CN115181778A - 选择治疗性分子的方法 - Google Patents

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S.E.默瑟
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Abstract

本发明涉及选择治疗性分子的方法。本公开内容提供采用钙波动测定法和/或序列评分计算鉴定对于给药是安全的分子的方法。本公开内容还包括采用钙波动测定法、序列评分方法、体内耐受性测定法或其任何组合选择或鉴定具有可耐受的体内神经毒性的分子的方法。

Description

选择治疗性分子的方法
本申请是申请日为2016年2月4日的中国专利申请201680019958.2“选择治疗性分子的方法”的分案申请。
早期申请的引用
本申请是要求2015年2月4日提交的美国临时申请号62/112,058、2015年5月4日提交的美国临时申请号62/156,684和2016年1月15日提交的美国临时申请号62/279,610的权益的PCT申请，其所有通过引用以其整体结合到本文中。
通过EFS-WEB电子提交的序列表的引用
本申请中提交的电子提交序列表(名称：3338.035PC03 SL.txt，大小：339,610字节；创建日期：2016年2月4日)的内容通过引用以其整体结合到本文中。
技术领域
本发明涉及用于选择毒副作用降低的治疗性分子的方法。所述方法可在给予实验室动物之前在体外或在计算机上使用以筛选分子，或所述方法可体内用于实验室动物。
背景技术
在特异性靶向治疗学领域中，一些治疗性分子例如通过与蛋白质的非特异性相互作用、刺激不需要的免疫应答或在组织中蓄积而引起毒副作用。当将治疗性分子给予受试者时，一个重大顾虑是分子的潜在神经毒性。暴露于神经毒性分子可导致脑和外周神经系统损伤，造成长期的生理问题。因此，当给予时，治疗性分子不仅仅在治疗需要的疾病或病症中有效，而且还有可接受的毒性(例如神经毒性)是重要的。
最有效的治疗性分子的确定通常包括合成大量经设计靶向细胞中的某一因子的分子并针对活性和毒性测试该大量的分子。虽然可进行动物研究以测定毒性，但进行动物研究(其中由于待测试的大量分子具有有毒性质所致，大量动物死亡)在伦理上或经济上都不可取。因此，需要测定治疗性分子的毒性(例如神经毒性)而不需要动物试验的改进方法。
发明内容
本公开内容提供测试或测定分子的体内急性神经毒性的方法，所述方法包括在与分子接触的神经元细胞中体外测量胞内游离钙浓度的波动(“钙波动”)。
本公开内容还提供用于选择具有可耐受的体内急性神经毒性的分子的方法，所述方法包括体外测量与分子接触的体外神经元细胞中的钙波动，其中所述分子显示与对照相当的钙波动水平。
涉及测量钙波动的本公开内容的上述方法可进一步包括计算分子(例如包含核苷酸序列的多核苷酸)的序列评分，其中序列评分通过下式(I)计算：
(核苷酸序列中C核苷酸或其类似物的数目 - 核苷酸序列中G核苷酸或其类似物 的数目)/核苷酸序列的总核苷酸长度 (I)。
本发明还提供测定包含核苷酸序列的分子的体内急性神经毒性的方法，所述方法包括计算序列评分，其中序列评分通过下式(I)计算：
(核苷酸序列中C核苷酸或其类似物的数目 - 核苷酸序列中G核苷酸或其类似物 的数目)/核苷酸序列的总核苷酸长度 (I)。
本发明还提供选择包含具有可耐受的体内急性神经毒性的核苷酸序列的分子的方法，所述方法包括应用下式(I)计算序列评分：
(核苷酸序列中C核苷酸或其类似物的数目 - 核苷酸序列中G核苷酸或其类似物 的数目)/核苷酸序列的总核苷酸长度 (I)，
其中核苷酸序列具有大于或等于0.2的序列评分。
在其它实施方案中，本公开内容提供选择具有可耐受的体内急性神经毒性的分子的方法，所述方法包括测量体内耐受性。本发明提供其中体内耐受性被分成5个耐受性类别之一的方法。本发明还提供可为以下的耐受性类别：1)活动过度；2)活动和觉醒降低；3)运动功能障碍和/或共济失调；4)姿势和呼吸异常；和5)震颤和/或抽搐。在一个实施方案中，可通过将分子注射入哺乳动物脑中，并将以0-20的标度在耐受性类别中将哺乳动物的耐受性分级，来测量体内耐受性。
本发明的上述方法可进一步包括测量神经元细胞培养物中的微管蛋白强度、靶蛋白的表达或分子的行为表现。
本发明还提供用于将按照上述方法测试的分子给予需要治疗疾病或病况的受试者的方法。
在某些实施方案中，所述分子包括蛋白质、肽、小分子、多核苷酸(例如反义寡核苷酸)或其任何组合。
实施方案
E1. 一种测试或测定分子的体内急性神经毒性的方法，所述方法包括体外测量与分子接触的神经元细胞中的钙波动。
E2. 实施方案1的方法，其中将所述分子的钙波动与未暴露于所述分子的神经元细胞(“对照细胞”)的钙波动进行比较。
E3. 实施方案2的方法，其中对照细胞是溶媒对照细胞。
