JP2003529325A - ヒト輸送タンパク質 - Google Patents

ヒト輸送タンパク質

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JP2003529325A JP2001505695A JP2001505695A JP2003529325A JP 2003529325 A JP2003529325 A JP 2003529325A JP 2001505695 A JP2001505695 A JP 2001505695A JP 2001505695 A JP2001505695 A JP 2001505695A JP 2003529325 A JP2003529325 A JP 2003529325A
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tppt
polynucleotide
polypeptide
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ユエ、ヘンリー
ヒルマン、ジェニファー・エル
タング、トム・ワイ
バンドマン、オルガ
バーフォード、ニール
ボーグン、マライア・アール
アジムザイ、ヤルダ
リュ、デュング・アイナ・エム
オウ−ヤング、ジャニス・エル
パターソン、チャンドラ
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インサイト・ゲノミックス・インコーポレイテッド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト輸送タンパク質（TPPT）と、TPPTを同定及びコードするポリヌクレオチドとを提供する。本発明はまた、発現ベクター及び宿主細胞、抗体、アゴニスト、アンタゴニストを提供する。更に、本発明は、TPPTの発現に関連する疾患の診断・治療・予防方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の技術分野） 本発明は、ヒト輸送タンパク質の核酸配列及びアミノ酸配列、並びに輸送、代
謝、神経、心血管、生殖及び免疫の異常や、癌を含めた細胞増殖異常の診断、治
療及び予防におけるこれらの配列の利用法に関するものである。
【０００２】 （発明の背景） 真核生物の細胞は、疎水性の脂質二重層膜によって囲まれ、機能的に異なるオ
ルガネラに細分される。これらの膜は多くの分子に対するバリアとして機能し、
サイトゾル、細胞外環境及び各細胞内のオルガネラの内容物の間の本質的な差異
を保持する。オルガネラ間における脂質膜を横切る必須の栄養素、所定の金属イ
オン、代謝性廃棄物、細胞シグナル分子、巨大分子及びタンパク質の輸送は、種
々の輸送分子によって媒介されなければならない。細胞質と細胞外環境との間及
び細胞質と細胞オルガネラの小胞体スペース(lumenal spaces)との間の輸送は、
特異的な輸送タンパク質を必要とする。各輸送タンパク質は、イオン、糖又はア
ミノ酸のような分子の特定のクラスを輸送し、また多くの場合にはそのクラスの
所定の分子種に対して特異的である。
【０００３】 細胞及びオルガネラは、輸送タンパク質が種々の代謝性廃棄物のみならず必須
の栄養素並びにK+、NH4+、Pi、SO4 2−を含めた金属イオン、糖及ビタミンを搬入
及び搬出することを必要とする。また、輸送タンパク質は、抗生物質抵抗性、毒
素分泌、イオンバランス、シナプス神経伝達、腎機能、腸管吸収、腫瘍成長及び
他の多様な細胞機能において作用する（Griffith, J. and C. Sansom (1998) Th e Transporter Facts Book , Academic Press, San Diego CA, pp. 3-29）。輸送
は、受動的な濃度依存的メカニズムによって起こり得るか、或いはATP加水分解
若しくはイオン勾配等のエネルギー源に関連し得る。輸送において機能するタン
パク質には、特異的な溶質と結合し、立体配置的変化を受けてその結合した溶質
を膜を横切り移動させる担体タンパク質と、親水性の細孔から特異的な溶質を膜
を通して電気化学的溶質勾配の下方に拡散させ得るチャネルタンパク質とが含ま
れる。
【０００４】 輸送タンパク質は多くの場合にはマルチパス(multi-pass)膜貫通タンパク質で
あり、それらは能動的に膜を横切り分子を輸送するか、或いは受動的に分子を横
断させ得る。能動輸送には、通常は電気化学的勾配に反して膜を横切る、溶質の
指向性ポンピング(directional pumping)が含まれる。能動輸送は、ATP加水分解
や電気化学的に有利なイオン勾配等の代謝的エネルギーの源と密接に関連する。
受動輸送には、電気化学的勾配の下方への溶質の移動が含まれる。輸送タンパク
質は、更に担体タンパク質又はチャネルタンパク質の何れかに分類され得る。担
体タンパク質は、能動輸送若しくは受動輸送において機能し得るものであり、輸
送される特異的な溶質と結合し、立体配置的変化を受けてその結合した溶質を膜
を横切り移動させる。チャネルタンパク質は、受動輸送のみで機能し、膜を横切
る親水性の細孔に基づくものである。細孔が開くと、無機イオン等の特異的な溶
質が膜を通過して溶質の電気化学的勾配を下る。例としては、イオン勾配によっ
て駆動される促通輸送体、二次的な能動的共輸送体及び対向輸送体や、MHCクラ
スI分子に対する抗原性ペプチドのターゲティング及び多剤耐性に関与する活性A
TP結合カセット輸送体が挙げられる。輸送される基質は、栄養素及びイオンから
多種多様な薬物、ペプチド類及びタンパク質にわたる。
【０００５】 小胞体膜貫通タンパク質、ARL-6（ADPリボシル化様因子）の作用の情報につい
ては、Greenfield, J. J. and S. High (1999; J. Cell Sci. 112: 14771486)を
参照されたい。還元型の葉酸の担体輸送体タンパク質の情報については、Dixon,
K. H. et al. (1994; J. Biol. Chem. 269: 17-20) 及び Moscow, J. A. et al
. (1995; Cancer Res. 55: 5983-5987)を参照されたい。
【０００６】 単一の溶質を膜の一方から他方へ輸送する担体タンパク質は、単輸送体と称さ
れる。逆に、共役輸送体は、同じ方向（共輸送）又は逆方向（対向輸送）の何れ
かにおいて、同時の１つの溶質の輸送又は第２の溶質の経時的な輸送に関与する
。例えば、腸及び腎臓上皮には、細胞膜を横切るナトリウム勾配によって駆動さ
れる種々の共輸送体系が含まれる。ナトリウムは、電気化学的な勾配の下方の細
胞内に移動すると共に、溶質を細胞内へ運ぶ。溶質の取込みのための駆動力を提
供するナトリウム勾配は、遍在性のNa+/K+ ATPアーゼによって維持される。ナト
リウム共役輸送体には、哺乳動物のグルコース輸送体（SGLTI）、ヨウ化物輸送
体（NIS）、及びマルチビタミン輸送体（SMVT）が含まれる。全ての３種の輸送
体は、１２の推定上の膜貫通セグメント、細胞外グリコシル化部位、並びに細胞
質指向(cytoplasmically-oriented)のN末端及びC末端を有する。
【０００７】 ミトコンドリアの担体タンパク質は、膜貫通タンパク質であり、細胞質ゾルと
ミトコンドリア基質の間でイオン及び荷電代謝産物を輸送する。例としては、AD
P、ATP担体タンパク質；2-オキソグルタル酸／リンゴ酸担体；水素イオンを細胞
質ゾルから基質へと輸送する褐色脂肪脱共役タンパク質；ピルビン酸担体；リン
ゴ酸、コハク酸、フマル酸、及びリン酸を輸送するジカルボン酸担体；クエン酸
及びリンゴ酸を輸送するトリカルボン酸担体；並びにグレーブス病担体タンパク
質、甲状腺機能亢進症に帰着する自己免疫疾患及び活性なグレーブス病を患う患
者においてIgGによって認識されるタンパク質が挙げられる（Stryer, L. (1995)
Biochemistry, W. H. Freeman and Company, New York NY, p. 551; PROSITE P
DOC00189 Mitochondrial energy transfer proteins signature; Online Mendel
ian Inheritance in Man (OMIM) *275000 Graves Disease）。
【０００８】 また、この輸送体のクラスには、内側のミトコンドリアの膜を横切る水素イオ
ンの漏出を引き起こし、従ってATP合成から脱共役酸化的リン酸化(uncoupling o
xidative phosphorylation)を引き起こすATPミトコンドリアの脱共役タンパク質
が含まれる。結果として、熱の形態でのエネルギー散逸をもたらす。ミトコンド
リアの脱共役タンパク質は、温度調節及び代謝率のモジュレータとして関連づけ
られており、肥満症等の代謝病に対する薬剤の潜在的な標的として提案されてい
る（Ricquier, D. et al. (1999) J. Int. Med. 245: 637-642）。
【０００９】 鉄、亜鉛、銅、コバルト、マンガン、モリブデン、セレン、ニッケル、及びク
ロム等の多くの金属イオンは、幾つかの酵素に対するコファクターとして重要で
ある。例えば、亜鉛は細胞外基質メタロプロテイナーゼ等の酵素の作用に必要と
され、亜鉛イオンは、ジンクフィンガー、ジンククラスター、及びLIMドメイン
を含めた転写制御因子において通常見られる幾つかのモチーフを安定化する。亜
鉛及び他の金属イオンは、食事制限において必ず与えられるものであり、胃腸管
において輸送体によって吸収される。血漿タンパク質は、金属イオンを肝臓及び
他の標的器官へ輸送し、ここでは、特異的な輸送体が必要に応じてイオンを細胞
及び細胞オルガネラに移動させる。金属イオン代謝の不均衡は、多くの症状と関
連づけられている（Danks, D. M. (1986) J. Med. Genet. 23: 99-106）。
【００１０】 最も大きく最も多様な既知の輸送タンパク質のファミリーは、ATP結合カセッ
ト（ABC）輸送体である。ファミリーとしてABC輸送体が輸送可能な物質は、化学
的構造が著しく異なり、その大きさはイオン、糖、アミノ酸、ペプチド、及びリ
ン脂質糖の小さな分子から、リポペプチド、大きなタンパク質、及び合成の疎水
性薬剤にまで及ぶ。ABCタンパク質は４つの分子、即ちATPを加水分解して輸送体
に必要なエネルギを供給する２つのヌクレオチド結合ドメイン（NBD）と、各々
が６つの推定上の膜貫通セグメントを含む２つの膜貫通ドメイン（MSD）からな
る。これらの４つのモジュールは、嚢胞性線維症の膜貫通レギュレータの場合の
ように単一の遺伝子によってコードされるか、或いは別々の遺伝子によってコー
ドされる。別々の遺伝子によってコードされる場合、各遺伝子産物には単一のMB
D又はMSDが含まれる。これらの「半分の分子(half-molecules)」は、Tap1及びTa
p2等のホモ及びヘテロダイマー、小胞体に基づく主要組織適合性（MHC）ペプチ
ド輸送系を形成する。幾つかの遺伝病は、次に示す疾病及びそれらに対応するタ
ンパク質のように、ABC輸送体のABC輸送体の欠陥に起因する。それらは、嚢胞性
線維症（CFTR、イオンチャネル）、副腎白質萎縮症（副腎白質萎縮症タンパク質
、ALDP）、ツェルヴェーガー症候群（ペルオキシソーム膜タンパク質-70、PMP70
）、及び高インシュリン性低血糖症（スルホニル尿素受容体、SUR）である。ヒ
ト癌細胞における多剤耐性（MDR）タンパク質及び他のABC輸送体の過剰発現によ
って、化学療法に用いられる種々の細胞毒性の薬物に対する細胞の耐性がもたら
される（Taglicht, D. and S. Michaelis (1998) Methods Enzymol. 292: 131-1
63）。
【００１１】 核膜孔複合体（NPC）は、核と細胞質の間のタンパク質及びRNA分子の輸送を媒
介して遺伝子発現の調節に寄与する核膜にまたがる大きな多タンパク質複合体で
ある。NPCは、イオン、小分子、及び約60kD未満の巨大分子の受容拡散を許容し
、一方でより大きな巨大分子は促進性でエネルギ依存性の経路によって輸送され
る。塩基性残基に濃縮されたアミノ酸の短い伸展よりなる核局在化シグナル（NL
S）は、糖質コルチコイド受容体のように核に対する標的とされるタンパク質に
おいて見られる。NLSはNLS受容体importinによって認識され、そこで単量体のGT
P結合タンパク質と相互作用する。このNLSタンパク質／受容体／Ran複合体は、
ホモ二量体のタンパク質核輸送因子２（NTF2）に補助され核膜孔を移動する（Na
kielny, S. and G. Dreyfuss (1997) Curr. Opin. Cell Biol. 9: 420429; Gorl
ich, D. (1997) Curr. Opin. Cell Biol. 9: 412-419）。４つのＯ連鎖の糖タン
パク質p62、p58、p54、及びp45は、NPCの核質及び細胞質の表面の双方に局在化
する環を形成する安定な「p62複合体」として存在する。p62、p58、及びp54タン
パク質は、細胞質ゾルの輸送因子p97及びNTF2と全て直接的に相互作用し、この
ことはp62複合体がNPCの中央のゲートチャネル付近の重要なリガンド結合部位で
あることを示唆している（Hu, T. et al. (1996) J. Cell Biol. 134: 589-601
）。
【００１２】 また、輸送は、例えばショウジョウバエからヒトまでにわたる種属のオス及び
メスの生殖系列における姉妹細胞の細胞質を結ぶ細胞間橋によって起こり得る。
これらの橋は、発達において細胞間での細胞質物質の通過を可能とする。また、
細胞間橋は体細胞を結合することも分かっている。４ラウンドの有糸分裂によっ
て単一の前駆細胞から得られたショウジョウバエの卵室のナース細胞及び卵母細
胞は、環状管と称される細胞間橋によって互いに結びつけられる。その細胞は有
糸分裂の後に完全には分離せず、有糸分裂の分裂溝は、細胞間のトンネルを裏打
ちするアクチン細胞骨格の付加によって環状管に形質転換される。ショウジョウ
バエのkelchタンパク質は、環状管におけるアクチンの組織化において機能する
。kelchにおける変異は、ショウジョウバエにおいてメスの生殖不能を引き起こ
す。kelchには、４つのタンパク質ドメイン、即ちN末端におけるNTRドメイン、B
TB或いはPOZドメイン、IVR或いは介在性の領域、及び６つの５０個のアミノ酸ke
lch反復を含むkelch反復ドメインが含まれる。BTB或いはPOZドメイン、転写制御
因子を含む幾つかのジンクフィンガーにおいて見られる１２０のアミノ酸モチー
フは、kelchの二量体化において重要であり得る。kelch反復は、同様に他のタン
パク質においても見られ、アクチン結合にとって重要であり得る（Robinson, D.
N. and L. Cooley (1997) J. Cell Biol. 138: 799-810; Cooley, L. (1998) C
ell 93: 913-915）。
【００１３】 イオンチャネル 細胞の電位は、細胞膜を横切るイオンの移動を調節することによって生じ、ま
た維持される。イオンの移動には、膜においてイオン選択性の細孔を形成するイ
オンチャネルを必要とする。イオンチャネルは、共通の構造的及び機構的テーマ
を共有する。そのチャネルは、４つ若しくは５つのサブユニット或いはタンパク
質モノマーからなり、それは細胞膜において円筒状に配置されている。各サブユ
ニットは、通常は６つの潜在的な膜貫通セグメントからなる（S1、S2、S3、S4、
S5及びS6）。円筒の中央は、αへリックス又はβストランドに沿って並ぶ細孔を
形成する。αへリックス及びβストランドを含むアミノ酸残基の側鎖は、チャネ
ルの電荷（カチオン又はアニオン）選択性を確立する。選択性の度合、或いはど
のような特異的なイオンがチャネルの通過を許容されるかは、細孔の最も狭い部
分の直径に左右される。イオンチャネルには、基本的な２つのタイプ、イオン輸
送体及び開閉型イオンチャネル(gated ion channels)が存在する。イオン輸送体
は、ATP加水分解から得られたエネルギを利用し、イオン濃度勾配に反してイオ
ンを能動的に輸送する。開閉型イオンチャネルは、制限された条件下で、イオン
の電気化学的勾配の下方へのイオンの受動的な流れを可能とする。これらのイオ
ンチャネルのタイプは共に（１）神経細胞の軸索に沿った電気インパルス伝導、
（２）細胞における濃度勾配に反する分子の輸送、（３）筋収縮の開始、及び（
４）内分泌細胞の分泌において利用される電気化学的勾配を生じさせ、維持し、
また利用する。
【００１４】 膜貫通ATPアーゼは３つのファミリーに分類される。リン酸化（P）クラスイオ
ン輸送体には、リン酸化によって活性化されるNa+-K+ ATPアーゼ、Ca2+ ATPアー
ゼ、H+ ATPアーゼ、及びCu++ATPアーゼが含まれる。Pクラスイオン輸送体は、細
胞質ゾルのNa+及びCa2+の濃度を低く、細胞質ゾルのK+の濃度を高くするような
静止電位分布の保持を担う。イオン輸送体の空胞性（V）クラスには、リソソー
ム及びゴルジ等の細胞内オルガネラにおけるプロトンポンプが含まれる。Vクラ
スイオン輸送体は、機能に必要とされるこれらのオルガネラのルーメンにおいて
低いpHを生じさせることを担う。共役因子（F）クラスは、ミトコンドリアにお
けるプロトンポンプからなる。Fクラスイオン輸送体は、水素イオン勾配を利用
し、ADP及び無機リン酸塩からATPを生成する。
【００１５】 Cu++ATPアーゼは、細胞から銅を搬出する（PROSITE PDOC00139 E1-E2 ATPases
phosphorylation site）。或るCu++ATPアーゼにおける変異はウィルソン病を引
き起こし、そこでは幾つかの器官（特に肝臓及び脳）において有毒な量の銅が蓄
積する（Tanzi, R. E. et al. (1993) Nat. Genet. 5: 344-350）。別のCu++ATP
アーゼにおける変異はメンケス病及び後角症候群を引き起こす。メンケス病の変
異は、胃腸管からの銅の搬出を遮断し、骨格異常、重度の精神遅滞、神経性の変
性症、及び早期の幼児期の死亡を引き起こす（Harrison, M. D. and C. T. Dame
ron (1999) J. Biochem. Mol. Toxicol. 13: 93-106）。後角症候群の変異は、
結合組織欠陥を引き起こす（Harrison, supra ; Levinson, B. et al. (1996) H
um. Mol. Genet. 5: 1737-1742）。 イオン輸送体の共役因子（F）クラスは、ミトコンドリア、葉緑体、及び細菌
におけるプロトンポンプからなる。例えばF0F1 ATPアーゼは、内側のミトコンド
リア膜を横切る水素イオン勾配を利用し、ADP及び無機リン酸塩（Pi）からATPを
生成する。F0F1 ATPアーゼは、水素イオンが流れる膜貫通チャネルであるF0複合
体と、ATP合成活性が存在するF1複合体とからなる。F0は３つのサブユニット、A
（プロテイン６として知られる）、B、及びCを有する（Lodish, H. et al. (199
5) Molecular Cell Biology. Scientific American Books, New York NY, pp. 7
52-756; PROSITE PDOC00420 ATP synthase a subunit signature）。 電位開閉型Ca2+チャネルは、シナプス前神経伝達物質の放出、及び心筋及び骨
格筋収縮に関与している。骨格筋の電位開閉型Ca2+チャネル（L型チャネル）及
び脳（N型チャネル）の電位開閉型Ca2+チャネルが精製されており、両者はその
機能は全く異なっているが、類似のサブユニット組成を有している。チャネルは
３つのサブユニットからなる。α１サブユニットは、膜細孔及び電位センサを形
成し、α２δ及びβサブユニットは、電位依存性、ゲート開閉特性、及びチャネ
ルの流れの振幅を変調する。これらのサブユニットは、少なくとも６個のα１、
１個のα２δ、及び４個のβ遺伝子によってコードされる。第４のサブユニット
γは、平滑筋において同定されている（Walker,D. et al. (1998) J. Biol. Che
m. 273: 2361-2367; and Jay, S. D. et al. (1990) Science 248: 490-492）。
ヒトβ４サブユニットは、マウス癲癇遺伝子lethargicのホモログであり、失調
症及び欠神てんかんを含めた神経性の障害に関与するものの候補である（Escayg
, A. et al. (1998) Genomics 50: 14-22）。
【００１６】 リガンド開閉型チャネルは、細胞内外のメディエータがそのチャネルに結合し
たときにその細孔を開く。神経伝達物質開閉型チャネルは、神経伝達物質がそれ
らの細胞外ドメインに結合したときに開くチャネルである。これらのチャネルは
、神経又は筋肉細胞のシナプス後の膜に存在する。神経伝達物質開閉型チャネル
には２種類が存在する。ナトリウムチャネルは、アセチルコリン、グルタミン酸
塩、及びセロトニンのような興奮性神経伝達物質に応答して開く。これが開くこ
とによりNa+の流入が生じ、電位開閉型チャネルを活性化し、活動電位を開始さ
せる初めの局所的な脱分極が生じる。塩素イオンチャネルは、γアミノ酪酸（GA
BA）及びグリシンのような抑制性神経伝達物質に応答して開き、これにより膜の
過分極が生じ、その後活動電位が生成される。
【００１７】 イオンチャネルは、幾つかの組織において発現され、そこで種々のプロセスに
関与する。CNGチャネルは、光受容体及び嗅覚細胞において大量に発現される一
方で、肝臓、肺、松果体、網膜の神経節細胞、精巣、大動脈、及び脳においても
見られる。カルシウム活性化K+チャネルは、腎臓におけるブラジキニンの血管拡
張性の効果並びに血中の脳の毛細管内皮細胞から過剰なK+を血中に流すことを担
う。また、それらはアゴニスト刺激の脱分極後の顆粒球の再分極に関連づけられ
る（Ishi, T. M. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 11651-11656
）。他の膜貫通タンパク質、leukotrine B4受容体（BLT）は、感染症に対する宿
主細胞の防御及び炎症反応に関与していると考えられる。また、BLTはHIV補助受
容体として機能する（Izumi, T. et al. (1997) Nature 387: 620-624; Martin,
V. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274: 8597-8603）。
【００１８】 イオンチャネルは薬物治療の標的とされてきた。神経伝達物質開閉型チャネル
は、不眠症、不安、うつ病、及び精神分裂病の処置ための治療における標的とさ
れてきた。電位開閉型チャネルは、不整脈、虚血性発作、頭部外傷、神経変性の
障害のための治療における標的とされてきた（Taylor, C. P. and L. S. Narasi
mhan (1997) Adv. Pharmacol. 39: 47-98）。
【００１９】 K+チャネルは全ての種類の細胞に存在し、電圧、ATP濃度、Ca++及びcAMPのよ
うな２次メッセンジャーによって調節され得る。非興奮性の組織では、Ｋ＋チャ
ネルは、タンパク質合成、内分泌の調節、及び膜の内外での浸透圧平衡の維持に
関与する。神経や他の興奮性の細胞では、活動電位の調節及び膜の再分極に加え
て、K+チャネルは、静止膜電位を設定する役目も担う。サイトゾルは非拡散性の
陰イオンを含み、この正味の負の電荷との平衡をとるために、そのような細胞は
Na+、K+、及びCl-の再分配をもたらすイオンチャネル及びNa+-K+ポンプを有する
。このポンプは、Na+を細胞外に、K+を細胞内に3:2の比率で能動輸送する。細胞
膜におけるイオンチャネルにより、K+及びCl−が受動的な拡散によって流れ得る
ことになる。サイトゾル内の高い負の電荷のために、Cl−は細胞外に流出する。
K+の流動は、K+を細胞内に押し込む起電力、K+を細胞から押し出すK+の濃度勾配
によって平衡がとられる。従って、静止膜電位は、主としてK+の流動によって調
節される（Salkoff, L. and T. Jegla (1995) Neuron 15: 489492）。NY-REN-45
、K+チャネル内在性膜たん白質についての情報は、Scanlan, M. J. et al.（199
8; Int. J. Cancer 76: 652-658）を参照されたい。emopamil結合タンパク質（E
BP）は、原核生物及び真核生物の双方の薬物輸送タンパク質と構造的特徴を共有
する。Na+チャネル、膜貫通タンパク質ミエリン蛋白ゼロ（MPZ）は、デジェリー
ヌ‐ソッタ病(Dejerine-Scottas disease)（遺伝性の運動及び感覚性の神経障害
III型）の幾つかの散発性の症例の原因であり得る（Hayasaka, K. et al. (1993
) Nat. Genet.5: 266-268）。
【００２０】 K+細孔形成サブユニットは通常６個の膜貫通ドメインを有し、５番目と６番目
の膜貫通領域の間に膜電位を検知する短い領域を有し、そのアミノ末端及びカル
ボキシ末端は細胞内に位置している。哺乳動物の心臓では、心室の活動電位にあ
る時間がK+の流動によって制御される。従ってK+チャネルは、心臓の鼓動の速度
及び律動の調節の要となる。K+チャネルの機能障害は、高血圧症、低カリウム血
症、及び関連するバーター症候群及びゲテルマン(Getelman)症候群等の様々な腎
疾患との関連を有するとともに、てんかんを含む神経疾患等との関連を有する。
老人斑の主要な成分、即ちβアミロイド又はAβが、海馬のニューロンにおける
電位開閉型カルシウムチャネルをブロックするという観察結果から、アルツハイ
マー病にも関連づけられている（Antes, L. M. et al.(1998) Seminar Nephrol.
18: 31-45; Stoffel, M. and L. Y. Jan (1998) Nat. Genet. 18: 6-8; Madeja
, M. et al. (1997) Eur. J. Neurosci. 9: 390-395; Good, T. A. et al. (199
6) Biophys. J. 70: 296-304）。
【００２１】 開閉型イオンチャネルは、細孔の開閉を調節することによってイオンの流れを
制御する。これらのチャネルはゲート開閉機能の調節方法に従って分類される。
力学的開閉型イオンチャネルは、機械的なストレスに応答して細孔を開き、電位
開閉型のチャネルは、膜電位の変化に応答して細孔を開き、リガンド開閉型チャ
ネルは、特異的なイオン、ヌクレオチド及び神経伝達物質の存在下において細孔
を開く。
【００２２】 電位開閉型のNa+チャネルは、神経細胞、骨格筋、心臓、及び神経内分泌組織
の電気的な興奮性の原因である。例えば、電位開閉型のNa+チャネルの逐次の開
閉は、神経細胞の軸索への活動電位の伝播に帰着する。ラットの脳組織から単離
されたNa+チャネルは、２つのより小さい補助的なサブユニットβ１及びβ２に
関連するαサブユニットを形成する260kDaの細孔からなるヘテロトリマー複合体
である。β２サブユニットは、内在性膜糖タンパク質であって、細胞外のIgドメ
インを含み、それとα及びβ１サブユニットとの連合は、チャネルの機能の上昇
、チャネルのゲート開閉特性の変化、及び細胞全体のキャパシタンスの増大と相
関する（Isom, L. L. et al. (1995) Cell 83: 433-442）。
【００２３】 内在性膜タンパク質 既知の内在性膜タンパク質の殆どは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び
細胞内ドメインによって特徴付けられる膜貫通タンパク質（TM）である。TMドメ
インは通常、αへリックス状の高次構造を有すると推定される１５個から２０個
の疎水性のアミノ酸からなる。TMタンパク質は、バイトピック(bitopic)（I型及
びII型）及びポリトピック(polytopic)（III型及びIV型）に分類される。（Sing
er, S.J. (1990) Annu. Rev. Cell Biol. 6:247-96）。バイトピックタンパク質
は膜に一回貫通し、ポリトピックタンパク質は多数の膜貫通セグメントを含む。
シグナル伝達に関与する細胞表面受容体タンパク質として機能するTMタンパク質
には、ショウジョウバエpecanexやfrizzledタンパク質LIV-1タンパク質、NF2タ
ンパク質、及びGNS1/SUR4真核生物内在性膜タンパク質等の成長因子受容体及び
分化因子受容体及び受容体相互作用タンパク質が含まれる。TMタンパク質はまた
、ギャップ結合チャネル（コネキシン）やイオンチャネルなどのイオン或いは代
謝産物の輸送体、及びレクチンやインテグリン、フィブロネクチンなどの接着タ
ンパク質として働く。TMタンパク質はまた、calveolinなどの小胞オルガネラ形
成分子、或いは分化抗原(CD)及び糖タンパク質、ムチンなどの細胞認識分子に見
られる。コネクシンについての情報は、Kanter, H. L. et al.（1994; J. Mol.
