さ）として規定され、そして全長配列未
満のせいぜいいくらかの部分である。フラグメントは、選択された核酸配列また
はアミノ酸配列の任意の連続する部分に由来し得る。誘導体は、直接的にかまた
は改変もしくは部分的置換によってかのいずれかでネイティブな化合物から形成
される核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、ネイティブな化合物に
類似する構造を有する（しかし、同一ではない）が、特定の成分または側鎖に関
してそれとは異なる核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、合成物で
あり得るか、または進化的に異なる起源に由来し得、そして野生型と比較して、
類似の代謝活性または反対の代謝活性を有し得る。
【００５８】 誘導体およびアナログは、以下に記載のように、誘導体またはアナログが、修
飾された核酸またはアミノ酸を含む場合、全長、または全長以外のものであり得
る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体またはアナログは、種々の実施形態
において、本発明の核酸もしくはタンパク質に、同一の大きさの核酸またはアミ
ノ酸配列にわたって、または整列した配列と比較した場合（この整列は、当該分
野で公知であるコンピューター相同性プログラムによって実施される）、少なく
とも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％もの
同一性（好ましい同一性は、８０〜９９％）で実質的に相同であるか、あるいは
そのコードする核酸がストリンジェントの、中程度にストリンジェントの、また
は低いストリンジェントの条件下で上記のタンパク質をコードする配列の相補体
にハイブリダイズし得る、領域を含む分子を包含するが、これらに限定されない
。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ Ｍ
ＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３、および以下を参照のこと。例示のプログラム
は、Ｇａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓ
ｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ ＵＮＩＸ（登録商標）、
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）（デフォルト設定を使用、
これは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ
．Ｍａｔｈ．、１９８１、２：４８２−４８９、これらは、その全体が参考とし
て本明細書中に援用される）を使用する）である。
【００５９】 「相同な核酸配列」もしくは「相同なアミノ酸配列」、またはその改変体とは
、上記で考察したように、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルにおける相
同性によって特徴付けられる配列をいう。相同なヌクレオチド配列は、ＡＣＰＬ
Ｘポリペプチドのアイソフォームをコードする配列をコードする。アイソフォー
ムは、例えば、ＲＮＡの選択的スプライシングの結果として、同一の生物の異な
る組織において発現され得る。あるいは、アイソフォームは、異なる遺伝子によ
ってコードされ得る。本発明において、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の
種（哺乳動物が挙げられるが、これに限定されず、従って、例えば、マウス、ラ
ット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよび他の生物が挙げられ得る）のＡＣ
ＰＬＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。相同なヌクレオチド
配列はまた、天然に生じる対立遺伝子改変体および本明細書に記載されるヌクレ
オチド配列の変異体が挙げられるが、これらに限定されない。しかし、相同的ヌ
クレオチド配列は、ヒトＡＣＰＬＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列を
含まない。相同核酸配列は、配列番号２の保存的アミノ酸置換（以下を参照のこ
と）、およびＡＣＰＬＸ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む
。ＡＣＰＬＸタンパク質の生物学的活性は以下に記載されている。相同的アミノ
酸配列は、ヒトＡＣＰＬＸポリペプチドのアミノ酸配列をコードしない。
【００６０】 ヒトＡＣＰＬＸ遺伝子のクローニングから決定されたヌクレオチド配列は、他
の細胞型（例えば、他の組織由来）におけるＡＣＰＬＸホモログ、ならびに他の
哺乳動物由来のＡＣＰＬＸホモログを同定および／またはクローニングする際の
使用のために設計されるプローブおよびプライマーの作製を可能にする。このプ
ローブ／プライマーは、代表的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを
含む。このオリゴヌクレオチドは、代表的には、配列番号１の少なくとも約１２
個、約２５個、約５０個、約１００個、約１５０個、約２００個、約２５０個、
約３００個、約３５０個もしくは約４００個以上の連続するセンス鎖ヌクレオチ
ド配列；または配列番号１のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；あるいは配列番
号１の天然に存在する変異体の少なくとも約１２個、約２５個、約５０個、約１
００個、約１５０個、約２００個、約２５０個、約３００個、約３５０個もしく
は約４００個以上の連続するセンス鎖ヌクレオチド配列または配列番号１の天然
に存在する変異体のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列に、ストリンジェントな条
件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
【００６１】 ヒトＡＣＰＬＸヌクレオチド配列に基づくプローブは、同じまたは相同なタン
パク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出するために使用され得る。種
々の実施形態において、このプローブはさらに、プローブに付着した標識基を含
み、例えば、この標識基は放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子
であり得る。このようなプローブは、ＡＣＰＬＸタンパク質を誤って発現する細
胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として、例えば、被験体由
来の細胞のサンプル中のＡＣＰＬＸをコードする核酸のレベルを測定すること（
例えば、ＡＣＰＬＸ ｍＲＮＡレベルを検出すること、またはゲノムＡＣＰＬＸ
遺伝子が変異しているかまたは欠失しているか否かを決定すること）によって使
用され得る。
【００６２】 「ＡＣＰＬＸの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」は、本発明のポ
リペプチドの活性に類似するが必ずしも同一ではない活性を示すポリペプチドを
いい、用量依存性の有無に関わらず、特定の生物学的アッセイにおいて測定され
るような成熟形態を含む。「ＡＣＰＬＸの生物学的に活性な部分」をコードする
核酸フラグメントは、ＡＣＰＬＸの生物学的活性（ＡＣＰＬＸタンパク質の生物
学的活性は、以下に記載される）を有するポリペプチドをコードする、配列番号
１の一部を単離し、ＡＣＰＬＸタンパク質のコードされた部分を発現させ（例え
ば、インビトロでの組換え発現によって）、そしてＡＣＰＬＸのコードされた部
分の活性を評価することによって調製され得る。例えば、ＡＣＰＬＸの生物学的
に活性な部分をコードする核酸フラグメントは、必要に応じて、ＡＴＰ結合ドメ
インを含み得る。別の実施形態おいて、ＡＣＰＬＸの生物学的に活性な部分をコ
ードする核酸フラグメントは、１つ以上の領域を含む。
【００６３】 （ＡＣＰＬＸの改変体） 本発明はさらに、遺伝コードの縮重に起因して、配列番号１に示されるヌクレ
オチド配列とは異なる核酸分子を包含する。従って、これらの核酸は、配列番号
１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＡＣＰＬＸタンパク質（例
えば、配列番号２のポリペプチド）と同じＡＣＰＬＸタンパク質をコードする。
別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号２に示される
アミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００６４】 配列番号１に示されるヒトＡＣＰＬＸヌクレオチド配列に加えて、ＡＣＰＬＸ
のアミノ酸配列における変化を導くＤＮＡ配列多型は、集団（例えば、ヒト集団
）内に存在し得ることが、当業者によって理解される。ＡＣＰＬＸ遺伝子中のこ
のような遺伝的多型は、天然の対立遺伝子のバリエーションに起因して、集団内
の個体間に存在し得る。本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」および「
組換え遺伝子」は、ＡＣＰＬＸタンパク質、好ましくは哺乳動物のＡＣＰＬＸタ
ンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子をいう。こ
のような天然の対立遺伝子のバリエーションは、代表的には、ＡＣＰＬＸ遺伝子
のヌクレオチド配列において１〜５％の変動性を生じ得る。天然の対立遺伝子バ
リエーションの結果であり、そしてＡＣＰＬＸの機能的活性を変化させない、Ａ
ＣＰＬＸ内の任意および全てのこのようなヌクレオチドのバリエーションならび
に得られるアミノ酸多型は、本発明の範囲内であると意図される。
【００６５】 さらに、他の種由来のＡＣＰＬＸタンパク質をコードし、従って、配列番号１
のヒト配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内に
あることが意図される。本発明のＡＣＰＬＸのｃＤＮＡの天然の対立遺伝子改変
体およびホモログに対応する核酸分子は、本明細書中に開示されるヒトＡＣＰＬ
Ｘ核酸に対するその相同性に基づいて、ストリンジェントハイブリダイゼーショ
ン条件下で、標準的なハイブリダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーショ
ンプローブとしてヒトｃＤＮＡまたはその一部を用いて単離され得る。例えば、
可溶性ヒトＡＣＰＬＸ ｃＤＮＡは、ヒトの膜結合ＡＣＰＬＸに対するその相同
性に基づいて単離され得る。同様に、膜結合ヒトＡＣＰＬＸ ｃＤＮＡは、可溶
性ヒトＡＣＰＬＸに対するその相同性に基づいて単離され得る。
【００６６】 従って、別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも６ヌ
クレオチド長であり、そしてストリンジェント条件下で配列番号１のヌクレオチ
ド配列を含む核酸分子にハイブリダイズする。別の実施形態では、この核酸は、
少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００または７５０ヌクレオチ
ド長である。別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、コード領域に
ハイブリダイズする。本明細書中で用いられる場合、用語「ストリンジェント条
件下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄に関して、
互いに少なくとも６０％相同なヌクレオチド配列が代表的には互いにハイブリダ
イズしたままである条件を記載することを意図する。
【００６７】 ホモログ（すなわち、ヒト以外の種由来のＡＣＰＬＸタンパク質をコードする
核酸）または他の関連配列（例えば、パラログ（ｐａｒａｌｏｇ））は、特定の
ヒト配列の全てまたは一部をプローブとし、核酸ハイブリダイゼーションおよび
クローニングに関して当該分野で周知の方法を使用して、低い、中程度の、また
は高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションによって入手され得る。
【００６８】 本明細書で用いられる場合、語句「ストリンジェントハイブリダイゼーション
条件」は、その条件下で、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが、
その標的配列にハイブリダイズするが、その他の配列にはハイブリダイズしない
条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる状況で
異なる。より長い配列は、より短い配列より高い温度で特異的にハイブリダイズ
する。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで
、特定の配列の熱融解点（Ｔm）より約５℃低いように選択される。このＴｍは
、標的配列に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイ
ズする（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下）温度である。標的配列
は一般に過剰で存在するので、Ｔｍでは、５０％のプローブが平衡状態で占有さ
れている。代表的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、塩
濃度が約１．０Ｍナトリウムイオンより少なく、代表的には約０．０１〜１．０
Ｍナトリウムイオン（またはその他の塩）、そして温度が短いプローブ、プライ
マーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ）について少なく
とも約３０℃、そしてより長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチド
について少なくとも約６０℃であるような条件である。ストリンジェントな条件
はまた、ホルムアミドのような、脱安定化剤の添加で達成され得る。
【００６９】 ストリンジェント条件は、当業者に公知であり、そしてＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲ
ＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉ
ｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出
され得る。好ましくは、この条件は、互いに少なくとも約６５％、約７０％、約
７５％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％または約９９％相同な配列が
、代表的には互いにハイブリダイズしたままであるような条件である。ストリン
ジェントハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ ＰＶＰ、
０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ ＢＳＡ、および５００ｍｇ／ｍｌ変性
サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中での６５℃でのハイブリダイゼーションであ
る。このハイブリダイゼーションに、０．２×ＳＳＣ、０．０１％ ＢＳＡ中で
の５０℃での１回以上の洗浄が続く。ストリンジェント条件下で配列番号１の配
列にハイブリダイズする、本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸
分子に対応する。本明細書中で使用される場合、「天然に存在する」核酸分子と
は、天然に存在する（例えば、天然のタンパク質をコードする）ヌクレオチド配
列を有する、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子をいう。
【００７０】 第２の実施形態では、配列番号１またはそれらのフラグメント、アナログもし
くは誘導体のヌクレオチド配列を含む核酸分子に、中程度のストリンジェンシー
条件下でハイブリダイズし得る核酸配列が提供される。中程度のストリンジェン
シーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、５５℃での６×ＳＳＣ、５
×デンハルト溶液、０．５％ ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮ
Ａ中でのハイブリダイゼーション、続いて１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中での
３７℃での１回以上の洗浄である。用いられ得る中程度のストリンジェンシーの
他の条件は、当該分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９
３，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯ
ＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹおよびＫｒｉｅｇｌｅｒ
，１９９０，ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＡＮＤ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ
ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ
を参照のこと。
【００７１】 第３の実施形態では、配列番号１、またはそれらのフラグメント、アナログも
しくは誘導体のヌクレオチド配列を含む核酸分子に、低ストリンジェンシー条件
下でハイブリダイズし得る核酸が提供される。低ストリンジェンシーハイブリダ
イゼーション条件の非限定的な例は、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ ＰＶ
Ｐ、０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サ
ケ精子ＤＮＡ、１０％（重量／容量）デキストラン硫酸中での４０℃でのハイブ
リダイゼーション、続いて２×ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
４）、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１％ ＳＤＳ中での５０℃での１回以上の洗
浄である。用いられ得る低ストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知で
ある（例えば、種交差ハイブリダイゼーションについて用いられるように）。例
えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬ
Ｓ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ，ＮＹならびにＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦ
ＥＲ ＡＮＤ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡ
Ｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ
，１９８１，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７８：６７８９
−６７９２を参照のこと。
【００７２】 （保存的変異） 集団中に存在し得る、ＡＣＰＬＸ配列の天然に存在する対立遺伝子改変体に加
えて、当業者は、配列番号１のヌクレオチド配列への変異によって変化が導入さ
れ得、それによって、ＡＣＰＬＸタンパク質の機能的能力を変更することなく、
コードされるＡＣＰＬＸタンパク質のアミノ酸配列に変化がもたらされることを
さらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基にてアミノ酸置換をもたらす
ヌクレオチド置換は、配列番号１の配列において行われ得る。「非必須」アミノ
酸残基は、生物学的活性を変更することなく、ＡＣＰＬＸの野生型配列から、変
更され得る残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要と
される。例えば、本発明のＡＣＰＬＸタンパク質の間で保存されているアミノ酸
残基は、特に変更を受け入れ難いと予測される。
【００７３】 さらに、ＡＣＰＬＸメンバー間で保存されるアミノ酸残基（図３Ａ〜Ｃおよび
図４のように示される整列によって示される）は、変更を受けにくいと予想され
る。例えば、本発明のＡＣＰＬＸタンパク質は、ＡＣＰＬＸメンバー（すなわち
、カルボキシペプチダーゼファミリーのタンパク質、およびＡＣＰＬＸホモログ
）の中で典型的に保存される領域である少なくとも１つのドメインを含み得る。
そのようなので、これらの保存ドメインは、おそらく、変異を受けにくいようで
ある。しかし、他のアミノ酸残基（例えば、ＡＣＰＬＸタンパク質のメンバー間
で保存されてないかまたは半分保存されているのみのアミノ酸残基）は、活性に
必ずしも必須でないかもしれず、従って、おそらくより変更を受けやすい。
【００７４】 本発明の別の局面は、活性に必須ではないアミノ酸残基における変化を含む、
ＡＣＰＬＸタンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなＡＣＰＬＸタ
ンパク質は、アミノ酸配列が、配列番号２とは異なるが、生物学的活性をなお保
持する。１つの実施形態では、単離された核酸分子は、タンパク質をコードする
ヌクレオチド配列を含み、ここで、このタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配
列に少なくとも約７５％の相同性であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、この
核酸分子によってコードされるタンパク質は、配列番号２に少なくとも約８０％
相同性であり、より好ましくは配列番号２に少なくとも約９０％、約９５％、約
９８％相同性であり、そして最も好ましくは少なくとも約９９％相同性である。
【００７５】 配列番号２のタンパク質に相同なＡＣＰＬＸタンパク質をコードする単離され
た核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列に１以上のヌクレオチドの置換、
付加または欠失を導入することにより作製され得、その結果、１以上のアミノ酸
の置換，付加または欠失が、コードされるタンパク質に導入される。
【００７６】 変異は、標準技術（例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）
によって配列番号１のヌクレオチド配列に導入され得る。好ましくは、保存的ア
ミノ酸置換が、１以上の推定非必須アミノ酸残基にて作製される。「保存的アミ
ノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される、
アミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分
野で定義されている。これらのファミリーとしては、以下が挙げられる：塩基性
側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖
を有するアミノ酸（例えば、アルパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖
を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、ト
レオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、ア
ラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチ
オニン、トリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン
、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシ
ン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）。従って、ＡＣＰＬＸ中
の推定非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖のファミリー由来の別のアミノ酸残基で
置換される。あるいは、別の実施形態では、変異は、ＡＣＰＬＸコード配列の全
てまたは一部に沿って（例えば、飽和変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔ
ａｇｅｎｅｓｉｓ）によって）ランダムに導入され得、そして得られる変異体は
、ＡＣＰＬＸの生物学的活性についてスクリーニングされて、活性を維持する変
異体を同定し得る。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１
９、２１または２３の変異誘発に続いて、コードされるタンパク質は、当該分野
で公知の任意の組換え技術によって発現され得、そしてこのタンパク質の活性が
決定され得る。
【００７７】 １つの実施形態では、変異ＡＣＰＬＸタンパク質は、以下についてアッセイさ
れ得る：（１）他のＡＣＰＬＸタンパク質、他の細胞表面タンパク質、または生
物学的に活性なそれらの部分と、タンパク質：タンパク質相互作用を形成する能
力、（２）変異ＡＣＰＬＸタンパク質と、ＡＣＰＬＸのレセプターとの間の複合
体形成；（３）変異ＡＣＰＬＸタンパク質が細胞内標的タンパク質またはその生
物学的に活性な部分に結合する能力；（例えば、アビジンタンパク質）；（４）
ＢＲＡタンパク質に結合する能力；あるいは（５）抗ＡＣＰＬＸタンパク質抗体
に特異的に結合する能力。
【００７８】 （アンチセンスＡＣＰＬＸ核酸） 本発明の別の局面は、配列番号１またはそのフラグメント、アナログもしくは
誘導体のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズし得るかまたは相補
的である、単離されたアンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は
、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的である（例えば、二本鎖ｃＤ
ＮＡ分子のコード鎖に相補的であるかまたはｍＲＮＡ配列に相補的である）ヌク
レオチド配列を含む。特定の局面では、少なくとも約１０、約２５、約５０、約
１００、約２５０もしくは約５００ヌクレオチドまたは全体のＡＣＰＬＸコード
鎖、またはそれらの一部のみに相補的な配列を含む、アンチセンス核酸分子が提
供される。配列番号２のＡＣＰＬＸタンパク質のフラグメント、ホモログ、誘導
体およびアナログをコードする核酸分子、または配列番号１のＡＣＰＬＸの核酸
配列に相補的なアンチセンス核酸がさらに提供される。
【００７９】 １つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＡＣＰＬＸをコードするヌク
レオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。用語「
コード領域」とは、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含む、ヌクレオチド配列
の領域をいう（例えば、配列番号２に対応する、ヒトＡＣＰＬＸのタンパク質コ
ード領域）。別の実施形態では、このアンチセンス核酸分子は、ＡＣＰＬＸをコ
ードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンス
である。用語「非コード領域」とは、コード領域に隣接する、アミノ酸に翻訳さ
れない、５’配列および３’配列をいう（すなわち、５’非翻訳領域および３’
非翻訳領域ともいわれる）。
【００８０】 本明細書中に開示されるＡＣＰＬＸをコードするコード鎖配列（例えば、配列
番号１）を考慮すれば、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒ
ｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎの塩基対合の規則に従って設計され得る。アン
チセンス核酸分子は、ＡＣＰＬＸ ｍＲＮＡのコード領域全体に相補的であり得
るが、より好ましくは、ＡＣＰＬＸ ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域
の一部にのみにアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチ
センスオリゴヌクレオチドは、ＡＣＰＬＸ ｍＲＮＡの翻訳開始部位を取り囲む
領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さが
約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５また
は約５０ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公
知の手順を用いて、化学的合成または酵素連結反応を用いて構築され得る。例え
ば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に
存在するヌクレオチド、またはこの分子の生物学的安定性を増大させるように、
もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定
性を増大させるように設計された種々に改変されたヌクレオチドを用いて化学的
に合成され得る（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌク
レオチドが用いられ得る）。
【００８１】 アンチセンス核酸を作製するために用いられ得る改変されたヌクレオチドの例
としては以下が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−
クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセ
チルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシ
メチルアミノメチル２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラ
シル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン（ｇａｌａｃｔｏｓ
ｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチ
ルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデ
ニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−
アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキ
シアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン（ｍａｎｎ
ｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−
メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル
−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン（
ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−
チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ
酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオ
ウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（
ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。あるいは、このアンチセンス核
酸は、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされた発現ベクターを用いて
生物学的に生成され得る（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、
以下の小節にさらに記載される、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向であ
る）。
【００８２】 本発明のアンチセンス核酸分子は、代表的には被験体に投与されるか、または
インサイチュで生成され、その結果それらは、ＡＣＰＬＸタンパク質をコードす
る細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、または
それに結合し、それによってこのタンパク質の発現を、例えば転写および／また
は翻訳を阻害することによって阻害する。ハイブリダイゼーションは、安定な二
重鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によってか、または例えばＤＮＡ二重
鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんのメジャーグルーブ
（ｍａｊｏｒ ｇｒｏｏｖｅ）における特異的相互作用を介してであり得る。本
発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位での直接的注射
が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的化す
るように改変され得、次いで全身に投与される。例えば、全身投与のために、ア
ンチセンス分子は、それらが選択された細胞表面上に発現されたレセプターまた
は抗原に特異的に結合するように改変され得る。これは、例えば、そのアンチセ
ンス核酸分子を細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に
連結することによる。このアンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に記載され
るベクターを用いて細胞に送達され得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度
を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ ＩＩプロモーターま
たはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれているベクター構築物が、好
ましい。
【００８３】 なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー
核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイ
ブリッドを形成する。ここで、通常のβ−ユニットとは対照的に、鎖は、互いに
平行に走行する（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ １５：６６２５〜６６４１）。このアンチセンス核酸分子はまた、２
’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５：６１３１〜６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮ
Ａアナログ（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２１５：３２７〜
３３０）を含み得る。
【００８４】 このような改変としては、非制限的な例として、改変塩基、および糖リン酸バ
ックボーンが改変または誘導体化された核酸が挙げられる。これらの改変は、少
なくとも一部は、改変された核酸の化学的安定性を増強するために実施され、そ
の結果、それらは、例えば、被験体での治療的適用におけるアンチセンス結合核
酸として使用され得る。
【００８５】 （ＡＬＣＬＰＬＸリボザイムおよびＰＮＡ部分） なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。
リボザイムは、一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を切断し得るリボヌクレアーゼ
