JP2003528583A - ヘパトーム誘導増殖因子様タンパク質、これらをコードするポリヌクレオチド、および使用方法。 - Google Patents

ヘパトーム誘導増殖因子様タンパク質、これらをコードするポリヌクレオチド、および使用方法。

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JP2003528583A
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キャサリン バーゲス，
リチャード エイ． シムケッツ，
フェレンチ エル． ボルドッグ，
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ウィリアム ラロッシェル，
ステイシー ミンスコフ，
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キュラジェン コーポレイション
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規の単離されたポリヌクレオチドであるＨＤＧＦＸ、ならびにＨＤＧＦＸをコードするポリヌクレオチドおよびＨＤＧＦＸに免疫特異的に結合する抗体、あるいはこのＨＤＧＦＸポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体の任意の誘導体、改変体、変異体またはフラグメントを提供する。本発明はさらに、広範な病理学的状態の検出および処置、ならびに他の用途に、ＨＤＧＦＸポリペプチド、ポリヌクレオチド、および抗体を使用する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、一般に、新規な核酸およびポリペプチド、そしてより詳細には、増
殖因子に関連するポリペプチドをコードする新規核酸に関する。
【０００２】 （発明の背景） ヘパトーム由来増殖因子（ＨＤＧＦ）およびＨＤＧＦ関連タンパク質（ＨＲＰ
）は、Ｎ末端でよく保存されたアミノ酸配列を有する遺伝子ファミリーに属する
。ヘパトーム由来増殖因子ＨＤＧＦは、胎児大動脈において高度に発現されるこ
の分泌ヘパリン結合増殖因子の新しいファミリーにおいて同定された最初のメン
バーであった。他のヘパリン結合タンパク質と同様に、ＨＤＧＦは、線維芽細胞
のマイトジェン活性を有する酸性ポリペプチドである。
【０００３】 血管増殖におけるＨＤＧＦの生物学的役割は、未知である。しかし、ＨＤＧＦ
は、ヒトアテローム硬化症性頸動脈における平滑筋細胞中の増殖細胞核抗原（Ｐ
ＣＮＡ）と共存し、これは、ＨＤＧＦの役割が、発生中においておよび血管損傷
に応答して、平滑筋増殖を調節することであることを示唆する。
【０００４】 （発明の要旨） 本発明は、ヘパトーム由来増殖因子（ＨＤＧＦ）タンパク質に対して相同性を
有する新規ポリペプチドをコードする核酸の発見に一部基づく。この新規なヘパ
トーム由来増殖因子Ｘ（ＨＤＧＦＸ）ポリヌクレオチド配列およびこれらの核酸
配列によってコードされるＨＤＧＦＸポリペプチド、ならびにそれらのフラグメ
ント、ホモログ、アナログおよび誘導体が、本発明において特許請求される。
【０００５】 １つの局面において、本発明は、単離されたＨＤＧＦＸ核酸（配列番号１（表
１に示されるような））あるいはそのフラグメント、ホモログ、アナログまたは
誘導体を提供し、この核酸は、ＨＤＧＦＸポリペプチドをコードする。この核酸
は、例えば、表１のアミノ酸配列（配列番号２）を含むポリペプチドに対して、
少なくとも８５％同一なポリペプチドをコードする核酸配列を含む。この核酸は
、例えば、ゲノムＤＮＡフラグメントであり得るか、またはそれは、ｃＤＮＡ分
子であり得る。別の局面において、本発明は、表１に示されるＨＤＧＦＸ核酸の
相補体、あるいはそのフラグメント、ホモログ、アナログまたは誘導体を提供す
る。
【０００６】 本明細書中に記載される核酸の１以上を含むベクター、およびそれらのベクタ
ーまたは本明細書中に記載される核酸を含む細胞もまた、本発明に含まれる。
【０００７】 本発明はまた、上記の任意の核酸分子を含む組換え発現ベクターで形質転換さ
れた宿主細胞に関する。
【０００８】 １つの局面において、本発明は、ＨＤＧＦＸ核酸および薬学的に受容可能なキ
ャリアまたは希釈剤を含む、薬学的組成物を包含する。さらなる局面において、
本発明は、実質的に精製されたＨＤＧＦＸポリペプチド（例えば、ＨＤＧＦＸ核
酸によってコードされる任意のＨＤＧＦＸポリペプチド）、ならびにそのフラグ
メント、ホモログ、アナログおよび誘導体を包含する。本発明はまた、ＨＤＧＦ
Ｘポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む、薬学的
組成物を包含する。
【０００９】 さらなる局面において、本発明は、ＨＤＧＦＸポリペプチドに特異的に結合す
る抗体を提供する。抗体は、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル
抗体であり得、そしてそのフラグメント、ホモログ、アナログおよび誘導体であ
り得る。本発明はまた、ＨＤＧＦＸ抗体および薬学的に受容可能なキャリアまた
は希釈剤を含む、薬学的組成物を包含する。本発明はまた、上記の任意の核酸分
子によってコードされるポリペプチド上のエピトープに結合する単離された抗体
に関する。
【００１０】 本発明はさらに、上記の任意の核酸分子によってコードされるポリペプチドに
結合する抗体およびネガティブコントロール抗体を備える、キットに関する。
【００１１】 本発明はさらに、ＨＤＧＦＸポリペプチドを産生するための方法を提供する。
この方法は、ＨＤＧＦＸ核酸（例えば、ＨＤＧＦＸ核酸を含むベクター）を含む
細胞を提供する工程、およびこの核酸によってコードされるＨＤＧＦＸポリペプ
チドを発現するのに十分な条件下でこの細胞を培養する工程を包含する。次いで
、発現されたＨＤＧＦＸポリペプチドが、この細胞から回収される。好ましくは
、細胞は、内因性ＨＤＧＦＸポリペプチドをほとんど産生しないかまたは全く産
生しない。細胞は、例えば、原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。
【００１２】 本発明は、上記に開示される任意の核酸分子によってコードされるポリペプチ
ドに対する、哺乳動物における免疫応答を誘導する方法を提供する。１つの実施
形態において、この方法は、この免疫応答を誘導するのに十分な量のこのポリペ
プチドを哺乳動物に投与する工程を包含する。別の実施形態において、この方法
は、この免疫応答を誘導するのに十分なＨＤＧＦＸポリペプチドを産生するのに
十分な量の、ＨＤＧＦＸポリペプチドをコードする核酸を、哺乳動物に投与する
工程を包含する。
【００１３】 本発明はまた、ＨＤＧＦＸポリペプチドに結合する化合物を同定する方法に関
する。この方法は、このＨＤＧＦＸポリペプチドに化合物を接触させて、そして
この化合物がこのＨＤＧＦＸポリペプチドに結合するか否かを決定することによ
る。
【００１４】 本発明はさらに、ＨＤＧＦＸポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する
方法を提供する。この方法は、ＨＤＧＦＸポリペプチドに化合物を接触させて、
そしてこのＨＤＧＦＸポリペプチド活性が調節されるか否かを決定することによ
る。
【００１５】 本発明はまた、ＨＤＧＦＸポリペプチド活性を調節する化合物に関し、この化
合物は、ＨＤＧＦＸポリペプチドにこの化合物を接触させてそしてこの化合物が
ＨＤＧＦＸポリペプチドの活性を調節するか否かを決定することによって同定さ
れ、この化合物は、ＨＤＧＦＸポリペプチドに結合するか、またはＨＤＧＦＸポ
リペプチドをコードする核酸分子に結合する。
【００１６】 さらなる局面において、本発明は、被験体における組織増殖関連障害（例えば
、腫瘍、再狭窄、乾癬、糖尿病、術後合併症および慢性関節リウマチ）を診断す
る方法を包含する。この方法は、被験体からの核酸サンプル（例えば、ＲＮＡま
たはＤＮＡ、あるいは両方）を提供する工程、およびこの被験体の核酸サンプル
中のＨＤＧＦＸ核酸の量を測定する工程を包含する。次いで、被験体核酸サンプ
ルにおけるＨＤＧＦＸ核酸の量を、コントロールサンプル中のＨＤＧＦＸ核酸の
量と比較する。コントロールサンプル中のＨＤＧＦＸの量と比較した、サンプル
中のＨＤＧＦＸ核酸の量の変化は、この被験体が組織増殖関連障害を有すること
を示す。
【００１７】 なおさらなる局面において、本発明は、組織増殖関連障害を処置または予防ま
たは遅延する方法を提供する。この方法は、このような処置または予防または遅
延が所望される被験体に、ＨＤＧＦＸ核酸、ＨＤＧＦＸポリペプチドまたはＨＤ
ＧＦＸ抗体を、その被験体における組織増殖関連障害を処置、予防または遅延す
るのに十分な量で投与する工程を包含する。
【００１８】 他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用
語は、本発明が属する分野の当業者に通常理解される意味と同じ意味を有する。
本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価な方法および材料が、
本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料を以下
に記載する。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の
参考文献は、参考としてそれらの全体が援用される。矛盾する場合は、本明細書
（定義を含む）が優先する（ｃｏｎｔｒｏｌ）。さらに、材料、方法、および実
施例は、例示のみであり、そして限定することを意図されない。
【００１９】 本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から
明らかである。
【００２０】 （発明の詳細な説明） ＨＤＧＦＸ（ＡＬ０３３５３９＿Ａとも呼ばれる）、新規ヘパトーム由来増殖
因子（「ＨＤＧＦ」）関連ポリペプチド、およびこのポリペプチドをコードする
核酸が、本発明に含まれる。ＨＤＧＦＸポリペプチドまたはそのフラグメントに
特異的に結合する抗体が、本発明に含まれる。本発明はさらに、ＨＤＧＦＸ核酸
、ポリペプチドおよび抗体の、フラグメント、ホモログ、アナログおよび誘導体
を含む。
【００２１】 ヒトＨＤＧＦＸ遺伝子のＤＮＡ配列（８８０ヌクレオチド；配列番号１）、お
よびそのコードされるアミノ酸配列（配列番号２）を、表１に示す。翻訳された
タンパク質は、ヌクレオチド７９〜８３１にコードされる。ＨＤＧＦＸタンパク
質産物（配列番号２）は、２５１アミノ酸長である。ＨＤＧＦＸポリペプチドの
推定分子量は、２７，２３３．３ダルトンである。配列番号２のタンパク質は、
０．８８００の確実度で核に局在することが、ＰＳＯＲＴソフトウェアプログラ
ムによって予測される。
【００２２】 クローンＨＤＧＦＸ＿Ａによってコードされる本発明のタンパク質としては、
本明細書中に記載のＯＲＦによってコードされるような、開示された全長タンパ
ク質、ならびに翻訳後修飾の結果としてその全長タンパク質から生じる任意の成
熟タンパク質が挙げられる。従って、本発明のタンパク質は、ＨＤＧＦＸ＿Ａタ
ンパク質の前駆体および任意の活性形態の両方を包含する。
【００２３】 ソフトウェアプログラムＰＳＯＲＴおよびＳｉｇｎａｌＰは、ＨＤＧＦＸがシ
グナルペプチドを含まないことを予測する。
【００２４】 （表１） ヘパトーム由来増殖因子ホモログのポリヌクレオチド配列（配列番号１）およ
びアミノ酸配列（配列番号２）
【００２５】
【表１】 ＢＬＡＳＴＰプログラムおよびＢＬＡＳＴＸプログラムを使用する配列データ
ベースの検索は、このＨＤＧＦＸ＿Ａタンパク質産物（配列番号２）が、２３５
残基のウシヘパトーム由来増殖因子関連タンパク質（ＨＲＰ−３）（ＴＲＥＭＢ
ＬＮＥＷ−ＡＣＣ：ＣＡＢ４０３４８）と、２３４残基中１４３残基（６１％）
が同一であり、そして２３４残基中１５５残基（６６％）がポジティブであるこ
とを示す。アライメント結果を表２に示す。
【００２６】 （表２：ＨＤＧＦＸ 対 ＨＲＰ−３を示すＢＬＡＳＴ結果） （Ｏｕｅｒｙ（問い合わせ）＝ＨＤＧＦＸ；Ｓｂｊｃｔ（対照）＝ＨＲＰ−３
（配列番号３））
【００２７】
【表２】 ＨＤＧＦＸタンパク質産物（配列番号２）はまた、２４０残基のヒトヘパトー
ム由来増殖因子（ＨＤＧＦ）タンパク質（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｐ５１
８５８）と、２２８残基中１３５残基（５９％）が同一であり、そして２２８残
基中１５６残基（６８％）がポジティブであると見い出された。アライメント結
果を表３、セクションＡおよびＢに示す。
【００２８】 （表３：ＨＤＧＦＸ 対 ＨＤＧＦを示すＢＬＡＳＴ結果）
【００２９】
【表３】 ＰＲＯＤＯＭデータベースの検索（０．０００００１のＥ値カットオフ）は、
ＨＤＧＦＸポリペプチド配列が、増殖因子のファミリーに相同であることを示し
た（表４、黒色の陰影は同一性を示し、灰色の陰影は保存的置換を示す）。表４
のファミリーメンバー間の相同性の長さおよび複雑性では、これらの配列間の保
存が偶然にのみ生じるという可能性は７ｅ-27未満である。Ａｌｔｓｃｈｕｌら
、１９９７ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２を参照
のこと。相同であると見い出されたタンパク質としては、マウスＨＤＧＦ（配列
番号６）（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：Ｐ５１８５９）のアミノ酸１０〜１１７、別
のマウスＨＤＧＦＲＰ２（配列番号７）（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：０３５５４０
）のアミノ酸１〜１２３、ヒトＬＥＤＧＦ（配列番号８）（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯ
Ｔ：Ｏ７５４７５）のアミノ酸１〜１２７、別のヒトＬＥＤＧＦ（配列番号９）
（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：Ｏ７５４７５）のアミノ酸１〜１２７、およびマウス
ＨＤＧＦＲＰ１（配列番号１０）（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：０３５５３９）のア
ミノ酸９〜１１７が挙げられる。
【００３０】
【表４】 本発明に従うＨＤＧＦＸ核酸およびそのコードされるポリペプチドは、種々の
適用および状況下で有用である。例えば、ＨＤＧＦＸの核酸およびポリペプチド
は、ヘパトーム由来増殖因子ファミリーのメンバーであるタンパク質を同定する
ために使用され得る。ＨＤＧＦＸの核酸およびポリペプチドはまた、ＨＤＧＦの
活性または機能を阻害または増強する分子についてスクリーニングするために使
用され得る。詳細には、本発明に従う核酸およびポリペプチドは、例えば、脈管
形成、ニューロン発生または精子形成を調節または阻害する小分子の同定のため
の標的として使用され得る。これらの分子は、哺乳動物（例えば、ヒト）におけ
る癌、神経学的障害または不妊症を処置するために使用され得る。
【００３１】 さらに、本発明に従う種々のＨＤＧＦＸの核酸およびポリペプチドは、ドメイ
ンの存在および先に記載のタンパク質に対する配列関連性に従って、とりわけ、
このタンパク質ファミリーの新規メンバーとして有用である。例えば、このＨＤ
ＧＦＸ核酸およびそれらのコードされるポリペプチドは、ヘパトーム由来増殖因
子に属するタンパク質に特徴的な構造モチーフを含む。このタンパク質ファミリ
ーに属するタンパク質は、脈管形成の調節および阻害に関連してきた。脈管形成
は、胚形成、創傷治癒および女性の生殖サイクルにおける重要な通常の生理学的
プロセスである。しかし、病理学的プロセスとして、これは、慢性炎症、線維増
殖（ｆｉｂｒｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）障害および腫瘍形成において中心
的役割を果たす。従って、本発明に従うＨＤＧＦＸの核酸およびポリペプチド、
抗体および関連する化合物は、種々の癌、冠状動脈疾患、関節炎および糖尿病性
網膜症に関連する治療的適用において有用である。
【００３２】 免疫蛍光データは、ＨＤＧＦが、ヘパトーム細胞の細胞質に局在し、そして正
常組織および腫瘍細胞株において遍在的に発現されることを示す。例えば、Ｎａ
ｋａｍｕｒａら、１９９４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５１４３−２
５１４９を参照のこと。従って、代替的実施形態において、ＨＤＧＦＸ（本発明
に従うヒトヘパトーム由来増殖因子ホモログを含む）は、合成シグナルペプチド
を有するサイトゾルタンパク質であり得る。Ｎａｋａｍｕｒａらは、ＨＤＧＦが
、推定核局在シグナルが存在するにも関わらず、線維芽細胞の外側で機能する線
維芽細胞に対するマイトジェン活性を有する、おそらく新規なヘパリン結合タン
パク質であることを示唆する。従って、別の実施形態において、ＨＤＧＦＸは、
ヒトの体内の種々の細胞および組織が応答する新規増殖調節因子として作用し得
る（実施例８を参照のこと）。
【００３３】 さらに、本発明のＨＤＧＦＸの核酸、ポリペプチド、抗体および関連する化合
物は、精子形成を調節するため、平滑筋増殖を刺激するため、およびニューロン
発生を調節するために使用され得る。
【００３４】 精製されたＨＤＧＦＸタンパク質でのインビボ研究（以下の実施例７に示され
るような）は、脾性の髄外造血およびリンパ系過形成の増加を実証する。これは
、例えば、造血および免疫学的関連障害を調節する（例えば、免疫系を刺激する
ことによって）ことによる、血液関連障害の処置における本発明のＨＤＧＦＸの
核酸、ポリペプチド、抗体および関連する化合物の潜在的な治療的適用および診
断適用を示す。
【００３５】 本発明のＨＤＧＦＸ核酸およびポリペプチドについてのさらなる有用性を、本
明細書中に開示する。
【００３６】 （ＨＤＧＦＸ核酸） 本発明の新規核酸は、ＨＤＧＦＸ、ＨＤＧＦＸ様ポリペプチドまたは生物学的
に活性なそれらの部分をコードする核酸を含む。これらの核酸には、配列が配列
番号１に提供される核酸、またはそれらのフラグメント、誘導体もしくはホモロ
グがある。さらに、本発明は、配列番号１の変異体核酸もしくは改変体核酸、ま
たはそれらのフラグメントを含み、これらの塩基のいずれかは、そのＨＤＧＦＸ
様活性および生理学的機能を保持するタンパク質をなおコードしつつ、配列番号
１に示される対応する塩基から変更され得る。本発明はさらに、配列番号１の核
酸配列の相補体（そのフラグメント、誘導体、アナログおよびホモログを含む）
を含む。ＨＤＧＦＸの部分の相補鎖の例は、実施例の節においてオリゴヌクレオ
チドプライマーとして示される。本発明はさらに、核酸もしくは核酸フラグメン
ト、またはその相補体（これらの構造は化学修飾を含む）を含む。
【００３７】 さらなる核酸は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＤＧＦＸポリペプチドを
コードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列を
有するポリペプチドをコードする核酸は、配列番号１の核酸配列またはそのフラ
グメントを含む。
【００３８】 さらに、本発明のＨＤＧＦＸ核酸は、配列番号１の変異体核酸もしくは改変体
核酸、またはそのフラグメントを含み、これらの塩基のいずれかは、ＨＤＧＦＸ
様活性および生理学的な機能を維持するタンパク質をなおコードしつつ、開示さ
れた配列から変更され得る。本発明はさらに、配列番号１の核酸配列の相補体（
そのフラグメント、誘導体、アナログおよびホモログを含む）をさらに含む。本
発明はさらに、核酸もしくは核酸フラグメント、またはその相補体（これらの構
造は化学修飾を含む）を含む。
【００３９】 本発明のＨＤＧＦＸ核酸は、ＨＤＧＦＸポリペプチドの成熟形態をコードし得
る。本明細書中で使用される場合、ポリペプチドの「成熟」形態またはタンパク
質は、天然に存在するポリペプチドまたは前駆体形態またはプロプロテイン（ｐ
ｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）の生成をいう。天然に存在するポリペプチドまたは前駆体
形態またはプロプロテインとしては、非限定的な例の目的のみとして、対応する
遺伝子によりコードされる全長遺伝子産物が挙げられる。あるいは、これらは、
本明細書中に開示されるオープンリーディングフレームによりコードされるポリ
ペプチド、前駆体またはプロプロテインとして規定され得る。生成物「成熟」形
態は、また非限定的な例の目的として、１以上の天然に存在するプロセシング工
程（これらがこの遺伝子産物が生じる細胞または宿主細胞内で起こる場合）の結
果として生じる。ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態に至るこのよう
なプロセシング工程の例としては、オープンリーディングフレームの開始コドン
によりコードされるＮ末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドまた
はリーダー配列のタンパク質分解切断が挙げられる。従って、残基１〜Ｎ（残基
１がＮ末端メチオニンである場合）を有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク
質から生じる成熟形態は、Ｎ末端メチオニンの除去後に残基２〜Ｎを有する。あ
るいは、残基１〜Ｎ（ここで、Ｎ末端シグナル配列（残基１〜Ｍ）が切断される
）を有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態は、残りの
残基Ｍ＋１〜残基Ｎを有する。さらに、「成熟」タンパク質またはフラグメント
は、開始メチオニンの除去またはシグナルペプチドの除去よりも切断事象により
生じ得る。さらに、本明細書中で使用される場合、ポリペプチドまたはタンパク
質の「成熟」形態は、タンパク質分解事象ではなく、翻訳後修飾の工程から生じ
得る。このようなさらなるプロセスとしては、非限定的な例として、グリコシル
化、ミリスチル化またはリン酸化が挙げられる。一般に、成熟ポリペプチドまた
はタンパク質は、これらのプロセスの１つのみまたはこれらの任意の組み合わせ
の操作から生じ得る。
【００４０】 ＨＤＧＦＸポリペプチドをコードする核酸（例えば、配列番号２をコードする
ＨＤＧＦＸ ｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとし
ての使用について十分な核酸フラグメント、およびＨＤＧＦＸ核酸分子の増幅ま
たは変異のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとしての使用のた
めのフラグメントもまた含まれる。本明細書中で使用される場合、用語「核酸分
子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例
えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを使用して作成されるＤＮＡまたはＲ
ＮＡのアナログ、ならびにそれらの誘導体、フラグメントおよびホモログを含む
ことを意図する。核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本
鎖ＤＮＡである。
【００４１】 「プローブ」とは、種々の長さの核酸配列をいい、好ましくは、用途に依存し
て、少なくとも約１０ヌクレオチド（ｎｔ）、２０ｎｔ、３０ｎｔ、５０ｎｔ、
１００ｎｔ、５００ｎｔ、１０００ｎｔ、または例えば、約６，０００ｎｔほど
の大きさの間である。プローブは、同一、類似または相補的な核酸配列の検出に
おいて使用される。より長いプローブは、通常、天然供給源または組換え供給源
から入手され（しかし、これらは、同様に化学合成により調製され得る）、非常
に特異的であり、そしてオリゴマーよりもはるかに遅くハイブリダイズする。プ
ローブは、一本鎖または二本鎖であり得、そしてＰＣＲ、メンブレンベースのハ
イブリダイゼーション技術またはＥＬＩＳＡのような技術において特異性を有す
るように設計される。
【００４２】 「単離された」核酸分子は、この核酸の天然の供給源中に存在するその他の核
酸分子とは異なるものである。単離された核酸分子の例としては、ベクター中に
含まれる組換えＤＮＡ分子、異種宿主細胞中に維持される組換えＤＮＡ分子、部
分的または実質的に精製された核酸分子、および合成ＤＮＡまたはＲＮＡ分子が
挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、「単離された」核酸は、こ
の核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中でこの核酸に天然に隣接する配列（すな
わち、この核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。例えば
、種々の実施形態で、単離されたＨＤＧＦＸ核酸分子は、この核酸が由来する細
胞のゲノムＤＮＡ中でこの核酸に天然で隣接する、約５０ｋｂ、２５ｋｂ、５ｋ
ｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌ
クレオチド配列を含み得る。さらに、「単離された」核酸分子、例えば、ｃＤＮ
Ａ分子は、組換え技術により産生される場合、その他の細胞物質または培養培地
を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合、化学物質前駆体もしく
はその他の化学物質を実質的に含まないものであり得る。
【００４３】 本発明の核酸分子、例えば、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子
、またはこれらのヌクレオチド配列の任意の相補体は、標準的な分子生物学的技
法および本明細書で提供される配列情報を用いて単離され得る。ハイブリダイゼ
ーションプローブとして、配列番号１の核酸の全部または一部を使用して、ＨＤ
ＧＦＸ核酸配列は、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術（
例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ
ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＹ ＭＡＮＵＡＬ第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌら、（編）、ＣＵＲＲＥＮ
Ｔ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈ
ｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３に記載されるよ
うに）を用いて単離され得る。
【００４４】 本発明の核酸は、標準的なＰＣＲ増幅技法に従って、テンプレートとしてｃＤ
ＮＡ、ｍＲＮＡあるいはゲノムＤＮＡ、および適切なオリゴヌクレオチドプライ
マーを用いて増幅され得る。このように増幅された核酸は、適切なベクター中に
クローン化され、そしてＤＮＡ配列分析により特徴付けられ得る。さらに、ＨＤ
ＧＦＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術、
例えば、自動化ＤＮＡ合成機を用いることにより調製され得る。
【００４５】 本明細書で用いられる場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、一連の連結され
たヌクレオチド残基をいい、このオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応で用いられ
るに十分な数のヌクレオチド塩基を有する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲ
ノム配列もしくはｃＤＮＡ配列に基づき得るか、またはそれから設計され得、そ
して特定の細胞もしくは組織において、同一、類似もしくは相補的ＤＮＡまたは
ＲＮＡを増幅し、確認し、もしくはその存在を示すために用いられる。オリゴヌ
クレオチドは、約１０ｎｔ、５０ｎｔ、または１００ｎｔの長さ、好ましくは約
１５ｎｔ〜３０ｎｔの長さを有する核酸配列の部分を含む。１つの実施形態では
、１００ｎｔより少ない長さの核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、さらに、
配列番号１の少なくとも６個連続するヌクレオチド、またはその相補体を含む。
オリゴヌクレオチドは、化学的に合成され得、そしてプローブとして用いられ得
る。
【００４６】 別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１のいずれかに
示されるヌクレオチド配列またはこのヌクレオチド配列の一部分の相補体である
核酸分子を含む。別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号
１のいずれかに示されるヌクレオチド配列の相補体である核酸分子またはそのヌ
クレオチド配列の一部を含む。配列番号１に示されるヌクレオチド配列に相補的
である核酸分子は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に十分相補的である
核酸分子であり、配列番号１に示される核酸配列に対しミスマッチがほとんどま
たは全くなく水素結合し得、それによって安定な二本鎖を形成する。
【００４７】 本明細書で用いる場合、用語「相補的」は、核酸分子のヌクレオチド単位間の
Ｗａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成をいい、そして
用語「結合」は、２つのポリペプチドまたは化合物または関連ポリペプチドまた
は化合物またはその組合せ間の物理的または化学的相互作用を意味する。結合は
、イオン性、非イオン性、ファンデルワールス性、疎水性相互作用などを含む。
物理的相互作用は直接的であるかまたは間接的であり得る。間接的相互作用は、
別のポリペプチドまたは化合物を介するか、またはその効果に起因し得る。直接
的結合は、別のポリペプチドもしくは化合物を介して、またはその効果に起因し
て生じない、その他の実質的な化学的中間体がない相互作用をいう。
【００４８】 さらに、本発明の核酸分子は、配列番号１の核酸配列の一部のみ（例えば、プ
ローブまたはプライマーとして使用され得るフラグメント、あるいはＨＤＧＦＸ
の生物学的に活性な部分をコードするフラグメント）を含み得る。本明細書中に
提供される「フラグメント」は、少なくとも６個の（連続する）核酸配列または
少なくとも４個の（連続する）アミノ酸配列（それぞれ、核酸の場合には、特異
的ハイブリダイゼーションを可能にし、またはアミノ酸の場合には、エピトープ
の特異的な認識を可能にするに十分な長さ）の配列として規定され、そして全長
配列未満のせいぜいいくらかの部分である。フラグメントは、選択された核酸配
列またはアミノ酸配列の任意の連続する部分に由来し得る。「誘導体」は、直接
的にかまたは改変もしくは部分的置換によってかのいずれかでネイティブな化合
物から形成される核酸配列またはアミノ酸配列である。「アナログ」は、ネイテ
ィブな化合物に類似する構造を有する（しかし、同一ではない）が、特定の成分
または側鎖に関してそれとは異なる核酸配列またはアミノ酸配列である。アナロ
グは、合成物であり得るか、または進化的に異なる起源に由来し得、そして野生
型と比較して、類似の代謝活性または反対の代謝活性を有し得る。
【００４９】 誘導体およびアナログは、以下に記載のように、誘導体またはアナログが、修
飾された核酸またはアミノ酸を含む場合、全長、または全長以外のものであり得
る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体またはアナログとしては、種々の実
施形態において、同一の大きさの核酸またはアミノ酸配列にわたって、または整
列した配列に比較した場合（この整列は、当該分野で公知であるコンピューター
相同性プログラムによって実施される）、少なくとも約７０％、８０％、８５％
、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％もの同一性（好ましい同一性は、８
０〜９９％）で、本発明の核酸もしくはタンパク質に実質的に相同であるか、あ
るいはそのコードする核酸がストリンジェントの、中程度にストリンジェントの
、または低いストリンジェントの条件下で上記のタンパク質をコードする配列の
相補体にハイブリダイズし得る、領域を含む分子が挙げられるが、これらに限定
されない。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ
ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏ
ｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３、および以下を参照のこと。例示的な
プログラムは、Ｇａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａ
ｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ ＵＮＩＸ（登
録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）（デフォルト設
定を使用、これは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ
．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、１９８１、２：４８２−４８９、これらは、その全体
が参考として本明細書中に援用される）を使用する）である。
【００５０】 「相同な核酸配列」もしくは「相同なアミノ酸配列」、またはその改変体とは
、上記で考察したように、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルにおける相
同性によって特徴付けられる配列をいう。相同なヌクレオチド配列は、ＨＤＧＦ
Ｘポリペプチドのアイソフォームをコードする配列をコードする。アイソフォー
ムは、例えば、ＲＮＡの選択的スプライシングの結果として、同一の生物の異な
る組織において発現され得る。あるいは、アイソフォームは、異なる遺伝子によ
ってコードされ得る。本発明において、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の
種（哺乳動物が挙げられるが、これに限定されず、従って、例えば、マウス、ラ
ット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよび他の生物が挙げられ得る）のＨＤ
ＧＦＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。相同なヌクレオチド
配列はまた、天然に生じる対立遺伝子改変体および本明細書に記載されるヌクレ
オチド配列の変異体が挙げられるが、これらに限定されない。しかし、相同的ヌ
クレオチド配列は、ヒトＨＤＧＦＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列を
含まない。相同核酸配列は、配列番号２のいずれかの保存的アミノ酸置換（以下
を参照のこと）、およびＨＤＧＦＸ活性を有するポリペプチドをコードするこれ
らの核酸配列を含む。ＨＤＧＦＸタンパク質の生物学的活性は以下に記載されて
いる。
【００５１】 本明細書中で使用される場合、「同一な」残基は、等価なヌクレオチド塩基ま
たは２つの配列のアラインメントにおけるアミノ酸残基が同じ残基である２つの
配列間の比較におけるこれらの残基に対応する。１つのアラインメント中の２つ
の配列間の比較が、比較における等価な位置における残基が、以下に規定される
同じアミノ酸または保存されたアミノ酸のいずれかであることを示す場合に、残
基は、「類似」または「ポジティブ」として代替的に記載される。
【００５２】 ヒトＨＤＧＦＸ遺伝子のクローニングから決定されたヌクレオチド配列は、他
の細胞型（例えば、他の組織由来）におけるＨＤＧＦＸホモログ、ならびに他の
哺乳動物由来のＨＤＧＦＸホモログを同定および／またはクローニングする際の
使用のために設計されるプローブおよびプライマーの作製を可能にする。このプ
ローブ／プライマーは、代表的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを
含む。このオリゴヌクレオチドは、代表的には、配列番号１；または配列番号１
のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；あるいは配列番号１の天然に存在する変異
体の少なくとも約１２個、約２５個、約５０個、約１００個、約１５０個、約２
００個、約２５０個、約３００個、約３５０個または約４００個以上の連続する
センス鎖ヌクレオチド配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする
ヌクレオチド配列の領域を含む。
【００５３】 ヒトＨＤＧＦＸヌクレオチド配列に基づくプローブは、同じまたは相同なタン
パク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出するために使用され得る。種
々の実施形態において、このプローブはさらに、プローブに付着した標識基を含
み、例えば、この標識基は放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子
であり得る。このようなプローブは、例えば、被験体由来の細胞のサンプル中の
ＨＤＧＦＸをコードする核酸のレベルを測定すること（例えば、ＨＤＧＦＸ ｍ
ＲＮＡレベルを検出すること、またはゲノムＨＤＧＦＸ遺伝子が変異しているか
または欠失しているか否かを決定すること）によって、ＨＤＧＦＸタンパク質を
誤って発現する細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として使
用され得る。
【００５４】 「ＨＤＧＦＸの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」は、本発明のポ
リペプチドの活性に類似するが必ずしも同一ではない活性を示すポリペプチドを
いい、用量依存性の有無に関わらず、特定の生物学的アッセイにおいて測定され
るような成熟形態を含む。「ＨＤＧＦＸポリペプチドの生物学的に活性な部分」
をコードする核酸フラグメントは、以下に記載されるようなＨＤＧＦＸの生物学
的活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号１の一部を単離し、ＨＤＧ
ＦＸタンパク質のコードされた部分を発現させ（例えば、インビトロでの組換え
発現によって）、そしてＨＤＧＦＸのコードされた部分の活性を評価することに
よって調製され得る。
【００５５】 （ＨＤＧＦＸの改変体） 本発明はさらに、遺伝コードの縮重に起因して、開示されるＨＤＧＦＸヌクレ
オチド配列とは異なる核酸分子を包含する。従って、これらの核酸は、配列番号
１に示されるヌクレオチド配列によりコードされるのと同じＨＤＧＦＸタンパク
質をコードする。別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列
番号２のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌク
レオチド配列を有する。
【００５６】 配列番号１のいずれかに示されるヒトＨＤＧＦＸヌクレオチド配列に加えて、
ＨＤＧＦＸのアミノ酸配列における変化に至るＤＮＡ配列多型は、集団（例えば
、ヒト集団）内に存在し得ることが、当業者によって理解される。ＨＤＧＦＸ遺
伝子中のこのような遺伝的多型は、天然の対立遺伝子のバリエーションに起因し
て、集団内の個体間に存在し得る。本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子
」および「組換え遺伝子」は、ＨＤＧＦＸタンパク質、好ましくは哺乳動物のＨ
ＤＧＦＸタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子
をいう。このような天然の対立遺伝子のバリエーションは、代表的には、ＨＤＧ
ＦＸ遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％の変動性を生じる。天然の対立
遺伝子バリエーションの結果であり、そしてＨＤＧＦＸの機能的活性を変化させ
ない、ＨＤＧＦＸ内の任意および全てのこのようなヌクレオチドのバリエーショ
ンならびに得られるアミノ酸多型は、本発明の範囲内であることが意図される。
【００５７】 さらに、他の種由来のＨＤＧＦＸタンパク質をコードし、従って、配列番号１
のヒト配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内に
あることが意図される。本発明のＨＤＧＦＸのｃＤＮＡの天然の対立遺伝子改変
体およびホモログに対応する核酸分子は、本明細書中に開示されるヒトＨＤＧＦ
Ｘ核酸に対するその相同性に基づいて、ストリンジェントハイブリダイゼーショ
ン条件下で、標準的なハイブリダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーショ
ンプローブとしてヒトｃＤＮＡまたはその一部を用いて単離され得る。
【００５８】 別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも６ヌクレオチ
ド長であり、そしてストリンジェントな条件下で配列番号１のヌクレオチド配列
を含む核酸分子にハイブリダイズする。別の実施形態では、この核酸は、少なく
とも１０、２５、５０、１００、２５０、５００または７５０ヌクレオチド長で
ある。別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、コード領域にハイブ
リダイズする。本明細書中で用いられる場合、用語「ストリンジェント条件下で
ハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する条件を記
載することを意図し、この条件下では、互いに最小の程度の類似性を超えるヌク
レオチド配列が代表的には互いにハイブリダイズしたままである。例えば、課さ
れたストリンジェンシーの程度に依存して、互いに少なくとも約６０％相同なヌ
クレオチド配列がハイブリダイズし得る。