Cell. Cardiol. 26: 861-868）を参照されたい。
【００２４】 多くの膜タンパク質（MP）は、特定の細胞下部位に対してこれらのタンパク質
を標的とするアミノ酸配列モチーフを含む。このようなモチーフの例には、例え
ば、PDZドメイン、KDEL、RGD、NGR及びGSL配列モチーフ、フォンウィルブランド
因子A(vWFA)ドメイン、EGF様ドメインがある。RGD及びNGR、GSLモチーフ含有ペ
プチドは、腫瘍脈管構造の標的癌治療において薬物送達剤として利用されてきた
（Arap, W. et al. (1998) Science, 279: 377-380）。更にMPは、細胞外分子或
いは細胞内分子との相互作用を媒介するC型レクチンドメインとして知られる糖
質認識ドメイン(CRD)などのするアミノ酸配列モチーフも含み得る。
【００２５】 Gタンパク質共役受容体（GPCR）は、細胞外のシグナルを伝達する内在性膜タ
ンパク質のスーパーファミリーである。GPCRには、成体アミンの受容体、炎症の
脂質メディエータの受容体、ペプチドホルモン及び感覚シグナルのメディエータ
の受容体が含まれる。これらの高度に保存された受容体の構造は、７つの疎水性
の膜貫通領域、細胞外のN末端、細胞質のC末端からなる。３つの細胞外ループが
３つの細胞内ループと互い違いとなって７つの膜貫通領域を結びつける。これら
のタンパク質の最も保存された部分は、膜貫通領域及び最初の２つの細胞質ルー
プである。システインのジスルフィド架橋が第２及び第３の細胞外ループを結ぶ
。第２の細胞質ループに存在する保存された酸性-Arg-芳香族残基トリプレット
は、Gタンパク質と相互作用し得る。GPCRコンセンサスパターンは、このスーパ
ーファミリーに属する殆どのタンパク質の特徴である（ExPASy PROSITE documen
t PS00237; and Watson, S. and S. Arkinstall (1994) The G-protein Linked Receptor Facts Book , Academic Press, San Diego CA, pp 2-6）。GPCRをコー
ドする遺伝子の転写活性における変異及び変化は、精神分裂病、パーキンソン病
、アルツハイマー病、薬物嗜癖、及び摂食障害等の神経性の障害と関連づけられ
ている。
【００２６】 チトクロームは、ヘム補欠分子族、強固に結合した鉄原子を含むポルフィリン
環を含む電子伝達タンパク質である。チトクロームは、呼吸、光合成、脂肪酸代
謝、及び神経伝達物質の生合成等の多種多様な細胞プロセスにおいて酸化還元酵
素として作用する。ヘム鉄原子は、電子を受取るときに第二鉄から第一鉄の酸化
状態に変化することによって実際の電子伝達体として役立つ。チトクロームは、
NADH或いはアスコルビン酸等の基質から電子を受取り、他のチトクローム、ユビ
キノン、又はセミデヒドロアスコルビン酸(semidehydroascorbic)等の他の電子
伝達体に供与する（Lodish, H. et al. (1995) Molecular Cell Biologv, Scien
tific American Books, New York NY, pp. 759-770,786-797; Sperling, P. et
al. (1995) Eur. J. Biochem. 232: 798-805; and Online Mendelian Inheritan
ce in Man (OMIM) *600019 Cytochrome b561, CYB561）。
【００２７】 チトクロームb5は、脂質及び薬物代謝に関与する膜結合酸化還元酵素における
電子供与体である。チトクロームb5は、ゴルジ、血漿、外側のミトコンドリア、
小胞体及び微小体膜において発見されている。チトクロームb5における保存され
たアミノ酸には、W34、H51、P52、G53、054、G63、F70及びH74における８つの不
変のアミノ酸、並びにL24、I35、S36、V41、Y42、N43、T45、W47、A48、L58、D6
5、T67、L85、T87及びG88における１５の保存されたアミノ酸が含まれる（番号
付けはthe sunflower cytochrome b5/delta-6 desaturase fusion protein; GI
1040729, Sperling, supraに基づく）。不変の残基H51PGGは、ヘム結合に関与す
る。チトクロームb5様ドメインは、他の酵素に関連して発見されている。例えば
、チトクロームb5様ドメインは、酵母菌及びHistoplasma capsulatumにおけるδ
-9脂肪酸デサチュラーゼ、硝酸還元酵素、亜硫酸レダクターゼ、フラボシトクロ
ムb2、Arabidopsis thalianaアシルリピドデサチュラーゼ、Boraro officinalis (ルリヂサ)、並びにHelianthus annuus（ヒマワリ）δ-6サチュラーゼの一部で
ある（Sperling, sunra; Sayanova, 0. et al (1997) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 94:4211-4216; and Mitchell, A.G. and C.E. Martin (1997) J. Biol. Che
m. 272:28281-28288）。
【００２８】 シグナルペプチドは、小胞体（ER）に輸送されるタンパク質に見られる。シグ
ナルペプチドは、疎水性塩基が多いアミノ酸の短い配列からなる。通常、シグナ
ルペプチドは、タンパク質のＮ末端の端部に見られ、サイトゾルシグナル認識ペ
プチド（SRP）によって認識される。このSRPはシグナルペプチドに結合し、ERの
内在性膜タンパク質であるSRP受容体と結合する。SRP受容体と結合すると、シグ
ナルペプチドを含む新規に産生されたタンパク質は、ER膜を通って輸送される。
シグナルペプチドを含むタンパク質は、脂質二重層の中に導入され、細胞小器官
の管腔に輸送されるか、或いは細胞外に分泌される。
【００２９】 疾病との相関 多数のヒトの疾患や異常症の病因は、膜を横切る分子の輸送における障害に起
因しうる。膜結合受容体やイオンチャネルの輸送における欠陥は、例えば、嚢胞
性線維症、グルコース‐ガラクトース吸収不全症候群、高コレステロール血症、
ギールケ病、所定の型の糖尿病等の幾つかの障害に関連する。膜を横切る小さな
分子を輸送を不能にする単一の遺伝子欠陥の障害には、例えば、シスチン尿症、
イミノグリシン尿症、Hartup病、及びファンコーニ病が含まれる（van't Hoff,
W. G. (1996) Exp. Nephrol. 4: 253-262; Talente, G. M. et al. (1994) Ann.
Intern. Med. 120: 218-226; and Chillon, M. et al. (1995) New Engl. J. M
ed. 332: 1475-1480）。
【００３０】 シスチン尿症は、システインのジスルフィド結合ダイマー、システインの輸送
不能、血中の尿に起因するシステイン遺伝病である。尿中のシステインの蓄積は
、腎臓におけるシスチン結石の形成をもたらす。
【００３１】 ヒトの血漿に存在するトランスチレチン（TTR）は、甲状腺ホルモンチロキシ
ンに結合し、そして輸送する。TTRにおける変異は、TTRからアミロイド、不溶性
の原繊維構造への転換をもたらす。結果として生じるアミロイドプラークは、家
族性のアミロイド多発神経障害及び老人性の全身性アミロイド症の発生における
原因因子であることが示されている（Miroy, G. J. et al. (1996) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 93: 15051-15056）。
【００３２】 31kDaの赤血球の内在性膜タンパク質、Stomatinは、遺伝性貧血ストマトサイ
ト増多症に関連づけられている。この貧血は、stomatinが欠乏し、Na+ 及びK+を
漏出させる赤血球によって特徴づけられる。従って、stomatinはイオン輸送の調
節において所定の役割を果たしていると推定される。赤血球のイオン輸送欠陥は
、高血圧症のような他の障害に関連づけられる（Stewart, G. W. (1997) Int. J
. Biochem. Cell Biol. 29: 271-274）。
【００３３】 新規なヒト輸送タンパク質及びそれらをコードするポリヌクレオチドの開示は
、輸送、代謝、神経、心血管、生殖及び免疫の異常や、癌を含めた細胞増殖異常
の診断、予防及び治療に役立つ新たな組成物を提供して当業者の要求を満たすも
のである。
【００３４】 （発明の要約） 本発明は、総称して「TPPT」、個別にはそれぞれ「TPPT-1」及び「TPPT-2」、
「TPPT-3」、「TPPT-4」、「TPPT-5」、「TPPT-6」、「TPPT-7」、「TPPT-8」、
「TPPT-9」、「TPPT-10」、「TPPT-11」、「TPPT-12」、「TPPT-13」、「TPPT-1
4」、「TPPT-15」、「TPPT-16」、「TPPT-17」、「TPPT-18」、「TPPT-19」、「
TPPT-20」、「TPPT-21」、「TPPT-22」、「TPPT-23」、「TPPT-24」、「TPPT-25
」、「TPPT-26」「TPPT-27」、「TPPT-28」、「TPPT-29」、「TPPT-30」、「TPP
T-31」、「TPPT-32」、「TPPT-33」、「TPPT-34」、「TPPT-35」、「TPPT-36」
、「TPPT-37」、「TPPT-38」、「TPPT-39」、「TPPT-40」、「TPPT-41」、「TPP
T-42」、「TPPT-43」と呼ぶヒト輸送タンパク質である精製されたポリペプチド
を提供する。本発明の一実施態様では、（a）SEQ ID NO:1乃至43（SEQ ID NO:1
−43）からなる一群から選択されたアミノ酸配列と、（b）SEQ ID NO:1−43から
なる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有する天然の
アミノ酸配列と、（c）SEQ ID NO:1−43からなる一群から選択されたアミノ酸配
列の生物学的に活性な断片と、（d）SEQ ID NO:1−43とからなる一群から選択さ
れたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成される一群から選択されたアミノ酸配
列を含む単離されたポリペプチドを提供する。別法では、SEQ ID NO:1−43のア
ミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００３５】 更に本発明は、（a）SEQ ID NO:1−43からなる一群から選択されたアミノ酸配
列と、（b）SEQ ID NO:1−43からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％
以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、（c）SEQ ID NO:1−43からな
る一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、（d）SEQ ID NO
:1−43からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成される
一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポ
リヌクレオチドを提供する。別法では、このポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1
−43からなる一群から選択されたポリペプチドをコードする。別法では、このポ
リヌクレオチドは、SEQ ID NO:44−86からなる一群から選択される。
【００３６】 更に、本発明は、（a）SEQ ID NO:1−43からなる一群から選択されたアミノ酸
配列と、（b）SEQ ID NO:1−43からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０
％以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、（c）SEQ ID NO:1−43から
なる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、（d）SEQ ID
NO:1−43からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成され
る一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドと機能的に結合されたプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドを
提供する。別法では、本発明は、この組換えポリヌクレオチドで形質転換された
細胞を提供する。更なる別法では、本発明は、この組換えポリヌクレオチドを含
む遺伝子組換え生物を提供する。
【００３７】 また、本発明は、（a）SEQ ID NO:1−43からなる一群から選択されたアミノ酸
配列と、（b）SEQ ID NO:1−43からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０
％以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、（c）SEQ ID NO:1−43から
なる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、（d）SEQ ID
NO:1−43とからなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成さ
れる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドの生産方法を提供する
。この方法は、（a）このポリペプチドの発現に好適な条件下で、このポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドと機能的に結合されたプロモーター配列を含
む組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を培養するステップと、（b）
このように発現したポリペプチドを回収するステップとを含む。
【００３８】 更に、本発明は、（a）SEQ ID NO:1−43からなる一群から選択されたアミノ酸
配列と、（b）SEQ ID NO:1−43からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０
％以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、（c）SEQ ID NO:1−43から
なる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、（d）SEQ ID
NO:1−43とからなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成さ
れる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する単
離された抗体を提供する。
【００３９】 更に、本発明は、（a）SEQ ID NO:44−86からなる一群から選択されたポリヌ
クレオチド配列と、（b）SEQ ID NO:44−86からなる一群から選択されたポリヌ
クレオチド配列と７０％以上の配列同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列
と、（c）前記（a）に相補的なポリヌクレオチド配列と、（d）前記（b）に相補
的なポリヌクレオチド配列と、（e）前記（a）乃至（d）のRNA等化物とで構成さ
れる一群から選択されたポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチ
ドを提供する。別法では、このポリヌクレオチドは、少なくとも６０個の連続す
るヌクレオチドを含む。
【００４０】 更に本発明は、（a）SEQ ID NO:44−86からなる一群から選択されたポリヌク
レオチド配列と、（b）SEQ ID NO:44−86からなる一群から選択されたポリヌク
レオチド配列と７０％以上の配列同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列と
、（c）前記（a）に相補的なポリヌクレオチド配列と、（d）前記（b）に相補的
なポリヌクレオチド配列と、（e）前記（a）乃至（d）のRNA等化物とで構成され
る一群から選択されたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を有す
る標的ポリヌクレオチドをサンプルにおいて検出する方法を提供する。この方法
は、（a）前記サンプル内の標的ポリヌクレオチドと相補的な配列を構成する少
なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含むプローブと前記サンプルをハイブ
リダイズさせるステップであって、前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドま
たはその断片とでハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、前記プ
ローブが前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする、該ステップ
と、（b）前記ハイブリダイゼーション複合体の存在するか否かを検出し、存在
する場合には随意選択でその収量を測定するステップとを含む。別法では、前記
プローブは、少なくとも６０個の連続するヌクレオチドを含む。
【００４１】 更に本発明は、（a）SEQ ID NO:44−86からなる一群から選択されたポリヌク
レオチド配列と、（b）SEQ ID NO:44−86からなる一群から選択されたポリヌク
レオチド配列と７０％以上の配列同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列と
、（c）前記（a）に相補的なポリヌクレオチド配列と、（d）前記（b）に相補的
なポリヌクレオチド配列と、（e）前記（a）乃至（d）のRNA等化物とで構成され
る一群から選択されたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を有す
る標的ポリヌクレオチドをサンプルにおいて検出する方法を提供する。この方法
は、（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて、前記標的ポリヌクレオチドまた
はその断片を増幅するステップと、（ｂ）増幅された前記標的ポリヌクレオチド
またはその断片が存在するか否かを検出し、存在する場合には随意選択でその収
量を測定するステップとを含む。
【００４２】 更に本発明は、（a）SEQ ID NO:1−43からなる一群から選択されたアミノ酸配
列と、（b）SEQ ID NO:1−43からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％
以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、（c）SEQ ID NO:1−43からな
る一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、（d）SEQ ID NO
:1−43とからなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成され
る一群から選択されたアミノ酸配列を含む効果的な量のポリペプチド及び好適な
医薬用賦形剤を含む医薬組成物を提供する。一実施例では、SEQ ID NO:1−43か
らなる一群から選択されたアミノ酸配列を含む医薬組成物を提供する。更に、本
発明は、患者にこの医薬組成物を投与することを含む、機能的TPPTの発現の低下
に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【００４３】 更に本発明は、（a）SEQ ID NO:1−43からなる一群から選択されたアミノ酸配
列と、（b）SEQ ID NO:1−43からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％
以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、（c）SEQ ID NO:1−43からな
る一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、（d）SEQ ID NO
:1−43とからなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成され
る一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドのアゴニストとして効果
的な化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、（a）このポリ
ペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、（b）このサンプルの
アゴニスト活性を検出するステップとを含む。別法では、本発明は、この方法に
よって同定されたアゴニスト化合物と好適な医薬用賦形剤とを含む医薬組成物を
提供する。更なる別法では、本発明は、この医薬組成物の患者への投与を含む、
機能的TPPTの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【００４４】 更に、本発明は、（a）SEQ ID NO:1−43からなる一群から選択されたアミノ酸
配列と、（b）SEQ ID NO:1−43からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０
％以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、（c）SEQ ID NO:1−43から
なる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、（d）SEQ ID
NO:1−43とからなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成さ
れる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドのアンタゴニストとし
て効果的な化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、（a）こ
のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、（b）このサン
プルのアンタゴニスト活性を検出するステップとを含む。別法では、本発明は、
この方法によって同定されたアンタゴニスト化合物と好適な医薬用賦形剤とを含
む医薬組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、この医薬組成物の患者へ
の投与を含む、機能的TPPTの過剰な発現に関連した疾患やその症状の治療方法を
提供する。
【００４５】 更に本発明は、（a）SEQ ID NO:1−43からなる一群から選択されたアミノ酸配
列と、（b）SEQ ID NO:1−43からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％
以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、（c）SEQ ID NO:1−43からな
る一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、（d）SEQ ID NO
:1−43とからなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成され
る一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する化合
物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、（a）このポリペプチド
を好適な条件下で少なくとも１つの化合物と結合させるステップと、（b）この
ポリペプチドとこの検査化合物との結合を検出して、このポリペプチドと特異的
に結合する化合物を同定するステップとを含む。
【００４６】 更に本発明は、（a）SEQ ID NO:1−43からなる一群から選択されたアミノ酸配
列と、（b）SEQ ID NO:1−43からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％
以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、（c）SEQ ID NO:1−43からな
る一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、（d）SEQ ID NO
:1−43とからなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成され
る一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドの活性を調節する化合物
をスクリーニングする方法を提供する。このスクリーニング方法は、（a）この
ポリペプチドを、その活性が許容される条件下で少なくとも１つの化合物と結合
させるステップと、ｂ）この検査化合物の存在下でのこのポリペプチドの活性を
評価するステップと、（ｃ）この検査化合物の存在下でのこのポリペプチドの活
性と、この検査化合物の不在下でのこのポリペプチドの活性とを比較するステッ
プとを含み、この検査化合物の存在下でのこのポリペプチドの活性の変化が、こ
のポリペプチドの活性を調節する化合物の存在を示唆するという特徴を有する。
【００４７】 更に本発明は、SEQ ID NO:44−86からなる一群から選択された配列を含む標的
ポリヌクレオチドの発現を変化させるのに効果的な化合物をスクリーニングする
方法であって、（a）この標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露
するステップと、（b）この標的ポリヌクレオチドの発現の変化を検出するステ
ップとを含む、該スクリーニング方法を提供する。
【００４８】 （本発明の記載について） 本発明のタンパク質及び核酸配列、方法について説明する前に、本発明は、こ
こに開示した特定の装置及び材料、方法に限定されず、その実施形態を変更でき
ることを理解されたい。また、ここで用いられる用語は、特定の実施例のみを説
明する目的で用いられたものであり、後述の請求の範囲によってのみ限定され、
本発明の範囲を限定することを意図したものではないということも理解されたい
。
【００４９】 本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その（この等）」
は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って
、例えば「或る宿主細胞」は複数の宿主細胞を含み、その「抗体」は複数の抗体
は含まれ、当業者には周知の等価物なども含まれる。
【００５０】 本明細書で用いた全ての科学技術用語は、別の方法で定義されていない限り、
本発明の属する技術分野の一般的な技術者が普通に解釈する意味と同じである。
本明細書で記述したものと類似、或いは同等の全ての装置及び材料、方法は本発
明の実施及びテストに使用できるが、好適な装置及び材料、方法をここに記す。
本明細書に記載の全ての文献は、本発明に関連して使用する可能性のある文献に
記載された細胞系、プロトコル、試薬、ベクターを記述し開示するために引用し
た。従来の発明を引用したからと言って、本発明の新規性が損なわれると解釈さ
れるものではない。
【００５１】 （定義） 用語「TPPT」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など全ての種（特にウシ
、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に
精製されたTPPTのアミノ酸配列を指す。
【００５２】 用語「アゴニスト」は、TPPTの生物学的活性を強化したり、模倣する分子を指
す。このアゴニストは、TPPTに直接相互作用するか、或いはTPPTが関与する生物
学的経路の成分と作用して、TPPTの活性を調節するタンパク質、核酸、糖質、小
分子、任意の他の化合物や組成物を含み得る。
【００５３】 用語「アレル変異配列」は、TPPTをコードする遺伝子の別の形を指す。アレル
変異配列は、核酸配列における少なくとも１つの変異によって生じ、変異mRNA若
しくは変異ポリペプチドになり、これらの構造や機能は変わる場合もあれば変わ
らない場合もある。ある遺伝子は、天然型のアレル変異配列が存在しないもの、
１つ或いは多数存在するものがある。一般にアレル変異配列を生じる変異は、ヌ
クレオチドの自然な欠失、付加、或いは置換による。これらの各変異は、単独或
いは他の変異と同時に起こり、所定の配列内で一回或いはそれ以上生じる。
【００５４】 TPPTをコードする「変異」核酸配列は、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或
いは置換が起こっても、TPPTと同じポリペプチド或いはTPPTの機能特性の少なく
とも１つを備えるポリペプチドを指す。この定義には、TPPTをコードするポリヌ
クレオチド配列の正常な染色体の遺伝子座ではない位置でのアレル変異配列との
不適当或いは予期しないハイブリダイゼーション、並びにTPPTをコードするポリ
ヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或
いは検出困難な多形性を含む。コードされたタンパク質も変異され得り、サイレ
ント変化を生じTPPTと機能的に等価となるアミノ酸残基の欠失、挿入、或いは置
換を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にTPPTの活性
が保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／また
は両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。例えば、負に荷電したアミ
ノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸には
リシン及びアルギニンが含まれ得る。類似の親水性の値をもち極性非荷電側鎖を
有するアミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニンが含まれ
得る。類似の親水性の値をもち非荷電側鎖を有するアミノ酸には、ロイシン、イ
ソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、フェニルアラニン及びチロシンが含
まれ得る。
【００５５】 用語「アミノ酸」及び「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリ
ペプチド、タンパク質配列、或いはそれらの任意の断片を指し、天然の分子及び
合成分子を含む。「アミノ酸配列」が天然のタンパク質分子の配列を指す場合、
「アミノ酸配列」及び類似の用語は、アミノ酸配列を記載したタンパク質分子に
関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。
【００５６】 用語「増幅」は、核酸配列の複製物を作製することに関連する。一般に増幅は
、この技術分野で周知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術によって行われる。
【００５７】 用語「アンタゴニスト」は、TPPTの生物学的活性を阻害或いは減弱する分子で
ある。アンタゴニストは、TPPTに直接相互作用するか、或いはTPPTが関与する生
物学的経路の成分と作用して、TPPTの活性を調節する抗体、核酸、糖質、小分子
、任意の他の化合物や組成物などのタンパク質を含み得る。
【００５８】 用語「抗体」は、抗原決定基と結合可能なFab及びF(ab')2、及びそれらの断片
、Fv断片などの無傷の分子を指す。TPPTポリペプチドと結合する抗体は、抗体を
免疫する小ペプチドを含む無傷の分子またはその断片を用いて産生可能である。
動物（例えば、マウス、ラット、若しくはウサギ）を免疫化するのに使用される
ポリペプチド或いはオリゴペプチドは、RNAの翻訳から、或いは化学的に合成可
能であり、必要に応じて担体タンパク質と結合させることも可能である。ペプチ
ドと化学的に結合した一般に用いられる担体は、ウシ血清アルブミン、チログロ
ブリン、及びキーホールリンペットヘモニアン（KLH）を含む。次ぎに、この結
合したペプチドを用いて動物を免疫化する。
【００５９】 用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の領域（即ちエピトープ）
を指す。タンパク質或いはタンパク質の断片が、宿主動物を免疫化するのに用い
られるとき、このタンパク質の種々の領域は、抗原決定基（タンパク質上の特定
の領域或いは三次元構造体）に特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る。抗原
決定基は、抗体と結合するために無傷の抗原（即ち、免疫応答を引き出すために
用いられる免疫原）と競合し得る。
【００６０】 本明細書において「アンチセンス」は、特定の核酸配列のセンス（コーディン
グ）鎖と塩基対を形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス成分には、DNA
と、RNAと、ペプチド核酸（PNA）と、ホスホロチオネートやメチルホスホネート
、ベンジルホスホネート（benzylphosphonate）などの修飾された骨格（backbon
e linkage）を有するオリゴヌクレオチドと、2'-メトキシエチル糖または2'-メ
トキシエトキシ糖などの修飾された糖を有するオリゴヌクレオチドと、5-メチル
シトシンまたは2'-deoxyuracil、7-deaza-2'-deoxyguanosineなどの修飾された
塩基を有するオリゴヌクレオチドを含み得る。アンチセンス分子は、化学合成や
転写を含む任意の方法で作り出すことができる。相補的アンチセンス分子は、一
度細胞に導入されると、細胞によって作られた天然の核酸配列と塩基対となって
二重鎖を形成し、転写や翻訳を阻害する。「負」または「マイナス」という表現
はアンチセンス鎖であり、「正」または「プラス」という表現はセンス鎖である
。
【００６１】 用語「生物学的に活性」は、天然分子の構造的、調節的、或いは生化学的な機
能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」または「免疫原
性」は、天然或いは組換え体のTPPT、合成のTPPTまたはそれらの任意のオリゴペ
プチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合
する能力を指す。
【００６２】 用語「相補的」は、塩基対合によってアニールする２つの一本鎖核酸配列間の
関係を指す。例えば、配列「５'ＡＧＴ３'」が相補的な配列「３'ＴＣＡ５'」と
対をなす。
【００６３】 「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定のアミノ酸配列を
含む組成物」は広い意味で、所定のヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列を含
む任意の組成物を指す。この組成物は、乾燥した製剤或いは水溶液を含み得る。
TPPT若しくはTPPTの断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物は、ハ
イブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは、凍結乾燥
状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合させることが可能である。ハ
イブリダイゼーションにおいて、プローブは、塩（例えば、NaCl）及び界面活性
剤（例えば、SDS：ドデシル硫酸ナトリウム）、その他の物質（例えば、デンハ
ート液、乾燥ミルク、サケ精子DNAなど）を含む水溶液に展開され得る。
【００６４】 「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにDNA配列の解析を繰り
返し行い、XL-PCRキット（PE Biosystems,Foster City CA）を用いて５'及び／
または３'の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはGEL
VIEW 断片構築システム（GCG, Madison, WI）またはPhrap (University of Wash
ington, Seattle WA)等の断片構築用のコンピュータプログラムを用いて１つ或
いはそれ以上の重複するcDNAやEST、またはゲノムDNA断片から構築された核酸配
列を指す。伸長及び重複の両方によって構築されるコンセンサス配列もある。
【００６５】 用語「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど変えない置換
を指す。即ち、置換によってそのタンパク質の構造や機能が大きくは変わらず、
そのタンパク質の構造、特にその機能が保存される。以下に、あるタンパク質の
元のアミノ酸が別のアミノ酸に置換される保存的なアミノ酸置換を示す。 元の残基 保存的な置換 Ala Gly, Set Arg His, Lys Asn Asp, Gln, His Asp Asn, Glu Cys Ala, Ser Gln Asn, Glu, His Glu Asp, Gln, His Gly Ala His Asn, Arg, Gln, Glu Ile Leu, Val Leu Ile, Val Lys Arg, Gln, Glu Met Leu, Ile Phe His, Met, Leu, Trp, Tyr Ser Cys, Thr Thr Ser, Val Trp Phe, Tyr Tyr His, Phe, Trp Val Ile. Leu, Thr 一般に、保存されたアミノ酸置換の場合は、a）置換された領域のポリペプチ
ドの骨格構造、例えば、βシートやαヘリックス高次構造、b）置換された部位
の分子の電荷または疎水性、及び／または、c）側鎖の大半が維持される。
【００６６】 用語「欠失」は、１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列の変化、或
いは１個以上のヌクレオチドが欠如する核酸配列の変化を指す。
【００６７】 用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指
す。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば、アルキル基、アシル基、ヒ
ドロキシル基、或いはアミノ基による水素の置換がある。誘導体ポリヌクレオチ
ドは、自然分子（未修飾の分子）の生物学的或いは免疫学的機能の少なくとも１
つを維持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドとは、もとのポリ
ペプチドの生物学的機能、或いは免疫学的機能の少なくとも１つを維持する、グ
リコシル化、ポリエチレングリコール化、或いは任意の同様のプロセスによって
修飾されたポリペプチドのことである。
【００６８】 「検出可能な標識」は、測定可能な信号を生成し得る、ポリヌクレオチドやポ
リペプチドに共有結合或いは非共有結合するレポーター分子や酵素を指す。
【００６９】 用語「断片」は、TPPTまたはTPPTをコードするポリヌクレオチドの固有の部分
であって、その親配列（parent sequence）と同一であるがその配列より長さが
短いものを指す。「断片」の最大の長さは、親配列から１つのヌクレオチド／ア
ミノ酸残基を差し引いた長さである。例えば、ある断片は、５〜１０００個の連
続するヌクレオチド或いはアミノ酸残基を含む。プローブ、プライマー、抗原、
治療用分子、またはその他の目的に用いる断片は、少なくとも５、１０、１５、
１６、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０若
しくは５００個の連続するヌクレオチド或いはアミノ酸残基の長さである。断片
は、優先的に分子の特定の領域から選択される場合もある。例えば、ポリペプチ
ド断片は、所定の配列に示された最初の２５０若しくは５００のアミノ酸（或い
は、ポリペプチドの最初の２５％または５０％）から選択された連続するアミノ
酸の所定の長さを含み得る。これらの長さは一例であり、配列表及び表、図面を
含む明細書に記載の任意の長さが、本発明の実施例に含まれ得る。
【００７０】 SEQ ID NO:44−86の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは
異なる、SEQ ID NO:44−86を明確に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域
を含む。SEQ ID NO:44−86のある断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増
幅技術、またはSEQ ID NO:44−86を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似
の方法に有用である。ある断片と一致するSEQ ID NO:44−86の正確な断片の長さ
や領域は、その断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に測
定できる。
【００７１】 「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例
えばメチオニン）、それに続くオープンリーディングフレーム及び翻訳終止コド
ンを有する配列である。「完全長」ポリヌクレオチド配列は、「完全長」ポリペ
プチド配列をコードする。
【００７２】 「相同性」は、２つ以上のポリヌクレオチド配列間または２つ以上のポリペプ
チド配列間の配列類似性である。この配列類似性は配列同一性と言い換えること
ができる。
【００７３】 SEQ ID NO:1−43のある断片は、SEQ ID NO:44−86のある断片によってコード
される。SEQ ID NO:1−43のある断片は、特異的にSEQ ID NO:1−43を同定する固
有のアミノ酸配列の領域を含む。例えば、SEQ ID NO:1−43のある断片は、特異
的にSEQ ID NO:1−43を認識する抗体の作製用の免疫原性ペプチドとして有用で
ある。ある断片と一致するSEQ ID NO:1−43の正確な断片の長さや領域は、その
断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に測定できる。
【００７４】 用語「類似性」は相補性の程度を表す。これには、部分的類似性と完全な類似
性とがある。用語「同一性」を「類似性」とも言える。同一の配列と標的の核酸
とのハイブリダイゼーションが少なくとも部分的に阻止される部分的に相補的な
配列は、「実質的に類似」と呼ばれる。完全に相補的な配列と標的の配列とのハ
イブリダイゼーションの阻止は、緩いストリンジェントな条件の下、ハイブリダ
イゼーションアッセイ（サザンブロッティング或いはノーザンブロッティング法
、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて検査される。実質的に類似の配列或
いはハイブリダイゼーションプローブは、緩いストリンジェントな条件の下、完
全に類似（同一）の配列と標的の配列との結合に対して競合して抑制する。これ
は、緩いストリンジェントな条件下では非特異的な結合が許容されるということ
ではなく、緩いストリンジェントな条件では、２つの配列の互いへの結合が特異
的（即ち、選択的）に相互作用しなけらばならい。部分的な相補性ともいえない
（例えば、３０％未満の類似性或いは同一性）第２の標的配列を用いて、非特異
的結合が存在しないことの検査が可能である。非特異的結合が存在しない場合は
、実質的に類似配列或いはプローブが第２の非相補的標的配列とハイブリダイズ
しない。
【００７５】 ポリヌクレオチド配列についての用語「パーセントの同一性」又は「％の同一
性」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる、２つ以上
のポリヌクレオチド配列間の一致する残基の百分率のことである。このようなア
ルゴリズムは、標準化され再現できる方法で、２つの配列間のアラインメントを
最適化するべく、配列にギャップを挿入して、より意味をもつ２つの配列間の比
較を行うことができる。
【００７６】 ポリヌクレオチド配列間の同一性のパーセントは、MEGALIGN version 3.12e配