活性を有する触媒性ＲＮＡ分子であり、これらは、（その一本鎖核酸に対して）
相補領域を有する。従って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッド型リボザイム
（ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４
：５８５〜５９１に記載される））を使用して、ＡＣＰＬＸ ｍＲＮＡ転写物を
触媒的に切断し、それによってＡＣＰＬＸ ｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＡＣ
ＰＬＸをコードする核酸に特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示され
るＡＣＰＬＸ ＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１）に基づいて
設計され得る。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、ＡＣＰＬＸをコードす
るｍＲＮＡ内で切断されるヌクレオチド配列に相補的である、テトラヒメナＬ−
１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体が構築され得る。例えば、Ｃｅｃｈら、米国特許
第４，９８７，０７１号；およびＣｅｃｈら、米国特許第５，１１６，７４２号
を参照のこと。あるいは、ＡＣＰＬＸ ｍＲＮＡを使用して、ＲＮＡ分子のプー
ルから、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択し得る。例え
ば、Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１〜１４１８
を参照のこと。
【００８６】 あるいは、ＡＣＰＬＸ遺伝子発現は、ＡＣＰＬＸの調節領域（例えば、ＡＣＰ
ＬＸのプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列
を標的化し、標的細胞中でＡＣＰＬＸ遺伝子の転写を妨害する三重らせん構造を
形成することによって阻害され得る。一般には、Ｈｅｌｅｎｅ．（１９９１）Ａ
ｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．６：５６９〜８４；Ｈｅｌｅｎｅら（
１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７〜３６；およびＭ
ａｈｅｒ（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４：８０７〜１５を参照のこと。
【００８７】 種々の実施形態において、ＡＣＰＬＸの核酸は、塩基部分、糖部分またはリン
酸骨格で改変され、例えば、その分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは
可溶性を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を改変して、
ペプチド核酸を生成し得る（Ｈｙｒｕｐら（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ
Ｃｈｅｍ ４：５〜２３を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「
ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格が偽ペプチド
骨格によって置換され、そして４つの天然の核塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）の
みが保持されている核酸模倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）をいう。ＰＮＡの中性
の骨格は、低いイオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的ハイブ
リダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は
、上記のＨｙｒｕｐら（１９９６）；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６
）ＰＮＡＳ ９３：１４６７０〜６７５において記載されるような標準的固相ペ
プチド合成プロトコルを用いて行われ得る。
【００８８】 ＡＣＰＬＸのＰＮＡは、治療的適用および診断的適用において使用され得る。
例えば、ＰＮＡは、例えば転写または翻訳の停止を誘導することまたは複製を阻
害することによる、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンスまたは抗
遺伝子剤として使用され得る。ＡＣＰＬＸのＰＮＡはまた、例えばＰＮＡ指向性
ＰＣＲクランピングによる遺伝子における一塩基対変異の分析において；他の酵
素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）と組み合わせて使用される場合の人工制限酵素
として（Ｈｙｒｕｐ Ｂ．（１９９６）上記）；またはＤＮＡ配列およびハイブ
リダイゼーションのプローブもしくはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐら（１９９
６）上記；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ（１９９６）、上記）、使用され得る。
【００８９】 別の実施形態において、ＡＣＰＬＸのＰＮＡは、例えば、それらの安定性また
は細胞性取り込みを増強するために、ＰＮＡに脂溶性基または他のヘルパー基を
結合することによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、またはリポソー
ムもしくは当該分野において公知の薬物送達の他の技術の使用によって改変され
得る。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組合せ得る、ＡＣＰＬＸのＰ
ＮＡ−ＤＮＡキメラが生成され得る。ＰＮＡ部分が高い結合親和性および特異性
を提供する一方で、そのようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮａｓｅ
ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用するのを可能にする。
ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基のスタッキング、核塩基間の結合数および方向に
関して選択される適切な長さのリンカーを使用して連結され得る（Ｈｙｒｕｐ（
１９９６）上記）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐ（１９９６）上
記およびＦｉｎｎら（１９９６）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２４：３３５
７〜６３において記載されるように行われ得る。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的な
ホスホラミダイトカップリング化学を用いて固体支持体上で合成され得、そして
改変されたヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）ア
ミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイト）が、ＰＮＡとＤＮＡの５
’末端との間に使用され得る（Ｍａｇら（１９８９）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅ
ｓ １７：５９７３〜８８）。次いで、ＰＮＡモノマーが段階様式でカップリン
グされ、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子
を生成する（Ｆｉｎｎら（１９９６）上記）。あるいは、５’ＤＮＡセグメント
および３’ＰＮＡセグメントを用いて、キメラ分子が合成され得る。Ｐｅｔｅｒ
ｓｅｎら（１９７５）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ５：１１１
９〜１１１２４を参照のこと。
【００９０】 他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、以下のような他の付属の基を
含み得る：ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的化するため
）、または細胞膜を横切る輸送を容易にする因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ
ら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６
５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８〜６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を
参照のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３
４を参照のこと）。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘
発切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：
９５８〜９７６を参照のこと）、またはインターカレーター剤（例えば、Ｚｏｎ
，１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９を参照のこと）で改変さ
れ得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチ
ド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発
切断剤など）に結合され得る。
【００９１】 （ＡＣＰＬＸポリペプチド） 本発明のＡＣＰＬＸポリペプチドは、その配列が配列番号２に提供されるＡＣ
ＰＬＸ様タンパク質を含む。本発明はまた、なおそのＡＣＰＬＸ様活性および生
理学的機能を維持するタンパク質、またはその機能的フラグメントをコードする
が、その任意の残基が配列番号２に示される対応する残基から変化し得る、変異
体または改変体タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、この変異体ま
たは改変体タンパク質において、２０％までまたはそれ以上の残基がそのように
変化され得る。いくつかの実施形態において、本発明に従ったＡＬＣＬＰＬＸポ
リペプチドは、成熟ポリペプチドである。
【００９２】 一般に、ＡＣＰＬＸ様機能を保持するＡＣＰＬＸ様改変体は、配列中の特定位
置の残基が他のアミノ酸により置換され、そしてさらに、親タンパク質の２つの
残基間にさらなる残基を挿入する可能性、および親配列から１つ以上の残基を欠
失する可能性を含む任意の改変体を含む。任意のアミノ酸置換、挿入または欠失
が、本発明に包含される。好適な状況では、この置換は、上記で規定されるよう
な保存的置換である。
【００９３】 本発明の１つの局面は、単離されたＡＣＰＬＸタンパク質、およびその生物学
的に活性な部分、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログ
に関する。抗ＡＣＰＬＸ抗体を惹起するための免疫原としての使用に適するポリ
ペプチドフラグメントもまた提供される。１つの実施形態では、ネイティブなＡ
ＣＰＬＸタンパク質が、標準的なタンパク質精製技法を用いる適切な精製スキー
ムにより、細胞または組織供給源から単離され得る。別の実施形態では、ＡＣＰ
ＬＸタンパク質は、組換えＤＮＡ技法により生産される。組換え発現の代替えと
して、ＡＣＰＬＸタンパク質またはポリペプチドは、標準的なペプチド合成技法
を用いて化学的に合成され得る。
【００９４】 「単離された」または「精製された」タンパク質またはその生物学的に活性な
部分は、ＡＣＰＬＸタンパク質の由来する細胞または組織供給源由来の細胞性物
質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学合成される場
合に化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞性物質を実
質的に含まない」は、ＡＣＰＬＸタンパク質の調製物を含み、この調製物におい
て、ＡＣＰＬＸタンパク質が単離または組換え産生される細胞の細胞性成分から
、ＡＣＰＬＸタンパク質は分離されている。１つの実施形態において、用語「細
胞性物質を実質的に含まない」は、非ＡＣＰＬＸタンパク質（本明細書中におい
て「夾雑タンパク質」とも呼ばれる）を約３０％未満（乾燥重量にて）、より好
ましくは非ＡＣＰＬＸタンパク質を約２０％未満、なおより好ましくは非ＡＣＰ
ＬＸタンパク質を約１０％未満、そして最も好ましくは非ＡＣＰＬＸタンパク質
を約５％未満有する、ＡＣＰＬＸタンパク質の調製物を含む。ＡＣＰＬＸタンパ
ク質またはその生物学的に活性な部分が組換え産生される場合、好ましくは、調
製物はまた、培養培地を実質的に含まない。すなわち、培養培地は、そのタンパ
ク質調製物の容量の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、そして最も好
ましくは約５％未満を示す。
【００９５】 用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、タンパク質が
、そのタンパク質の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離され
ているＡＣＰＬＸタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態において、用語「
化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、化学前駆体または非Ａ
ＣＰＬＸの化学物質を約３０％未満（乾燥重量にて）、より好ましくは化学前駆
体または非ＡＣＰＬＸ化学物質を約２０％未満、なおより好ましくは化学前駆体
または非ＡＣＰＬＸ化学物質を約１０％未満、そして最も好ましくは化学前駆体
または非ＡＣＰＬＸ化学物質を約５％未満有する、ＡＣＰＬＸタンパク質の調製
物を含む。
【００９６】 ＡＣＰＬＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＡＣＰＬＸタンパク質
より少ないアミノ酸を含み、そしてＡＣＰＬＸタンパク質の少なくとも１つの活
性を示す、ＡＣＰＬＸタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２に示され
るアミノ酸配列）に十分に相同なアミノ酸配列、またはＡＣＰＬＸタンパク質の
アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。代表的には、生物
学的に活性な部分は、ＡＣＰＬＸタンパク質の少なくとも１つの活性を有するド
メインまたはモチーフを含む。ＡＣＰＬＸタンパク質の生物学的に活性な部分は
、例えば、長さが１０、２５、５０、１００またはそれより多いアミノ酸である
ポリペプチドであり得る。
【００９７】 本発明のＡＣＰＬＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、ＡＣＰＬＸタンパ
ク質間に保存される上記の同定されたドメインの少なくとも１つを含み得る。さ
らに、タンパク質の他の領域が欠失している他の生物学的に活性な部分は、組換
え技術によって調製され得、そしてネイティブなＡＣＰＬＸタンパク質の機能的
活性のうちの１つ以上について評価され得る。
【００９８】 １つの実施形態において、ＡＣＰＬＸタンパク質は、配列番号２に示されるア
ミノ酸配列を有する。他の実施形態において、ＡＣＰＬＸタンパク質は、配列番
号２に実質的に相同であり、そして以下に詳細に議論されるように、天然の対立
遺伝子改変体または変異誘発に起因してアミノ酸配列が異なるが、配列番号２の
タンパク質の機能的活性を保持する。従って、別の実施形態において、ＡＣＰＬ
Ｘタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも約４５％相同なアミノ
酸配列を含み、そして、配列番号２のＡＣＰＬＸタンパク質の機能的活性を保持
するタンパク質である。
【００９９】 （２つ以上の配列間の相同性の決定） ２つのアミノ酸配列または２つの核酸の相同性の百分率を決定するために、配
列は、至適な比較の目的のために整列される（例えば、ギャップは、配列間の最
適な整列について比較される配列のいずれかに導入され得る）。次いで、対応す
るアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドが
比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ
酸残基またはヌクレオチドで占められる場合、分子はその位置で相同である（す
なわち、本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「相同性」は、ア
ミノ酸または核酸の「同一性」と等価である）。
【０１００】 核酸配列の相同性は、２つの配列間の同一性の程度として決定され得る。相同
性は、当該分野において公知のコンピュータープログラム（例えば、ＧＣＧプロ
グラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰソフトウェア）を用いて決定され得
る。ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ １９７０ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ
４８：４４３〜４５３を参照のこと。核酸配列比較のための以下の設定（ＧＡ
Ｐ作製ペナルティー、５．０、およびＧＡＰ伸長ペナルティー、０．３）を用い
てＧＣＧ ＧＡＰソフトウェアを使用すると、上記で言及される類似の核酸配列
のコード領域は、配列番号１に示されるＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード）部分と、
好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくと
も８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少な
くとも９９％の同一性の程度を示す。
【０１０１】 用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列
が、特定の比較領域にわたって、残基毎を基準として同一である程度をいう。用
語「配列同一性のパーセンテージ」は、以下により算出される：この比較領域に
わたって最適に整列された２つの配列を比較すること、両方の配列において同一
の核酸塩基（例えば、核酸の場合にはＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が存在す
る位置の数を決定し、一致した位置の数を導くこと、この一致した位置の数を、
比較領域の内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算すること、お
よびその結果を１００で乗算して、配列同一性のパーセンテージを導くこと。用
語「実質的な同一性」は、本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチド配列
の特徴を示し、ここでこのポリヌクレオチドは、比較領域にわたり参照配列と比
較して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同
一性、そして頻繁には９０〜９５％の配列同一性、より通常には少なくとも９９
％の配列同一性を有する配列を含む。用語「陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）残基の百
分率」は、以下により算出される：その比較領域にわたって最適に整列された２
つの配列を比較すること、同一のアミノ酸および保存的アミノ酸置換が、上記の
ように両方の配列において存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を導く
こと、この一致した位置の数を、比較領域中の位置の総数（すなわち、ウインド
ウサイズ）で除算すること、およびその結果を１００で乗算して、陽性残基の百
分率を導くこと。
【０１０２】 （キメラタンパク質および融合タンパク質） 本発明はまた、ＡＣＰＬＸキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する
。本明細書中で使用される場合、ＡＣＰＬＸ「キメラタンパク質」またはＡＣＰ
ＬＸ「融合タンパク質」は、非ＡＣＰＬＸポリペプチドに作動可能に連結された
、ＡＣＰＬＸポリペプチドを含む。「ＡＣＰＬＸポリペプチド」は、ＡＣＰＬＸ
に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいうが、「非ＡＣＰＬＸポリペ
プチド」は、ＡＣＰＬＸタンパク質に対して実質的に相同ではないタンパク質（
例えば、ＡＣＰＬＸタンパク質とは異なり、かつ同一でかまたは異なる生物体に
由来するタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。Ａ
ＣＰＬＸ融合タンパク質において、このＡＣＰＬＸポリペプチドは、ＡＣＰＬＸ
タンパク質のすべてまたは一部分に対応し得る。１つの実施形態では、ＡＣＰＬ
Ｘ融合タンパク質は、ＡＣＰＬＸタンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性
な部分を含む。別の実施形態では、ＡＣＰＬＸ融合タンパク質は、ＡＣＰＬＸタ
ンパク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質にお
いて、用語「作動可能に連結された」は、ＡＣＰＬＸポリペプチドおよび非ＡＣ
ＰＬＸポリペプチドが、インフレームで互いに融合されていることを示すことが
意図される。非ＡＣＰＬＸポリペプチドは、ＡＣＰＬＸポリペプチドのＮ末端ま
たはＣ末端に融合され得る。
【０１０３】 例えば、１つの実施形態では、ＡＣＰＬＸ融合タンパク質は、第２のタンパク
質の細胞外ドメインに連結されたＡＣＰＬＸポリペプチドを含む。このような融
合タンパク質は、ＡＣＰＬＸ活性を調節する化合物についてのスクリーニングア
ッセイでさらに利用され得る（このようなアッセイは、以下に詳細に記載される
）。
【０１０４】 別の実施形態においては、この融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＡＣＰＬＸ融合タ
ンパク質であり、ここではＡＣＰＬＸ配列が、ＧＳＴ（すなわち、グルタチオン
Ｓ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合される。このような融合タンパク
質は、組換えＡＣＰＬＸの精製を容易にし得る。
【０１０５】 さらに別の実施形態において、この融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグ
ナル配列を含むＡＣＰＬＸタンパク質である。例えば、ネイティブのＡＣＰＬＸ
シグナル配列（すなわち、配列番号２のアミノ酸）は、別のタンパク質から除去
され、シグナル配列と置換され得る。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細
胞）において、ＡＣＰＬＸの発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使
用によって増加され得る。
【０１０６】 別の実施形態においては、この融合タンパク質は、ＡＣＰＬＸ−免疫グロブリ
ン融合タンパク質であり、ここでは１つ以上のドメインを含むＡＣＰＬＸ配列が
、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合される
。本発明のこのＡＣＰＬＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、薬学的組成物中
に取り込まれ、そして被験体に投与されて、細胞の表面上でＡＣＰＬＸリガント
とＡＣＰＬＸタンパク質との間の相互作用を阻害し、それによってインビボのＡ
ＣＰＬＸ媒介信号伝達を抑制し得る。１つの非限定的な例においては、意図され
る本発明のＡＣＰＬＸリガンドは、ＡＣＰＬＸレセプターである。このＡＣＰＬ
Ｘ−免疫グロブリン融合タンパク質を用い、ＡＣＰＬＸ同族リガンドの生体利用
性に影響を与え得る。ＡＣＰＬＸリガンド／ＡＣＰＬＸ相互作用の阻害は、増殖
障害および分化障害の両方の処置、ならびに細胞生存の調節（例えば、促進また
は阻害）に、治療的に有用であり得る。さらに、本発明のこのＡＣＰＬＸ−免疫
グロブリン融合タンパク質は、被験体中で抗ＡＣＰＬＸ抗体を産生するための免
疫原として用いられ得、ＡＣＰＬＸリガンドを精製し、そしてＡＣＰＬＸリガン
ドとのＡＣＰＬＸの相互作用を阻害する分子を同定するスクリーニングアッセイ
で用いられ得る。
【０１０７】 本発明のＡＣＰＬＸキメラまたは融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技
法により産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフ
ラグメントを、従来の技法に従って、例えば、連結のための平滑末端または粘着
（ｓｔａｇｇｅｒ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応
じて粘着（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）末端のフィルイン、所望しない連結を避けるため
のアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を採用することにより、イン
フレームで一緒に連結する。別の実施形態では、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡ合
成機を含む従来技法により合成し得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ
増幅を、キメラ遺伝子配列を生成するために次いでアニールおよび再増幅され得
る、２つの連続遺伝子フラグメント間の相補的オーバハングを生じるアンカープ
ライマーを用いて実施し得る（例えば、Ａｕｓｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮＴ
ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）。さらに、融合成分（例えば、
ＧＳＴポリペプチド）をすでにコードした多くの発現ベクターが市販されている
。ＡＣＰＬＸをコードする核酸は、この融合成分がＡＣＰＬＸタンパク質にイン
フレーム連結されるように、このような発現ベクター中にクローン化され得る。
【０１０８】 （ＡＣＰＬＸアゴニストおよびアンタゴニスト） 本発明はまた、ＡＣＰＬＸアゴニスト（模倣物）として、またはＡＣＰＬＸア
ンタゴニストとして機能するＡＣＰＬＸタンパク質の改変体に関する。ＡＣＰＬ
Ｘタンパク質の改変体、例えば、ＡＣＰＬＸタンパク質の離散した点変異または
短縮型が、変異誘発により生成され得る。ＡＣＰＬＸタンパク質のアゴニストは
、天然に存在する形態のＡＣＰＬＸタンパク質と実質的に同じ生物学的活性、ま
たはその生物学的活性のサブセットを保持し得る。ＡＣＰＬＸタンパク質のアン
タゴニストは、天然に存在する形態のＡＣＰＬＸタンパク質の１つ以上の活性を
、例えば、ＡＣＰＬＸタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流また
は上流メンバーに競合的に結合することにより阻害し得る。従って、特異的生物
学的効果が、限られた機能の改変体を用いた処理により惹起され得る。１つの実
施形態では、このタンパク質の天然に存在する形態の生物学活性のサブセットを
有する改変体を用いた被験体の処置は、ＡＣＰＬＸタンパク質の天然に存在する
形態を用いた処置に対して被験体におけるより少ない副作用を有する。
【０１０９】 ＡＣＰＬＸアゴニスト（模倣物）として、またはＡＣＰＬＸアンタゴニストの
いずれかとして機能するＡＣＰＬＸタンパク質の改変体は、ＡＣＰＬＸタンパク
質アゴニストまたはアンタゴニスト活性のためのＡＣＰＬＸタンパク質の変異体
、例えば短縮型変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするこ
とにより同定され得る。１つの実施形態では、ＡＣＰＬＸ改変体の多彩なライブ
ラリーは、核酸レベルのコンビナトリアル変異誘発により生成され、そして多彩
な遺伝子ライブラリーによりコードされる。ＡＣＰＬＸ改変体の多彩なライブラ
リーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、潜在的なＡＣＰＬＸ配列
の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、あるいは、その中にＡＣＰＬＸ配
列のセットを含む（例えば、ファージディスプレイのための）より大きな融合タ
ンパク質のセットとして発現可能であるように、遺伝子配列に酵素的に連結する
ことにより産生され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なＡＣＰＬＸ
改変体のライブラリーを産生するために用いられ得る種々の方法がある。縮重遺
伝子配列の化学的合成は、自動化ＤＮＡ合成機中で実施され得、次いでこの合成
遺伝子は、適切な発現ベクター中に連結される。遺伝子の縮重セットの使用は、
１つの混合物において、潜在的なＡＣＰＬＸ配列の所望のセットをコードする配
列のすべての供給を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当該
分野で公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ
５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０
５６；Ｉｋｅら（１９８３）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １１：４７７を参照
のこと）。
【０１１０】 （ポリペプチドライブラリー） さらに、ＡＣＰＬＸタンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーを用
いて、ＡＣＰＬＸタンパク質の改変体のスクリーニングおよび引き続く選択のた
めのＡＣＰＬＸフラグメントの多彩な集団を生成し得る。１つの実施形態では、
コード配列フラグメントのライブラリーは、ＡＣＰＬＸコード配列の二本鎖ＰＣ
Ｒフラグメントを、１分子あたり約１つのみのニックが生じる条件下、ヌクレア
ーゼで処理すること、二本鎖ＤＮＡを変性させること、異なるニック産物からの
センス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成するためにこのＤＮＡを
再生すること、Ｓ１ヌクレアーゼを用いた処理により再形成された二本鎖から一
本鎖部分を除去すること、および得られるフラグメントライブラリーを発現ベク
ター中に連結することにより生成し得る。この方法により、ＡＣＰＬＸタンパク
質の種々のサイズのＮ末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリ
ーが派生し得る。
【０１１１】 点変異または短縮により作成されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産
物をスクリーニングするため、選択された性質を有する遺伝子産物のｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技法が当該分野で公知である
。このような技法を、ＡＣＰＬＸタンパク質のコンビナトリアル変異誘発により
生成された遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用可能である。大きな
遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、高スループット分析に適した
最も広く用いられる技法は、代表的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現
ベクター中にクローニングすること、得られるベクターのライブラリーで適切な
細胞を形質転換すること、およびこのコンビナトリアル遺伝子を、所望の活性の
検出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする
条件下で発現することを含む。ライブラリー中の機能的変異体の頻度を増大する
新規技法であるリクルーシブエンセブル変異誘発（ＲＥＭ）を、スクリーニング
アッセイと組み合わせて用い、ＡＣＰＬＸ改変体を同定し得る（Ａｒｋｉｎおよ
びＹｏｕｒｖａｎ（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇ
ｒａｖｅら（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６：３２７
−３３１）。
【０１１２】 （ＡＣＰＬＸ抗体） ＡＣＰＬＸタンパク質に対する抗体、またはＡＣＰＬＸタンパク質のフラグメ
ントもまた、本発明に含まれる。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は
、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な
部分（すなわち、抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む
分子）をいう。このような抗体としては、ポリクロナール抗体、モノクロナール
抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆabフラグメント、Ｆab' フラグメントおよび
Ｆ(ab')2フラグメント、ならびにＦab発現ライブラリーが挙げられるが、これら
に限定されない。一般的に、ヒト由来の抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、
ＩｇＥおよびＩｇＤの任意のクラスに関連し、これらは分子内に存在する重鎖の
性質によってお互いに異なる。特定のクラスは同様にサブクラス（例えば、Ｉｇ
Ｇ1、ＩｇＧ2など）を有する。さらに、ヒトにおいては、軽鎖はκ鎖またはλ鎖
であり得る。本明細書中で抗体に対する参照は、ヒト抗体種のすべてのこのよう
なクラス、サブクラスおよび型に対する参照を含む。
【０１１３】 本発明の単離されたＡＣＰＬＸ関連タンパク質は、抗原、またはその一部もし
くはフラグメントとして役立つことが意図され得、そしてさらに、免疫原として
使用され、ポリクロナール抗体およびモノクロナール抗体の調製のための標準的
な技術を用いて、抗原に免疫特異的に結合する抗体を生成し得る。全長タンパク
質が使用され得るか、あるいは本発明は、免疫原として使用するための抗原の抗
原性ペプチドフラグメントを提供する。抗原性ペプチドフラグメントは、全長タ
ンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２において示されるアミノ酸配列）
の少なくとも６アミノ酸残基を含み、そしてそれらのエピトープを含み、その結
果このペプチドに対して惹起された抗体は、全長タンパク質またはこのエピトー
プを含む任意のフラグメントと特定の免疫複合体を形成する。好ましくは、抗原
性ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基、または少なくとも１５アミノ酸残
基、または少なくとも２０アミノ酸残基、または少なくとも３０アミノ酸残基を
含む。この抗原性ペプチドにより含まれる好ましいエピトープは、そのペプチド
表面上に位置するタンパク質の領域であり；通常、これらは親水性領域である。
【０１１４】 本発明の特定の実施形態では、抗原性ペプチドにより包含される少なくとも１
つのエピトープは、ＡＣＰＬＸタンパク質の表面上に位置するＡＣＰＬＸ関連タ
ンパク質の領域、例えば、親水性領域である。ヒトＡＣＰＬＸ関連タンパク質配
列の疎水性分析は、ＡＣＰＬＸ関連タンパク質のどの領域が特に親水性であるか
、そしてそれ故、抗体産生を標的にするために有用な表面残基をコードするよう
であるかを示す。抗体産生を標的にする手段として、親水性および疎水性の領域
を示すヒドロパシープロットを、例えば、フーリエ変換とともにまたはなしの、
Ｋｙｔｅ ＤｏｏｌｉｔｔｌｅまたはＨｏｐｐ Ｗｏｏｄｓ法を含む、当該分野