【００５９】 本明細書で用いられる場合、語句「ストリンジェントハイブリダイゼーション
条件」は、その条件下で、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが、
その標的配列にハイブリダイズするが、その他の配列に最適にはハイブリダイズ
しない；より一般的にはプローブに対する特定の程度の類似性未満の配列にハイ
ブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そ
して異なる状況において異なる。より長い配列は、より短い配列より高い温度で
特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定された
イオン強度およびｐＨで、特定の配列についての熱融解点（Ｔm）より約５℃低
く選択される。このＴmは、標的配列に相補的なプローブの５０％が、平衡状態
で標的配列にハイブリダイズする（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度
下）温度である。標的配列は一般に過剰に存在するので、Ｔmでは、プローブの
５０％が平衡状態で占有されている。代表的には、ストリンジェントな条件は、
ｐＨ７．０〜８．３で、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオン未満、代表的には
約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン（またはその他の塩）、そして温度は、
短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、１０ｎｔ〜５０
ｎｔ）については少なくとも約３０℃、そしてより長いプローブ、プライマーお
よびオリゴヌクレオチドについては少なくとも約６０℃であるような条件である
。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような、脱安定化剤の添加で
達成され得る。
【００６０】 上記のような、ストリンジェント条件は、当業者に公知であり、そしてＣＵＲ
ＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６
．３．６に見出され得る。好ましくは、この条件は、互いに少なくとも約６５％
、約７０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％または約９９
％同一な配列が、代表的には互いにハイブリダイズしたままであるような条件で
ある。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６×Ｓ
ＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０
２％ ＰＶＰ、０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ ＢＳＡ、および５００
ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中での６５℃でのハイブリダイ
ゼーションである。このハイブリダイゼーションの後に０．２×ＳＳＣ、０．０
１％ ＢＳＡ中での５０℃での１回以上の洗浄が続く。ストリンジェント条件下
で配列番号１の配列にハイブリダイズする、本発明の単離された核酸分子は、天
然に存在する核酸分子に対応する。本明細書中で使用される場合、「天然に存在
する」核酸分子とは、天然に存在する（例えば、天然のタンパク質をコードする
）ヌクレオチド配列を有する、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子をいう。
【００６１】 ホモログ（すなわち、ヒト以外の種由来のＨＤＧＦＸタンパク質をコードする
核酸）または他の関連配列（例えば、パラログ（ｐａｒａｌｏｇｓ））は、特定
のヒト配列の全てまたは一部をプローブとし、核酸ハイブリダイゼーションおよ
びクローニングに関して当該分野で周知の方法を使用して、低い、中程度の、ま
たは高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションによって入手され得る。
【００６２】 第２の実施形態では、配列番号１またはそれらのフラグメント、アナログもし
くは誘導体のヌクレオチド配列を含む核酸分子に、中程度のストリンジェンシー
条件下でハイブリダイズする核酸配列が提供される。中程度のストリンジェンシ
ーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、５５℃での６×ＳＳＣ、５×
デンハルト溶液、０．５％ ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ
中でのハイブリダイゼーション、続いて１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中での３
７℃での１回以上の洗浄である。用いられ得る他の中程度のストリンジェンシー
の条件は、当該分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３
，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬ
ＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹおよびＫｒｉｅｇｌｅｒ，
１９９０，ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＡＮＤ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ
ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを
参照のこと。
【００６３】 第３の実施形態では、配列番号１、またはそれらのフラグメント、アナログも
しくは誘導体のヌクレオチド配列を含む核酸分子に、低ストリンジェンシー条件
下でハイブリダイズする核酸が提供される。低ストリンジェンシーハイブリダイ
ゼーション条件の非限定的な例は、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ ＰＶＰ
、０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ
精子ＤＮＡ、１０％（重量／容量）デキストラン硫酸中での４０℃でのハイブリ
ダイゼーション、続いて２×ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４
）、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１％ ＳＤＳ中での５０℃での１回以上の洗浄
である。用いられ得る他の低ストリンジェンシーの条件は、当該分野で周知であ
る（例えば、種交差ハイブリダイゼーションについて用いられるように）。例え
ば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ
ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓ
ｏｎｓ，ＮＹならびにＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥ
Ｒ ＡＮＤ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ
，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ，
１９８１，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７８：６７８９−
６７９２を参照のこと。
【００６４】 （保存的変異） 集団中に存在し得るＨＤＧＦＸヌクレオチド配列（例えば、遺伝子配列）の天
然に存在する対立遺伝子改変体に加えて、当業者は、変異によって配列番号１の
ヌクレオチド配列に変化が導入され得、それによって、ＨＤＧＦＸタンパク質の
機能的能力を変更することなく、コードされるＨＤＧＦＸタンパク質のアミノ酸
配列における変化がもたらされることをさらに理解する。例えば、「非必須」ア
ミノ酸残基にてアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換は、配列番号１の配列
において行われ得る。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を有意に変更す
ることなく、ＨＤＧＦＸポリペプチドの野生型配列由来の変更され得る配列中の
位置における残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要
とされる。例えば、本発明のＨＤＧＦＸがメンバーであるＨＤＧＦＸタンパク質
のファミリーのメンバー間で保存されているアミノ酸残基は、特に変更を受け入
れられないと予測される。
【００６５】 例えば、本発明に従うＨＤＧＦＸタンパク質は、代表的にはＨＤＧＦＸタンパ
ク質ファミリーメンバーにおける保存領域である、少なくとも１つのドメインを
含み得る。このように、これらの保存されたドメインは、変異を受け入れそうに
ない。しかし、他のアミノ酸残基（例えば、ＨＤＧＦＸタンパク質ファミリーの
メンバー間であまり保存されていないアミノ酸残基）は、活性について必須では
ないかもしれず、従ってより変更を受け入れる傾向が強い。
【００６６】 本発明の別の局面は、活性に必須ではない配列番号２のアミノ酸配列に関する
アミノ酸残基における変化を含む、ＨＤＧＦＸタンパク質をコードする核酸分子
に関する。１つの実施形態では、単離された核酸分子は、タンパク質をコードす
るヌクレオチド配列を含み、ここで、このタンパク質は、配列番号２のアミノ酸
配列に少なくとも約７５％の類似しているアミノ酸配列を含む。好ましくは、こ
の核酸によってコードされるタンパク質は、配列番号２に少なくとも約８０％同
一であり、より好ましくは配列番号２に少なくとも約９０％、９５％、９８％、
そして最も好ましくは少なくとも約９９％同一である。
【００６７】 配列番号２のタンパク質に相同なタンパク質をコードする単離された核酸分子
は、対応するヌクレオチド配列に１以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失
を導入することにより作製され得、その結果、１以上のアミノ酸の置換，付加ま
たは欠失が、コードされるタンパク質に導入される。
【００６８】 変異は、標準技術（例えば、部位指向変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）に
よって配列番号１に導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、１以上
の推定非必須アミノ酸残基にて作製される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ
酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される、アミノ酸置換である。
類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で規定されている。
特定のアミノ酸残基は、１以上の分類可能な特徴を有する側鎖を有する。これら
のファミリーとしては、以下が挙げられる：塩基性側鎖を有するアミノ酸（例え
ば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、
アルパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、
グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システ
イン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、
イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、
β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）お
よび芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリ
プトファン、ヒスチジン）。従って、ＨＤＧＦＸポリペプチド中の推定非必須ア
ミノ酸残基は、同じ側鎖のファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。あ
るいは、別の実施形態では、変異は、ＨＤＧＦＸコード配列の全てまたは一部に
沿って（例えば、飽和変異誘発によって）ランダムに導入され得、そして得られ
る変異は、ＨＤＧＦＸポリペプチドの生物学的活性についてスクリーニングされ
て、活性を維持する変異体を同定し得る。配列番号１の変異誘発に続いて、コー
ドされるタンパク質は、当該分野で公知の任意の組換え技術によって発現され得
、そしてこのタンパク質の活性が決定され得る。
【００６９】 アミノ酸ファミリーの関連性はまた、側鎖に基づいて決定され得る。置換され
たアミノ酸は、完全に保存された「強い」残基または完全に保存された「弱い」
残基であり得る。保存されたアミノ酸残基の「強い」群は、以下の群のいずれか
であり得る：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、Ｍ
ＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷ（ここで、単一の文字のアミノ酸コードは、互いに置換さ
れ得るこれらのアミノ酸残基によりグループ化される）。同様に、保存された残
基の「弱い」群は、以下のいずれかで有り得る：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴ
ＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＶＬ
ＩＭ、ＨＦＹ。
【００７０】 （アンチセンスＨＤＧＦＸ核酸） 本発明の別の局面は、ＨＤＧＦＸ核酸にハイブリダイズ可能かまたは相補的で
る単離された単離されたアンチセンス核酸分子（例えば、配列番号１またはその
フラグメント、アナログもしくは誘導体のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハ
イブリダイズし得るかまたは相補的であり得る、単離されたアンチセンス核酸分
子）に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核
酸に相補的である（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるかま
たはｍＲＮＡ配列に相補的である）ヌクレオチド配列を含む。特定の局面では、
少なくとも約１０、２５、５０、１００、２５０もしくは５００ヌクレオチドま
たはＨＤＧＦＸコード鎖全体、またはそれらの一部のみに相補的な配列を含む、
アンチセンス核酸分子が提供される。配列番号２のＨＤＧＦＸタンパク質のフラ
グメント、ホモログ、誘導体およびアナログをコードする核酸分子、または配列
番号１のＨＤＧＦＸの核酸配列に相補的なアンチセンス核酸がさらに提供される
。
【００７１】 １つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＨＤＧＦＸポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスで
ある。用語「コード領域」とは、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含む、ヌク
レオチド配列の領域（例えば、配列２のいずれかに対応するＨＤＧＦＸポリペプ
チドのタンパク質コード領域）をいう。別の実施形態では、このアンチセンス核
酸分子は、ＨＤＧＦＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の
「非コード領域」に対してアンチセンスである。用語「非コード領域」とは、コ
ード領域に隣接する、アミノ酸に翻訳されない、５’配列および３’配列をいう
（すなわち、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域ともいわれる）。
【００７２】 本明細書中に開示されるＨＤＧＦＸコード鎖配列（例えば、配列番号１）を考
慮すれば、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋまたは
Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎの塩基対合の規則に従って設計され得る。アンチセンス核酸
分子は、ＨＤＧＦＸ ｍＲＮＡのコード領域全体に相補的であり得る。あるいは
、アンチセンス核酸分子は、ＨＤＧＦＸ ｍＲＮＡのコード領域または非コード
領域の一部にのみアンチセンスであるオリゴヌクレオチドであり得る。例えば、
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＨＤＧＦＸ ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周
囲の領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約
５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５または
約５０ヌクレオチド長であり得る。
【００７３】 本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用いて、化学的合成ま
たは酵素連結反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、
アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、またはこ
の分子の生物学的安定性を増大させるように、もしくはアンチセンス核酸とセン
ス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計された
種々に改変されたヌクレオチドを用いて化学的に合成され得る（例えば、ホスホ
ロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが用いられ得る）。
【００７４】 アンチセンス核酸を作製するために用いられ得る改変されたヌクレオチドの例
としては以下が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−
クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセ
チルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシ
メチルアミノメチル２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラ
シル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン（ｇａｌａｃｔｏｓ
ｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチ
ルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデ
ニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−
アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキ
シアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン（ｍａｎｎ
ｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−
メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル
−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン（
ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−
チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ
酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオ
ウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（
ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。あるいは、このアンチセンス核
酸は、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされた発現ベクターを用いて
生物学的に生成され得る（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、
以下の節にさらに記載される、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である
）。
【００７５】 本発明のアンチセンス核酸分子は、代表的には被験体に投与されるか、または
インサイチュで生成され、その結果それらは、ＨＤＧＦＸタンパク質をコードす
る細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、または
それに結合し、それによってこのタンパク質の発現を阻害する（例えば、転写お
よび／または翻訳を阻害することによって）。ハイブリダイゼーションは、安定
な二重鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によってか、または例えばＤＮＡ
二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんのメジャーグル
ーブ（ｍａｊｏｒ ｇｒｏｏｖｅ）における特異的相互作用を介してであり得る
。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位での直接的
注射が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的
化するように改変され得、次いで全身に投与される。例えば、全身投与のために
、アンチセンス分子は、それらが選択された細胞表面上に発現されたレセプター
または抗原に特異的に結合するように改変され得る。これは、例えば、そのアン
チセンス核酸分子を細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗
体に連結することによる。このアンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に記載
されるベクターを用いて細胞に送達され得る。アンチセンス分子の十分な細胞内
濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ ＩＩプロモータ
ーまたはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれているベクター構築物が
、一般的に好ましい。
【００７６】 なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー
核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイ
ブリッドを形成する。ここで、通常のβ−ユニットとは対照的に、鎖は、互いに
平行に走行する（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ １５：６６２５〜６６４１）。このアンチセンス核酸分子はまた、２
’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５：６１３１〜６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮ
Ａアナログ（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２１５：３２７〜
３３０）を含み得る。
【００７７】 このような改変としては、非制限的な例として、改変塩基、および糖リン酸バ
ックボーンが改変または誘導体化された核酸が挙げられる。これらの改変は、少
なくとも一部は、改変された核酸の化学的安定性を増強するために実施され、そ
の結果、それらは、例えば、被験体での治療的適用におけるアンチセンス結合核
酸として使用され得る。
【００７８】 ＨＤＧＦＸリボザイムが、本発明内にまた存在する。リボザイムは、一本鎖核
酸（例えば、ＨＤＧＦＸ ｍＲＮＡ）を切断し得るリボヌクレアーゼ活性を有す
る触媒性ＲＮＡ分子であり、これらは、その一本鎖核酸に対して相補領域を有す
る。従って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッド型リボザイム（Ｈａｓｅｌｈ
ｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５〜５９
１に記載される））を使用して、ＨＤＧＦＸ ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し
、それによってＨＤＧＦＸ ｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＨＤＧＦＸをコード
する核酸に特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示されるＨＤＧＦＸ核
酸のヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１）に基づいて設計され得る。例え
ば、活性部位のヌクレオチド配列が、ＨＤＧＦＸをコードするｍＲＮＡ内で切断
されるヌクレオチド配列に相補的である、テトラヒメナＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮ
Ａの誘導体が構築され得る。例えば、Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７
１号；およびＣｅｃｈら、米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。ある
いは、ＨＤＧＦＸ ｍＲＮＡを使用して、ＲＮＡ分子のプールから、特異的リボ
ヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択し得る。例えば、Ｂａｒｔｅｌら
（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１〜１４１８を参照のこと。
【００７９】 あるいは、ＨＤＧＦＸ遺伝子発現は、ＨＤＧＦＸ遺伝子の調節領域（例えば、
ＨＤＧＦＸ遺伝子のプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌク
レオチド配列を標的化し、標的細胞中でＨＤＧＦＸ遺伝子の転写を妨害する三重
らせん構造を形成することによって阻害され得る。一般には、Ｈｅｌｅｎｅ．（
１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．６：５６９〜８４；Ｈｅ
ｌｅｎｅら（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７〜３
６；およびＭａｈｅｒ（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４：８０７〜１５を
参照のこと。
【００８０】 種々の実施形態において、ＨＤＧＦＸの核酸は、塩基部分、糖部分またはリン
酸骨格で改変され、例えば、その分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは
可溶性を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を改変して、
ペプチド核酸を生成し得る（Ｈｙｒｕｐら（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ
Ｃｈｅｍ ４：５〜２３を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「
ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格が偽ペプチド
骨格によって置換され、そして４つの天然の核酸塩基のみが保持されている核酸
模倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）をいう。ＰＮＡの中性の骨格は、低いイオン強
度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションを可能
にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、上記のＨｙｒｕｐら（
１９９６）；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９３：１４６７０〜６７５において記載されるよう
な標準的固相ペプチド合成プロトコルを用いて行われ得る。
【００８１】 ＨＤＧＦＸ核酸に基づいたＰＮＡは、治療的適用および診断的適用において使
用され得る。例えば、ＰＮＡは、例えば転写または翻訳の停止を誘導することま
たは複製を阻害することによる、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセ
ンスまたは抗遺伝子剤として使用され得る。ＨＤＧＦＸ核酸に基づいたＰＮＡは
また、例えばＰＮＡ指向性ＰＣＲクランピングによる遺伝子における一塩基対変
異の分析において；他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）と組み合わせて使用
される場合の人工制限酵素として（Ｈｙｒｕｐ Ｂ．（１９９６）上記）；また
はＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのプローブもしくはプライマーとし
て（Ｈｙｒｕｐら（１９９６）上記；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ（１９９６）
、上記）、使用され得る。
【００８２】 さらなる実施形態において、ＨＤＧＦＸ核酸のＰＮＡは、例えば、それらの安
定性または細胞性取り込みを増強するために、ＰＮＡに脂溶性基または他のヘル
パー基を結合することによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、または
リポソームもしくは当該分野において公知の薬物送達の他の技術の使用によって
改変され得る。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組合せ得る、この核
酸のＰＮＡ−ＤＮＡキメラが生成され得る。ＰＮＡ部分が高い結合親和性および
特異性を提供する一方で、そのようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮ
ａｓｅ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用するのを可能に
する。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基のスタッキング、核塩基間の結合数および
方向を考慮して選択される適切な長さのリンカーを使用して連結され得る（Ｈｙ
ｒｕｐ（１９９６）上記）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐ（１９
９６）上記およびＦｉｎｎら（１９９６）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２４
：３３５７〜６３において記載されるように行われ得る。例えば、ＤＮＡ鎖は、
標準的なホスホラミダイトカップリング化学を用いて固体支持体上で合成され得
、そして改変されたヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリ
チル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイト）が、ＰＮＡとＤ
ＮＡの５’末端との間に使用され得る（Ｍａｇら（１９８９）Ｎｕｃｌ Ａｃｉ
ｄ Ｒｅｓ １７：５９７３〜８８）。次いで、ＰＮＡモノマーが段階様式でカ
ップリングされ、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキ
メラ分子を生成する（Ｆｉｎｎら（１９９６）上記）。あるいは、５’ＤＮＡセ
グメントおよび３’ＰＮＡセグメントを用いて、キメラ分子が合成され得る。Ｐ
ｅｔｅｒｓｅｎら（１９７５）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ５
：１１１９〜１１１２４を参照のこと。
【００８３】 他の実施形態において、ＨＤＧＦＸ核酸またはアンチセンス核酸は、以下のよ
うな他の付属の基を含み得る：ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプタ
ーを標的化するため）、または細胞膜を横切る輸送を容易にする因子（例えば、
Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
．Ｓ．Ａ．８６：６５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８〜６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ
８８／０９８１０を参照のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号
ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブ
リダイゼーション誘発切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ ６：９５８〜９７６を参照のこと）、またはインターカレーター
剤（例えば、Ｚｏｎ，１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９を参
照のこと）で改変され得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分
子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリ
ダイゼーション誘発切断剤など）に結合され得る。
【００８４】 （ＨＤＧＦＸポリペプチド） 本発明のＨＤＧＦＸポリペプチドは、その配列が配列番号２に提供される配列
のタンパク質を含む。本発明はまた、ＨＤＧＦＸポリペプチドの成熟形態および
ＨＤＧＦＸポリペプチドの変異体形態または改変体形態を含む。いくつかの実施
形態において、変異体または改変体ＨＤＧＦＸは、表１に示される対応する残基
からいずれかの残基が変化され得るタンパク質を含むが、なおそのＨＤＧＦＸ様
活性および生理学的機能、またはその機能的フラグメントを維持するタンパク質
をコードする。本発明は、上記の改変体ＨＤＧＦＸ核酸によってコードされるペ
プチドを含む。変異体および改変体タンパク質において、２０％までまたはそれ
以上の残基がそのように変化され得る。
【００８５】 一般に、ＨＤＧＦＸ機能を保持するＨＤＧＦＸポリペプチド改変体は、配列中
の特定位置の残基が他のアミノ酸により置換される任意のＨＤＧＦＸポリペプチ
ド改変体を含む。ＨＤＧＦＸ改変体ポリペプチドはまた、親タンパク質の２つの
残基間にさらなる残基を挿入されるＨＤＧＦＸポリペプチド、および照会ＨＤＧ
ＦＸポリペプチド配列（例えば、配列番号２、または配列番号２の成熟形態）か
ら１つ以上の残基を欠失するタンパク質を含む。従って、照会ＨＤＧＦＸポリペ
プチド配列（例えば、配列番号２、または配列番号２の成熟形態）に関する任意
のアミノ酸置換、挿入または欠失が、本発明に包含される。いくつかの実施形態
において、変異体または改変体タンパク質は、照会ＨＤＧＦＸ配列に関して、１
以上の置換、挿入、または欠失を含み得る。
【００８６】 本発明は、単離されたＨＤＧＦＸタンパク質、およびその生物学的に活性な部
分、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログを含む。
抗ＨＤＧＦＸ抗体を惹起するための免疫原としての使用のために適切なポリペプ
チドフラグメントもまた提供される。１つの実施形態において、ネイティブなＨ
ＤＧＦＸタンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を用いる適切な精製スキー
ムによって、細胞または組織供給源から単離され得る。別の実施形態において、
ＨＤＧＦＸタンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって産生される。組換え発現に
代わるものとして、ＨＤＧＦＸタンパク質またはポリペプチドは、標準的なペプ
チド合成技術を用いて化学合成され得る。
【００８７】 「単離された」または「精製された」タンパク質またはその生物学的に活性な
部分は、ＨＤＧＦＸタンパク質の由来する細胞または組織供給源由来の細胞性物
質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学合成される場
合に化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞性物質を実
質的に含まない」は、ＨＤＧＦＸタンパク質の調製物を含み、この調製物におい
て、ＨＤＧＦＸタンパク質が単離または組換え産生される細胞の細胞性成分から
、このタンパク質は分離されている。１つの実施形態において、用語「細胞性物
質を実質的に含まない」は、非ＨＤＧＦＸタンパク質（本明細書中において「夾
雑タンパク質」とも呼ばれる）を約３０％未満（乾燥重量にて）、より好ましく
は非ＨＤＧＦＸタンパク質を約２０％未満、なおより好ましくは非ＨＤＧＦＸタ
ンパク質を約１０％未満、そして最も好ましくは非ＨＤＧＦＸタンパク質を約５
％未満有する、ＨＤＧＦＸタンパク質の調製物を含む。ＨＤＧＦＸタンパク質ま
たはその生物学的に活性な部分が組換え産生される場合、好ましくは、調製物は
また培養培地を実質的に含まない。すなわち、培養培地は、そのタンパク質調製
物の容量の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは
約５％未満を示す。
【００８８】 用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、タンパク質が
、そのタンパク質の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離され
ているＨＤＧＦＸタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態において、用語「
化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、化学前駆体または非Ｈ
ＤＧＦＸの化学物質を約３０％未満（乾燥重量にて）、より好ましくは化学前駆
体または非ＨＤＧＦＸポリペプチドを約２０％未満、なおより好ましくは化学前
駆体または非ＨＤＧＦＸポリペプチドを約１０％未満、そして最も好ましくは化
学前駆体または非ＨＤＧＦＸポリペプチドを約５％未満有する、ＨＤＧＦＸタン
パク質の調製物を含む。
【００８９】 ＨＤＧＦＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＨＤＧＦＸタンパク質
より少ないアミノ酸を含み、そしてＨＤＧＦＸタンパク質の少なくとも１つの活
性を示す、ＨＤＧＦＸタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２に示され
るアミノ酸配列）に十分に相同なアミノ酸配列、またはＨＤＧＦＸタンパク質の
アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。代表的には、生物
学的に活性な部分は、ＨＤＧＦＸタンパク質の少なくとも１つの活性を有するド
メインまたはモチーフを含む。ＨＤＧＦＸタンパク質の生物学的に活性な部分は
、例えば、長さが１０、２５、５０、１００またはそれより多いアミノ酸である
ポリペプチドであり得る。
【００９０】 本発明のＨＤＧＦＸの生物学的に活性な部分は、ＨＤＧＦＸタンパク質ファミ
リー間に保存される上記の同定されたドメインの少なくとも１つを含み得る。さ
らに、タンパク質の他の領域が欠失している他の生物学的に活性な部分は、組換
え技術によって調製され得、そしてネイティブなＨＤＧＦＸタンパク質の機能的
活性のうちの１つ以上について評価され得る。
【００９１】 いくつかの実施形態において、ＨＤＧＦＸタンパク質は、配列番号２に実質的
に相同であり、そして以下に詳細に議論されるように、天然の対立遺伝子改変体
または変異誘発に起因してアミノ酸配列が異なるが、配列番号２のタンパク質の
機能的活性を保持する。従って、別の実施形態において、ＨＤＧＦＸタンパク質
は、配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも約４５％、そしてより好ましくは、
約５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％
または９９％でさえ相同なアミノ酸配列を含み、そして、配列番号２のＨＤＧＦ
Ｘタンパク質の配列を有する対応するポリペプチドのＨＤＧＦＸの機能的活性を
保持するタンパク質である。
【００９２】 （２つ以上の配列間の相同性の決定） ２つのアミノ酸配列または２つの核酸の相同性の百分率を決定するために、配
列は、至適な比較の目的のために整列される（例えば、ギャップは、配列間の最
適な整列について比較される配列のいずれかに導入され得る）。次いで、対応す
るアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドが
比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ
酸残基またはヌクレオチドで占められる場合、分子はその位置で相同である（す