列アラインメントプログラムに組込まれるCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルト
パラメータを用いて決定可能である。このプログラムはLASERGENEソフトウェア
パッケージの一部であり、分子生物学分析プログラム一式（DNASTAR, Madison W
I）である。このCLUSTAL Vは、Higgins, D.G. 及び P.M. Sharp (1989) CABIOS
5:151-153、Higgins, D.G. 他 (1992) CABIOS 8:189-191に記載されている。ポ
リヌクレオチド配列の対のアライメントの場合、デフォルトパラメーターは、Kt
uple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定する。「重み
付けされた」残基重み付け表が、デフォルトとして選択された。同一性のパーセ
ントは、アラインメントされたポリヌクレオチド配列間の「類似性のパーセント
」としてCLUSTAL Vによって報告される。
【００７７】 別法では、一般に用いられ、無料で入手可能な配列比較アルゴリズム一式が、
NCBI、Bethesda、MD、及びインターネット（http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/BLAS
T/）などから入手できるNational Center for Biotechnology Information (NCB
I) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul, S.F. 他 (1990) J
. Mol. Biol. 215:403-410)によって得られる。このBLASTソフトウェア一式には
、既知のポリヌクレオチド配列と様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配
列とのアラインメントに用いられる「blastn」を含む、様々な配列分析プログラ
ムが含まれる。「BLAST 2 Sequences」と呼ばれるツールが入手可能であり、２
つのヌクレオチド配列の対を直接比較するために用いられる。「BLAST 2 Sequen
ces」は、http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.htmlにアクセスして、対話形
式で利用ができる。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn 及び blastp（以
下に記載）の両方に用いることができる。BLASTプログラムは、一般的には、デ
フォルトを設定するギャップ及び他のパラメーターと共に用いられる。例えば、
２つのヌクレオチド配列を比較する場合、ある者は、デフォルトパラメータに設
定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (April-21-2000)でblast
nを使用するであろう。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、以下のよ
うにする。
【００７８】 Matrix: BLOSUM62 Reward for match: 1 Penalty for mismatch: -2 Open Gap: 5 及び Extension Gap: 2 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 11 Filter: on 同一性のパーセントは、例えば、特定の配列番号で決められた、所定の配列の
全長に対して測定してもよいし、それより短い長さに対して、例えば、ある大き
な所定の配列から得られた断片、例えば、連続する少なくとも、２０または３０
、４０、５０、７０、１００、２００のヌクレオチドの断片の長さに対して測定
してもよい。このような長さは単なる例であり、配列表及び表、図面を含む明細
書に記載の配列の任意の長さの断片を用いて、同一性のパーセントが測定される
長さを示すことができる。
【００７９】 高い同一性を示さない核酸配列でも、遺伝子コードの縮重によって類似のアミ
ノ酸配列をコードし得る。縮重を利用して核酸配列を変え、それぞれが実質的に
同じタンパク質をコードする様々な核酸配列を作製できることを理解されたい。
【００８０】 ポリペプチド配列に用いられる用語「パーセントの同一性」又は「％の同一性
」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポ
リペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラ
インメントの方法は周知である。アラインメント方法の中には、保存的なアミノ
酸置換を考慮したものもある。詳細に上述したこのような保存的な置換は、一般
に、置換部位の電荷や疎水性が保存され、ポリペプチドの構造（従って機能も）
が保存される。
【００８１】 ポリペプチド配列間の同一性のパーセントは、MEGALIGN バージョン3.12e配列
アラインメントプログラム（上記）に組込まれるCLUSTAL Vアルゴリズムのデフ
ォルトパラメータを用いて決定可能である。CLUSTAL Vを用いる対方式のポリぺ
プチド配列のアライメントの場合、デフォルトパラメーターは、Ktuple=1、gap
penalty=3、window=5、及び「diagonals saved」=5と設定する。PAM250マトリク
スが、デフォルトの残基重み付け表として選択される。ポリヌクレオチドアライ
ンメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の同一性のパー
セントは、「類似性のパーセント」としてCLUSTAL Vによって報告される。
【００８２】 別法では、NCBI BLASTソフトウェア一式が用いられる。例えば、２つのポリペ
プチド配列を対で比較をする場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定され
た「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (Apr-21-2000)でblastpを使用
するであろう。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、以下のようにする
。
【００８３】 Matrix: BLOSUM62 Open Gap: 11 及び Extension Gap: 1 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 3 Filter: on 同一性のパーセントは、例えば、特定の配列番号で決められた、所定のポリペ
プチド配列の全長に対して測定してもよいし、それより短い長さに対して、例え
ば、ある大きな所定のポリペプチド配列から得られた断片、例えば、連続する少
なくとも１５、２０または３０、４０、５０、７０、１５０の残基の断片の長さ
に対して測定してもよい。このような長さは単なる例であり、配列表及び表、図
面を含む明細書に記載の配列の任意の長さの断片を用いて、同一性のパーセント
が測定される長さを示すことができる。
【００８４】 「ヒト人工染色体（HAC）」は、約６kb（キロベース）〜１０MbのサイズのDNA
配列を含み得る、安定した有糸分裂染色体の分離及び維持に必要な全てのエレメ
ントを含む直鎖状の小染色体である。
【００８５】 用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せる
ために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。
【００８６】 「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、
ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリ
ングのプロセスである。特異的なハイブリダイゼーションとは、２つの核酸配列
が高い相同性を有することを意味する。アニーリングが許容される条件下で、特
異的なハイブリダイゼーション複合体が形成され、洗浄過程の後もハイブリダイ
ズしたままである。洗浄過程は、ハイブリダイゼーションプロセスの厳密性即ち
ストリンジェント（stringency）の決定において特に重要であり、よりストリン
ジェントな条件では、非特異的な結合、即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の
結合が減少する。核酸配列間のアニーリングが許容される条件は、当業者によっ
て日常的に決定され、ハイブリダイゼーションの間は一定であるが、洗浄過程は
、目的のストリンジェントにするためにその最中に条件の変更が可能であり、ハ
イブリダイゼーション特異性が得られる。アニーリングが許容される条件は、例
えば、温度が６８℃で、約６×SSC、約１％（w/v）のSDS、並びに約１００μｇ
／ｍｌのせん断して変性したサケ精子DNAが含まれる。
【００８７】 一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、洗浄過程を行う際
の温度によっても左右される。この洗浄温度は通常、所定のイオン強度とｐＨに
おける特定の配列の熱融点（Tm）より約５〜２０℃低く選択される。このTmは、
（所定のイオン強度とｐＨの下）標的の配列の５０％が完全に一致するプローブ
とハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式及び核酸のハイブリダイゼー
ションの条件は、周知であり、Sambrook, J. 他による, 1989, Molecular Cloni ng: A Laboratory Manual , 第2版の1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainvi
ew NY; 特に2巻の9章に記載されている。
【００８８】 本発明のポリヌクレオチド間の高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーシ
ョンでは、約０．２x SSC及び約１％のSDSの存在の下、約６８℃で１時間の洗浄
過程を含む。別法では、６５℃、６０℃、５５℃、４２℃の温度で行う。SSCの
濃度は、約０．１％のSDSが存在の下、約０．１〜２x SSCの範囲である。通常は
、ブロッキング試薬を用いて非特異的なハイブリダイゼーションを阻止する。こ
のようなブロッキング試薬には、例えば、約１００〜２００μｇ／ｍｌの切断さ
れ変性したサケ精子DNAが含まれる。約３５〜５０％v/vの濃度のホルムアミドな
どの有機溶剤が、例えば、RNAとDNAのハイブリダイゼーションなどの特定の場合
に用いることができる。これらの洗浄条件の有用な改変は、当業者には周知であ
る。特に高いストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーションは、ヌクレオ
チド間の進化における類似性を示唆し得る。このような類似性は、それらのヌク
レオチド及びコードされたポリペプチドが類似の役割を果たしていることを強く
示唆する。
【００８９】 用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合によっ
て、形成された２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体
は溶液中（例えば、Ｃ０ｔまたはＲ０ｔ分析）で形成されるか、或いは溶液中の
１つの核酸配列と固体の支持物（例えば、紙、膜、フィルター、チップ、ピン、
或いはスライドガラス、または細胞及びその核酸を固定する任意の適当な基板）
に固定されたもう一つの核酸配列とで形成され得る。
【００９０】 用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチド
がそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いは核酸配列の変化を指す。
【００９１】 「免疫応答」は、炎症性疾患及び外傷、免疫異常、感染症、遺伝病などに関連
する症状を指す。これらの症状は、細胞系及び全身防衛系に影響を及ぼすサイト
カイン及びケモカイン、別の情報伝達分子などの様々な因子の発現という特徴を
もつ。
【００９２】 用語「マイクロアレイ」は、基質上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチド
またはその他の化合物の構成を指す。
【００９３】 用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有
の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化
合物を指す。
【００９４】 用語「変調」は、TPPTの活性の変化を指す。例えば、変調によって、TPPTのタ
ンパク質活性、或いは結合特性、またはその他の生物学的特性、機能的特性或い
は免疫学的特性の変化が起こる。
【００９５】 用語「核酸」及び「核酸配列」は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリ
ヌクレオチド、或いはそれらの断片を指し、一本鎖若しくは二本鎖であって、セ
ンス鎖或いはアンチセンス鎖であるゲノム起源若しくは合成起源のDNA或いはRNA
、ペプチド核酸（PNA）、任意のDNA様物質、及びRNA様物質である。
【００９６】 「機能的に結合した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係に
ある状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を
与える場合、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に結合している。一般
に、機能的に結合したDNA配列は、同じ読み枠内で２つのタンパク質をコードす
る領域が結合する必要がある場合は、非常に近接或いは連続する。
【００９７】 「ペプチド核酸（PNA）」は、末端がリシンで終わるアミノ酸残基のペプチド
骨格に結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含
む、アンチセンス分子又は抗遺伝子剤を指す。この末端のリシンにより、この組
成物が溶解性となる。PNAは、相補的な一本鎖DNAやRNAに優先的に結合して転写
物の伸長を止め、ポリエチレングリコール化して細胞における寿命を延ばし得る
。
【００９８】 TPPTの「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、
ラセミ化、蛋白分解性切断及びその他の当分野で既知の修飾を含まれ得る。これ
らのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、TPPTの酵素
環境に依存し、細胞の種類によって異なり得る。
【００９９】 「プローブ」とは、同一配列或いはアレル核酸配列、関連する核酸配列の検出
に用いる、TPPTやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸配列
のことである。プローブは、検出可能な標識またはレポーター分子が結合され単
離されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドである。典型的な標識には、放
射性アイソトープ及びリガンド、化学発光試薬、酵素がある。「プライマー」と
は、相補的な塩基対を形成して標的のポリヌクレオチドにアニーリング可能な、
通常はDNAオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーがポリヌクレ
オチドにアニーリングした後、あるDNAポリメラーゼ酵素によって、標的のDNA一
本鎖に沿って伸長される。プライマーの組は、例えば、PCR法における核酸配列
の増幅（及び同定）に用いることができる。
【０１００】 本発明に用いられるプローブ及びプライマーは、既知の配列の少なくとも１５
の連続するヌクレオチドを含む。特異性を高めるために、より長いプローブ及び
プライマーが用いることも可能である。例えば、開示した核酸配列の連続する少
なくとも２０または２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００
、１５０のヌクレオチドを含む。プローブ及びプライマーは、上記した例より相
当長いものも用いることができ、本明細書の表及び図面、配列表に示された任意
の長さのヌクレオチドも用いることができることを理解されたい。
【０１０１】 プローブ及びプライマーの準備及び使用方法については、例えば、Sambrook,
J.他による、1989年、名称「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第2
版の1-3巻(Cold Spring Harbor Press, Plainview NY)、またはAusubel, F.M.
他による、1987年、名称「Current Protocols in Molecular Biology」(Greene
Pubi. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY)、並びに Innis他による、
1990年、名称「PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications」(Acade
mic Press, San Diego CA.)を参照されたい。PCR用のプライマーの組は、例えば
、Primer (Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research
, Cambridge MA)などのそのような目的のためのコンピュータプログラムを用い
て、ある既知の配列から引き出すことができる。
【０１０２】 プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドは、当分野で周知のプライマー選
択用のコンピュータプログラムで選択される。例えば、OLIGO 4.06ソフトウェア
は、それぞれが最大１００ヌクレオチドまでのPCR用のプライマーの対の選択、
及び３２，０００塩基までの入力ポリヌクレオチド配列から最大５，０００ヌク
レオチドまでの大きなポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの分析に有用で
ある。類似のプライマー選択用プログラムには、能力を拡大する追加の機能が含
まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム（Genome Center at Uni
versity of Texas South West Medical Center, Dallas TXより入手可能）は、
メガベース配列から特定のプライマーを選択できるため、ゲノムワイドスコープ
（genome-wide scope）におけるプライマーの設計に有用である。Primer3プライ
マー選択プログラム（Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research,
Cambridge MA1より入手可能）によって、ユーザーは、プライマー結合部位とし
て避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（mispriming libaray
）」を入力できる。また、Primer3は、特にマイクロアレイのオリゴヌクレオチ
ドの選択に有用である（後の方の２つのプライマー選択プログラムのソースコー
ドは、それぞれのソースから得ることができ、ユーザーのニーズを満たすように
変更することもできる）。PrimerGenプログラム（UK Human Genome Mapping Pro
ject Resource Centre, Cambridge UK より入手可能）は、多数の配列アライン
メントに基づいてプライマーを設計するため、アラインメントされた核酸配列の
最も保存された領域或いは最も保存されていない領域のどちらかとハイブリダイ
ズするプライマーを選択することができる。従って、このプログラムは、固有及
び保存されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドの断片の同定に有用である
。上記した任意の選択方法で同定されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチド
の断片は、例えば、PCR法やシークエンシングプライマー、マイクロアレイエレ
メント、或いはサンプルの核酸の完全或いは部分的に相補的なポリヌクレオチド
を同定する特定のプローブなどの、ハイブリダイゼーション技術に有用である。
オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記した方法に制限されるものではない。
【０１０３】 本明細書における「組換え核酸」は天然の配列ではなく、２つ以上の配列の離
れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人工の組み合せは、化
学合成によって作られる場合も多いが、前出のSambrook に記載されたような遺
伝子工学の技術を用いて核酸の離れたセグメントを人工的に操作する方がより一
般的である。この「組換え核酸」には、単に核酸の一部の追加または置換、欠失
によって変更された核酸も含む。組換え核酸は、あるプロモーター配列に機能的
に結合した核酸配列を含む場合もある。このような組換え核酸は、例えば、ある
細胞を形質転換するのに用いられるベクターの一部であり得る。
【０１０４】 別法では、このような組換え核酸は、この組換え核酸を発現する哺乳動物のワ
クチン接種に用いると、その哺乳動物の防衛的な免疫応答を誘発する、ワクシニ
アウイルスに基づいたウイルスベクターの一部であり得る。
【０１０５】 「調節エレメント」は、通常は遺伝子の非翻訳領域に由来する核酸配列であり
、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５'及び３'の非翻訳領域（UTR
）を含む。調節エレメントは、転写や翻訳、またはRNAの安定性を調節する宿主
またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１０６】 「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いられる化学的
または生化学的な部分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤
、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子及びその他の
当分野で既知の成分が含まれる。
【０１０７】 本明細書において、DNA配列に対する「RNA等価物」とは、基準となるDNA配列
と同じ直鎖の核酸配列から構成されるが、窒素性塩基のチミンがウラシルに置換
され、糖鎖の背骨がデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０１０８】 用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。TPPTをコードする
核酸若しくはその断片、TPPT自体を含むと推定されるサンプルには、体液と、細
胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小器官、膜と、細胞と、溶
液中に存在する又は基板に固定されたゲノムDNA、RNA、cDNAと、組織又は組織プ
リント等も含まれ得る。
【０１０９】 用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチ
ドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しく
は合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、結合する分子に
よって認識される、例えば、抗原決定基つまりエピトープなどのタンパク質の特
定の構造の存在によって左右される。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して
特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」及び抗体を含む反応液に、エ
ピトープＡを含むポリペプチド或いは結合していない無標識の「Ａ」が存在する
と、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。
【０１１０】 用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離或い
は分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物
が少なくとも約６０％除去されたものであり、好ましくは約７５％以上の除去、
最も好ましいくは９０％以上除去されたものを指す。
【０１１１】 「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ
酸またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１１２】 用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィ
ルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビード、ゲ
ル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。この基板に
は、壁または塹壕、ピン、チャンネル、細孔などの様々な表面形態があり、そこ
にポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１１３】 「転写イメージ」は、所定条件下での所定時間における特定の細胞の種類また
は組織による集合的遺伝子発現のパターンを指す。
【０１１４】 「形質転換」とは、外来DNAが受容細胞に導入されるプロセスのことである。
形質転換は、当分野で周知の種々の方法により、自然或いは人工の条件下で起こ
り得り、原核宿主細胞若しくは真核宿主細胞の中に外来核酸配列を挿入する任意
の周知の方法によって行うことができる。この形質転換の方法は、形質転換され
る宿主細胞のタイプによって選択される。この方法には、バクテリオファージま
たはウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、リポフェクション
、及び微粒子照射が含まれるが、これらに限定されるものではない。「形質転換
された」細胞には、導入されたDNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは
宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる
。さらに、限られた時間に一時的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含
まれる。
【０１１５】 本明細書における「遺伝子組換え生物」とは、当分野で周知の遺伝子組換え技
術などを用いて、人間が生物の１つ以上の細胞に異種の核酸を導入した任意の生
物であり、動物及び植物を含むが、それらに限定されるものではない。微量注入
や組換えウイルスに感染させるなどの慎重な遺伝子操作によって、細胞の前駆体
に直接或いは間接的に異種核酸を細胞に導入する。「遺伝子操作」とは、典型的
な交雑育種やin vitroでの受精ではなく、組換えDNA分子を導入することである
。本発明に従った遺伝子組換え生物には、細菌及びラン藻類、菌類、植物、動物
が含まれる。本発明の単離されたDNAは、当分野で周知の、例えば、感染、形質
移入、形質転換、トランス接合（transconjugation）などの方法によって、宿主
に導入することができる。本発明のDNAをそのような生物に導入する技術は周知
であり、前出のSambrook他（1989）に記載されている。
【０１１６】 特定の核酸配列の「変異配列」とは、デフォルトパラメーター設定の「BLAST
2 Sequences」ツールVersion 2.0.9 (May-07-1999)を用いるblastnによって、あ
る核酸配列のある長さに対する該特定の核酸配列の同一性が、少なくとも４０％
と決定された核酸配列のことである。このような核酸の対は、ある長さにおいて
、例えば、少なくとも５０％または６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、
９５％、９８％、或いはそれ以上の同一性を示し得る。ある変異配列は、例えば
、「アレル」変異配列（上述）または「スプライス」変異配列、「種」変異配列
、「多型」変異配列と表すことができる。スプライス変異配列は基準分子と同一
性が極めて高い可能性があるが、mRNAプロセッシング中のエキソンの択一的スプ
ライシングによってポリヌクレオチドの数が多くなったり、少なくなったりする
。対応するポリペプチドは、基準分子に存在する追加の機能ドメインを有したり
、基準分子に存在するドメインが欠落したりし得る。種変異配列は、種によって
異なるポリヌクレオチド配列である。得られるポリペプチドは、互いに高いアミ
ノ酸同一性を有する。多型変異配列は、所定の種と種における特定の遺伝子のポ
リヌクレオチド配列が異なる。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１
つのヌクレオチドが異なる「１ヌクレオチド多型」（SNP）も含み得る。SNPの存
在は、例えば、或る集団、病態、病態の性向を示唆し得る。
【０１１７】 特定のポリペプチド配列の「変異体」とは、デフォルトパラメーター設定の「
BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9 (May-07-1999)を用いるblastpによっ
て、ある核酸配列のある長さに対する該特定のポリペプチド配列の同一性が、少
なくとも４０％と決定されたポリペプチド配列のことである。このようなポリペ
プチドの対は、ある長さにおいて、例えば、少なくとも５０％または６０％、７
０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、或いはそれ以上の同一性を示
し得る。
【０１１８】 （発明） 本発明は、新規のヒト輸送タンパク質（TPPT）及びTPPTをコードするポリヌク
レオチドの発見に基づいた、輸送及び代謝、神経、心血管、生殖、免疫の疾患、
並びに癌を含む細胞増殖異常の診断、治療、及び予防におけるそれらの組成物の
使用に関する。
【０１１９】 表１は、TPPTをコードする完全長のヌクレオチド配列の構築に用いたインサイ
ト社クローンを示す。列１及び列２はそれぞれ、ポリペプチド配列及びヌクレオ
チド配列の配列番号（SEQ ID NO）を示す。列３は、各TPPTをコードする核酸が
同定されたIncyteクローンのクローンIDを示し、列４は、それらのクローンが単
離されたcDNAライブラリを示す。列５は、Incyteクローン及びそれらに対応する
cDNAライブラリを示す。cDNAライブラリが示されていないインサイト社クローン
は、プールされたcDNAライブラリに由来する。Genbank配列識別子も、列５の該
当箇所に記載する。列５に示されているインサイト社クローン及びGenbank cDNA
は、各TPPTのコンセンサスヌクレオチド配列の構築に用いられ、ハイブリダイゼ
ーション技術における断片として有用である。
【０１２０】 表２の各列は、本発明の各ポリペプチドの様々な特性を示す。列１は配列番号
（SEQ ID NO）、列２は各ポリペプチドにおけるアミノ酸残基の数、列３は潜在
的なリン酸化部位、列４は潜在的なグリコシル化部位、列５はシグネチャ（sign
ature）配列及びモチーフを有するアミノ酸残基、列６は、BLAST分析によって同
定された相同配列、及び相当する引用を示す。また、引用することを持って本明
細書のの一部とする。列７は、分析方法、場合によってはその分析方法が適用で
きる検索可能なデータベースを示す。列７の分析方法は、配列相同性及びタンパ
ク質モチーフによって各ポリペプチドを特長つけるために用いられた。
【０１２１】 表３の列は、TPPTをコードするヌクレオチド配列に関連した組織特異性及び疾
患、異常症、症状を示している。表３の列１は、ヌクレオチドの配列番号（SEQ
ID NO）を示している。列２は、列１のヌクレオチド配列の断片を示している。
これらの断片は、例えば、SEQ ID NO:44−86を同定し、SEQ ID NO:44−86と関連
するポリヌクレオチド配列とを区別する、ハイブリダイゼーション若しくは増幅
の技術において有用である。これらの断片によってコードされるポリペプチドは
、例えば、免疫原性ペプチドとして有用である。列３は、TPPTを発現する組織名
、及びTPPTを発現する全組織におけるその割合を示す。列４は、TPPTを発現する
組織に関連する疾患若しくは異常症、症状、並びにTPPTを発現する全組織におけ
るそれらの割合を示す。列５は、各cDNAライブラリのサブクローニングに用いた
ベクターを示す。
【０１２２】 注目すべきは、SEQ ID NO:50が心血管組織においてのみ発現し、SEQ ID NO:56
が神経及び胃腸組織に発現し、SEQ ID NO:57が胃腸組織に発現し、SEQ ID NO:66
が神経系組織に発現することである。また、SEQ ID NO:75が組織特異的に発現す
ることにも注目されたい。SEQ ID NO:75を発現するcDNAライブラリは、７１％を
超える割合が肺組織に由来する。
【０１２３】 表４の各列は、TPPTをコードするcDNAのクローンが単離されたcDNAライブラリ
の作製に用いられた組織についての説明である。列１は、ヌクレオチドのSEQ ID
NOを示し、列２はそれらのクローンが単離されたcDNAライブラリを示し、列３
は列２のcDNAライブラリに関連する組織の由来及び詳細を示す。
【０１２４】 SEQ ID NO:44は、第７染色体の38.80〜42.10センチモルガンの範囲内にマッピ
ングされる。SEQ ID NO:48は、第１０染色体の107.90〜122.80センチモルガンの
範囲内にマッピングされる。SEQ ID NO:60は、第２染色体の157.0〜167.0センチ
モルガンの範囲内にマッピングされる。SEQ ID NO:65は、第２染色体の17.4〜40
.7センチモルガン及び第５染色体の61.1〜69.6センチモルガンの範囲内にマッピ
ングされる。この第５染色体の61.1〜69.6センチモルガンの範囲内にはコケーン
症候群に関連する遺伝子もマッピングされる。SEQ ID NO:69は、第３染色体の15
7.40〜162.00センチモルガンの範囲内にマッピングされる。SEQ ID NO:70は、第
３染色体の176.40〜179.80センチモルガンの範囲内にマッピングされる。SEQ ID
NO:71は、第１８染色体の短腕（ｐ）末端から52.30センチモルガンの範囲内に
マッピングされる。SEQ ID NO:73は、第１７染色体の75.70〜84.20センチモルガ
ン及び第２染色体の204.70〜209.30センチモルガンの範囲内にマッピングされる
。SEQ ID NO:76は、第２０染色体の79.00〜94.40センチモルガンの範囲内にマッ
ピングされる。SEQ ID NO:80は、第１８染色体の1.60〜6.20センチモルガン及び
第１１染色体の117.90〜126.00センチモルガンの範囲内にマッピングされる。SE
Q ID NO:83は、第１７染色体の67.60〜69.30センチモルガン及び83.8センチモル
ガンから長腕（ｑ）末端まで、並びに第７染色体の105.20〜114.50センチモルガ
ンの範囲内にマッピングされる。
【０１２５】 本発明はまた、TPPTの変異体も含む。好適なTPPTの変異体は、TPPTの機能的或
いは構造的特徴の少なくともどちらか一方を有し、かつTPPTアミノ酸配列に対し
て少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％のアミ
ノ酸配列同一性、更には少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１２６】 本発明はまた、TPPTをコードするポリヌクレオチドを提供する。特定の実施例
において、本発明は、TPPTをコードするSEQ ID NO:44−86からなる一群から選択
された配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。配列表に示したSEQ ID NO:
44−86のポリヌクレオチド配列は、窒素系塩基のチミンがウラシルに置換され、
糖鎖の背骨がデオキシリボースではなくリボースからなる等価RNA配列を含む。
【０１２７】 本発明はまた、TPPTをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳
細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、TPPTをコードするポリ
ヌクレオチド配列と少なくとも７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少
なくとも８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも９５％ものポ
リヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の特定の実施形態は、SEQ ID NO:44
−86からなる一群から選択された核酸配列と少なくとも７０％のポリヌクレオチ
ド配列同一性、或いは少なくとも８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には
少なくとも９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有するSEQ ID NO:44−86か
らなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列を提供す
る。上記したポリヌクレオチド変異配列は何れも、TPPTの機能的或いは構造的特
徴の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードする。
【０１２８】 遺伝暗号の縮重により作り出され得るTPPTをコードする種々のポリヌクレオチ
ド配列には、既知の自然発生する任意の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の
類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したが
って本発明には、可能なコドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作り出
され得る可能なポリヌクレオチド配列の変異の全てが含まれ得る。これらの組み
合わせは、天然のTPPTのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレッ
ト遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されていると考慮する。
【０１２９】 TPPTをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は一般に、好適に選択さ
れたストリンジェントな条件下で、天然のTPPTのヌクレオチド配列とハイブリダ
イズ可能であるが、非天然のコドンを含めるなどの実質的に異なった使い方のコ
ドンを有するTPPT或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作ることは
有利となり得る。特定のコドンが宿主によって利用される頻度に基づいてコドン
を選択して、ペプチドの発現が特定の真核細胞又は原核宿主に発生する割合を高
めることが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えないで、TPPT及びその
誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、天然の配
列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるRNA転写
物を作ることにある。
【０１３０】 本発明はまた、TPPT及びその誘導体をコードするDNA配列又はそれらの断片を
完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成配列を、当分野
で良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の何れ
の中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、TPPTまたはその任意の断片
をコードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。
【０１３１】 更に本発明には、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載されたポ
リヌクレオチド配列、特に、SEQ ID NO:44−86及びそれらの断片とハイブリダイ
ズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる(例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger
(1987) Methods Enzymol. 152:399-407; and Kimmel. A.R. (1987) Methods En
zymol. 152:507-511.を参照)。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼ
ーションの条件は、「定義」に記載されている。
【０１３２】 当分野で周知のDNAのシークエンシング方法を用いて、本発明の何れの実施例
も実行可能である。この方法には、例えばDNAポリメラーゼIのクレノウ断片、SE
QUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（PE Biosystems,
Foster City CA）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Pharmacia Biotech P
iscataway NJ）、或いはELONGASE増幅システム(Life Technologies, Gaithersbu
rg MD)にみられるような校正エキソヌクレアーゼとポリメラーゼとの組み合わせ
などの酵素が用いられる。好ましくは、MICROLAB2200液体転移システム（Hamilt
on, Reno, NV）、PTC200 Thermal Cycler200（MJ Research, Watertown MA）及
びABI CATALYST 800 (PE Biosystems) などの装置を用いて配列の準備を自動化
する。次に、ABI 373或いは377 DNAシークエンシングシステム(PE Biosystems)
、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム(Molecular Dynamics. Sunnyval
e CA)または当分野で周知の他の方法を用いてシークエンシングを行う。得られ
た配列を当分野で周知の様々なアルゴリズムを用いて分析する(例えば、Ausubel
, F.M. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N
ew York NY, unit 7.7; Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechn ology , Wiley VCH, New York NY, pp. 856-853.を参照)。
【０１３３】 当分野で周知のPCR法をベースにした種々の方法で、部分的なヌクレオチド配
列を利用して、TPPTをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節エレメ
ントなどの上流にある配列を検出する。例えば制限部位PCR法を利用する１つの
方法では、一般的なプライマー及び入れ子プライマー（nested primer）を用い
てクローニングベクター内のゲノムDNAから未知の配列を増幅する（例えば、Sar
kar, G. (1993) PCR Methods Applic 2:318-322を参照）。逆PCR法を用いる別法
では、広範な方向に伸長して環状化した鋳型から未知の配列を増幅するプライマ
ーを用いる。この鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限
断片に由来する（例えば、Triglia, T.等（1988）Nucleic Acids Res 16:8186を
参照）。キャプチャPCR法を用いる第３の方法は、ヒト及び酵母菌人工染色体DNA
の既知の配列に隣接するDNA断片のPCR増幅を含む（例えば、Lagerstrom, M.他（