E4. 实施方案3的方法，其中与溶媒对照细胞中的钙波动相比，与所述分子接触的神经元细胞中的钙波动为约70%或更高、约75%或更高、约80%或更高、约85%或更高、约90%或更高、约95%或更高、约96%或更高、约97%或更高、约98%或更高、约99%或更高、约100%或更高、约120%或更高、约140%或更高、约160%或更高、约180%或更高、约200%或更高、约220%或更高、约240%或更高或约250%或更高。
E5. 一种选择或鉴定具有可耐受的体内急性神经毒性的分子的方法，所述方法包括体外测量与分子接触的神经元细胞中的钙波动，其中与所述分子接触的神经元细胞显示水平相当于或高于溶媒对照细胞的水平的钙波动。
E6. 实施方案5的方法，其中与溶媒对照细胞中的钙波动相比，与分子接触的神经元细胞中的钙波动为约70%或更高、约75%或更高、约80%或更高、约85%或更高、约90%或更高、约95%或更高、约96%或更高、约97%或更高、约98%或更高、约99%或更高、约100%或更高、约120%或更高、约140%或更高、约160%或更高、约180%或更高、约200%或更高、约220%或更高、约240%或更高或约250%或更高。
E7. 实施方案1-6中任一个的方法，其中神经元细胞自哺乳动物原代皮质神经元制备。
E8. 实施方案中任一个的方法，其中所述分子包括小分子、多核苷酸、蛋白质、肽或其任何组合。
E9. 实施方案8的方法，其中所述蛋白质包括抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、细胞因子、细胞表面受体、激素、生长因子或其任何组合。
E10. 实施方案1-9中任一个的方法，其中钙波动为AMPA受体依赖性钙波动。
E11. 实施方案1-10中任一个的方法，其中钙波动在Mg2+离子存在下测量。
E12. 实施方案11的方法，其中Mg2+离子的浓度为至少约0.5 mM、至少约0.6 mM、至少约0.7 mM、至少约0.8 mM、至少约0.9 mM、至少约1 mM、至少约1.5 mM、至少约2.0 mM、至少约2.5 mM、至少约3.0 mM、至少约4 mM、至少约5 mM或至少约10mM。
E13. 实施方案1-12中的一个的方法，其中钙波动通过测量钙染料的荧光来测定。
E14. 实施方案1-13中的一个的方法，所述方法进一步包括将所述分子给予需要治疗疾病或病况的受试者。
E15. 实施方案14的方法，其中疾病或病况选自病毒感染、神经病症(例如阿尔茨海默氏痴呆(Alzheimer's disease)、进行性核上性麻痹、唐氏综合征、拳击运动员痴呆(慢性创伤性脑病和其它创伤性脑损伤)、连锁于染色体17的额颞痴呆合并帕金森综合征(FTDP-17)、Lytico-Bodig病(关岛型帕金森综合征-痴呆复合征)、缠结主导型痴呆(tangle-predominant dementia)、神经节神经胶质瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、铅毒性脑病、半侧巨脑症(Hemimegalencephaly)、结节性脑硬化、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、皮克病(Pick's disease)、皮质基底神经节变性、嗜银颗粒病、皮质基底节变性、脂褐质沉积症、额颞痴呆、核上麻痹和额颞叶变性、脑网络络功能障碍疾病(例如所有形式的癫痫和抑郁)、脊髓病症、外周神经病、颅神经病症(例如三叉神经痛)、自主神经系统病症(例如家族性自主神经机能异常或多系统萎缩)、中枢和外周神经系统运动障碍(例如帕金森病(Parkinson's disease)、特发性震颤、肌萎缩性侧索硬化、图雷特综合征(Tourette's Syndrome)、多发性硬化或不同类型的外周神经病)、睡眠障碍(例如发作性睡病)、偏头痛或其它类型的头痛(例如丛集性头痛和紧张型头痛)、下背部和颈部疼痛、中枢神经病、神经精神疾病、注意力缺陷障碍伴多动症、孤独症、亨廷顿舞蹈病(Huntington's disease)、雷特综合征(Rett Syndrome)、安格曼综合征(Angelman Syndrome)、器质性精神病、脑或骨髓感染(包括脑膜炎)或朊病毒病)、贫血、癌症、白血病、炎症性病况或自身免疫性疾病(例如关节炎、银屑病、红斑狼疮、多发性硬化)、细菌感染、额颞痴呆-τ (FTD-τ)、连锁于染色体17的额颞痴呆和帕金森综合征(FTDP-17)、皮质基底节变性(CBD)、创伤性脑损伤、慢性创伤性脑病、HIV相关神经认知障碍、嗜银颗粒病、唐氏综合征-阿尔茨海默氏痴呆、遗忘性轻度认知障碍-阿尔茨海默氏痴呆、帕金森病痴呆、哈勒沃登-施帕茨病(泛酸激酶相关神经变性)、C型尼曼-皮克病(Niemann Pickdisease type