なわち、本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「相同性」は、ア
ミノ酸または核酸の「同一性」と等価である）。
【００９３】 核酸配列の相同性は、２つの配列間の同一性の程度として決定され得る。相同
性は、当該分野において公知のコンピュータープログラム（例えば、ＧＣＧプロ
グラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰソフトウェア）を用いて決定され得
る。ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ １９７０ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ
４８：４４３〜４５３を参照のこと。核酸配列比較のための以下の設定（ＧＡ
Ｐ作製ペナルティー、５．０、およびＧＡＰ伸長ペナルティー、０．３）を用い
てＧＣＧ ＧＡＰソフトウェアを使用すると、上記で言及される類似の核酸配列
のコード領域は、配列番号１に示されるＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード）部分と、
好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８
％、または９９％の同一性の程度を示す。配列同一性の程度を決定するための対
応するソフトウェア手順は、当該分野で広範に公知であり、本文脈において使用
され得る。
【００９４】 用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列
が、特定の比較領域にわたって、残基毎を基準として同一である程度をいう。用
語「配列同一性のパーセンテージ」は、以下により算出される：この比較領域に
わたって最適に整列された２つの配列を比較すること、両方の配列において同一
の核酸塩基（例えば、核酸の場合にはＡ、ＴもしくはＵ、Ｃ、Ｇ、またはＩ）が
存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を導くこと、この一致した位置の
数を、比較領域の内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算するこ
と、およびその結果を１００で乗算して、配列同一性のパーセンテージを導くこ
と。用語「実質的な同一性」は、本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチ
ド配列の特徴を示し、ここでこのポリヌクレオチドは、比較領域にわたり参照配
列と比較して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の
配列同一性、そして頻繁には９０〜９５％の配列同一性、より通常には少なくと
も９９％の配列同一性を有する配列を含む。用語「陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）残
基の百分率」は、以下により算出される：その比較領域にわたって最適に整列さ
れた２つの配列を比較すること、同一のアミノ酸および保存的アミノ酸置換が、
上記のように両方の配列において存在する位置の数を決定し、一致した位置の数
を導くこと、この一致した位置の数を、比較領域中の位置の総数（すなわち、ウ
インドウサイズ）で除算すること、およびその結果を１００で乗算して、陽性残
基の百分率を導くこと。
【００９５】 （キメラＨＤＧＦＸタンパク質および融合ＨＤＧＦＸタンパク質） 本発明はまた、ＨＤＧＦＸキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する
。本明細書中で使用される場合、ＨＤＧＦＸ「キメラタンパク質」またはＨＤＧ
ＦＸ「融合タンパク質」は、非ＨＤＧＦＸポリペプチドに作動可能に連結された
、ＨＤＧＦＸポリペプチドを含む。「ＨＤＧＦＸポリペプチド」は、ＨＤＧＦＸ
ポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはそのフラグ
メント、変異体、もしくは誘導体をいうが、「非ＨＤＧＦＸポリペプチド」は、
ＨＤＧＦＸタンパク質に対して実質的に相同ではないタンパク質（例えば、ＨＤ
ＧＦＸタンパク質とは異なり、かつ同一でかまたは異なる生物体に由来するタン
パク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。従って、ＨＤＧ
ＦＸ融合タンパク質において、このＨＤＧＦＸポリペプチドは、ＨＤＧＦＸタン
パク質のすべてまたは一部分に対応し得る。１つの実施形態では、ＨＤＧＦＸ融
合タンパク質は、ＨＤＧＦＸタンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部
分を含む。別の実施形態では、ＨＤＧＦＸ融合タンパク質は、ＨＤＧＦＸタンパ
ク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質において
、用語「作動可能に連結された」は、ＨＤＧＦＸポリペプチドおよび非ＨＤＧＦ
Ｘポリペプチドが、インフレームで互いに融合されていることを示すことが意図
される。非ＨＤＧＦＸポリペプチドは、ＨＤＧＦＸポリペプチドのＮ末端または
Ｃ末端に融合され得る。
【００９６】 例えば、１つの実施形態では、ＨＤＧＦＸ融合タンパク質は、第２のタンパク
質の細胞外ドメインに作動可能に連結されたＨＤＧＦＸポリペプチドを含む。こ
のような融合タンパク質は、ＨＤＧＦＸ活性を調節する化合物についてのスクリ
ーニングアッセイでさらに利用され得る（このようなアッセイは、以下に詳細に
記載される）。
【００９７】 別の実施形態においては、この融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＨＤＧＦＸ融合タ
ンパク質であり、ここではＨＤＧＦＸ配列が、ＧＳＴ（すなわち、グルタチオン
Ｓ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合される。このような融合タンパク
質は、組換えＨＤＧＦＸの精製を容易にし得る。
【００９８】 さらに別の実施形態において、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル
配列を含むＨＤＧＦＸタンパク質である。例えば、ネイティブなＨＤＧＦＸシグ
ナル配列は除去され得、そして別のタンパク質由来のシグナル配列と置換され得
る。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、ＨＤＧＦＸの発現
および／または分泌は、異種シグナル配列の使用を介して増加され得る。
【００９９】 さらなる実施形態においては、この融合タンパク質は、ＨＤＧＦＸ−免疫グロ
ブリン融合タンパク質であり、ここでは１つ以上のドメインを含むＨＤＧＦＸ配
列が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合さ
れる。本発明のこのＨＤＧＦＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、薬学的組成
物中に取り込まれ、そして被験体に投与されて、細胞の表面上でＨＤＧＦＸリガ
ントとＨＤＧＦＸタンパク質との間の相互作用を阻害し、それによってインビボ
のＨＤＧＦＸ媒介信号伝達を抑制し得る。１つの例においては、意図される本発
明のＨＤＧＦＸリガンドは、ＨＤＧＦＸレセプターである。このＨＤＧＦＸ−免
疫グロブリン融合タンパク質を用い、ＨＤＧＦＸ同族リガンドの生体利用性に影
響を与え得る。ＨＤＧＦＸリガンド／ＨＤＧＦＸ相互作用の阻害は、増殖障害お
よび分化障害の両方の処置、および細胞生存を調節（例えば、促進または阻害）
するために、治療的に有用であり得る。さらに、本発明のこのＨＤＧＦＸ−免疫
グロブリン融合タンパク質は、被験体中で抗ＨＤＧＦＸ抗体を産生するための免
疫原として用いられ得、ＨＤＧＦＸリガンドを精製し、そしてＨＤＧＦＸリガン
ドとのＨＤＧＦＸの相互作用を阻害する分子を同定するスクリーニングアッセイ
で用いられ得る。本発明のＨＤＧＦＸキメラまたは融合タンパク質は、標準的な
組換えＤＮＡ技法により産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコー
ドするＤＮＡフラグメントを、従来の技法に従って、例えば、連結のための平滑
末端または突出（ｓｔａｇｇｅｒ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素
消化、必要に応じて突出（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）末端の充填、所望しない連結を避
けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を使用することによ
り、インフレームで一緒に連結する。別の実施形態では、融合遺伝子を、自動化
ＤＮＡ合成機を含む従来技法により合成し得る。あるいは、遺伝子フラグメント
のＰＣＲ増幅を、キメラ遺伝子配列を生成するために引き続きアニールおよび再
増幅され得る、２つの連続遺伝子フラグメント間の相補的オーバハングを生じる
アンカープライマーを用いて実施し得る（例えば、Ａｕｓｂｅｌら（編）ＣＵＲ
ＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）。さらに、融合成分
（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をすでにコードした多くの発現ベクターが市販
されている。ＨＤＧＦＸをコードする核酸は、この融合部分がＨＤＧＦＸタンパ
ク質にインフレーム連結されるように、このような発現ベクター中にクローン化
され得る。
【０１００】 （ＨＤＧＦＸアゴニストおよびアンタゴニスト） 本発明はまた、ＨＤＧＦＸアゴニスト（模倣物）として、またはＨＤＧＦＸア
ンタゴニストとして機能するＨＤＧＦＸタンパク質の改変体に関する。ＨＤＧＦ
Ｘタンパク質の改変体、例えば、ＨＤＧＦＸタンパク質の離散した点変異または
短縮型が、変異誘発により生成され得る。ＨＤＧＦＸタンパク質のアゴニストは
、天然に存在する形態のＨＤＧＦＸタンパク質と実質的に同じ生物学的活性、ま
たはその生物学的活性のサブセットを保持し得る。ＨＤＧＦＸタンパク質のアン
タゴニストは、天然に存在する形態のＨＤＧＦＸタンパク質の１つ以上の活性を
、例えば、ＨＤＧＦＸタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流また
は上流メンバーに競合的に結合することにより阻害し得る。従って、特異的生物
学的効果が、限られた機能の改変体を用いた処理により惹起され得る。１つの実
施形態では、このタンパク質の天然に存在する形態の生物学活性のサブセットを
有する改変体を用いた被験体の処置は、ＨＤＧＦＸタンパク質の天然に存在する
形態を用いた処置に対して被験体におけるより少ない副作用を有する。
【０１０１】 ＨＤＧＦＸアゴニスト（模倣物）として、またはＨＤＧＦＸアンタゴニストの
いずれかとして機能するＨＤＧＦＸタンパク質の改変体は、ＨＤＧＦＸタンパク
質アゴニストまたはアンタゴニスト活性のためのＨＤＧＦＸタンパク質の変異体
、例えば短縮型変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするこ
とにより同定され得る。１つの実施形態では、ＨＤＧＦＸ改変体の多彩なライブ
ラリーは、核酸レベルのコンビナトリアル変異誘発により生成され、そして多彩
な遺伝子ライブラリーによりコードされる。ＨＤＧＦＸ改変体の多彩なライブラ
リーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、潜在的なＨＤＧＦＸ配列
の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、あるいは、その中にＨＤＧＦＸ配
列のセットを含む（例えば、ファージディスプレイのための）より大きな融合タ
ンパク質のセットとして発現可能であるように、遺伝子配列に酵素的に連結する
ことにより産生され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なＨＤＧＦＸ
改変体のライブラリーを産生するために用いられ得る種々の方法がある。縮重遺
伝子配列の化学的合成は、自動化ＤＮＡ合成機中で実施され得、次いでこの合成
遺伝子は、適切な発現ベクター中に連結される。遺伝子の縮重セットの使用は、
１つの混合物において、潜在的なＨＤＧＦＸ改変体配列の所望のセットをコード
する配列のすべての供給を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法
は当該分野で公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄ
ｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ ５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８
：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １１：４７７
を参照のこと）。
【０１０２】 （ポリペプチドライブラリー） さらに、ＨＤＧＦＸタンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーを用
いて、ＨＤＧＦＸタンパク質の改変体のスクリーニングおよび引き続く選択のた
めの増殖プロモーターフラグメントの多彩な集団を生成し得る。１つの実施形態
では、コード配列フラグメントのライブラリーは、ＨＤＧＦＸコード配列の二本
鎖ＰＣＲフラグメントを、１分子あたり約１つのみのニックが生じる条件下、ヌ
クレアーゼで処理すること、二本鎖ＤＮＡを変性させること、異なるニック産物
からのセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成するためにこのＤ
ＮＡを再生すること、Ｓ１ヌクレアーゼを用いた処理により再形成された二本鎖
から一本鎖部分を除去すること、および得られるフラグメントライブラリーを発
現ベクター中に連結することにより生成し得る。この方法により、ＨＤＧＦＸタ
ンパク質の種々のサイズのＮ末端および内部フラグメントをコードする発現ライ
ブラリーが派生し得る。
【０１０３】 点変異または短縮により作成されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産
物をスクリーニングするため、選択された性質を有する遺伝子産物のｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技法が当該分野で公知である
。このような技法を、ＨＤＧＦＸタンパク質のコンビナトリアル変異誘発により
生成された遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用可能である。大きな
遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、高スループット分析に適した
最も広く用いられる技法は、代表的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現
ベクター中にクローニングすること、得られるベクターのライブラリーで適切な
細胞を形質転換すること、およびこのコンビナトリアル遺伝子を、所望の活性の
検出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする
条件下で発現することを含む。ライブラリー中の機能的変異体の頻度を増大する
新規技法であるリクルーシブエンセブル変異誘発（ＲＥＭ）を、スクリーニング
アッセイと組み合わせて用い、ＨＤＧＦＸ改変体を同定し得る（Ａｒｋｉｎおよ
びＹｏｕｒｖａｎ（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇ
ｒａｖｅら（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６：３２７
−３３１）。
【０１０４】 （抗ＨＤＧＦＸ抗体） 本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、および
免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原に特異的
に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子）をいう。このような抗体
としては、ポリクロナール抗体、モノクロナール抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、
Ｆabフラグメント、Ｆab'フラグメントおよびＦ(ab')2フラグメント、ならびに
Ｆab発現ライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。一般的に、ヒト
由来の抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤの任意のクラ
スに関連し、これらは分子内に存在する重鎖の性質によってお互いに異なる。特
定のクラスは同様にサブクラス（例えば、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2など）を有する。さ
らに、ヒトにおいては、軽鎖はκ鎖またはλ鎖であり得る。本明細書中で抗体に
対する参照は、ヒト抗体種のすべてのこのようなクラス、サブクラスおよび型に
対する参照を含む。
【０１０５】 本発明の単離されたタンパク質は、抗原、またはその一部もしくはフラグメン
トとして役立つことが意図され得、そしてさらに、免疫原として使用され、ポリ
クロナール抗体およびモノクロナール抗体の調製のための標準的な技術を用いて
、抗原に免疫特異的に結合する抗体を生成し得る。全長タンパク質が使用され得
るか、あるいは本発明は、免疫原として使用するための抗原の抗原性ペプチドフ
ラグメントを提供する。抗原性ペプチドフラグメントは、全長タンパク質のアミ
ノ酸配列（例えば、配列番号２において示されるアミノ酸配列）の少なくとも６
アミノ酸残基を含み、そしてそれらのエピトープを含み、その結果このペプチド
に対して惹起された抗体は、全長タンパク質またはこのエピトープを含む任意の
フラグメントと特定の免疫複合体を形成する。好ましくは、抗原性ペプチドは、
少なくとも１０アミノ酸残基、または少なくとも１５アミノ酸残基、または少な
くとも２０アミノ酸残基、または少なくとも３０アミノ酸残基を含む。この抗原
性ペプチドにより含まれる好ましいエピトープは、そのペプチド表面上に位置す
るタンパク質の領域であり；通常、これらは親水性領域である。
【０１０６】 本発明の特定の実施形態では、抗原性ペプチドにより包含される少なくとも１
つのエピトープは、タンパク質の表面上に位置するＨＤＧＦＸの領域、例えば、
親水性領域である。ヒトＨＤＧＦＸ関連タンパク質配列の疎水性分析は、ＨＤＧ
ＦＸ関連タンパク質のどの領域が特に親水性であるか、そしてそれ故、抗体産生
を標的にするために有用な表面残基をコードするようであるかを示す。抗体産生
を標的にする手段として、親水性および疎水性の領域を示すヒドロパシープロッ
トを、例えば、フーリエ変換を使用してかまたは使用しないかのいずれかで、Ｋ
ｙｔｅ ＤｏｏｌｉｔｔｌｅまたはＨｏｐｐ Ｗｏｏｄｓ法を含む、当該分野で
周知の任意の方法により生成し得る。例えば、それらの全体が本明細書に参考と
して援用される、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：３８２４−３８２８；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌ
ｉｔｔｌｅ １９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１４２を参照
のこと。抗原性タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくは
ホモログ内の１つ以上のドメインに対して特異的な抗体はまた、本明細書中で提
供される。
【０１０７】 本願明細書において開示されるように、配列番号２のＨＤＧＦＸタンパク質配
列、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログは、これ
らのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の生成において、免疫原として
利用され得る。本願明細書において用いられる場合、用語「抗体」は、免疫グロ
ブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原
に特異的に結合する（これと免疫反応する）抗原結合部位を含む分子）（例えば
、ＨＤＧＦＸ）をいう。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノク
ローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ＦabおよびＦ(ab')2フラグメント、なら
びにＦab発現ライブラリーが挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形
態において、ヒトＨＤＧＦＸタンパク質に対する抗体が、開示される。当該分野
で公知の種々の手順が、配列番号２のＨＤＧＦＸタンパク質配列、あるいはそれ
らの誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログに対するポリクローナル抗
体またはモノクローナル抗体の産生のために用いられ得る。これらのタンパク質
のいくつかは、以下で議論される。
【０１０８】 １つの実施形態において、所望の特異性を保有する抗体のスクリーニングのた
めの方法は、当該分野内で公知の酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
および他の免疫学的に媒介された技術を含むが、これに限定されない。特定の実
施形態において、ＨＤＧＦＸタンパク質の特定のドメインに対して特異的である
抗体の選抜は、このようなドメインを所有しているＨＤＧＦＸタンパク質のフラ
グメントに結合するハイブリドーマの生成により容易にされる。ＨＤＧＦＸタン
パク質（例えば、ＨＧＤＦ（例えば、表３〜４を参照のこと）と比較した場合の
ＨＤＧＦＸタンパク質に特異的なカルボキシル末端残基）、またはそれらの誘導
体、フラグメント、アナログまたはホモログ内の１つ以上のドメインについて特
異的である抗体がまた、本願明細書において提供される。
【０１０９】 当該分野において公知の種々の手順が、本発明のタンパク質、またはその誘導
体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオルソログに対して指向される
ポリクロナール抗体またはモノクロナール抗体の産生のために使用され得る（例
えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｍｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａ
ｒｌｏｗ Ｅ，およびＬａｎｅ Ｄ，１９９８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ、ＮＹ（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。これら
の抗体のうちのいくつかは、以下で考察される。
【０１１０】 （ポリクロナール抗体） ポリクロナール抗体の産生のために、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ
、ヤギ、マウスまたは他の動物）は、ネイティブなタンパク質、その合成改変体
、または前記の誘導体を用いる１以上の注射によって免疫され得る。適切な免疫
原性調製物は、例えば、天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク
質を提示する化学的に合成されたポリペプチド、または組換え的に発現される免
疫原性タンパク質を含み得る。さらに、このタンパク質は、免疫されている哺乳
動物において免疫原性であることが知られている第２のタンパク質に結合体化さ
れ得る。このような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘ
モシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、および大豆トリプシンイ
ンヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。この調製物はさらに、アジ
ュバントを含み得る。種々のアジュバントが免疫学的応答を増加させるために使
用され、このようなアジュバントとしては、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ（完全および不完
全）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、
リゾレシチン、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、
ペプチド、油乳濁液、ジニトロフェノールなど）、ヒトにおいて使用可能なアジ
ュバント（例えば、Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−ＧｕｅｒｉｎおよびＣ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）または類似の免疫刺激剤が挙げ
られるが、これらに限定されない。使用され得るアジュバントのさらなる例とし
ては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロー
スジコリノミコレート）が挙げられる。
【０１１１】 免疫原性タンパク質に対して指向されるポリクロナール抗体分子は、哺乳動物
から（例えば、血液から）単離され得、そして周知の技術（例えば、プロテイン
ＡまたはプロテインＧを用いるアフィニティクロマトグラフィー（これは、主に
免疫血清のＩｇＧ画分を提供する））によってさらに精製され得る。続いて、ま
たは代替的に、求められている免疫グロブリンの標的である特定の抗原またはそ
の抗原のエピトープがカラムに固定され、免疫アフィニティクロマトグラフィー
によって免疫特異的抗体を精製し得る。免疫グロブリンの精製は、例えば、Ｄ．
Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓ
ｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ ＰＡより発行）、第１４巻、第８号
（２０００年４月１７日）、２５〜２８頁）によって考察される。
【０１１２】 （モノクローナル抗体） 本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノク
ローナル抗体組成物」は、独特の軽鎖遺伝子産物および独特の重鎖遺伝子産物か
らなる唯一の分子種の抗体分子を含む抗体分子の集団をいう。特に、モノクロー
ナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、すべての分子の集団に同一である。従
って、ＭＡｂは、抗原への独特の結合親和性によって特徴付けられる抗原の特定
のエピトープと免疫反応可能な抗原結合部位を含む。
【０１１３】 モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ方法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭ
ｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載されるよう
な方法）を使用して調製され得る。ハイブリドーマ方法において、マウス、ハム
スター、または他の適切な宿主細胞は、免疫因子で代表的に免疫され、免疫因子
に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生し得るリンパ球を誘発する。
あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。
【０１１４】 免疫因子としては、代表的に、タンパク質抗原、そのフラグメントまたはその
融合タンパク質が挙げられる。一般的には、以下のいずれかである：ヒト起源の
細胞が望まれる場合は、末梢血リンパ球が使用され、または非ヒト哺乳動物供給
源が望まれる場合は、脾臓細胞またはリンパ節細胞が使用される。次いで、適切
な融合因子（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して、リンパ球を不死化
細胞株に融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔ
ｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）第５９−１０３頁）。不死
化細胞株は、通常形質転換された哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシおよびヒト
起源の骨髄腫細胞である。通常ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が使用される
ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、１以上の物質（融合されていない不死化細
胞の増殖も生存も阻害する）を含む適切な培養培地中で培養され得る。例えば、
親の細胞が酵素、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（
ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマからの培養培地は、代
表的にヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み（「ＨＡＴ培地
」）、それらの物質はＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を阻害する。
【０１１５】 好ましい不死化細胞株は、効率的に融合する細胞株であり、それらは選択され
た抗体産生細胞の安定な高レベルの抗体の発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のよ
うな培地に敏感である。より好ましい不死化細胞株はマウス骨髄腫細胞株であり
、それらを、例えば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉ
ｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａおよ
びＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａ
ｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから得ることが可能である。ヒト骨髄腫および
マウス−ヒト骨髄腫細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載
される（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１
９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒ
ｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，
Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８７）第５
１−６３頁）。
【０１１６】 次いで、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、抗原に対するモノクロ
ーナル抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞
によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって決定
されるか、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（Ｒ
ＩＡ）または酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ））によって決定さ
れる。このような技術およびアッセイは、当該分野で公知である。モノクローナ
ル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード分析によ
って決定され得る。例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ １９８０ Ａ
ｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０を参照のこと。標的抗原に対する高い
程度の特異性および高結合親和性を有する抗体を同定することが、目的であり、
モノクローナル抗体の治療学的適用において特に重要である。
【０１１７】 所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、希釈手順を限定することによって
、クローンをサブクローニングし得、そして標準方法によって増殖し得る（Ｇｏ
ｄｉｎｇ，１９８６）。例えば、この目的のために適切な培養培地としては、Ｄ
ｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍおよび
ＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳
動物内の腹水としてインビボで増殖され得る。
【０１１８】 サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリ
ン精製手順（例えば、タンパク質Ａセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマ
トグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィー
）によって、培養培地または腹水から、単離または精製され得る。
【０１１９】 モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１
６，５６７号に記載される方法）によって作製され得る。本発明のモノクローナ
ル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重
鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプロ
ーブを使用することによって）容易に単離され得、そして配列決定され得る。本
発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ
。一旦単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに配置され得、次いでそれらは、
宿主細胞（例えば、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないサルＣ
ＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞）に
トランスフェクトされ、組換え宿主細胞内でのモノクローナル抗体の合成を得る
。ＤＮＡはまた、例えば、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常
ドメインをコードする配列の置換（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒ
ｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８，８１２−１３（１９９４））によってか、ま
たは非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列のすべてまたは一部の
配列をコードする免疫グロブリンへの共有結合的な連結によって改変され得る。
このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常領域に置換さ
れ得るか、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変領域に置換され得、
キメラ二価の抗体を作製する。
【０１２０】 （ヒト化抗体） 本発明のタンパク質抗原に対する抗体は、さらにヒト化抗体またはヒト抗体を
含み得る。これらの抗体は、投与された免疫グロブリンに対するヒトの免疫応答
を引き起こさないヒトへの投与に適する。抗体のヒト化形態は、キメラ免疫グロ
ブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ
、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2または他の抗体の抗原結合配列）であり、それらは
主にヒト免疫グロブリンの配列から構成され、そして非ヒト免疫グロブリンに由
来する最小の配列を含む。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列についてのげっ歯
類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列の置換によって、Ｗｉｎｔｅｒらの方法（Ｊｏｎｅｓ
ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら
、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら
、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の後に達成され
得る（米国特許第５，２２５，５３９号もまた参照のこと）。いくつかの場合に
おいて、ヒト免疫グロブリンのＦｖ骨格（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）残基は、対応す
る非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、患者の抗体においても、
移入されたＣＤＲまたは骨格配列においても見出されない残基を含み得る。一般
に、ヒト化抗体は、すべての少なくとも１つ、および代表的には２つの可変領域
を実質的に含む。これらの領域内で、すべてのまたは実質的にすべてのＣＤＲ領
域は非ヒト免疫グロブリンの領域に対応し、そしてすべてまたは実質的にすべて
の骨格領域はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の領域に対応する。ヒト化抗
体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、代表的には、ヒト免疫グロブリン
の少なくとも一部を必要に応じて含む（Ｊｏｎｅｓら、１９８６；Ｒｉｅｃｈａ
ｍａｎｎら、１９８８；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．
Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２））。
【０１２１】 （ヒト抗体） ＣＤＲを含む軽鎖および重鎖の両方の全体配列がヒト遺伝子から本質的に生じ
る抗体分子に、十分なヒト抗体は基本的に関連する。このような抗体を、「ヒト
抗体」、または「十分なヒト抗体」と本明細書中で呼ぶ。ヒトモノクローナル抗
体は、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術によって調製され得る；ヒトＢ細胞ハイ
ブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４
：７２を参照のこと）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハ
イブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢ
ＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ
，Ｉｎｃ．，第７７−９６頁）。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実行にお
いて使用され得、そしてヒトハイブリドーマの使用によってか（Ｃｏｔｅら、１
９８３．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０：２０２６−２
０３０を参照のこと）、またはインビトロでのＥｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ Ｖｉ
ｒｕｓを用いたヒトＢ細胞による形質転換によって（Ｃｏｌｅら、１９８５：Ｍ
ＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲ
ＡＰＹ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，第７７−９６頁を参照のこと）産
生され得る。
【０１２２】 さらに、ヒト抗体はまた、さらなる技術（ファージディスプレイライブラリー
（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７
：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８
１（１９９１））を含む）を使用して産生され得る。同様に、ヒト免疫グロブリ
ン位置をトランスジェニック動物（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が、部
分的または完全に不活化されているマウス）に導入することによって、ヒト抗体
は作製され得る。チャレンジの際にヒト抗体産生が観察され、このことはすべて
の点（遺伝子再配列、アセンブリー、および抗体レパートリーを含む）でヒトに
おいて観察されたものに密接に類似する。このアプローチは、例えば、以下に記
載される：米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第