で周知の任意の方法により生成し得る。例えば、それらの全体が本明細書に参考
として援用される、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：３８２４−３８２８；ＫｙｔｅおよびＤｏｏ
ｌｉｔｔｌｅ １９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１４２を参
照のこと。抗原性タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログもしく
はホモログ内の１つ以上のドメインに対して特異的な抗体はまた、本明細書中で
提供される。
【０１１５】 本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログ
もしくはオルソログは、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の
産生における免疫原として利用され得る。
【０１１６】 当該分野において公知の種々の手順が、本発明のタンパク質、またはその誘導
体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオルソログに対して指向される
ポリクロナール抗体またはモノクロナール抗体の産生のために使用され得る（例
えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｍｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａ
ｒｌｏｗ Ｅ，およびＬａｎｅ Ｄ，１９９８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ、ＮＹ（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。これら
の抗体のうちのいくつかは、以下で考察される。
【０１１７】 （ポリクロナール抗体） ポリクロナール抗体の産生のために、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ
、ヤギ、マウスまたは他の動物）は、ネイティブなタンパク質、その合成改変体
、または前記の誘導体を用いる１以上の注射によって免疫され得る。適切な免疫
原性調製物は、例えば、天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク
質を提示する化学的に合成されたポリペプチド、または組換え的に発現される免
疫原性タンパク質を含み得る。さらに、このタンパク質は、免役されている哺乳
動物において免疫原性であることが知られている第２のタンパク質に結合体化さ
れ得る。このような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘ
モシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、および大豆トリプシンイ
ンヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。この調製物はさらに、アジ
ュバントを含み得る。種々のアジュバントが免疫学的応答を増加させるために使
用され、このようなアジュバントとしては、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ（完全および不完
全）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、
リゾレシチン、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、
ペプチド、油乳濁液、ジニトロフェノールなど）、ヒトにおいて使用可能なアジ
ュバント（例えば、Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−ＧｕｅｒｉｎおよびＣ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）または類似の免疫刺激剤が挙げ
られるが、これらに限定されない。使用され得るアジュバントのさらなる例とし
ては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロー
スジコリノミコレート）が挙げられる。
【０１１８】 免疫原性タンパク質に対して指向されるポリクロナール抗体分子は、哺乳動物
から（例えば、血液から）単離され得、そして周知の技術（例えば、プロテイン
ＡまたはプロテインＧを用いるアフィニティクロマトグラフィー（これは、主に
免疫血清のＩｇＧ画分を提供する））によってさらに精製され得る。続いて、ま
たは代替的に、求められている免疫グロブリンの標的である特定の抗原またはそ
の抗原のエピトープがカラムに固定され、免疫アフィニティクロマトグラフィー
によって免疫特異的抗体を精製し得る。免疫グロブリンの精製は、例えば、Ｄ．
Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓ
ｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ ＰＡより発行）、第１４巻、第８号
（２０００年４月１７日）、２５〜２８頁）によって考察される。
【０１１９】 （モノクローナル抗体） 本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノク
ローナル抗体組成物」は、独特の軽鎖遺伝子産物および独特の重鎖遺伝子産物か
らなる唯一の分子種の抗体分子を含む抗体分子の集団をいう。特に、モノクロー
ナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、すべての分子の集団に同一である。従
って、ＭＡｂは、抗原への独特の結合親和性によって特徴付けられる抗原の特定
のエピトープと免疫反応可能な抗原結合部位を含む。
【０１２０】 モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ方法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭ
ｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載されるよう
な方法）を使用して調製され得る。ハイブリドーマ方法において、マウス、ハム
スター、または他の適切な宿主細胞は、免疫因子で代表的に免疫され、免疫因子
に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生し得るリンパ球を誘発する。
あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。
【０１２１】 免疫因子としては、代表的に、タンパク質抗原、そのフラグメントまたはその
融合タンパク質が挙げられる。一般的には、以下のいずれかである：ヒト起源の
細胞が望まれる場合は、末梢血リンパ球が使用され、または非ヒト哺乳動物供給
源が望まれる場合は、脾臓細胞またはリンパ節細胞が使用される。次いで、適切
な融合因子（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して、リンパ球を不死化
細胞株に融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔ
ｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）第５９−１０３頁）。不死
化細胞株は、哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞に
通常形質転換される。通常ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハ
イブリドーマ細胞は、１以上の物質（融合されていない不死化細胞の増殖も生存
も阻害する）を適切に含む適切な培養培地中で培養され得る。例えば、親の細胞
が酵素、ヒポキサンチングアニンンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰ
ＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマからの培養培地は、代表的に
ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、
それらの物質はＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を阻害する。
【０１２２】 好ましい不死化細胞株は、効率的に融合する細胞株であり、それらは選択され
た抗体産生細胞の安定な高レベルの抗体の発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のよ
うな培地に敏感である。より好ましい不死化細胞株はマウス骨髄腫細胞株であり
、それらを、例えば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉ
ｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａおよ
びＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａ
ｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから得ることが可能である。ヒト骨髄腫および
マウス−ヒト骨髄腫細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載
される（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）
；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃ
ｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｍａｒｃ
ｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８７）第５１−６３
頁）。
【０１２３】 次いで、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、抗原に対するモノクロ
ーナル抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞
によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって決定
されるか、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（Ｒ
ＩＡ）または酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ））によって決定さ
れる。このような技術およびアッセイは、当該分野で公知である。モノクローナ
ル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード分析によ
って決定され得る。好ましくは、標的抗原に対する高い程度の特異性および高結
合親和性を有する抗体が、単離される。
【０１２４】 所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、希釈手順を限定することによって
、クローンをサブクローニングし得、そして標準方法によって増殖し得る。例え
ば、この目的のために適切な培養培地としては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄ
ｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭｅｄｉｕｍおよびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙
げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物内の腹水としてインビボ
で増殖され得る。
【０１２５】 サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリ
ン精製手順（例えば、タンパク質Ａセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマ
トグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィー
）によって、培養培地または腹水から、単離または精製され得る。
【０１２６】 モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１
６，５６７号に記載される方法）によって作製され得る。本発明のモノクローナ
ル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重
鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプロ
ーブを使用することによって）容易に単離され得、そして配列決定され得る。本
発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ
。一旦単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに配置され得、次いでそれらは、
宿主細胞（例えば、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないサルＣ
ＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞）に
トランスフェクトされ、組換え宿主細胞内でのモノクローナル抗体の合成を得る
。ＤＮＡはまた、例えば、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常
ドメインをコードする配列の置換（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒ
ｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８，８１２−１３（１９９４））によってか、ま
たは非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列のすべてまたは一部の
配列をコードする免疫グロブリンへの共有結合的な連結によって改変され得る。
このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常領域に置換さ
れ得るか、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変領域に置換され得、
キメラ二価の抗体を作製する。
【０１２７】 （ヒト化抗体） 本発明のタンパク質抗原に対する抗体は、さらにヒト化抗体またはヒト抗体を
含み得る。これらの抗体は、投与された免疫グロブリンに対するヒトの免疫応答
を引き起こさないヒトへの投与に適する。抗体のヒト化形態は、キメラ免疫グロ
ブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ
、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2または他の抗体の抗原結合配列）であり、それらは
主にヒト免疫グロブリンの配列から構成され、そして非ヒト免疫グロブリンに由
来する最小の配列を含む。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列についてのげっ歯
類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列の置換によって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方
法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉ
ｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅ
ｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）
）の後に達成され得る。（米国特許第５，２２５，５３９号もまた参照のこと。
）いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖ骨格（ｆｒａｍｅｗｏｒ
ｋ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、患者
の抗体においても、移入されたＣＤＲまたは骨格配列においても見出されない残
基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、すべての少なくとも１つ、および代表的
には２つの可変領域を実質的に含む。これらの領域内で、すべてのまたは実質的
にすべてのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンの領域に対応し、そしてすべてま
たは実質的にすべての骨格領域はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の領域に
対応する。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、代表的には、
ヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を必要に応じて含む（Ｊｏｎｅｓら、１９
８６；Ｒｉｅｃｈａｍａｎｎら、１９８８；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏ
ｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２））。
【０１２８】 （ヒト抗体） ＣＤＲを含む軽鎖および重鎖の両方の全体配列がヒト遺伝子から本質的に生じ
る抗体分子に、ヒト抗体は十分に関連する。このような抗体を、「ヒト抗体」、
または「十分なヒト抗体」と本明細書中で呼ぶ。ヒトモノクローナル抗体は、ト
リオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術によって調製され得る；ヒトＢ細胞ハイブリドー
マ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４：７２を
参照のこと）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリド
ーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥ
Ｓ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ
．，第７７−９６頁）。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実行において使用
され得、そしてヒトハイブリドーマの使用によってか（Ｃｏｔｅら、１９８３．
Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０を参照のこ
と）、またはインビトロでのＥｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓを用いたヒ
トＢ細胞による形質転換によって（Ｃｏｌｅら、１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡ
Ｌ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ
Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，第７７−９６頁を参照のこと）産生され得る。
【０１２９】 さらに、ヒト抗体はまた、さらなる技術（ファージディスプレイライブラリー
（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７
：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８
１（１９９１））を含む）を使用して産生され得る。同様に、ヒト免疫グロブリ
ン遺伝子座をトランスジェニック動物（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が
、部分的または完全に不活化されているマウス）に導入することによって、ヒト
抗体は作製され得る。チャレンジの際にヒト抗体産生が観察され、このことはす
べての点（遺伝子再配列、アセンブリー、および抗体レパートリーを含む）でヒ
トにおいて観察されたものに密接に類似する。このアプローチは、例えば、以下
に記載される：米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；
同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２
５号；同第５，６１１，０１６号、およびＭａｒｋｓら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ １０、７７９−７８３（１９９２））；Ｌｏｎｂｅｒｇら（Ｎａｔｕ
ｒｅ ３６８ ８５６−８５９（１９９４））；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（Ｎａｔｕｒ
ｅ ３６８、８１２−１３（１９９４））；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４、８４５−５１（１９９６））；Ｎｅｕｂ
ｅｒｇｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４、８２６（１９
９６））；ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３ ６５−９３（１９９５））。
【０１３０】 ヒト抗体は、抗原によるチャレンジに応答して動物の内因性抗体よりもヒト抗
体を十分に産生するように改変されたトランスジェニック非ヒト動物を使用して
、さらに産生され得る。（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０２６０２を参照のこと。）非
ヒト宿主における重免疫グロブリン鎖および軽免疫グロブリン鎖をコードする内
因性遺伝子は、不活性化されており（ｉｎｃａｐａｃｉｔａｔｅ）、そしてヒト
重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードする活性な遺伝子座は、宿主のゲノムに
挿入される。例えば、要求性ヒトＤＮＡセグメントを含む酵母人工染色体を使用
して、ヒト遺伝子は組み込まれる。次いで、すべての所望の改変を提供する動物
を、完全な改変の相補体よりもより少ない改変の相補体を含む中間トランスジェ
ニック動物を雑種することによって子孫として得る。このような非ヒト動物の好
ましい実施形態は、マウスであり、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ
９６／３４０９６に開示されるようにＸｅｎｏｍｏｕｓTMと呼ばれる。この動物
は、ヒト免疫グロブリンを十分に分泌するＢ細胞を産生する。目的の免疫原での
免疫後の動物から（例えば、ポリクローナル抗体の調製）、あるいは動物由来の
不死化されたＢ細胞（例えば、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ）
から、抗体を直接得ることが可能である。さらに、ヒト可変領域を有する免疫グ
ロブリンをコードする遺伝子は、抗体を直接得るために回復され、そして発現さ
れ得るか、または抗体のアナログ（例えば、１本鎖Ｆｖ分子）を得るために、さ
らに改変され得る。
【０１３１】 内因性免疫グロブリン重鎖の発現を欠く非ヒト宿主（マウスとして例証される
）を作製するための方法の例は、米国特許第５，９３９，５９８号に記載される
。それを、以下の工程を包含する方法によって得ることが可能である：遺伝子座
の再配置を防ぎ、そして再配置された免疫グロブリン重鎖遺伝子座の転写物の形
成を防ぐために、胚幹細胞における少なくとも１つの内因性重鎖遺伝子座由来の
Ｊセグメント遺伝子を欠失する工程であって、ここで、該欠失が、選択マーカー
をコードする遺伝子を含む標的ベクターによってもたらされる、工程；およびト
ランスジェニックマウス（その体細胞および生殖細胞は、選択マーカーをコード
する遺伝子を含む）を、胚幹細胞から作製する工程。
【０１３２】 目的の抗体（例えば、ヒト抗体）を産生する方法は、米国特許第５，９１６，
７７１号に開示される。それは以下の工程を包含する：重鎖をコードするヌクレ
オチド配列を含む発現ベクターを、培養中の１つの哺乳動物宿主細胞に導入する
工程、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、別の哺乳動物
宿主細胞に導入する工程、およびハイブリッド細胞を形成するために２つの細胞
融合する工程。ハイブリッド細胞は、重鎖および軽鎖を含む抗体を発現する。
【０１３３】 この手順のさらなる改善において、免疫原上の臨床的に関連するエピトープを
同定する方法、および関連するエピトープに高い親和性で免疫特異的に結合する
抗体を選択する相関する方法は、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５３０４９に開示される
。
【０１３４】 （Ｆabフラグメントおよび１本鎖抗体） 本発明に従って、技術は、本発明の抗原性タンパク質に特異的な１本鎖抗体の
産生に適用され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）
。さらに、方法は、Ｆab発現ライブラリーの構築に適用されて（例えば、Ｈｕｓ
ｅら、１９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１を参照のこと）
、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログについ
ての所望の特異性を有するモノクローナルＦabフラグメントの迅速かつ効果的な
同定を可能にし得る。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含む抗体フラグ
メント（（ｉ）抗体分子のペプシン消化によって産生されるＦ(ab')2フラグメン
ト；（ｉｉ）Ｆ(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって
産生されたＦabフラグメント；（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤を用いた抗体分
子の処理によって産生されたＦabフラグメント、および（ｉｖ）Ｆvフラグメン
トを含むが、これらに限定ない）は、当該分野で公知の技術によって産生され得
る。
【０１３５】 （二重特異的抗体） 二重特異的抗体は、モノクローナル抗体（好ましくはヒトモノクローナル抗体
またはヒト化されたモノクローナル抗体）であって、これは少なくとも２つの異
なる抗原に対して結合特異性を有する。この場合において、結合特異性の１つは
、本発明の抗原性タンパク質に対してである。第２の結合標的は、任意の他の抗
原であり、そして有利には細胞表面タンパク質あるいはレセプターまたはレセプ
ターサブユニットである。
【０１３６】 二重特異的抗体を作製する方法は、当該分野で公知である。伝統的に、二重特
異的抗体の組換え生成は、２つの免疫グロブリンの重鎖／軽鎖の対の同時発現に
基づき、ここでこの２つの重鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎおよ
びＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫
グロブリンの重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせのために、これらのハイブ
リドーマ（クアドローマ）は、１０の異なる抗体分子の潜在的混合物を作製し、
このうち１つのみが正確な二重特異的構造を有する。この正確な分子の精製は、
通常アフィニティークロマトグラフィー工程によって達成される。同様の手順は
、１９９３年５月１３日開示のＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋ
ｅｒら、１９９１ ＥＭＢＯ Ｊ．、１０：３６５５−３６５９において開示さ
れる。
【０１３７】 所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインは、免疫
グロブリン定常ドメイン配列に融合され得る。この融合は、好ましくは免疫グロ
ブリン重鎖定常ドメインを有し、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくと
も部分を含む。この融合物中の少なくとも１つに存在する軽鎖結合のために必要
な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。この免疫
グロブリン重鎖融合体、および所望の場合、この免疫グロブリン軽鎖をコードす
るＤＮＡは、別々の発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主生物体に同時ト
ランスフェクトされる。二重特異的抗体の作製のさらなる詳細は、例えば、Ｓｕ
ｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（
１９８６）を参照のこと。
【０１３８】 ＷＯ９６／２７０１１に記載される別のアプローチに従って、抗体分子の対の
間の界面は、組換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーのパーセンテージ
を最大化するために操作され得る。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３
領域の少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子の界面からの
１つ以上の小さなアミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはト
リプトファン）で置換される。大きな側鎖についての同一または同様のサイズの
代償的な「空洞」は、大きなアミノ酸側鎖を小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラ
ニンまたはスレオニン）で置換することによって、第２の抗体分子の界面上に生
成される。このことは、ホモダイマーのような他の不必要な最終生成物に対して
、ヘテロダイマーの収量を増加するための機構を提供する。
【０１３９】 二重特異的抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’） 2 二重特異的抗体）として調製され得る。抗体フラグメントから二重特異的抗体
を作製するための技術は、文献において記載される。例えば、二重特異的抗体は
、化学結合を使用して調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２
９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体がタンパク分解的に切断されてＦ（
ａｂ’）2フラグメントを作製する手順を記載する。これらのフラグメントは、
ビシナルジチオールを安定化し、そして分子間ジスルフィド形成を阻止するため
に、ジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元される。次いで、この作
製されたＦａｂ’フラグメントは、チオニトロベンゾエート（ＴＢＮ）誘導体に
変換される。次いで、Ｆａｂ’−ＴＢＮ誘導体の１つは、メルカプトエチルアミ
ンでの還元によってＦａｂ’−チオールに再変換され、そしてこれは等モル量の
他のＦａｂ’−ＴＢＮ誘導体と混合されて二重特異的抗体を形成する。生成され
た二重特異的抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用され得る。
【０１４０】 さらに、Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され得、そして
化学的にカップリングされて二重特異的抗体を形成する。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ
．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全にヒト化され
た二重特異的抗体Ｆ（ａｂ’）2分子の生成を記載する。各Ｆａｂ’フラグメン
トは、Ｅ．ｃｏｌｉから別々に分泌され、そしてインビトロでの指向された化学
的カップリングに供され、二重特異的抗体を形成する。従って、形成されたこの
二重特異的抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞および正常なヒト
Ｔ細胞に結合し得、そしてヒト胸部腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の
溶解性活性を誘因し得る。
【０１４１】 組換え細胞培養物から直接二重特異的抗体フラグメントを作製し、そして単離
するための種々の技術が記載されてきた。例えば、二重特異的抗体は、ロイシン
ジッパーを使用して産生される。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質
由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦ
ａｂ’部分に結合される。この抗体ホモダイマーは、ヒンジ領域で還元されてモ
ノマーを形成し、次いで再酸化されて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法
はまた、抗体ホモダイマーの産生のために使用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８
（１９９３）に記載されるこの「ディアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）」技術は、
二重特異的抗体フラグメントを作製するための代替的な機構を提供した。このフ
ラグメントは、短すぎて同じ鎖上の２つのドメインの間を対にできないリンカー
によって軽鎖可変領域（ＶL）に接続された重鎖可変領域（ＶH）を含む。従って
、１つのフラグメントのＶHおよびＶLドメインは、別のフラグメントの相補的な
ＶLおよびＶHドメインと対になるように強制され、これによって２つの抗原結合
部位が形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用によって二重特異的抗体フ
ラグメントを作製するための別のストラテジーもまた、報告されてきた。Ｇｒｕ
ｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。
【０１４２】 ２つより多い結合価を有する抗体が意図される。例えば、三重特異的抗体が調
製され得る。Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０１４３】 例示的な二重特異的抗体は、２つの異なるエピトープに結合し得、このうち少
なくとも１つは、本発明のタンパク質抗原に起源を有する。あるいは、免疫グロ
ブリン分子の抗抗原性アームは、Ｔ細胞レセプター分子のような白血球（例えば
、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、またはＢ７）、あるいはＩｇＧに対するＦｃレセ
プター（Ｆｃ Ｒ）（例えば、Ｆｃ ＲＩ（ＣＤ６４）、Ｆｃ ＲＩＩ（ＣＤ３
２）およびＦｃ ＲＩＩＩ（ＣＤ１６））上の標的化分子に結合するアームに、
特定の抗原を発現する細胞に対する細胞の防御機構に焦点を合わせるように結合
され得る。二重特異的抗体はまた、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞傷害
性因子に指向するために使用され得る。これらの抗体は抗原結合アーム、および
細胞傷害性因子または放射性核種キレーター（例えば、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ
、ＤＯＴＡ、またはＴＥＴＡ）に結合するアームを保有する。目的の別の二重特
異的抗体は、本明細書中に記載のタンパク質抗原に結合し、そしてさらに組織因
子（ＴＦ）に結合する。
【０１４４】 （ヘテロ接合体抗体） ヘテロ接合体抗体はまた、本発明の範囲内である。ヘテロ接合体抗体は、２つ
の共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不必要
な細胞に標的化するために（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ
感染の処置のために（ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０
３０８９）提案されてきた。この抗体（架橋剤を含む抗体を含む）は、インビト
ロで、合成タンパク質化学において公知の方法を使用して調製され得ることが意
図される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応の使用またはチオエーテ
ル結合の形成によって構築され得る。この目的のための適切な試薬の例としては
、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデート、ならびに
例えば米国特許第４，６７６，９８０号において開示される試薬が挙げられる。
【０１４５】 （エフェクター機能操作） 本発明の抗体を、エフェクター機能について、例えば癌の処置における抗体の
効力を増大するように改変することが望ましい。例えば、システイン残基は、Ｆ
ｃ領域に導入され得、これによってこの領域における鎖間ジスルフィド結合の形
成を可能にする。従って、作製されるこのホモダイマー抗体は、改良されたイン
ターナリゼーションの能力および／または増加した補体媒介細胞死滅、ならびに
抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．、１７６：１１９１−１１９５（１１９２）およびＳｈｏｐｅｓ、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照のこと。増大し
た抗腫瘍活性を有するホモダイマー抗体はまた、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５３：２５６０−２６５６（１９９３）に記載されるヘテロ
二官能性架橋剤を使用して調製され得る。あるいは、抗体は操作され得、これは
二重のＦｃ領域を有し、そしてこれによって増大した補体溶解およびＡＤＣＣの
能力を有し得る。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ
Ｄｅｓｉｇｎ，３：２１９−２３０（１９８９）を参照のこと。
【０１４６】 （免疫接合体） 本発明はまた、細胞傷害性の薬剤（例えば、化学療法剤、毒素（例えば、細菌
、真菌、植物、または動物起源の酵素学的に活性な毒素、あるいはそれらのフラ
グメント）、または放射性同位体（すなわち、放射性接合体））に結合した抗体
を含む免疫接合体に関する。
【０１４７】 このような免疫接合体の作製において有用な化学療法剤は、上記に記載される
。使用され得る酵素学的に活性な毒素およびそれらのフラグメントとしては、ジ
フテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、
モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏ
ｒｄｉｉタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏ
ｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡ
Ｐ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａインヒビター、クルシン（
ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、ｓｅｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉ
ｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉ
ｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノ
マイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、およ
びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎ）が挙げられる。種々の放射性核種は
、放射性結合した抗体の作製のために利用可能である。その例としては、212Ｂ
ｉ、131Ｉ、131Ｉｎ、90Ｙ、および186Ｒｅが挙げられる。
【０１４８】 抗体および細胞傷害性因子の接合体は、種々の二官能性タンパク質−カップリ
ング剤（例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロ
ピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）（Ｉ
Ｔ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデート Ｈ
ＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド
（例えば、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ））、ビスアジ
ド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−
ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレ
ンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６−ジイソシアネート
）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジ
ニトロベンゼン））を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔ
ｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載されるよう
に調製され得る。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチル
ジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体
への結合のための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこ
と。
【０１４９】 別の実施形態において、腫瘍の前標的化における利用のために、この抗体は、
「レセプター」（例えば、ストレプトアビジン）に結合され得、ここで抗体−レ
セプター接合体は患者に投与され、続いて除去剤を使用して結合していない接合
体が循環から除去され、次いで細胞傷害性因子に次々に結合する「リガンド」（
例えば、アビジン）が投与される。
【０１５０】 （ＡＣＰＬＸ組換え発現ベクターおよび宿主細胞） 本発明の別の局面は、ＡＣＰＬＸタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグ
メント、アナログ、もしくはホモログをコードする核酸を含むベクター、好まし
くは発現ベクターに関する。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は
、これが接続された別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。ベクターの１つの型
は「プラスミド」であり、これはさらなるＤＮＡセグメントが連結し得る環状の
二本鎖ＤＮＡループをいう。ベクターの別の型はウイルス性ベクターであり、こ
こでさらなるＤＮＡセグメントはこのウイルス性ゲノムに連結され得る。特定の
ベクターは宿主細胞中で自発的に複製し得、この中に導入される（例えば、細菌
の複製起源を有する細菌ベクターおよびエピソームの哺乳類ベクター）。他のベ
クター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入される際に
宿主細胞のゲノムに組み込まれ、そしてこれによって宿主のゲノムと同調して複
製される。さらに、特定のベクターは、これが作動可能に連結される遺伝子の発
現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で「発現ベクター」といわ
れる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラ
スミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は
、このプラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるため、交換可
能に使用され得る。しかし、本発明は、ウイルス性ベクター（例えば、複製欠損
レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような発現ベク
ターのこのような他の形態を含むことを意図し、これは等価な機能を果たす。
【０１５１】 本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸を、宿主細胞における核酸の発
現に適切な形態で含み、これはこの組換え発現ベクターが、発現のために使用さ
れる宿主細胞に基いて選択される１つ以上の調節配列を含むこと意味し、これは
発現される核酸配列に作動可能に連結される。組換え発現ベクターにおいて、「
作動可能に連結」は、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可
能にする（例えば、このベクターが宿主細胞に導入される場合、インビトロ転写
／翻訳系または宿主細胞において）ような様式で調節配列に連結されることを意
味することを意図する。
【０１５２】 用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメ
ント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調
節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣ
ＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５、Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に
記載されている。調節配列は、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の
構成的発現を指向する配列、および特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配
列の発現を指向する配列（例えば、組織特異的調節配列）を含む。発現ベクター
の設計が形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベル
などのような因子に依存し得ることは当業者に理解される。本発明の発現ベクタ
ーは、宿主細胞に導入され、それにより、本明細書に記載されるような核酸によ
りコードされるタンパク質またはペプチド（融合タンパク質または融合ペプチド
を含む）（例えば、ＡＣＰＬＸタンパク質、ＡＣＰＬＸタンパク質の変異形態、
融合タンパク質など）を生成し得る。
【０１５３】 本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞における、
ＡＣＰＬＸタンパク質の発現のために設計され得る。例えば、ＡＣＰＬＸタンパ
ク質は、細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（
バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞におい
て発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳ
ＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧ
Ｙ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ
．（１９９０）においてさらに考察される。あるいは、組換え発現ベクターは、
例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、インビト
ロで転写および翻訳され得る。
【０１５４】 原核生物におけるタンパク質の発現は、最も頻繁には、融合タンパク質または
非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成的プロモーターまたは誘導性
プロモーターを含むベクターを有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉにおい
て実行される。融合ベクターは、そこにコードされるタンパク質に、通常、組換
えタンパク質のアミノ末端に、多数のアミノ酸を付加する。このような融合ベク
ターは、代表的には、以下の３つの目的のために役立つ：（ｉ）組換えタンパク
質の発現を増加させること；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解度を増加させるこ
と；および（ｉｉｉ）親和性精製においてリガンドとして作用することによって
組換えタンパク質の精製の際に補助すること。しばしば、融合発現ベクターにお
いて、タンパク質分解の切断部位が、融合部分と組換えタンパク質との結合部に
導入され、そして融合タンパク質の精製の後に、組換えタンパク質が組換えタン
パク質の融合部分から分離されることを可能にする。このような酵素、およびそ
の同族の認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む
。代表的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（
ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを、それぞれ、標
的の組換えタンパク質に融合するｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７
：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖ
ｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔ
ａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
【０１５５】 適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍ
ｒａｎｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ １１
ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧ
Ｙ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が
挙げられる。
【０１５６】 Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大化するための１つのストラ
テジーは、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力が損なわれた宿
主細菌中でタンパク質を発現させることである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，
ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ Ｉ
Ｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８を参照のこと。別のスト
ラテジーは、各アミノ酸についての個々のコドンが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて優先
的に利用されるように、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変更するこ
とである（例えば、Ｗａｄａら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２
０：２１１１−２１１８を参照のこと）。本発明の核酸配列のこのような変更は
、標準的なＤＮＡ合成技術によって実行され得る。
【０１５７】 別の実施形態において、ＡＣＰＬＸ発現ベクターは、酵母発現ベクターである
。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ．ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現のための
ベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、（１９８７）ＥＭＢ
Ｏ Ｊ ６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗ
ｉｔｚ、（１９８２）Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃ
ｈｕｌｔｚら、（１９８７）Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌ
ｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉ
ｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【０１５８】 あるいは、ＡＣＰＬＸは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細
胞中で発現され得る。培養された昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）中でのタンパ
ク質の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ
（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３：２１５６−２１
６５）およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９
）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９）が挙げられる。
【０１５９】 なお別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用し
て、哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８
（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（
Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ ６：１８７−１９５）が挙げられ
る。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、
ウイルスの調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用されるプロ
モーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシ
ミアンウイルス４０に由来する。原核生物細胞および真核生物細胞の両方のため
の他の適切な発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬ
ＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章および第１７章を参照
のこと。
【０１６０】 別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型（例え
ば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現する）中で優先的に核酸の
発現を指向し得る。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切
な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（
肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら，１９８７．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １：２６８−
２７７）、リンパ特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ，１９８
８．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、特に、Ｔ細胞レセプタ
ープロモーター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９．ＥＭＢＯ
Ｊ ８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら，１９８
３．Ｃｅｌｌ ３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，
１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７４１−７４８）のプロモーター、ニューロン特異
的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅおよ
びＲｕｄｄｌｅ，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら，１９
８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２−９１６）、および乳腺特異的プロモー
ター（例えば、ミルク乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号およ
び欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発生的に調節されるプロモ
ーターもまた含まれる（例えば、マウスホックス（ｍｕｒｉｎｅ ｈｏｘ）プロ
モーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９
：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓお
よびＴｉｌｇｈｍａｎ，１９８９．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）
。
【０１６１】 本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発
明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、そのＤＮＡ分
子は、ＡＣＰＬＸ ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（Ｄ
ＮＡ分子の転写によって）を可能にする様式で調節配列に作動可能に連結される
。種々の細胞型におけるアンチセンスＲＮＡ分子の連続的な発現を指向する、ア
ンチセンス方向でクローニングされた核酸に作動可能に連結される調節配列が選
択され得る。例えば、アンチセンスＲＮＡの構成的発現、組織特異的発現、また
は細胞型特異的発現を指向する、ウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハ
ンサー、または調節配列が選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、組換え
プラスミド、ファージミド、または弱毒化されたウイルスの形態であり得、ここ
ではアンチセンス核酸は、高効率調節領域の制御下で産生され、その活性は、ベ
クターが導入される細胞型によって決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用す
る遺伝子発現の調節の議論については、例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら、「Ａｎ
ｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ
ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１巻（１）１９８６を参照のこと。
【０１６２】 本発明の別の局面は、本発明の組換え発現べクターが導入された宿主細胞に関
する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で、交換可能
に使用される。このような用語は、特定の対象の細胞をいうのみでなく、そのよ
うな細胞の子孫または潜在的な子孫をいうことが理解される。変異または環境的
影響のいずれかに起因して、特定の改変が次の世代において生じ得るので、この
ような子孫は、実際、親の細胞と同一でないかもしれないが、なお、本明細書中
で使用されるような用語の範囲内に含まれる。
【０１６３】 宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、Ａ
ＣＰＬＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母ま
たは哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）または
ＣＯＳ細胞）で発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０１６４】 ベクターＤＮＡは、従来的な形質転換技術またはトランスフェクション技術を
介して原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用され
る場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来性の核酸
（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための当該分野で認識される種々の技
術をいうことを意図し、これらには、リン酸カルシウム共沈殿または塩化カルシ
ウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクショ
ン、またはエレクトロポレーションが含まれる。宿主細胞を形質転換またはトラ
ンスフェクションするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵ
ＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．第２版、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）および他の実験室マニュアル
に見出され得る。
【０１６５】 哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのために、使用される発現ベクタ
ーおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞のほんの一部のみが外来Ｄ
ＮＡをそのゲノムに組み込まれ得ることが知られている。これらの要素を同定お
よび選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコード
する遺伝子が、一般的には目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。種々の
選択マーカーには、薬物（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトト
レキサート）に対する耐性を付与するものが含まれる。選択マーカーをコードす
る核酸は、ＡＣＰＬＸをコードするベクターと同じベクター上で宿主細胞に導入
され得るか、あるいは別々のベクター上で導入され得る。導入された核酸で安定
にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定され得る（例えば、選
択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存し、一方他の細胞は死滅する）。
【０１６６】 本発明の宿主細胞（例えば、培養中の原核生物宿主細胞および真核生物宿主細
胞）は、ＡＣＰＬＸタンパク質を産生（すなわち、発現）するために使用され得
る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して、ＡＣＰＬＸタンパ
ク質を産生するための方法を提供する。１つの実施形態において、本発明の方法
は、ＡＣＰＬＸタンパク質が産生されるような適切な培地中で、本発明の宿主細
胞（ここに、ＡＣＰＬＸタンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入され
た）を培養する工程を包含する。別の実施形態において、本発明はさらに、培地
または宿主細胞からＡＣＰＬＸタンパク質を単離する工程を包含する。
【０１６７】 （トランスＡＣＰＬＸジェニック動物） 本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使
用され得る。例えば、１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＡＣＰＬ
Ｘタンパク質コード配列が導入された、受精した卵母細胞または胚性幹細胞であ
る。次いで、このような宿主細胞は、外因性のＡＣＰＬＸ配列がそのゲノムに導
入された非ヒトトランスジェニック動物、または内因性のＡＣＰＬＸ配列が変更
された相同組換え動物を作製するために使用され得る。このような動物は、ＡＣ
ＰＬＸタンパク質の機能および／または活性を研究するため、ならびにＡＣＰＬ
Ｘタンパク質活性のモジュレーターを同定および／または評価するために有用で
ある。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」とは、非ヒト
動物であり、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは、ラットまたはマウス
のような齧歯類であり、その動物の１つ以上の細胞が、導入遺伝子を含む。トラ
ンスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤ
ギ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。導入遺伝子は、細胞（この細胞からト
ランスジェニック動物が発生する）のゲノムに組み込まれかつ成熟動物のゲノム
に残存する、外因性のＤＮＡであり、それによって、トランスジェニック動物の
１つ以上の細胞型または組織においてコードされた遺伝子産物の発現を指向する
。本明細書中で使用される場合、「相同組換え動物」とは、非ヒト動物であり、
好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはマウスであり、ここで内因性のＡＣ
ＰＬＸ遺伝子は、内因性の遺伝子と、その動物の発生の前にその動物の細胞（例
えば、その動物の胚細胞）に導入された外因性のＤＮＡ分子との間の相同組換え
によって変更されている。
【０１６８】 本発明のトランスジェニック動物は、ＡＣＰＬＸをコードする核酸を、例えば
、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって、受精した卵母細胞
の雄性前核に導入すること、および卵母細胞が偽妊娠した雌性養育動物（ｆｏｓ
ｔｅｒ ａｎｉｍａｌ）中で発達することを可能にすることによって作製され得
る。配列番号１を含む配列は、非ヒト動物のゲノムに導入遺伝子として導入され
得る。あるいは、ヒトのＡＣＰＬＸ遺伝子の非ヒトホモログ（例えば、マウスの
ＡＣＰＬＸ遺伝子）は、ヒトのＡＣＰＬＸ ｃＤＮＡに対するハイブリダイゼー
ションに基づいて単離され得（以下にさらに記載される）、そして導入遺伝子と
して使用され得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた導入遺
伝子中に含まれ得、その導入遺伝子の発現の効率を増大させ得る。組織特異的調
節配列（単数または複数）は、特定の細胞に対して、ＡＣＰＬＸタンパク質の発
現を指向するように、ＡＣＰＬＸ導入遺伝子に作動可能に連結され得る。胚の操
作およびマイクロインジェクションを介するトランスジェニック動物（特に、マ
ウスのような動物）を生成するための方法は、当該分野で慣習的になっており、
そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号；同第４，８７０，００９号；
および同第４，８７３，１９１号；ならびにＨｏｇａｎ １９８６、ＭＡＮＩＰ
ＵＬＡＴＩＮＧ ＴＨＥ ＭＯＵＳＥ ＥＭＢＲＹＯ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。同様の方法は、他のトランスジェ
ニック動物の作製のために使用される。トランスジェニック初代（ｆｏｕｎｄｅ
ｒ）動物は、そのゲノムにおけるＡＣＰＬＸ導入遺伝子の存在および／またはそ
の動物の組織または細胞中のＡＣＰＬＸ ｍＲＮＡの発現に基づいて同定され得
る。次いで、トランスジェニック初代動物は、導入遺伝子を有するさらなる動物
を繁殖させるために使用され得る。さらに、ＡＣＰＬＸタンパク質をコードする
導入遺伝子を有するトランスジェニック動物は、さらに、他の導入遺伝子を有す
る他のトランスジェニック動物に繁殖させ得る。
【０１６９】 相同組換え動物を作製するために、ＡＣＰＬＸ遺伝子の少なくとも一部を含む
ベクターを調製する。この遺伝子において、欠失、付加、または置換が導入され
て、それによってそのＡＣＰＬＸ遺伝子が変化されている（例えば、機能的に破
壊される）。ＡＣＰＬＸ遺伝子はヒト遺伝子（例えば、配列番号１のｃＤＮＡ）
であり得るが、より好ましくは、ヒトのＡＣＰＬＸ遺伝子の非ヒトホモログであ
る。例えば、配列番号１のヒトのＡＣＰＬＸ遺伝子のマウスホモログは、マウス
ゲノムにおいて内因性のＡＣＰＬＸ遺伝子を変更するのに適切な相同組換えベク
ターを構築するために使用され得る。１つの実施形態において、そのベクターは
、相同組換えに際して、その内因性のＡＣＰＬＸ遺伝子が、機能的に破壊される
ように設計される（すなわち、機能的タンパク質をもはやコードしない；「ノッ
クアウト」ベクターともいわれる）。
【０１７０】 あるいは、このベクターは、相同組換えに対して、内因性ＡＣＰＬＸ遺伝子が
変異されるか、あるいはさもなければ、変更されるが、なお機能性タンパク質を
コードするように、設計され得る（例えば、上流の調節領域が変更され、それに
よって内因性ＡＣＰＬＸタンパク質の発現を変更し得る）。相同組換えベクター
において、ＡＣＰＬＸ遺伝子の変更された部分は、ＡＣＰＬＸ遺伝子のさらなる
核酸によって、その５’末端および３’末端で隣接され、相同組換えが、ベクタ
ーによって保有される外因性ＡＣＰＬＸ遺伝子と胚性幹細胞中の内因性ＡＣＰＬ
Ｘ遺伝子との間で起こることを可能にする。さらなる隣接するＡＣＰＬＸ核酸は
、内因性遺伝子との首尾よい相同組換えのために十分な長さである。典型的に、
数キロベースの隣接するＤＮＡ（５’末端および３’末端の両方における）が、
ベクターに含まれる。例えば、相同組換えベクターの記述についてＴｈｏｍａｓ
ら（１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：５０３を参照のこと。このベクターは、（例え
ば、エレクトロポレーションによって）胚性幹細胞株に導入され、導入されたＡ
ＣＰＬＸ遺伝子が内因性ＡＣＰＬＸ遺伝子と相同組換えした細胞が、選択される
（例えば、Ｌｉら（１９９２）Ｃｅｌｌ ６９：９１５を参照のこと）。
【０１７１】 次いで、選択された細胞が、動物（例えば、マウス）の胚盤胞へ注入され、凝
集キメラを形成する。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ（１９８７）のＴＥＲＡＴＯＣＡ
ＲＣＩＮＯＭＡＳ ＡＮＤ ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ：Ａ
ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ、Ｏｘ
ｆｏｒｄ、１１３頁〜１５２頁を参照のこと。次いで、キメラ胚が、適切な偽妊
娠雌性養育動物に移植され得、そしてその胚は分娩に到る。それらの生殖細胞中
に相同組換えされたＤＮＡを保有する子孫が、動物を繁殖させるために使用され
得、この動物の全ての細胞は、導入遺伝子の生殖系列伝達による、相同組換えさ
れたＤＮＡを含む。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築するための
方法が、さらに以下に記載される；Ｂｒａｄｌｅｙ（１９９１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ
ｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：８２３−８２９；ＰＣＴ国際公開番号：ＷＯ
９０／１１３５４；ＷＯ９１／０１１４０；ＷＯ９２／０９６８；およびＷＯ／
９３／０４１６９。
【０１７２】 別の実施形態において、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択された
系を含むトランスジェニック非ヒト動物が産生され得る。このような系の１つの
例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃ
ｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の記述については、例えば、Ｌａｋｓｏら（１
９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２−６
２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である。Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ
ら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１−１３５５を参照のこと。ｃ
ｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が導入遺伝子の発現を調節するために使用され
る場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードする
導入遺伝子を含む動物が必要となる。このような動物は、例えば、２種のトラン
スジェニック動物（一方は選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を含み
、他方はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む）を交配することによる
「二重の」トランスジェニック動物の構築によって提供され得る。
【０１７３】 本明細書中に記載されるトランスジェニック非ヒト動物のクローンがまた、Ｗ
ｉｌｍｕｔら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３に記載される
方法に従って、産生され得る。簡単には、トランスジェニック動物からの細胞（
例えば、体細胞）は単離および誘導される、増殖周期から出、そしてＧ0期に入
り得る。次いで、静止期の細胞が、例えば、電気パルスの使用により、その静止
期の細胞が単離される同種の動物から摘出された卵母細胞へ融合され得る。次い
で、この再構築された卵母細胞は培養され、これにより、これは桑実胚または未
分化胚芽細胞に発達し、次いで、偽妊娠雌性養育動物に移される。この雌性養育
動物から産まれた子孫は、その細胞（例えば、その体細胞）が単離された動物の
クローンである。
【０１７４】 （薬学的組成物） 本発明のＡＣＰＬＸ核酸分子、ＡＣＰＬＸタンパク質、および抗ＡＣＰＬＸ抗
体（これはまた、本明細書中で、「活性化合物」とも呼ばれる）、ならびにそれ
らの誘導体、フラグメント、アナログ、およびホモログが、投与に適した薬学的
組成物に組み込まれ得る。このような組成物は、典型的に、核酸分子、タンパク
質または抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用さ
れる場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的な投与に適合した、任意
および全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤およ
び吸収遅延剤（ｄｅｌａｙｉｎｇ ａｇｅｎｔ）などを含むことが意図される。
適切なキャリアは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（当該分野の標準的参考文献）（本明細書中に参考として援用
される）の最新版に記載される。このようなキャリアまたは希釈剤の好ましい例
としては、水、生理食塩水、ｆｉｎｇｅｒ溶液、デキストロース溶液、および５
％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよ
び非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油）もまた、使用され得る。薬学的に活性
な物質におけるこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任
意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である範囲を除いて、組成物に
おけるその使用が考慮される。補助活性化合物はまた、組成物へ組み込まれ得る
。
【０１７５】 本明細書中に開示される抗体はまた、免疫リポソームとして処方され得る。抗
体を含むリポソームは、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４０３０（１９８０）；および
米国特許第４，４８５，０４５号および同４，５４４，５４５号に記載される当
該分野において公知の方法によって調製される。
【０１７６】 特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰ
ＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成
物を用いる逆相蒸発法によって生成され得る。リポソームは、規定されたポアサ
イズのフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームを得る。
本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントは、Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，２５７：２８６−２８８（１９９２）に記載されるように、ジスルフィ
ド相互変換反応を介してリポソームに結合体化され得る。化学療法剤（例えば、
ドキソルビシン）は、必要ならばリポソーム内に含まれる。Ｇａｂｉｚｏｎら、
Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８１（１９）：１４８４（
１９８９）を参照のこと。
【０１７７】 本発明の薬学的組成物は、その意図される投与の経路と適合するように処方さ
れる。投与の経路の例には、非経口（例えば、静脈、皮内、皮下）投与、経口（
例えば、吸入）投与、経皮（局所的）投与、経粘膜（ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ
）投与、および直腸投与が挙げられる。非経口適用、皮内適用または皮下適用の
ために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射用水、生理
食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレング
リコールまたは他の合成溶媒のような、滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたは
メチルパラベンのような、抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムの
ような、抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような、キレート剤
；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような、緩衝液、および塩化ナトリウム
またはデキストロースのような、張度の調節のための薬剤。ｐＨは、塩酸または
水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調整され得る。非経口調製物は、アン
プル、使い捨てシリンジ、あるいはガラスまたはプラスチックから作製される多
用量のバイアル中に入れられ得る。
【０１７８】 注入使用に適した薬学的組成物は、滅菌水性溶液（ここで、水溶解性）または
分散液、および滅菌の注入可能な溶液または分散液の即座の調製のための滅菌粉
末を含む。静脈投与について、適切なキャリアには、生理食塩水、静菌水、Ｃｒ
ｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬTM（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）または
リン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成
物は、滅菌性でなければならず、そして容易な注入性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉ
ｔｙ）が存在する程度に流動性であるべきである。これは、製造および保存の条
件下で安定でなければならず、そして、細菌および真菌のような微生物の汚染行
為に対して保護されるべきである。このキャリアは、例えば、以下を含む溶媒ま
たは分散媒であり得る：水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、
プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）ならびにそれ
らの適切な混合物。適切な流動性が、例えば、レシチンのようなコーティングの
使用によって、分散液の場合に、要求される粒子サイズを維持することによって
、および界面活性剤を使用することによって維持され得る。微生物の作用の防止
は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェ
ノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場
合、組成物中に等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール（
ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトール）塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注
入可能組成物の長時間吸収は、組成物に吸収を遅らせる薬剤（例えば、アルミニ
ウムモノステアレートおよびゼラチン）を含ませることによってもたらされ得る
。
【０１７９】 滅菌注射可能溶液は、必要量のこの活性化合物（例えば、ＡＣＰＬＸタンパク
質あるいは抗ＡＣＰＬＸ抗体））を、適切な溶媒中に、上記で列挙される成分の
１つまたは組み合わせと共に組み込み、必要な場合、続いて濾過滅菌することに
よって調製され得る。一般的に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒および
上記で列挙される成分から必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中へ組み込
むことによって調製される。滅菌注射可能液剤の調製のための滅菌散剤の場合に
おいて、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、活性成分お
よび既に滅菌濾過されたその液剤からの任意のさらなる所望の成分の散剤を得る
。
【０１８０】 経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。これらは
、ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤へと圧縮され得る。経口治療
投与の目的のために、この活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得、そして
錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた
、マウスウォッシュとしての使用のために流体キャリアを使用して調製され得、
ここで、この流体キャリア中のこの化合物は、経口的に適用され、そしてさっと
動かされ、そして吐き出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合性の結合
剤、および／またはアジュバント材料が、この組成物の一部として含まれ得る。
錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などが、任意の以下の成分または同様の性
質を有する化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶セルロース、ガムトラガ
ントまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤
（例えば、アルギン酸）、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、またはコーンスタ
ーチ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステロート（Ｓｔｅ
ｒｏｔｅ））；潤滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）
；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；あるいは香味剤（例えば、
ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバー）。
【０１８１】 吸入による投与について、この化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素
のような気体）を含む圧縮容器またはディスペンサー、あるいは噴霧器から、エ
アロゾル噴霧の形態で送達される。
【０１８２】 全身的投与はまた、経粘膜手段または経皮手段により得る。経粘膜投与または
経皮投与について、浸透される障壁に適切な浸透剤が、処方物において使用され
る。このような浸透剤は、一般的に、当該分野で公知であり、そして、例えば、
経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げ
られる。経粘膜投与は、鼻噴霧または坐剤の使用によって達成され得る。経皮投
与については、この活性化合物は、当該分野で一般的に公知である軟膏剤、軟膏
、ゲル、またはクリーム剤へ処方される。
【０１８３】 この化合物はまた、直腸送達のための坐剤（例えば、ココアバターおよび他の
グリセリドのような従来の坐剤ベースと共に）または貯留（ｒｅｎｔｅｎｔｉｏ
ｎ）浣腸の形態で調製され得る。
【０１８４】 １つの実施形態において、この活性化合物は、身体からの迅速な排出に対して
この化合物を保護するキャリアを用いて調製され（例えば、制御放出処方物）、
これには、移植片およびマイクロカプセル化された送達系が挙げられる。酢酸エ
チレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステ
ル、およびポリ乳酸のような、生分解性で、生体適合性なポリマーが使用され得
る。このような処方物の調製のための方法は、当該業者には明らかである。これ
らの材料はまた、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒ
ｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販され、手に入れることができる。リ
ポソーム懸濁剤（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞へ標的化
されるリポソームを含む）がまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され
得る。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、
当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０１８５】 投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態で、経口組成物ま
たは非経口組成物を処方することが、特に有益である。本明細書で使用される投
薬単位形態は、処置される被験体についての単位投薬量として適切な物理的に個
々の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと関連して所望の治療
的効果を生じるように計算された、所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単
位形態についての詳細は、この活性化合物、および達成されるべき特定の治療効
果に独特の特性、ならびに個体の処置のためのこのような活性化合物を調合する
際に当該分野に固有の制限によって決定されるか、あるいはこれらに直接依存す
る。
【０１８６】 本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとし
て使用され得る。遺伝子治療ベクターは、被験体へ、例えば静脈注射、局所投与
（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）によって、または定位注射（
例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）によって送達され得る。遺伝子治
療ベクターの薬学的調製物には、受容可能な希釈剤中の遺伝子治療ベクターが挙
げられ得るか、または遺伝子送達ビヒクルが組み込まれる徐放性マトリックスが
挙げられ得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞からインタク
トで産生され得（例えば、レトロウイルスベクター）、薬学的調製物は、遺伝子
送達系を産生する１以上の細胞を含み得る。
【０１８７】 本発明のタンパク質、ならびに本明細書中に記載されたスクリーニングによっ
て同定された他の分子と特異的に結合する抗体は、薬学的組成物の形態で種々の
障害の処置のために投与され得る。このような組成物の調製に関する原理および
考察、ならびに組成物の選択の際の手引きは、例えば、以下に提供される：Ｒｅ
ｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｏｆ
Ｐｈａｒｍａｃｙ 第１９版（編集者Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏら）
Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ．Ｐａ：１９９５；Ｄｒｕｇ Ａｂｓ
ｏｒｐｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｐｏｓｓｉｂｉ
ｌｉｔｉｅｓ，Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ，Ａｎｄ Ｔｒｅｎｄｓ，Ｈａｒｗｏｏ
ｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ，Ｐａ．，
１９９４；ならびにＰｅｐｔｉｄｅ Ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅ
ｌｉｖｅｒｙ（Ａｄｖａｎｃｅｓ Ｉｎ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ，第４巻），１９９１，Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。抗原性タン
パク質が細胞内であり、全体の抗体が阻害剤として使用される場合、抗体の細胞
内移行が好ましい。しかし、リポソームはまた、抗体、もしくは抗体フラグメン
トを細胞内へ送達するために使用され得る。抗体フラグメントが使用される場合
、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の阻害フラグメントが
好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列を結合
する能力を保持するペプチド分子が設計され得る。このようなペプチドは、化学
的に合成され得る、および／または組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。例
えば、Ｍａｒａｓｃｏら、１９９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，９０：７８８９−７８９３を参照のこと。本明細書中の処方物はまた、
特定の徴候が処置されるために必要なように、１より多い活性化合物、好ましく
は互いに不利に働かない相補的活性を有する活性化合物を含み得る。あるいは、
またはさらに、組成物は、その機能を増強する薬剤（例えば、細胞傷害性、サン
トカイン、化学療法剤、または増殖阻害剤）を含み得る。このような分子は、意
図される目的について効果的な量で組合わせて適切に存在する。活性成分はまた
、コロイド状薬剤送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、微
小エマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）においてか、またはマクロエマ
ルジョンにおいて、例えば、コアセルベーション技術または界面の重合によって
調製された微小カプセル（それぞれ、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまた
ははゼラチン微小カプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）微小カプセル
）に閉じ込められ得る。
【０１８８】 インビボ投与のために使用される処方物は、滅菌されなければならない。これ
は、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。
【０１８９】 徐放性調製物が調製され得る。徐放性調製物の適切な例は、抗体を含む固体疎
水性ポリマーの半透過性のマトリクスを含み、ここのマトリクスは、成形物の形
態（例えば、フィルム、または微小カプセル）である。徐放性マトリクスの例と
しては、以下が挙げられる：ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒ
ドロキシエチル−メタクリレート）、もしくはポリ（ビニルアルコール））、ポ
リラクタイド（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ）（米国特許第３，７７３，９１９号）
、Ｌ−グルタミン酸およびエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性エ
チレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲ
ＯＮ ＤＥＰＯＴTM（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびループロリド（ｌｅ
ｕｐｒｏｌｉｄｅ）酢酸からなる注射可能ミクロスフェア））、ならびにポリ−
Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸。エチレン−酢酸ビニルおよび酪酸−グリコー
ル酸のようなポリマーは、１００日を越えてまで分子を放出し得るが、特定のヒ
ドロゲルは、より短い期間にわたってタンパク質を放出する。
【０１９０】 薬学的組成物は、投与のための指導書とともに容器、パック、またはディスペ
ンサーに含まれ得る。
【０１９１】 （スクリーニング方法および検出方法） 本発明の単離された核酸分子は、以下にさらに説明されるように、ＡＣＰＬＸ
タンパク質（例えば、遺伝子治療用途における宿主細胞中の組換え発現ベクター
を介して）を発現するため、ＡＣＰＬＸ ｍＲＮＡ（例えば、生物学的サンプル
において）またはＡＣＰＬＸ遺伝子における遺伝子損傷を検出するため、ならび
にＡＣＰＬＸ活性を調節するために使用され得る。さらに、ＡＣＰＬＸタンパク
質は、ＡＣＰＬＸタンパク質活性または発現を調節する薬物または化合物をスク
リーニングするために、ならびにＡＣＰＬＸタンパク質の不十分なもしくは過剰
な産生によって、あるいはＡＣＰＬＸ野生型タンパク質と比較して減少したもし
くは異常な活性を有するＡＣＰＬＸタンパク質形態の産生によって特徴付けられ
る障害（例えば、ガンまたはプレクランプシア（ｐｒｅｃｌａｍｐｓｉａ）のよ
うな増殖性障害あるいは上記１〜１４節に記載される任意の疾患または障害）を
処置するために使用され得る。さらに、本発明の抗ＡＣＰＬＸ抗体が、ＡＣＰＬ
Ｘタンパク質を検出して単離するため、およびＡＣＰＬＸ活性を調節するために
使用され得る。
【０１９２】 本発明は、さらに、本明細書中で記載されるスクリーニングアッセイによって
同定される新規の薬剤、および上述のような処置のためのそれらの使用に関する
。
【０１９３】 （スクリーニングアッセイ） 本発明は、調節因子、すなわち、ＡＣＰＬＸタンパク質に結合するか、あるい
は例えば、ＡＣＰＬＸタンパク質の発現またはＡＣＰＬＸタンパク質の活性に対
して刺激効果または阻害効果を有する、候補または試験化合物または薬剤（例え
ば、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子または他の薬物）を同定するための方法
（本明細書中において「スクリーニングアッセイ」とも称される）を提供する。
本発明はまた、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイにおいて同定さ
れる化合物を含む。
【０１９４】 １実施形態において、本発明は、ＡＣＰＬＸタンパク質またはポリペプチド、
あるいはその生物学的に活性な部分の膜結合形態に結合するか、または膜結合形
態の活性を調節する、候補化合物もしくは試験化合物をスクリーニングするため
のアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビ
ナトリアルライブラリー法における多数のアプローチの任意のものを使用して得
られ得、これには、以下が挙げられる：生物学的ライブラリー；空間的にアクセ
ス可能な平行固相ライブラリーもしくは溶液相ライブラリー；逆重畳を要する合
成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティ
ークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリ
ーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは
、ペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは化合物の小分子ライブラリーに適用
可能である。例えば、Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄ
ｅｓ １２：１４５）を参照のこと。
【０１９５】 本明細書中で使用される場合、「低分子」とは、約５ｋＤ未満の分子量、最も
好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物をいうように意味される。低分
子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、糖、脂質また
は他の有機分子もしくは無機分子であり得る。化学的および／または生物学的混
合物（例えば、真菌、細菌または藻類抽出物）のライブラリーは、当該分野で公
知であり、そして本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングされ得る
。
【０１９６】 分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば以下
に見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔ
ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ
ら（１９９４）Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ
Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９
９４）Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ３３：２０６１；およ
びＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３７：１２３３。
【０１９７】 化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２〜４２１）、あるいはビーズ上（Ｌ
ａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ
（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５〜５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ
米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ 米国特許第５，２３
３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａ
ｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上（Ｓｃ
ｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６〜３９０
；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉ
ｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．８
７：６３７８〜６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２
２２：３０１〜３１０；Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２３３，４０９号）にお
いて示され得る。
【０１９８】 １つの実施形態において、アッセイは細胞ベースのアッセイであり、ここで、
膜結合形態のＡＣＰＬＸタンパク質、またはその生物学的に活性な部分を細胞表
面上に発現する細胞が、試験化合物と接触され、そしてこの試験化合物が、ＡＣ
ＰＬＸタンパク質に結合する能力が、決定される。例えば、細胞は、哺乳動物起
源または酵母細胞であり得る。この試験化合物がＡＣＰＬＸタンパク質に結合す
る能力の決定は、例えば、その試験化合物を放射性同位体標識または酵素標識と
カップリングさせて、その結果、この試験化合物のＡＣＰＬＸタンパク質または
その生物学的に活性な部分に対する結合が、複合体におけるその標識化合物を検
出することによって決定され得ることによって達成され得る。例えば、試験化合
物は、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ、または3Ｈで直接的または間接的のいずれかで標識さ
れ得、そしてその放射性同位体が、放射線放射の直接の計数により、またはシン
チレーション計数により、検出され得る。あるいは、試験化合物は、例えば、西
洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで
酵素的に標識され得、そしてこの酵素的標識が、適切な基質の生成物への転換を
決定することにより、検出され得る。１つの実施形態において、このアッセイは
、膜結合形態のＡＣＰＬＸタンパク質、またはその生物学的に活性な部分をその
細胞表面上に発現する細胞を、ＡＣＰＬＸと結合する公知の化合物と接触させて
、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物に試験化合物を接触させ
る工程、ならびにこの試験化合物がＡＣＰＬＸタンパク質と相互作用する能力を
決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＡＣＰＬＸタンパク質と相互
作用する能力を決定する工程が、この試験化合物が、公知の化合物と比較して、
ＡＣＰＬＸまたはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を決定する
工程を包含する。
【０１９９】 別の実施形態において、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、これは、
膜結合形態のＡＣＰＬＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面
上で発現する細胞を、試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物が
、ＡＣＰＬＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば
、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物が、Ａ
ＣＰＬＸまたはその生物学的に活性な部分の活性を調節する能力の決定は、例え
ば、ＡＣＰＬＸタンパク質が、ＡＣＰＬＸ標的分子に結合またはこれら標的分子
と相互作用する能力を決定することによって、達成され得る。本明細書中におい
て使用する場合には、「標的分子」とは、ＡＣＰＬＸタンパク質が自然に結合ま
たは相互作用する分子であり、例えば、ＡＣＰＬＸタンパク質を発現する細胞表
面上の分子、第二の細胞表面上の分子、細胞外環境中の分子、細胞膜の内部表面
と会合する分子、または細胞質分子である。ＡＣＰＬＸ標的分子は、非ＡＣＰＬ
Ｘ分子あるいは本発明のＡＣＰＬＸタンパク質またはポリペプチドである。１つ
の実施形態において、ＡＣＰＬＸ標的分子は、シグナル伝達経路の構成要素であ
り、これは、細胞膜を通って細胞内への細胞外シグナル（例えば、化合物が膜結
合ＡＣＰＬＸ分子に結合することにより発生するシグナル）の伝達を促進する。
その標的は、例えば、触媒活性を有する第二の細胞内タンパク質、または下流シ
グナル分子のＡＣＰＬＸとの会合を容易にするタンパク質であり得る。
【０２００】 ＡＣＰＬＸタンパク質がＡＣＰＬＸ標的分子に結合するかまたはその標的分子
と相互作用する能力の決定は、直接的結合を決定するための上記方法の１つによ
り、達成され得る。１つの実施形態において、ＡＣＰＬＸタンパク質がＡＣＰＬ
Ｘ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相互作用する能力の決定は、その
標的分子の活性を決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の
活性は、その標的の細胞セカンドメッセンジャー（すなわち、細胞内Ｃａ2+、ジ
アシルグリセロール、ＩＰ3など）の誘導を検出すること、適切な基質への標的
の触媒活性／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー
（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする核酸に作動的に連結されたＡＣＰＬＸ
応答性調節エレメントを含む）の誘導を検出すること、または細胞応答（例えば
、細胞生存度、細胞分化、または細胞増殖）を検出することにより、決定され得
る。
【０２０１】 なお別の実施形態において、本発明のアッセイは、無細胞アッセイであり、Ａ
ＣＰＬＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物に接触させる
工程、ならびにその試験化合物がＡＣＰＬＸタンパク質またはその生物学的に活
性な部分と結合する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物の、ＡＣＰ
ＬＸタンパク質への結合は、上記のように、直接的または間接的にのいずれかで
決定され得る。１つのこのような実施形態において、このアッセイは、ＡＣＰＬ
Ｘタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＡＣＰＬＸを結合する公知の
化合物に接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試
験化合物に接触させる工程、ならびにその試験化合物がＡＣＰＬＸタンパク質と
相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＡＣＰＬ
Ｘタンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、この試験化合物が、公知の
化合物と比較して、ＡＣＰＬＸ、またはその生物学的に活性な部分と優先的に相