C)、强直性肌营养不良、肌萎缩性侧索硬化、半侧巨脑症、结节性脑硬化复征、2b型局灶性皮质发育不良、神经节细胞肿瘤、Dravet综合征(婴儿期重度阵挛性癫痫)、颞叶癫痫、Ohtahara综合征(早期婴儿型癫痫性脑病合并压抑爆发)、Lafora体病、广泛性癫痫伴热性癫痫发作、婴儿痉挛(韦斯特综合征(West syndrome))、Lennox Gastaut综合征、安格曼综合征、雷特综合征、Landau Kleffner综合征、局灶性颠痫、单纯局灶性颠痫(不丧失意识)、局灶性认知障碍颠痫(意识障碍)、发展成全身性强直阵挛性(GTC)惊厥的局灶性颠痫、全身性癫痫发作(惊厥或非惊厥、带有涉及皮层下结构的两侧放电)、失神发作、肌阵挛发作、阵挛发作、强直发作、强直-阵挛发作和强直发作、孤独症、孤独症谱系障碍、阿斯珀格病症(Asperger’s disorder)、广泛性发育障碍及其任何组合。
E16. 实施方案1-15中任一个的方法，其中所述分子包括多核苷酸。
E17. 实施方案16的方法，所述方法另包括计算序列评分，其中序列评分通过下式(I)计算：
(多核苷酸中C核苷酸或其类似物的数目 - 多核苷酸中G核苷酸或其类似物的数 目)/多核苷酸的总核苷酸长度(数目)　　　　　　　　　(I)。
E18. 一种测定包含多核苷酸的分子的体内急性神经毒性的方法，所述方法包括计算序列评分，其中序列评分通过下式(I)计算：
(多核苷酸中C核苷酸或其类似物的数目 - 多核苷酸中G核苷酸或其类似物的数 目)/多核苷酸的总核苷酸长度(数目)　　　　　　　　　(I)。
E19. 一种选择包含具有可耐受的体内急性神经毒性的多核苷酸的分子的方法，所述方法包括应用下式(I)计算序列评分：
(多核苷酸中C核苷酸或其类似物的数目 - 多核苷酸中G核苷酸或其类似物的数 目)/多核苷酸的总核苷酸长度(数目)　　　　　　　　(I)，
其中多核苷酸具有大于或等于0.2的序列评分。
E20. 实施方案17-19中任一个的方法，其中序列评分大于或等于0.2、大于或等于0.25、大于或等于0.3、大于或等于0.35、大于或等于0.4、大于或等于0.45、大于或等于0.5、大于或等于0.55、大于或等于0.6、大于或等于0.65、大于或等于0.7、大于或等于0.75、大于或等于0.8、大于或等于0.85、大于或等于0.9、大于或等于0.95、大于或等于1.0、大于或等于1.5、大于或等于2.0、大于或等于3.0或者大于或等于4.0。
E21. 实施方案16-20中任一个的方法，其中多核苷酸包括DNA或RNA。
E22. 实施方案16-21中任一个的方法，其中多核苷酸是单链的。
E23. 实施方案16-22中任一个的方法，其中多核苷酸是长约10-约50个核苷酸的反义寡核苷酸(即寡聚体)。
E24. 实施方案23的方法，其中反义寡核苷酸调节靶蛋白的表达。
E25. 实施方案23的方法，其中反义寡核苷酸靶向靶蛋白的mRNA。
E26. 实施方案25的方法，其中mRNA是pre-mRNA或成熟mRNA。
E27. 实施方案25-26中任一个的方法，其中mRNA在细胞中表达。
E28. 实施方案27的方法，其中mRNA在神经元细胞中表达。
E29. 实施方案23-28中任一个的方法，其中反义寡核苷酸调节神经元细胞培养物中靶基因的mRNA表达。
E30. 实施方案23-29中任一个的方法，其中反义寡核苷酸调节神经元细胞培养物中靶蛋白编码的蛋白质表达。
E31. 实施方案23-30中任一个的方法，其中反义寡核苷酸与靶基因的mRNA或pre-mRNA互补。
E32. 实施方案1-31中任一个的方法，所述方法进一步测量所述分子的靶蛋白体外表达的降低。
E33. 实施方案1-32中任一个的方法，所述方法进一步包括测量所述分子的体内耐受性。
E34. 实施方案33的方法，其中体内耐受性通过将所述分子给予哺乳动物并将哺乳动物的耐受性按耐受性类别分级来测量。
E35. 实施方案33的方法，其中将所述分子给予哺乳动物的脑。
E36. 一种测试或测定分子的体内耐受性的方法，所述方法包括将所述分子给予哺乳动物并将哺乳动物的耐受性按耐受性类别分级。
E37. 实施方案34-36中任一个的方法，其中耐受性类别包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个耐受性类别。
E38. 实施方案37的方法，其中耐受性类别选自：1)活动过度；2)活动和觉醒降低；3)运动功能障碍和/或共济失调；4)姿势和呼吸异常；5)震颤和/或惊厥及其两种或更多种的组合。
E39. 实施方案38的方法，其中所述分子显示每个耐受性类别中0-4的体内耐受性评分。
E40. 实施方案39的方法，其中所述分子显示合计介于0和8之间的体内耐受性评分。
E41. 实施方案39或40的方法，其中所述分子显示合计介于0和6之间、介于0和5之间、介于0和4之间、介于0和3之间、介于0和2之间或介于之间0和1的体内耐受性评分。