５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号
；同第５，６１１，０１６号、およびＭａｒｋｓら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ １０、７７９−７８３（１９９２））；Ｌｏｎｂｅｒｇら（Ｎａｔｕｒｅ
３６８ ８５６−８５９（１９９４））；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（Ｎａｔｕｒｅ
３６８、８１２−１３（１９９４））；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４、８４５−５１（１９９６））；Ｎｅｕｂｅｒ
ｇｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４、８２６（１９９６
））；ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１３ ６５−９３（１９９５））。
【０１２３】 ヒト抗体は、抗原によるチャレンジに応答して動物の内因性抗体よりもヒト抗
体を十分に産生するように改変されたトランスジェニック非ヒト動物を使用して
、さらに産生され得る（ＰＣＴ刊行物ＷＯ９４／０２６０２を参照のこと）。非
ヒト宿主における重免疫グロブリン鎖および軽免疫グロブリン鎖をコードする内
因性遺伝子は、耐えられなくなっており、そしてヒト重鎖および軽鎖免疫グロブ
リンをコードする活性な位置は、宿主のゲノムに挿入される。例えば、要求性ヒ
トＤＮＡセグメントを含む酵母人工染色体を使用して、ヒト遺伝子は組み込まれ
る。次いで、すべての所望の改変を提供する動物を、完全な改変の相補体よりも
より少ない改変の相補体を含む中間トランスジェニック動物を雑種することによ
って子孫として得る。このような非ヒト動物の好ましい実施形態は、マウスであ
り、ＰＣＴ刊行物ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０９６に開示され
るようにＸｅｎｏｍｏｕｓTMと呼ばれる。この動物は、ヒト免疫グロブリンを十
分に分泌するＢ細胞を産生する。目的の免疫原を有する免疫後の動物から（例え
ば、ポリクローナル抗体の調製）、あるいは動物由来の不死化されたＢ細胞（例
えば、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ）から、抗体を直接得るこ
とが可能である。さらに、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺
伝子は、抗体を直接得るために回復され、そして発現され得るか、または抗体の
アナログ（例えば、１本鎖Ｆｖ分子）を得るために、さらに改変され得る。
【０１２４】 内因性免疫グロブリン重鎖の発現を欠く非ヒト宿主（マウスとして例証される
）を作製するための方法の例は、米国特許第５，９３９，５９８号に記載される
。それを、以下の工程を包含する方法によって得ることが可能である：位置の再
配列を防ぎ、そして再配列された免疫グロブリン重鎖位置の転写物の形成、およ
び選択マーカーをコードする遺伝子を含む標的ベクターによって影響される欠失
を防ぐために、胚幹細胞における少なくとも１つの内因性重鎖位置由来のＪセグ
メント遺伝子を欠失する工程；およびトランスジェニックマウス（その体細胞お
よび生殖細胞は、選択マーカーをコードする遺伝子を含む）を、胚幹細胞から作
製する工程。
【０１２５】 目的の抗体（例えば、ヒト抗体）を産生する方法は、米国特許第５，９１６，
７７１号に開示される。それは以下の工程を包含する：重鎖をコードするヌクレ
オチド配列を含む発現ベクターを、培養中の１つの哺乳動物宿主細胞に導入する
工程、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、別の哺乳動物
宿主細胞に導入する工程、およびハイブリッド細胞を形成するために２つの細胞
融合する工程。ハイブリッド細胞は、重鎖および軽鎖を含む抗体を発現する。
【０１２６】 この手順のさらなる改善において、免疫原上の臨床的に関連するエピトープを
同定する方法、および関連するエピトープに高い親和性で免疫特異的に結合する
抗体を選択する相関する方法は、ＰＣＴ刊行物ＷＯ９９／５３０４９に開示され
る。
【０１２７】 （Ｆabフラグメントおよび単鎖抗体） 本発明に従って、技術は、本発明の抗原性タンパク質に特異的な単鎖抗体の産
生に適用され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。
さらに、方法は、Ｆab発現ライブラリーの構築に適用され得（例えば、Ｈｕｓｅ
ら、１９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１を参照のこと）、
タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログについて
の所望の特異性を有するモノクローナルＦabフラグメントの迅速かつ効果的な同
定を可能にする。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含む抗体フラグメン
ト（（ｉ）抗体分子のペプシン消化によって産生されるＦ(ab')2フラグメント；
（ｉｉ）Ｆ(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって産生
されたＦabフラグメント；（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤を用いた抗体分子の
処理によって産生されたＦabフラグメント、および（ｉｖ）Ｆvフラグメントを
含むが、これらに限定ない）は、当該分野で公知の技術によって産生され得る。
【０１２８】 （二重特異的抗体） 二重特異的抗体は、モノクローナル抗体（好ましくはヒトモノクローナル抗体
またはヒト化されたモノクローナル抗体）であって、これは少なくとも２つの異
なる抗原に対して結合特異性を有する。この場合において、結合特異性の１つは
、本発明の抗原性タンパク質に対してである。第２の結合標的は、任意の他の抗
原であり、そして有利には細胞表面タンパク質あるいはレセプターまたはレセプ
ターサブユニットである。
【０１２９】 二重特異的抗体を作製する方法は、当該分野で公知である。伝統的に、二重特
異的抗体の組換え生成は、２つの免疫グロブリンの重鎖／軽鎖の対の同時発現に
基づき、ここでこの２つの重鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎおよ
びＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫
グロブリンの重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせのために、これらのハイブ
リドーマ（クアドローマ）は、１０の異なる抗体分子の潜在的混合物を作製し、
このうち１つのみが正確な二重特異的構造を有する。この正確な分子の精製は、
通常アフィニティークロマトグラフィー工程によって達成される。同様の手順は
、１９９３年５月１３日開示のＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋ
ｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１０：３６５５−３６５９（１９９１）において開示
される。
【０１３０】 所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインは、免疫
グロブリン定常領域配列に融合され得る。この融合は、好ましくは免疫グロブリ
ン重鎖定常ドメインを有し、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも部
分を含む。この融合物中の少なくとも１つに存在する軽鎖結合のために必要な部
位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。この免疫グロ
ブリン重鎖融合体、および所望の場合、この免疫グロブリン軽鎖をコードするＤ
ＮＡは、別々の発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主生物体に同時トラン
スフェクトされる。二重特異的抗体の作製のさらなる詳細は、例えば、Ｓｕｒｅ
ｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９
８６）を参照のこと。
【０１３１】 ＷＯ９６／２７０１１に記載される別のアプローチに従って、抗体分子の対の
間の界面は、組換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーのパーセンテージ
を最大化するために操作され得る。好ましい界面は、抗体定常領域のＣＨ３領域
の少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子の界面からの１つ
以上の小さなアミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプ
トファン）で置換される。大きな側鎖についての同一または同様のサイズの代償
的な「空洞」は、大きなアミノ酸側鎖を小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン
またはスレオニン）で置換することによって、第２の抗体分子の界面上に生成さ
れる。このことは、ホモダイマーのような他の不必要な最終生成物よりも、ヘテ
ロダイマーの収量を増加するための機構を提供する。
【０１３２】 二重特異的抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）2 二重特異的抗体）として調製され得る。抗体フラグメントから二重特異的抗体
を作製するための技術は、文献において記載される。例えば、二重特異的抗体は
、化学結合を使用して調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２
９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体がタンパク分解的に切断されてＦ（
ａｂ’）2フラグメントを作製する手順を記載する。これらのフラグメントは、
ビシナルジチオールを安定化し、そして分子間ジスルフィド形成を阻止するため
に、ジチオール錯化剤ナトリウム亜ヒ酸塩の存在下で還元される。次いで、この
作製されたＦａｂ’フラグメントは、チオニトロベンゾエート（ＴＢＮ）誘導体
に変換される。次いで、Ｆａｂ’−ＴＢＮ誘導体の１つは、メルカプトエチルア
ミンでの還元によってＦａｂ’−チオールに再変換され、そしてこれは等モル量
の他のＦａｂ’−ＴＢＮ誘導体と混合されて二重特異的抗体を形成する。生成さ
れた二重特異的抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用され得る。
【０１３３】 さらに、Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され得、そして
化学的にカップリングされて二重特異的抗体を形成する。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ
．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全にヒト化され
た二重特異的抗体Ｆ（ａｂ’）2分子の生成を記載する。各Ｆａｂ’フラグメン
トは、Ｅ．ｃｏｌｉから別々に分泌され、そしてインビトロの化学的カップリン
グに供され、二重特異的抗体を形成する。従って、形成されたこの二重特異的抗
体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合
し得、そしてヒト胸部腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解性活性を
誘因し得る。
【０１３４】 組換え細胞培養物から直接二重特異的抗体フラグメントを作製し、そして単離
するための種々の技術がまた記載されてきた。例えば、二重特異的抗体は、ロイ
シンジッパーを使用して産生される。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパ
ク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体
のＦａｂ’部分に結合される。この抗体ホモダイマーは、ヒンジ領域で還元され
てモノマーを形成し、次いで再酸化されて抗体ヘテロダイマーを形成する。この
方法はまた、抗体ホモダイマーの産生のために使用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅ
ｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４
４８（１９９３）に記載されるこの「ディアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）」技術
は、二重特異的抗体フラグメントを作製するための代替的な機構を提供した。こ
のフラグメントは、短すぎて同じ鎖上の２つのドメインの間を対にできないリン
カーによって軽鎖可変領域（ＶL）に接続された重鎖可変領域（ＶH）を含む。従
って、１つのフラグメントのＶHおよびＶLドメインは、別のフラグメントの相補
的なＶLおよびＶHドメインと対になるように強制され、これによって２つの抗原
結合部位が形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用によって二重特異的抗
体フラグメントを作製するための別のストラテジーもまた、報告されてきた。Ｇ
ｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照のこ
と。
【０１３５】 ２つ以上の結合価を有する抗体が意図される。例えば、三重特異的抗体が調製
され得る。Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０１３６】 例示的な二重特異的抗体は、２つの異なるエピトープに結合し得、このうち少
なくとも１つは、本発明のタンパク質抗原に起源を有する。あるいは、免疫グロ
ブリン分子の抗抗原性アームは、Ｔ細胞レセプター分子のような白血球（例えば
、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、またはＢ７）、あるいはＩｇＧに対するＦｃレセ
プター（ＦｃγＲ）（例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３
２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６））上の標的化分子に結合するアームに、
特定の抗原を発現する細胞に対する細胞の防御機構に焦点を合わせるように結合
され得る。二重特異的抗体はまた、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞傷害
性因子に指向するために使用され得る。これらの抗体は抗原結合アーム、および
細胞傷害性因子または放射性核種キレーター（例えば、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ
、ＤＯＴＡ、またはＴＥＴＡ）に結合するアームを保有する。目的の別の二重特
異的抗体は、本明細書中に記載のタンパク質抗原に結合し、そしてさらに組織因
子（ＴＦ）に結合する。
【０１３７】 （ヘテロ接合体抗体） ヘテロ接合体抗体はまた、本発明の範囲内である。ヘテロ接合体抗体は、２つ
の共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不必要
な細胞に標的化するために（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ
感染の処置のために（ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０
３０８９）提案されてきた。この抗体（架橋剤を含む抗体を含む）は、インビト
ロで、合成タンパク質化学において公知の方法を使用して調製され得ることが意
図される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応の使用またはチオエーテ
ル結合の形成によって構築され得る。この目的のための適切な試薬の例としては
、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデート、ならびに
例えば米国特許第４，６７６，９８０号において開示される試薬が挙げられる。
【０１３８】 （エフェクター機能操作） 本発明の抗体を、エフェクター機能について、例えば癌の処置における抗体の
効力を増大するように改変することが望ましくあり得る。例えば、システイン残
基は、Ｆｃ領域に導入され得、これによってこの領域における鎖間ジスルフィド
結合の形成を可能にする。従って、作製されるこのホモダイマー抗体は、改良さ
れたインターナリゼーションの可能性および／または増加した補体媒介細胞死滅
、ならびに抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７６：１１９１−１１９５（１１９２）およびＳｈｏｐｅ
ｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照のこ
と。増大した抗腫瘍活性を有するホモダイマー抗体はまた、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５３：２５６０−２６５６（１９９３）に記載さ
れるヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製され得る。あるいは、抗体は操作され
得、これは二重のＦｃ領域を有し、そしてこれによって増大した補体溶解および
ＡＤＣＣの可能性を有し得る。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ
Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，３：２１９−２３０（１９８９）を参照のこと。
【０１３９】 （免疫接合体） 本発明はまた、細胞傷害性の薬剤（例えば、化学療法剤、毒素（例えば、細菌
、真菌、植物、または動物起源の酵素学的に活性な毒素、あるいはそれらのフラ
グメント）、または放射性同位体（すなわち、放射性接合体））に結合した抗体
を含む免疫接合体に関する。
【０１４０】 このような免疫接合体の作製において有用な化学療法剤は、上記に記載される
。使用され得る酵素学的に活性な毒素およびそれらのフラグメントとしては、ジ
フテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、
モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏ
ｒｄｉｉタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏ
ｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡ
Ｐ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａインヒビター、クルシン（
ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、ｓｅｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉ
ｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉ
ｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノ
マイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、およ
びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎ）が挙げられる。種々の放射性核種は
、放射性結合した抗体の作製のために利用可能である。その例としては、212Ｂ
ｉ、131Ｉ、131Ｉｎ、90Ｙ、および186Ｒｅが挙げられる。
【０１４１】 抗体および細胞傷害性因子の接合体は、種々の二官能性タンパク質結合因子（
例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネー
ト（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）（ＩＴ）、イ
ミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデート ＨＣＬ）、
活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば
、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ））、ビスアジド化合物
（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニ
ウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミ
ン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６−ジイソシアネート）、およ
びビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベ
ンゼン））を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製さ
れ得る。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレ
ントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への結合
のための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。
【０１４２】 別の実施形態において、腫瘍の前標的化における利用のために、この抗体は、
「レセプター」（例えば、ストレプトアビジン）に結合され得、ここで抗体−レ
セプター接合体は患者に投与され、続いて除去剤を使用して結合していない接合
体が循環から除去され、次いで細胞傷害性因子に次々に結合する「リガンド」（
例えば、アビジン）が投与される。
【０１４３】 （免疫リポソーム） 本明細書中に開示される抗体はまた、免疫リポソームとして形成され得る。抗
体を含むリポソームは、当該分野で公知の方法（例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：３６８８（１９８５）；
Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４０３
０（１９８０）；および米国特許第４，４８５，０４５号および４，５４４，５
４５号に記される）によって調製される。増強された循環時間を有するリポソー
ムは、米国特許台５，０１３，５５６号に記載されている。
【０１４４】 特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリ、コレステロール、およびＰＥ
Ｇ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成
物を用いる逆層エバポレーション法によって精製され得る。リポソームは、所定
の穿孔サイズのフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソーム
が得られる。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントは、Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されるように
ジスルフィド交換反応を介してリポソームに結合体化され得る。化学療法剤（例
えば、ドキソルビシン）は、必要に応じてリポソーム内に含まれる。Ｇａｂｉｚ
ｏｎら、Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８１（１９）：１
４８４（１９８９）を参照のこと。
【０１４５】 （本発明のタンパク質に対して特異的な抗体の診断適用） 本発明のタンパク質に特異的な抗体は、タンパク質の局在化および／または定
量化に関連する当該分野で公知の方法（例えば、適切な生理学的試料内のタンパ
ク質のレベルを測定するための使用、診断方法における使用、タンパク質の画像
化での使用など）で使用され得る。所与の実施形態において、タンパク質、また
はその誘導体、フラグメントもしくはホモログに対する抗体（抗原結合ドメイン
を含む）は、薬理学的に活性な化合物（以下を参照のこと）として利用される。
【０１４６】 本発明のタンパク質に対して特異的な抗体は、標準的な技術（例えば、免疫ア
フィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降）によりタンパク質を単離する
ために使用される。このような抗体は、細胞から天然のタンパク質抗原を精製す
ること、および宿主細胞中で発現する組換え産生抗体を精製することを容易にし
得る。さらに、このような抗体を使用して、抗原タンパク質の存在比および発現
パターンを評価するために抗原タンパク質（例えば、細胞溶解物または細胞上清
中）を検出する。タンパク質に対して特異的な抗体を診断的に使用して、例えば
、所定の処置レジメンの有効性を決定するために、臨床試験手順の一部として組
織中のタンパク質レベルを検出し得る。検出は、検出可能な物質に抗体をカップ
リングする（すなわち、物理学的に連結する）ことによって容易にされ得る。検
出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光性物質、
生体発光性物質、および放射活性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、
ホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ、またはアセチルクロリンステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族の複
合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが
挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、アンベリフェロン、フルオレセイン、
フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン
フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光性
物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生体発光性物質の例としては、ルシ
フェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、そして適切な放射性
物質の例としては、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓまたは3Ｈが挙げられる。
【０１４７】 （抗体の薬学的組成物） 本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体および本明細書中に開示されるス
クリーニングアッセイによって同定される他の分子は、薬学的組成物の形態で種
々の障害の処置のために投与され得る。このような組成物を調製する工程に包含
される原理および考察、ならびに成分選択のガイドラインは、以下に提供される
：例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴ
ＩＣＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ １９版（Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒ
ｏら編）Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１９９５：ＤＲＵＧ
ＡＢＳＯＲＰＴＩＯＮ ＥＮＨＡＮＣＥＭＥＮＴ：ＣＯＮＣＥＰＴＳ，ＰＯＳ
ＳＩＢＬＩＴＩＥＳ，ＬＩＭＩＴＡＴＩＯＮＳ，ＡＮＤ ＴＲＥＮＤＳ，Ｈａｗ
ｏｏｄ Ａｃａｃｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ，Ｐａ
．，１９９４；およびＰＥＰＴＩＤＥ ＡＮＤ ＰＲＯＴＥＩＮ ＤＲＵＧ Ｄ
ＥＬＩＶＥＲＹ（Ａｄｖａｎｃｅｓ Ｉｎ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，第４巻）１９９１，Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。
【０１４８】 抗原タンパク質が細胞内にあり、そして全抗体がインヒビターとして使用され
る場合、抗体を内在化することが好ましい。しかし、リポソームをまた使用して
、抗体または抗体フラグメントを細胞に送達し得る。抗体フラグメントを使用す
る場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最も小さい阻害フラ
グメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質
配列と結合する能力を保持するペプチド分子が設計され得る。このようなペプチ
ドは、化学的に合成され得るかおよび／または組換えＤＮＡ技術によって産生さ
れ得る。例えば、Ｍａｒａｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，９０：７８８９−７８９３（１９９３）を参照のこと。本明細書中の処
方物はまた、必要な場合、処理される特定の標識に対して１以上の活性化合物、
好ましくは、互いに不利に影響を及ぼさない相補的活性を有する１以上の活性化
合物を含み得る。あるいは、またはさらに、この組成物は、例えば、細胞障害剤
、サイトカイン、化学療法剤または増殖阻害剤のような機能を強化する薬剤を含
み得る。このような分子は、意図される目的のために有効である量の組合せで適
切に存在する。
【０１４９】 この活性成分は、例えば、従来の技術または界面重合化（例えば、ヒドロキシ
メチルセルロース（コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミク
ロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）中）また
はゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロ
カプセル（マクロエマルジョン中）によって調製されるマイクロカプセル中に包
理され得る。
【０１５０】 インビボ投与に使用されるべき処方物は、滅菌されなければならない。これは
、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。
【０１５１】 （抗体治療） 本発明の抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体および
完全ヒト抗体を含む）は、治療剤として使用され得る。このような薬剤は、一般
に被験体の疾患または病理を処置または予防するために使用される。抗体調製（
好ましくは、標的抗原に対して高度な特異性および高度な親和性を有する抗体）
は、被験体に投与され、そして一般に標的との結合に起因して効果を有する。こ
のような効果は、所定の抗体分子と問題の標的分子との間の特異的な相互作用の
性質に依存して、２種類の効果があり得る。第１の場合、抗体の投与は、天然で
結合する内因性リガンドと標的との結合を抑止または阻害し得る。この場合、こ
の抗体は、標的に結合し、そして天然に存在するリガンドの結合部位をマスクし
、ここで、このリガンドはエフェクター分子として役立つ。従って、レセプター
は、リガンドが応答するシグナル伝達経路を媒介する。
【０１５２】 あるいは、この効果は、この抗体が標的分子上でエフェクター結合部位と結合
することによって生理学的結果を惹起する効果であり得る。この場合、この標的
（疾患または病理において不在または欠損し得る内因性リガンドを有するレセプ
ター）は、代替エフェクターリガンドとして抗体と結合し、レセプターによって
レセプターベースのシグナル伝達事象を開始する。
【０１５３】 本発明の抗体の治療有効量は、一般に、治療目的を達成するために必要とされ
る量に関連する。上記のように、これは、抗体とその標的抗体との間の結合相互
作用であり得、特定の場合にこの標的の機能を妨害し、そして別の場合に生理学
的応答を促進する。投与されるべき必要量は、さらに、特異的抗原に対する抗体
の結合親和性に依存し、そして投与された抗体が投与される他の被験体の自由体
積から除去される速度にも依存する。本発明の抗体または抗体フラグメントの治
療有効用量の共通の範囲は、非制限例であるが、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５
０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。共通の用量頻度は、例えば、１日に２回〜１週間
に１回までの範囲であり得る。
【０１５４】 （ＨＤＧＦＸ組換えベクターおよび宿主細胞） 本発明の別の局面は、ＨＤＧＦＸタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグ
メント、アナログ、もしくはホモログをコードする核酸を含むベクター、好まし
くは発現ベクターに関する。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は
、これが接続された別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。ベクターの１つの型
は「プラスミド」であり、これはさらなるＤＮＡセグメントが連結し得る環状の
二本鎖ＤＮＡループをいう。ベクターの別の型はウイルス性ベクターであり、こ
こでさらなるＤＮＡセグメントはこのウイルス性ゲノムに連結され得る。特定の
ベクターは宿主細胞中で自発的に複製し得、この中に導入される（例えば、細菌
の複製起源を有する細菌ベクターおよびエピソームの哺乳類ベクター）。他のベ
クター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入される際に
宿主細胞のゲノムに組み込まれ、そしてこれによって宿主のゲノムと同調して複
製される。さらに、特定のベクターは、これが作動可能に連結される遺伝子の発
現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で「発現ベクター」といわ
れる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラ
スミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は
、このプラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるため、交換可
能に使用され得る。しかし、本発明は、ウイルス性ベクター（例えば、複製欠損
レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような発現ベク
ターのこのような他の形態を含むことを意図し、これは等価な機能を果たす。
【０１５５】 本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸を、宿主細胞における核酸の発
現に適切な形態で含み、これはこの組換え発現ベクターが、発現のために使用さ
れる宿主細胞に基づいて選択される１つ以上の調節配列を含むこと意味し、これ
は発現される核酸配列に作動可能に連結される。組換え発現ベクターにおいて、
「作動可能に連結」は、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を
可能にする（例えば、このベクターが宿主細胞に導入される場合、インビトロ転
写／翻訳系または宿主細胞において）ような様式で調節配列に連結されることを
意味することを意図する。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーお
よび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを
意図する。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、ＧＥＮＥ ＥＸＰ
ＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯ
ＬＯＧＹ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａ
ｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節配列は、多くの型の宿主細胞にお
いてヌクレオチド配列の構成的発現を指向する配列、および特定の宿主細胞のみ
においてヌクレオチド配列の発現を指向する配列（例えば、組織特異的調節配列
）を含む。発現ベクターの設計が形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタ
ンパク質の発現のレベルなどのような因子に依存し得ることは当業者に理解され
る。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、それにより、本明細書に記
載されるような核酸によりコードされるタンパク質またはペプチド（融合タンパ
ク質または融合ペプチドを含む）（例えば、ＨＤＧＦＸタンパク質、ＨＤＧＦＸ
タンパク質の変異形態、融合タンパク質など）を生成し得る。
【０１５６】 本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞における、
ＨＤＧＦＸ核酸の発現のために設計され得る。例えば、ＨＤＧＦＸは、細菌細胞
（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス
発現ベクターを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。
適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣ
ＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５、Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に
おいてさらに考察される。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロ
モーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写および翻
訳され得る。
【０１５７】 原核生物におけるタンパク質の発現は、最も頻繁には、融合タンパク質または
非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成的プロモーターまたは誘導性
プロモーターを含むベクターを有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉにおい
て実行される。融合ベクターは、そこにコードされるタンパク質に、通常、組換
えタンパク質のアミノ末端に、多数のアミノ酸を付加する。このような融合ベク
ターは、代表的には、以下の３つの目的のために役立つ：（１）組換えタンパク
質の発現を増加させること；（２）組換えタンパク質の溶解度を増加させること
；および（３）親和性精製においてリガンドとして作用することによって組換え
タンパク質の精製の際に補助すること。しばしば、融合発現ベクターにおいて、
タンパク質分解の切断部位が、融合部分の結合部に導入され、そして融合タンパ
ク質の精製の後に、組換えタンパク質が組換えタンパク質の融合部分から分離さ
れることを可能にする。このような酵素、およびその同族の認識配列は、第Ｘａ
因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクター
としては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合
タンパク質、またはプロテインＡを、それぞれ、標的の組換えタンパク質に融合
するｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ ａ
ｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およ
びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げ
られる。
【０１５８】 適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍ
ｒａｎｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ １１
ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧ
Ｙ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が
挙げられる。
【０１５９】 Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大化するための１つのストラ
テジーは、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力が損なわれた宿
主細菌中でタンパク質を発現させることである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，
ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ Ｉ
Ｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８を参照のこと。別のスト
ラテジーは、各アミノ酸についての個々のコドンが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて優先