互作用する能力を決定する工程を包含する。
【０２０２】 さらに別の実施形態において、アッセイは、無細胞アッセイであり、ＡＣＰＬ
Ｘタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させる工程、
ならびにその試験化合物がＡＣＰＬＸタンパク質またはその生物学的に活性な部
分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する
。この試験化合物がＡＣＰＬＸの活性を調節する能力の決定は、例えば、ＡＣＰ
ＬＸタンパク質が、ＡＣＰＬＸ標的分子に結合する能力を、直接的結合の決定の
ための上記方法の１つによって決定することにより、達成され得る。代替の実施
形態において、この試験化合物がＡＣＰＬＸタンパク質の活性を調節する能力の
決定は、ＡＣＰＬＸタンパク質が、ＡＣＰＬＸ標的分子をさらに調節する能力を
決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の適切な基質に対す
る触媒活性／酵素活性は、上記のように決定され得る。
【０２０３】 なお別の実施形態において、無細胞アッセイは、ＡＣＰＬＸタンパク質または
その生物学的に活性な部分を、ＡＣＰＬＸタンパク質を結合する公知の化合物に
接触させてアッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物と
接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＡＣＰＬＸタンパク質と相互作用す
る能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＡＣＰＬＸタンパク
質と相互作用する能力の決定は、ＡＣＰＬＸタンパク質が、ＡＣＰＬＸ標的分子
と優先的に結合するか、またはその標的分子の活性を優先的に調節する能力を決
定する工程を包含する。
【０２０４】 本発明の無細胞アッセイは、ＡＣＰＬＸタンパク質の、可溶性の形態または膜
結合形態の両方の使用に受け入れられる。膜結合形態のＡＣＰＬＸタンパク質を
含む無細胞アッセイの場合には、ＡＣＰＬＸタンパク質の膜結合形態が溶液中に
維持されるように、可溶化剤を利用することが望ましくあり得る。このような可
溶化剤の例には、非イオン性界面活性剤が挙げられ、例えば、ｎ−オクチルグル
コシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ
−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録
商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録
商標）、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）n（Ｉｓｏｔｒｉ
ｄｅｃｙｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｅｔｈｅｒ）n、Ｎ−ド
デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−
（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート（３
−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ
−１−ｐｒｏｐａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳ）、または３−（３
−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスル
ホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍ
ｍｉｎｉｏｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ
）（ＣＨＡＰＳＯ）である。
【０２０５】 本発明の上記アッセイ方法の１つより多い実施形態において、ＡＣＰＬＸタン
パク質またはその標的分子のいずれかを固定して、そのタンパク質の一方または
両方の非複合形態からの複合形態の分離を促進し、そしてそのアッセイの自動化
に適用させることが、望ましくあり得る。試験化合物の、ＡＣＰＬＸタンパク質
への結合、または候補化合物の存在下および非存在下での、ＡＣＰＬＸタンパク
質の標的分子との相互作用は、これらの反応物を収容するために適切な任意の容
器内で、達成され得る。このような容器の例には、マイクロタイタープレート、
試験管、および微小遠心管が挙げられる。１実施形態において、そのタンパク質
の一方または両方がマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加す
る融合タンパク質が、提供され得る。例えば、ＧＳＴ−ＡＣＰＬＸ融合タンパク
質またはＧＳＴ標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉ
ｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導
体化マイクロタイタープレート上に吸着され得、次いでこれらは、試験化合物と
合わせられるか、あるいは試験化合物および吸着されない標的タンパク質、また
はＡＣＰＬＸタンパク質のいずれかと合わせられ、そしてこの混合物が、複合体
形成に貢献する条件下（例えば、塩およびｐＨに関して生理学的条件）でインキ
ュベートされる。インキュベーションに続いて、ビーズまたはマイクロタイター
プレートウェルを洗浄して、結合していないあらゆる成分を除去し、ビーズの場
合にはマトリックスを固定し、例えば上記のように、複合体を直接的または間接
的のいずれかで決定する。あるいは、複合体がマトリックスから解離され得、そ
してＡＣＰＬＸタンパク質の結合レベルまたは活性レベルを、標準的な技術を使
用して決定し得る。
【０２０６】 タンパク質をマトリックスに固定するための他の技術がまた、本発明のスクリ
ーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、ＡＣＰＬＸタンパク質、また
はその標的分子のいずれかが、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を利用し
て、固定され得る。ビオチニル化ＡＣＰＬＸタンパク質、または標的分子は、当
該分野において周知の技術を使用して、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミド）から調製され得（例えば、ビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）、そしてストレプトアビジン
で被覆した９６ウェルのプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェル
に固定され得る。あるいは、ＡＣＰＬＸタンパク質、または標的分子と反応性で
あるがＡＣＰＬＸタンパク質のその標的分子への結合を妨害しない抗体が、その
プレートのウェルに誘導体化され得、そして結合していない標的またはＡＣＰＬ
Ｘタンパク質が、抗体の結合によってウェル内にトラップされ得る。このような
複合体を検出するための方法には、ＧＳＴ固定複合体に関しての上記のものに加
えて、ＡＣＰＬＸタンパク質または標的分子と反応性の抗体を使用する、複合体
の免疫検出、ならびにＡＣＰＬＸタンパク質、または標的分子に関する酵素活性
の検出に依存する酵素結合アッセイが挙げられる。
【０２０７】 別の実施形態において、ＡＣＰＬＸタンパク質発現のモジュレーターは、細胞
を候補化合物と接触させ、そして細胞中のＡＣＰＬＸ ｍＲＮＡまたはタンパク
質の発現を決定する方法において同定される。候補化合物の存在下でのＡＣＰＬ
Ｘ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、候補化合物の非存在下でのＡＣ
ＰＬＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較される。次いで、候補化
合物は、この比較に基づいて、ＡＣＰＬＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のモ
ジュレーターとして同定され得る。例えば、ＡＣＰＬＸ ｍＲＮＡまたはタンパ
ク質の発現が候補化合物の非存在下より、その存在下における方が大きい（すな
わち、統計的に有意に大きい）場合、この候補化合物は、ＡＣＰＬＸ ｍＲＮＡ
またはタンパク質の発現の刺激物質として同定される。あるいは、ＡＣＰＬＸ
ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の非存在下よりその存在下の方が
少ない（統計的に有意に少ない）場合、この候補化合物は、ＡＣＰＬＸ ｍＲＮ
Ａまたはタンパク質の発現のインヒビターとして同定される。細胞中のＡＣＰＬ
Ｘ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、ＡＣＰＬＸ ｍＲＮＡまたはタ
ンパク質を検出するために本明細書中に記載の方法によって決定され得る。
【０２０８】 本発明のなお別の局面において、ＡＣＰＬＸタンパク質は、ツーハイブリッド
アッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおいて「ベイトタンパク質」とし
て使用されて（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１
９９３）Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら、１９９３ Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら、１９９
３ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら
、１９９３ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ
ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）、ＡＣＰＬＸ（「ＡＣＰＬＸ結合タンパク
質」または「ＡＣＰＬＸ−ｂｐ」）に結合するか、またはこれと相互作用し、そ
してＡＣＰＬＸ活性を調節する他のタンパク質を同定し得る。このようなＡＣＰ
ＬＸ結合タンパク質はまた、例えば、ＡＣＰＬＸ経路の上流または下流エレメン
トとしてＡＣＰＬＸタンパク質によるシグナル伝達に関与するようである。
【０２０９】 ツーハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ド
メインからなる、大部分の転写因子のモジュール的性質に基づく。簡潔には、こ
のアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。一方の構築物においては
、ＡＣＰＬＸをコードする遺伝子が公知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤ
ＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他方の構築物においては、
ＤＮＡ配列のライブラリー由来の、未同定タンパク質（「プレイ」または「サン
プル」）をコードするＤＮＡ配列が、公知の転写因子の活性化ドメインをコード
する遺伝子に融合される。「ベイト」および「プレイ」タンパク質がインビボで
相互作用して、ＡＣＰＬＸ依存性複合体を形成し得る場合、この転写因子のＤＮ
Ａ結合ドメインおよび活性化ドメインは、非常に近くにある。近位にあることに
より、転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結されたレポーター遺伝
子（例えば、ＬａｃＺ）の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現が検出さ
れ得、そして機能的転写因子を含む細胞コロニーは、単離され得、そしてＡＣＰ
ＬＸと相互作用するタンパク質をコードするクローニングされた遺伝子を得るた
めに使用され得る。
【０２１０】 本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイにより同定される新規な薬剤
および本明細書中に記載されるような処置のためのこの薬剤の使用に関する。
【０２１１】 （検出アッセイ） 本明細書中で同定されるｃＤＮＡ配列の一部分またはフラグメント（および対
応する完全な遺伝子配列）は、ポリヌクレオチド試薬として多くの方法で使用さ
れ得る。例えば（限定はされない）、これらの配列を使用して、（ｉ）微量の生
物学的サンプルから個体を同定し得る（組織型決定）；および（ｉｉ）生物学的
サンプルの法医学的識別を助け得る。これらの適用のうちのいくつかは、以下の
節において記載される。
【０２１２】 （組織型決定（ｔｉｓｓｕｅ ｔｙｐｉｎｇ）） 本発明のＡＣＰＬＸ配列は、わずかな生物学的サンプルから個体を識別するた
めに使用され得る。この技術において、個体のゲノムＤＮＡは、１つ以上の制限
酵素で消化され、そして同定のために独特のバンドを生成するためにサザンブロ
ット上でプローブされる。本発明の配列は、ＲＦＬＰ（米国特許第５，２７２，
０５７号に記載の「制限フラグメント長多型」）のためのさらなるＤＮＡマーカ
ーとして有用である。
【０２１３】 さらに、本発明の配列を用いて、個体のゲノムの選択された部分について実際
の塩基ごとにＤＮＡ配列を決定する代替的技術を提供し得る。従って、本明細書
中に記載のＡＣＰＬＸ配列を用いて、配列の５’末端および３’末端から２つの
ＰＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これらのプライマーを使用して、個体
のＤＮＡを増幅し得、引き続いて、配列決定し得る。
【０２１４】 このように調製された個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、各個体が、
対立遺伝子差異に起因するこのようなＤＮＡ配列の独特のセットを有するので、
唯一の個体識別を提供し得る。本発明の配列は、個体由来および組織由来の配列
のこのような識別を得るために使用され得る。本発明のＡＣＰＬＸ配列は、ヒト
ゲノムの部分を独特に表す。対立遺伝子変異は、これらの配列のコード領域にお
いてある程度生じ、そして非コード領域においてより大きな程度に生じる。個々
のヒト間での対立遺伝子変異は、各５００塩基につき約１回の頻度で生じると見
積もられる。対立遺伝子変異の多さは、制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）を
含む単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）に起因する。
【０２１５】 本明細書中で記載の配列の各々は、ある程度、標準物質（これに対して個体か
らのＤＮＡが識別の目的で比較され得る）として使用され得る。より多くの多型
が非コード領域で生じるので、個体を区別するために、それほど多くの配列が必
要であるわけではない。非コード配列は、おそらく１０〜１，０００プライマー
のパネルを用いてポジティブな個体識別を不自由なく提供し得る。これらのプラ
イマーは、各々が１００塩基の増幅された非コード配列を生じる。推定コード配
列（例えば、配列番号１、３、５、７または９における配列）が使用される場合
、ポジティブな個体識別に関するプライマーのより適切な数は、５００〜２，０
００である。
【０２１６】 （予測医療） 本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬物ゲノム（ｐｈａｒｍａｃｏ
ｇｅｎｏｍｉｃｓ）およびモニタリング臨床試験が、予後（予測）の目的に使用
され、これによって個体を予防的に処置する、予測医療の分野に関する。従って
、本発明の１つの局面は、ＡＣＰＬＸタンパク質および／または核酸の発現、な
らびにＡＣＰＬＸの活性を、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組
織）の関連で決定し、これによって、異常なＡＣＰＬＸの発現または活性に関連
して、個体が疾患または障害に罹患するかどうか、あるいは障害を発症するリス
クがあるかどうかを決定する。本発明はまた、個体が、ＡＣＰＬＸのタンパク質
、核酸の発現または活性と関連した障害を発症するリスクがあるかどうかを決定
するための予後的（または予測的）アッセイを提供する。例えば、ＡＣＰＬＸ遺
伝子における変異が、生物学的サンプルにおいてアッセイされ得る。このような
アッセイは、予後的または予測的な目的に使用され得、これによってＡＣＰＬＸ
のタンパク質、核酸の発現または生物学的活性によって特徴付けられるかまたは
それに関連した障害の発病の前に個体を予防的に処置する。
【０２１７】 本発明の別の局面は、個体におけるＡＣＰＬＸタンパク質、核酸の発現または
活性を決定するための方法を提供し、これによって、その個体についての適切な
治療的または予防的因子（本明細書において「薬物ゲノム」とよばれる）を選択
する。薬物ゲノムは、個体の遺伝型（例えば、特定の因子に対して応答する個体
の能力を決定するために試験された個体の遺伝型）に基づいた、個体の治療的ま
たは予防的処置のための因子（例えば、薬物）の選択を可能にする。
【０２１８】 本発明のなお別の局面は、臨床試験におけるＡＣＰＬＸの発現または活性に対
する因子（例えば、薬剤、化合物）の影響をモニタリングすることに関する。
【０２１９】 これらおよび他の因子は、以下の節でさらに詳細に記載される。
【０２２０】 （診断アッセイ） 生物学的サンプルにおけるＡＣＰＬＸの存在または非存在を検出するための例
示的な方法は、試験被験体から生物学的サンプルを得る工程、およびその生物学
的サンプルをＡＣＰＬＸタンパク質またはＡＣＰＬＸタンパク質をコードする核
酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出し得る化合物もしくは薬剤とを接
触させ、その結果、ＡＣＰＬＸの存在が、その生物学的サンプルにおいて検出さ
れる、工程を包含する。ＡＣＰＬＸのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するた
めの薬剤は、ＡＣＰＬＸのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る
、標識された核酸プローブである。この核酸プローブは、例えば、全長のＡＣＰ
ＬＸ核酸（例えば、配列番号１またはその部分の核酸（例えば、少なくとも、１
５、３０、５０、１００、２５０もしくは５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレ
オチドであり、そしてストリンジェントな条件下でＡＣＰＬＸのｍＲＮＡまたは
ゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするに十分である核酸））であり得る。
本発明の診断アッセイにおける使用のための他の適切なプローブは本明細書中に
記載される。
【０２２１】 ＡＣＰＬＸタンパク質を検出するための１つの薬剤は、ＡＣＰＬＸと結合し得
る抗体、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。本発明のタンパク質
に対する抗体は、タンパク質の局在および／または定量化に関連する、当該分野
で公知の方法において使用され得る（例えば、適切な生理学的サンプル内のタン
パク質のレベルの測定における使用のため、診断方法における使用のため、タン
パク質の画像化における使用のためなど）。所定の実施形態では、タンパク質に
対する抗体または抗原結合ドメインを含むその誘導体、フラグメント、アナログ
またはホモログは、薬理学的に活性な組成物として使用される。
【０２２２】 本発明のタンパク質に特異的な抗体は、標準技術（例えば、免疫親和性クロマ
トグラフィまたは免疫沈降）によって、タンパク質を単離するために用いられ得
る。このような抗体は、細胞からの天然のタンパク質抗原の精製および宿主細胞
において発現される組換え的に産生された抗原の精製を容易にし得る。さらに、
抗原タンパク質の発現の量およびパターンを評価するために、このような抗体を
用いて（例えば、細胞の溶解液または細胞上清における）抗原タンパク質を検出
し得る。このタンパク質に対する抗体は、例えば、所定の処置レジメンの有効性
を決定するために、臨床試験の手順の一部として組織におけるタンパク質レベル
を診断的にモニターするために用いられ得る。検出は、抗体を検出可能物質にカ
ップリングする（すなわち、物理的に連結する）ことにより容易にされ得る。検
出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生
物発光物質および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはア
セチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子団複合体の例としては、
ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍
光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソ
チオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン（ｄｉｃｈｌｏｒｏ
ｔｒｉａｚｉｎｙｌａｍｉｎｅ）フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィ
コエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物
発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げ
られ、そして、適切な放射性物質の例としては125Ｉ、131Ｉ、35Ｓまたは3Ｈが
挙げられる。
【０２２３】 抗体は、ポリクローナルであり得るか、またはより好ましくはモノクローナル
抗体であり得る。インタクトな抗体またはそのフラグメント（例えば、Ｆａｂま
たはＦ（ａｂ’）2）が使用され得る。用語「標識（された）」とは、プローブ
または抗体に関して、検出可能な物質をそのプローブもしくは抗体にカップリン
グさせる（すなわち、物理的に連結する）ことによって、そのプローブまたは抗
体を直接標識すること、ならびに、直接標識される別の試薬との反応性によって
、そのプローブもしくは抗体を間接的に標識をすることを包含することが意図さ
れる。間接的な標識の例としては、蛍光標識された二次抗体を用いる一次抗体の
検出、および蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて検出され得るようにビ
オチンを用いるＤＮＡプローブの末端標識が挙げられる。用語「生物学的サンプ
ル」とは、被験体から単離された、組織、細胞および生物学的流体ならびに被験
体に存在する組織、細胞および流体を含むことが意図される。すなわち、本発明
の検出方法を用いて、生物学的サンプル中のＡＣＰＬＸのｍＲＮＡ、タンパク質
またはゲノムＤＮＡを、インビトロおよびインビボで検出し得る。例えば、ＡＣ
ＰＬＸ ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダ
イゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。ＡＣＰ
ＬＸタンパク質の検出のためのインビトロ技術としては、酵素結合免疫吸着アッ
セイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光が挙げられ
る。ＡＣＰＬＸゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザン
ハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、ＡＣＰＬＸタンパク質の検出の
ためのインビボ技術としては、標識された抗ＡＣＰＬＸ抗体を被験体に導入する
ことが挙げられる。例えば、その抗体は、放射性マーカーを用いて標識され得る
。この被験体における放射性マーカーの存在および位置は、標準的な画像化技術
によって検出され得る。
【０２２４】 １つの実施形態において、この生物学的サンプルは、その試験被験体からのタ
ンパク質分子を含む。あるいは、その生物学的サンプルは、その試験被験体から
のｍＲＮＡ分子またはその試験被験体からのゲノムＤＮＡ分子を含み得る。好ま
しい生物学的サンプルは、被験体から従来の手段によって単離された末梢血白血
球サンプルである。
【０２２５】 １つの実施形態において、本発明の方法はさらに、コントロール被験体からコ
ントロール生物学的サンプルを得る工程、そのコントロールサンプルを、ＡＣＰ
ＬＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムを検出し得る化合物または薬剤と接
触させ、その結果、ＡＣＰＬＸのタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存
在がその生物学的サンプルにおいて検出される、工程、およびそのコントロール
サンプルにおけるＡＣＰＬＸのタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在
と、その試験サンプルにおけるＡＣＰＬＸのタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノム
ＤＮＡの存在とを比較する工程を包含する。
【０２２６】 本発明はまた、生物学的サンプルにおけるＡＣＰＬＸの存在を検出するための
キットを包含する。例えば、このキットは、以下を備え得る：生物学的サンプル
においてＡＣＰＬＸのタンパク質またはｍＲＮＡを検出し得る、標識された化合
物または薬剤；そのサンプルにおいてＡＣＰＬＸの量を決定するための手段；お
よびそのサンプルにおけるＡＣＰＬＸの量を標準と比較するための手段。この化
合物または薬剤は、適切な容器内にパッケージングされ得る。このキットは、さ
らに、ＡＣＰＬＸタンパク質または核酸を検出するためにキットを用いるための
説明書を備え得る。
【０２２７】 （予後アッセイ） 本明細書において記載された診断方法をさらに利用して、ＡＣＰＬＸの異常発
現または異常活性に関連した疾患もしくは障害を有するか、またはその発症の危
険性を有する被験体を同定し得る。例えば、本明細書に記載されるアッセイ（例
えば、上述の診断アッセイまたは下記のアッセイ）を利用して、ＡＣＰＬＸのタ
ンパク質、核酸の発現または活性に関連する障害を有するかまたはその発症の危
険性を有する被験体を同定し得る。あるいは、この予後アッセイを利用して、疾
患または障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。
従って、本発明は、ＡＣＰＬＸの異常発現または異常活性に関連する疾患もしく
は障害を同定するための方法を提供する。ここで、試験サンプルは、被験体から
得られ、そしてＡＣＰＬＸのタンパク質または核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノム
ＤＮＡ）が検出され、ここで、ＡＣＰＬＸのタンパク質または核酸の存在は、Ａ
ＣＰＬＸの異常発現または異常活性に関連する疾患または障害を有するかまたは
その発症の危険性を有する被験体についての診断指標である。本明細書において
使用される場合「試験サンプル」とは、目的の被験体から得られた生物学的サン
プルをいう。例えば、試験サンプルは、生物学的流体（例えば、血清）、細胞サ
ンプル、または組織であり得る。
【０２２８】 さらに、本明細書に記載される予後アッセイを使用して、被験体に薬剤（例え
ば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核
酸、低分子、または他の薬物候補）を投与してＡＣＰＬＸの異常発現または異常
活性に関連する疾患または障害を処置し得るか否かを、決定し得る。例えば、こ
のような方法を使用して、被験体が障害のための薬剤で有効に処置され得るか否
かを決定し得る。従って、本発明は、ＡＣＰＬＸの異常発現または異常活性に関
連する障害についての薬剤を用いて、被験体が有効に処置され得るか否かを決定
するための方法を提供する。ここで、試験サンプルが得られ、そしてＡＣＰＬＸ
のタンパク質または核酸が検出される（例えば、ここで、ＡＣＰＬＸのタンパク
質または核酸の存在は、この薬剤が投与されてＡＣＰＬＸの異常発現または異常
活性に関連する障害が処置され得る被験体についての、診断指標である）。
【０２２９】 本発明の方法はまた、ＡＣＰＬＸ遺伝子における遺伝的損傷を検出し、それに
よって、その損傷遺伝子を有する被験体が異常な細胞増殖および／または分化に
よって特徴付けられる障害についての危険性を有するか否かを決定するためにも
使用され得る。種々の実施形態において、この方法は、その被験体からの細胞の
サンプルにおいて、ＡＣＰＬＸタンパク質をコードする遺伝子の統合性に影響を
与える少なくとも１つの変更によって特徴付けられる遺伝的損傷の存在または非
存在、あるいはＡＣＰＬＸ遺伝子の誤発現を検出する工程を包含する。例えば、
そのような遺伝的損傷は、以下の少なくとも１つの存在を確認することによって
検出され得る：（ｉ）ＡＣＰＬＸ遺伝子からの１つ以上のヌクレオチドの欠失；
（ｉｉ）ＡＣＰＬＸ遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの付加；（ｉｉｉ）ＡＣ
ＰＬＸ遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの置換、（ｉｖ）ＡＣＰＬＸ遺伝子の染
色体再配置；（ｖ）ＡＣＰＬＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルに
おける変更、（ｖｉ）ＡＣＰＬＸ遺伝子の異常改変（例えば、ゲノムＤＮＡのメ
チル化パターンの異常改変）、（ｖｉｉ）ＡＣＰＬＸ遺伝子のメッセンジャーＲ
ＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、（ｖｉｉｉ）ＡＣＰＬＸ
タンパク質の非野生型レベル、（ｉｘ）ＡＣＰＬＸ遺伝子の対立遺伝子の欠失、
ならびに（ｘ）ＡＣＰＬＸタンパク質の不適切な翻訳後修飾。本明細書において
記載されるように、当該分野において、ＡＣＰＬＸ遺伝子における損傷を検出す
るために使用され得る、多数の公知のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学
的サンプルは、従来手段によって被験体から単離された末梢血白血球サンプルで
ある。しかし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプルが使用され得、これには
、例えば、頬粘膜細胞が挙げられる。
【０２３０】 特定の実施形態において、損傷の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（
例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を参
照のこと）（例えば、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲ）、あるいは、連
結連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら，１９８８．Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら，１９９４．Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ ９１：３６０−３６４を参照の
こと）におけるプローブ／プライマーの使用を包含する。後者は、ＡＣＰＬＸ遺
伝子における点変異を検出するために特に有用であり得る）（Ａｂｒａｖａｙａ
ら，１９９５ Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２３：６７５−６８２を参照の
こと）。この方法は、患者から細胞のサンプルを収集する工程、核酸（例えば、
ゲノム、ｍＲＮＡまたはその両方）をそのサンプルの細胞から単離する工程、Ａ
ＣＰＬＸの遺伝子に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーとその核
酸サンプルとを、ＡＣＰＬＸ遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーション
および増幅が生じるような条件下で接触させる工程、ならびに増幅産物の存在も
しくは非存在を検出する工程、またはその増幅産物のサイズを検出する工程およ
びその長さをコントロールサンプルと比較する工程を包含し得る。ＰＣＲおよび
／またはＬＣＲは、本明細書中に記載される変異を検出するために使用される技
術のいずれかとともに予備的増幅工程として使用されることが望ましくあり得る
ことが予想される。
【０２３１】 代替的な増幅方法としては、以下が挙げられる：当業者に周知な技術を用いた
、その増幅された分子の検出の前の、自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、
１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−
１８７８を参照のこと）、転写増幅系（Ｋｗｏｈら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７を参照のこと）；
Ｑβレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
６：１１９７を参照のこと）、または他の任意の核酸増幅方法。これらの検出
スキームは、核酸分子が非常に極少数で存在する場合に、そのような核酸分子の
検出のために特に有用である。
【０２３２】 代替の実施形態において、サンプル細胞からのＡＣＰＬＸ遺伝子における変異
は、制限酵素切断パターンにおける変更によって同定され得る。例えば、サンプ
ルおよびコントロールのＤＮＡが単離され、増幅され（必要に応じて）、１つ以
上の制限エンドヌクレアーゼを用いて消化され、そしてフラグメント長の大きさ
がゲル電気泳動によって決定され、そして比較される。サンプルＤＮＡとコント
ロールＤＮＡとの間のフラグメント長の大きさにおける差異は、そのサンプルＤ
ＮＡにおける変異を示す。さらに、配列特異的なリボザイムの使用（例えば、米
国特許第５，４９３，５３１号を参照のこと）を使用して、リボザイム切断部位
の発生または喪失によって特異的な変異の存在についてスコア付けし得る。
【０２３３】 他の実施形態において、ＡＣＰＬＸにおける遺伝子変異は、サンプル核酸およ
びコントロール核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、数百または数千のオリ
ゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイに対してハイブリダイズさせること
によって同定され得る（例えば、Ｃｒｏｎｉｎら、１９９６．Ｈｕｍａｎ Ｍｕ
ｔａｔｉｏｎ ７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｌら，１９９６．Ｎａｔ．Ｍｅｄ
．２：７５３−７５９を参照のこと）。例えば、ＡＣＰＬＸにおける遺伝子変異
は、Ｃｒｏｎｉｎら（前出）に記載されるように光生成ＤＮＡプローブを含む二
次元アレイにおいて同定され得る。手短には、プローブの第一ハイブリダイゼー
ションアレイを用いて、サンプルおよびコントロールにおける長いストレッチの
ＤＮＡにわたって走査し、連続的に重複するプローブの線形アレイを作成するこ
とによって、その配列間の塩基変化を同定し得る。この工程は、点変異の同定を
可能にする。この工程に第二のハイブリダイゼーションアレイが続き、これは、
検出される全ての改変体または変異に相補的な、より小さな特化されたプローブ
アレイを用いることによる特定の変異の特徴付けを可能にする。各変異アレイは
、一方が野生型遺伝子に対して相補的であり、そして他方が変異遺伝子に対して
相補である並行プローブセットから構成される。
【０２３４】 なお別の実施形態において、当該分野で公知の種々の配列決定反応のいずれか
を使用して、ＡＣＰＬＸ遺伝子を直接配列決定し得、そしてサンプルＡＣＰＬＸ
配列と対応する野生型（コントロール）配列とを比較することによって、変異を
検出し得る。配列決定反応の例としては、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ，１
９７７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ ７４：５６０または
Ｓａｎｇｅｒ，１９７７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ ７
４：５４６３によって開発された技術に基づくものが挙げられる。診断アッセイ
を実施する場合、種々の自動化配列決定手順のいずれかを利用し得ることもまた