E42. 实施方案1-41中任一个的方法，所述方法进一步包括测量所述分子的行为测验评分。
E43. 实施方案42的方法，其中行为测验评分通过将所述分子给予哺乳动物并对哺乳动物的行为表现进行分级来测量。
E44. 实施方案41-43中任一个的方法，其中行为测验是短期记忆测验、空间学习和记忆测验、步态分析测验或其任何组合。
E45. 实施方案1-44中任一个的方法，所述方法进一步包括测量神经元细胞培养物中所述分子的微管蛋白强度。
E46. 实施方案45的方法，其中将所述分子的微管蛋白强度与不暴露于所述分子中的神经元细胞的微管蛋白强度进行比较。
E47. 实施方案46的方法，其中所述分子降低神经元细胞培养物中微管蛋白强度小于约25%、小于约20%、小于约15%、小于约10%、小于约5%或小于约1%。
E48. 实施方案1-47中任一个的方法，所述方法进一步包括将所述分子给予需要治疗疾病或病况的受试者。
E49. 实施方案48的方法，其中疾病或病况选自病毒感染、神经病症(例如阿尔茨海默氏痴呆、进行性核上性麻痹、唐氏综合征、拳击运动员痴呆(慢性创伤性脑病和其它创伤性脑损伤)、连锁于染色体17的额颞痴呆合并帕金森综合征(FTDP-17)、亨廷顿舞蹈病、雷特综合征、安格曼综合征、Lytico-Bodig病(关岛型帕金森综合征-痴呆复合征)、缠结主导型痴呆、神经节神经胶质瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、铅毒性脑病、半侧巨脑症、结节性脑硬化、哈勒沃登-施帕茨病、皮克病、皮质基底神经节变性、嗜银颗粒病、皮质基底节变性、脂褐质沉积症、额颞痴呆、核上麻痹和额颞叶变性、脑网络络功能障碍疾病(例如所有形式的癫痫和抑郁)、脊髓病症、外周神经病、颅神经病症(例如三叉神经痛)、自主神经系统病症(例如家族性自主神经机能异常或多系统萎缩)、中枢和外周神经系统运动障碍(例如帕金森病、特发性震颤、肌萎缩性侧索硬化、图雷特综合征、多发性硬化或不同类型的外周神经病)、睡眠障碍(例如发作性睡病)、偏头痛或其它类型的头痛(例如丛集性头痛和紧张型头痛)、下背部和颈部疼痛、中枢神经病、神经精神疾病、注意力缺陷障碍伴多动症、孤独症、亨廷顿舞蹈病、器质性精神病、脑或骨髓感染(包括脑膜炎)或朊病毒病)、贫血、癌症、白血病、炎症性病况或自身免疫性疾病(例如关节炎、银屑病、红斑狼疮、多发性硬化)、细菌感染、额颞痴呆-τ (FTD-τ)、连锁于染色体17的额颞痴呆和帕金森综合征(FTDP-17)、皮质基底节变性(CBD)、创伤性脑损伤、慢性创伤性脑病、HIV相关神经认知障碍、嗜银颗粒病、唐氏综合征-阿尔茨海默氏痴呆、遗忘性轻度认知障碍-阿尔茨海默氏痴呆、帕金森病痴呆、哈勒沃登-施帕茨病(泛酸激酶相关神经变性)、C型尼曼-皮克病、强直性肌营养不良、肌萎缩性侧索硬化、半侧巨脑症、结节性脑硬化复征、2b型局灶性皮质发育不良、神经节细胞肿瘤、Dravet综合征(婴儿期重度阵挛性癫痫)、颞叶癫痫、Ohtahara综合征(早期婴儿型癫痫性脑病合并压抑爆发)、Lafora体病、广泛性癫痫伴热性癫痫发作、婴儿痉挛(韦斯特综合征)、Lennox Gastaut综合征、安格曼综合征、雷特综合征、Landau Kleffner综合征、局灶性颠痫、单纯局灶性颠痫(不丧失意识)、局灶性认知障碍颠痫(意识障碍)、发展成全身性强直阵挛性(GTC)惊厥的局灶性颠痫、全身性癫痫发作(惊厥或非惊厥、带有涉及皮层下结构的两侧放电)、失神发作、肌阵挛发作、阵挛发作、强直发作、强直-阵挛发作和强直发作、孤独症、孤独症谱系障碍、阿斯珀格病症、广泛性发育障碍及其任何组合。
E50. 实施方案49的方法，其中所述分子治疗或预防疾病或病况。
E51. 实施方案16-50中任一个的方法，其中多核苷酸是反义寡核苷酸。
E52. 实施方案16-51中任一个的方法，其中多核苷酸包含至少1个核苷酸类似物。
E53. 实施方案16-52中任一个的方法，其中多核苷酸包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个核苷酸类似物。
E54. 实施方案52或53的方法，其中一个或多个核苷酸类似物是锁定核酸(LNA)、2'-O-烷基-RNA、2'-氨基-DNA、2'-氟-DNA、阿拉伯糖核酸(ANA)、2'-氟-ANA、己糖醇核酸(HNA)、间插核酸(INA)、约束乙基核苷(cEt)、2'-O-甲基核酸(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基核酸(2'-MOE)或其任何组合。
E55. 实施方案23-54中任一个的方法，其中反义寡核苷酸包括选自以下的核苷间键：磷酸二酯键、磷酸三酯键、甲基膦酸酯键、氨基磷酸酯键、硫代磷酸酯键及其组合。