1991）PCR Methods Applic 1:111-119を参照）。この方法では、多数の制限酵素
による消化及びライゲ−ションを用いて、PCRを行う前に未知の配列の領域の中
に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、当分野で周知の別の方
法を用いて未知の配列を得ることも可能である。(例えば、Parker, J.D. 他 (19
91)Nucleic Acids Res. 19:3055-3060を参照)。更に、PCR、ネスト化プライマー
、PROMOTERFINDERライブラリ（Clontech, Palo Alto CA）を用いれば、ゲノムDN
A内の歩行が可能である。この方法ではライブラリをスクリーニングする必要が
なく、イントロン／エキソン接合部を探すのに有用である。全てのPCR法をベー
スにした方法では、プライマーは、市販のOLIGO 4.06 Primer Analysis softwar
e（National Biosciences, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムなどを用
いて、長さが２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含量が５０％以上、約６８℃〜７２
℃の温度で鋳型に対してアニーリングするよう設計される。
【０１３４】 完全長のcDNAをスクリーニングする場合は、大きなcDNAを含むようにサイズが
選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、オリゴd(T)ライブラリが完
全な長さのcDNAを産生できない場合は、遺伝子の５'領域を有する配列を含むも
のが多いランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリが有用である。ゲノムライ
ブラリは、５'非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
【０１３５】 市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはPCR
産物のヌクレオチド配列のサイズの分析、または確認が可能である。詳しくは、
キャピラリーシークエンシングには、電気泳動による分離のための流動性ポリマ
ー、及び４つの異なったヌクレオチドに特異的なレーザーで活性化される蛍光色
素、放出された波長の検出に利用するCCDカメラを使用することが可能である。
出力／光強度は、適切なソフトウェア（例えば、GENOTYPER及びSEQUENCE NAVIGA
TOR、PE Biosystems）を用いて電気信号に変換され、サンプルのローディングか
らコンピュータ分析までのプロセス及び電子データ表示がコンピュータ制御可能
である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しない場合
もあるDNAの小片のシークエンシングに特に適している。
【０１３６】 本発明の別の実施例では、TPPTをコードするポリヌクレオチド配列またはその
断片を組換えDNA分子にクローニングして、適切な宿主細胞内にTPPT、その断片
または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の縮重により
、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のDNA配列が
作られ得り、これらの配列をTPPTのクローン化及び発現に利用可能である。
【０１３７】 種々の目的でTPPTをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知られ
ている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。この
目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシング及び／または発現の調節が
含まれるが、これらに限定されるものではない。ランダムな断片によるDNAの混
合や遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドのPCR再組み立てを用いて、ヌクレオ
チド配列の組換えが可能である。例えば、オリゴヌクレオチド媒介性定方向突然
変異誘発を利用して、新しい制限部位を生成する突然変異の導入、グリコシル化
パターンの変更、コドン選択の変更、スプライスバリアントの作製等が可能であ
る。
【０１３８】 本発明のヌクレオチドを、MOLECULARBREEDING (Maxygen Inc., Santa Clara C
A; 米国特許第5,837,458号; Chang, C.-C. 他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:793
-797; Christians, F.C. 他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264; Crameri, A
. 他 (1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319)などのDNAシャフリング技術を用い
てシャフリングして、TPPTの生物学的または酵素的な活性、或いは他の分子や化
合物と結合する能力などのTPPTの生物学的特性を変更或いは改良することができ
る。DNAシャフリングは、PCR法による遺伝子断片の組換えで遺伝子変異体のライ
ブラリを作製するプロセスである。次に、このライブラリを、目的の特性を有す
る遺伝子変異体を同定するために選択或いはスクリーニングする。これらの好ま
しい変異体をプールし、DNAシャフリング及び選択／スクリーニングを繰り返す
。従って、人工的な育種及び急速な分子の進化によって多様な遺伝子が作られる
。例えば、ランダムな位置に変異がある１つの遺伝子の断片を、目的の特性が最
適化するまで、組換え及びスクリーニング、シャフリングを実施することもでき
る。別法では、所定の遺伝子の断片を、同じ或いは異なった種の同じ遺伝子ファ
ミリーの相同な遺伝子の断片で組換え、それによってプロトコルに従った調節可
能な方法で、多数の天然遺伝子の遺伝子多様性を最大にすることができる。
【０１３９】 別の実施例によれば、TPPTをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を
用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Caruthers. M.H.等（1980
）Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7:215-223; 及びHorn, T.他（1980）Nucl. Acid
s Res. Symp. Ser.225-232を参照）。別法として、化学的方法を用いてTPPT自体
またはその断片を合成することが可能である。例えば、ペプチド合成は種々の固
相技術を用いて実行可能である（例えば、Creighton, T. (1984) Proteins. Str uctures and Molecular Properties , WH Freeman, New York NY, pp. 55-60; Ro
berge, J.Y.等(1995) Science 269:202-204を参照）。また、合成の自動化は例
えばABI 431Aペプチドシンセサイザー（PE Biosystems）を用いて達成し得る。
更にTPPTのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の変更、及
び／または化学的方法を用いた他のタンパク質または任意のその一部からの配列
との組み合わせにより、天然のポリペプチド配列を有するポリペプチドまたは変
異体ポリペプチドを作製することが可能である。
【０１４０】 このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィー(例えば、Chiez, R.M.
及び F.Z. Regnier (1990)Methods Enzymol. 182:392-421を参照)を用いて実質
的に精製可能である。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸分析或いはシーク
エンシングにより確認することができる(例えば、Creighton、前出、pp28-53を
参照)。
【０１４１】 生物学的に活性なTPPTを発現させるために、TPPTをコードするヌクレオチド配
列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。この発現ベクターは、好
適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要なエレメン
トを含む。これらのエレメントには、ベクター及びTPPTをコードするポリヌクレ
オチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５'
及び３'の非翻訳領域などの調節配列が含まれる。このようなエレメントは、そ
の長さ及び特異性が様々である。特定の開始シグナルによって、TPPTをコードす
る配列のより効果的な翻訳を達成することが可能である。このようなシグナルに
は、ＡＴＧ開始コドン及びコザック配列などの近傍の配列が含まれる。TPPTをコ
ードする配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入
された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであ
ろう。しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は
、インフレームのＡＴＧ開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベク
ターに含まれなければならない。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、自然及び
合成の様々なものから得ることが可能である。用いられる特定の宿主細胞系に好
適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である。(例え
ば、Scharf, D. 他 (1994) Results Probl. Cell Differ. 201−18-162.を参照)
。
【０１４２】 当業者に周知の方法を用いて、TPPTをコードする配列、好適な転写及び翻訳調
節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法に
は、in vitro組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換え技術が含まれ
る。(例えば、 Sambrook, J. 他. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Ma nual , Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, 4章及び8章, 及び１6-17章;
及び Ausubel, F.M. 他. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Jo
hn Wiley & Sons, New York NY, ch. 9章及び13章1−4章を参照)。
【０１４３】 種々の発現ベクター／宿主系を利用して、TPPTをコードする配列の保持及び発
現が可能である。これらには、限定するものではないが、組換えバクテリオファ
ージ、プラスミド、またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌など
の微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換された酵母菌や、ウイルス発現ベク
ター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベク
ター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス
、TMV）または細菌発現ベクター（例えば、TiまたはpBR３２２プラスミド）で形
質転換された植物細胞系や、動物細胞系などが含まれる（前出のSambrook、前出
のAusubel、Van Heeke, G. and S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:550
3-5509、Bitter, G.A.他 (1987) Methods Enzymol. 153:516-544; Scorer、C.A.
ら (1994) Bio/Technology 12:18 1-184; Engelhard、E.K. 他 (1994) Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V. 他 (1996) Hum. Gene Ther. 7
:1937-1945、タカマツ, N. (1987) EMBOJ. 6:307-311、Coruzzi, G. 他 (1984)
EMBOJ. 3:1671-1680、Broglie, R. 他 (1984) Science 224:838-843、Winter, J
. 他 (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105、『マグローヒル科学技
術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGr
aw Hill New York NY, pp.191-196、Logan, J. and T. Shenk (1984) Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 81:3655-3659、Harrington, J.J. 他 (1997) Nat. Genet. 1
5:345-355等を参照）。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスま
たはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由
来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団
へ輸送することができる（Di Nicola, M. 他 (1998) Cancer Gen. Ther. 5(6):3
50-356、Yu, M. 他(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(13):6340-6344、Bul
ler, R.M. 他(1985) Nature 317(6040):813-815; McGregor, D.P. 他(1994) Mol
. Immunol. 31(3):219-226、Verma, I.M. and N. Somia (1997) Nature 389:239
-242等を参照）。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない
。
【０１４４】 細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、TPPTをコード
するポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、TPPTを
コードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、
増殖には、PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla CA)またはpSPORT１プラスミド(G
IBCO BRL)などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターの多
数のクローニング部位にTPPTをコードする配列をライゲーションするとlacＺ遺
伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スク
リーニング法が可能となる。更に、これらのベクターを用いて、クローニングさ
れた配列のin vitroでの転写、ジデオキシンスクリーニング、ヘルパーファージ
による一本鎖の救出、入れ子状態の欠失を作り出すことが可能である(例えば、V
an Heeke, G.及びS.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509.を参照
)。例えば、抗体の産生のためなどに多量のTPPTが必要な場合は、TPPTの発現を
ハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力に発現を誘発するT5
またはT7バクテリオファージプロモーターを含むベクターを使用できる。
【０１４５】 TPPTの発現に酵母の発現系の使用が可能である。α因子やアルコールオキシダ
ーゼやPGHプロモーターなどの構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多種の
ベクターが、酵母菌サッカロミセス−セレビジエまたはPichia pastorisに使用
可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内
への保持のどちらかを誘導し、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列
を組み込む。(例えば、上記のAusubel.; 及びBitter, G.A. 他 (1987) Methods
Enzymol.153:51-794: Scorer. C. A. 他 (1994) Bio/Technology 121−181-184.
を参照) 植物系もTPPTの発現に使用可能である。TPPTをコードする配列の転写は、例え
ば、CaMV由来の35S及び19Sプロモーターなどのウイルスプロモーターが単独で、
或いはTMV（例えば、Coruzzi, 前出、Broglie, 前出、Winter, 前出を参照）由
来のオメガリーダー配列と組み合わせて促進される。これらの作製物は、直接の
DNA形質転換或いは病原体を介したトランスフェクションによって、植物細胞の
中に導入可能である。（例えば、The McGraw Hill Yearbook of Science and Te chnology （1992）McGraw Hill NY, pp.191-196を参照）。
【０１４６】 哺乳動物細胞では、多種のウイルスベースの発現系が利用され得る。アデノウ
イルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダ
ー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にTPPTをコードする配列を結
合し得る。ウイルスのゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域への挿入により、感
染した宿主細胞にTPPTを発現する生ウイルスを得ることが可能である（Logan, J
.及びShenk, T.（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659を参照）。さら
に、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて
、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させることが可能である。タンパク質を
高レベルで発現させるために、SV40またはEBVを基にしたベクターを用いること
が可能である。
【０１４７】 ヒト人工染色体（HAC）を用いて、プラスミドで発現しそれに含まれているも
のより大きなDNAの断片を供給可能である。治療のために約６kb〜１０MbのHACs
を作製し、従来の輸送方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、または
ベシクル）で供給する。(例えば、Harrington. J.J. 他 (1997) Nat Genet.15:3
45-355.を参照)。
【０１４８】 哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞にお
けるTPPTの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、TPPTをコ
ードする配列を株化細胞に形質転換することが可能である。このような発現ベク
ターは、ウイルス起源の複製及び／または内在性の発現要素や、同じ或いは別の
ベクターの上の選択マーカー遺伝子を含む。ベクターの導入の後、細胞を選択培
地に移す前に、強化培地で約１〜２日の間増殖させる。選択マーカーの目的は選
択的な媒介物に対する抵抗性を与えるとともに、その存在により導入された配列
を確実に発現する細胞の増殖及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細
胞の耐性クローンは、その細胞型に好適な組織培養技術を用いて増殖可能である
。
【０１４９】 任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収することが可能であ
る。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジン
キナーゼ遺伝子及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ
、それぞれtk−又はapr−細胞において使用される。(例えば、Wigler, M. 他 (1
977) Cell 11:223-232; 及びLowy, I. 他(1980) Cell 22:817-823を参照)。また
代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択のベースとして用いること
ができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグ
リコシッドネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え、als或いはpatはクロル
スルフロン（cTPPTsulfuron）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラー
ゼ（phosphinotricin acetyltransferase）に対する耐性を与える(例えば、Wigl
er, M. 他. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-3570; Colbere-Garapin,
F. 他(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14を参照)。さらに選択に利用できる遺伝子
、例えば、代謝のために細胞が必要なものを変えるtrpB及びhisDが文献に記載さ
れている（例えば、Hartman, S.C.及びR.C. Mulligan（1988）Proc. Natl. Acad
. Sci. 85:8047-51を参照）。アニトシアニン、緑色蛍光タンパク質（GFP；Clon
tech）、βグルクロニダーゼ及びその基質GUS，ルシフェラーゼ及びその基質ル
シフェリンなどの可視マーカーが用いられる。緑色蛍光タンパク質（GFP）(Clon
tech, Palo Alto, CA)も使用できる。これらのマーカーを用いて、トランスフォ
ーマントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定
したタンパク質発現を定量することが可能である（例えば、Rhodes, C.A.他（19
95）Methods Mol. Biol. 55:121-131を参照）。
【０１５０】 マーカー遺伝子の発現の存在／不在によって目的の遺伝子の存在が示されても
、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、TPPTをコード
する配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、TPPTをコードする配列を
含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定可能である。
または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がTPPTをコードする配列
と一列に配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子
の発現は、通常タンデム遺伝子の発現も示す。
【０１５１】 一般に、TPPTをコードする核酸配列を含み、TPPTを発現する宿主細胞は、当業
者に周知の種々の方法を用いて特定することが可能である。これらの方法には、
DNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーションや、PCR法、核酸或いはタンパ
ク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチップベース
の技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、
これらに限定されるものではない。
【０１５２】 特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるTP
PTの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。この
ような技法には、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ELISA）、ラジオ
イムノアッセイ（RIA）、蛍光標示式細胞分取器（FACS）などがある。TPPT上の
２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノ
クローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）
が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及
びその他のアッセイは、当分野では十分に知られている。(例えば、 Hampton. R
. 他.(1990) Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul
. MN, Sect. IV; Coligan, J. E. 他Current Protocols in Immunology, Greene
Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York. NY; 及びPound, J.D. (
1990) Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ)。
【０１５３】 種々の標識技術及び結合技術が当業者には周知であり、様々な核酸アッセイお
よびアミノ酸アッセイに用いられ得る。TPPTをコードするポリヌクレオチドに関
連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或い
はPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション
、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。別
法として、TPPTをコードする配列、またはその任意の断片をmRNAプローブを生成
するためのベクターにクローニングすることも可能である。当分野では周知であ
り市販されているこのようなベクターを、T7，T3，またはSP6などの好適なRNAポ
リメラーゼ及び標識されたヌクレオチドの追加によって、in vitroでのRNAプロ
ーブの合成に用いることができる。これらの方法は、例えば、Amersham Pharmac
ia Biotech及びPromega（Madison WI）、U.S. Biochemical Corp（Cleveland OH
）が市販する種々のキットを用いて行うことができる。容易な検出のために用い
得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、コファクター、インヒビター
、磁気粒子、及び放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色素産生剤などが含
まれる。
【０１５４】 TPPTをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地で
のこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で培養される。形質転換された
細胞から産生されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される
その配列及び／またはそのベクターによる。TPPTをコードするポリヌクレオチド
を含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するTPPTの分泌を誘導
するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０１５５】 更に、挿入した配列の発現調節能力または発現したタンパク質を所望の形にプ
ロセシングする能力によって宿主細胞株が選択される。このようなポリペプチド
の修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（
lipidation）、及びアシル化が含まれるが、これらに限定されるものではない。
タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを
利用して、標的タンパク質、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能
である。翻訳後の活性のための特定の細胞装置及び特徴のある機構をもつ種種の
宿主細胞（例えば、CHO、HeLa、MDCK、MEK293、WI38）がAmerican Type Culture
Collection（ATCC; Bethesda, MD）より入手可能であり、外来のタンパク質の
正しい修飾及びプロセシングを確実にするために選択される。
【０１５６】 本発明の別の実施例では、TPPTをコードする自然或いは変更された、または組
換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列
に結合させる。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラTP
PTタンパク質が、TPPTの活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスク
リーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分が、
市販の親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。このような部分
には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質
（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6−Hi
s、FLAG、c−mc、赤血球凝集素（HA）が含まれるが、これらに限定されるもので
はない。GST及びMBP、Trx、CBP、6−Hisによって、固定されたグルタチオン、マ
ルトース、フェニルアルシン酸化物（phenylarsine oxide）、カルモジュリン、
金属キレート樹脂のそれぞれで同族の融合タンパク質の精製が可能となる。FLAG
、c−mc、及び赤血球凝集素（HA）によって、これらのエピトープ標識を特異的
に認識する市販のモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いた融合タン
パク質の免疫親和性の精製ができる。また、TPPTをコードする配列と異種タンパ
ク質配列との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺
伝子操作すると、TPPTが精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質
の発現と精製の方法は、Ausubel. (1995、前出 ch 10).に記載されている。市販
されている様々なキットを用いて、融合タンパク質の発現及び精製を促進できる
。
【０１５７】 本発明の別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽
出系(Promega)を用いてin vitroで放射能標識したTPPTの合成が可能である。こ
れらの系は、T7またはT3、SP6プロモーターと機能的に結合したタンパク質をコ
ードする配列の転写と翻訳をつなげる。翻訳は、例えば、35Ｓメチオニンである
放射能標識されたアミノ酸前駆体の存在の下で起こる。
【０１５８】 本発明のTPPTまたはその断片を用いて、TPPTに特異結合する化合物をスクリー
ニングすることができる。少なくとも１つまたは複数の検査化合物を用いて、TP
PTへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。検査化合物の例に
は、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば受容体）または小分子が挙
げられる。
【０１５９】 一実施例では、このように同定された化合物は、例えばリガンドやその断片な
どのTPPTの天然のリガンド、または天然の基質、構造的または機能的な擬態性ま
たは自然結合パートナーに密接に関連している（Coligan, J.E. 他 (1991) Curr ent Protocols in Immunology 1(2)の5章等を参照）。同様に、化合物は、TPPT
が結合する天然受容体、或いは例えばリガンド結合部位などの少なくとも受容体
のある断片に密接に関連し得る。何れの場合も、既知の技術を用いてこの化合物
を合理的に設計することができる。一実施例では、このような化合物に対するス
クリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方と
してTPPTを発現する好適な細胞の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、
酵母、大腸菌からの細胞が含まれる。TPPTを発現する細胞またはTPPTを含有する
細胞膜断片を検査化合物と接触させて、TPPTまたは化合物の何れかの結合、刺激
または阻害を分析する。
【０１６０】 あるアッセイは、単に検査化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、結合を
、フルオロフォア、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識に
より検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの検査化
合物を、溶液中の或いは固体支持物に固定されたTPPTと結合させるステップと、
TPPTとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、標識され
た競合物の存在下での検査化合物の結合の検出及び測定を行うことができる。更
にこのアッセイでは、細胞遊離剤、化学ライブラリまたは天然の生成混合物を用
いて実施することができ、検査化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固
定させる。
【０１６１】 本発明のTPPTまたはその断片を用いて、TPPTの活性を調整する化合物をスクリ
ーニングすることが可能である。このような化合物には、アゴニスト、アンタゴ
ニスト、或るいは部分的または逆アゴニスト等が含まれる。一実施例では、TPPT
が少なくとも１つの検査化合物と結合する、TPPTの活性が許容される条件下でア
ッセイを実施し、検査化合物の存在下でのTPPTの活性が検査化合物不在下でのTP
PTの活性と比較する。検査化合物の存在下でのTPPTの活性の変化は、TPPTの活性
を調整する化合物の存在を示唆する。別法では、検査化合物をTPPTの活性に適し
た条件下でTPPTを含むin vitroまたは細胞遊離系と結合させてアッセイを実施す
る。これらアッセイの何れかにおいて、TPPTの活性を調整する検査化合物は間接
的に結合することが可能であり、検査化合物と直接接触する必要がない。少なく
とも１つから複数の検査化合物をスクリーニングすることができる。
【０１６２】 別の実施例では、胚性幹細胞（ES細胞）における相同組換えを用いて動物モデ
ル系内で、TPPTまたはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノ
ックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患
動物モデルの作製に有用である（米国特許第5,175,383号及び第5,767,337号等を
参照）。例えば129/SvJ細胞株等のマウスES細胞は初期のマウス胚に由来し、培
地で増殖させることができる。このES細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼ遺伝子（neo: Capecchi, M.R. (1989) Science 244:1288-1292）等のマー
カー遺伝子で破壊した目的の遺伝子を含むベクターで形質転換する。このベクタ
ーは、相同組換えにより宿主ゲノムの対応する領域に組み込まれる。別法では、
Cre-loxP系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的
遺伝子をノックアウトする（Marth, J.D. (1996) Clin. Invest. 97:1999-2002;
Wagner, K.U. 他 (1997) Nucleic Acids Res. 25:4323-43 30）。形質転換した
ES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス系等から採取したマウス細胞胚盤胞に微
量注入する。胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝
形質を決め、これを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。
このようにして作製した遺伝子組換え動物は、潜在的な治療薬や毒性薬剤で検査
することができる。
【０１６３】 TPPTをコードするポリヌクレオチドをin vitroでヒト胚盤胞由来のES細胞にお
いて操作することが可能である。ヒトES細胞は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細
胞の種類を含む少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。こ
れらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統及び心筋細胞に分化する（Thomso
n, J.A. 他 (1998) Science 282:1145-1 147）。
【０１６４】 TPPTをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノッ
クイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換え動物（マウスまたはラット）を
作製することが可能である。ノックイン技術を用いて、TPPTをコードするポリヌ
クレオチドの或る領域を動物ES細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに
組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺
伝子組換え子孫または近交系について研究し、潜在的な医薬品を用いて処置し、
ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばTPPTを乳汁内に分泌す
るなどTPPTを過剰発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る（
Janne, J. 他 (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55-74）。
【０１６５】 （治療） TPPTのある領域とヒト輸送タンパク質のある領域との間に、例えば配列及びモ
チーフの文脈における化学的及び構造的類似性が存在する。更に、TPPTの発現は
、神経、心血管、生殖、胃腸、造血／免疫の組織、及び炎症、細胞増殖、癌に密
接に関連する。従って、TPPTは、輸送、代謝、神経、心血管、生殖及び免疫の疾
患、並びに癌を含む細胞増殖異常においてある役割を果たすと考えられる。TPPT
の発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療においては、TPPTの発現または
活性を低下させることが望ましい。また、TPPTの発現または活性の低下に関連す
る疾患の治療においては、TPPTの発現または活性を増大させることが望ましい。
【０１６６】 従って、一実施例において、TPPTの発現または活性の低下に関連した疾患の治
療または予防のために、患者にTPPTまたはその断片や誘導体を投与することが可
能である。限定するものではないが、このような疾患の例には輸送障害含まれ、
その中には運動不能症、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調、ベッカ
ー筋ジストロフィー、顔面麻痺、シャルコー‐マリー‐ツース病、糖尿病、尿崩
症、糖尿病性ニューロパシー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、高カリウム血
性周期性四肢麻痺、正常カリウム血性周期性四肢麻痺、パーキンソン病、悪性高
熱、多剤耐性、重症筋無力症、筋緊張性異栄養症、緊張病、錐体外路性終末欠陥
症候群、ジストニー、末梢神経疾患、脳性腫瘍、前立腺癌と、口峡炎、徐脈型不
整脈、頻拍性型不整脈、高血圧症、遺伝性QT延長症候群、心筋炎、心筋症、ネマ
リンミオパシーラネマリン筋障害、中心核ミオパシー、脂質ミオパシー、ミトコ
ンドリアミオパシー、甲状腺中毒性ミオパシー、エタノールミオパシー、皮膚筋
炎、封入体筋炎、感染性節炎、及び多発性筋炎などの輸送に関連した心臓病と、
アルツハイマー病、健忘症、双極性障害、痴呆、うつ病、てんかん、トゥーレッ
ト病、妄想性精神病、及び分裂病などの輸送に関連した神経障害と、神経線維腫
症、帯状疱疹後神経痛、３叉神経ニューロパシー、サルコイドーシス、鎌状赤血
球性貧血、ウィルソン病、白内障、不妊症、肺動脈狭窄症、常染色体性感音性難
聴、高／低血糖症、グレーブス病、甲状腺腫、クッシング病と、副腎機能不全、
グルコース‐ガラクトース吸収不全症候群、高コレステロール血症、副腎性白質
ジストロフィー、ツェルヴェーガー症候群、メンケス病、後角症候群、フォンギ
ルケ症候群、シスチン尿症、イミノグリシン尿症、Hartup病、ファンコニ病、ま
た代謝異常も含まれ、その中には副腎機能不全、脳腱黄色腫症、副腎皮質過形成
、クマリン耐性、嚢胞性線維症、糖尿病、脂肪性肝硬変、果糖-1，6-ジホスファ
ターゼ欠損症、ガラクトース血症、甲状腺腫、グルカゴノーマ、糖原病、遺伝性
果糖不耐症、アドレナリン過剰症、腎臟不全症、上皮小体亢進症、副甲状腺低下
症、高コレステロール血症、甲状腺亢進症、低血糖症、甲状腺低下症、高脂血症
、脂質ミオパシー（lipid myopathies）、脂肪異栄養症、リソソーム蓄積症、マ
ンノシドーシス、ノイラミニダーゼ欠損症、肥満症、ペントース−フェニルケト
ン尿症、プソイドビタミンD欠損症、また神経の疾患が含まれ、その中には、癲
癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハ
ンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬
化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺
伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、
脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神
経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー及びクロイツフェルト‐ヤコブ
病、ゲルストマン症候群、Gerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含むプリオ