意図される（例えば、Ｎａｅｖｅら，１９９５．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
１９：４４８を参照のこと）。これらには、質量分析法による配列決定法（例え
ば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら，１９９６．Ａ
ｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆ
ｆｉｎら，１９９３．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８
：１４７−１５９を参照のこと）が含まれる。
【０２３５】 ＡＣＰＬＸ遺伝子における変異を検出するための他の方法としては、切断剤か
らの保護を使用して、ＲＮＡ／ＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡのヘテロ二重鎖に
基づくミスマッチ塩基を検出する方法が挙げられる（例えば、Ｍｙｅｒｓら，１
９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２を参照のこと）。一般に、「ミスマ
ッチ切断」の当該分野の技術は、野生型のＡＣＰＬＸ配列を含む（標識された）
ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織サンプルから得られた潜在的な変異体ＲＮＡまたは
ＤＮＡとハイブリダイズさせることによって形成されるヘテロ二重鎖を提供する
工程によって始まる。この二本鎖の二重鎖を、二重鎖の一本鎖領域（例えば、そ
のコントロールとサンプルの鎖との間の塩基対ミスマッチに起因して存在するも
の）を切断する薬剤を用いて処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を、ＲＮ
ａｓｅを用いて処理し得、そしてＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、そのミスマッ
チ領域を酵素的に消化することに対して、Ｓ1ヌクレアーゼを用いて処理し得る
。他の実施形態において、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡのいずれかの二
重鎖を、ミスマッチ領域を消化するために、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オ
スミウム、およびピペリジンを用いて処理し得る。そのミスマッチ領域の消化後
、次いで、得られた物質を変性ポリアクリルアミドゲル上で、大きさにより分離
して、変異の部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら，１９８８．Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａら，１
９９２．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５を参照のこ
と。１つの実施形態において、コントロールのＤＮＡまたはＲＮＡは、検出のた
めに標識され得る。
【０２３６】 なお別の実施形態において、ミスマッチ切断反応は、二本鎖ＤＮＡにおけるミ
スマッチ塩基対を認識する１つ以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ
修復」酵素）を、細胞のサンプルから得られたＡＣＰＬＸ ｃＤＮＡにおける点
変異を検出およびマッピングするために規定された系において使用する。例えば
、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチでＡを切断し、そしてＨｅ
Ｌａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチでＴを切断
する。例えば、Ｈｓｕら，１９９４．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １５：１
６５７〜１６６２を参照のこと。例示的な実施形態に従って、ＡＣＰＬＸ配列（
例えば、野生型ＡＣＰＬＸ配列）に基づくプローブは、試験細胞由来のｃＤＮＡ
または他のＤＮＡ産物にハイブリダイズされる。二重鎖は、ＤＮＡミスマッチ修
復酵素を用いて処理され、そしてその切断産物（もしあれば）は、電気泳動プロ
トコルなどから検出され得る。例えば、米国特許第５，４５９，０３９号を参照
のこと。
【０２３７】 他の実施形態において、電気泳動の移動度における変化は、ＡＣＰＬＸ遺伝子
における変異を同定するために使用される。例えば、一本鎖コンホメーション多
型（ＳＳＣＰ）は、変異体と野生型核酸との間の電気泳動の移動度における差異
を検出するために使用され得る。例えば、Ｏｒｉｔａら，１９８９．Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：８６：２７６６；Ｃｏｔｔｏｎ，１９９
３．Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５−１４４；Ｈａｙａｓｈｉ，１９９２
．Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３〜７９を参照のこと。
サンプルおよびコントロールＡＣＰＬＸ核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントは、変
性され、そして再生される。一本鎖核酸の二次構造は、配列に従って変化し、電
気泳動の移動度において得られる変化は、１つの塩基変化の検出さえも可能にす
る。ＤＮＡフラグメントは、標識され得るか、または標識されたプローブを用い
て検出され得る。アッセイの感度は、二次構造が配列中の変化に対してより感受
的である（ＤＮＡよりもむしろ）ＲＮＡを使用することによって増強され得る。
１つの実施形態において、本発明の方法は、ヘテロ二重鎖分析を利用して、電気
泳動の移動度における変化に基づいて二本鎖のヘテロ二重鎖分子を分離する。例
えば、Ｋｅｅｎら，１９９１．Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．７：５を参照のこと
。
【０２３８】 なお別の実施形態において、一定勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミド
ゲルにおける変異体または野生型フラグメントの移動は、変性勾配ゲル電気泳動
（ＤＧＧＥ）を使用してアッセイされる。例えば、Ｍｙｅｒｓら，１９８５．Ｎ
ａｔｕｒｅ ３１３：４９５を参照のこと。ＤＧＧＥが分析の方法として使用さ
れる場合、ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲにより約４０ｂｐの高融解ＧＣリッチＤＮ
ＡのＧＣクランプを付加することによって、完全には変性されないことを確実す
るように改変される。さらなる実施形態において、温度勾配は、コントロールお
よびサンプルＤＮＡの移動度における差異を同定するために、変性剤勾配の代わ
りに使用される。例えば、ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ，１９８
７．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２７５３を参照のこと。
【０２３９】 点変異を検出するための他の技術の例としては、以下が挙げられるが、これら
に限定されない：選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増
幅、または選択的プライマー伸長。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、
既知の変異が中心的に配置されるように調製され得、次いで、完全なマッチが見
出される場合にのみハイブリダイゼーションを許容する条件下で標的ＤＮＡにハ
イブリダイズされる。例えば、Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４
：１６３）；Ｓａｉｋｉら，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８６：６２３０を参照のこと。このような対立遺伝子特異的オリゴヌ
クレオチドは、このオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ膜に付着され、そして
標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズされる場合に、ＰＣＲ増幅された標的Ｄ
ＮＡまたは多くの異なる変異にハイブリダイズされる。
【０２４０】 あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術は、本発明
と合わせて使用され得る。特異的増幅についてのプライマーとして使用されるオ
リゴヌクレオチドは、分子の中心において（その結果、増幅は、差次的ハイブリ
ダイゼーションに依存する）（例えば、Ｇｉｂｂｓら，１９８９．Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：２４３７−２４４８）か、あるいは適切な条件下でミ
スマッチが妨げられ得るかまたはポリメラーゼ伸長を減少し得る、１つのプライ
マーの３’の最末端で、目的の変異を保有し得る（例えば、Ｐｒｏｓｓｎｅｒ，
１９９３．Ｔｉｂｔｅｃｈ．１１：２３８）。さらに、切断に基づく検出を行う
ために、変異領域に新規な制限部位を導入することが、望ましくあり得る。例え
ば、Ｇａｓｐａｒｉｎｉら，１９９２．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ６：
１を参照のこと。特定の実施形態において、増幅はまた、増幅用Ｔａｑリガーゼ
を使用して実施され得ることが予測される。例えば、Ｂａｒａｎｙ，１９９１．
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９を参照のこと。
このような場合において、連結は、５’配列の３’末端に完全なマッチが存在す
る場合にのみ生じ、増幅の存在または非存在を探索することによって、特定の部
位における既知の変異の存在を検出することを可能にする。
【０２４１】 本明細書中に記載される方法は、例えば、本明細書中に記載れる少なくとも１
つのプローブ核酸または抗体試薬を含む、予めパッケージングされた診断キット
を利用することによって実施され得、これは、例えば、ＡＣＰＬＸ遺伝子と関連
する疾患または疾病の症状または家族病歴を示す患者を診断するための臨床的設
定において簡便に使用され得る。
【０２４２】 さらに、ＡＣＰＬＸが発現される任意の細胞型または組織（好ましくは、末梢
血白血球）は、本明細書中に記載される予後アッセイにおいて利用され得る。し
かし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプル（例えば、頬粘膜細胞を含む）が
、使用され得る。
【０２４３】 （薬理ゲノム学（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）） ＡＣＰＬＸ活性（例えば、ＡＣＰＬＸ遺伝子発現）に対する刺激性または阻害
性の影響を有する因子、すなわちモジュレーターは、本明細書中に記載されるス
クリーニングアッセイによって同定されるように、異常なＡＣＰＬＸ活性と関連
する障害（例えば、癌）、または免疫障害を処置（予防的または治療的に）する
ために個体に投与され得る。このような処置と合わせて、個体の薬理ゲノム学（
すなわち、個体の遺伝子型と外来化合物または薬物に対するその個体の応答との
間の関係についての研究）が、考慮され得る。治療剤の代謝における差異は、薬
理学的に活性な薬物の用量と血中濃度との間の関係を変更することによって、重
篤な毒性または治療の失敗を導き得る。従って、個体の薬理ゲノム学は、個体の
遺伝子型の考慮に基づく予防的または治療的処置のために有効な薬剤（例えば、
薬物）の選択を許容する。このような薬理ゲノム学は、さらに、適切な投薬量お
よび治療レジメンを決定するために使用され得る。従って、ＡＣＰＬＸタンパク
質の活性、ＡＣＰＬＸ核酸の発現、あるいは個体におけるＡＣＰＬＸ遺伝子の変
異含量が決定されて、それによって個体の治療的または予防的処置のために適切
な薬剤を選択し得る。
【０２４４】 薬理ゲノム学は、罹患された人おける変更された薬物の性質および異常な作用
に起因して、薬物に応答する臨床的に有意な遺伝性変更を扱う。例えば、Ｅｉｃ
ｈｅｌｂａｕｍ、１９９６、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ．，２３：９８３〜９８５；Ｌｉｎｄｅｒ、１９９７、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅ
ｍ．，４３：２５４〜２６６を参照のこと。一般に、２つの型の薬理ゲノム学状
態が、区別され得る。薬物が身体に作用する方法を変更する１つの因子として伝
達される遺伝的状態（変更された薬物作用）、または身体が薬物に作用する方法
を変更する１つの因子として伝達される遺伝的状態（変更された薬物代謝）。こ
れらの薬理ゲノム学状態は、稀な欠損としてか、または多型としてのいずれかで
生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）欠損
は、一般的な遺伝性酵素病であり、この主な臨床的合併症は、酸化剤薬物（抗マ
ラリア剤、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取およびソラマメの消
費後の溶血である。
【０２４５】 例示的な実施形態として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および持続
期間の両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトラ
ンスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびシトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６およ
びＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多型の発見は、幾人かの患者が予期される薬物効果
を得ないか、または標準的かつ安全な用量の薬物を摂取した後に過大な薬物応答
および深刻な毒性を示すことに関しての説明を提供した。これらの多型は、集団
において２つの表現型（高い代謝能を持つ人（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｍｅｔａｂ
ｏｌｉｚｅｒ）（ＥＭ）および低い代謝能を持つ人（ｐｏｏｒ ｍｅｔａｂｏｌ
ｉｚｅｒ）（ＰＭ））で表現される。ＰＭの有病率は、異なる集団の間で異なる
。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型であり、そしていくら
かの変異がＰＭにおいて同定されており、この全ては機能的ＣＹＰ２Ｄ６の非存
在に至る。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低い代謝能を持つ人は、彼らが
標準的な用量を受ける場合に、かなり頻繁に過大な薬物応答および副作用を経験
する。代謝産物が活性な治療剤の一部分である場合、そのＣＹＰ２Ｄ６形成代謝
産物であるモルヒネによって媒介されるコデインの鎮痛効果について実証される
ように、ＰＭは治療的応答を示さない。他の極端なものは、標準的な用量に応答
しない、いわゆる超迅速な代謝能を持つ人である。最近、超迅速な代謝の基準と
なる分子は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に起因していることが同定されている。
【０２４６】 従って、ＡＣＰＬＸのタンパク質の活性、ＡＣＰＬＸの核酸の発現、あるいは
個体におけるＡＣＰＬＸの遺伝子の変異内容を決定して、それによって、その個
体の治療的または予防的処置のために適切な薬剤を選択し得る。さらに、薬理ゲ
ノム学の研究を使用して、個体の薬物応答性の表現型の同定に対して薬物代謝酵
素をコードする多型対立遺伝子の遺伝子型を適用し得る。この知見は、用量また
は薬物選択に適用される場合、有害な反応または治療の失敗を回避し得、従って
、被験体をＡＣＰＬＸの調節因子（例えば、本明細書中に記載される例示的なス
クリーニングアッセイの１つによって同定される調節因子）を用いて処置する場
合に治療的または予防的効率を増強し得る。
【０２４７】 （臨床試験中の効果のモニタリング） ＡＣＰＬＸの発現または活性（例えば、異常な細胞増殖および／または分化を
調節する能力）に対する薬剤（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングす
ることは、基本的な薬物スクリーニングのみではなく、臨床試験にも適用され得
る。例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイによって決
定される、ＡＣＰＬＸ遺伝子発現、タンパク質レベルを増加するため、またはＡ
ＣＰＬＸ活性をアップレギュレートする薬剤の効力は、減少したＡＣＰＬＸ遺伝
子発現、タンパク質レベル、またはダウンレギュレートしたＡＣＰＬＸの活性を
示す被験体の臨床試験においてモニターされ得る。あるいは、スクリーニングア
ッセイによって決定される、ＡＣＰＬＸ遺伝子発現、タンパク質レベルを減少、
またはＡＣＰＬＸの活性をダウンレギュレートする薬剤の効力は、増加したＡＣ
ＰＬＸ遺伝子発現、タンパク質レベル、またはアップレギュレートしたＡＣＰＬ
Ｘの活性を示す被験体の臨床試験においてモニターされ得る。このような臨床試
験において、ＡＣＰＬＸの発現または活性、および好ましくは、例えば、細胞増
殖または免疫障害に関与するような他の遺伝子が、「リードアウト（読み出し）
（ｒｅａｄ ｏｕｔ）」、すなわち、特定の細胞の免疫応答性のマーカーとして
使用され得る。
【０２４８】 限定ではなく、例として、ＡＣＰＬＸを含む遺伝子（これは、ＡＣＰＬＸ活性
（例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイにおいて同定
される）を調節する薬剤（例えば、化合物、薬物または低分子）を用いる処置に
よって、細胞内で調節される）が、同定され得る。従って、細胞性増殖障害に対
する薬剤の効果を研究するために、例えば、臨床試験において、細胞が単離され
得、そしてＲＮＡが調製され得、そしてＡＣＰＬＸおよびこの障害に関与する他
の遺伝子の発現のレベルについて分析され得る。遺伝子発現のレベル（すなわち
、遺伝子発現パターン）は、本明細書中に記載されるように、ノーザンブロット
分析もしくはＲＴ−ＰＣＲによるか、あるいは産生されるタンパク質の量を測定
することによるか、本明細書中に記載されるような方法の１つによるか、あるい
はＡＣＰＬＸまたは他の遺伝子の活性のレベルを測定することによって、定量さ
れ得る。この様式で、この遺伝子発現パターンは、この薬剤に対する細胞の生理
学的応答の指標であるマーカーとして作用し得る。従って、この応答状態は、こ
の薬剤を用いる個体の処置の前、および処置の間の種々の時点で、決定され得る
。
【０２４９】 １つの実施形態において、本発明は、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニ
スト、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、低分子、または本明細書
中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される他の薬物候補物）を
用いる、被験体の処置の効力をモニタリングするための方法を提供し、これは、
以下の工程を包含する：（ｉ）薬剤の投与の前に、被験体から投与前サンプルを
得る工程；（ｉｉ）この投与前サンプルにおいて、ＡＣＰＬＸタンパク質、ｍＲ
ＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出する工程；（ｉｉｉ）この被験
体から１つ以上の投与後サンプルを得る工程；（ｉｖ）この投与後サンプルにお
いて、ＡＣＰＬＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性
のレベルを検出する工程；（ｖ）この投与前サンプルにおけるＡＣＰＬＸタンパ
ク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを、この投与後
サンプルにおけるＡＣＰＬＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現
または活性のレベルと比較する工程；ならびに（ｖｉ）従って、この被験体に対
する薬剤の投与を変更する工程。例えば、この薬剤の増加した投与は、検出され
るよりも高いレベルにＡＣＰＬＸの発現または活性を増加することが（すなわち
、この薬剤の効力を増加すること）望ましくあり得る。あるいは、この薬剤の減
少した投与は、検出されるよりも低いレベルにＡＣＰＬＸの発現または活性を減
少することが（すなわち、この薬剤の効力を減少すること）望ましくあり得る。
【０２５０】 （処置方法） 本発明は、異常なＡＣＰＬＸの発現または活性に関連する障害の危険性のある
（または感受性）か、またはこの障害を有する被験体を処置する予防的および治
療的の両方の方法を提供する。これらの治療方法は、以下により詳細に議論され
る。
【０２５１】 （疾患および障害） （その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）増加したレベルま
たは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を拮抗する（
すなわち、低減または阻害する）治療剤を用いて処置され得る。活性を拮抗する
治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤と
しては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）上記ペプチド、ま
たはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；（ｉｉ）上記ペプ
チドに対する抗体；（ｉｉｉ）上記ペプチドをコードする核酸；（ｉｖ）相同組
換えによって上記ペプチドの内因性機能を「ノックアウトする」ために利用され
る、アンチセンス核酸および「機能不全性」である（すなわち、上記ペプチドに
対するコード配列のコード配列内の異種挿入に起因する）核酸の投与（例えば、
Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８〜１２９２を
参照のこと）；または（ｖ）上記ペプチドとその結合パートナーとの間の相互作
用を変化させる、調節因子（すなわち、インヒビター、アゴニストおよびアンタ
ゴニスト（本発明のさらなるペプチド模倣物または本発明のペプチドに対して特
異的な抗体を含む））。
【０２５２】 （その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）減少したレベルま
たは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を増加させる
（すなわち、活性に対するアゴニストである）治療剤を用いて処置され得る。活
性をアップレギュレートする治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され
得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されな
い：上記ペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモロ
グ；あるいはバイオアベイラビリティーを増加させるアゴニスト。
【０２５３】 増加したレベルまたは減少したレベルは、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定
量することによって、容易に検出され得る。この定量は、患者の組織サンプルを
（例えば、生検組織から）入手し、そしてそのサンプルを、その発現したペプチ
ド（または上記ペプチドのｍＲＮＡ）のＲＮＡレベルまたはペプチドレベル、構
造および／または活性をインビトロでアッセイすることによる。当該分野におい
て周知の方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：イムノア
ッセイ（例えば、ウェスタンブロット分析、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
ポリアクリルアミドゲル電気泳動が後に続く免疫沈降、免疫細胞化学などによる
）および／またはｍＲＮＡの発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッ
セイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチュハイブリダイ
ゼーションなど）。
【０２５４】 （予防的方法） １つの局面において、本発明は、被験体において異常なＡＣＰＬＸの発現また
は活性と関連する疾患または状態を、ＡＣＰＬＸの発現または少なくとも１つの
ＡＣＰＬＸ活性を調節する薬剤をこの被験体に投与することによって予防するた
めの方法を提供する。異常なＡＣＰＬＸの発現または活性によって引き起こされ
るかまたはこれらに起因する、疾患にかかる危険がある被験体は、例えば、本明
細書中に記載の診断アッセイまたは予後アッセイのいずれか、またはそれらの組
み合わせによって、同定され得る。予防薬剤の投与は、疾患または障害が予防さ
れるか、あるいはその進行を遅らせられるように、このＡＣＰＬＸ異常の特徴で
ある症状の発現の前に行い得る。このＡＣＰＬＸ異常の型に依存して、例えば、
ＡＣＰＬＸアゴニスト薬剤またはＡＣＰＬＸアンタゴニスト薬剤が、その被験体
を処置するために使用され得る。その適切な薬剤は、本明細書中に記載のスクリ
ーニングアッセイに基づいて決定され得る。本発明の予防方法は、以下の小区分
において、さらに議論される。
【０２５５】 （治療方法） 本発明の別の局面は、治療目的のためにＡＣＰＬＸの発現または活性を調節す
る方法に関する。本発明の調節方法は、細胞を、その細胞に関するＡＣＰＬＸタ
ンパク質活性の活性のうちの１つ以上を調節する薬剤と接触させる工程を包含す
る。ＡＣＰＬＸタンパク質活性を調節する薬剤は、核酸またはタンパク質、ＡＣ
ＰＬＸタンパク質の天然に存在する同族リガンド、ペプチド、ＡＣＰＬＸペプチ
ド模倣物、または他の低分子のような、本明細書中に記載されるような薬剤であ
り得る。１つの実施形態において、この薬剤は、ＡＣＰＬＸタンパク質活性のう
ちの１つ以上を刺激する。このような刺激薬剤の例としては、活性なＡＣＰＬＸ
タンパク質、およびその細胞に導入されたＡＣＰＬＸをコードする核酸分子が挙
げられる。別の実施形態において、この薬剤は、ＡＣＰＬＸタンパク質活性のう
ちの１つ以上を阻害する。このような阻害薬剤の例としては、アンチセンスＡＣ
ＰＬＸ核酸分子、および抗ＡＣＰＬＸ抗体が挙げられる。これらの調節方法は、
インビトロで（例えば、その薬剤とともにその細胞を培養することによって）、
あるいはインビボで（例えば、被験体にその薬剤を投与することによって）実施
され得る。このように、本発明は、ＡＣＰＬＸのタンパク質または核酸分子の、
異常な発現または異常な活性によって特徴付けられる、疾患または障害に罹患し
た個体を処置する方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ＡＣ
ＰＬＸの発現または活性を調節する（例えば、アップレギュレートまたはダウン
レギュレートする）薬剤（例えば、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイ
によって同定される薬剤）あるいはそのような薬剤の組み合わせを投与する工程
を包含する。別の実施形態において、この方法は、ＡＣＰＬＸのタンパク質また
は核酸分子を、低減したかまたは異常な、ＡＣＰＬＸの発現または活性を補償す
るための治療として、投与する工程を包含する。
【０２５６】 ＡＣＰＬＸ活性の刺激は、ＡＣＰＬＸが異常にダウンレギュレートされている
状況、および／またはＡＣＰＬＸ活性の増加が有益な効果を有するようである状
況において、望ましい。このような状況の１つの例は、被験体が、異常な細胞増
殖および／または細胞分化によって特徴付けられる障害（例えば、癌または免疫
関連障害）を有する場合である。このような状況の別の例は、被験体が妊娠性疾
患（例えば、子かん前症）を有する場合である。
【０２５７】 ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体を
含む本発明の抗体は、治療因子として使用され得る。このような因子は、一般に
、被験体における疾患または病理学を処置または防止するために使用される。抗
体の調製物、好ましくはその標的抗原に対して高い特異性および高い親和性を有
するものが、被験体に投与され、そして一般に、この標的との結合に起因する効
果を有する。このような効果は、所定の抗体分子と問題のその標的抗原との間の
相互作用の特異的な特性に依存して、１種類または２種類であり得る。第一の例
において、抗体の投与は、標的の天然に結合する内因性リガンドとの結合を排除
または阻害し得る。この場合において、抗体は、標的に結合して、そして天然に
存在するリガンドの結合部位をマスクする。ここで、このリガンドは、エフェク
ター分子として働く。従って、レセプターは、リガンドに応答性のシグナル伝達
経路を媒介する。
【０２５８】 あるいは、この効果は、抗体が標的分子上のエフェクター結合部位に結合する
ことによって生理学的結果を誘発するというものであり得る。この場合、標的（
疾患または病理学において存在しないかもしれないかまたは欠損し得る内因性リ
ガンドを有するレセプター）は、代理のエフェクターリガンドとして抗体を結合
し、レセプターベースのシグナル伝達事象をレセプターによって開始する。
【０２５９】 本発明の抗体の治療的有効量は、一般に治療目的に達する必要のある量に関す
る。上記のように、これは、抗体とそのリガンド抗原との間の結合相互作用であ
り得、これは、特定の場合には標的の機能を干渉し、他の場合には生理学的応答
を促進する。投与されるために必要とされる量はさらに、その特異的抗原に対す
る抗体の結合親和性に依存し、投与された抗体が投与される他の被験体の空隙率
（ｆｒｅｅ ｖｏｌｕｍｅ）から除去される速度にも依存する。本発明の抗体ま
たは抗体フラグメントの治療的に有効な投薬についての一般的範囲は、非限定的
な例として、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。一般
の投薬頻度は、例えば、１日２回〜週に１回の範囲であり得る。
【０２６０】 （治療剤の生物学的効果の決定） 本発明の種々の実施形態において、適切なインビトロアッセイまたはインビボ
アッセイを実施して、特定の治療剤の効果およびその投与が罹患組織の処置を示
すか否かを決定する。
【０２６１】 種々の特定の実施形態において、インビトロアッセイが患者の障害に関与する
代表的な細胞型で行われ、所定の治療剤がこの細胞型に対して所望の効果を発揮
するか否かを決定し得る。治療における使用のための化合物は、ヒト被験体にお
いて試験する前に適切な動物モデル系において試験され得る。これらの動物モデ
ル系としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ラット、マウス、
ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなど。同様に、インビボ試験については、当該分
野で公知の任意の動物モデル系が、ヒト被験体に対する投与の前に使用され得る
。
【０２６２】 本発明はさらに、以下の非限定的実施例を使用して例示される。
【０２６３】 （実施例１．ＡＬＣＬＰＸ核酸（「ＡＬ０３５４６０Ａ」）の分子クローニン
グ） 公知のカルボキシペプチダーゼに関するポリペプチド（配列番号２（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２）をコードする図１に示されるヌクレオチド配列（配列番号１）
を、ヒトゲノムＤＮＡの種々の領域をアセンブリすることによって同定した。こ
のアセンブリされた配列を、ＡＬ０３５４６０Ａと名付けた。
【０２６４】 ＳＩＧＮＡＬＰ分泌シグナル予想アルゴリズムは、ＡＬ０３５４６０Ａによっ
てコードされるポリペプチド（配列番号２）が残基２０と２１との間にシグナル
ペプチダーゼ切断部位を有することを予想した。従って、コードされるＡＬ０３
５４６０Ａタンパク質の成熟形態に対応する予想されたＯＲＦがクローニングさ
れた。
【０２６５】 オリゴヌクレオチドプライマーを、このタンパク質に対応するＤＮＡセグメン
トをＰＣＲを使用して増幅するために設計した。順方向プライマーは、ＢｇｌＩ
Ｉ制限部位を含み、そして逆方向プライマーは、インフレームでＸｈｏＩ制限部
位を含んだ。以下のＰＣＲプライマーを使用した： ＡＬ０３５４６０Ａ順方向：
【０２６６】
【化１】 （配列番号３）、および ＡＬ０３５４６０Ａ逆方向：
【０２６７】
【化２】 （配列番号４）。
【０２６８】 ＰＣＲ反応を、５０μｌ容量において、合計５ｎｇのヒト心臓ｃＤＮＡテンプ
レート、それぞれ１μＭのＡＬ０３５４６０Ａ順方向プライマーおよびＡＬ０３
５４６０Ａ逆方向プライマー、５μモルのｄＮＴＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）および１μｌの５０×Ａｄｖ
ａｎｔａｇｅ−ＨＦ２ポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）を使用して実施した。以下のＰＣＲ反応条件を使用した： ａ）９６℃ ３分間 ｂ）９６℃ ３０秒間変性 ｃ）７０℃ ３０秒間、プライマーアニーリング ｄ）７２℃ ４分間伸長 工程（ｂ）〜（ｄ）を１０回繰り返す。工程ｃ）の温度を１℃／サイクルだけ
減少する ｅ）９６℃ ３０秒間変性 ｆ）６０℃ ３０秒間アニーリング ｇ）７２℃ ４分間伸長 工程（ｅ）〜（ｇ）を２５回繰り返す ｈ）７２℃ １０分間の最終伸長。
【０２６９】 約２．２ｋｂｐの推定されたサイズを有するＰＣＲ産物を、アガロースゲルか
ら単離し、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，
ＣＡ）に連結した。クローン化した挿入物を、ベクター特異的Ｍ１３順方向（−
４０）プライマーおよびＭ１３逆方向プライマー、ならびにイカの遺伝子特異的
プライマーを使用して配列決定した：
【０２７０】
【化３】 挿入物の配列を、予想されたＡＬ０３５４６０Ａ成熟タンパク質（残基２１〜
７３４）についてコードするオープンリーディングフレームとして確認した。こ
のクローンを、ｐＣＲ２．１−ＡＬ０３５４６０と名付けた。
【０２７１】 （実施例２．哺乳動物発現ベクターｐＣＥＰ４／Ｓｅｃの構築） 哺乳動物細胞へのＡＣＰＬＸ配列の発現を試験するために、ｐＣＥＰ４／Ｓｅ
ｃと名付けたベクターを構築した。
【０２７２】 ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃベクターを、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から構築した。以下のオリ
ゴヌクレオチドプライマーを設計して、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５Ｈ
ｉｓ発現ベクターからのフラグメントを増幅した。
【０２７３】 ｐＳｅｃ−Ｖ５−Ｈｉｓ順方向
【０２７４】
【化４】 （配列番号１７）および ｐＳｅｃ−Ｖ５−Ｈｉｓ逆方向
【０２７５】
【化５】 （配列番号１８） ＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩおよびＡｐａＩで消化し、そしてＩｇκリーダー配列
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）を保有する、ＸｈｏＩ／Ａ
ｐａＩ消化したｐＳｅｃＴａｇ２Ｂベクターに連結した。得られたベクターの正
確な構造（インフレームでＩｇ−κリーダーおよびＶ５−Ｈｉｓ６を含むｐＳｅ
ｃＶ５Ｈｉｓ）を、ＤＮＡ配列分析により確認した。ベクターｐＳｅｃＶ５Ｈｉ
ｓを、ＰｍｅＩおよびＮｈｅＩで消化して、正確なフレームで上記エレメントを
保持するフラグメントを提供した。このＰｍｅＩ−ＮｈｅＩフラグメントを、Ｂ
ａｍＨＩ／ＫｌｅｎｏｗおよびＮｈｅＩで処理したベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結した。得られたベクターはｐ
ＣＥＰ４／Ｓｅｃと命名され、そしてＰＣＭＶおよび／またはＰＴ７プロモータ
ーの制御下に、インフレームでＩｇκリーダー、目的のクローンの挿入部位、な
らびにＶ５およびＨｉｓ６を含む。ＰＣＥＰ４／Ｓｅｃは、任意のタンパク質を