E56. 实施方案23-55中任一个的方法，其中反义寡核苷酸是gapmer、blockmer、mixmer或wingmer。
E57. 实施方案1-56中任一个的方法，其中当将所述分子给予实验室动物时，超过20%的动物存活。
E58. 实施方案1-57中任一个的方法，其中当将所述分子给予实验室动物时，超过50%的动物存活。
E59. 实施方案1-58中任一个的方法，其中当将所述分子给予实验室动物时，超过85%的动物存活。
E60. 一种分子，其选自实施方案1-59中任一个的方法。
E61. 一种治疗疾病或病况的方法，所述方法包括给予实施方案60的分子。
E62. 实施方案61的方法，其中所述疾病或病况与神经元细胞有关。
E63. 一种测试或测定分子的体内急性神经毒性的方法，所述方法包括以下步骤：1)将所述分子加入神经元细胞培养物中，和2)体外测量神经元细胞中的钙波动。
E64. 实施方案63的方法，所述方法进一步包括将与神经元细胞中的钙波动与未暴露于所述分子的神经元细胞(“对照细胞”)的钙波动进行比较。
E65. 实施方案63或64的方法，其中神经元细胞自哺乳动物皮层神经元制备。
E66. 实施方案63-65中任一个的方法，其中钙波动是依赖AMPA受体的。
E67. 实施方案63-66中任一个的方法，其中钙波动在Mg2+离子存在下测量。
E68. 实施方案67的方法，其中Mg2+离子的浓度为至少约0.5 mM、至少约0.6 mM、至少约0.7 mM、至少约0.8 mM、至少约0.9 mM、至少约1 mM、至少约1.5 mM、至少约2.0 mM、至少约2.5 mM、至少约3.0 mM、至少约4 mM、至少约5 mM或至少约10mM。
E69. 实施方案63-68中任一个的方法，其中所述分子包括小分子、多核苷酸、蛋白质、肽或其任何组合。
E70. 实施方案69的方法，所述方法进一步包括计算序列评分的步骤，其中序列评分通过下式(I)计算：
(多核苷酸中C核苷酸或其类似物的数目 - 多核苷酸中G核苷酸或其类似物的数目)/多核苷酸中的总核苷酸数 　　　　　　　　　　　　(I)。
E71. 一种测定包含核苷酸序列的分子的体内急性神经毒性的方法，所述方法包括计算序列评分，其中序列评分通过下式(I)计算：
(核苷酸序列中C核苷酸或其类似物的数目 - 核苷酸序列中G核苷酸或其类似物 的数目)/多核苷酸中的总核苷酸数　　　　　　　　　(I)，
其中核苷酸序列具有大于或等于0.2的序列评分。
E72. 实施方案63-71中任一个的方法，所述方法进一步包括测量所述分子的体内耐受性。
E73. 实施方案63-72中任一个的方法，所述方法进一步包括测量神经元细胞培养物中的微管蛋白强度。
E74. 实施方案63-73中任一个的方法，其中所述分子是反义寡核苷酸。
E75. 实施方案63-74中任一个的方法，其中当将所述分子给予实验室动物时，超过50%的动物存活。
E76. 实施方案63-74中任一个的方法，其中当将所述分子给予实验室动物时，超过85%的动物存活。
E77. 一种用于治疗疾病或病况的分子，其中所述分子通过实施方案63-76的方法中测定或鉴定具有可耐受的体内急性神经毒性。
E78. 实施方案77的方法，其中所述疾病或病况与神经元细胞有关。
E79. 一种用于治疗需要治疗的受试者的神经疾病或病况的反义寡核苷酸，其中与溶媒对照细胞的钙波动相比，与反义寡核苷酸接触的神经元细胞的钙波动为约70%或更高、约75%或更高、约80%或更高、约85%或更高、约90%或更高、约95%或更高、约96%或更高、约97%或更高、约98%或更高、约99%或更高、约100%或更高、约120%或更高、约140%或更高、约160%或更高、约180%或更高、约200%或更高、约220%或更高、约240%或更高或约250%或更高。
E80. 一种用于治疗神经疾病或病况的反义寡核苷酸，其序列评分为大于或等于0.2、大于或等于0.25、大于或等于0.3、大于或等于0.35、大于或等于0.4、大于或等于0.45、大于或等于0.5、大于或等于0.55、大于或等于0.6、大于或等于0.65、大于或等于0.7、大于或等于0.75、大于或等于0.8、大于或等于0.85、大于或等于0.9、大于或等于0.95、大于或等于1.0、大于或等于1.5、大于或等于2.0、大于或等于3.0或者大于或等于4.0。
E81. 在测试或测定分子的体内神经毒性的方法中，改进包括体外测量在与分子接触的神经元细胞中的钙波动。
E82. 在选择或鉴定具有可耐受的体内神经毒性的分子的方法中，改进包括体外测量在与分子接触的神经元细胞中的钙波动，其中与所述分子接触的神经元细胞显示水平相当于或高于溶媒对照细胞的水平的钙波动。
E83. 在实施方案81或82的方法中，改进另包括计算序列评分，其中所述分子包括多核苷酸且其中多核苷酸的序列评分通过下式(I)计算：
(多核苷酸中C核苷酸或其类似物的数目 - 多核苷酸中G核苷酸或其类似物的数 目)/多核苷酸中的总核苷酸数 (I)。