ン病と、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節
硬化症、小脳網膜血管芽腫（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３
叉神経血管症候群、中枢神経系性精神薄弱及び他の発生障害、脳性麻痺、神経骨
格異常症、自律神経系障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性
、代謝性、内分泌性、及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺
と、気分性及び不安性の障害、分裂病性疾患を含む精神病と、季節性障害（SAD
）と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠
陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレッ
ト病と、進行性核上麻痺、皮質基部変性（corticobasal degeneration）及び家
族性の前頭側頭性健忘症とが含まれ、また心血管疾患が含まれ、その中には、動
静脈瘻、アテローム硬化、高血圧、脈管炎、レイノー病、静脈奇形、動脈解離、
静脈瘤、血栓静脈炎及び静脈血栓、血管の腫瘍、血栓崩壊の合併症、バルーン血
管形成術（balloon angioplasty）、血管置換術、大動脈冠動脈バイパス術移植
手術（coronary artery bypass graft suegery）や、うっ血性心不全、虚血性心
疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁
狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪状石灰化（mitral annular calcificati
on）、僧帽弁脱出、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性
血栓性心内膜炎、全身性エリテマトーデスの心内膜炎、カルチノイド心疾患、心
筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、及び心臓移植の合併症
や、先天性肺異常（congenital lung anomalies）、肺拡張不全、肺うっ血及び
肺水腫、肺動脈塞栓症、肺出血、肺梗塞、肺高血圧症、血管硬化症、閉塞性肺疾
患、拘束性肺疾患（restrictive pulmonary disease）、慢性閉塞性肺疾患、肺
気腫、慢性気管支炎、気管支喘息、細気管支拡張症、細菌性肺炎、ウイルス性肺
炎及びマイコプラズマ肺炎、肺膿瘍、肺結核、びまん性間質性疾患（diffuse in
terstitial diseases）、塵肺症、サルコイド症、特発性肺繊維症（idiopathic
pulmonary fibrosis）、剥離性間質性肺炎、過敏症肺炎（hypersensivitity pne
umonitis）、肺好酸球増加閉塞性細気管支炎―器質性肺炎（pulmonary eosinoph
ilia bronchiolitis obliterans-organizing pneumonia）、びまん性肺出血症候
群（diffuse pulmonary hemorrhage syndromes）、グッドパスチャー症候群、特
発性肺血鉄症、肺併発膠原血管病（pulmonary involvement in collagen-vascul
ar disorders）、肺胞たんぱく症、肺腫瘍、炎症性及び非炎症性胸水（inflamma
tory and noninflammatory pleural effusions）、気胸症、胸膜腫瘍、薬物性肺
病（drug-induced lung disease）、放射線肺病（radiation-induced lung dese
ase）及び肺移植の合併症が含まれ、また生殖障害が含まれ、その中には、プロ
ラクチン産生異常と、卵管病、排卵異常、及び子宮内膜症、発情期異常、月経周
期異常、多嚢胞卵巣症候群、卵巣過剰刺激症候群、子宮内膜癌及び卵巣癌、子宮
筋腫、自己免疫異常、異所性妊娠、及び奇形発生を含む不妊症と、乳癌、線維嚢
胞性乳腺症、及び乳漏症と、精子形成異常、生理学上の精子異常、精巣癌、前立
腺癌、良性の前立腺過形成、前立腺炎、ペーロニー病、インポテンス、男性乳房
癌及び女性化乳房とが含まれ、また、免疫異常も含まれ、その中には炎症及び日
光性角化症、後天性免疫不全症候群（AIDS）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症
候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、動脈硬化、喘息、アテ
ローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性
多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィ（APECED）、気管支炎、滑液包炎、
胆嚢炎、硬変、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病
、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮
性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状
腺炎、発作性夜間血色素尿症、肝炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、混合
型結合織病（MCTD）、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨髄線
維症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、真性多血症、多発性筋炎、乾癬、ライタ
ー症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラ
キシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、原発性血小板血症、血小板減
少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイ
ルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症
、外傷と、リンパ腫及び白血病、骨髄腫を含む造血性の癌が含まれ、また細胞増
殖異常が含まれ、その中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎
、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビ
ン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ
腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、
脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、
膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺含まれる。
【０１６７】 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むTPPTの発現
または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、TPPTまたはその断
片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。
【０１６８】 更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むTPPTの
発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製
されたTPPTを含む医薬組成物を好適な医薬用担体と共に患者に投与することも可
能である。
【０１６９】 更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むTPPTの
発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、TPPTの活性を
調節するアゴニストを患者に投与することも可能である。
【０１７０】 更なる実施例では、TPPTの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または
予防のために、患者にTPPTのアンタゴニストを投与することが可能である。限定
するものではないが、このような疾患の例には、上記した輸送、代謝、神経、心
血管、生殖及び免疫の疾患、並びに癌を含む細胞増殖異常が含まれる。一実施態
様では、TPPTと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはTPPT
を発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティング或いは運搬機構として
間接的に用いられ得る。
【０１７１】 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むTPPTの発現
または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、TPPTをコードする
ポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを患者に投与することも可能で
ある。
【０１７２】 別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニ
スト、相補的な配列、ベクターを別の好適な治療薬と組み合わせて投与すること
もできる。当業者は、従来の医薬原理にしたがって併用療法で用いる好適な治療
薬を選択可能である。治療薬との組み合わせにより、上に列記した種々の疾患の
治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いて少ない量の各薬剤
で医薬効果をあげることが可能であり、広範囲な副作用の可能性を低減し得る。
【０１７３】 TPPTのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能
である。詳しくは、精製されたTPPTを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラ
リをスクリーニングしてTPPTと特異的に結合するものを同定が可能である。TPPT
の抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。このよう
な抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、
Fabフラグメント、及びFab発現ライブラリによって作られたフラグメントが含ま
れる。但し、これらに限定されるものではない。治療用には、中和抗体（即ち、
二量体の形成を阻害するもの）が特に好ましい。
【０１７４】 抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のも
のを含む種々の宿主が、TPPTまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備える
そのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々の
アジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。このようなアジュバント
にはフロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバ
ント、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳
剤、キーホールリンペットヘモシニアン、及びジニトロフェノールなどの界面活
性剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒトに用いられるアジュ
バントの中では、BCG（bacilli Calmette-Guerin）及びCorynebacterium parvum が特に好ましい。
【０１７５】 TPPTに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、ま
たは断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなり、一般的には約１０個以上の
アミノ酸からなるものが好ましい。これらのオリゴペプチド或いはペプチド、ま
たはそれらの断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であること
が望ましい。TPPTアミノ酸の短いストレッチは、KLHなどの別のタンパク質の配
列と融合し、キメラ分子に対する抗体が産生され得る。
【０１７６】 TPPTに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体
分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。これらの技術に
は、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びEBV−ハイブリ
ドーマ技術が含まれるが、これらに限定されるものではない（例えば、Kohler,
G. 等. (1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D. 等. (1985) .J. Immunol. Met
hods 81−8-42; Cote, R.J. 等. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030
; Cole, S.P. 等. (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120を参照）。
【０１７７】 更に、「キメラ抗体」作製のために発達したヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝
子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を備
える分子を得るために用いられる（例えば、Morrison, S.L.他. (1984) Proc. N
atl. Acad. Sci. 81−4851−4855; Neuberger, M.S.他. (1984) Nature 312:604
-608; Takeda, S.等. (1985) Nature 314:452,454を参照）。別法では、当分野
で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、
TPPT特異性一本鎖抗体を生成する。関連する特異性を備えるが別のイディオタイ
プの組成の抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリから鎖混
合によって生成することもできる（例えば、Burton D.R. (1991) Proc. Natl. A
cad. Sci. 88:11120-3を参照）。
【０１７８】 抗体は、リンパ球集団の中のin vivo産生を誘発することによって、または免
疫グロブリンライブラリのスクリーニング又は文献に示されているような、高度
に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって、産生すること
もできる（例えば、Orlandi, R. 他. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3833
-3837; Winter, G. 他. (1991) Nature 349:293-299を参照）。
【０１７９】 TPPTに対する特異的な結合部位を含む抗体も産生することができる。例えば、
このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって生成されるF（ab'）に断
片と、F（ab'）に断片のジスルフィド架橋を減じることによって生成されるFab
断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。別法では、Fab発現ライ
ブラリを作製することによって、所望の特異性とモノクローナルFab断片の迅速
且つ容易な同定が可能となる（例えば、Huse, W.D. 等. (1989) Science 254:12
75-1281を参照）。
【０１８０】 種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体
を同定する。隔離された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナ
ル抗体の何れかを用いる競合的な結合、または免疫放射線活性のための数々のプ
ロトコルが、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、TPPT
とその特異性抗体との間の複合体調整の計測が含まれる。二つの非干渉性TPPTエ
ピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナル
ベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用する
ことができる(Pound、前出)。
【０１８１】 ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、T
PPTに対する抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは
、平衡状態の下でTPPT抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で
除して得られる値である。多数のTPPTエピトープに対して親和性が不均一なポリ
クローナル抗体医薬のＫａは、TPPTに対する抗体の平均親和性または結合活性を
表す。特定のTPPTエピトープに単一特異的なモノクローナル抗体医薬のＫａは、
親和性の真の測定値を表す。Ka値が１０９〜１０１２Ｌ／ｍｏｌの高親和性抗体
医薬は、TPPT抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに
用いるのが好ましい。Ka値が１０６〜１０７Ｌ／ｍｏｌの低親和性抗体医薬は、
TPPTが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（immunopuri
fication）及び類似の処理に用いるのが好ましい。(Catty, D. (1988) Antibodi es, Volume I: A Practical Approach . IRL Press, Washington, DC; Liddell,
J. E. and Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, J
ohn Wiley & Sons, New York NY)。
【０１８２】 ある下流での適用におけるこのような医薬品の品質及び適性を調べるために、
ポリクローナル抗体医薬の抗体価及び結合活性を更に評価する。例えば、少なく
とも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的
な抗体を含むポリクローナル抗体医薬は一般に、TPPT抗体複合体を沈殿させなけ
ればならない処理に用いられる。様々な適用例における抗体の特異性及び抗体価
、結合活性、抗体の品質や使用法の指針は一般に入手可能である。(例えば、Cat
ty, 前出, 及びColigan 他、前出を参照)。
【０１８３】 本発明の別の実施例では、TPPTをコードするポリヌクレオチド、またはその任
意の断片や相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施態様では、
TPPTをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチ
センス分子（DNA及びRNA、修飾ヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更する
ことができる。このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、TPPTをコードする配列の制御領域
から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である。
【０１８４】 治療に用いる場合、アンチセンス配列を好適な標的細胞に導入するのに好適な
任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的
タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を発現する発
現プラスミドの形で細胞内に送達することができる（例えば、Slater, J.E. 他
(1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102(3):469-475; and Scanlon, K.J. 他 (1
995)9(13):1288-1296.を参照 ）。また、アンチセンス配列は、例えばレトロウ
イルスやアデノ関連ウイルスベクター等のウイルスベクターを用いて細胞内に導
入することもできる（例えば、Miller, A.D. (1990) Blood 76:271; Ausubel,
前出; Uckert, W. and W. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63(3):323-347を
参照）。その他の遺伝送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロ
ープ、及び当分野で周知のその他の系が含まれる（Rossi, J.J. (1995) Br. Med
. Bull. 51(1):217-225; Boado, R.J.他 (1998) J. Pharm. Sci. 87(11):1308-1
315; and Morris, M.C. 他 (1997) Nucleic Acids Res. 25(14):2730-2736.を参
照）。
【０１８５】 本発明の別の実施例では、TPPTをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若し
くは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療は、（i）遺
伝子欠損症（例えば、Ｘ染色体連鎖遺伝（Cavazzana-Calvo, M. 他 (2000) Scie
nce 288:669-672）によって特徴づけられる重度の複合型免疫欠損（SCID）-X1）
、遺伝性アデノシン−デアミナーゼ（ADA）欠損症(Blaese, R.M. 他 (1995) Sci
ence 270:475-480; Bordignon, C. 他 (1995) Science 270:470-475)に関連する
重度の複合型免疫欠損、嚢胞性繊維症（Zabner, J. 他 (1993) Cell 75:207-216
: Crystal, R.G. 他 (1995) Hum. Gene Therapy 6:643-666; Crystal, R.G. 他
. (1995) Hum. Gene Therapy 6:667-703）、サラセミア（thalassamia）、家族
性高コレステロール血症、第VIII因子若しくは第IX因子欠損による血友病（Crys
tal, 35 R.G. (1995) Science 270:404-410; Verma, I.M. and Somia. N. (199
7) Nature 389:239-242）を治療したり、（ii）条件的致死性遺伝子産物（例え
ば、細胞増殖の制御不能による癌の場合）を発現させたり、及び（iii）細胞内
の寄生虫（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）（Baltimore, D. (1988) Natu
re 335:395-396; Poescbla, E. 他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:11
395-11399）や、B型若しくはC型肝炎ウイルス（HBV、HCV）、Candida albicans
及びParacoccidioides brasiliensis等の真菌寄生虫、Plasmodium falciparum及
びTrypanosoma cruzi等の原虫寄生体）に対する防御機能を有するタンパク質を
発現させて行うことができる。TPPTの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が
疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からTPPTを発現させて、遺伝
子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【０１８６】 本発明の更なる実施例では、TPPTの欠損による疾患や異常症は、TPPTをコード
する哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によって
TPPT欠損細胞に導入することによって治療する。in vivo或いはex vitroの細胞
に用いる機械的な導入技術には、（i）個々の細胞内へのDNAのマイクロインジェ
クション、（ii）金粒子の打ち込み、（iii）リポソーム仲介性トランスフェク
ション、（iv）受容体仲介性遺伝子導入、及び（v）DNAトランスポソン（Morgan
, R.A. and W.F. Anderson (1993) Annu. Rev. Biochem. 62:191-217; Ivics, Z
. (1997) Cell 91:501-510; Boulay, J-L. and H. Rｅcipon (1998) Curr. Opin
. Biotechnol. 9:445-450）の使用が含まれる。
【０１８７】 TPPTの発現に影響を及ぼし得る発現ベクターには、限定するものではないが、
PCDNA 3.1、EPITAG、PRCCMV2、PREP、PVAXベクター(Invitrogen, Carlsbad CA)
、PCMV-SCRIPT、PCMV-TAG、PEGSH／PERV (Stratagene, La Jolla CA)、PTET-OFF
、PTET-ON、PTRE2、PTRE2-LUC、PTK-HYG (Clontech, Palo Alto CA)が含まれる
。TPPTを発現させるために、（i）恒常的に活性なプロモーター（例えば、サイ
トメガロウイルス（CMV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、SV40ウイルス、チミジ
ンキナーゼ（TK）、若しくはβ−アクチン遺伝子等）、(ii)誘導性プロモーター
（例えば、市販されているT-REXプラスミド（Invitrogen）に含まれている、テ
トラサイクリン調節性プロモーター（Gossen, M. and H. Bujard (1992) Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547-5551; Gossen, M. 他 (1995) Science 268:1
766-1769; Rossi, F.M.V. and H.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:4
51-456））、エクジソン誘導性プロモーター（市販されているプラスミドPVGRXR
及びPINDに含まれている：Invitrogen）、FK506／ラパマイシン誘導性プロモー
ター、またはRU486／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Rossi, F.M.V. a
nd H.M. Blau, 前出）、または（iii）正常な個体に由来するTPPTをコードする
内在性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いるこ
とが可能である。
【０１８８】 市販のリポソーム形質転換キット（例えば、Invitrogenが販売しているPERFEC
T LIPID及びTRANSFECTION KIT）を用いれば、当業者は経験にそれほど頼らない
でもポリヌクレオチドを培養中の標的細胞に導入することが可能である。別法で
は、リン酸カルシウム法（Graham. F.L. and A.J. Eb (1973) Virology 52:456-
467）若しくは電気穿孔法 (Neumann, B. 他 (1982) EMBO J. 1:841-845)を用い
て形質転換を行う。初代細胞にDNAを導入するためには、これらの標準的な哺乳
動物トランスフェクションプロトコルを変更する必要がある。
【０１８９】 本発明の別の実施例では、TPPTの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾
患や異常症は、（i）レトロウイルス末端反復配列（LTR）プロモーター若しくは
独立したプロモーターのコントロール下でTPPTをコードするポリヌクレオチドと
、（ii）好適なRNAパッケージングシグナルと、（iii）追加のレトロウイルス・
シス作用性RNA配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコーディング配列を伴
うRev応答性エレメント（RRE）とからなるレトロウイルスベクターを作製して治
療することができる。レトロウイルスベクター（例えば、PFB及びPFBNEO）はStr
atagene社から入手可能であり、公表データ（Riviere, I. 他. (1995) Proc. Na
tl. Acad. Sci. U.S.A. 92:6733-6737）に基づいている。上記データを引用する
ことをもって本明細書の一部とする。このベクターは、VSVg（Armentano, D. 他
(1987) J. Virol. 61:1647-1650; Bender, M.A. 他 (1987) J. Virol. 61:1639
-1646; Adam, M.A. and A.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802-3806; Dull, T
. 他 (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zufferey, R. 他 (1998) J. Virol. 72:
9873-9880）等の乱交雑エンベロープタンパク質若しくは標的細胞上の受容体に
対する親和性を有するエンベロープ遺伝子を発現する好適なベクター産生細胞系
（VPCL）において増殖される。RIGGに付与された米国特許第5,910,434号（「Met
hod for obtaining retrovirus packaging cell lines producing high transdu
cing efficiency retroviral supernatant」）において、レトロウイルスパッケ
ージング細胞系を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明
細書の一部とする。レトロウイルスベクターの増殖、ある細胞集団（例えば、CD
4+Ｔ細胞）の形質導入、並びに形質導入した細胞を患者に戻す方法は、遺伝子治
療の分野では周知であり、多数の文献に記載されている（Ranga, U. 他. (1997)
J. Virol. 71:7020-7029; Bauer, G. 他 (1997) Blood 89:2259-2267; Bonyhad
i, M.L. (1997) J. Virol. 71:4707-4716; Ranga, U. 他 (1998) Proc. Natl. A
cad. Sci. U.S.A. 95:1201-1206: Su, L. (1997) Blood 89:2283-2290）。
【０１９０】 別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、TPPTの発現に関連
する１或いは複数の遺伝子異常を有する細胞にTPPTをコードするポリヌクレオチ
ドを送達する。アデノウイルス系ベクターの作製及びパッケージングは当分野で
は周知である。複製欠損型アデノウイルスベクターは、免疫調節タンパク質をコ
ードする遺伝子を膵臓の無損傷の膵島の中に導入するために可変性であることが
証明された（Csete, M.E. 他. (1995) Transplantation 27:263-268）。使用で
きる可能性のあるアデノウイルスベクターが、米国特許第5,707,618号（「Adeno
virus vectors for gene therapy」）に記載されており、引用することをもって
本明細書の一部とする。アデノウイルスベクターについてはまた、Antinozzi, P
.A. 他 (1999) Annu. Rev. Nutr. 19:511-544; and Verma, I.M. and N. Somia
(1997) Nature 18:389:239-242を参照し、引用することをもって本明細書の一部
とする。
【０１９１】 別法では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、TPPTの発現に関連する１
或いは複数の遺伝子異常を有する標的細胞にTPPTをコードするポリヌクレオチド
を送達する。単純疱疹ウイルス（HSV）系のベクターは、HSV親和性の中枢神経細
胞にTPPTを導入する際に特に重要である。ヘルペス系ベクターの作製及びパッケ
ージングは当分野では周知である。複製適格性の単純疱疹ウイルス（HSV）I型系
のベクターは、霊長類の眼にレポーター遺伝子を送達するために用いられてきた
（Liu, X. 他 (1999) Exp. Eye Res.169:385-395）。HSV-1ウイルスベクターの
作製は、DeLucaに付与された米国特許第5,804,413号(Herpes simplex virus swa
ins for gene transfer)に記載されており、引用することをもって本明細書の一
部とする。米国特許第5,804,413号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために、
好適なプロモーターのコントロールの下で、細胞に導入される少なくとも１つの
内在性遺伝子を含むゲノムからなる組換えHSV d92についての記載がある。また
上記特許には、ICP4、ICP27及びICP22のために除去される組換えHSV株の作製及
び使用方法が開示されている。HSVベクターについては、Goins, W.F. 他 (1999)
J. Virol. 73:519-532 and Xu, H. 他 (1994) Dev. Biol. 163:152-161を参照
し、引用することをもって本明細書の一部とする。クローニングされたヘルペス
ウイルス配列の操作や、巨大ヘルペスウイルスのゲノムの異なった部分を含む多
数のプラスミドをトランスフェクトした後の組換えウイルスの継代、ヘルペスウ
イルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイルスの細胞への感染は当分野で周知
の技術である。
【０１９２】 別法では、αウイルス（正の一本鎖RNAウイルス）ベクターを用いてTPPTをコ
ードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスで
あるセムリキ森林熱ウイルス（Semliki Forest Virus, SFV）の生物学的な研究
が広範に行われ、遺伝子伝達ベクター（gene transfer vector）がSFVゲノムに
基づいていることが分かった（Garoff, H. and K.-J. Li (1998) Cun. Opin. Bi
otech. 9:464-469）。αウイルスRNAの複製中に、通常はウイルスカプシドタン
パク質をコードするサブゲノムRNAが作り出される。このサブゲノムRNAが完全長
のゲノムRNAより高いレベルで複製されるため、酵素活性（例えばプロテアーゼ
及びポリメラーゼ）を有するウイルスタンパク質に対してカプシドタンパク質が
過剰に産生される。同様に、TPPTをコードする配列をαウイルスゲノムのカプシ
ドをコードする領域に導入することによって、ベクター導入細胞において多数の
TPPTをコードするRNAが産生され、高いレベルでTPPTが合成される。通常はαウ
イルス感染は２〜３日以内の細胞溶解に関係するが、シンドビスウイルス（SIN
）の変異体を有するハムスターの正常な腎細胞（BHK-21）の持続的な感染を確立
する能力は、αウイルスの溶解性の複製が遺伝子治療に適用できるように好適に
変更することが可能であることを示唆している（Dryga, S.A. 他. (1997) Virol
ogy 228 :74-83）。様々な宿主にαウイルスを導入できることから、様々なタイ
プの細胞にTPPTを導入することできる。ある集団における細胞のサブセットの特
定の形質導入には、形質導入する前に細胞のソーティングを必要とする場合があ
る。αウイルスの感染性cDNAクローンの操作、αウイルスcDNA及びRNAのトラン
スフェクション、並びにαウイルスの感染方法は当分野で周知である。
【０１９３】 例えば開始部位から約−１０から約＋１０までの転写開始部位に由来するオリ
ゴヌクレオチドを用いて、遺伝子の発現を阻害することが可能である。同様に、
三重らせん塩基対合法を用いて阻害することができる。三重らせん構造は、二重
らせんがポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結合のために十分に広がる
のを阻止するため有用である。三重式DNAを用いる最近の治療の進歩は文献に記
載されている（例えば、Gee, J.E. 等. (1994) In: Huber, B.E. 及び B.I. Car
r, Molecular and ImmunologiTPPTproaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisc
o, NYを参照）。相補的な配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソ
ームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳を阻止するように設計でき
る。
【０１９４】 酵素性RNA分子であるリボザイムは、RNAの特異的切断を触媒するために用いる
ことができる。リボザイム作用の機構には、相補的な標的RNAへのリボザイム分
子の配列特異性ハイブリダイゼーションが含まれ、ヌクレオチド鎖切断が続く。
例えば、TPPTをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を、特異的且つ効果的に触
媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。
【０１９５】 任意の潜在的RNA標的内の特異的なリボザイム切断部位が、後続の配列ＧＵＡ
、ＧＵＵ、及びＧＵＣを含むリボザイム切断部位に対して、標的分子をスキャニ
ングすることによって初めに同定される。一度同定されると、切断部位を含む標
的遺伝子の領域に対応する１５個から２０個のリボヌクレオチドの短いRNA配列
を、オリゴヌクレオチドの機能を不全にする二次的な構造の特徴について評価す
ることが可能である。候補標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用
いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの容易性をテス
トすることによって評価することが可能である。
【０１９６】 本発明の相補的なリボ核酸分子及びリボザイムは、当分野で周知の方法を用い
て、核酸分子の合成のために作製することができる。これらの方法には、固相ホ
スホラミダイト化合物などのオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法が含ま
れる。別法では、RNA分子がin vitro及びin vivoでTPPTをコードするDNA配列の
転写によって生成され得る、このようなDNA配列はT7またはSP6等の好適なRNAポ
リメラーゼプロモータを用いて、種々のベクターの中に組み入れることが可能で
ある。別法では、相補的なRNAを構成的または誘導的に合成するこれらのcDNA作
製物は、細胞株、細胞、または組織の中に導入することができる。
【０１９７】 RNA分子を修飾することによって、細胞内の安定性を高め、半減期を長くする
ことができる。可能な修飾には、分子の５’及び／または３’端部でのフランキ
ング配列の追加、または分子のバックボーン内でのホスホジエステラーゼ結合よ
りむしろホスホロチオネート又は２’Ｏメチルの使用が含まれるが、これらに限
定されるものではない。PNAの生成に固有のこの概念は、内在性のエンドヌクレ
アーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、
及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び同様の修飾形態だけでなく
、イノシン、キュエオシン（queosine）、及びワイブトシン（wybutosine）など
の従来のものでない塩基を含めることによって、これらの分子の全体に拡大する
ことができる。
【０１９８】 本発明の更なる実施例は、TPPTをコードするポリヌクレオチドの発現の変化に
有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。特定のポリヌクレオチドの発現
の変化に有効な化合物には、限定するものではないが、特定のポリヌクレオチド
配列と相互作用可能な非高分子化学物質、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオ
リゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子やその他のポ
リペプチド転写調節因子が含まれる。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現の
インヒビター或いはエンハンサーとして作用し、ポリヌクレオチドの発現を変化
させ得る。従って、TPPTの発現または活性の増加に関連する疾患の治療において
は、TPPTをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療
上有用であり、TPPTの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、
TPPTをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有
用であり得る。
【０１９９】 特定のポリヌクレオチドの発現の変化の有効性を調べるために、少なくとも１
個から複数個の検査化合物をスクリーニングすることができる。検査化合物は、
有効な化合物の化学修飾を含む当分野で周知の任意の方法で得ることができる。
このような方法は、ポリヌクレオチドの発現を変化させる場合、一般に市販され
ている或いは専売の天然または非天然の化合物ライブラリから選択する場合、標
的ポリヌクレオチドの化学的及び／または構造的特性に基づいて化合物を合理的
にデザインする場合、更に組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラ
リから選択する場合に有効である。TPPTをコードするポリヌクレオチドを含むサ
ンプルは、少なくとも１つの検査化合物に曝露して得る。サンプルには、例えば
無傷細胞、透過化処理した細胞、in vitro細胞遊離系または再構成生化学系が含
まれ得る。TPPTをコードするポリヌクレオチドの発現における変化は、当分野で
周知の任意の方法でアッセイする。通常、TPPTをコードするポリヌクレオチドの
配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーシ
ョンにより、特定のヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーションの
収量を定量し、その値が１或いは複数の検査化合物に曝露される及び曝露されな
いポリヌクレオチドの発現の比較における基準となり得る。検査化合物に曝露さ
れるポリヌクレオチドの発現の変化が検出される場合は、ポリヌクレオチドの発
現の変化に検査化合物が有効であることを示している。特定のポリヌクレオチド
の発現の変化に有効な化合物を調べるために、例えばSchizosaccharomyces pomb e 遺伝子発現系（Atkins, D. 他 (1999) 米国特許第5,932,435号、Arndt, G.M.