Ｉｇκ鎖シグナルペプチドに融合することによって、異種タンパク質発現および
分泌を可能にする発現ベクターである。発現タンパク質の検出および精製は、Ｃ
末端におけるＶ５エピトープタグおよび６×Ｈｉｓタグ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の存在により補助される。
【０２７６】 （実施例３：ヒト胚腎臓２９３細胞における、ＡＬ０３５４６０Ａの発現） ヒトＡＬ０３５４６０Ａ配列を含む２．１ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩフラグ
メントを、ｐＣＲ２．１−ＡＬ０３５４６０Ａ（実施例２）から単離し、そして
ベクターｐＣＥＰ４／Ｓｅｃにサブクローン化して（実施例３）、発現ベクター
ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−ＡＬ０３５４６０を生成した。ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−ＡＬ
０３５４６０Ａベクターを、製造者の指示書（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖ
ｉｌｌｅ，ＭＤ）に従って、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓ試薬を使用し
て、２９３細胞にトランスフェクトした。この細胞ペレットおよび上清を、トラ
ンスフェクション７２時間後回収し、そして抗Ｖ５抗体を用いるウェスタンブロ
ッティング（還元条件）によりＡＬ０３５４６０Ａ発現について試験した。ｈＡ
Ｌ０３５４６０の成熟フラグメントについて予想された分子量は、プライマーに
よってコードされる４アミノ酸を含んで、８０１３２ｋＤａである。図６は、ｈ
ＡＬ０３５４６０Ａの単量体形態が２９３細胞によって分泌される１２５ｋＤａ
の優勢なバンドとして発現されることを示す。ＡＬ０３５４６０Ａの成熟フラグ
メントは、６つの潜在的Ｎ−グリコシル化部位を予測する。予想された分子量と
観察された値との間の矛盾は、このタンパク質のグリコシル化に帰する。さらに
、いくつかのより大きい分子量バンドは、分泌されたＡＬ０３５４６０Ａタンパ
ク質のオリゴマー化を示す。
【０２７７】 （実施例４．クローンＡＬ０３５４６０Ａを使用する発現分析） クローンＡＬ０３５４６０Ａに対して相同な配列の発現を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ
ｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標） ７７００
配列検出システムにおいて実施されるリアルタイムの定量的ＰＣＲ（ＴＡＱＭＡ
Ｎ（登録商標））により、４１正常サンプルおよび５５腫瘍サンプルにおいて評
価した。表ＢＢにおいて、以下の省略形が使用される： ｃａ．＝癌腫、 ＊＝転移から確立された ｍｅｔ＝転移 ｓ ｃｅｌｌ ｖａｒ＝小細胞改変体 ｎｏｎ−ｓ＝ ｎｏｎ−ｓｍ＝非小 ｓｑｕａｍ＝扁平（ｓｑｕａｍｏｕｓ） ｐｌ．ｅｆｆ＝ ｐｌ ｅｆｆｕｓｉｏｎ＝胸水 ｇｌｉｏ＝神経膠腫 ａｓｔｒｏ＝星状細胞腫 ｎｅｕｒｏ＝神経芽腫。
【０２７８】 （表ＩＩＩ．発現分析において使用される組織サンプル）
【０２７９】
【表３】 ９６個のＲＮＡサンプルを、分析した。発現を参照ＲＮＡと比較した。特に、
サンプルを、β−アクチンおよびＧＡＰＤＨに対して正規化した。ＲＮＡ（約５
０ｎｇの総ＲＮＡまたは約１ｎｇのポリＡ＋ＲＮＡ）を、製造業者のプロトコー
ルに従って、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）逆転写試薬キット（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ；カタログ番号Ｎ８０８−０２３４）
およびランダムヘキサマーを使用してｃＤＮＡに転換した。反応を２０μｌにお
いて実施し、そして３０分間、４８℃においてインキュベートした。次いで、ｃ
ＤＮＡ（５μｌ）を、製造業者のプロトコールに従って、β−アクチンおよびＧ
ＡＰＤＨ ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイ試薬（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ；それぞれ、カタログ番号４３１０８８１Ｅおよび４３１０８８４Ｅ）ならび
にＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ユニバーサルＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＰＥ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３０４４４７）を使用するＴＡＱＭＡ
Ｎ（登録商標）反応のために別個のプレートに移した。反応を、以下のパラメー
タを使用して２５μｌにおいて実施した：５０℃にて２分；９５℃にて１０分；
９５℃にて１５秒／６０℃にて１分（４０サイクル）。結果は、対数スケールを
使用してＣＴ値（所定のサンプルが蛍光の閾値レベルを越えるサイクル）として
記録され、２つのサンプルの間のＲＮＡ濃度における差異がΔＣＴの二乗として
表された。βアクチンおよびＧＡＰＤＨについて得られる平均ＣＴ値を使用して
、ＲＮＡサンプルを正規化した。最高のＣＴ値を生成するＲＮＡサンプルは、さ
らなる希釈を必要としないが、全ての他のサンプルをそれらのβ−アクチン／Ｇ
ＡＰＤＨ平均ＣＴ値に従って、このサンプルに対して希釈した。
【０２８０】 正規化されたＲＮＡ（５μｌ）をｃＤＮＡに転換し、そして製造業者の指示に
従って、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｒｅａｇｅ
ｎｔｓ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３０９１６９）および遺
伝子特異的プライマーを使用するＴＡＱＭＡＮ（登録商標）によって分析した。
プローブおよびプライマーを、入力として、クローンＡＬ０３５４６０Ａの配列
を使用するＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ’ｓ Ｐｒｉｍｅｒ
Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｐｐｌｅ Ｃｏｍｐｕｔｅ
ｒのＭａｃｉｎｔｏｓｈ Ｐｏｗｅｒ ＰＣ用バージョンＩ）に従って、アッセ
イについて設計した。２セットのプライマー（順方向および逆方向）ならびにプ
ローブを作製し、以下に示した。
【０２８１】 セットＡｇ８６は、配列２６７−３４２を標的化する
【０２８２】
【化６】 セットＡｇ８６ｂは、配列２７１−３４６を標的化する
【０２８３】
【化７】 デフォルト設定を反応条件に使用し、そしてプライマーを選択する前に以下の
パラメータを設定した：プライマー濃度＝２５０ｎＭ、プライマー融解温度（Ｔ m ）範囲＝５８℃〜６０℃、プライマー最適Ｔm＝５９℃、最大プライマー差＝２
℃、プローブは、５’Ｇを有さず、プローブＴmは、プライマーＴmよりも１０℃
高くなければならない、アンプリコンサイズは、７５ｂｐ〜１００ｂｐである。
選択されたプローブおよびプライマー（下記を参照のこと）を、Ｓｙｎｔｈｅｇ
ｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）によって合成した。プローブを、ＨＰＬ
Ｃにより二重精製して、結合していない色素を取り除き、そして質量分析法によ
り評価して、それぞれ、プローブの５’末端および３’末端へのレポーター色素
および消光色素の結合を確認した。これらの最終濃度は、以下の通りであった：
順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、各々９００ｎＭ、ならびにプロー
ブは、２００ｎＭ。
【０２８４】 ＰＣＲ条件：各組織および各細胞株由来の正規化ＲＮＡを、９６ウェルＰＣＲ
プレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の各ウェルにス
ポットした。２つのプローブ（ＡＬＣＬＰＸプローブで多重化されたＡＬＣＬＰ
ＬＸ特異的プローブおよび別の遺伝子特異的プローブ）をＰＣＲカクテル、ＰＥ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７７００用の１ × ＴａｑＭａｎTMＰＣＲ Ｍａｓ
ｔｅｒ Ｍｉｘを使用して、５ｍＭ ＭｇＣｌ２，ｄＮＴＰｓ（１：１：１：２
比率のｄＡ，Ｇ，Ｃ，Ｕ）、０．２５ Ｕ／ｍｌ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ TM （ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、および０．４Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅインヒ
ビター、ならびに０．２５ Ｕ／μｌ逆転写酵素と共にセットアップした。逆転
写を、４８℃で３０分間実施し、次いで、以下のような増幅／ＰＣＲサイクルを
実施した：９５℃で１０分間、次いで、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を４
０サイクル。
【０２８５】 プローブセットＡｇ８６についての結果を、図６Ａ〜Ｃに示す。最高の発現は
、正常組織の胎児腎臓、乳腺、胎盤および子宮筋層において見出された。プロー
ブセットＡｇ８６ｂの使用は、同一の組織ならびに脂肪において高発現レベルを
、そして他の正常組織において中程度のレベルを検出した（図７Ａ〜Ｃ）。
【０２８６】 クローンＡＬ０３５４６０Ａについて、このクローンにおける位置５８８漢６
３を検出する、以下のプライマーおよびプローブを使用した：
【０２８７】
【化８】 これらの結果を、図７Ａ〜７Ｃに示す。クローンＡＬ０３５４６０Ａの高発現
を、試験した正常脳組織のほとんどにおいて見出した。さらに、低レベルの発現
を、多くの他の正常組織および特定の癌組織において見出す。
【０２８８】 （実施例５．ＡＬ０３５４６０による腫瘍増殖の抑制） 乳癌細胞株および卵巣腫瘍細胞株を、誘導性プロモーターの制御下でＡＬ０３
５４６０Ａ遺伝子でトランスフェクトする。使用され得る細胞株としては、以下
が挙げられる：乳房癌（胸水）ＭＣＦ−７、乳房癌（胸水）ＭＤＡ−ＭＢ−２３
１、乳房癌（胸水）Ｔ４６Ｄ、乳房癌ＢＴ−５４９、乳房癌ＭＤＡ−Ｎ、卵巣癌
ＯＶＣＡＲ−３、卵巣癌ＯＶＣＡＲ−４、卵巣癌ＯＶＣＡＲ−５、卵巣癌ＯＶＣ
ＡＲ−８、卵巣癌ＩＧＲＯＶ−１および、卵巣癌（腹水）ＳＫ−ＯＶ−３。これ
らの細胞株は、ＡＬ０３５４６０Ａの減少した発現を示す。安定的な形質導入体
を、例えば、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０
）またはｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら、（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ ６：１
８７−１９５）へのＡＬ０３５４６０Ａ遺伝子の組み込みに基づく方法を使用し
て作製する。誘導性プロモーターを、Ｓａｅｚ Ｅら（Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇ
ｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｎｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ａ
ｎｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ １９９７年１０月；８（５）：６０８−１６）に総説されたプロモータ
ーの中から選択し得る。真核生物細胞についての他の適切な発現系については、
例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡ
ＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ
．，１９８９の第１６章および第１７章に記載される。哺乳動物細胞の適切な遺
伝子形質転換はまた、Ｓａｗａｄａ Ｍ．およびＫａｍａｔａｋｉ Ｔ．（Ｇｅ
ｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒ ｃｅｌｌｓ ｓｔａｂｌｙ ｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｎｇ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｍｕｔａｇｅｎ ａｓｓａｙｓ．Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ
．１９９８年８月；４１１（１）：１９−４３）ならびにＤｅＣｒｕｚ ＥＥら
（Ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｓｏｍａｔｉｃ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ
ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ Ｏｎｃｏｌ．１９９６年３月；１
（２）：７３−８３）によって記載される。トランスフェクションを、例えば、
リポソーム媒介トランスフェクション（Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ Ｅ．Ｔ．およびＯ
ｌｅｒ Ｊ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０００；１３０：１５５
−６４）、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション（Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ
Ｅ．Ｔ．およびＧｏｉｆｆｏｎ Ｖ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２
０００；１３０：１４７−５３）、またはリン酸カルシウムトランスフェクショ
ン（Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ Ｅ．Ｔ．およびＧｏｉｆｆｏｎ Ｖ． Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０００；１３０：１３５−４５）によってもたらされ
得る。
【０２８９】 細胞をトランスフェクトした後、細胞増殖に対するＡＬ０３５４６０Ａ遺伝子
産物の効果を、誘導後に評価する。インビトロ増殖およびインビボ増殖の両方を
、モニターし、そして空ベクターでトランスフェクトした腫瘍細胞の増殖と比較
する。トランスフェクトされた細胞がＡＬ０３５４６０Ａの発現後にインビトロ
およびインビボの両方での増殖速度における減少を示すことが予想される。
【０２９０】 （他の実施形態） 本発明は、その詳細な説明とともに記載されてきたが、前述の説明は例示であ
って、本発明の範囲を限定することを意図するのではない。本発明の範囲は、添
付の特許請求の範囲の範囲により規定される。他の局面、利点および改変は、上
記の特許請求の範囲の範囲内にある。
【０２９１】
【図面の簡単な説明】
【０２９２】
【図１】 図１は、本発明のＡＣＰＬＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（配
列番号１）の表示である。
【０２９３】
【図２】 図２は、図１に示されるヌクレオチド配列によりコードされるＡＣＰＬＸポリ
ペプチド配列（配列番号２）の表示である。
【０２９４】
【図３】 図３Ａおよび図３Ｂは、マウスＡＥＢＰ１ポリペプチド（配列番号＿）（「Ｑ
６１２８１」）、ヒトＡＥＢＰ１ポリペプチド（配列番号＿）（「Ｑ１４１１３
」）、マウス大動脈カルボキシペプチダーゼ様−２ポリペプチド（配列番号＿）
（「Ｏ８８４４２」）、マウスカルボキシペプチダーゼＸ２ポリペプチド（配列
番号＿）（「Ｏ５４８６０」）および本発明のＡＣＰＬＸポリペプチド（配列番
号２）（「ＡＬＯ３５４６０＿ＧＥＮＥＳＣＡＮ＿ｐｒｅｄｅｉｃｅｄ＿ｐｅｐ
」）のアミノ酸配列の比較である。
【０２９５】
【図４】 図４は、マウスＣＰＰＸ１ポリペプチド（ＡＦＯ７７７３８）およびＡＣＰＬ
Ｘポリペプチド（配列番号２）（「ＡＬＯ３５４６０＿ＧＥＮＥＳＣＡＮ＿ｐｒ
ｅｄｉｃｔｅｄ＿ｐｅｐ」）のアミノ酸配列中の同一の領域および保存的アミノ
酸置換の領域を示す比較である。
【０２９６】
【図５】 図５は、２９３細胞によるＡＣＰＬＸポリペプチドの発現を示すウェスタンブ
ロットの表示である。
【０２９７】
【図６】 図６Ａ〜６Ｃは、種々の細胞型および組織におけるＡＣＰＬ核酸の相対的発現
を示すヒストグラムである。
【０２９８】
【図７】 図７Ａ〜７Ｃは、プローブセットＡＧ８６ｂを使用する種々の組織における本
発明のＡＣＰＬＸ核酸の相対的発現を示すヒストグラムである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｐ 9/00 ４Ｂ０６５ 48/00 9/10 １０１ ４Ｃ０８４ Ａ６１Ｐ 9/00 9/12 ４Ｃ０８５ 9/10 １０１ 35/00 ４Ｃ０８６ 9/12 Ｃ０７Ｋ 16/40 ４Ｃ０８７ 35/00 Ｃ１２Ｎ 1/02 ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 16/40 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/02 1/19 1/15 1/21 1/19 9/64 Ｚ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ 9/64 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｍ 33/50 33/566 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ６０／２２４，０８６ (32)優先日 平成12年８月９日(2000．8．9) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／６４１，７４１ (32)優先日 平成12年８月18日(2000．8．18) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA35 AA40 BA11 BB50 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA14 CA04 DA02 EA04 GA11 HA12 4B050 CC03 DD11 LL01 LL03 4B063 QA01 QA18 QQ20 QQ42 QQ52 QR55 QR59 QR62 QR77 QR80 QS24 QS25 QS28 QS34 4B064 AG27 CA19 CA20 CC24 CE12 DA01 DA13 4B065 AA93X AA93Y AB01 AC14 CA33 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA35 CA53 CA56 CA59 DC22 MA52 MA55 MA66 NA14 ZA361 ZA421 ZA451 ZB261 ZC781 4C085 AA13 AA14 AA16 BB11 CC05 DD22 DD23 DD86 EE01 EE06 FF24 4C086 AA01 AA03 EA16 MA04 MA52 MA55 MA66 NA14 ZA36 ZA42 ZA45 ZB26 ZC78 4C087 AA01 AA03 BB65 BC83 MA52 MA55 MA66 NA14 ZA36 ZA42 ZA45 ZB26 4H045 AA11 AA30 CA40 DA76 DA89 EA20 EA50 FA71 FA72 FA74 GA26

Claims (43)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 単離されたポリペプチドであって、以下： ａ）配列番号２によって提供されるアミノ酸配列の成熟形態； ｂ）配列番号２によって提供されるアミノ酸配列の成熟形態の改変体であって
    、ここで、該成熟形態中の任意のアミノ酸が異なるアミノ酸に改変され、ただし
    、該成熟形態の配列中の１５％以下のアミノ残基がそのように改変される、改変
    体； ｃ）配列番号２によって提供されるアミノ酸配列； ｄ）配列番号２によって提供されるアミノ酸配列の改変体であって、ここで該
    選択された配列中で特定される任意のアミノ酸が異なるアミノ酸に改変され、た
    だし、該配列中の１５％以下のアミノ酸残基がそのように改変される、改変体；
    および ｅ）ａ）〜ｄ）のいずれかのフラグメント からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが
    、配列番号２によって提供されるによって提供される配列の天然に存在する対立
    遺伝子改変体である、ポリペプチド。
  3. 【請求項３】 請求項２に記載のポリペプチドであって、ここで、前記改変
    体が単一ヌクレオチド多型の翻訳である、ポリペプチド。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが
    請求項１に記載の改変体ポリペプチドであり、ここで、前記選択された配列中で
    特定される任意のアミノ酸が保存的置換を提供するように改変される、ポリペプ
    チド。
  5. 【請求項５】 単離された核酸分子であって、該核酸分子が、以下： ａ）配列番号２によって提供されるアミノ酸配列の成熟形態； ｂ）配列番号２によって提供されるアミノ酸配列の成熟形態の改変体であって
    、ここで、該選択された配列の該成熟形態中の任意のアミノ酸が異なるアミノ酸
    に改変され、ただし、該成熟形態の配列中の１５％以下のアミノ残基がそのよう
    に改変される、改変体； ｃ）配列番号２によって提供されるアミノ酸配列； ｄ）配列番号２によって提供されるアミノ酸配列の改変体であって、ここで、
    該選択された配列中で特定される任意のアミノ酸が異なるアミノ酸に改変され、
    ただし、該配列中の１５％以下のアミノ酸残基がそのように改変される、改変体
    ； ｅ）配列番号２によって提供されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該
    ポリペプチドの任意の改変体の、少なくとも一部をコードする核酸フラグメント
    であって、ここで、該選択された配列の任意のアミノ酸が異なるアミノ酸に改変
    され、ただし、該配列中の１０％以下のアミノ酸残基がそのように変化される、
    核酸フラグメント；および ｆ）該核酸分子のいずれかの相補体 からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配
    列を含む、単離された核酸分子。
  6. 【請求項６】 請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が
    天然に存在する対立遺伝子核酸改変体のヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
  7. 【請求項７】 改変体ポリペプチドをコードする請求項５に記載の核酸分子
    であって、ここで、該改変体ポリペプチドが天然に存在するポリペプチド改変体
    のポリペプチド配列を有する、核酸分子。
  8. 【請求項８】 請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が
    前記改変体ポリペプチドをコードする単一ヌクレオチド多型を含む、核酸分子。
  9. 【請求項９】 請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が
    以下： ａ）配列番号１によって提供されるされるヌクレオチド配列； ｂ）ヌクレオチド配列であって、ここで、配列番号１によって提供されるヌク
    レオチド配列中の１つ以上のヌクレオチドが、該選択された配列によって提供さ
    れるヌクレオチドから異なるヌクレオチドに改変され、ただし、１７％以下のヌ
    クレオチドがそのように改変される、ヌクレオチド配列； ｃ）配列番号１によって提供されるされる配列の核酸フラグメント；および ｄ）核酸フラグメントであって、ここで、配列番号１によって提供されるヌク
    レオチド配列中の１つ以上のヌクレオチドが、該選択された配列によって提供さ
    れるヌクレオチドから異なるヌクレオチドに改変され、ただし、１７％以下のヌ
    クレオチドがそのように改変される、核酸フラグメント； からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
  10. 【請求項１０】 請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子
    は、配列番号１によって提供されるされるヌクレオチド配列または該ヌクレオチ
    ド配列の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、核酸分子。
  11. 【請求項１１】 請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子
    が、以下：ヌクレオチド配列であって、前記選択されたヌクレオチド配列のコー
    ド配列において特定される任意のヌクレオチドが、該選択された配列によって提
    供されるヌクレオチドから異なるヌクレオチドに改変され、ただし、該選択され
    たコード配列中の１７％以下のヌクレオチドがそのように変化される、ヌクレオ
    チド配列、第１のポリヌクレオチドの相補体である単離された第２のポリヌクレ
    オチド、またはこれらいずれかのフラグメント を含む、核酸分子。
  12. 【請求項１２】 請求項１１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
  13. 【請求項１３】 前記核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターをさら
    に含む、請求項１２に記載のベクター。
  14. 【請求項１４】 請求項１２に記載のベクターを含む、細胞。
  15. 【請求項１５】 請求項１に記載のポリペプチドに免疫特異的に結合する、
    抗体。
  16. 【請求項１６】 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１５に記載
    の抗体。
  17. 【請求項１７】 前記抗体がヒト化抗体である、請求項１５に記載の抗体。
  18. 【請求項１８】 サンプル中の請求項１に記載のポリペプチドの存在または
    量を決定するための方法であって、該方法は、以下： （ａ）該サンプルを提供する工程； （ｂ）該サンプルに該ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体を導入する工
    程；および （ｃ）該ポリペプチドに結合する抗体の存在または量を測定して、それによっ
    て該サンプル中のポリペプチドの存在または量を決定する工程、 を包含する、方法。
  19. 【請求項１９】 サンプル中の請求項５に記載の核酸分子の存在または量を
    決定するための方法であって、該方法は、以下： （ａ）該サンプルを提供する工程； （ｂ）該サンプルに該核酸分子に結合するプローブを導入する工程；および （ｃ）該核酸分子に結合する該プローブの存在または量を測定して、それによ
    って該サンプル中の該核酸分子の存在または量を決定する工程、 を包含する、方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１に記載のポリペプチドに結合する因子を同定する
    方法であって、該方法は、以下： （ａ）該ポリペプチドに該因子を導入する工程；および （ｂ）該因子が該ポリペプチドに結合するか否かを決定する工程、 を包含する、方法。
  21. 【請求項２１】 病態の処置における使用のための潜在的な治療因子を同定
    するための方法であって、ここで、該病態は、請求項１に記載のポリペプチドの
    異常な発現または異常な生理学的相互作用に関連し、該方法は、以下： （ａ）請求項１に記載のポリペプチドを発現しかつ該ポリペプチドに起因する
    特性または機能を有する細胞を提供する工程； （ｂ）候補物質を含有する組成物と該細胞とを接触させる工程；および （ｃ）該物質が該ポリペプチドに起因する該特性または該機能を変更するか否
    かを決定する工程を包含し、 これによって、該物質の存在中に観察された変更が、該細胞を該物質を欠く組
    成物と接触させた際に観察されない場合、該物質が潜在的な治療因子として同定
    される、方法。
  22. 【請求項２２】 請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節するための方
    法であって、該方法は、請求項１に記載のポリペプチドを発現する細胞サンプル
    に、該ポリペプチドの活性を調節するに十分な量で該ポリペプチドに結合する化
    合物を導入する工程を包含する、方法。
  23. 【請求項２３】 請求項１に記載のポリペプチドと関連する病態を処置また
    は予防する方法であって、該方法は、そのような処置または予防が所望される被
    験体に、該被験体の該病態を処置または予防するに十分な量で請求項１に記載の
    ポリペプチドを投与する工程を包含する、方法。
  24. 【請求項２４】 前記被験体がヒトである、請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 請求項１に記載のポリペプチドと関連する病態を処置また
    は予防する方法であって、該方法は、そのような処置または予防が所望される被
    験体に、該被験体の該病態を処置または予防するに十分な量で請求項５に記載の
    核酸を投与する工程を包含する、方法。
  26. 【請求項２６】 前記被験体がヒトである、請求項２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 請求項１に記載のポリペプチドと関連する病態を処置また
    は予防する方法であって、該方法は、そのような処置または予防が所望される被
    験体に、該被験体の該病態を処置または予防するに十分な量で請求項１５に記載
    の抗体を投与する工程を包含する、方法。
  28. 【請求項２８】 前記被験体がヒトである、請求項２７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 請求項１に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能な
    キャリアを含有する、薬学的組成物。
  30. 【請求項３０】 請求項５に記載の核酸分子および薬学的に受容可能なキャ
    リアを含有する、薬学的組成物。
  31. 【請求項３１】 請求項１５に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリ
    アを含有する、薬学的組成物。
  32. 【請求項３２】 請求項２９に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む
    、キット。
  33. 【請求項３３】 請求項３０に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む
    、キット。
  34. 【請求項３４】 請求項３１に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む
    、キット。
  35. 【請求項３５】 ヒトの疾患と関連する症候群を処置するための医薬の製造
    における治療剤の使用であって、該疾患が請求項１に記載のポリペプチドと関連
    する病態から選択され、ここで、該治療剤が請求項１に記載のポリペプチドであ
    る、使用。
  36. 【請求項３６】 ヒトの疾患と関連する症候群を処置するための医薬の製造
    における治療剤の使用であって、該疾患が請求項１に記載のポリペプチドと関連
    する病態から選択され、ここで、該治療剤が請求項５に記載の核酸である、使用
    。
  37. 【請求項３７】 ヒトの疾患と関連する症候群を処置するための医薬の製造
    における治療剤の使用であって、該疾患が請求項１に記載のポリペプチドと関連
    する病態から選択され、ここで、該治療剤が請求項１５に記載の抗体である、使
    用。
  38. 【請求項３８】 請求項１に記載のポリペプチドと関連する病態に対する活
    性もしくは潜伏のモジュレーターまたは該病態の疾病素質をスクリーニングする
    ための方法であって、該方法は、以下： ａ）請求項１に記載のポリペプチドと関連する病態に対する増加した危険状態
    の試験動物に試験化合物を投与する工程であって、ここで、該試験動物は請求項
    １に記載のポリペプチドを組み換え発現する、工程； ｂ）工程（ａ）の該化合物を投与する工程の後に該試験動物中の該ポリペプチ
    ドの活性を測定する工程；および ｃ）該試験動物における該タンパク質の活性を、該ポリペプチドが投与されて
    いないコントロール動物における該ポリペプチドの活性と比較する工程であって
    、ここで、該コントロール動物に関連した該試験動物中の該ポリペプチドの活性
    における変化は、該試験化合物が請求項１に記載のポリペプチドと関連する病態
    の潜伏のモジュレーターまたは該病態の疾病素質であることを示す、工程 を包含する、方法。
  39. 【請求項３９】 請求項３６に記載の方法であって、ここで、前記試験動物
    が、野生型試験動物に関連して増加したレベルで、試験タンパク質導入遺伝子を
    発現するかまたはプロモーターの制御下で該導入遺伝子を発現する、組換え試験
    動物であり、ここで、該プロモーターは、該導入遺伝子のネイティブな遺伝子プ
    ロモーターではない、方法。
  40. 【請求項４０】 第１の哺乳動物被験体における請求項１に記載のポリペプ
    チドの変化したレベルと関連する疾患の存在または該疾患の疾病素質を決定する
    ための方法であって、該方法は、以下： ａ）該第１の哺乳動物被験体由来のサンプル中の該ポリペプチドの発現レベル
    を測定する工程；および ｂ）工程（ａ）の該サンプル中の該ポリペプチドの量を、該疾患を有さないこ
    とが既知であるかまたは該疾患にかかりにくいことが既知である第２の哺乳動物
    被験体由来のコントロールサンプル中に存在する該ポリペプチドの量と比較する
    工程を包含し、 ここで、該コントロールサンプルと比較した場合の該第１の被験体における該
    ペプチドの発現レベルにおける変化が、該疾患の存在または該疾患の疾病素質を
    示す、方法。
  41. 【請求項４１】 第１の哺乳動物被験体における請求項５に記載の核酸分子
    の変化したレベルと関連する疾患の存在または該疾患の疾病素質を決定するため
    の方法であって、該方法は、以下： ａ）該第１の哺乳動物被験体由来のサンプル中の該核酸の量を測定する工程；
    および ｂ）工程（ａ）の該サンプル中の該核酸の量を、該疾患を有さないことが既知
    であるかまたは該疾患にかかりにくいことが既知である第２の哺乳動物被験体由
    来のコントロールサンプル中に存在する該核酸の量と比較する工程を包含し、 ここで、該コントロールサンプルと比較した場合の該第１の被験体における該
    核酸のレベルにおける変化が、該疾患の存在または該疾患の疾病素質を示す、方
    法。
  42. 【請求項４２】 哺乳動物において病理学的状態を処置する方法であって、
    該方法は、該病理状態を緩和するに十分な量でポリペプチドを該哺乳動物に投与
    する工程を包含し、ここで、該ポリペプチドが、配列番号２によって提供される
    アミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性なフラグメントを含むポリペプチド
    に少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドである、方法。
  43. 【請求項４３】 哺乳動物の病理状態を処置する方法であって、該方法は、
    該病理状態を緩和するに十分な量で請求項１５に記載の抗体を該哺乳動物に投与
    する工程を包含する、方法。
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