E84. 在测定包含多核苷酸的分子的体内急性神经毒性的方法中，改进包括计算多核苷酸的序列评分，其中序列评分通过下式(I)计算：
(多核苷酸中C核苷酸或其类似物的数目 - 多核苷酸中G核苷酸或其类似物的数 目)/多核苷酸中的总核苷酸数 (I)。
E85. 在选择包含具有可耐受的体内急性神经毒性的多核苷酸的分子的方法中，改进包括应用下式(I)计算序列评分：
(多核苷酸中C核苷酸或其类似物的数目 - 多核苷酸中G核苷酸或其类似物的数 目)/多核苷酸中的总核苷酸数 (I)，
其中多核苷酸具有大于或等于0.2的序列评分。
E86. 在实施方案81-85的方法中，改进进一步包括测量所述分子的靶蛋白的体外表达的减少。
E87. 在实施方案81-85中任一个的方法中，改进进一步包括测量所述分子的体内耐受性。
E88. 在实施方案87的方法中，其中体内耐受性通过将所述分子给予哺乳动物并将哺乳动物的耐受性按耐受性类别分级来测量。
附图说明
图1：显示原代神经元自发钙波动的图。如之前所述测量原代神经元自发钙波动(Murphy等, 1992, J. Neurosci. 12:4834-4845)。加入α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸(AMPA)受体拮抗剂，6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(CNQX；3µM)降低表示测定中总AMPA反应的钙波动达20% (AMPA标记线条所示)。当N-甲基-D-天冬氨酸酯(NMDA)受体功能被1mM MgCl2阻断时，钙波动进一步降低达约80% (NMDA标记线条所示)。
图2：显示AMPA介导的钙波动被反义寡聚体抑制作为神经元网活性破坏指征的图。评价在1mM MgCl2存在或不存在(在每种情况下代表100%对照)时，反义寡聚体对NMDA或AMPA介导的自发钙波动的抑制。加入25 μM反义寡聚体(TGTgatgcaggaGTT) (SEQ ID NO:304) (ASO-00007)抑制AMPA受体而非NMDA受体介导的波动。显示了ASO和表现类似的其它寡聚体负面影响体内中枢神经系统(CNS)网活性和体外电生理学自发神经元活性(数据未显示)。
图3：序列评分相对于体内耐受性评分的相关分析。通过将合适的数目代入下式来计算各寡聚体的序列评分：((C核苷酸或类似物的数目 - G核苷酸的数目)/寡聚体中的核苷酸长度(数目))。在单次脑室内(i.c.v.)给予小鼠100µg寡聚体或鞘内(i.t.)给予大鼠900µg寡聚体或高达1500µg后，根据观察结果计算体内耐受性评分。根据5个类别观察啮齿动物：1)活动过度；2)活动和觉醒降低；3)运动功能障碍和/或共济失调；4)姿势和呼吸异常；和5)震颤和/或惊厥。总体内耐受性评分是5个单位评分的总和；单位评分的每一个以0-4的标度测量。因此，体内耐受性总评分的范围可为0-20。通过该公式计算的序列评分位于X轴，体内耐受性评分位于Y轴。
图4：显示τ反义寡核苷酸对原代神经元中的自发钙波动的影响。图4列出寡聚体名称、ASO标识号、ASO序列、SEQ ID号、MAPT pre-mRNA序列上的目标开始和结束位置和作为对照的百分比的钙波动数据(如下文实施例2中所述)。图4中具有错配碱基的寡聚体的实例以“mm”提供。具体的错配碱基对用黑体字、下划线、斜体字和突出显示。
图5：显示示例性反义寡核苷酸的体内耐受性。图5列出ASO标识号、ASO序列、SEQID号、MAPT pre-mRNA序列上的目标开始和结束位置、体内急性耐受性评分(如下文实施例6中所述)和在给药后余留的脑MAPT mRNA的百分比(亦如下文实施例6中所述)。
图6：显示因示例性反义寡核苷酸所致的τ蛋白减少。图6列出SEQ ID号、寡聚体名称、ASO标识号、ASO序列、MAPT pre-mRNA序列上的目标开始和结束位置、成熟mRNA序列上的目标起点和归一化Tau/Tuj-1和Tuj-1免疫细胞化学值(如下文实施例7中所述)。图6中具有错配碱基的寡聚体的实例以“mm”提供。具体的错配碱基对用黑体字、下划线、斜体字和突出显示。
发明详述
I. 定义
要注意，术语“a”或“an”实体是指该实体的一个或多个；例如，“分子”要理解为代表一个或多个分子。因此，术语“a” (或“an”)，“一个或多个”和“至少1个”在本文可互换使用。
此外，“和/或”在本文使用时要视为与或不与另一个具体公开两个指定特征或组分的每一个。因此，如本文用于短语例如“A和/或B”的术语“和/或”意在包括“A和B”、“A或B”、“A” (单独地)和“B” (单独地)。同样地，如本文用于短语例如“A、B和/或C”的术语“和/或”意在包括下列方面的任一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A (单独地)；B (单独地)；和C (单独地)。