他 (2000) Nucleic Acids Res. 28:E15）またはHeLa細胞等のヒト細胞株（Clark
e, M.L. 他 (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:8-13）を用いてスク
リーニングする。本発明の特定の実施例は、特異的ポリヌクレオチド配列に対す
るアンチセンス活性を調べるための、各オリゴヌクレオチド（デオキシリボヌク
レオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、及び修飾オリゴヌクレオチド）の
組み合わせライブラリのスクリーニングを含む（Bruice, T.W. 他 (1997) 米国
特許第5,686,242号、Bruice, T.W. 他 (2000) 米国特許第6,022,691号）。
【０２００】 ベクターを細胞又は組織に導入する多数の方法が利用でき、in vivo、in vitr o 、及びex vivoでの使用に等しく適している。ex vivoでの治療の場合、患者か
ら採取された肝細胞の中にベクターを導入して、自家移植で同じ患者に戻すため
にクローニング増殖される。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリ
カチオンアミノポリマーによる運搬は、当分野で周知の方法を用いて実行するこ
とができる（例えば、Goldman, C.K. 他. (1997) Nature Biotechnology 15:462
-66:を参照）。
【０２０１】 上記したいかなる治療方法も、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサ
ギ及びサルなどの哺乳動物を含む、治療が必要な全ての被験者に適用できる。
【０２０２】 本発明の別の実施例は、上記した全ての治療効果のために、医学上認められる
担体と共に医薬品或いは無菌組成物の投与に関連する。このような医薬組成物は
、TPPT、TPPTの抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、又はTPPTのインヒビ
ターなどからなる。この組成物は、単体で、或いは安定剤などの１種類以上の別
の薬剤と共に、無菌の生体適合性医薬品担体に投与することができる。このよう
な医薬品担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、及び水などが含まれる
がこれらに限定されるものではない。この組成物は、単独或いは薬物又はホルモ
ンなどの別の薬剤と共に投与することができる。
【０２０３】 本発明に用いられる医薬組成物は、様々な経路を用いて投与するが可能である
。この経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下、心室内、
経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、または直腸が含まれるがこれ
らに限定されるものではない。
【０２０４】 肺投与用の医薬組成物は、液状または乾燥粉末状に調製することができる。こ
のような医薬組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（
例えば、従来の低分子量有機薬剤）の場合には、速効製剤のエアロゾル輸送が当
分野で周知である。高分子（例えばより大きなペプチドやタンパク質）の場合に
は、肺の肺胞領域を介する肺輸送の技術が近年向上したため、インスリン等の薬
剤を実際に血中に輸送することが可能となった（Patton, J.S. 他, 米国特許第5
,997,848号等を参照）。肺輸送は、針注射を用いないで投与できるという点で優
れており、潜在的に有毒な浸透エンハンサーが必要でなくなる。
【０２０５】 本発明に用いる好適な医薬組成物には、目的を達成するため、効果的な量の活
性処方成分を含む組成物が含まれる。当業者は、十分に自身の能力で効果的な服
用量を決めることができる。
【０２０６】 医薬組成物の特殊な形状は、TPPTまたはその断片を含む高分子を直接細胞内に
輸送するべく調製される。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は
、細胞融合及び高分子の細胞内輸送を促進し得る。別法では、TPPTまたはその断
片をHIV Tat-1タンパク質の陽イオンN末端部に結合することもできる。このよう
にして作製された融合タンパク質は、マウスモデル系の脳を含む全ての組織の細
胞に形質導入されることが確認されている（Schwarze, S.R. 他 (1999) Science
285:1569-1572）。
【０２０７】 どのような組成物であっても、治療に効果的な薬用量は、初めは、例えば腫瘍
細胞の腫瘍細胞アッセイで、或いは動物モデルのどちらかで推定することができ
る。通常、動物モデルには、マウス、ウサギ、イヌ、サル、またはブタなどが用
いられる。動物モデルはまた、好適な濃縮範囲及び投与の経路を決めるのに用い
ることができる。このような治療をもとに、ヒトへの有益な薬用量及び投与経路
を決定することができる。
【０２０８】 医学的に効果的な薬用量は、症状や容態を回復させる、たとえばTPPT又はその
断片、TPPTの抗体、TPPTのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなど
の活性処方成分の量に関連する。薬用有効度及び毒性は、たとえば、ED５０（服
用に対して集団の５０％に医薬的効果がある用量）またはLD５０（服用に対して
集団の５０％に致命的である用量）統計を計算するなど、細胞培養または動物実
験における標準的な薬剤手法によって決定することができる。毒性効果と治療効
果との薬用量比は治療指数であり、LD５０／ED５０と示すことができる。高い治
療指数を示す医薬組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られ
たデータが、ヒトへの適用のために、薬用量の範囲を調剤するのに用いられる。
このような組成物が含まれる薬用量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ED５０を
含む血中濃度の範囲であることが望ましい。薬用量は、用いられる投与形態及び
患者の感受性、投与の経路によって、この範囲内で様々である。
【０２０９】 正確な薬用量は、治療が必要な患者に関する要素を考慮して、実務者によって
決められるであろう。薬用量及び投与は、効果的なレベルの活性成分を与えるた
め或いは所望の効果を維持するために調節される。薬用量の要素として考慮され
るものには、疾患の重症度、患者の一般的な健康状態、年齢、体重、及び患者の
性別、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感受性、及び治療に対する応答
が含まれる。作用器官が長い医薬組成物は、三日か四日に一度、一週間に一度、
二週間に一度、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって左右され、投与
され得る。
【０２１０】 通常の薬用量は投与の経路によって異なるが、約0.1〜100,000μgまでの最大
約１グラムまでである。特定の薬用量及び運搬の方法に関するガイダンスは文献
に記載されており、一般に当分野の実務者はそれを利用することができる。当業
者は、タンパク質またはインヒビターとは異なったヌクレオチドの製剤を利用す
るであろう。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの運搬は、特定の細胞
、状態、位置などに対して特異的であろう。
【０２１１】 （診断） 別の実施例では、TPPTに特異的に結合する抗体が、TPPTの発現によって特徴付
けられる疾患の診断、またはTPPTやTPPTのアゴニストまたはアンタゴニスト、イ
ンヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる
。診断に有用な抗体は、治療のところで記載した方法と同じ方法で製剤される。
TPPTの診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは細胞や組織か
ら採取されたものからTPPTを検出する方法が含まれる。これらの抗体は、修飾を
して或いはしないで使用され、レポーター分子の共有結合性或いは非共有結合性
の接着によって標識化され得る。当分野で周知の種々のレポーター分子が用いら
れるが、その内の幾つかは上記した。
【０２１２】 TPPTを測定するためのELISA，RIA，及びFACSを含む種々のプロトコルは、当分
野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのTPPTの発現を診断する元とな
るものを提供する。正常或いは標準的なTPPTの発現の値は、複合体の形成に適し
た条件の下、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または
細胞とTPPTに対する抗体とを結合させることによって決定する。標準的な複合体
形成の量は、測光法（photometric）などの種々の方法で定量され得る。被験者
のTPPTの発現の量、制御及び疾患、生検組織からのサンプルが基準値と比較され
る。基準値と被験者との間の偏差が、診断の指標となる。
【０２１３】 別の実施例によれば、TPPTをコードするポリヌクレオチドを診断のために用い
ることもできる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、
相補的なRNA及びDNA分子、及びPNAが含まれる。このポリヌクレオチドを用いて
、疾患と相関し得るTPPTを発現する生検組織における遺伝子の発現を検出し定量
する。この診断アッセイを用いて、TPPTの存在の有無、更に過剰な発現を調べ、
治療中のTPPT値の調節を監視する。
【０２１４】 ある実施形態では、TPPTまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリ
ヌクレオチド配列を検出可能なPCRプローブを用いたハイブリダイゼーションに
よって、TPPTをコードする核酸配列を同定することが可能である。例えば５'調
節領域である高度に特異的な領域か、例えば保存されたモチーフであるやや特異
性の低い領域から作られているかのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーショ
ン或いは増幅のストリンジェントは、プローブがTPPTをコードする自然界の配列
のみを同定するかどうか、或いはアレルや関連配列コードする自然界の配列のみ
を同定するかどうかによって決まるであろう。
【０２１５】 プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、TPPTをコードする任意の配
列と少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼ
ーションプローブには、DNAあるいはRNAが可能であり、SEQ ID NO:44−86の配列
、或いはTPPT遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配
列に由来し得る。
【０２１６】 TPPTをコードするDNAに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作
製方法には、TPPT及びTPPT誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をmRNAプロ
ーブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。このようなベクタ
ーは市販されており、当業者には周知であり、好適なRNAポリメラーゼ及び好適
な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでRNAプローブを合
成するために用いられる。ハイブリダイゼーションプローブは、例えば３２Ｐ或
いは３５Ｓなどの放射性核種、或いはアビジン／ビオチン（biotin）結合系によ
ってプローブに結合されたアルカリホスファターゼなどの酵素標識等の種々のレ
ポーターの集団によって標識され得る。
【０２１７】 TPPTをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、TPPTの発現に関連する疾患
を診断することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例に
は輸送障害含まれ、その中には運動不能症、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張
性運動失調、ベッカー筋ジストロフィー、顔面麻痺、シャルコー‐マリー‐ツー
ス病、糖尿病、尿崩症、糖尿病性ニューロパシー、デュシェンヌ型筋ジストロフ
ィー、高カリウム血性周期性四肢麻痺、正常カリウム血性周期性四肢麻痺、パー
キンソン病、悪性高熱、多剤耐性、重症筋無力症、筋緊張性異栄養症、緊張病、
錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、末梢神経疾患、脳性腫瘍、前立腺癌と
、口峡炎、徐脈型不整脈、頻拍性型不整脈、高血圧症、遺伝性QT延長症候群、心
筋炎、心筋症、ネマリンミオパシーラネマリン筋障害、中心核ミオパシー、脂質
ミオパシー、ミトコンドリアミオパシー、甲状腺中毒性ミオパシー、エタノール
ミオパシー、皮膚筋炎、封入体筋炎、感染性節炎、及び多発性筋炎などの輸送に
関連した心臓病と、アルツハイマー病、健忘症、双極性障害、痴呆、うつ病、て
んかん、トゥーレット病、妄想性精神病、及び分裂病などの輸送に関連した神経
障害と、神経線維腫症、帯状疱疹後神経痛、３叉神経ニューロパシー、サルコイ
ドーシス、鎌状赤血球性貧血、ウィルソン病、白内障、不妊症、肺動脈狭窄症、
常染色体性感音性難聴、高／低血糖症、グレーブス病、甲状腺腫、クッシング病
と、副腎機能不全、グルコース‐ガラクトース吸収不全症候群、高コレステロー
ル血症、副腎性白質ジストロフィー、ツェルヴェーガー症候群、メンケス病、後
角症候群、フォンギルケ症候群、シスチン尿症、イミノグリシン尿症、Hartup病
、ファンコニ病、また代謝異常も含まれ、その中には副腎機能不全、脳腱黄色腫
症、副腎皮質過形成、クマリン耐性、嚢胞性線維症、糖尿病、脂肪性肝硬変、果
糖-1，6-ジホスファターゼ欠損症、ガラクトース血症、甲状腺腫、グルカゴノー
マ、糖原病、遺伝性果糖不耐症、アドレナリン過剰症、腎臟不全症、上皮小体亢
進症、副甲状腺低下症、高コレステロール血症、甲状腺亢進症、低血糖症、甲状
腺低下症、高脂血症、脂質ミオパシー（lipid myopathies）、脂肪異栄養症、リ
ソソーム蓄積症、マンノシドーシス、ノイラミニダーゼ欠損症、肥満症、ペント
ース−フェニルケトン尿症、プソイドビタミンD欠損症、また神経の疾患が含ま
れ、その中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマ
ー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障
害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症
、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及び
ウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静
脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー及びクロイ
ツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、Gerstmann-Straussler-Scheinker
症候群を含むプリオン病と、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、
神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（cerebelloretinal hemangiobla
stomatosis）、脳３叉神経血管症候群、中枢神経系性精神薄弱及び他の発生障害
、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多
発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力
症、周期性四肢麻痺と、気分性及び不安性の障害、分裂病性疾患を含む精神病と
、季節性障害（SAD）と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー
、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経
痛、及びトゥーレット病と、進行性核上麻痺、皮質基部変性（corticobasal deg
eneration）及び家族性の前頭側頭性健忘症とが含まれ、また心血管疾患が含ま
れ、その中には、動静脈瘻、アテローム硬化、高血圧、脈管炎、レイノー病、静
脈奇形、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎及び静脈血栓、血管の腫瘍、血栓崩壊の
合併症、バルーン血管形成術（balloon angioplasty）、血管置換術、大動脈冠
動脈バイパス術移植手術（coronary artery bypass graft suegery）や、うっ血
性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾
患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪状石灰化（mitral a
nnular calcification）、僧帽弁脱出、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性
心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性エリテマトーデスの心内膜炎、カル
チノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、及
び心臓移植の合併症や、先天性肺異常（congenital lung anomalies）、肺拡張
不全、肺うっ血及び肺水腫、肺動脈塞栓症、肺出血、肺梗塞、肺高血圧症、血管
硬化症、閉塞性肺疾患、拘束性肺疾患（restrictive pulmonary disease）、慢
性閉塞性肺疾患、肺気腫、慢性気管支炎、気管支喘息、細気管支拡張症、細菌性
肺炎、ウイルス性肺炎及びマイコプラズマ肺炎、肺膿瘍、肺結核、びまん性間質
性疾患（diffuse interstitial diseases）、塵肺症、サルコイド症、特発性肺
繊維症（idiopathic pulmonary fibrosis）、剥離性間質性肺炎、過敏症肺炎（h
ypersensivitity pneumonitis）、肺好酸球増加閉塞性細気管支炎―器質性肺炎
（pulmonary eosinophilia bronchiolitis obliterans-organizing pneumonia）
、びまん性肺出血症候群（diffuse pulmonary hemorrhage syndromes）、グッド
パスチャー症候群、特発性肺血鉄症、肺併発膠原血管病（pulmonary involvemen
t in collagen-vascular disorders）、肺胞たんぱく症、肺腫瘍、炎症性及び非
炎症性胸水（inflammatory and noninflammatory pleural effusions）、気胸症
、胸膜腫瘍、薬物性肺病（drug-induced lung disease）、放射線肺病（radiati
on-induced lung desease）及び肺移植の合併症が含まれ、また生殖障害が含ま
れ、その中には、プロラクチン産生異常と、卵管病、排卵異常、及び子宮内膜症
、発情期異常、月経周期異常、多嚢胞卵巣症候群、卵巣過剰刺激症候群、子宮内
膜癌及び卵巣癌、子宮筋腫、自己免疫異常、異所性妊娠、及び奇形発生を含む不
妊症と、乳癌、線維嚢胞性乳腺症、及び乳漏症と、精子形成異常、生理学上の精
子異常、精巣癌、前立腺癌、良性の前立腺過形成、前立腺炎、ペーロニー病、イ
ンポテンス、男性乳房癌及び女性化乳房とが含まれ、また、免疫異常も含まれ、
その中には炎症及び日光性角化症、後天性免疫不全症候群（AIDS）及び副腎機能
不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、
動脈硬化、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性
甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィ（APECED）、
気管支炎、滑液包炎、胆嚢炎、硬変、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚
炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球
症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グ
レーブス病、橋本甲状腺炎、発作性夜間血色素尿症、肝炎、過好酸球増加症、過
敏性大腸症候群、混合型結合織病（MCTD）、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋
又は心膜炎症、骨髄線維症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、真性多血症、多発
性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候
群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、原発性
血小板血症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液
透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原
虫感染症、蠕虫感染症、外傷と、リンパ腫及び白血病、骨髄腫を含む造血性の癌
が含まれ、また細胞増殖異常が含まれ、その中には日光性角化症及びアテローム
性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、
発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺
癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副
腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝
臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺含まれる。TPPTをコードす
るポリヌクレオチド配列は、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或い
はその他の膜系の技術、PCR法、ディップスティック（dipstick）、ピン（pin）
、ELISA式アッセイ、及び変異TPPTの発現を検出するために患者から採取した体
液或いは組織を利用するマイクロアレイに使用することが可能である。このよう
な質的或いは量的方法は、当分野では周知である。
【０２１８】 ある実施態様では、TPPTをコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患、特
に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。TPPTをコードするヌ
クレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体
の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加える
ことができるであろう。好適な培養期間の後、サンプルを洗浄し、シグナルを定
量して基準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、制御サンプルと較
べて著しく変わっている場合は、サンプル内のTPPTをコードするヌクレオチド配
列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセ
イを用いて、動物実験、臨床試験、或いは個人の患者の治療を監視における、特
定の治療効果を推定することが可能である。
【０２１９】 TPPTの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、正常あ
るいは標準的な発現の概要が確立される。これは、ハイブリダイゼーション或い
は増幅に好適な条件の下、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出され
た体液或いは細胞と、TPPTをコードする配列或いはその断片とを結合させること
により達成され得る。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被験者から得
た値と周知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験からの
値とを比較することによって定量可能である。正常なサンプルから得た標準的な
値を、疾患の症状を示す被験者から得た値と比較可能である。基準値と被験者の
値との偏差を用いて罹患しているかどうを決定する。
【０２２０】 疾患の存在が確定され、治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイを通常ベースで繰り返して、被験者における発現のレベルが正常な
患者に示される値に近づき始めたかどうかを推定することが可能である。繰り返
し行ったアッセイの結果を、数日から数ヶ月の期間の治療の効果を見るのに用い
ることができる。
【０２２１】 癌では、個体からの生体組織における異常な量の転写物が、疾患の発生の素因
を示し、また実際に臨床的症状が出る前に疾患を検出する方法を提供することが
可能である。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法或いは積
極的な治療法を早くから利用して、癌の発生または進行を防ぐことが可能となる
。
【０２２２】 TPPTをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への
利用には、PCRの利用が含まれ得る。このようなオリゴマーは、化学的な合成、
酵素を用いた生成、或いはin vitroで生成され得る。オリゴマーは、好ましくは
TPPTをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはTPPTをコードするポリヌクレ
オチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件の下、特定の遺伝
子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリン
ジェントな条件の下、近縁のDNA或いはRNA配列の検出及び／または定量のため用
いることが可能である。
【０２２３】 或る実施態様において、TPPTをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いて、一塩基多型（SNP）を検出し得る。SNPは、ヒ
トの先天性または後天性遺伝病の原因となる場合が多いヌクレオチドの置換、挿
入及び欠失である。限定するものではないが、SNPの検出方法には、一本鎖立体
構造多型（SSCP）及び蛍光SSCP（fSSCP）法が含まれる。SSCPでは、TPPTをコー
ドするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリ
メラーゼ連鎖反応（PCR）でDNAを増幅する。このDNAは、例えば病変或いは正常
な組織、生検サンプル、体液等に由来し得る。このDNA内のSNPは、一本鎖形状の
PCR産物の２次及び３次構造に差異を生じさせる。この差異は非変性ゲル中での
ゲル電気泳動法を用いて検出可能である。fSCCPでは、オリゴヌクレオチドプラ
イマーを蛍光標識することによって、DNAシークエンシング装置などのハイスル
ープット機器でアンプリマー（amplimer）の検出をすることが可能になる。更に
、インシリコSNP（in silico SNP：isSNP）と呼ばれる配列データベース分析法
は、共通のコンセンサス配列の構築に用いられる個々の重複するDNA断片の配列
を比較することによって、多型を同定することができる。これらのコンピュータ
ベースの方法は、DNA配列クロマトグラムの自動分析及び統計モデルを用いたシ
ークエンシングエラーや研究室でのDNAの調整に起因する配列のばらつきを排除
する。別法では、例えばハイスループットのMASSARRAYシステム（Sequenom, Inc
., San Diego CA）を用いた質量分析によりSNPを検出し、特徴付ける。
【０２２４】 TPPTの発現を定量するために用いられ得る方法には、ヌクレオチドの放射標識
或いはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（coamplification）、及び標準的な
曲線に結果が加えられたものが含まれる（例えば、Melby, P.C.等(1993) J. Imm
unol. Methods, 159:235-44；Duplaa, C.等(1993) Anal. Biochem. 229-236を参
照）。多数のサンプルの定量速度は、目的のオリゴマーやポリヌクレオチドが種
々の希釈液に含まれ、分光光度法或いは非色応答によって定量が迅速なハイスル
ープット型のアッセイを用いることで加速された。
【０２２５】 更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列に由来
するオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおける標的と
して用いることができる。マイクロアレイを転写イメージング技術に用いて、多
数の遺伝子の相対発現レベルを同時にモニタリングすることができる。これにつ
いては、Seilhamer, J.J.他に付与された米国特許第5,840,484号（名称「Compar
ative Gene Transcript Analysis」）に記載されており、この引用を以って本明
細書の一部とする。マイクロアレイはまた、遺伝子変異、突然変異及び多型の同
定に用いることができる。この情報を用いて、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝
的根拠を解明し、疾患を診断し、遺伝子発現に関連する疾病の進行／後退をモニ
タリングし、疾患の治療における治療薬の開発や活性のモニタリングを行うこと
ができる。特に、患者にとって最適かつ有効な治療法を選択するために、この情
報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを作成することができる。例えば、患
者の薬理ゲノムプロフィールに基づいて、患者に対して極めて効果的でありなが
ら副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【０２２６】 別の実施例では、TPPTに特異的な抗体、TPPTまたはその断片をマイクロアレイ
上でエレメントとして用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のよ
うにタンパク質間相互作用、薬剤−標的相互作用及び遺伝子発現プロフィールを
モニタリング及び測定することが可能である。
【０２２７】 当分野で周知の方法でマイクロアレイを準備して使用し、分析する。(例えば
、Brennan, T.M. 他 (1995) 米国特許第5,474,796号;Schena, M. 他 (1996) Pro
c. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619; Baldeschweiler 他(1995) PCT出願番号W
O95/251116; Shalon, D.他 (1995) PCT出願番号WO95/35505; Heller, R.A. 他(1
997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150-2155; 及び Heller, M.J. 他 (1997) 米
国特許第5,605,662号を参照)。様々なタイプのマイクロアレイが周知であり、詳
細については、DNA Microarrays: A Practical Approach, M. Schena, ed. (199
9) Oxford University Press, Londonに記載されている。また、この文献を引用
することを以って本明細書の一部とする。
【０２２８】 本発明の別の実施例ではまた、TPPTをコードする核酸配列を用いて、天然のゲ
ノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製す
ることが可能である。コーディング配列または非コーディング配列の何れかを用
いることができるが、或る例では、コーディング配列より非コード配列が好まし
い。例えば、多重遺伝子ファミリーのメンバー間にコーディング配列が保存され
ていることにより、染色体マッピング時に望ましくない交差ハイブリダイゼーシ
ョンが生じる可能性がある。この配列は、特定の染色体、染色体の特定領域また
は人工の染色体、例えば、ヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細
菌人工染色体（BAC）、細菌P1産物、或いは単一染色体cDNAライブラリに対して
マッピングされる（Harrington, J.J. ら (1997) Nat Genet. 15:345-355、Pric
e, C.M. (1993) Blood Rev. 7:127-134、Trask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:
149-154等を参照）。一度マッピングすると、本発明の核酸配列を用いて、例え
ば病状の遺伝と特定の染色体領域やまたは制限断片長多型（RFLP）の遺伝とが相
関するような遺伝子連鎖地図を作成可能である（Lander, E.S. and D. Botstein
(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7353-7357を参照）。
【０２２９】 in sit蛍光ハイブリダイゼーション（FISH）は、他の物理的及び遺伝子地図デ
ータと相関し得る（例えば、Heinz-Ulrich, 他による(1995) in Meyers, 前出,
pp. 965-968を参照）。遺伝子地図データの例は、種々の科学誌あるいはOnline
Mendelian Inheritance in Man（OMIM）のワールドワイドウェブのサイトで見付
けることができる。物理的な染色体地図上のTPPTをコードする遺伝子の位置と特
定の疾患との相関性、或いは特定の疾患に対する素因が、このような疾患と関連
するDNA領域の決定に役立つため、更なる位置を決定するクローニングが行われ
る。
【０２３０】 染色体標本のin sitハイブリダイゼーション、及び確定した染色体マーカーを
用いた結合分析などの物理的マッピング技術を用いて、遺伝子地図を拡張するこ
ともできる。マウスなどの別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置させることに
より、たとえ正確なヒト染色体の位置が分かっていなくても、関連するマーカー
が明らかになる場合が多い。この情報は、位置クローニング或いは別の遺伝子発
見技術を用いて遺伝的疾患の研究をしている研究者にとって価値がある。疾患や
症候群に関与する１つ或いは複数の遺伝子の位置が、例えば血管拡張性失調症の
11q22-23などの特定の遺伝子領域に遺伝子結合によって大まかに決定されると、
その領域に対するどの配列マッピングも、さらなる調査のための関連する遺伝子
或いは調節遺伝子を表す（例えば、Gatti, R.A.他による（1988）Nature 336:57
7-580を参照）。また、目的の本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者、保
有者、即ち感染者の間の、転位置、反転などによる染色体位置の違いを検出する
こともある。
【０２３１】 本発明の別の実施例では、TPPT、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそ
のオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のラ
イブラリのスクリーニングに用いることができる。このようなスクリーニングに
用いる断片は、溶液に遊離、固体支持物に固定、細胞の表面上に保持、或いは細
胞内に存在する。TPPTと検査する薬剤との結合による複合体の形成を測定しても
よい。
【０２３２】 薬剤スクリーニングに用いる別の方法は、目的のタンパク質に対して、好適な
結合親和性を有する化合物のスクリーニング処理能力を高めるために用いられる
（例えば、Geysen,他による(1984) PCT出願番号 WO84/03564を参照）。この方法
では、相当な数の異なる小さな試験用化合物が、プラスチックピン或いは他の基
板の上に合成される。試験用化合物は、TPPT、或いはその断片と反応してから洗
浄される。次ぎに、結合されたTPPTが、当分野で周知の方法で検出される。精製
されたTPPTはまた、前記した薬剤をスクリーニングする技術に用いられるプレー
ト上で直接被覆することもできる。別法では、非中和抗体を用いて、ペプチドを
捕らえ、固体支持物に固定することもできる。