的に利用されるように、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変更するこ
とである（例えば、Ｗａｄａら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２
０：２１１１−２１１８を参照のこと）。本発明の核酸配列のこのような変更は
、標準的なＤＮＡ合成技術によって実行され得る。
【０１６０】 別の実施形態において、ＨＤＧＦＸ発現ベクターは、酵母発現ベクターである
。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ．ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現のための
ベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、（１９８７）ＥＭＢ
Ｏ Ｊ ６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗ
ｉｔｚ、（１９８２）Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃ
ｈｕｌｔｚら、（１９８７）Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌ
ｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉ
ｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【０１６１】 あるいは、ＨＤＧＦＸ核酸は、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆
虫細胞中で発現され得る。培養された昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）中でタン
パク質の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリー
ズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３：２１５６−２
１６５）およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８
９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９）が挙げられる。
【０１６２】 なお別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用し
て、哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８
（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（
Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ ６：１８７−１９５）が挙げられ
る。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、
ウイルスの調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用されるプロ
モーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシ
ミアンウイルス４０に由来する。原核生物細胞および真核生物細胞の両方のため
の他の適切な発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬ
ＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章および第１７章を参照
のこと。
【０１６３】 別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型（例え
ば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現する）中で優先的に核酸の
発現を指向し得る。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切
な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（
肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １：２６８−
２７７）、リンパ特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９８
８）Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４３：２３５−２７５）、特に、Ｔ細胞レセプタ
ープロモーター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ
Ｊ ８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８
３）Ｃｅｌｌ ３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（
１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：７４１−７４８）のプロモーター、ニューロン特異
的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅおよ
びＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９
８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２−９１６）、および乳腺特異的プロモー
ター（例えば、ミルク乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号およ
び欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発生的に調節されるプロモ
ーターもまた含まれる（例えば、マウスホックス（ｍｕｒｉｎｅ ｈｏｘ）プロ
モーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９
：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓお
よびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ３：５３７−５４６）
。
【０１６４】 本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発
明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、そのＤＮＡ分
子は、ＨＤＧＦＸ ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（Ｄ
ＮＡ分子の転写によって）を可能にする様式で調節配列に作動可能に連結される
。種々の細胞型におけるアンチセンスＲＮＡ分子の連続的な発現を指向する、ア
ンチセンス方向でクローニングされた核酸に作動可能に連結される調節配列が選
択され得る。例えば、アンチセンスＲＮＡの構成的発現、組織特異的発現、また
は細胞型特異的発現を指向する、ウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハ
ンサー、または調節配列が選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、組換え
プラスミド、ファージミド、または弱毒化されたウイルスの形態であり得、ここ
ではアンチセンス核酸は、高効率調節領域の制御下で産生され、その活性は、ベ
クターが導入される細胞型によって決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用す
る遺伝子発現の調節の議論については、例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら、「Ａｎ
ｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ
ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１巻（１）１９８６を参照のこと。
【０１６５】 本発明の別の局面は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関
する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で、交換可能
に使用される。このような用語は、特定の対象の細胞をいうのみでなく、そのよ
うな細胞の子孫または潜在的な子孫をいうことが理解される。変異または環境的
影響のいずれかに起因して、特定の改変は次の世代において存在し得るので、こ
のような子孫は、実際、親の細胞と同一でないかもしれないが、なお、本明細書
中で使用されるような用語の範囲内に含まれる。
【０１６６】 宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、Ｈ
ＤＧＦＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母ま
たは哺乳動物細胞（例えば、ヒトチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）ま
たはＣＯＳ細胞）で発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である
。
【０１６７】 ベクターＤＮＡは、従来的な形質転換またはトランスフェクション技術を介し
て原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場
合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来性の核酸（例
えば、ＤＮＡ）を宿主細胞中に導入するための当該分野で認識される種々の技術
をいうことを意図し、これらには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈
殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、また
はエレクトロポレーションが含まれる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェ
クトするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬ
ＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）および他の実験室マニュアルに見出され得
る。
【０１６８】 哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションについては、使用される発現ベク
ターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞のほんの一部のみが外来
ＤＮＡをそのゲノム中に組み込み得ることが知られている。これらの要素を同定
および選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコー
ドする遺伝子が、一般的には目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。種々
の選択マーカーには、薬物に対する耐性を付与するマーカー（例えば、Ｇ４１８
、ハイグロマイシン、およびメトトレキセート）が含まれる。選択マーカーをコ
ードする核酸は、増殖プロモーターをコードするベクターと同じベクター上で宿
主細胞に導入され得るか、あるいは別々のベクター上で導入され得る。導入され
た核酸とともに安定にトランスフェクトされる細胞は、薬物選択によって同定さ
れ得る（例えば、選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存するが、他の細胞
は死滅する）。
【０１６９】 本発明の宿主細胞（例えば、培養中の原核生物宿主細胞および真核生物宿主細
胞）は、ＨＤＧＦＸタンパク質を産生（すなわち、発現）するために使用され得
る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して、ＨＤＧＦＸタンパ
ク質を産生するための方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、
ＨＤＧＦＸタンパク質が産生されるような適切な培地中で、本発明の宿主細胞（
ここに、ＨＤＧＦＸポリペプチドをコードする組換え発現ベクターが導入されて
いる）を培養する工程を包含する。別の実施形態において、この方法はさらに、
培地または宿主細胞からＨＤＧＦＸを単離する工程を包含する。
【０１７０】 （トランスジェニック動物） 本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使
用され得る。例えば、１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＨＤＧＦ
Ｘコード配列が導入される、受精した卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで
、このような宿主細胞は、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用
され得、ここで外因性のＨＤＧＦＸ配列は、それらのゲノムまたは相同組換え動
物（ここで内因性のＨＤＧＦＸ配列が変更されている）に導入される。このよう
な動物は、ＨＤＧＦＸ配列の機能および／または活性を研究するため、およびＨ
ＤＧＦＸの活性のモジュレーターを同定および／または評価するために有用であ
る。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」とは、非ヒト動
物、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは、ラットまたはマウスのような
齧歯動物であり、ここでこれらの動物の１つ以上の細胞は、導入遺伝子を含む。
トランスジェニック動物の他の例には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤ
ギ、ニワトリ、両生類などを含む。導入遺伝子は、細胞のゲノムに組み込まれ（
この細胞からトランスジェニック動物が発生する）、そして成熟動物のゲノムに
残存する外因性のＤＮＡであり、それによって、このトランスジェニック動物の
１つ以上の細胞型または組織においてコード遺伝子産物の発現を指向する。本明
細書中で使用される場合、「相同組換え動物」とは、非ヒト動物であり、好まし
くは哺乳動物、より好ましくはマウスであり、ここで、内因性ＨＤＧＦＸ遺伝子
は、この内因性の遺伝子と、動物の発生の前に動物の細胞（例えば、動物の胚細
胞）に導入された外因性ＤＮＡ分子との間の相同組換えによって、変更されてい
る。
【０１７１】 本発明のトランスジェニック動物は、ＨＤＧＦＸをコードする核酸を、（受精
した卵母細胞の雄性前核に導入することによって例えば、マイクロインジェクシ
ョン、レトロウイルス感染によって）、およびこの卵母細胞が偽妊娠雌性フォス
ター動物（ｆｏｓｔｅｒ ａｎｉｍａｌ）中で発生することを可能にすることに
よって作製され得る。配列番号１のヒトＨＤＧＦＸ ＤＮＡ配列は、非ヒト動物
のゲノムに導入遺伝子として導入され得る。あるいは、ヒトＨＤＧＦＸ遺伝子の
非ヒトホモログ（例えば、マウスＨＤＧＦＸ遺伝子）は、ヒトＨＤＧＦＸ ｃＤ
ＮＡに対するハイブリダイゼーションに基づいて単離され得（上述にさらに記載
される）、そして導入遺伝子として使用され得る。イントロン配列およびポリア
デニル化シグナルもまた導入遺伝子中に含まれ、その導入遺伝子の発現の効率を
増大させ得る。組織特異的調節配列（単数または複数）は、特定の細胞に対して
、ＨＤＧＦＸタンパク質の発現を指向するために、ＨＤＧＦＸ導入遺伝子に作動
可能に連結される。胚の操作およびマイクロインジェクションを介するトランス
ジェニック動物（特に、マウスのような動物）を生成するための方法は、当該分
野で従来的になっており、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号；同
第４，８７０，００９号；および同第４，８７３，１９１号；ならびにＨｏｇａ
ｎ １９８６、ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ ＴＨＥ ＭＯＵＳＥ ＥＭＢＲＹＯ
，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。同様の
方法は、他のトランスジェニック動物の作製のために使用される。トランスジェ
ニック初代動物は、そのゲノムにおけるＨＤＧＦＸ導入遺伝子の存在および／ま
たはその動物の組織または細胞中のＨＤＧＦＸ ｍＲＮＡの発現に基づいて同定
され得る。次いで、トランスジェニック初代動物は、導入遺伝子を有するさらな
る動物を繁殖させるために使用され得る。さらに、ＨＤＧＦＸをコードする導入
遺伝子を有するトランスジェニック動物は、さらに、他の導入遺伝子を有する他
のトランスジェニック動物へと繁殖させ得る。
【０１７２】 相同組換え動物を作製するために、欠失、付加、または置換が導入されて、そ
れによってＨＤＧＦＸ遺伝子が変化（例えば、機能的に破壊）されている、少な
くとも、ＨＤＧＦＸ遺伝子の一部を含むベクターを調製する。ＨＤＧＦＸ遺伝子
は、ヒト遺伝子（例えば、配列番号１）であり得るが、より好ましくは、ヒトＨ
ＤＧＦＸ遺伝子の非ヒトホモログである。例えば、配列番号１のヒトＨＤＧＦＸ
遺伝子のマウスホモログは、マウスゲノムにおいて内因性ＨＤＧＦＸ遺伝子を変
更するのに適切な相同組換えベクターを構築するために使用され得る。１つの実
施形態において、そのベクターは、相同組換えに際して、内因性ＨＤＧＦＸ遺伝
子が、機能的に破壊される（すなわち、機能的タンパク質をもはやコードしない
；「ノックアウト」ベクターともいわれる）ように設計される。
【０１７３】 あるいは、このベクターは、相同組換えの際に、内因性ＨＤＧＦＸ遺伝子が変
異されるか、あるいはさもなければ、変更されるが、なお機能性タンパク質をコ
ードするように設計される（例えば、上流の調節領域を変更して、それによって
内因性ＨＤＧＦＸタンパク質の発現を変更し得る）。相同組換えベクターにおい
て、ＨＤＧＦＸ遺伝子の変更された部分は、ＨＤＧＦＸ遺伝子のさらなる核酸に
よって、その５’末端および３’末端で隣接され、相同組換えが、ベクターによ
って運ばれる外因性ＨＤＧＦＸタンパク質と胚幹細胞中の内因性ＨＤＧＦＸタン
パク質との間で起こることを可能にする。さらなる隣接するＨＤＧＦＸタンパク
質核酸は、内因性遺伝子との首尾よい相同組換えに十分な長さである。代表的に
、数キロベースの隣接するＤＮＡ（５’末端および３’末端の両方）が、ベクタ
ーに含まれる。例えば、相同組換えベクターの記載について、Ｔｈｏｍａｓら（
１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：５０３を参照のこと。このベクターは、胚幹細胞株
に導入され（例えば、エレクトロポレーションによって）、この導入されたＨＤ
ＧＦＸ遺伝子が、内因性ＨＤＧＦＸタンパク質遺伝子と相同組換えされた細胞が
、選択される（例えば、Ｌｉら（１９９２）Ｃｅｌｌ ６９：９１５を参照のこ
と）。
【０１７４】 次いで、この選択された細胞を、動物（例えば、マウス）の胚盤胞へ注入して
、凝集キメラを形成する。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ（１９８７）のＴＥＲＡＴＯ
ＣＡＲＣＩＮＯＭＡＳ ＡＮＤ ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ：
Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ、
Ｏｘｆｏｒｄ １１３頁〜１５２頁を参照のこと。次いで、キメラ胚を、適切な
偽妊娠雌性フォスター動物に移植し得、そしてこの胚を、一定期間置く。それら
の胚芽細胞中に相同組換えＤＮＡを保有する子孫を使用して、動物を繁殖し得、
ここで、この動物の全ての細胞は、導入遺伝子の生殖系列伝達によって、この相
同組換えＤＮＡを含む。相同的組換えベクターおよび相同的組換え動物を構築す
るための方法が、さらに以下に記載される；Ｂｒａｄｌｅｙ（１９９１）Ｃｕｒ
ｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：８２３−８２９；ＰＣＴ国際公開番
号：ＷＯ９０／１１３５４；ＷＯ９１／０１１４０；ＷＯ９２／０９６８；およ
びＷＯ９３／０４１６９。
【０１７５】 別の実施形態において、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択された
系を含む、非ヒトトランスジェニック動物が産生され得る。このような系の１つ
の例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。
ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の記載については、例えば、Ｌａｋｓｏら、
１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２−
６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａ
ｎら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１−１３５５を参照のこと）
。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が導入遺伝子の発現を調節するために使用
される場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコード
する導入遺伝子を含む動物が、必要となる。このような動物は、例えば、２種の
トランスジェニック動物（一方は選択されたタンパク質をコードした導入遺伝子
を含み、他方はリコンビナーゼをコードした導入遺伝子を含む）を交配すること
による、「二重の」トランスジェニック動物の構築によって提供され得る。
【０１７６】 本明細書中に記載されるトランスジェニック非ヒト動物のクローンがまた、Ｗ
ｉｌｍｕｔら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３に記載される
方法に従って、産生され得る。簡単には、トランスジェニック動物由来の細胞（
例えば、体細胞）を、単離および誘導し、増殖サイクルから出し、そしてＧ0期
に入らせ得る。次いで、この静止細胞を、例えば、電気パルスの使用により、静
止細胞が単離される同種動物由来の、摘出された卵母細胞へ融合し得る。次いで
、この再構築された卵母細胞を培養し、これにより、これは桑実胚または未分化
胚芽細胞に発達し、次いで、偽妊娠雌性フォスター動物に移される。この雌性フ
ォスター動物の産生子孫は、この細胞（例えば、体細胞）が単離される動物のク
ローンである。
【０１７７】 （薬学的組成物） 本発明のＨＤＧＦＸ核酸分子、ＨＤＧＦＸタンパク質、および抗ＨＤＧＦＸ抗
体、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、アナログ、およびホモログは、本
明細書中で「活性化合物」といわれる。さらに、本発明のＨＤＧＦＸ核酸分子、
ＨＤＧＦＸタンパク質、および抗ＨＤＧＦＸ抗体、ならびにそれらの誘導体、フ
ラグメント、アナログ、およびホモログに結合するか、またはＨＤＧＦＸ核酸分
子、ＨＤＧＦＸタンパク質、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、アナログ
、およびホモログに共通して起因する薬学的アゴニストまたはアンタゴニスト応
答を誘導するかのいずれかである特性を有する低分子量の化合物をまた、本明細
書中で「活性化合物」または「治療剤」と呼ぶ。これらの治療剤は、被験体への
投与に適した薬学的組成物に組み込まれ得る。このような組成物は、代表的に、
核酸分子、タンパク質または抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。
【０１７８】 本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的な
投与に適合した、任意および全ての溶媒、分散液、コーティング、抗菌剤および
抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤（ｄｅｌａｙｉｎｇ ａｇｅｎｔ）などを含
むことが意図される。適切なキャリアは、当該分野における標準的な参考書であ
る、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｓの最新版（本明細書中で参考として援用される）に記載される。このようなキ
ャリアまたは賦形薬の好ましい例としては、水、生理食塩水、フィンガー溶液、
デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンを含むが、これらに限定さ
れない。リポソームおよび非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油）はまた、使用
され得る。薬学的に活性物質である、このような媒体および薬剤の使用は、当該
分野で周知である。この活性化合物と不適合性である任意の従来の媒体または薬
剤の範囲を除いて、組成物におけるその使用は、意図される。補足的な活性化合
物はまた、この組成物に組み込まれ得る。
【０１７９】 本発明の薬学的組成物は、その意図される投与の経路と適合可能に処方される
。投与経路の例としては、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下）、経口（例え
ば、吸入）、経皮的（すなわち、局所的）、粘膜を越えて、および直腸投与が挙
げられる。非経口、皮内、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液
としては、以下の成分が挙げられ得る：滅菌賦形薬（注射のための水、生理食塩
水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコ
ールまたは他の合成溶媒）；抗菌性剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチ
ルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム）
；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；緩衝液（例え
ば、アセテート、シトラートまたはホスフェート）；および張度の調整のための
薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。ｐＨは、酸または塩基
（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）を用いて調整され得る。非経口調製物
は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量
バイアルに封入され得る。
【０１８０】 注射使用に適した薬学的組成物は、滅菌の水溶液（ここで、水溶性）または分
散液および滅菌注射可能な溶液または分散液の即席調製のための滅菌粉末を含む
。静脈内投与について、適切なキャリアには、生理食塩水、静菌性水、Ｃｒｅｍ
ｏｐｈｏｒ ＥＬTM（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン
酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は
、滅菌性であるべきであり、そして容易な注入性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔ
ｙ）が存在する程度に流動的であるべきである。これは、製造および保存の条件
下で安定でなければならず、そして、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に
対して維持されるべきである。このキャリアは、例えば、以下を含む溶媒または
分散媒体であり得る：例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロ
ール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）ならび
にそれらの適切な混合物。適切な流動性が、例えば、レシチンなどのコーティン
グの使用によって、分散に関しては、要求される粒子サイズを維持することによ
って、および界面活性剤を使用することによって維持され得る。微生物の作用の
予防は、種々の抗菌および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フ
ェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの
場合、組成物中に等張剤（例えば、糖、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソル
ビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注射
可能組成物の長期の吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、アルミニウムモノス
テアレートおよびゼラチン）を組成物に含ませることによってもたらされ得る。
【０１８１】 滅菌注射可能溶液は、必要量のこの活性化合物（例えば、ＨＤＧＦＸタンパク
質あるいは抗ＨＤＧＦＸ抗体）を、適切な溶媒中に、上記で列挙される成分の１
つまたは組み合わせと共に組み込み、必要な場合、続いて濾過滅菌することによ
って調製され得る。一般的に、分散液は、活性化合物を、基本分散媒体および上
記で列挙される成分から必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中へ組み込む
ことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合にお
いて、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、活性成分およ
び予め滅菌濾過されたその溶液からの任意のさらなる所望の成分の粉末を得る。
【０１８２】 経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。これらは
、ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤へ圧縮され得る。経口治療投
与の目的のために、この活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得、そして錠
剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、
マウスウォッシュ（ｍｏｕｔｈｗａｓｈ）としての使用のために流体キャリアを
使用して調製され得、ここで、この流体キャリア中のこの化合物は、経口的に適
用され、そして素早く動かされ（スイッシュ）（ｓｗｉｓｈ）、そして吐き出さ
れるか、または飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュ
バント材料が、この組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、
トローチ剤などが、以下のいずれかの成分または同様の性質を有する化合物を含
み得る：結合剤（例えば、微結晶セルロース、ガムトラガントまたはゼラチン）
；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸
）、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチ；滑沢剤（例えば、ステアリン酸
マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ）；グライダント（ｇｌｉｄａｎｔ）（例
えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリ
ン）；あるいは香味剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレ
ンジフレーバー）。
【０１８３】 吸入による投与について、この化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素
のような気体）を含む圧縮容器またはディスペンサー、あるいは噴霧器から、エ
アロゾルスプレーの形態で送達される。
【０１８４】 全身的投与はまた、経粘膜手段または経皮手段により得る。経粘膜投与または
経皮投与について、浸透されるバリアに対して適切な浸透剤が、処方において使
用される。このような浸透剤は、一般的に、当該分野で公知であり、そして、例
えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体
が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤によって達成され得る。経
皮投与については、この活性化合物は、当該分野で一般的に公知である軟膏剤、
軟膏、ゲル、またはクリーム剤へ処方される。
【０１８５】 この化合物はまた、直腸送達のための坐剤の使用（例えば、ココアバターおよ
び他のグリセリドのような従来の坐剤ベースと共に）または保持浣腸の形態で調
製され得る。
【０１８６】 １つの実施形態において、この活性化合物は、身体からの迅速な排出に対して
この化合物を保護するキャリアを用いて調製され（例えば、制御放出処方物）、
これには、移植片およびマイクロカプセル化された送達系が挙げられる。酢酸エ
チレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステ
ル、およびポリ乳酸のような、生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。
このような処方物の調製のための方法は、当該業者には明らかである。これらの
材料はまた、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎｏｖａ Ｐｈａｒ
ｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能である。リポソーム懸
濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を含む、感染させた細胞へ標的
化されるリポソームを含む）がまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用さ
れ得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるよう
な、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０１８７】 徐放性調製物は、調製され得る。徐放性調製物の適切な例としては、抗体を含
有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックス
は、成形された粒子（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態である
。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ
（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））
、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸のコポ
リマーおよびエチル−Ｌ−グルタメート、非分解性エチレン−ビニルアセテート
、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴTM （乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドで構成される注入可能
なミクロスフェア）、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げら
れる。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマー
は、１００日を超えて分子の放出を可能にする一方で、特定のヒドロゲルは、よ
り短い期間でタンパク質を放出する。
【０１８８】 投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態で、経口組成物ま
たは非経口組成物を処方することが、特に有益である。本明細書で使用される投
薬単位形態は、処置される被験体のための単位投薬量として適切な、物理的に個
々の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと関連して、所望の治
療的効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単
位形態についての詳細は、この活性化合物の固有の特性、および達成される特定
の治療効果、ならびに個体の処置のためのこのような活性化合物を調合する当該
分野に固有の制限によって決定されるか、あるいはこれらに直接依存する。
【０１８９】 本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとし
て使用され得る。遺伝子治療ベクターは、被験体へ、任意の複数の経路（例えば
、米国特許第５，７０３，０５５号に記載される）に送達され得る。従って、送
達は、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照
のこと）または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１：３０５４−３０５７を参照のこと）が挙げられる。遺
伝子治療ベクターの薬学的調製物には、受容可能な希釈剤中の遺伝子治療ベクタ
ーが挙げられ得、または遺伝子送達ビヒクルが組み込まれる徐放性マトリックス
を含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが、組換え細胞からインタク
トで産生され得（例えば、レトロウイルスベクター）、この薬学的調製物は、遺
伝子送達系を産生する１以上の細胞を含み得る。
【０１９０】 薬学的組成物は、投与のための使用説明書をとともに、キット（例えば、容器
、包装、またはディスペンサー）に含まれ得る。
【０１９１】 ヒトの疾患に関与する症候群を処置するための薬剤の製造において、治療に使
用することはまた、本発明の範囲内であり、この疾患は、ＨＤＧＦＸ関連障害か
ら選択され、ここで、この治療は、ＨＤＧＦＸポリペプチド、ＨＤＧＦＸ核酸、
および抗ＨＤＧＦＸ抗体からなる群から選択される。
【０１９２】 （本発明のさらなる使用および方法） 種々のＨＤＧＦＸファミリメンバーは、新脈管形成、精子形成、平滑筋増殖お
よびニューロンの発達を含む。従って、このことは、これらの機能に関連する疾
患を処置または診断する際にＨＤＧＦＸの役割を示唆する。例えば、種々のＨＤ
ＧＦＸ癌、冠動脈疾患、関節炎、糖尿病網膜症、不妊症および種々の神経学的疾
患（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症および精
神医学的疾患）。
【０１９３】 腫瘍形成においてＨＤＧＦＸの潜在的役割は、以下を含み得る：腫瘍の増殖の
自己分泌刺激作用、ホルモンの独立、新脈管形成、転移の進行、化学療法抵抗性
、放射線抵抗性、第２組織部位微小環境に限定された栄養性因子での生存、なら
びに腫瘍細胞マトリクスの分解よび腫瘍細胞の転移（すなわち、腫瘍浸襲）の刺
激作用。
【０１９４】 本明細書中で記載される核酸分子、タンパク質、タンパク質相同体、および抗
体が、以下の１つ以上の方法において使用され得る：（ａ）スクリーニングアッ
セイ；（ｂ）検出アッセイ（例えば、染色体マッピング、組織タイピング、法医
学生物学）；（ｃ）予測医学（例えば、診断アッセイ、予後アッセイ、臨床試験
モニタリング、および薬理ゲノミックス）；ならびに（ｄ）処置の方法（例えば
、治療および予防）。
【０１９５】 本発明の単離された核酸分子は、以下にさらに説明されるように、ＨＤＧＦＸ
タンパク質（例えば、遺伝子治療用途における宿主細胞中の組換え発現ベクター
）を発現するため、ＨＤＧＦＸ ｍＲＮＡ（例えば、生物学的サンプルにおいて
）またはＨＤＧＦＸ遺伝子における遺伝子損傷を検出するため、ならびにＨＤＧ
ＦＸ活性を調節するために使用され得る。さらに、ＨＤＧＦＸタンパク質は、Ｈ
ＤＧＦＸ活性または発現を調節する薬物または化合物をスクリーニングするため
に、ならびにＨＤＧＦＸタンパク質の不十分なもしくは過剰な産生によって、あ
るいはＨＤＧＦＸ野生型タンパク質と比較して減少したもしくは異常な活性を有
するＨＤＧＦＸタンパク質形態の産生によって特徴付けられる障害（例えば、増
殖障害または分化障害）を処置するために使用され得る。さらに、本発明の抗Ｈ
ＤＧＦＸ抗体が、ＨＤＧＦＸタンパク質を検出して単離するため、およびＨＤＧ
ＦＸ活性を調節するために使用され得る。
【０１９６】 本発明は、さらに、上述のスクリーニングアッセイによって同定される新規の
薬剤、および本明細書中で記載されるような処置のためのそれらの使用に関する
。
【０１９７】 （スクリーニングアッセイ） 本発明は、調節因子、すなわち、ＨＤＧＦＸタンパク質に結合するか、あるい
は例えば、ＨＤＧＦＸ発現またはＨＤＧＦＸ活性に対して刺激効果または阻害効
果を有する、候補物または試験化合物もしくは試験薬剤（例えば、タンパク質、
ポリペプチド、核酸またはポリヌクレオチド、ペプチド、ペプチド模倣物、低分
子（アゴニストもしくはアンタゴニスト）または他の薬物）を同定するための方
法（本明細書中において「スクリーニングアッセイ」とも称される）を提供する
。ＨＤＧＦＸポリペプチドに結合し得る候補物または試験化合物もしくは試験薬