要了解，本文不论何处以用语“包含”描述各方面，还提供用“由……组成”和/或“基本上由……组成”表示的另外的类似方面。
除非另有说明，否则本文所用的所有技术和科学术语具有本公开内容与之相关的领域的普通技术人员通常理解的相同含义。例如，Concise Dictionary of Biomedicineand Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press；The Dictionaryof Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press和OxfordDictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, OxfordUniversity Press为技术人员提供本公开内容所用许多术语的通用词典。
以其Système International de Unites (SI)公认形式标示单位、首标和符号。数值范围包括界定该范围的数值。除非另有说明，否则核苷酸序列以5'向3'方向从左向右书写。氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。本文提供的标题不限制本公开内容不同方面，其可在提及作为整体的说明书时使用。因此，通过引用以其整体更全面地定义紧接下文定义的术语。
术语“约”在本文使用意指大约、大体、大致或左右。当术语“约”结合数值范围使用时，它通过延伸所列数值之上和之下的边界来修改该范围。一般来说，术语“约”可通过变动例如上下10% (较高或较低)修改某一数值高于和低于规定值。例如，约70%可包括70% - 7%至70% + 7%，即63%-77%。
术语“治疗性分子”是指具有体内治疗作用用于治疗疾病或病况的任何化合物。治疗性分子的非限制性实例包括天然存在的、修饰的、重组产生的或化学合成的寡聚体、一个或多个核苷酸、一个或多个核苷、一个或多个氨基酸、多核苷酸、肽、蛋白质、多肽或小分子化合物。是治疗性分子的蛋白质包括但不限于抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、细胞因子、细胞表面受体、激素、生长因子或其任何组合。
术语“寡聚体”在本发明的情况下，是指由两个或更多个核苷酸共价连接形成的分子(即寡核苷酸)。寡聚体包含长度约10-约50，例如10 – 20、16-20、10 – 30、10 – 35、10 –40或10 – 45个核苷酸的连续核苷酸序列。本文所用术语“反义寡聚体”、“反义寡核苷酸”和“ASO”可与术语“寡聚体”互换。在不同的实施方案中，本发明的寡聚体不含RNA (单元)。在一些实施方案中，寡聚体包括一个或多个DNA单元。在一个实施方案中，本发明的寡聚体是线性分子或作为线性分子合成。在一些实施方案中，寡聚体是单链分子，且不含例如至少3、4或5个连续核苷酸的短区域，其与同一寡聚体内的等同区域互补(即双链体)—在这一方面，寡聚体(基本上)不是双链。在一些实施方案中，寡聚体基本上不是双链。在一些实施方案中，寡聚体不是siRNA。在不同的实施方案中，本发明的寡聚体完全由连续核苷酸区组成。因此，在一些实施方案中，寡聚体基本上不是自互补的。
术语“核酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”或“核酸序列”旨在包括多个核酸(例如两个或更多个、三个或更多个等)。术语“核酸”或“核苷”是指存在于多核苷酸中的单一核酸区段，例如DNA、RNA或其类似物。在一些实施方案中，术语“核苷酸”、“单元”和“单体”可互换使用。应认识到，当提及核苷酸或单体的序列时，所提及的是碱基(例如A、T、G、C或U)的序列及其类似物。术语“核苷酸序列”是指包含至少2个核苷酸彼此连接的分子。
本文所用术语“核苷酸”是指包含糖部分、碱基部分和例如磷酸酯或硫代磷酸酯核苷酸间连接基等共价连接基团(连接基)的糖苷，并包括天然存在的核苷酸(例如DNA或RNA)和包含修饰的糖和/或碱基部分的非天然存在的核苷酸两者，后者在本文亦称为“核苷酸类似物”。在本文中，单个核苷酸(单元)亦可称为单体或核酸单元。在某些实施方案中，术语“核苷酸类似物”是指具有修饰的糖部分的核苷酸。本文其它部分公开了具有修饰的糖部分的核苷酸(例如LNA)的非限制性实例，例如2′-O-甲基、2′-氟(2′-F)、2′-O-甲氧基乙基(2′-MOE)和2′,4′-受约束的2′-O-乙基(cEt)。在其它实施方案中，术语“核苷酸类似物”是指具有修饰的碱基部分的核苷酸。具有修饰的碱基部分的核苷酸包括但不限于5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤或2-氯-6-氨基嘌呤。在某些实施方案中，当提及本文公开的序列评分公式时，胞嘧啶的核苷酸类似物是5-甲基胞嘧啶。