【０２３３】 別の実施例では、TPPTと結合可能な中和抗体がTPPTと結合するため試験用化合
物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。
この方法では、抗体が、TPPTと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチド
の存在も検出する。
【０２３４】 別の実施例では、発展途上の分子生物学技術にTPPTをコードするヌクレオチド
配列を用いて、限定はされないが、現在知られているトリプレット暗号及び特異
的な塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術を提供
することができる。
【０２３５】 当分野の技術者であれば、更なる説明がなくても前述の説明だけで最大限に本
発明を利用できるであろう。したがって、以下に記載する特定の好適な実施例は
、例示目的であって本発明を限定するものではない。
【０２３６】 前述した及び以下に記載した全ての特許出願、特許、刊行物、特に米国特許出
願通し番号60/139,923及び60/148,177、60/149,357、60/162,287に言及すること
をもって本明細書の一部とする。
【０２３７】 （実施例） １ cDNAライブラリの作製 RNAは、Clontech社から購入、或いは表４に列記した組織から単離した。まず
、この組織の一部をホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に
溶解する一方、この組織の別の一部をホモジナイズしてフェノールに溶解するか
、或いはTRIZOL (Life Technologies)、グアニジニウムイソチオシアネート及び
フェノールの単相溶液などの好適な変性剤の混合液に溶解した。この溶解物を塩
化セシウムにおいて遠心分離またはクロロホルムで抽出した。イソプロパノール
或いは酢酸ナトリウムのどちらかとエタノール、或いは別の方法でこの溶解物か
らRNAを沈殿させた。
【０２３８】 RNAの純度を高めるためにRNAのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰
り返した。場合によっては、DNA分解酵素でRNAを処理する。殆どのライブラリで
は、オリゴd(T)連結常磁性粒子(Promega)またはOLIGOTEXラテックス粒子(QIAGEN
. Valencia CA)、OLIGOTEX mRNA精製キット(QIAGEN)を用いてポリ（A＋）RNAを
単離した。別法では、POLY(A)PURE mRNA精製キット(Ambion, Austin TX)などの
別のRNA単離キットを用いて組織溶解物から直接単離した。
【０２３９】 ある場合には、Stratagene社にRNAを提供し、Stratagene社が対応するcDNAラ
イブラリを作製した。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム(Stratagene)
またはSUPERSCRIPT プラスミドシステム(Life Technologies)を用いて当分野で
周知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成してcDNAライブラリを作製した。
(例えば、Ausubel, 1997,前出,ユニット5.1-6.6を参照)。逆転写は、オリゴd(T)
またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプタ
ーを二本鎖cDNAに結合させてから、好適な１つの制限酵素或いは複数の制限酵素
でcDNAを消化した。殆どのライブラリでは、SEPHACRYL S 1000または SEPHAROSE
CL2B、SEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィー(Amersham Pharmacia Biotech
)、アガロースゲル電気泳動法によってcDNAの大きさ（300〜1000bp）を選択した
。PBLUESCRIPTプラスミド(Stratagene)またはpSPORT1プラスミド(Life Technolo
gies)、pcDNA2.1プラスミド(Invitrogen Carlsbad CA)、plNCYプラスミド(Incyt
e Pharmaceuticals, Palo Alto CA)などの好適なプラスミドのポリリンカーの適
合性制限酵素部位にcDNAを結合させた。この組換えプラスミドを、Stratagene社
のXL1-Blue, XL1-BIueMRF、SOLR、またはLife Technologies社のDH5αまたはDH
10B、ELECTROMAX DH 10Bを含むコンピテント大腸菌細胞に導入し組み込んだ。
【０２４０】 ２ cDNAクローンの単離 上記実施例１で記載したように得たプラスミドは、UNIZAPベクターシステム(S
tratagene)或いは細胞溶解を利用したin vivo切除によって宿主細胞から回収し
た。MagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム(Promega)、及びAGTC Minip
rep精製キット(Edge Biosystems, Gaithersburg MD)、QIAGEN社のQIAWELL 8 Pla
smid、QIAWELL 8 Plus Plasmid、QIAWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、REAL
Prep 96プラスミドキットの内の少なくとも１つを用いてプラスミドを精製した
。沈殿させた後、０．１ｍｌの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾
燥しないで４℃で保管した。
【０２４１】 別法では、ハイスループットの直接結合PCR法によって宿主細胞溶解物からプ
ラスミドDNAを増幅した。(Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216:1-14)。宿主
細胞の溶解及び熱サイクリング過程を単一反応混合液で行った。サンプルを処理
してから３８４−ウェルプレートに移して保管し、増幅したプラスミドDNAの濃
度をPICOGREEN色素(Molecular Probes, Eugene OR)及びFluoroskan II蛍光スキ
ャナー(Labsystems Oy, Helsinki, Finland)を用いて蛍光定量的に測定した。
【０２４２】 ３ シークエンシング及び分析 実施例２に記載したようにプラスミドにおいて回収したインサイト社cDNAは、
以下に示すようにシークエンシングした。cDNAのシークエンシング反応は、標準
的な方法で、或いはABI CATALYST 800 (PE Biosystems) thermal cyclerまたはP
TC-200 thermal cycler (MJ Research)とHYDRAマイクロディスペンサー(Robbins
Scientific) またはMICROLAB 2200 (Hamilton) 液体転移システムとの組み合わ
せなどのハイスループット装置で行った。cDNAのシークエンシング反応の準備に
は、Amersham Pharmacia Biotech社の試薬、またはABI PRISM BIGDYE Terminato
r cycle sequencing ready reactionキット(PE Biosystems)などのABIシークエ
ンシングキットに含まれる試薬を用いた。cDNAのシークエンシング反応の電気泳
動的な分離及び標識したポリヌクレオチドの検出には、MEGABACE 1000 DNAシー
クエンシングシステム(Molecular Dynamics)、標準ABIプロトコル及び塩基対呼
び出しソフトウェアを用いるABI PRISM 373または377シークエンシングシステム
(PE Biosystems)、当分野で周知のその他の配列解析システムを用いた。cDNA配
列の読み枠は、標準的な方法(Ausubel, 1997, 前出, unit 7.7)を用いて決定し
た。cDNA配列の幾つかを選択して、本実施例の６に記載した方法で配列を伸長し
た。
【０２４３】 cDNAのシークエンシングから得たポリヌクレオチド配列の構築及び解析は、当
分野の技術者に周知のアルゴリズムを利用したソフトウェアを組合せて行った。
表５は、利用したツール、ソフトウェア、アルゴリズム、それらの説明、引用文
献、閾値パラメーターの概要を示す。表５の列１は用いたツール及びプログラム
、アルゴリズム、列２はそれらの簡単な説明、列３は引用することで本明細書の
一部とした引用文献、列４の記載部分は２つの配列の一致度の評価に用いたスコ
ア及び確率値、他のパラメータを示す（確率値が高ければ高いほど配列間の相同
性が高くなる）。配列の解析には、MACDNASIS PROソフトウェア(Hitachi Softwa
re Engineering, S. San Francisco CA)及びLASERGENEソフトウェア (DNASTAR)
を用いた。
【０２４４】 ポリヌクレオチド配列の確証は、BLAST及び動的計画法、ジヌクレオチド最近
接分析に基づいたプログラム及びアルゴリズムを用いて、ベクター及びリンカー
、ポリＡ配列を取り除き、あいまいな塩基対をマスクすることで行った。次に、
BLAST及びFASTA、BLIMPSに基づいたプログラムを用いて、公共のデータベースで
あるGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳類、脊椎動物、真核生物のデータベー
スやBLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びPFAMなどのデータベースから選択した配
列に対してこれらの配列を問合わせて注釈を得た。Phred及びPhrap、Consedに基
づいたプログラムを用いて完全長のポリヌクレオチド配列の中にこれらの配列を
構築して、BLAST及びFASTA、BLIMPSに基づいたプログラムでオープンリーディン
グフレームのためにスクリーニングした。完全長のポリヌクレオチド配列を翻訳
して対応する完全長のアミノ酸配列を引き出し、GenBankデータベース(上記)及
びSwissProt、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びPrositeなどのデータベース、
またはPFAMなどの隠れマルコフモデル(HMM)に基づいたタンパク質ファミリーデ
ータベースに対して問い合わせてこれらの完全長の配列を分析した。HMMは、確
率を利用して遺伝子ファミリーのコンセンサス一次構造を解析する（例えば、Ed
dy, S.R. (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6:361-365を参照）。
【０２４５】 完全長のポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の構築及び分析に用いる上記
のプログラムは、SEQ ID NO:44−86からのポリヌクレオチド配列の断片の同定に
も使用できる。約２０〜４０００個までのヌクレオチドの断片はハイブリダイゼ
ーション及び増幅に有用であり、上記の発明で説明した。
【０２４６】 ４ ポリヌクレオチド発現の分析 ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技
術であり、特定の細胞種或いは組織からのRNAが結合されている膜への標識され
たヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う(例えば、Sambrook,前出,
7章; 及び Ausubel. F.M. 他、前出, 4章及び16章を参照)。
【０２４７】 BLASTに用いる類似のコンピュータ技術を用いて、GenBank或いはLIFESEQ（Inc
yte Pharmaceuticals）のようなcDNAデータベース内の同一或いは関連する分子
を検索する。この分析は多くの膜系ハイブリダイゼーションより非常に速度が速
い。さらにコンピュータ検索の感度を変更して、任意の特定の一致が、厳密な一
致或いは相同的一致の何れかとして分類されるかを確定することができる。検索
の基準は、
【０２４８】
【数１】
【０２４９】 として定義される積スコアである。積スコアは、０〜１００の標準化された値で
あり、以下のように求める。BLASTスコアにヌクレオチド配列の一致率を乗じ、
その積を２つの配列の短い方の長さの５倍で除する。高スコアのセグメントの対
（HSP）において一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不適性塩基対に
−４を割り当てることにより、BLASTスコアを計算する。２つの配列は、２以上
のHSPを共有し得る（ギャップにより離隔される）。２以上のHSPがある場合には
、最高BLASTスコアの塩基対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、BLASTア
ラインメントの断片的重複と質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、
比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合にのみ
得られる。積スコア７０は、１００％の一致で一端が７０％重畳しているか、或
いは８８％一致で他端が１００％重畳しているかの何れかの場合である。積スコ
ア５０は、１００％の一致で一端が５０％重畳しているか、或いは７９％の一致
で他端が１００％重畳しているかの何れかの場合である。
【０２５０】 ノーザン分析の結果は、TPPTをコードする転写物が発生したライブラリの分布
割合として報告される。分析には、器官／組織及び疾患によるcDNAライブラリの
分類も含まれる。器官／組織のカテゴリーには、心血管、皮膚、発生、内分泌、
胃腸、造血／免疫、筋骨格、神経、生殖、泌尿器が含まれる。疾患のカテゴリー
には、癌、炎症、外傷、細胞増殖、神経、プール(pooled)が含まれる。カテゴリ
ー別に、目的の配列を発現するライブラリの数を数えて、それを全ての範囲のラ
イブラリの数で除した。各組織に特異的に発現する割合（パーセント）と各疾患
で発現する割合を表３に示した。
【０２５１】 ５ TPPTをコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング SEQ ID NO:44−49及びSEQ ID NO:54−86を構築するために用いたcDNA配列を、
BLAST及びSmith-Watermanアルゴリズムを用いて、インサイト社LIFESEQデータベ
ース及び公共のドメインデータベースの配列と比較した。SEQ ID NO:44−49及び
SEQ ID NO:54−86と一致するこれらのデータベースの配列を、Phrap（表５）な
どの構築アルゴリズムを使用して、連続及び重複した配列のクラスターに組み入
れた。Stanford Human Genonse Center (SHGC)、Whitehead Institute for Geno
me Research (WIGR)及びGenethonなどの公共の情報源から入手できる放射線ハイ
ブリッド（radiation hybrid）及び遺伝子マッピングのデータを用いて、クラス
ター化した配列がすでにマッピングされているかを調べる。クラスターにマッピ
ングされた配列が含まれている場合は、そのクラスターの全ての配列（特定のSE
Q ID NOを含む）をそのマッピング位置に割り当てた。
【０２５２】 SEQ ID NO:44及びSEQ ID NO:48、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:69
、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:80、
SEQ ID NO:83の遺伝子地図の位置は、ヒト染色体の区間即ち範囲として本明細書
の発明の部分に記載した。SEQ ID NO:65及びSEQ ID SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:8
3については、２つ以上のマッピング位置が報告された。このことは、SEQ ID NO
:65及びSEQ ID SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:83に類似しているが完全には一致して
いない以前にマッピングされた配列がそれぞれのクラスターに組み入れられたこ
とを示唆するものである。センチモルガンで示したマッピング位置の範囲は、染
色体の短腕（p）の末端から測定した（センチモルガン（cM）は、同一染色体上
の遺伝子間の乗換え率に基づいた距離を表す単位である。平均すると、１cMはヒ
トの染色体の１メガベースに概ね等しいいが、組換え率の高い部分と低い部分が
あるため、大きく変化し得る）。距離cMは、配列がそれぞれのクラスターに含ま
れている放射線ハイブリッドマーカーの境界を検出できるGenethonによってマッ
ピングされた遺伝子マーカーに基づいている。示された区間内に位置する公共の
配列及びインサイト社の配列に関連する疾患も、本明細書の該当する発明の部分
に記載した。ヒトゲノム地図やNCBI 「GeneMap'99」World Wide Web site (http
://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap/)などの公衆が入手可能な情報を用いて、既
に同定された疾患遺伝子が上記した区間内或いは隣接するかを決定することがで
きる。
【０２５３】 ６ TPPTをコードするポリヌクレオチドの伸長 SEQ ID NO:44−86の完全長の核酸配列は、完全長分子の好適な断片から設計し
たオリゴヌクレオチドプライマーを用いてその完全長分子の好適な断片を伸長し
て作製した。一方のプライマーは既知の断片の５'の伸長を開始するために合成
し、他方のプライマーは既知の断片の３'の伸長を開始するために合成した。開
始プライマーは、OLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）或いは他の
適切なプログラムを用いて、約２２個から約３０個のヌクレオチドの長さで約５
０％以上のＧＣ含量を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールす
るように設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体が生じない
ようにヌクレオチドを伸長した。
【０２５４】 選択されたヒトcDNAライブラリを用いてこの配列を伸長した。２段階以上の伸
長が必要な場合、若しくは望ましい場合は、追加或いはネスト化プライマーの組
を設計する。
【０２５５】 当分野で既知の方法を利用したPCR法で高い忠実度で増幅した。PCRはPTC-200
thermal cycler (MJ Research, Inc.)用いて96ウェルブロックプレートで行った
。反応混合液は、鋳型DNA及び200 nmolの各プライマー、Mg２+と(NH4)2SO4とβ
−メルカプトエタノールを含むバッファー、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pha
rmacia Biotech)、ELONGASE酵素(Life Technologies)、Pfu DNAポリメラーゼ(St
ratagene)を含む。プライマーの組、PCI AとPCI Bに対して以下のパラメーター
で増幅を行った。 ステップ１ ９４℃で３分間 ステップ２ ９４℃で１５秒 ステップ３ ６０℃で１分間 ステップ４ ６８℃で２分間 ステップ５ ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す ステップ６ ６８℃で５分間 ステップ７ ４℃で保管 別法では、プライマーの組、T7とSK+に対して以下のパラメーターで増幅を行っ
た。 ステップ１ ９４℃で３分間 ステップ２ ９４℃で１５秒 ステップ３ ５７℃で１分間 ステップ４ ６８℃で２分間 ステップ５ ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す ステップ６ ６８℃で５分間 ステップ７ ４℃で保管。
【０２５６】 各ウェルのDNA濃度は、１X TE及び0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した
100μlのPICOGREEN定量試薬(0.25% (v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugen
e OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Coming Costar, Acton MA)の各ウェルに分
配してDNAが試薬と結合できるようにして測定する。このプレートをFluoroskan
II (Labsystems Oy, Helsinki, Finland)でスキャンして、サンプルの蛍光を計
測してDNAの濃度を定量化する。反応混合物の5〜10μlのアリコットを１％のア
ガロースミニゲル上での電気泳動によって解析し、何れの反応物が配列を伸長す
ることに成功したかを決定する。
【０２５７】 伸長したヌクレオチドを脱塩及び濃縮してから384ウェルプレートに移し、Cvi
JIコレラウィルスエンドヌクレアーゼ(Molecular Biology Research, Madison W
I)で消化し、pUC 18ベクター(Amersham Pharmacia Biotech)に再連結する前に音
波処理またはせん断を行った。ショットガンシークエンシングのために、消化し
たヌクレオチドを低濃度（０．６〜０．８％）のアガロースゲル上に分離して断
片を切断し、寒天をAgar ACE (Promega)で消化した。T4リガーゼ(New England B
iolabs, Beverly MA)を用いて伸長したクローンをpUC 18ベクター(Amersham Pha
rmacia Biotech)に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)で制限部位の延
び出しを処理してコンピテント大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を
選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってLB/2Xカ
ルベニシリン培養液の384ウェルプレートに３７℃で一晩培養した。
【０２５８】 細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)及びPfu
DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でDNAをPCR増幅した。 ステップ１ ９４℃で３分間 ステップ２ ９４℃で１５秒 ステップ３ ６０℃で１分間 ステップ４ ７２℃で２分間 ステップ５ ステップ２、３、及び４を２９回繰り返す ステップ６ ７２℃で５分間 ステップ７ ４℃で保管。 上記したようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でDNAを定量化した。DNA回収
率の悪いサンプルは、上記した条件で再び増幅した。サンプルを20％のジメチル
サルホサイド（dimethysulphoxide）(1:2, v/v)で希釈し、DYENAMIC DIRECTキッ
ト(Amersham Pharmacia Biotech)またはABI PRISM BIGDYE Terminator cycle se
quencing ready reactionキット(PE Biosystems)を用いてシークエンシングした
。
【０２５９】 同様に上述の手順で、SEQ ID NO:44−86のヌクレオチド配列を利用し、この伸
長のために設計したオリゴヌクレオチドと好適なゲノムライブラリを用いて５′
調節配列を得た。
【０２６０】 ７ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化及び使用法 SEQ ID NO:44−86から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて
、cDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約２０塩基対からなる
オリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、より大きなcDNAフラグメントの
場合でも基本的に同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、OLIGO4.06ソフト
ウェア（National Bioscience）のような最新式のソフトウェアを用いてデザイ
ンし、50pmolの各オリゴマーと、250μCiの[γ‐３２Ｐ]アデノシン三リン酸（A
mersham, Chicago, IL）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN、Bost
on MA）とを組み合わせて用いることにより標識する。標識されたオリゴヌクレ
オチドを、SEPHADEX G-25超精細排除デキストランビードカラム（Amersham Phar
macia Biotech）を用いて実質的に精製する。毎分１０７カウントの標識された
プローブを含むアリコットを、次のエンドヌクレアーゼ、Ase I、Bgl II、Eco R
I、Pst I、Xba1或いはPvu II（DuPont NEN）の１つを用いて切断したヒトゲノム
DNAの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において用いる。
【０２６１】 各切断物からのDNAを、0.7％アガロースゲル上で分画して、ナイロン製メンブ
ラン（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に転写する。ハイブリ
ダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り除くた
め、例えば、最大０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸
ナトリウムの条件の下、ブロットを順次室温にて洗浄する。ハイブリダイゼーシ
ョンパターンをオートラジオグラフィー或いは別のイメージ化手段で視覚化して
比較する。
【０２６２】 ８ マイクロアレイ マイクロアレイ上のアレイエレメントの連結または合成は、フォトリソグラフ
ィ、ピエゾプリント（インクジェットプリンター、前出のBaldeschweiler等を参
照）、機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて
達成することが可能である。上記各技術において基板は、均一な非多孔性の固体
とするべきである（Schena (1999).前出）。推奨する基板には、シリコン、シリ
カ、スライドガラス、ガラスチップ及びシリコンウエハがある。別法では、ドッ
トブロット法またはスロットブロット法に類似のアレイを利用して、熱や紫外線
、または化学的或いは機械的な結合手段で基板の表面にエレメントを配置して結
合させることができる。通常のアレイは利用可能な方法や機械を用いて作製でき
、任意の適正な数のエレメントを含めることができる（Schena, M. 他 (1995) S
cience 270:467-470、Shalon. D. 他 (1996) Genome Res. 6:639-645、Marshall
, A. and J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16:27-31.を参照）。
【０２６３】 完全長cDNA、発現遺伝子配列断片（EST）、或いはそれらの断片やオリゴマー
が、マイクロアレイのエレメントとなり得る。ハイブリダイゼーションに好適な
断片やオリゴマーを、LASERGENEソフトウェア（DNASTAR）などの当分野で周知の
ソフトウェアを用いて選択することが可能である。このアレイエレメントを、生
体サンプル中のポリヌクレオチドとハイブリダイズさせる。生体サンプル中のポ
リヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識またはその他の分子タグに
結合する。ハイブリダイゼーションの後、生体サンプルからハイブリダイズしな
かったヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントにおけ
るハイブリダイゼーションを検出する。別法では、レーザー脱離及び質量スペク
トロメトリーを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ
上のエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの相補性の程度及び相
対的存在量は、算定することができる。一実施例におけるマイクロアレイの調整
及び使用について、以下に詳述する。
【０２６４】 組織または細胞サンプルの準備 グアニジウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全RNAを単離し、オ
リゴ(dT)セルロース法を用いてポリ(A)+RNAを精製する。各ポリ(A)+RNAサンプル
は、MMLV逆転写酵素、０.０５ pg/μlのオリゴ(dT)プライマー（21mer）、１×
第１鎖緩衝液、０.０３単位/μlのRNアーゼインヒビター、５００μM dATP、５
００μM dGTP、５００μM dTTP、４０μM dCTP、４０μM dCTP-Cy3（BDS）また
はdCTP-Cy5（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて逆転写する。この逆転写反
応は、GEMBRIGHTキット（Incyte）を用いて、200 ngのポリ(A)+RNAを含む25 ml
容量で行う。特異的なコントロールポリ(A)+RNAは、in vitro転写により非コー
ディング酵母ゲノムDNAから合成する。３７０℃で２時間インキュベートした後
、各反応サンプル（一方はCy3標識、他方はCy5標識）は、２.５mlの０.５M 水酸
化ナトリウムで処理し、８５０℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させ
てRNAを変性する。サンプルは、２つの連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピン
カラム（CLONTECH Laboratories, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA）を用いて精
製する。結合後、２つの反応サンプルを、１mlのグリコーゲン（１mg/ml）、６
０mlの酢酸ナトリウム及び３００mlの１００％エタノールを用いてエタノール沈
殿させる。サンプルは次に、SpeedVAC（Savant Instruments Inc., Holbrook NY
）を用いて乾燥して仕上げ、１４μl ５×SSC／０.２％ SDS中で再懸濁する。
【０２６５】 マイクロアレイの準備 本発明の配列を用いて、アレイエレメントを作製する。各アレイエレメントは
、クローン化cDNA挿入断片を含むベクターを含有する細菌性細胞から増幅する。
PCR増幅は、cDNA挿入断片に隣接するベクター配列に相補的なプライマーを用い
る。３０サイクルのPCRによって、１〜２ngの初期量から５μgを超える最終量ま
でアレイエレメントを増幅する。増幅されたアレイエレメントは、SEPHACRYL-40
0（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて精製する。
【０２６６】 精製したアレイエレメントを、ポリマーコートされたスライドガラス上に固定
する。顕微鏡スライドガラス（Corning）は、処理中及び処理後に大量の蒸留水
での洗浄と、０.１％のSDS及びアセトン中で超音波による洗浄を行う。スライド
ガラスは、４％フッ化水素酸（VWR Scientific Products Corporation (VWR), W
est Chester PA）中でエッチングし、蒸留水中で広範囲にわたって洗浄し、９５
％エタノール中の０.０５％アミノプロピルシラン（Sigma）でコーティングする
。コーティングしたスライドガラスは、１１０℃の天火で硬化させる。
【０２６７】 米国特許第5,807,522号に記載されている方法を用いて、コーティングしたガ
ラス基板にアレイエレメントを付加する。この特許に引用することを以って本明
細書の一部とする。平均濃度が１００ng/μlのアレイエレメントDNA１μlを高速
機械装置により開放型キャピラリープリンティングエレメント（open capillary
printing element）に充填する。次にこの装置が、スライド毎に約５nlのアレ
イエレメントサンプルを分注する。
【０２６８】 マイクロアレイには、STRATALINKER UVクロスリンカー（Stratagene）を用い
てUV架橋する。マイクロアレイは、室温において０.２％SDSで１回洗浄し、蒸留
水で３回洗浄する。非特異的な結合部位は、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)（Trop
ix, Inc., Bedford MA）における０.２％カゼイン中で６０℃で３０分間マイク
ロアレイをインキュベートし、その後上述したように０.２％SDS及び蒸留水で洗
浄することによってブロックする。
【０２６９】 ハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーション反応液は、５×SSC、０.２％SDSハイブリダイゼーシ
ョン緩衝液にCy3及びCy5標識したcDNA合成産物を各０.２μg含む９μlのサンプ
ル混合体を含めたものである。サンプル混合液を、６５℃で５分間加熱し、マイ
クロアレイ表面上に一定量分注してから１.８cm2 のカバーガラスで覆う。この
アレイを、顕微鏡スライドより僅かに大きいキャビティを有する防水チェンバー
に移す。チャンバーの角に１４０μlの５×SSCを加えて、チャンバー内を湿度10
0%に保持する。このアレイを含むチャンバーを、６０℃で約６．５時間インキュ
ベートする。アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×SSC,０.１％SDS）において４５
℃で１０分間、第２洗浄緩衝液中（０.１×SSC）において４５℃で１０分間それ
ぞれ３回洗浄し、その後乾燥させる。
【０２７０】 検出 レポーター標識されたハイブリダイゼーション複合体は、Cy3を励起するため
の４８８nm、及びCy3を励起するための６３２nmのスペクトル線を生成し得るInn
ova 70混合ガス10 Wレーザー（Coherent, Inc., Santa Clara CA）を備えた顕微
鏡で検出する。２０倍の顕微鏡対物レンズ（Nikon, Inc., Melville NY）を用い
て、アレイ上に励起レーザー光を集中させる。このアレイを含むスライドを顕微
鏡のコンピュータ制御X-Yステージに置き、対物レンズを通してラスタスキャン
する。本実施例で用いた１.８cm×１.８cmのアレイは、２０μmの解像度でスキ
ャンする。
【０２７１】 ２つの異なるスキャンにおいて、混合ガスマルチラインレーザーは２つの蛍光
体を連続的に励起する。放射された光は、波長に基づいて２つの蛍光体に対応す
る２つの光電子増倍管検出器（PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Brid
gewater NJ）に分割される。アレイと光電子増倍管との間に配設された好適なフ
ィルターを用いて信号をフィルタリングする。用いる蛍光体の最大発光は、Cy3
では５６５nm、Cy5では６５０nmである。装置は両方の蛍光体からのスペクトル
を同時に記録できるが、レーザー源に好適なフィルターを用いて、蛍光体１つに
つき１回スキャンし、各アレイを通常２回スキャンする。
【０２７２】 スキャンの感度は通常、既知濃度のサンプル混合体に添加されるcDNAコントロ
ール種により生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置
には相補的DNA配列を含め、その位置におけるシグナルの強度がハイブリダイズ
する種の重量比1：100,000に相関するようにする。異なる試料（例えば検査細胞
及びコントロール細胞を代表する）からの２つのサンプルを、各々異なる蛍光体
で標識し、他と異なって発現する遺伝子を同定するために単一のアレイにハイブ
リダイズさせる場合には、較正は２つの蛍光体を有する較正するcDNAのサンプル
を標識して、ハイブリダイゼーション混合液に各々等量を加えて行う。
【０２７３】 光電子増倍管の出力は、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールされ
た１２ビットRTI-835Hアナログ−ディジタル（AID）変換ボード（Analog Device
s, Inc., Norwood MA）を用いてディジタル化される。ディジタル化されたデー
タは、リニア２０色変換を用いてシグナル強度が青色（低シグナル）から赤色（
高シグナル）までの擬似カラー範囲にマッピングされるイメージとして表示され
る。データはまた、定量的に分析される。２つの異なる蛍光体を同時に励起して
測定する場合には、各蛍光体の発光スペクトルを用いて、先ずデータは蛍光体間
の光学的漏話（重複発光スペクトルに起因する）に対して補正される。
【０２７４】 グリッドを蛍光シグナルイメージ上に重畳して、各スポットからのシグナルが
グリッドの各エレメントに中央に位置するようにする。各エレメント内の蛍光シ
グナルを統合し、シグナルの平均強度に対応する数値を得る。シグナル分析に用
いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム（Incyte）である。
【０２７５】 ９ 相補的ポリヌクレオチド TPPTをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、天然の