剤は、以下の分子量を有する：約５０Ｄａ、１００Ｄａ、１５０Ｄａ、３００Ｄ
ａ、３３０Ｄａ、３５０Ｄａ、４００Ｄａ、５００Ｄａ、７５０Ｄａ、１０００
Ｄａ、１２５０Ｄａ、１５００Ｄａ、１７５０Ｄａ、２０００Ｄａ、５０００Ｄ
ａ、１０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄ
ａ、１００，０００Ｄａまたは１００，０００Ｄａ以上。特定の実施形態におい
て、ＨＤＧＦＸポリペプチドと結合する候補物は、約１５００Ｄａ未満の分子量
を有する。
【０１９８】 機能的アッセイの詳細は、本明細書中で以下にさらに提供される。記載される
アッセイのいずれか、および薬理学、血液学、内科学、腫瘍学などの当業者に公
知のさらなるアッセイは、治療剤としてそれらの特性について候補物をスクリー
ニングするために使用され得る。記載されるが、本発明の治療剤は、タンパク質
、ポリペプチド、核酸またはポリヌクレオチド、ペプチド、ペプチド模倣物、低
分子（アゴニストもしくはアンタゴニストを含む）または本明細書中に記載され
る他の薬物を含む。
【０１９９】 １つの実施形態において、本発明は、ＨＤＧＦＸのタンパク質またはポリペプ
チド、あるいはその生物学的に活性な部分の膜結合形態に結合するか、またはそ
れら膜結合形態の活性を調節する、候補化合物もしくは試験化合物をスクリーニ
ングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において
公知のコンビナトリアルライブラリー法における任意の多数のアプローチを使用
して得られ得、これらのライブラリーには、以下が挙げられる：生物学的ライブ
ラリー；空間的にアクセス可能な平行固相もしくは溶液相ライブラリー；逆重畳
を要する合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびア
フィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的
ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのア
プローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは化合物の低分子ライブラ
リーに適用可能である（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ
Ｄｅｓｉｇｎ １２：１４５）。
【０２００】 分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば以下
に見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔ
ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ
ら（１９９４）Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ
Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９
９４）Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ３３：２０６１；およ
びＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３７：１２３３。
【０２０１】 化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２〜４２１）、あるいはビーズ上（Ｌ
ａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ
（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５〜５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ
米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ 米国特許第５，２３
３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａ
ｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上（Ｓｃ
ｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６〜３９０
；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉ
ｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．８
７：６３７８〜６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２
２２：３０１〜３１０；Ｌａｄｎｅｒ（上述））において示され得る。
【０２０２】 １つの実施形態において、アッセイは細胞ベースのアッセイであり、ここで、
膜結合形態のＨＤＧＦＸタンパク質、またはその生物学的に活性な部分を細胞表
面上に発現する細胞が、試験化合物と接触され、そしてこの試験化合物が、ＨＤ
ＧＦＸタンパク質に結合する能力が、決定される。例えば、細胞は、哺乳動物起
源または酵母細胞であり得る。この試験化合物がＨＤＧＦＸタンパク質に結合す
る能力の決定は、例えば、その試験化合物を放射性同位体標識または酵素標識と
カップリングさせて、その結果、この試験化合物のＨＤＧＦＸタンパク質または
その生物学的に活性な部分に対する結合が、複合体におけるその標識化合物を検
出することによって決定され得ることによって達成され得る。例えば、試験化合
物は、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ、または3Ｈで直接的または間接的のいずれかで標識さ
れ得、そしてその放射性同位体が、放射線放射の直接の計数により、またはシン
チレーション計数により、検出され得る。あるいは、試験化合物は、例えば、西
洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで
酵素的に標識され得、そしてこの酵素的標識が、適切な基質の生成物への転換を
決定することにより、検出され得る。１つの実施形態において、このアッセイは
、膜結合形態のＨＤＧＦＸタンパク質、またはその生物学的に活性な部分をその
細胞表面上に発現する細胞を、ＨＤＧＦＸと結合する公知の化合物と接触させて
、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物に試験化合物を接触させ
る工程、ならびにこの試験化合物がＨＤＧＦＸタンパク質と相互作用する能力を
決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＨＤＧＦＸタンパク質と相互
作用する能力を決定する工程が、この試験化合物が、公知の化合物と比較して、
ＨＤＧＦＸまたはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を決定する
工程を包含する。
【０２０３】 別の実施形態において、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、これは、
膜結合形態のＨＤＧＦＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面
上で発現する細胞を、試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物が
、ＨＤＧＦＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば
、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物が、Ｈ
ＤＧＦＸポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分の活性を調節する能力の
決定は、例えば、ＨＤＧＦＸタンパク質が、ＨＤＧＦＸ標的分子に結合またはこ
れら標的分子と相互作用する能力を決定することによって、達成され得る。本明
細書中において使用する場合には、「標的分子」とは、ＨＤＧＦＸタンパク質が
自然に結合または相互作用する分子であり、例えば、ＨＤＧＦＸタンパク質を発
現する細胞表面上の分子、第二の細胞表面上の分子、細胞外環境中の分子、細胞
膜の内部表面と会合する分子、または細胞質分子である。ＨＤＧＦＸ標的分子は
、非ＨＤＧＦＸ分子あるいは本発明のＨＤＧＦＸタンパク質またはポリペプチド
である。１つの実施形態において、ＨＤＧＦＸ標的分子は、シグナル伝達経路の
構成要素であり、これは、細胞膜を通って細胞内への細胞外シグナル（例えば、
化合物が膜結合ＨＤＧＦＸ分子に結合することにより発生するシグナル）の伝達
を促進する。その標的は、例えば、触媒活性を有する第二の細胞内タンパク質、
または下流シグナル分子のＨＤＧＦＸポリペプチドとの会合を容易にするタンパ
ク質であり得る。
【０２０４】 ＨＤＧＦＸタンパク質がＨＤＧＦＸ標的分子に結合するかまたはその標的分子
と相互作用する能力の決定は、直接的結合を決定するための上記方法の１つによ
り、達成され得る。１つの実施形態において、ＨＤＧＦＸタンパク質がＨＤＧＦ
Ｘ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相互作用する能力の決定は、その
標的分子の活性を決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の
活性は、その標的の細胞セカンドメッセンジャー（すなわち、細胞内Ｃａ2+、ジ
アシルグリセロール、ＩＰ3など）の誘導を検出すること、適切な基質への標的
の触媒活性／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー
（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする核酸に作動的に連結されたＨＤＧＦＸ
応答性調節エレメントを含む）の誘導を検出すること、または細胞応答（例えば
、細胞生存度、細胞分化、または細胞増殖）を検出することにより、決定され得
る。
【０２０５】 なお別の実施形態において、本発明のアッセイは、無細胞アッセイであり、Ｈ
ＤＧＦＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に試験化合物を接触させる
工程、ならびにその試験化合物がＨＤＧＦＸタンパク質またはその生物学的に活
性な部分と結合する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物のＨＤＧＦ
Ｘタンパク質への結合は、上記のように、直接的または間接的にかのいずれかで
決定され得る。１つの実施形態において、このアッセイは、ＨＤＧＦＸタンパク
質またはその生物学的に活性な部分に、ＨＤＧＦＸに結合する公知の化合物を接
触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物に試験化合物を
接触させる工程、ならびにその試験化合物がＨＤＧＦＸタンパク質と相互作用す
る能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＨＤＧＦＸタンパク
質と相互作用する能力を決定する工程は、この試験化合物が、公知の化合物と比
較して、ＨＤＧＦＸまたはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を
決定する工程を包含する。
【０２０６】 別の実施形態において、アッセイは、無細胞アッセイであり、ＨＤＧＦＸタン
パク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させる工程、ならび
にその試験化合物がＨＤＧＦＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活
性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この
試験化合物がＨＤＧＦＸポリペプチドの活性を調節する能力の決定は、例えば、
ＨＤＧＦＸタンパク質が、ＨＤＧＦＸ標的分子に結合する能力を、直接的結合の
決定のための上記方法の１つによって決定することにより、達成され得る。代替
の実施形態において、この試験化合物がＨＤＧＦＸポリペプチドの活性を調節す
る能力の決定は、ＨＤＧＦＸタンパク質が、ＨＤＧＦＸ標的分子をさらに調節す
る能力を決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の適切な基
質に対する触媒活性／酵素活性は、上に記載のように決定され得る。
【０２０７】 なお別の実施形態において、無細胞アッセイは、ＨＤＧＦＸタンパク質または
その生物学的に活性な部分に、ＨＤＧＦＸポリペプチドに結合する公知の化合物
を接触させてアッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物
と接触させる工程、およびこの試験化合物がＨＤＧＦＸタンパク質と相互作用す
る能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＨＤＧＦＸタンパク
質と相互作用する能力の決定は、ＨＤＧＦＸタンパク質が、ＨＤＧＦＸ標的分子
と優先的に結合するか、またはその標的分子の活性を優先的に調節する能力を決
定する工程を包含する。
【０２０８】 本発明の無細胞アッセイは、ＨＤＧＦＸポリペプチドの可溶性形態または膜結
合形態の両方の使用に受け入れられる。膜結合形態のＨＤＧＦＸポリペプチドを
含む無細胞アッセイの場合には、膜結合形態のＨＤＧＦＸポリペプチドが溶液中
に維持されるように、可溶化剤を利用することが望ましくあり得る。このような
可溶化剤の例には、非イオン性界面活性剤が挙げられ、例えば、ｎ−オクチルグ
ルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−
Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登
録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登
録商標）、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）n（Ｉｓｏｔｒ
ｉｄｅｃｙｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｅｔｈｅｒ）n）、Ｎ
−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、
３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート
（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉ
ｏｌ−１−ｐｒｏｐａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳ）、または３−
（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパン
スルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌ
ａｍｍｉｎｉｏｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａ
ｔｅ）（ＣＨＡＰＳＯ）である。
【０２０９】 ＨＤＧＦＸポリペプチドまたはその標的分子のいずれかを固定して、そのタン
パク質の一方または両方の非複合体化形態からの複合体化形態の分離を促進し、
そしてそのアッセイの自動化に適用させることが、望ましくあり得る。試験化合
物のＨＤＧＦＸポリペプチドへの結合、または候補化合物の存在下および非存在
下でのＨＤＧＦＸポリペプチドの標的分子との相互作用は、これらの反応物を収
容するために適切な任意の容器内で、達成され得る。このような容器の例には、
マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。１つの実
施形態において、そのタンパク質の一方または両方がマトリックスに結合するこ
とを可能にするドメインを付加する融合タンパク質が、提供され得る。例えば、
ＧＳＴ−ＨＤＧＦＸポリペプチド融合タンパク質またはＧＳＴ標的融合タンパク
質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ
．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上
に吸着され得、次いで、これらは、試験化合物と合わせられるか、あるいは試験
化合物および非吸着の標的タンパク質またはＨＤＧＦＸタンパク質のいずれかと
合わせられ、そしてこの混合物が、複合体形成に貢献する条件下（例えば、塩お
よびｐＨに関して生理学的条件）でインキュベートされる。インキュベーション
に続いて、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、結合して
いないあらゆる成分を除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定し、例えば
、上記のように、複合体を直接的または間接的のいずれかで決定する。あるいは
、複合体がマトリックスから解離され得、そしてＨＤＧＦＸの結合レベルまたは
活性レベルを、標準的な技術を使用して決定し得る。
【０２１０】 タンパク質をマトリックス上に固定するための他の技術もまた、本発明のスク
リーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、ＨＤＧＦＸポリペプチドま
たはその標的分子のいずれかが、ビオチンとストレプトアビジンとの結合体化を
利用して固定され得る。ビオチン化されたＨＤＧＦＸタンパク質または標的分子
は、当該分野において周知の技術を使用して、ビオチンＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミド）から調製され得（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）、そしてストレプトアビジ
ン被覆した９６ウェルのプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェル
に固定され得る。あるいは、ＨＤＧＦＸタンパク質または標的分子と反応性であ
るが、ＨＤＧＦＸタンパク質のその標的分子への結合を妨害しない抗体が、その
プレートのウェルに誘導体化され得、そして結合していない標的またはＨＤＧＦ
Ｘタンパク質が、抗体の結合体化によってウェル内にトラップされ得る。このよ
うな複合体を検出するための方法には、ＧＳＴ固定複合体に関しての上記のもの
に加えて、ＨＤＧＦＸタンパク質または標的分子と反応性の抗体を使用する複合
体の免疫検出、ならびにＨＤＧＦＸタンパク質または標的分子に関する酵素活性
の検出に依存する酵素結合アッセイが挙げられる。
【０２１１】 別の実施形態において、ＨＤＧＦＸの発現のモジュレーターは、細胞が候補化
合物と接触され、そして細胞中におけるＨＤＧＦＸのｍＲＮＡまたはタンパク質
の発現が決定される方法で同定される。候補化合物の存在下での、ＨＤＧＦＸの
ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルは、候補化合物不在下でのＨＤＧＦＸ
のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルと比較される。次いで、候補化合物
は、この比較に基づいて、ＨＤＧＦＸの発現のモジュレーターとして同定され得
る。例えば、ＨＤＧＦＸのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の存
在下で、その候補化合物が不在下よりも大きい（統計的に有意に大きい）場合、
この候補化合物は、ＨＤＧＦＸのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の刺激因子と
して同定される。あるいは、ＨＤＧＦＸのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、
候補化合物の存在下でその候補化合物の不在下よりも小さい（統計的に有意に小
さい）場合、この候補化合物は、ＨＤＧＦＸのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現
のインヒビターとして同定される。細胞中におけるＨＤＧＦＸのｍＲＮＡまたは
タンパク質の発現のレベルは、ＨＤＧＦＸのｍＲＮＡまたはタンパク質を検出す
るための本明細書中に記載される方法によって決定され得る。
【０２１２】 本発明のなお別の局面において、ＨＤＧＦＸタンパク質は、ツーハイブリッド
アッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおける「ベイト（ｂａｉｔ）タン
パク質」として使用され得（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒ
ｖｏｓら、（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら、（
１９９３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒ
ｔｅｌら、（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４；
Ｉｗａｂｕｃｈｉら、（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６
；およびＢｒｅｎｔ ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）、ＨＤＧＦＸと結合
するかまたは相互作用するタンパク質（「ＨＤＧＦＸ結合タンパク質」または「
ＨＤＧＦＸ−ｂｐ」）、ならびにＨＤＧＦＸの活性を調節する他のタンパク質を
同定する。このようなＨＤＧＦＸ結合タンパク質はまた、例えば、ＨＤＧＦＸ経
路の上流または下流のエレメントとして、ＨＤＧＦＸタンパク質によるシグナル
の伝播に関与するようである。
【０２１３】 ツーハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ド
メインからなる、大部分の転写因子の調節（ｍｏｄｕｌａｒ）性質に基づく。手
短には、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を使用する。１つの構築物
において、ＨＤＧＦＸをコードする遺伝子は、公知の転写因子（例えば、ＧＡＬ
−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他方の構築物に
おいて、ＤＮＡ配列のライブラリー由来の、未同定タンパク質（「プレイ（ｐｒ
ｅｙ）」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列は、公知の転写因子の活
性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「ベイト」および「プレイ」タ
ンパク質がインビボで相互作用し得る場合、ＨＤＧＦＸ依存複合体を形成して、
転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインが、密接に近接される。こ
の近接は、転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結されるレポーター
遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現が検
出され得、そしてこの機能性転写因子を含む細胞コロニーを単離および使用して
、ＨＤＧＦＸと相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を獲得し
得る。
【０２１４】 スクリーニングはまた、インビボで実施され得る。例えば、１つの実施形態に
おいて、本発明は、試験化合物をＨＤＧＦＸ関連障害の危険性が増加した試験動
物に投与することによる、ＨＤＧＣＸ関連障害の活性または潜伏もしくは素因の
モジュレーターをスクリーニングするための方法を含む。いくつかの実施形態に
おいて、試験動物は、ＨＤＧＣＸポリペプチドを組換え的に発現する。化合物の
投与後の試験動物におけるこのポリペプチドの活性が測定され、そして試験動物
におけるこのタンパク質の活性が、このポリペプチドを投与されなかったコント
ロール動物におけるこのポリペプチドの活性と比較される。コントロール動物に
対するこの試験動物におけるこのポリペプチドの活性の変化は、この試験化合物
が、ＨＤＧＦＸ関連障害の潜伏または素因のモジュレーターであることを示す。
【０２１５】 いくつかの実施形態において、試験動物は、試験タンパク質導入遺伝子を発現
するか、または野生型試験動物と比較して増加したレベルでプロモーターの制御
下で導入遺伝子を発現する、組換え試験動物である。好ましくは、プロモーター
は、導入遺伝子のネイティブな遺伝子プロモーターではない。
【０２１６】 本発明は、さらに、上記スクリーニングアッセイによって同定される新規試薬
および本明細書中に記載される処置のためのこれらの使用に関する。
【０２１７】 （検出アッセイ） 本明細書中で同定されるｃＤＮＡ配列の部分またはフラグメント（および対応
する完全遺伝子配列）は、ポリヌクレオチド試薬として多くの方法で使用され得
る。例えば、これらの配列は、（ｉ）それぞれの遺伝子を染色体上にマッピング
し；それによって遺伝病に関連する遺伝子領域を位置決めする；（ｉｉ）微小な
生物学的サンプルから個体を同定する（組織型決定）；そして（ｉｉｉ）生物学
的サンプルの法医学的同定における補助のために使用され得る。
【０２１８】 本発明のＨＤＧＦＸ配列はまた、わずかな生物学的サンプルから個体を識別す
るために使用され得る。この技術において、個体のゲノムＤＮＡは、１つ以上の
制限酵素で消化され、そして同定のために独特のバンドを生成するためにサザン
ブロット上でプローブされる。本発明の配列は、ＲＦＬＰ（米国特許第５，２７
２，０５７号に記載の「制限フラグメント長多型」）のためのさらなるＤＮＡマ
ーカーとして有用である。
【０２１９】 さらに、本発明の配列を用いて、個体のゲノムの選択された部分について実際
の塩基ごとにＤＮＡ配列を決定する代替的技術を提供し得る。従って、本明細書
中に記載のＨＤＧＦＸ配列を用いて、配列の５’末端および３’末端から２つの
ＰＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これらのプライマーを使用して、個体
のＤＮＡを増幅し得、引き続いて、配列決定し得る。
【０２２０】 このように調製された個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、各個体が、
対立遺伝子差異に起因するこのようなＤＮＡ配列の独特のセットを有するので、
唯一の個体識別を提供し得る。本発明の配列は、個体由来および組織由来の配列
のこのような識別を得るために使用され得る。本発明のＨＤＧＦＸ配列は、ヒト
ゲノムの部分を独特に表す。対立遺伝子変異は、これらの配列のコード領域にお
いてある程度生じ、そして非コード領域においてより大きな程度に生じる。個々
のヒト間での対立遺伝子変異は、各５００塩基につき約１回の頻度で生じると見
積もられる。対立遺伝子変異の多くは、制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）を
含む単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）に起因する。
【０２２１】 本明細書中で記載の配列の各々は、ある程度、標準物質（これに対して個体か
らのＤＮＡが識別の目的で比較され得る）として使用され得る。より多くの多型
が非コード領域で生じるので、個体を区別するために、それほど多くの配列が必
要であるわけではない。配列番号１の非コード配列は、上記のように、おそらく
１０〜１，０００プライマーのパネルを用いてポジティブな個体識別を不自由な
く提供し得る。これらのプライマーは、各々が１００塩基の増幅された非コード
配列を生じる。推定コード配列が使用される場合、ポジティブな個体識別に関す
るプライマーのより適切な数は、５００〜２，０００である。
【０２２２】 （法医学的生物学におけるＨＤＧＦＸ配列の使用） ＨＤＧＦＸの核酸配列またはポリペプチド配列に基づく、ＤＮＡに基づく識別
技術はまた、法医学的生物学において使用され得る。法医学的生物学は、例えば
、犯罪者をポジティブに識別するための手段として、犯罪現場で見いだされた生
物学的証拠の遺伝子型決定を利用する科学分野である。このような識別を行うた
めに、ＰＣＲ技術を用いて非常に少量の生物学的サンプル（例えば、犯罪現場で
見いだされた毛髪もしくは皮膚のような組織、または血液、唾液もしくは精液の
ような体液）から得られたＤＮＡ配列を増幅し得る。次いで、増幅された配列は
標準物質と比較され、それによって、生物学的サンプルの起源の識別を可能にし
得る。
【０２２３】 本発明の配列を使用して、ヒトゲノムにおける特定の遺伝子座に標的化される
ポリヌクレオチド試薬（例えば、ＰＣＲプライマー）を提供し得る。このＰＣＲ
プライマーは、例えば、別の「識別マーカー」（すなわち、特定の個体に独特な
別のＤＮＡ配列）を提供することにより、ＤＮＡベースの法医学的識別の信頼性
を増大し得る。上記のように、実際の塩基配列情報は、制限酵素で生成したフラ
グメントにより形成されるパターンに対する正確な代替手段として識別のために
使用され得る。配列番号１の非コード領域に標的化される配列は、より多くの多
型が非コード領域に生じ、このことにより、この技術を使用して個体を区別する
ことがより容易になるので、この用途のために特に適切である。ポリヌクレオチ
ド試薬の例としては、ＨＤＧＦＸ配列またはその部分（例えば、配列番号１の非
コード領域に由来するフラグメント）が挙げられ、この部分は、少なくとも２０
塩基、好ましくは少なくとも３０塩基の長さを有する。
【０２２４】 本明細書中に記載のＨＤＧＦＸ配列は、ポリヌクレオチド試薬（例えば、イン
サイチュハイブリダイゼーション技術において使用され得る標識プローブまたは
標識可能プローブ）を提供して、特定の組織（例えば、脳組織など）を同定する
ためにさらに使用され得る。これは、法医学的病理学者に未知の起源の組織が提
示された場合に非常に有用であり得る。このようなＨＤＧＦＸプローブのパネル
を使用して、種により、および／または起源の型により組織を同定し得る。
【０２２５】 類似の様式で、これらの試薬（例えば、ＨＤＧＦＸプライマーまたはプローブ
）を用いて、組織培養物を夾雑物質についてスクリーニングし得る（すなわち、
培養物中の異なる型の細胞の混在についてのスクリーニング）。
【０２２６】 （予測医療） 本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノム学（ｐｈａｒｍａｃ
ｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）およびモニタリング臨床試験が、予後（予測）の目的に使
用され、これによって個体を予防的に処置する、予測医療の分野に関する。従っ
て、本発明の１つの局面は、ＨＤＧＦＸタンパク質および／または核酸の発現、
ならびにＨＤＧＦＸの活性を、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、
組織）の関連で決定し、これによって、個体が、異常なＨＤＧＦＸの発現または
活性に関連する疾患または障害に罹患するかどうか、あるいは障害を発症するリ
スクがあるかどうかを決定するするための診断アッセイに関する。本発明はまた
、個体が、ＨＤＧＦＸのタンパク質、核酸の発現または活性と関連した障害を発
症するリスクがあるかどうかを決定するための予後的（または予測的）アッセイ
を提供する。例えば、ＨＤＧＦＸの遺伝子における変異が、生物学的サンプルに
おいてアッセイされ得る。このようなアッセイは、予後的または予測的な目的に
使用され得、これによってＨＤＧＦＸのタンパク質、核酸の発現または活性によ
って特徴付けられるかまたは関連した障害の発病の前に個体を予防的に処置する
。
【０２２７】 本発明の別の局面は、個体におけるＨＤＧＦＸのタンパク質、核酸の発現ある
いはＨＤＧＦＸの活性を決定するための方法を提供し、これによって、その個体
についての適切な治療的または予防的薬剤（本明細書において「薬理ゲノム学」
とよばれる）を選択する。薬理ゲノム学は、個体の遺伝型（例えば、特定の薬剤
に対して応答する個体の能力を決定するために試験された個体の遺伝型）に基づ
いて個体の治療的または予防的処置のための薬剤（例えば、薬物）の選択を可能
にする。
【０２２８】 本発明のなお別の局面は、臨床試験におけるＨＤＧＦＸの発現または活性に対
する薬剤（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることに関する。
【０２２９】 これらおよび他の薬剤は、以下の節でさらに詳細に記載される。
【０２３０】 （診断アッセイ） 細胞の増殖が役割を果たす他の状態としては、腫瘍、再狭窄、乾癬、デュプュ
イトラン拘縮、糖尿病合併症、カポージ肉腫および慢性関節リウマチが挙げられ
る。
【０２３１】 ＨＤＧＦＸポリペプチドを使用して、サンプルまたは組織と相互作用するポリ
ペプチドを同定し得る。この方法は、サンプルまたは組織をＨＤＧＦＸと接触さ
せる工程、ＨＤＧＦＸポリペプチドと、相互作用するポリペプチドとの間で複合
体を形成させる工程、および存在する場合には、この複合体を検出する工程を包
含する。
【０２３２】 本発明のタンパク質を使用して、このタンパク質を特異的に結合する抗体の産
生を刺激し得る。このような抗体は、サンプル中のタンパク質の発生を検出する
ための免疫診断手順において、使用され得る。本発明のタンパク質を使用して、
細胞の増殖が好ましい状態において、細胞の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および細胞の
増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を刺激し得る。一例は、例えば、造血およ
び血小板形成、胃腸管の管壁、ならびに毛包に対する化学療法剤の毒性副作用を
阻害することである。これらはまた、例えばアルツハイマー病を含む神経学的障
害における、新たな細胞増殖を刺激するために使用され得る。あるいは、拮抗処
置剤が投与され得、ここで、本発明のＨＤＧＦＸ様タンパク質を特異的に結合す
る抗体が、このタンパク質の特異的増殖誘導効果を阻止する。このような抗体は
、例えば、種々の腫瘍および良性過形成を含む増殖性障害の処置において、有用
であり得る。
【０２３３】 配列番号１のＨＤＧＦＸ核酸のいずれかの一部分に対応するポリヌクレオチド
またはオリゴヌクレオチドを使用して、対応するＯＲＦ遺伝子を含むＤＮＡを検
出し得るか、または対応するＨＤＧＦＸ遺伝子もしくはＨＤＧＦＸ様遺伝子の発
現を検出し得る。例えば、表３に見られるように、特定の細胞または組織におい
て発現されるＨＤＧＦＸ核酸を使用して、その特定の細胞型の存在を同定し得る
。
【０２３４】 生物学的サンプルにおけるＨＤＧＦＸポリペプチドの存在または非存在を検出
するための例示的な方法は、試験被験体から生物学的サンプルを得る工程、およ
びその生物学的サンプルをＨＤＧＦＸタンパク質またはＨＤＧＦＸタンパク質を
コードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出し得る化合物もしく
は薬剤とを接触させ、その結果、ＨＤＧＦＸポリペプチドの存在が、その生物学
的サンプルにおいて検出される、工程を包含する。ＨＤＧＦＸのｍＲＮＡもしく
はゲノムＤＮＡを検出するための薬剤は、ＨＤＧＦＸのｍＲＮＡもしくはゲノム
ＤＮＡにハイブリダイズし得る、標識された核酸プローブである。この核酸プロ
ーブは、例えば、全長のＨＤＧＦＸ核酸（例えば、配列番号１もしくはその部分
の核酸（例えば、少なくとも、１５、３０、５０、１００、２５０もしくは５０
０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、上記のように、ストリンジェン
トな条件下でＨＤＧＦＸのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイ
ズするに十分である核酸））であり得る。本発明の診断アッセイにおける使用の
ための他の適切なプローブは本明細書において記載されている。
【０２３５】 ＨＤＧＦＸタンパク質を検出するための薬剤は、ＨＤＧＦＸタンパク質に結合
し得る抗体であり、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、
ポリクローナルであり得るか、またはより好ましくはモノクローナル抗体であり
得る。インタクトな抗体またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａ
ｂ’）2）が使用され得る。用語「標識（された）」とは、プローブまたは抗体
に関して、検出可能な物質をそのプローブもしくは抗体にカップリングさせる（
すなわち、物理的に連結する）ことによって、そのプローブまたは抗体を直接標
識すること、ならびに、直接標識される別の試薬との反応性によって、そのプロ
ーブもしくは抗体の間接的に標識をすることを包含することが意図される。間接
的な標識の例としては、蛍光標識された二次抗体を用いた一次抗体の検出、およ
び蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて検出され得るようにＤＮＡプロー
ブのビオチンを用いた末端標識が挙げられる。用語「生物学的サンプル」とは、
被験体から単離された、組織、細胞および生物学的流体ならびに被験体に存在す
る組織、細胞および流体を含むことが意図される。すなわち、本発明の検出方法
を用いて、ＨＤＧＦＸのｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを、生物学的
サンプル中で、インビトロおよびインビボで検出し得る。例えば、ＨＤＧＦＸ
ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーシ
ョンおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。ＨＤＧＦＸタン
パク質の検出のためのインビトロ技術としては、酵素連結免疫吸着アッセイ（Ｅ
ＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光が挙げられる。ＨＤ
ＧＦＸゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリ
ダイゼーションが挙げられる。さらに、ＨＤＧＦＸタンパク質の検出のためのイ
ンビボ技術としては、標識された抗ＨＤＧＦＸ抗体を被験体に導入することが挙
げられる。例えば、その抗体は、放射性マーカーを用いて標識され得る。この被
験体における放射性マーカーの存在および位置は、標準的な画像化技術によって
検出され得る。
【０２３６】 １つの実施形態において、この生物学的サンプルは、その試験被験体からのタ
ンパク質分子を含む。あるいは、その生物学的サンプルは、その試験被験体から
のｍＲＮＡ分子またはその試験被験体からのゲノムＤＮＡ分子を含み得る。好ま
しい生物学的サンプルは、被験体から従来の手段によって単離された末梢血白血
球サンプルである。
【０２３７】 別の実施形態において、本発明の方法はさらに、コントロール被験体からコン
トロール生物学的サンプルを得る工程、そのコントロールサンプルを、ＨＤＧＦ
Ｘのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡを検出し得る化合物もしくは薬
剤と接触させ、その結果、ＨＤＧＦＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤ
ＮＡの存在がその生物学的サンプルにおいて検出される、工程、およびそのコン
トロールサンプルにおけるＨＤＧＦＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤ
ＮＡの存在と、その試験サンプルにおけるＨＤＧＦＸのタンパク質、ｍＲＮＡも
しくはゲノムＤＮＡの存在とを比較する工程を包含する。
【０２３８】 本発明はまた、生物学的サンプルにおけるＨＤＧＦＸポリペプチドの存在を検
出するためのキットを包含する。例えば、このキットは、以下を備え得る：生物
学的サンプルにおいてＨＤＧＦＸのタンパク質またはｍＲＮＡを検出し得る、標
識された化合物もしくは薬剤；そのサンプルにおけるＨＤＧＦＸポリペプチドの
量を決定するための手段；およびそのサンプルにおけるＨＤＧＦＸポリペプチド
の量を、標準と比較するための手段。この化合物または薬剤は、適切な容器内に
包装され得る。このキットは、さらに、ＨＤＧＦＸタンパク質または核酸を検出
するためにキットを用いるための説明書を備え得る。
【０２３９】 （予後アッセイ） 本明細書において記載された診断方法をさらに利用して、ＨＤＧＦＸポリペプ
チドの異常発現または異常活性に関連した疾患もしくは障害を有するか、または
その発症の危険にある被験体を同定し得る。例えば、本明細書に記載されるアッ
セイ（例えば、上述の診断アッセイまたは下記のアッセイ）を利用して、ＨＤＧ
ＦＸのタンパク質、核酸の発現または活性に関連する障害（例えば、増殖性また
は分化性の障害（例えば、過形成、腫瘍、再狭窄、乾癬、アルツハイマー病など
））を有するかまたはその発症の危険にある被験体を同定し得る。あるいは、こ
の予後アッセイを利用して、疾患または障害を有するかまたはその発症の危険に
ある被験体を同定し得る。従って、本発明は、ＨＤＧＦＸの異常発現または異常
活性に関連する疾患もしくは障害を同定するための方法を提供する。ここで、試
験サンプルは、被験体から得られ、そしてＨＤＧＦＸのタンパク質または核酸（
例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）が検出され、ここで、ＨＤＧＦＸのタンパク
質または核酸の存在は、ＨＤＧＦＸの異常発現または異常活性に関連する疾患ま
たは障害を有するかまたはその発症の危険にある被験体についての診断指標であ
る。本明細書において使用される「試験サンプル」とは、目的の被験体から得ら
れた生物学的サンプルをいう。例えば、試験サンプルは、生物学的流体（例えば
、血清）、細胞サンプル、または組織であり得る。