TPPTの発現を低下させるため即ち阻害するために用いられる。約１５〜約３０個
の塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、より小さな或いはよ
り大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Oligo4
.06ソフトウェア（National Biosciences）及びTPPTのコーディング配列を用い
て、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特
な５′配列から相補的なオリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモータ
ーがコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補
的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがTPPTをコードする転写物に結
合するのを阻害する。
【０２７６】 １０ TPPTの発現 TPPTの発現及び精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行う
ことができる。細菌でTPPTが発現するために、抗生物質耐性及びcDNAの転写レベ
ルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにcDNAをサブクローニン
グする。このようなプロモーターには、lacオペレーター調節エレメントに関連
するT5またはT7バクテリオファージプロモーター及びtrp-lac(tac)ハイブリッド
プロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。組換えベクター
を、BL21(DE3)などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌
が、イソプロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘発されるとTPPTを発
現する。真核細胞でのTPPTの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に一般に
バキュロウイスルスとして知られているAutographica californica核多面性ウイ
ルス(AcMNPV)を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子
を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移
のどちらかによって、TPPTをコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染力は維
持され、強いポリヘドリンプロモータによって高いレベルのcDNAの転写が行われ
る。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はSpodoptera frugiperda (Sf9)昆
虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後
者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる。(例え
ば、Engelhard. E. K.他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227; S
andig, V. 他 (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945.を参照)。
【０２７７】 殆どの発現系では、TPPTが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)
、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク
質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベース
の精製が素早く１回で行うことができる。Schistosoma japonicumからの２６キ
ロダルトンの酵素GSTによって、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で
固定されたグルタチオンで融合タンパク質の精製が可能となる(Amersham Pharma
cia Biotech)。精製の後、GST部分を特定の操作部位でTPPTからタンパク分解的
に切断できる。アミノ酸８個のペプチドであるFLAGで、市販のモノクローナル及
びポリクローナル抗FLAG抗体(Eastman Kodak)を用いた免疫親和性の精製が可能
となる。６個の連続するヒスチジン残基のストレッチである6-Hisによって、金
属キレート樹脂(QIAGEN)で精製が可能となる。タンパク質の発現及び精製の方法
は、Ausubel (1995,前出, ch 10, 16)に記載されている。これらの方法で精製し
たTPPTを直接用いて以下の実施例１１及び１２のアッセイを行うことができる。
【０２７８】 １１ TPPTの活性の実証 TPPTの輸送活性は、Xenopus Laevis卵母細胞の中に取り込まれた標識した基質
を測定してアッセイする。ステージ５及び６の卵母細胞にTPPT mRNA（10 ng／１
卵母細胞）を注入し、TPPTの発現が許容される条件下で、OR2培地（82.5mM NaCl
, 2.5 mM KCI, 1mM CaCl2, 1mM MgCl2, 1mM Na2HPO4, 5 mM Hepes, 3.8 mM NaOH
, 50 μg/ml gentamycin, pH 7.8）において１８℃で３日間インキュベートす
る。次に卵母細胞を標準的な取り込み培地（100mM NaCI, 2 mM KCl, 1mM CaCl2,
1mM MgCl2, 10mM Hepes/Tris pH 7.5）に移す。標識した基質（例えば、3Hでの
放射性標識、ローダミンでの蛍光標識等）を卵母細胞に加えて、種々の基質（例
えば、アミノ酸や糖、薬物、イオン、神経伝達物質等）の取り込みを開始させる
。３０分間インキュベートした後、Na+を含まない溶液で３回洗浄して取り込み
を停止させ、組み込まれた標識を測定し、コントロール（対照）と比較する。TP
PTの活性は、取り込まれた標識基質の程度に比例する。
【０２７９】 １２ 機能のアッセイ TPPTの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでの
TPPTをコードする配列の発現によって評価する。cDNAを、cDNAを高いレベルで発
現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニングする。
このようなベクターには、pCMV SPORTTM (Life Technologies.)及びpCR 3.1 (In
vitrogen, Carlsbad, CA)が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモータ
ーを含んでいる。５〜１０μgの組換えベクターを、例えば内皮由来か造血由来
のヒト細胞株にリポソーム製剤或いは電気穿孔法によって一時的に形質移入する
。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μｇのプラスミドを同時
に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入された細胞と形質移入
されていない細胞とを区別できる。また、標識タンパク質の発現によって、cDNA
の組換えベクターからの発現を正確に予想できる。このような標識タンパク質に
は、緑色蛍光タンパク質(GFP；Clontech)、及びCD64またはCD64-GFP融合タンパ
ク質が含まれる。レーザー光学に基づいた技術を利用した自動流動細胞計測法(F
CM)を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、その
細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。また、FCMで、先行した或
いは同時の細胞死の現象を診断する蛍光分子の取り込みを検出して計量する。こ
れらの現象には、プロピジウムヨウ化物でのDNAの染色によって計測される核DNA
内容物の変化と、ブロモデオキシウリジンの取り込み量の低下によって計測され
るDNA合成の下方調節と、特異的な抗体との反応性によって計測される細胞表面
及び細胞内のタンパンク質の発現の変化と、蛍光複合アネキシンＶタンパク質の
細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とが含まれる。流動細
胞計測法は、Ormerod, M. G.による (1994) Flow Cytometry Oxford, New York,
NY.に記載されている。
【０２８０】 遺伝子発現におけるTPPTの影響は、TPPTをコードする配列とCD64またはCD64-G
FPのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価すること
ができる。CD64またはCD64-GFPは形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グ
ロブリンG(IgG)の保存された領域と結合する。形質転換された細胞と形質転換さ
れない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビー
ドを用いて分離することができる(DYNAL. Lake Success. NY)。mRNAは、当分野
で周知の方法で細胞から精製することができる。TPPT及び目的の他の遺伝子をコ
ードするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することがで
きる。
【０２８１】 １３ TPPTに特異的な抗体の産生 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE；例えば、Harrington, M.G. (1990)
Methods Enzymol. 1816−3088-495を参照)または他の精製技術で実質的に精製
されたTPPTを用いて、標準的なプロトコルでウサギを免疫化して抗体を作り出す
。
【０２８２】 別法では、TPPTアミノ酸配列をLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて解
析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成してこれを
用いて当業者に周知の方法で抗体を生産する。Ｃ末端付近の、或いは隣接する親
水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については、当分野で周
知である(例えば、前出のAusubel, 1995,11章を参照)。
【０２８３】 通常、約１５残基の長さのオリゴペプチドを、Applied BiosystemsのABI 431A
ペプチドシンセサイザー（PE Biosystems）を用いてfmoc法のケミストリにより
合成し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（
MBS）を用いた反応によりKLH（Sigma-Aldrich, St. Louis MO）に結合させて、
免疫原性を高める(例えば、前出のAusubel, 1995を参照)。フロイントの完全ア
ジュバントにおいてオリゴペプチド−KLH複合体を用いてウサギを免疫化する。
得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗TPPT活性を検査するには、ペプチドまた
はTPPTを基板に結合し、１％BSAを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と
反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギIgGと反応させ
る。
【０２８４】 １４ 特異的抗体を用いる天然TPPTの精製 天然TPPT或いは組換えTPPTを、TPPTに特異的な抗体を用いるイムノアフィニテ
ィークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは
、CNBr-活性化SEPHAROSE（Amersham Pharmacia Biotech）のような活性化クロマ
トグラフィー用レジンと抗TPPT抗体とを共有結合させることにより形成する。結
合の後、そのレジンを製造者の使用説明書に従ってブロッキング処理し洗浄する
。
【０２８５】 TPPTを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、TPPTを優先的に吸着
できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファー
で）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とTPPTとの結合を切るような条
件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン
酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、TPPTを回収する。
【０２８６】 １５ TPPTと相互作用する分子の同定 TPPT又は生物学的に活性なその断片を、１２５Ｉボルトンハンター試薬（例え
ば、Bolton A.E.及びW.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529を参照）で標識
する。マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したTPPT
と共にインキュベートし、洗浄して、標識したTPPT複合体を有する全てのウェル
をアッセイする。様々なTPPT濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合し
たTPPTの数量及び親和性、会合についての値を計算する。
【０２８７】 別法では、TPPTと相互作用する分子を、Fields, S.及びO. Song(1989, Nature
340:245-246)に記載の酵母２−ハイブリッドシステム（yeast two-hybrid syst
em）やMATCHMAKERシステム(Clontech)などの２−ハイブリッドシステムに基づい
た市販のキットを用いて分析する。
【０２８８】 TPPTはまた、ハイスループット型の酵母２ハイブリッドシステムを使用するPA
THCALLINGプロセス（CuraGen Corp., New Haven CT）に用いて、遺伝子の２つの
大きなライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を決定す
ることができる（Nandabalan, K. 他 (2000) 米国特許第6,057,101号）。
【０２８９】 当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法
及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。特定の好適実施例に基
づいて本発明を説明したが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に
制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或いは関連す
る分野の専門家には明らかな、本明細書に記載の本発明の実施方法の様々な改変
は、特許請求の範囲に含まれる。
【０２９０】 （表の簡単な説明） 表１は、TPPTをコードする完全長の配列を作り出すために用いた、ポリペプチ
ド配列及びヌクレオチド配列の配列番号(SEQ ID NO)、クローン識別番号、cDNA
ライブラリ、及びcDNA断片を示す。
【０２９１】 表２は、潜在モチーフ及び相同配列を含む各ポリペプチド配列の特徴、並びに
TPPTの解析に用いた方法、アルゴリズム、及び検索可能なデータベースを示す。
【０２９２】 表３は、各核酸配列の選択された断片と、ノーザン分析によって決定された各
核酸配列の組織特異的発現パターンと、これらの組織に関連した疾患、異常症及
び症状と、各DNAがクローニングされたベクターとを示す。
【０２９３】 表４は、TPPTをコードするcDNAクローンを単離したcDNAライブラリの作製に用
いた組織を示す。
【０２９４】 表５は、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの分析に用いたツール、
プログラム、及びアルゴリズム、並びにその説明、引用文献、閾値パラメーター
を示す。
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【表１６】
【表１７】
【表１８】
【表１９】
【表２０】
【表２１】
【表２２】
【表２３】
【表２４】
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/16 Ａ６１Ｐ 3/02 ４Ｃ０８４ 3/00 3/04 ４Ｃ０８６ 3/02 3/06 ４Ｃ０８７ 3/04 3/08 ４Ｈ０４５ 3/06 3/10 3/08 5/14 3/10 5/38 5/14 7/00 5/38 7/06 7/00 7/08 7/06 7/12 7/08 9/04 7/12 9/06 9/04 9/08 9/06 9/10 9/08 １０１ 9/10 9/12 １０１ 11/00 9/12 11/06 11/00 11/08 11/06 13/08 11/08 15/00 13/08 15/08 15/00 15/10 15/08 15/14 15/10 17/00 15/14 17/06 17/00 19/02 17/06 19/06 19/02 19/10 19/06 21/00 19/10 21/02 21/00 21/04 21/02 25/00 21/04 25/02 １０３ 25/00 25/08 25/02 １０３ 25/18 25/08 25/20 25/18 25/24 25/20 25/28 25/24 27/12 25/28 27/16 27/12 29/00 27/16 １０１ 29/00 31/04 １０１ 31/10 31/04 31/12 31/10 33/00 31/12 35/00 33/00 35/02 35/00 37/02 35/02 37/08 37/02 43/00 １０５ 37/08 Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １０５ 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/53 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ａ６１Ｋ 31/7115 33/53 35/76 33/566 48/00 // Ａ６１Ｋ 31/7115 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 35/76 5/00 Ａ 48/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ６０／１４９，３５７ (32)優先日 平成11年８月18日(1999．8．18) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１６２，２８７ (32)優先日 平成11年10月28日(1999．10．28) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ユエ、ヘンリー アメリカ合衆国カリフォルニア州94087・ サニーベイル・ルイスアベニュー 826 (72)発明者 ヒルマン、ジェニファー・エル アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・＃12・モンロードライ ブ 230 (72)発明者 タング、トム・ワイ アメリカ合衆国カリフォルニア州95118・ サンノゼ・ランウィックコート 4230 (72)発明者 バンドマン、オルガ アメリカ合衆国カリフォルニア州94043・ マウンテンビュー・アンナアベニュー 366 (72)発明者 バーフォード、ニール アメリカ合衆国カリフォルニア州94122・ サンフランシスコ・フォースアベニュー 1308 (72)発明者 ボーグン、マライア・アール アメリカ合衆国カリフォルニア州94577・ サンレアンドロ・サンティアゴロード 14244 (72)発明者 アジムザイ、ヤルダ アメリカ合衆国カリフォルニア州94545・ ヘイワード・ロックスプリングスドライブ 2045 (72)発明者 リュ、デュング・アイナ・エム アメリカ合衆国カリフォルニア州95136・ サンノゼ・パークベルモントプレイス 55 (72)発明者 オウ−ヤング、ジャニス・エル アメリカ合衆国カリフォルニア州94005・ ブリスベーン・ゴールデンイーグルレーン 233 (72)発明者 パターソン、チャンドラ アメリカ合衆国カリフォルニア州94025・ メンロパーク・＃１・シャーウッドウェイ 490 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 CA25 CB01 CB03 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB07 HA16 4B024 AA01 AA11 CA04 CA09 GA11 HA03 HA14 4B063 QA01 QA18 QQ79 QR55 QS25 QS34 QX02 4B064 AG01 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AB01 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA03 AA13 BA35 BA44 CA01 MA13 MA17 MA24 MA44 MA56 MA57 MA59 MA60 MA66 NA14 ZA052 ZA062 ZA122 ZA162 ZA182 ZA202 ZA222 ZA232 ZA332 ZA362 ZA402 ZA432 ZA452 ZA522 ZA552 ZA662 ZA682 ZA752 ZA812 ZA842 ZA892 ZA942 ZA962 ZA972 ZB072 ZB112 ZB152 ZB212 ZB262 ZB322 ZB332 ZB352 ZB372 ZC062 ZC082 ZC212 ZC232 ZC332 ZC352 ZC552 4C086 AA02 AA03 MA01 MA04 MA13 MA17 MA44 MA52 MA56 MA57 MA59 MA60 MA66 ZA02 ZA05 ZA12 ZA15 ZA16 ZA18 ZA20 ZA22 ZA24 ZA33 ZA34 ZA36 ZA39 ZA40 ZA42 ZA43 ZA45 ZA51 ZA52 ZA55 ZA66 ZA68 ZA75 ZA81 ZA84 ZA89 ZA94 ZA96 ZB11 ZB13 ZB15 ZB21 ZB26 ZB27 ZB32 ZB33 ZB35 ZB37 ZC21 ZC23 ZC33 ZC35 ZC55 4C087 AA01 AA02 BC83 CA09 CA12 CA20 MA13 MA17 MA24 MA44 MA52 MA56 MA57 MA59 MA60 MA66 NA14 ZA02 ZA05 ZA06 ZA12 ZA15 ZA18 ZA23 ZA34 ZA40 ZA45 ZA55 ZA75 ZA94 ZA96 ZA97 ZB11 ZB21 ZB32 ZB37 ZC23 ZC33 ZC35 4H045 AA20 CA40 EA23 EA27 FA74

Claims (33)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 単離されたポリペプチドであって、 （ａ）SEQ ID NO:1乃至4及びSEQ ID NO:6乃至10、SEQ ID NO:12乃至36、SEQ I
    D NO:38乃至39、SEQ ID NO:41乃至43からなる一群から選択されたアミノ酸配列
    と、 （ｂ）SEQ ID NO:1乃至4及びSEQ ID NO:6乃至10、SEQ ID NO:12乃至36、SEQ I
    D NO:38乃至39、SEQ ID NO:41乃至43からなる一群から選択されたアミノ酸配列
    と少なくとも９０％の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、 （ｃ）SEQ ID NO:1乃至4及びSEQ ID NO:6乃至10、SEQ ID NO:12乃至36、SEQ I
    D NO:38乃至39、SEQ ID NO:41乃至43からなる一群から選択されたアミノ酸配列
    の生物学的に活性な断片と、 ｄ）SEQ ID NO:1乃至4及びSEQ ID NO:6乃至10、SEQ ID NO:12乃至36、SEQ ID
    NO:38乃至39、SEQ ID NO:41乃至43からなる一群から選択されたアミノ酸配列の
    免疫原性断片とで構成される一群から選択されたアミノ酸配列を含むことを特徴
    とする単離されたポリペプチド。
  2. 【請求項２】 SEQ ID NO:1乃至4及びSEQ ID NO:6乃至10、SEQ ID NO:12
    乃至36、SEQ ID NO:38乃至39、SEQ ID NO:41乃至43からなる一群から選択された
    請求項１の単離されたポリペプチド。
  3. 【請求項３】 請求項１のポリペプチドをコードする単離されたポリヌク
    レオチド。
  4. 【請求項４】 請求項２のポリペプチドをコードする単離されたポリヌク
    レオチド。
  5. 【請求項５】 SEQ ID NO:44乃至47及びSEQ ID NO:49乃至53、SEQ ID NO:
    55乃至79、SEQ ID NO:81乃至82、SEQ ID NO:84乃至86からなる一群から選択され
    た請求項４の単離されたポリヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 請求項３のポリヌクレオチドに機能的に結合されたプロモ
    ーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
  7. 【請求項７】 請求項６の組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞
    。
  8. 【請求項８】 請求項６の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝子組換え生
    物。
  9. 【請求項９】 請求項１のポリペプチドを生産する方法であって、 （ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項１のポリペプチドを
    コードするポリヌクレオチドに機能的に結合されたプロモーター配列を含む組換
    えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を培養するステップと、 （ｂ）そのように発現したポリペプチドを回収するステップとを含むことを特
    徴とする請求項１のポリペプチドの生産方法。
  10. 【請求項１０】 請求項１のポリペプチドに特異的に結合する単離された
    抗体。
  11. 【請求項１１】 単離されたポリヌクレオチドであって、 （ａ）SEQ ID NO:44乃至47及びSEQ ID NO:49乃至53、SEQ ID NO:55乃至79、SE
    Q ID NO:81乃至82、SEQ ID NO:84乃至86からなる一群から選択されたポリヌクレ
    オチド配列と、 （ｂ）SEQ ID NO:44乃至47及びSEQ ID NO:49乃至53、SEQ ID NO:55乃至79、SE
    Q ID NO:81乃至82、SEQ ID NO:84乃至86からなる一群から選択されたポリヌクレ
    オチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する天然のポリヌクレオチド配
    列と、 （ｃ）前記（ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列と、 （ｄ）前記（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド配列と、 （ｅ）前記（ａ）乃至（ｄ）のRNA等価物とで構成される一群から選択された
    ポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
  12. 【請求項１２】 請求項１１のポリヌクレオチドの少なくとも６０個の連
    続するヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
  13. 【請求項１３】 サンプルにおいて、請求項１１に記載のポリヌクレオチ
    ド配列を有する標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、 （ａ）前記サンプル内の前記標的ポリヌクレオチドと相補的な配列を構成する
    少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含むプローブで前記サンプルをハイ
    ブリダイズするステップであって、前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドま
    たはその断片とのハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、前記プ
    ローブが前記標的ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする、該ステップ
    と、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体が存在するか否かを検出し、存在す
    る場合には随意選択でその収量を測定するステップとを含むことを特徴とする標
    的ポリヌクレオチドの検出方法。
  14. 【請求項１４】 前記プローブが少なくとも６０個の連続するヌクレオチ
    ドを含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 サンプルにおいて、請求項１１のポリヌクレオチド配列
    を有する標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、 （ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて、前記標的ポリヌクレオチドまたは
    その断片を増幅するステップと、 （ｂ）増幅された前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在するか否か
    を検出し、存在する場合には随意選択でその収量を測定するステップとを含むこ
    とを特徴とする標的ポリヌクレオチドの検出方法。
  16. 【請求項１６】 有効量の請求項１のポリペプチド及び医薬的に容認でき
    る賦形剤を含む医薬組成物。
  17. 【請求項１７】 前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1乃至4及びSEQ ID NO:
    6乃至10、SEQ ID NO:12乃至36、SEQ ID NO:38乃至39、SEQ ID NO:41乃至43から
    なる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とす
    る請求項１６の医薬組成物。
  18. 【請求項１８】 機能的TPPT（ヒト輸送タンパク質である精製されたポリ
    ペプチド）の発現の低下に関連する疾患やその症状の治療方法であって、請求項
    １６の医薬組成物をそのような治療が必要な患者に投与することを含むことを特
    徴とする治療方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１のポリペプチドのアゴニストとして効果的な化
    合物をスクリーニングする方法であって、 （ａ）請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと
    、 （ｂ）前記サンプルのアゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴
    とするスクリーニング方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１９のスクリーニング方法によって同定されたア
    ゴニスト化合物及び医薬的に容認できる賦形剤を含む医薬組成物。
  21. 【請求項２１】 機能的TPPTの発現の低下に関連する疾患やその症状の治
    療方法であって、請求項２０の医薬組成物をそのような治療が必要な患者に投与
    することを含むことを特徴とする治療方法。
  22. 【請求項２２】 請求項１のポリペプチドのアンタゴニストとして効果的
    な化合物をスクリーニングする方法であって、 （ａ）請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと
    、 （ｂ）前記サンプルにおけるアンタゴニスト活性を検出するステップとを含む
    ことを特徴とするスクリーニング方法。
  23. 【請求項２３】 請求項２２のスクリーニング方法によって同定されたア
    ンタゴニスト化合物及び医薬的に容認できる賦形剤を含む医薬組成物。
  24. 【請求項２４】 機能的TPPTの過剰な発現に関連する疾患やその症状の治
    療方法であって、請求項２３の医薬組成物をそのような治療が必要な患者に投与
    することを含むことを特徴とする治療方法。
  25. 【請求項２５】 請求項１のポリペプチドに特異的に結合する化合物をス
    クリーニングする方法であって、 （ａ）請求項１のポリペプチドを好適な条件下で少なくとも１つの検査化合物
    と結合させるステップと、 （ｂ）請求項１のポリペプチドと前記検査化合物との結合を検出して、請求項
    １のポリペプチドと特異的に結合する化合物を同定するステップとを含むことを
    特徴とするスクリーニング方法。
  26. 【請求項２６】 請求項１のポリペプチドの活性を調節する化合物をスク
    リーニングする方法であって、 （ａ）請求項１のポリペプチドを、その活性が許容される条件下で少なくとも
    １つの検査化合物と結合させるステップと、 （ｂ）前記検査化合物の存在下での請求項１のポリペプチドの活性を評価する
    ステップと、 （ｃ）前記検査化合物の存在下での請求項１のポリペプチドの活性と、前記検
    査化合物の不在下での請求項１のポリペプチドの活性とを比較するステップとを
    含み、 前記検査化合物の存在下での請求項１のポリペプチドの活性の変化が、請求項
    １のポリペプチドの活性を調節する化合物の存在を示唆すること特徴とするスク
    リーニング方法。
  27. 【請求項２７】 請求項５の配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を変
    化させるのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、 （ａ）前記標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップ
    と、 （ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの発現の変化を検出するステップとを含むこ
    とを特徴とするスクリーニング方法。
  28. 【請求項２８】 SEQ ID NO:83のポリヌクレオチド配列を含む単離された
    ポリヌクレオチド。
  29. 【請求項２９】 請求項２８のポリヌクレオチドに機能的に結合されたプ
    ロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
  30. 【請求項３０】 請求項２９の組換えポリヌクレオチドで形質転換した細
    胞。
  31. 【請求項３１】 請求項２９の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝子組換
    え生物。
  32. 【請求項３２】 SEQ ID NO:40のアミノ酸配列を含むポリペプチドを生産
    する方法であって、 （ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で請求項３０の細胞を培養する
    ステップと、 （ｂ）そのように発現した前記ポリペプチドを回収するステップとを含むこと
    を特徴とするポリペプチド生産法方。
  33. 【請求項３３】 請求項２８の配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を
    変化させるのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、 （ａ）前記標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップ
    と、 （ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの発現の変化を検出するステップとを含むこ
    とを特徴とするスクリーニング方法。
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