【０２４０】 さらに、本明細書に記載される予後アッセイを使用して、被験体に薬剤（例え
ば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核
酸、低分子、または他の薬物候補）を投与してＨＤＧＦＸの異常発現または異常
活性に関連する疾患または障害を処置され得るか否かを、決定し得る。例えば、
このような方法を使用して、被験体が、増殖性障害、分化性障害、神経膠関連障
害などののような障害のための薬剤を用いて効果的に処置され得るか否かを決定
し得る。従って、本発明は、ＨＤＧＦＸの異常発現または異常活性に関連する障
害についての薬剤を用いて、被験体が有効に処置され得るか否かを決定するため
の方法を提供する。ここで、試験サンプルが得られ、そしてＨＤＧＦＸのタンパ
ク質または核酸が検出される（例えば、ここで、ＨＤＧＦＸのタンパク質または
核酸の存在は、この薬剤を投与してＨＤＧＦＸの異常発現または異常活性に関連
する障害を処置され得る被験体についての、診断指標である）。
【０２４１】 本発明の方法はまた、ＨＤＧＦＸ遺伝子における遺伝的損傷を検出し、それに
よって、その損傷遺伝子を有する被験体が、増殖性障害、分化性障害、神経膠関
連障害などについての危険にあるかその障害に罹患しているかを決定するために
も使用され得る。種々の実施形態において、この方法は、その被験体からの細胞
のサンプルにおいて、ＨＤＧＦＸタンパク質をコードする遺伝子の統合性に影響
を与える変更の少なくとも１つによって特徴付けられる遺伝的損傷の存在または
非存在、あるいはＨＤＧＦＸ遺伝子の誤発現を検出する工程を包含する。例えば
、そのような遺伝的損傷は、以下の少なくとも１つの存在を確認することによっ
て検出され得る：（１）ＨＤＧＦＸ遺伝子からの１つ以上のヌクレオチドの欠失
；（２）ＨＤＧＦＸ遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの付加；（３）ＨＤＧＦ
Ｘ遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの置換、（４）ＨＤＧＦＸ遺伝子の染色体再
配置；（５）ＨＤＧＦＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルにおける
変更、（６）ＨＤＧＦＸ遺伝子の異常改変（例えば、ゲノムＤＮＡのメチル化パ
ターンの異常改変）、（７）ＨＤＧＦＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の
非野生型スプライシングパターンの存在、（８）ＨＤＧＦＸタンパク質の非野生
型レベル、（９）ＨＤＧＦＸ遺伝子の対立遺伝子の欠失、ならびに（１０）ＨＤ
ＧＦＸタンパク質の不適切な翻訳後修飾。本明細書において記載されるように、
当該分野において、ＨＤＧＦＸ遺伝子における損傷を検出するために使用され得
る、多数の公知のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的サンプルは、従来
手段によって被験体から単離された末梢血白血球サンプルである。しかし、有核
細胞を含む任意の生物学的サンプルが使用され得、これには、例えば、頬粘膜細
胞が挙げられる。
【０２４２】 特定の実施形態において、損傷の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（
例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同４，６８３，２０２号を参照
のこと）（例えば、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲ）、あるいは、連結
連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら（１９９４）ＰＮ
ＡＳ ９１：３６０−３６４を参照のこと）におけるプローブ／プライマーの使
用を包含する。後者は、ＨＤＧＦＸ遺伝子における点変異を検出するために特に
有用であり得る（Ａｂｒａｖａｙａら（１９９５）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ ２３：６７５−６８２を参照のこと）。この方法は、患者から細胞のサンプ
ルを収集する工程、核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたはその両方）をそのサ
ンプルの細胞から単離する工程、ＨＤＧＦＸの遺伝子に特異的にハイブリダイズ
する１つ以上のプライマーとその核酸サンプルとを、ＨＤＧＦＸ遺伝子（存在す
る場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で、接触さ
せる工程、ならびに増幅産物の存在もしくは非存在を検出する工程、またはその
増幅産物の大きさを検出する工程およびその大きさをコントロールサンプルと比
較する工程を包含し得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書に記載され
る変異を検出するために使用される技術のいずれかとともに予備的増幅工程とし
て使用されるために所望され得ることが予想される。
【０２４３】 代替的な増幅方法としては、以下が挙げられる：自己維持配列複製（Ｇｕａｔ
ｅｌｌｉら、１９９０、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７
：１８７４−１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ、ら、１９８９、Ｐｒｏｃ Ｎ
ａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−βレプ
リカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１
１９７）、または他の任意の核酸増幅方法、それに続く、当業者に周知な技術を
用いた、その増幅された分子の検出。これらの検出スキームは、そのような核酸
分子が非常に極少数で存在する場合に、そのような核酸分子の検出のために特に
有用である。
【０２４４】 代替の実施形態において、サンプル細胞からのＨＤＧＦＸ遺伝子における変異
は、制限酵素切断パターンにおける変更によって同定され得る。例えば、サンプ
ルおよびコントロールのＤＮＡが単離され、増幅され（必要に応じて）、１つ以
上の制限エンドヌクレアーゼを用いて消化され、そしてフラグメント長の大きさ
がゲル電気泳動によって決定され、そして比較される。サンプルＤＮＡとコント
ロールＤＮＡとの間のフラグメント長の大きさにおける差異は、そのサンプルＤ
ＮＡにおける変異を示す。さらに、配列特異的なリボザイムの使用（例えば、米
国特許第５，４９３，５３１号を参照のこと）を使用して、リボザイム切断部位
の発生または喪失によって特異的な変異の存在についてスコア付けし得る。
【０２４５】 他の実施形態において、本発明のＨＤＧＦＸ核酸における遺伝子変異は、サン
プル核酸およびコントロール核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、数百また
は数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイに対してハイブリダイ
ズさせることによって同定され得る（Ｃｒｏｎｉｎら（１９９６）Ｈｕｍａｎ
Ｍｕｔａｔｉｏｎ ７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｌら（１９９６）Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２：７５３−７５９）。例えば、本発明のＨＤＧＦＸに
おける遺伝子変異は、Ｃｒｏｎｉｎら（上記）に記載のように光生成ＤＮＡプロ
ーブを含む二次元アレイにおいて同定され得る。手短には、プローブの第一ハイ
ブリダイゼーションアレイを用いて、サンプルおよびコントロールにおける長い
ストレッチのＤＮＡにわたって走査し、配列が重複するプローブの線形アレイを
作成することによって、その配列間の塩基変化を同定し得る。この工程は、点変
異の同定を可能にする。この工程に続いて、第二のハイブリダイゼーションアレ
イを用い、これは、検出される全ての改変体または変異体に相補的な、より小さ
な特化されたプローブアレイを用いて、特定の変異の特徴付けを可能にする。各
変異アレイは、一方が野生型遺伝子に対して相補的であり、そして他方が変異遺
伝子に対して相補的である並行プローブセットから構成される。
【０２４６】 なお別の実施形態において、当該分野で公知の種々の配列決定反応のいずれか
を使用して、ＨＤＧＦＸ遺伝子を直接配列決定し得、そしてサンプルのＨＤＧＦ
Ｘ配列と対応する野生型（コントロール）配列とを比較することによって、変異
を検出し得る。配列決定反応の例としては、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（
１９７７）ＰＮＡＳ ７４：５６０またはＳａｎｇｅｒ（１９７７）ＰＮＡＳ
７４：５４６３によって開発された技術に基づくものが挙げられる。診断アッセ
イを実施する場合、種々の自動化配列決定手順のいずれかを利用し得ることもま
た意図される（Ｎａｅｖｅら、（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９
：４４８）。これらには、質量分析法による配列決定法（例えば、ＰＣＴ国際公
開番号ＷＯ ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら（１９９６）Ａｄｖ Ｃｈｒｏｍ
ａｔｏｇｒ ３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎら（１９９３）Ａｐ
ｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３８：１４７−１５９を参照の
こと）が含まれる。
【０２４７】 ＨＤＧＦＸ遺伝子における変異を検出するための他の方法としては、切断薬剤
からの保護を使用して、ＲＮＡ／ＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡのヘテロ二重鎖
におけるミスマッチ塩基を検出する方法が挙げられる（Ｍｙｅｒｓら（１９８５
）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２）。一般に、「ミスマッチ切断」の当該分
野の技術は、野生型のＨＤＧＦＸ配列を含む（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡ
を、組織サンプルから得られた潜在的な変異体ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダ
イズさせることによって形成されるヘテロ二重鎖を提供する工程によって始まる
。この二本鎖の二重鎖を、二重鎖の一本鎖領域（例えば、そのコントロールとサ
ンプルの鎖との間の塩基対ミスマッチに起因して存在するもの）を切断する薬剤
を用いて処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を、ＲＮａｓｅを用いて処理
し得、そしてＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、そのミスマッチ領域を酵素的に消
化することに対して、Ｓ１ヌクレアーゼを用いて処理し得る。他の実施形態にお
いて、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡのいずれかの二重鎖を、ミスマッチ
領域を消化するために、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム、およびピ
ペリジンを用いて処理し得る。次いで、そのミスマッチ領域の消化後、得られた
材料を変性ポリアクリルアミドゲル上で、大きさで分離して、変異の部位を決定
する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓ
ｃｉ ＵＳＡ ８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａら（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ ２１７：２８６−２９５を参照のこと。１つの実施形態にお
いて、コントロールのＤＮＡまたはＲＮＡは、検出のために標識され得る。
【０２４８】 なお別の実施形態において、ミスマッチ切断反応は、二本鎖ＤＮＡにおけるミ
スマッチ塩基対を認識する１つ以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ
修復」酵素）を、細胞のサンプルから得られたＨＤＧＦＸ ｃＤＮＡにおける点
変異を検出およびマッピングするために規定された系において使用する。例えば
、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチでＡを切断し、そしてＨｅ
Ｌａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシダーゼは、Ｇ／ＴミスマッチでＴを切断
する（Ｈｓｕら（１９９４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １５：１６５７〜
１６６２）。例示的な実施形態に従って、ＨＤＧＦＸ配列（例えば、野生型ＨＤ
ＧＦＸ配列）に基づくプローブは、試験細胞由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産
物にハイブリダイズされる。二重鎖は、ＤＮＡミスマッチ修復酵素を用いて処理
され、そしてその切断産物（もしあれば）は、電気泳動プロトコルなどから検出
され得る。例えば、米国特許第５，４５９，０３９号を参照のこと。
【０２４９】 他の実施形態において、電気泳動の移動度における変化は、ＨＤＧＦＸ遺伝子
における変異を同定するために使用される。例えば、一本鎖配座多型（ＳＳＣＰ
）は、変異体と野生型核酸との間の電気泳動の移動度における差異を検出するた
めに使用され得る（Ｏｒｉｔａら（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ ＵＳＡ：８６：２７６６、またＣｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｔ
Ｒｅｓ ２８５：１２５〜１４４；Ｈａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ Ａ
ｎａｌ Ｔｅｃｈ Ａｐｐｌ ９：７３〜７９を参照のこと）。サンプルおよび
コントロールＨＤＧＦＸ核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントは、変性され、そして
再生される。一本鎖核酸の二次構造は、配列に従って変化し、電気泳動の移動度
において得られる変化は、１つの塩基変化の検出さえも可能にする。ＤＮＡフラ
グメントは、標識され得るか、または標識されたプローブを用いて検出され得る
。アッセイの感度は、二次構造が、配列中の変化に対してより感受的である、（
ＤＮＡよりもむしろ）ＲＮＡを使用することによって増強され得る。１つの実施
形態において、本発明の方法は、ヘテロ二重鎖分析を利用して、電気泳動の移動
度における変化に基づいて二本鎖のヘテロ二重鎖分子を分離する。例えば、Ｋｅ
ｅｎら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ ７：５を参照のこと。
【０２５０】 なお別の実施形態において、一定勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミド
ゲルにおける変異体または野生型フラグメントの移動は、変性勾配ゲル電気泳動
（ＤＧＧＥ）を使用してアッセイされる。例えば、Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｎ
ａｔｕｒｅ ３１３：４９５を参照のこと。ＤＧＧＥが分析の方法として使用さ
れる場合、ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲにより約４０ｂｐの高融点ＧＣリッチＤＮ
ＡのＧＣクランプを付加することによって、完全には変性されないことを確実す
るように改変される。さらなる実施形態において、温度勾配は、コントロールお
よびサンプルＤＮＡの移動度における差異を同定するために、変性剤勾配の代わ
りに使用される。例えば、ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８
７）Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ ２６５：１２７５３を参照のこと。
【０２５１】 点変異を検出するための他の技術の例としては、以下が挙げられるが、これら
に限定されない：選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増
幅、または選択的プライマー伸長。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、
既知の変異が中心的に配置されるように調製され得、次いで、完全なマッチが見
出される場合にのみハイブリダイゼーションを許容する条件下で標的ＤＮＡにハ
イブリダイズされる。例えば、Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４
：１６３）；Ｓａｉｋｉら（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ＵＳＡ ８６：６２３０を参照のこと。このような対立遺伝子特異的オリゴヌ
クレオチドは、このオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ膜に付着され、そして
標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズされる場合に、ＰＣＲ増幅された標的Ｄ
ＮＡまたは多くの異なる変異にハイブリダイズされる。
【０２５２】 あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術は、本発明
と合わせて使用され得る。特異的増幅のためのプライマーとして使用されるオリ
ゴヌクレオチドは、分子の中心において（その結果、増幅は、差次的ハイブリダ
イゼーションに依存する）（Ｇｉｂｂｓら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ １７：２４３７〜２４４８）か、もしくは適切な条件下でミスマ
ッチが妨げされ得るかまたはポリメラーゼ伸長を減少し得る、１つのプライマー
の３’の最末端で、目的の変異を保有し得る（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔ
ｉｂｔｅｃｈ １１：２３８）。さらに、変異の領域において新規な制限部位を
導入することは、切断に基づく検出を行うために望ましくあり得る。例えば、Ｇ
ａｓｐａｒｉｎｉら（１９９２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ６：１を参
照のこと。特定の実施形態において、増幅はまた、増幅用Ｔａｑリガーゼを使用
して実施され得ることが予測される。例えば、Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏ
ｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：１８９を参照のこと。このよ
うな場合において、連結は、５’配列の３’末端に完全なマッチが存在する場合
にのみ生じ、増幅の存在または非存在を探索することによって、特定の部位で既
知の変異の存在を検出することを可能にする。
【０２５３】 本明細書中に記載される方法は、例えば、本明細書中に記載れる少なくとも１
つのプローブ核酸または抗体試薬を含む、予めパッケージングされた診断キット
を利用することによって実施され得、これは、例えば、ＨＤＧＦＸ遺伝子を含む
疾患または疾病の症状または家族病歴を示す患者を診断するための臨床的設定に
おいて簡便に使用され得る。
【０２５４】 さらに、本発明のＨＤＧＦＸが発現される任意の細胞型または組織（好ましく
は、末梢血白血球）は、本明細書中に記載される予後アッセイにおいて利用され
得る。しかし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプル（例えば、頬粘膜細胞を
含む）が、使用され得る。
【０２５５】 （薬理ゲノム学（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）） ＨＤＧＦＸ活性（例えば、ＨＤＧＦＸ遺伝子発現）に対する刺激性または阻害
性の影響を有する因子、すなわちモジュレーターは、本明細書中に記載されるス
クリーニングアッセイによって同定されるように、異常なＨＤＧＦＸ活性に関連
する障害（例えば、神経学的障害、癌関連障害または妊娠性障害）を処置（予防
的または治療的に）するために個体に投与され得る。このような処置と合わせて
、個体の薬理ゲノム学（すなわち、個体の遺伝子型と外来化合物または薬物に対
するその個体の応答との間の関係についての研究）が、考慮され得る。治療剤の
代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血中濃度との間の関係を変
更することによって、重篤な毒性および治療の失敗を導き得る。従って、個体の
薬理ゲノム学は、個体の遺伝子型の考慮に基づく予防的または治療的処置のため
に有効な薬剤（例えば、薬物）の選択を許容する。このような薬理ゲノム学は、
さらに、適切な投薬量および治療剤レジメンを決定するために使用され得る。従
って、ＨＤＧＦＸタンパク質の活性、ＨＤＧＦＸ核酸の発現、あるいは個体にお
けるＨＤＧＦＸ遺伝子の変異含量が決定されて、それによって個体の治療的また
は予防的処置のために適切な薬剤を選択し得る。
【０２５６】 薬理ゲノム学は、罹患された人において変更された薬物の性質および異常な作
用に起因する、薬物への応答における臨床的に有意な遺伝性変更を扱う。例えば
、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ、１９９６，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ
Ｐｈｙｓｉｏｌ，２３：９８３〜９８５およびＬｉｎｄｅｒ、１９９７，Ｃｌｉ
ｎ Ｃｈｅｍ，４３：２５４〜２６６を参照のこと。一般に、２つの型の薬理ゲ
ノム学状態が、区別され得る。遺伝的状態は、薬物が身体に作用する方法を変更
する１つの因子として伝達されるか（変更された薬物作用）、または遺伝的状態
は、身体が薬物に作用する方法を変更する１つの因子として伝達される（変更さ
れた薬物代謝）。これらの薬理ゲノム学状態は、稀な欠損としてか、または多型
としてのいずれかで生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼ（Ｇ６ＰＤ）欠損は、一般的な遺伝性酵素病であり、この主な臨床的合併症は
、酸化剤薬物（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取
およびソラマメの消費後の溶血である。
【０２５７】 例示的な実施形態として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および持続
期間の両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトラ
ンスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびシトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６およ
びＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多型の発見は、幾人かの患者が予期される薬物効果
を得ないか、または標準的かつ安全な用量の薬物を摂取した後に過大な薬物応答
および深刻な毒性を示すことに関しての説明を提供した。これらの多型は、集団
において２つの表現型（高い代謝能を持つ人（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｍｅｔａｂ
ｏｌｉｚｅｒ）（ＥＭ）および低い代謝能を持つ人（ｐｏｏｒ ｍｅｔａｂｏｌ
ｉｚｅｒ）（ＰＭ））で表現される。ＰＭの有病率は、異なる集団の間で異なる
。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型であり、そしていくら
かの変異がＰＭにおいて同定されており、この全ては機能的ＣＹＰ２Ｄ６の非存
在に至る。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低い代謝能を持つ人は、彼らが
標準的な用量を受ける場合に、かなり頻繁に過大な薬物応答および副作用を経験
する。代謝産物が活性な治療的部分である場合、そのＣＹＰ２Ｄ６形成代謝産物
であるモルヒネによって媒介されるコデインの鎮痛効果について実証されるよう
に、ＰＭは治療的応答を示さない。他の極端なものは、標準的な用量に応答しな
い、いわゆる超迅速な代謝能を持つ人である。最近、超迅速な代謝の基準となる
分子は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に起因していることが同定されている。
【０２５８】 従って、ＨＤＧＦＸのタンパク質の活性、ＨＤＧＦＸの核酸の発現、あるいは
個体におけるＨＤＧＦＸの遺伝子の変異内容を決定して、それによって、その個
体の治療的または予防的処置のために適切な薬剤を選択し得る。さらに、薬理ゲ
ノム学の研究を使用して、個体の薬物応答性の表現型の同定のために薬物代謝酵
素をコードする多型対立遺伝子の遺伝子型を適用し得る。この知見は、用量また
は薬物選択に適用される場合、有害な反応または治療の失敗を回避し得、従って
、被験体をＨＤＧＦＸの調節因子（例えば、本明細書中に記載される例示的なス
クリーニングアッセイの１つによって同定される調節因子）を用いて処置する場
合に治療的または予防的効率を増強し得る。
【０２５９】 （臨床試験中の効果のモニタリング） ＨＤＧＦＸの発現または活性（例えば、異常な細胞増殖および／または分化を
調節する能力）に対する薬剤（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングす
ることは、基本的な薬物スクリーニングおよび臨床試験に適用され得る。例えば
、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイによって決定される薬
剤の、ＨＤＧＦＸの遺伝子発現、タンパク質レベルを増加する効力、またはＨＤ
ＧＦＸ活性をアップレギュレートする効力は、減少したＨＤＧＦＸの遺伝子発現
、タンパク質レベル、またはダウンレギュレートされたＨＤＧＦＸの活性を示す
被験体の臨床試験においてモニターされ得る。あるいは、スクリーニングアッセ
イによって決定される薬剤の、ＨＤＧＦＸの遺伝子発現、タンパク質レベルを減
少、またはＨＤＧＦＸの活性をダウンレギュレートする効力は、増加したＨＤＧ
ＦＸの遺伝子発現、タンパク質レベル、またはアップレギュレートしたＨＤＧＦ
Ｘの活性を示す被験体の臨床試験においてモニターされ得る。このような臨床試
験において、ＨＤＧＦＸの発現または活性、および好ましくは、例えば、増殖ま
たは神経障害に関与するような他の遺伝子が、「リードアウト（読み出し）（ｒ
ｅａｄ ｏｕｔ）」、すなわち、特定の細胞の応答性のマーカーとして使用され
得る。他のＨＤＧＦＸ関連障害としては、例えば、癌、細胞増殖障害、神経学的
障害；および妊娠性障害が挙げられる。
【０２６０】 例えば、遺伝子（本発明のＨＤＧＦＸをコードする遺伝子を含む）（これは、
ＨＤＧＦＸ活性（例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセ
イにおいて同定される）を調節する薬剤（例えば、化合物、薬物または低分子）
を用いる処置によって、細胞内で調節される）が、同定され得る。従って、細胞
性増殖障害に対する薬剤の効果を研究するために、例えば、臨床試験において、
細胞が単離され得、そしてＲＮＡが調製され得、そしてＨＤＧＦＸおよびこの障
害に関与する他の遺伝子の発現のレベルについて分析され得る。遺伝子発現のレ
ベル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、本明細書中に記載されるように、ノ
ーザンブロット分析もしくはＲＴ−ＰＣＲによるか、あるいは産生されるタンパ
ク質の量を測定することによるか、本明細書中に記載されるような方法の１つに
よるか、あるいは遺伝子または他の遺伝子の活性のレベルを測定することによっ
て、定量され得る。この様式で、この遺伝子発現パターンは、この薬剤に対する
細胞の生理学的応答の指標であるマーカーとして作用し得る。従って、この応答
状態は、この薬剤を用いる個体の処置の前、およびこの処置の間の種々の時点で
、決定され得る。
【０２６１】 １つの実施形態において、本発明は、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニ
スト、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチド模倣物、低分子、または本明細書
中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される他の薬物候補物）を
用いる、被験体の処置の効力をモニタリングするための方法を提供し、これは、
以下の工程を包含する：（ｉ）薬剤の投与の前に、被験体から投与前サンプルを
得る工程；（ｉｉ）この投与前サンプルにおいて、ＨＤＧＦＸのタンパク質、ｍ
ＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出する工程；（ｉｉｉ）この被
験体から１つ以上の投与後サンプルを得る工程；（ｉｖ）この投与後サンプルに
おいて、ＨＤＧＦＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または
活性のレベルを検出する工程；（ｖ）この投与前サンプルにおけるＨＤＧＦＸの
タンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを、この
投与後サンプルにおけるＨＤＧＦＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮ
Ａの発現または活性のレベルと比較する工程；ならびに（ｖｉ）それに従って、
この被験体に対する薬剤の投与を変更する工程。例えば、この薬剤の増加した投
与は、検出されるよりも高いレベルにＨＤＧＦＸの発現または活性を増加するこ
とが（すなわち、この薬剤の効力を増加すること）望ましくあり得る。あるいは
、この薬剤の減少した投与は、検出されるよりも低いレベルにＨＤＧＦＸの発現
または活性を減少することが（すなわち、この薬剤の効力を減少すること）望ま
しくあり得る。
【０２６２】 （処置方法） 本発明は、異常なＨＤＧＦＸの発現または活性に関連する障害の危険性のある
（または感受性）か、またはこの障害を有する被験体を処置する予防的および治
療的の両方の方法を提供する。
【０２６３】 （その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）増加したレベルま
たは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を拮抗する（
すなわち、低減または阻害する）治療剤を用いて処置され得る。活性を拮抗する
治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤と
しては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）ＨＤＧＦＸのポリ
ペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；（ｉ
ｉ）ＨＤＧＦＸペプチドに対する抗体；（ｉｉｉ）ＨＤＧＦＸペプチドをコード
する核酸；（ｉｖ）相同組換えによってＨＤＧＦＸポリペプチドの内因性機能を
「ノックアウトする」ために利用される、アンチセンス核酸および「機能不全性
」である（すなわち、ＨＤＧＦＸポリペプチドに対するコード配列のコード配列
内の異種挿入に起因する）核酸の投与、（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８９
、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８〜１２９２を参照のこと）；または（ｖ）
ＨＤＧＦＸペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を変化させる、調節
因子（すなわち、インヒビター、アゴニストおよびアンタゴニスト（本発明のさ
らなるペプチド模倣物または本発明のペプチドに対して特異的な抗体を含む））
。
【０２６４】 （その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）減少したレベルま
たは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を増加させる
（すなわち、活性に対するアゴニストである）治療剤を用いて処置され得る。活
性をアップレギュレートする治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され
得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されな
い：ポリペプチド、ペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもし
くはホモログ；あるいはバイオアベイラビリティーを増加させるアゴニスト。
【０２６５】 増加したレベルまたは減少したレベルは、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定
量することによって、容易に検出され得る。この定量は、患者の組織サンプルを
（例えば、生検組織から）入手し、そしてそのサンプルを、その発現したポリペ
プチド（またはＨＤＧＦＸポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）のＲＮＡレベル
またはポリペプチドレベル、構造および／または活性をインビトロでアッセイす
ることによる。当該分野において周知の方法としては、以下が挙げられるが、こ
れらに限定されない：イムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット分析、ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動が後に続く免疫
沈降、免疫細胞化学などによる）および／またはｍＲＮＡの発現を検出するため
のハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロッ
ト、インサイチュハイブリダイゼーションなど）。
【０２６６】 １つの局面において、本発明は、被験体において異常なＨＤＧＦＸの発現また
は活性と関連する疾患または状態を、ＨＤＧＦＸの発現または少なくとも１つの
ＨＤＧＦＸ活性を調節する薬剤をこの被験体に投与することによって予防するた
めの方法を提供する。異常なＨＤＧＦＸの発現または活性によって引き起こされ
るかまたはこれらに起因する、疾患にかかる危険がある被験体は、例えば、本明
細書中に記載の診断アッセイまたは予後アッセイのいずれか、またはそれらの組
み合わせによって、同定され得る。予防薬剤の投与は、疾患または障害が予防さ
れるか、あるいはその進行を遅らせられるように、このＨＤＧＦＸ異常の特徴で
ある症状の発現の前に行い得る。このＨＤＧＦＸ異常の型に依存して、例えば、
ＨＤＧＦＸアゴニスト薬剤またはＨＤＧＦＸアンタゴニスト薬剤が、その被験体
を処置するために使用され得る。その適切な薬剤は、本明細書中に記載のスクリ
ーニングアッセイに基づいて決定され得る。
【０２６７】 本発明の別の局面は、治療目的のために、ＨＤＧＦＸの発現または活性を調節
する方法に関する。本発明の調節方法は、細胞を、その細胞に関するＨＤＧＦＸ
タンパク質活性の活性のうちの１つ以上を調節する薬剤と接触させる工程を包含
する。ＨＤＧＦＸタンパク質活性を調節する薬剤は、核酸またはタンパク質、Ｈ
ＤＧＦＸタンパク質の天然に存在する同族リガンド、ペプチド、ＨＤＧＦＸペプ
チド模倣物、または他の低分子のような、本明細書中に記載されるような薬剤で
あり得る。１つの実施形態において、この薬剤は、ＨＤＧＦＸタンパク質活性の
うちの１つ以上を刺激する。このような刺激薬剤の例としては、その細胞に導入
された、活性なＨＤＧＦＸタンパク質、およびＨＤＧＦＸポリペプチドをコード
する核酸分子が挙げられる。別の実施形態において、この薬剤は、ＨＤＧＦＸタ
ンパク質活性のうちの１つ以上を阻害する。このような阻害薬剤の例としては、
アンチセンスＨＤＧＦＸ核酸分子、および抗ＨＤＧＦＸ抗体が挙げられる。これ
らの調節方法は、インビトロで（例えば、その薬剤とともにその細胞を培養する
ことによって）、あるいはインビボで（例えば、被験体にその薬剤を投与するこ
とによって）実施され得る。このように、本発明は、ＨＤＧＦＸのタンパク質ま
たは核酸分子の、異常な発現または異常な活性によって特徴付けられる、疾患ま
たは障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。１つの実施形態において、
この方法は、ＨＤＧＦＸの発現または活性を調節する（例えば、アップレギュレ
ートまたはダウンレギュレートする）薬剤（例えば、本明細書中に記載のスクリ
ーニングアッセイによって同定される薬剤）あるいはそのような薬剤の組み合わ
せを投与する工程を包含する。別の実施形態において、この方法は、ＨＤＧＦＸ
のタンパク質または核酸分子を、低減したかまたは異常な、ＨＤＧＦＸの発現ま
たは活性を補償するための治療として、投与する工程を包含する。
【０２６８】 本発明はさらに、以下の実施例において例示されるが、これらは、特許請求の
範囲の範囲を限定しない。
【０２６９】 （実施例） （実施例１．ＨＤＧＦＸの分子クローニング） 予測されたオープンリーディングフレームは、ウシ肝細胞由来の増殖因子関連
タンパク質３（ＨＲＰ−３）（ＴＲＥＭＢＬＮＥＷ−ＡＣＣ：ＣＡＢ４０３４８
）に対してアミノ酸レベルで全体で５９％の同一性を有する２５１アミノ酸長タ
ンパク質をコードする。予測した全長ＯＲＦをクローニングし、そして検証した
。
【０２７０】 （全長ＨＤＧＦＸのクローニング） オリゴヌクレオチドプライマーを、ＰＣＲによって、全長ＨＤＧＦＸ遺伝子産
物をコードするＤＮＡセグメントを増幅するために、設計した。順方向プライマ
ーは、インフレームＢａｍＨＩ制限部位およびコンセンサスＫｏｚａｋ配列を含
む。逆方向プライマーは、インフレームＸｈｏＩ制限部位を含む。ＰＣＲプライ
マーの配列は、以下である： ＨＤＧＦＸ Ｆｏｒｗ：ＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＧＧＣＣＴＡＣＧＧＣＡ
ＴＧＣＣＣＡＴＧＴＡＣ（配列番号１１）、および ＨＤＧＦＸ Ｒｅｖ：ＣＴＣＧＡＧＣＡＧＧＣＴＧＴＣＧＣＧＡＴＣＴＣＣＧＣ
ＣＧＣＣ（配列番号１２）。
【０２７１】 ＰＣＲ反応を、等量のヒト胎児脳、ヒト精巣、ヒト乳房およびヒト骨格筋組織
由来のｃＤＮＡを含む、ｃＤＮＡテンプレートの混合物（総量５ｎｇ）、１μＭ
のＨＤＧＦＸ ＦｏｒｗおよびＨＤＧＦＸ Ｒｅｖプライマーの各々、５μモル
のｄＮＴＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔ
ｏ ＣＡ）および１マイクロリットルの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＨＦ２ポリ
メラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ
ＣＡ）（５０マイクロリットル容量中）を用いて設定した。以下のＰＣＲ反応
条件を使用した： ａ） ９６℃ ３分間 ｂ） ９６℃ ３０秒間変性 ｃ） ７０℃ ３０秒間、プライマーアニーリング。この温度を次第に１℃／
サイクルずつ低下させた ｄ） ７２℃ １分間伸長 工程（ｂ）〜（ｄ）を１０回繰り返す ｅ） ９６℃ ３０秒間変性 ｆ） ６０℃ ３０秒間アニーリング ｇ） ７２℃ １分間伸長 工程（ｅ）〜（ｇ）を２５回繰り返す ｈ） ７２℃ １０分間最終伸長。
【０２７２】 約７５０ｂｐのＰＣＲ産物を、アガロースゲルでの電気泳動の後に単離し、そ
してｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）
に連結した。クローニングしたインサートを、ベクター特異的なＭ１３正方向プ
ライマー（−４０）およびＭ１３逆方向プライマー、ならびに以下の遺伝子特異
的プライマーを使用して、配列決定した： ＨＤＧＦＸ Ｓ１：ＧＡＣＡＡＧＣＣＧＡＣＣＣＡＣＧＣＴＧＧ（配列番号１３
）および ＨＤＧＦＸ Ｓ２：ＣＣＡＧＣＧＴＧＧＧＴＣＧＧＣＴＴＧＴＣ（配列番号１４
）。
【０２７３】 これらの配列を、予測したＨＤＧＦＸ全長タンパク質をコードするオープンリ
ーディングフレームとして確かめた。クローニングした配列は、配列番号１の予
測された翻訳産物と１００％同一である。このクローンを、ｐＣＲ２．１−ＡＬ
０３３５３９−Ｓ３２１−４Ｃと呼ぶ。
【０２７４】 （実施例２．哺乳動物発現ベクターｐＣＥＰ４／Ｖ５Ｈｉｓの構築） このオリゴヌクレオチドプライマー：
【０２７５】
【化１】 を、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ
ｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）由来のフラグメントを増幅するために設計した。このＰＣ
Ｒ産物を、ＸｈｏＩおよびＡｐａＩを用いて消化し、そしてＸｈｏＩ／ＡｐａＩ
消化されたｐＳｅｃＴａｇ２Ｂベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂ
ａｄ ＣＡ）に連結した。この得られたベクター、ｐＳｅｑＶ５Ｈｉｓの正確な
構造を、ＤＮＡ配列分析により検証した。このベクターｐＳｅｑＶ５Ｈｉｓを、
ＰｍｅＩおよびＮｈｅＩを用いて消化し、そしてＰｍｅＩ−ＮｈｅＩフラグメン
トを、ＢａｍＨＩ／ＫｌｅｎｏｗおよびＮｈｅＩ処理されたベクターｐＣＥＰ４
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）に連結した。得られたベクタ
ーを、ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃと名付けた。続いて、ｐｃＤＮＡ３．１Ａ（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）由来のＫｐｎＩおよびＸｈｏＩを単離
し、そしてＫｐｎＩおよびＸｈｏＩ処理されたｐＣＥＰ４／Ｓｅｃに連結した。
得られたベクター（ｐＣＥＰ４／Ｖ５Ｈｉｓと名付けられた）は、ｐＳｅｃＴａ
ｇ２Ｂに本来存在するＩｇＫａｐｐａ分泌シグナルを欠く。
【０２７６】 （実施例３．ヒト胚性腎２９３細胞におけるＨＤＧＦＸの発現） ＨＤＧＦＸ配列を含む０．８ｋｂＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、ｐＣ
Ｒ２．１−ＡＬ０３３５３９−Ｓ３２１−４Ｃから単離し（実施例１）、そして
ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ消化されたｐＣＥＰ４／Ｖ５Ｈｉｓ（実施例２）でサブク
ローン化し、発現ベクターｐＣＥＰ４／Ｖ５Ｈｉｓ−ＡＬ０３３５３９を生成し
た。ｐＣＥＰ４／Ｖ５Ｈｉｓ−ＡＬ０３３５３９ベクターを、製造者の指示に従
ってＬｉｐｏｆｅｖｔａｍｉｎｅＰｌｕｓ試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｒｏｃｋ
ｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用して、２９３細胞にトランスフェクトした。細胞ペレ
ットおよび上清を、トランスフェクションの７２時間後に回収し、そして抗Ｖ５
抗体で還元された条件下で、ウェスタンブロットを行うことにより、ＨＤＧＦＸ
発現について調べた。図１は、発現されたＨＤＧＦＸポリペプチドが、約５０ｋ
Ｄａの分子量を有することを示し、これは、ＳｅｅＢｌｕｅ分子量マーカー（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）を使用することによって示される
ように、２９３細胞により分泌される。
【０２７７】 （実施例４．組み換えＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＥＴ（Ｃ）の構築） ベクターｐＢＡＤｇＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｃａｒｓｂａ
ｄ，ＣＡ）を、ＮｃｏＩおよびＰｍｅＩ制限酵素を用いて消化し、ＢｇｌＩＩお
よびＳａｌＩクローニング部位ならびにＣ末端６×Ｈｉｓタグを含む１５０ｂｐ
のフラグメントを放出した。プラスミドｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄ
ｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を、制限酵素ＸｈｏＩを用いた消化により線状
にし、そしてＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントを
用いて満たした。次いで、制限酵素ＮｃｏＩを用いて消化した。引き続き、ｐＢ
ＡＤｇＩＩＩ由来のＮｃｏＩ−ＰｍｅＩフラグメントを、線状にされたｐＥＴ２
８ａに連結し、そして得られたＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターを、ｐＥＴ（Ｃ）と名
付けた。
【０２７８】 （実施例５．発現ベクターｐＥＴ（Ｃ）を使用した、組み換えＥ．ｃｏｌｉに
おけるＨＤＧＦＸの発現） ＨＤＧＦＸ遺伝子を含むＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩフラグメント（実施例１および
３）を、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限酵素を用いて消化したｐＥＴ（Ｃ）ベク
ター（実施例４）に連結した。得られた発現ベクターを、ｐＥＴ（Ｃ）−ＡＬ０
３３５３９と名付ける。このベクターにおいて、ＨＤＧＦＸを、そのＣ末端で、
６×Ｈｉｓタグに融合した。次いで、プラスミドｐＥＴ（Ｃ）−ＡＬ０３３５３
９で、Ｅ．ｃｏｌｉ発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３、ｐＬｙｓ）（Ｎｏｖａｇｅｎ，
Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を形質転換した。ＨＤＧＦＸポリペプチドの発現を、製
造者の指示に従って誘導した。誘導後、細胞全体を回収し、そしてタンパク質を
、抗Ｈｉｓ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、
ウェスタンブロッティングにより分析した。図２は、ＨＤＧＦＸポリペプチドが
、ＳｅｅＢｌｕｅ分子量マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｂａｄ，Ｃ
Ａ）を使用することにより示されるように、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞において、分子量
が約４５ｋＤａであるポリペプチドとして発現されたことを示す。
【０２７９】 （実施例６．ＨＤＧＦＸを用いた処置に対する応答の単球におけるサイトカイ
ン産生） 単球が、製造者の手順に従って、ＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ
Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、新鮮なヒト末梢血単核細胞から単離した。単球を
、１０％ウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）を含み、そしてＬ−グルタミン、ピル
ビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、ＨＥＰＥＳ、およびβ−メルカプトエタノ
ール（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ由来の補充物）で補充さ
れたＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ）で、ウェルあたり
１００μｌの容量で、９６ウェルの平らな底の組織培養処理されたプレートに、
ウェルあたり１×１０5細胞でプレートした。ＨＤＧＦＸを、実施例３に記載さ
れる馴化培地において、分泌されたタンパク質から精製した。ＨＤＧＦＸまたは
ビヒクルコントロール（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４；５０ｍＭ
ＮａＣｌ）をウェルに添加し、次いで、このサンプルを、１０％ＣＯ2の組織培
養インキュベーターで３７℃、２４時間インキュベートした。腫瘍壊死因子α（
ＴＮＦα）またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）産生を、ＥＬＩＳＡ（Ｐｈ
ａｒｍｉｎｇｅｎ）により細胞上清をアッセイすることにより測定した。
【０２８０】 この結果を、図３および４において示す。１００ｎｇ／ｍｌ ＨＤＧＦＸを用
いて処理された単球は、２３．８ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−６および０．６６ｎｇ／ｍ
ｌ ＴＮＦαを産生した。１０ｎｇ／ｍｌ ＨＤＧＦＸで処理された単球は、８
．３ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−６を産生したが、ＴＮＦα産生を、１０ｎｇ／ｍｌ Ｈ
ＤＧＦＸの処理で検出しなかった。ビヒクルコントロールで処理された単球は、
検出可能なレベルのＩＬ−６またはＴＮＦ αを産生しなかった。これらの結果
は、第２の、別個の実験で得られる結果を代表する。
【０２８１】 （実施例７．マウスにおけるＨＤＧＦＸの投与のインビボ効果） ＨＤＧＦＸを、実施例３に記載される馴化培地中で、分泌されたタンパク質か
ら精製した。Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｓからの正常雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、７日
間、毎日１回、ＨＤＧＦＸ（５ｍｇ／ｋｇ）またはコントロールビヒクル（１０
ｍｌ／ｋｇ）のｉｐ注射を与えた。８日目に、動物に、ＨＤＧＦＸ（５ｍｇ／ｋ
ｇ）およびＢｒｄＵ（１００ｍｇ／ｋｇ）を注射し、そして１時間後、イソフル
ランで麻酔し、そして全血球算定（ＣＢＣ）および臨床化学変化の測定のために
採血した。組織および器官を除去し、そして重さを計り、そして増殖変化の検出
のためのＢｒｄＵ免疫組織化学を含む組織病理学評価のためにホルマリンに回収
した。この結果を表５に示す。
【０２８２】 相対的な脾臓重量は、ビヒクルコントロールで処理されたマウスと比較して、
ＨＤＧＦＸで処理されたマウスにおいて６８％増大した（０．６８３＝０．０４
４グラム（ｇｒ）／１００ｇｒ体重対０．４０７±０．０８ｇｒ／１００ｇｒ体
重）。また、相対的肝臓重量は、ビヒクルコントロールで処理されたマウスと比
較して、ＨＤＧＦＸで処理されたマウスにおいて、１１％増大した（４．７３±
０．９６ｇｒ／１００ｇｒ体重対４．２７９±０．１１７ｇｒ／１００ｇｒ体重
）。ＨＤＧＦＸで処理されたマウスは、ビヒクルコントロールで処理されたマウ
スと比較して、骨髄における顆粒球生成の際立った増加を示した（骨髄：赤血球
比３：１対１：１）。ＨＤＧＦＸを用いた処理は、脾性骨髄外造血およびリンパ
球造血の際立った増加を生じた。組織病理学は、好中球細胞および単核細胞炎症
で、膵管に影響する亜急性炎症を示し、そしてＢｒｄＵ標識は、ＨＤＧＦＸで処
理されたマウスにおける実質において明らかであることを示した。
【０２８３】
【表５】 *心臓のびまん性（ｄｉｆｆｕｓｅ）鉱化作用 ＮＳＬ 顕著な病変はない （実施例８．ＨＤＧＦＸの増殖活性） 実施例７における結果は、ＨＤＧＦＸが、膵管上皮の増殖に影響することを示
唆する。従って、ＨＤＧＦＸの増殖効果を、これらの細胞の細胞培養において評
価した。
【０２８４】 （Ａ．細胞増殖の証明） 膵臓の新鮮な外科的サンプルから得られた、Ｈ６ｃ７ヒト膵管上皮（ＨＰＤＥ
）細胞におけるＨＤＧＦＸの増殖効果を調べた。分泌されたＨＤＧＦＸを、実施
例３に記載される馴化培地から精製した。
【０２８５】 １日目：ＨＰＤＥ細胞を、ウシ下垂体抽出物および上皮増殖因子（ＥＧＦ）（
５ｎｇ／ｍｌ）で補充されたＫＳＦ培地（ケラチノサイト増殖支持培地）におけ
る、６ウェルＮｕｎｃ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅプレートにおいて、約１
０，０００／ウェルでプレートした。
【０２８６】 ２日目：この培地を、補充物なしのＫＳＦに変えた。
【０２８７】 ３日目：この培地を、ＨＤＧＦ（ＥＸＴＲＡＣＴ；０．５〜５μｌ／ｍｌ培地
）、ＭＯＣＫ（１および５μｌ／ｍｌ）または精製されたＨＤＧＦ（ｎｇ／ｍｌ
）で補充したＫＳＦ培地に変えた。このときの細胞数は、約１．０７×１０4／
ウェルである。ＨＤＧＦ ＥＸＴＲＡＣＴは、ＨＤＧＦＸを含む最小精製馴化培
地に対する名称であり、そしてＭＯＣＫは、コントロール馴化培地に関連する。
【０２８８】 ７日目：細胞の数を、Ｃｏｕｌｔｅｒ ＺＭ細胞カウンターを使用して数えた
。この結果を、図５において示し、ここで、ＨＤＧＦＸを、ＨＤＧＦと呼ぶ。図
５における抽出効果は、馴化培地でもたらされ、そしてＨＤＧＦＸではもたらさ
れないようである。なぜなら、ＭＯＣＫが、同じ効果を提供するからである。融
合された精製タグを使用して精製されたＨＤＧＦＸ（実施例３）は、有意な増殖
効果を提供する（図５）。
【０２８９】 （Ｂ．高濃度のＨＤＧＦにおける増殖の抑制） 節Ａにおける実験を、より高い濃度のＨＤＧＦを使用することにより、広げた
。全ての群が、３つ組である。
【０２９０】 １日目：Ｈ６ｃ７細胞（Ｐ２８）を、増殖因子の補充物なしのＫＳＦ培地中、
約１０，０００細胞／ウェルで、６ウェルプレートにプレートした。
【０２９１】 ２日目：この培地を、同じ無補充物ＫＳＦ培地を補給して維持した。
【０２９２】 ３日目：この培地を、精製されたＨＤＧＦの種々の濃度を含む培地に交換した
。ＨＤＧＦを、コントロール群には添加しなかった。
【０２９３】 ８日目：この細胞を上記のように数えた。この結果を、図６に示した。
【０２９４】 最も低い濃度（パートＡで使用される最も高い濃度と同じである（図５））も
また、適度な程度の増殖を提供した。ＨＤＧＦの連続的なより高い濃度が、この
増殖を抑制するようである。
【０２９５】 この実験は、２回繰り返された。第１の実験において、コントロールレベルに
対する増殖およびＨＤＧＦの高い濃度の抑制は、見出されなかった。これは、繰
り返される細胞継代における細胞による、応答の欠失に起因すると考えられる。
第２の実験において、約１０％の範囲の増殖を、５６ｎｇ／ｍｌおよび１１２ｎ
ｇ／ｍｌのＨＤＧＦの濃度で観察され、２８ｎｇ／ｍｌおよび２２４ｎｇ／ｍｌ
の濃度は、コントロール（約１８０，０００／ウェル）と区別できない細胞数を
提供し、そして１４ｎｇ／ｍｌが、コントロールよりわずかに下回る細胞数を有
した。ウシ下垂体抽出物およびＥＧＦの存在下における細胞数は、約２７０，０
００／ウェルであった。
【０２９６】 （実施例９．ＨＤＧＦＸによる初期の遺伝子発現のノザンブロット分析） ｃ−ｍｙｃおよびｃ−ｆｏｓ発現のノザンブロット分析を、ＨＰＤＥ細胞のサ
ンプルにおいて、種々の時間の期間、ＨＤＧＦ（３５０ｎｇ／ｍｌ）を用いてそ
の細胞を処理した後、実施した。この結果を、図７において示す。
【０２９７】 全ての時点で、ＧＡＤＰＨの構成性発現と比較して、ＨＤＧＦを用いた処理後
、ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡ発現およびｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡ発現の上方制御がある
ようである。これは、ＨＤＧＦによる、ｃ−ｍｙｃおよびｃ−ｆｏｓに特徴的な
、転写初期遺伝子の活性と一致する。
【０２９８】 （実施例１０．ＨＤＧＦＸ核酸の定量発現分析） 種々のクローンの定量発現を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＥ（登録商標）７７００配列検出システムにおいて実
施されるリアルタイムの定量ＰＣＲ（ＴＡＱＭＡＮ（登録商標））により、４０
個の正常サンプルおよび５４個の腫瘍サンプルにおいて評価した。細胞株を、表
に示す。
【０２９９】 （表４：ＨＤＧＦＸ発現について分析された組織）
【０３００】
【表６】 ＫＥＹ：ｇｌｉｏ．＝グリア細胞；ａｓｔｒｏ．＝星状細胞；ｎｅｕｒｏ．＝神
経細胞；ｍｅｔ．＝転移；ＣＮＳ＝中枢神経系 最初に、９６ＲＮＡサンプルを、βアクチンおよびＧＡＰＤＨに正規化した。
ＲＮＡ（約５０ｎｇ合計または約１ポリＡ＋）を、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）逆
転写試薬キット（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ
；ｃａｔ ＃ Ｎ８０８−０２３４）およびランダムヘキサマーを、製造者プロ
トコールを使用して、ｃＤＮＡに変換した。反応を、２０μｌで実施し、そして
４８℃で、３０分間インキュベートした。次いで、ｃＤＮＡ（５μｌ）を、βア
クチンおよびＧＡＰＤＨ ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイ試薬（それぞれ、
ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；ｃａｔ．＃’ｓ ４３１０８８１Ｅおよび４３１
０８８４Ｅ）ならびにＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ
Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；ｃａｔ ＃ ４３０４４
４７を、製造者プロトコールに従って使用し、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応の
ために、別個のプレートに移した。反応を、以下のパラメーターを使用して２５
μｌで実施した：２分、５０℃；１０分、９５℃；１５秒、９５℃／１分、６０
℃（４０サイクル）。結果を、所定のサンプルと、δＣＴのパワーに対して２と
示される最も低いＣＴ値を有するサンプルとの間のＲＮＡ濃度の違いを用いて、
対数スケールを使用して、ＣＴ値（所定のサンプルが、蛍光の閾値レベルを超え
るサイクル）として記録した。次いで、相対的発現の百分率を、このＲＮＡの違
いの逆数をとり、そして１００を掛けることにより得る。βアクチンおよびＧＡ
ＰＤＨについて得られる平均のＣＴ値を使用して、ＲＮＡサンプルを正規化した
。最も高いＣＴ値を生じたＲＮＡサンプルは、更なる希釈を必要としないが、全
ての他のサンプルを、それらのβ−アクチン／ＧＡＰＤＨ平均ＣＴ値に従って、
このサンプルに関して希釈した。
【０３０１】 正規化されたＲＮＡ（５μｌ）を、ｃＤＮＡに変換し、そして製造者の指示に
従って、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｒｅａｇｅ
ｎｔｓ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；ｃａｔ．＃ ４３０９１６９）および遺
伝子特異的プライマーを使用して、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）を通じて分析する
。プローブおよびプライマーを、インプットとして、クローンＨＤＧＦＸ＿Ａの
配列を使用して、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ’ｓ Ｐｒｉ
ｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ（Ａｐｐｌｅ Ｃ
ｏｍｐｕｔｅｒ’ｓ Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ Ｐｏｗｅｒ ＰＣに関するバージョ
ンＩ）に従って、各アッセイについて設計した。デフォルト設定を、反応条件関
して使用して、そして以下のパラメーターを、プライマーを選択する前に設定し
た：プライマー濃度＝２５０ｎＭ、プライマー融解温度（Ｔm）範囲＝５８℃〜
６０℃、プライマー最適Ｔｍ＝５９℃、最大プライマー差異＝２℃、プローブは
、５’Ｇを有さず、プローブＴmは、プライマーＴmより１０℃高くなければなら
ず、アンプリコンサイズは、７５ｂｐ〜１００ｂｐである。選択されるプローブ
およびプライマー（以下を参照のこと）を、Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏ
ｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）により合成した。プローブを、結合していない色素を除去す
るためにＨＰＬＣにより２倍に精製して、そしてそれぞれ、プローブの５’末端
および３’末端へのレポーター色素およびクエンチャーの結合を立証するために
、質量分析計により評価した。それらの最終濃度は、正方向プライマーおよび逆
方向プライマーがそれぞれ９００ｎＭ、ならびにプローブは２００ｎＭであった
。
【０３０２】 ＰＣＲ条件：各組織および各細胞株由来の正規化されたＲＮＡを、９６ウェル
ＰＣＲプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の各ウェ
ルに、スポットした。２つのプローブを含むＰＣＲカクテル（ＨＤＧＦＸ＿Ａ特
異的プローブおよびＨＤＧＦＸ＿Ａプローブで多重化された別の遺伝子特異的プ
ローブ）を、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７７００についての、１×ＴａｑＭ
ａｎTM ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（５ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｄＮＴＰ（１：
１：１：２の比の、ｄＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕ）、０．２５Ｕ／ｍｌ ＡｍｐｌｉＴａｑ
ＧｏＩｄTM（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、および０．４Ｕ／μｌ ＲＮａ
ｓｅインヒビター、および０．２５Ｕ／μｌ逆転写酵素）を使用して、設定した
。逆転写を、以下のように、４８℃で３０分間、それに引き続き、増幅／ＰＣＲ
サイクルで実施した：９５℃、１０分、次いで、９５℃を１５秒、６０℃を１分
間の４０サイクル。
【０３０３】 （Ａ．プローブセットＡｇ０８２ｂ）
【０３０４】
【表７】 クローンＨＤＧＦＸ＿Ａの発現を、アッセイされる全ての正常組織および癌組
織の、正常精巣（１００．０％の相対的発現）および膵臓（９．０％の相対的発
現）においてのみ、プライマー−プローブセットＡｇ０８２ｂにより検出する。
【０３０５】 （Ｂ．プローブセットＡｇ０８２ｃ）
【０３０６】
【表８】 クローンＨＤＧＦＸ＿Ａの発現を、アッセイされる全ての正常組織および癌組
織のうち、正常精巣（１００．０％の相対的発現）および膵臓（９．７％の相対
的発現）においてのみ、プライマー−プローブセットＡｇ０８２ｃにより検出す
る。
【０３０７】 （等価物） 本発明の特定の実施形態の前述に詳述される説明から、核酸、ポリペプチド、
抗体、検出および処置を含む特定の新規の組成物および方法が記載されているこ
とは明らかである。これらの特定の実施形態は、詳細に本明細書中に開示されて
いるが、これは、例証の目的のための例として開示され、そして前記の添付され
る特許請求の範囲に関して、制限することを意図しない。特に、種々の置換、変
更、および改変が、特許請求の範囲により規定されるような発明の精神および範
囲から逸脱することなく、本発明に対して、当業者にとって慣例的な問題として
作製され得る。実際、本明細書中に記載される改変に加えて、本発明の種々の改
変が、前述の説明および添付の図から当業者に明らかとなる。このような改変は
、添付の特許請求の範囲内にあることを意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、２９３細胞によって分泌されたＨＤＧＦＸ（ＡＬ０３３５３９とも呼
ばれる）ポリペプチドのウエスタンブロットである。
【図２】 図２は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中で発現されたＨＤＧＦＸポリペプチドのウエスタ
ンブロットである。
【図３】 図３は、腫瘍壊死因子αの分泌によって測定した、ＨＤＧＦＸでの処理に応答
する単球の活性化である。
【図４】 図４は、インターロイキン−６の分泌によって測定した、ＨＤＧＦＸでの処理
に応答する単球の活性化である。
【図５】 図５は、ＨＤＧＦＸでの処理に応答する、ヒト膵管上皮細胞の増殖である。
【図６】 図６は、ＨＤＧＦＸでの処理に応答する、ヒト膵管上皮細胞の増殖である。
【図７】 図７は、ＨＤＧＦＸで処理したヒト膵管上皮細胞におけるｃ−ｍｙｃ遺伝子お
よびｃ−ｆｏｓ遺伝子のノーザンブロット分析である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 9/00 ４Ｃ０８５ Ａ６１Ｐ 3/10 15/00 ４Ｃ０８６ 9/00 17/02 ４Ｈ０４５ 15/00 17/06 17/02 19/02 17/06 29/00 19/02 １０１ 29/00 35/00 １０１ Ｃ０７Ｋ 14/47 35/00 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ボルドッグ， フェレンチ エル． アメリカ合衆国 コネチカット 06473， ノース ヘイブン， ハートフォード ターンパイク 1687 (72)発明者 ヤン， メイジャ アメリカ合衆国 コネチカット 06533， イースト ライム， キャットバード レーン ６ (72)発明者 ラロッシェル， ウィリアム アメリカ合衆国 コネチカット 06443， マディソン， デヴォンシャー レーン 15 (72)発明者 ミンスコフ， ステイシー アメリカ合衆国 コネチカット 06443， スタムフォード， フェアウェイ ドラ イブ 57 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 CA04 CA09 HA14 HA17 4B063 QA01 QA19 QQ43 QR32 QR55 QS34 4B064 AG01 CA19 CC24 DA01 DA14 4B065 AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA08 BA22 BA23 CA18 CA25 DC50 NA14 ZA362 ZA812 ZA892 ZA962 ZB152 ZB262 ZC352 4C085 AA13 BB11 CC26 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA36 ZA81 ZA89 ZA96 ZB15 ZB26 ZC35 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 CA40 DA22 DA75 EA28 EA51 FA74

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＨＤＧＦＸをコードする単離された核酸分子または該核酸分
    子の相補体であって、該分子は、配列番号２に対して少なくとも８５％同一であ
    る配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された
    核酸分子または該核酸分子の相補体。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の核酸分子または該核酸分子の相補体であっ
    て、前記ヌクレオチド配列が、配列番号２のポリペプチドをコードする、核酸分
    子または該核酸分子の相補体。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載の核酸分子または該核酸分子の相補体であっ
    て、該分子は、配列番号１のヒトＨＤＧＦＸをコードする、核酸分子または該核
    酸分子の相補体。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載の単離された核酸分子または該核酸分子の相
    補体であって、該分子が、配列番号１のヌクレオチドの配列を含む核酸分子に相
    補的な核酸配列に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、単
    離された核酸分子または該核酸分子の相補体。
  5. 【請求項５】 請求項１に記載の単離された核酸分子であって、該分子が、
    配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列において１以上の
    保存的置換を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、単離された核
    酸分子。
  6. 【請求項６】 請求項１に記載の核酸分子のオリゴヌクレオチドまたはその
    相補体であって、該核酸分子は１００ヌクレオチド未満の長さであり、そして配
    列番号１の少なくとも６個の連続したヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド
    またはその相補体。
  7. 【請求項７】 請求項１に記載の核酸分子を含む、核酸ベクター。
  8. 【請求項８】 前記ベクターが発現ベクターである、請求項７に記載の核酸
    ベクター。
  9. 【請求項９】 前記核酸分子に作動可能に連結された調節エレメントをさら
    に含む、請求項７に記載のベクター。
  10. 【請求項１０】 請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、宿主細胞。
  11. 【請求項１１】 単離されたポリペプチドであって、以下： ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド； ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドのフラグメントであって、
    該フラグメントが、配列番号２の少なくとも６個の連続したアミノ酸を含む、フ
    ラグメント； ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドの誘導体； ｄ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドのアナログ； ｅ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドのホモログ；ならびに ｆ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然に存在する対立遺伝
    子改変体であって、該ポリペプチドが、ストリンジェントな条件下で配列番号１
    の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、対立遺伝子改
    変体、 からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも８０％同一である、
    単離されたポリペプチド。
  12. 【請求項１２】 請求項１１に記載のポリペプチドであって、ここで該ポリ
    ペプチドまたはそのフラグメントが、以下： ａ）線維芽細胞増殖因子様活性； ｂ）細胞増殖性活性； ｃ）腫瘍形成活性；および ｄ）神経保護様活性、 からなる群から選択される活性を有する、ポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 請求項１１に記載のポリペプチドに選択的に結合する抗体
    、ならびに該抗体のフラグメント、ホモログ、アナログ、および誘導体。
  14. 【請求項１４】 請求項１１に記載のポリペプチドを産生する方法であって
    、該方法は、前記核酸分子が発現される条件下で、請求項１０に記載の宿主細胞
    を培養する工程を包含する、方法。
  15. 【請求項１５】 サンプル中において請求項１１に記載のポリペプチドの存
    在を検出する方法であって、該サンプルを請求項１１に記載のポリペプチドに選
    択的に結合する化合物と接触させる工程、および請求項１１に記載のポリペプチ
    ドに結合した化合物が該サンプル中に存在するか否かを決定する工程を包含する
    、方法。
  16. 【請求項１６】 サンプル中において請求項１に記載の核酸分子の存在を検
    出する方法であって、該方法は、該サンプルを該核酸分子に選択的に結合する核
    酸プローブまたはプライマーと接触させる工程、および請求項１に記載の核酸分
    子に結合した該核酸プローブまたはプライマーが該サンプル中に存在するか否か
    を決定する工程を包含する、方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１１に記載のポリペプチドの活性を調節する方法で
    あって、該方法は、請求項１１に記載のポリペプチドを含む細胞サンプルを、該
    ポリペプチドに結合する化合物と該ポリペプチドの活性を調節するに十分な量で
    接触させる工程を包含する、方法。
  18. 【請求項１８】 障害を処置または予防する方法であって、該障害は、増殖
    性障害、分化性障害、および腫瘍形成障害から選択され、該方法は、このような
    処置または予防が所望される被験体に、以下： ａ）ＨＤＧＦＸをコードする単離された核酸分子または該核酸分子の相補体で
    あって、該分子は、配列番号２に対して少なくとも８５％同一である配列を有す
    るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子また
    は該核酸分子の相補体； ｂ）単離されたポリペプチドであって、以下からなる群から選択されるポリペ
    プチドに対して少なくとも８０％同一である、単離されたポリペプチド： ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、 ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドのフラグメントであっ
    て、該フラグメントが、配列番号２の少なくとも６個の連続したアミノ酸を含む
    、フラグメント、 ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドの誘導体、 ｉｖ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドのアナログ、 ｖ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドのホモログ、および ｖｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然に存在する対立
    遺伝子改変体であって、該ポリペプチドが、ストリンジェントな条件下で配列番
    号１の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、対立遺伝
    子改変体；ならびに ｃ）工程（ｂ）のポリペプチドに選択的に結合する抗体、ならびに該抗体のフ
    ラグメント、ホモログ、アナログ、および誘導体； からなる群から選択される治療剤の一定量を投与する工程を包含し、ここで、該
    治療剤が、該被験体における増殖性障害、分化性障害、および腫瘍形成障害のう
    ちのいずれか１つを処置または予防するために十分な量で投与される、方法。
  19. 【請求項１９】 薬学的組成物であって、以下： ａ）ＨＤＧＦＸをコードする単離された核酸分子または該核酸分子の相補体で
    あって、該分子は、配列番号２に対して少なくとも８５％同一である配列を有す
    るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子また
    は該核酸分子の相補体； ｂ）単離されたポリペプチドであって、以下からなる群から選択されるポリペ
    プチドに対して少なくとも８０％同一である、単離されたポリペプチド： ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、 ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドのフラグメントであっ
    て、該フラグメントが、配列番号２の少なくとも６個の連続したアミノ酸を含む
    、フラグメント、 ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドの誘導体、 ｉｖ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドのアナログ、 ｖ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドのホモログ、および ｖｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然に存在する対立
    遺伝子改変体であって、該ポリペプチドが、ストリンジェントな条件下で配列番
    号１の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、対立遺伝
    子改変体；ならびに ｃ）工程（ｂ）のポリペプチドに選択的に結合する抗体、ならびに該抗体のフ
    ラグメント、ホモログ、アナログ、および誘導体； からなる群から選択される治療有効量または予防有効量の治療剤、および薬学的
    に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
  20. 【請求項２０】 １つ以上の容器に、治療的有効量または予防的有効量の請
    求項１９に記載の薬学的組成物を含む、キット。
  21. 【請求項２１】 ヒトの疾患に関連する症候群を処置するための医薬の製造
    における治療剤の使用であって、該疾患は、増殖性障害、分化性障害、および腫
    瘍形成障害から選択され、ここで、該治療剤は、以下： ａ）ＨＤＧＦＸをコードする単離された核酸分子または該核酸分子の相補体で
    あって、該分子は、配列番号２に対して少なくとも８５％同一である配列を有す
    るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子また
    は該核酸分子の相補体； ｂ）単離されたポリペプチドであって、以下からなる群から選択されるポリペ
    プチドに対して少なくとも８０％同一である、単離されたポリペプチド： ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、 ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドのフラグメントであっ
    て、該フラグメントが、配列番号２の少なくとも６個の連続したアミノ酸を含む
    、フラグメント、 ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドの誘導体、 ｉｖ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドのアナログ、 ｖ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドのホモログ、および ｖｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然に存在する対立
    遺伝子改変体であって、該ポリペプチドが、ストリンジェントな条件下で配列番
    号１の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、対立遺伝
    子改変体；ならびに ｃ）工程（ｂ）のポリペプチドに選択的に結合する抗体、ならびに該抗体のフ
    ラグメント、ホモログ、アナログ、および誘導体、 からなる群から選択される、使用。
  22. 【請求項２２】 増殖性障害、分化性障害、および腫瘍形成障害のいずれか
    １つに対する活性の調節因子、あるいは潜伏または素因の調節因子をスクリーニ
    ングするための方法であって、該方法は、以下： ａ）増殖性障害、分化性障害、および腫瘍形成障害のいずれか１つについて危
    険性の増加した試験動物に対して、試験化合物を投与する工程であって、ここで
    、該試験動物は、ＨＤＧＦＸタンパク質を組換え的に発現する、工程； ｂ）該試験動物における該タンパク質の活性の発現を測定する工程； ｃ）該タンパク質を組換え的に発現し、かつ増殖性障害、分化性障害、および
    腫瘍形成障害のいずれか１つについて危険性の増加していないコントロール動物
    において、該タンパク質の活性を測定する工程；ならびに ｄ）該試験動物および該コントロール動物における該タンパク質の発現を比較
    する工程であって、ここで、該コントロール動物に対する該試験動物における該
    タンパク質の活性の変化は、該試験化合物が、増殖性障害、分化性障害、および
    腫瘍形成障害のいずれか１つの潜伏の調節因子であることを示す、工程、 を包含する、方法。
  23. 【請求項２３】 請求項２２に記載の方法であって、ここで前記試験動物は
    、野生型試験動物と比較して増加したレベルで、試験タンパク質導入遺伝子を発
    現するか、またはプロモーターの制御下で該導入遺伝子を発現する組換え試験動
    物であり、ここで該プロモーターは、該導入遺伝子のネイティブな遺伝子プロモ
    ーターではない、方法。
  24. 【請求項２４】 請求項１１に記載のＨＤＧＦＸポリペプチドの変更された
    レベルに関連する疾患の存在または該疾患に対する素因を決定する方法であって
    、該方法は、以下： ａ）哺乳動物被験体由来のサンプルにおける該ポリペプチドの量を測定する工
    程；および ｂ）工程（ａ）における該ポリペプチドの量を、コントロールサンプル中に存
    在する該ポリペプチドの量と比較する工程、 を包含し、ここで、該コントロールサンプルと比較した場合の工程（ａ）におけ
    る該ポリペプチドのレベルの変更が疾患状態を示す、方法。
  25. 【請求項２５】 請求項１に記載のＨＤＧＦＸ核酸の変更されたレベルに関
    連する疾患の存在または該疾患に対する素因を決定する方法であって、該方法は
    、以下： ａ）哺乳動物被験体由来のサンプルにおける該核酸の量を測定する工程；およ
    び ｂ）工程（ａ）における該核酸の量を、コントロールサンプル中に存在する該
    核酸の量と比較する工程、 を包含し、ここで、該コントロールサンプルと比較した場合の工程（ａ）におけ
    る該核酸のレベルの変更が疾患状態を示す、方法。
  26. 【請求項２６】 哺乳動物における病理学的状態を処置する方法であって、
    該方法は、被験体に、該病理学的状態を軽減する量のポリペプチドを投与する工
    程を包含し、ここで該ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリ
    ペプチドに対して少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチド、
    またはその生物学的に活性なフラグメントである、方法。
  27. 【請求項２７】 哺乳動物における病理学的状態を処置する方法であって、
    該方法は、被験体に、該病理学的状態を軽減するのに十分な量の請求項１３に記
    載の抗体を投与する工程を包含する、方法。
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