本文所用术语“多核苷酸”是指序列中连接的两个或更多个核苷酸。示例性多核苷酸可包括具有2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸、10个核苷酸、寡核苷酸、50个核苷酸、51个核苷酸或更多个的核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸包括长于10个核苷酸、11个核苷酸、12个核苷酸、13个核苷酸、14个核苷酸、15个核苷酸、16个核苷酸、17个核苷酸、18个核苷酸、19个核苷酸、20个核苷酸、21个核苷酸、22个核苷酸、23个核苷酸、24个核苷酸26个核苷酸、27个核苷酸、28个核苷酸、29个核苷酸、30个核苷酸的核苷酸序列。在其它实施方案中，多核苷酸包括寡聚体(例如反义寡核苷酸)。在另外其它的实施方案中，多核苷酸包括编码蛋白质或多肽的核苷酸序列。在其它另外的实施方案中，多核苷酸包括长于100个核苷酸、长于200个核苷酸、长于300个核苷酸、长于400个核苷酸、长于500个核苷酸、长于1000个核苷酸、长于1500个核苷酸、长于2000个核苷酸、长于3000个核苷酸、长于4000个核苷酸或长于5000个核苷酸的核苷酸序列。
本文所用术语“核苷”用来指包含糖部分和碱基部分的糖苷，因此当提及核苷酸单元(其通过寡聚体核苷酸之间的核苷酸间键共价连接)时可以使用。在生物技术领域，术语“核苷酸”常用来指核酸单体或单元，因此在寡核苷酸的情况下可指碱基—例如“核苷酸序列”，通常是指核碱基序列(即糖骨架和核苷间键的存在是无疑的)。同样地，特别是在核苷间连接基团的一个或多个被修饰的寡核苷酸的情况下，术语“核苷酸”可指“核苷”。例如甚至当确定核苷间的键的存在或性质时，可使用术语“核苷酸”。
本文所用术语“核苷酸长度”意指指定序列中核苷酸(单体)的总数。例如，AAAgatgaaatttgctcTTA的序列(SEQ ID NO: 4)具有20个核苷酸；因此序列的核苷酸长度是20。本文所用术语“核苷酸长度”在本文可与“核苷酸数目”互换使用。
本文所用术语“转录物”可以指初级转录物，通过DNA转录合成并在加工即前体信使RNA (pre-mRNA)后变成信使RNA (mRNA)和经加工的mRNA本身。术语“转录物”可与“pre-mRNA”和“mRNA”互换使用。在DNA链转录为初级转录物后，新合成的初级转录物以若干方式修饰以转化成其成熟的功能形式以产生不同的蛋白质和RNA，例如mRNA、tRNA、rRNA、lncRNA、miRNA等。因此，术语“转录物”可包括外显子、内含子、5' UTR和3' UTR。
本文所用术语“表达”是指多核苷酸籍以产生基因产物(例如RNA或多肽)的过程。它包括而不限于多核苷酸转录成为信使RNA (mRNA)和mRNA翻译成为多肽。表达产生“基因产物”。如本文所用，基因产物可以是核酸(例如由基因转录产生的信使RNA)或自转录物翻译的多肽。本文所述基因产物进一步包括具有转录后修饰的核酸，例如聚腺苷酸化或剪接，或具有翻译后修饰的多肽，例如甲基化、糖基化、脂质添加、与其它蛋白质亚基缔合或蛋白水解性切割。
在测定本发明的寡聚体(或其区段)和编码哺乳动物基因的核酸的靶区段(例如本文公开的区段)之间的“互补性”程度时，“互补性” (亦为“同源性”或“同一性”)程度表示为在寡聚体(或其区段)的序列和与之最佳比对的靶区段(或靶区段的反向互补序列)序列之间的百分比同一性(或百分比同源性)。通过点算2个序列间是相同的比对碱基的数目，除以寡聚体中连续单体的总数，再乘以100，来计算百分比。在这类比较中，如果空位存在，则优选所述空位仅仅是错配，而非空位内单体的数目在本发明的寡聚体和靶区段之间不同的区域。
本文所用术语“互补序列”表示与参比序列互补的序列。众所周知，互补性是DNA复制和转录的基本原则，因为两个DNA或RNA序列之间共有的性质，使得当彼此反平行排列时，序列中各位置的核苷酸碱基都将是互补的，非常像照镜子并看到事物的反转面。因此，例如，5’“ATGC”3’序列的互补序列可书写为3’“TACG”5’或5’“GCAT”3’。本文所用术语“反向互补”、“反向互补的”和“反向互补性”可与术语“互补”、“互补的”和“互补性”互换。
术语“与……相当”在本文用来指比与之比较的参考值高或低差不多30%的值。例如，如果某一值低于参考值差不多30%，则该值被视为“与”参考值“相当”：例如，70与100相当、80与100相当、90与100相当、100与100相当、110与100相当、120与100相当和130与100相当。与对照的钙波动水平相当的分子的钙波动水平意指所述分子的钙波动水平为对照的钙波动水平的±30%、±20%、±10%或±5%。
本文所用术语“设计”或“寡聚体设计”或“ASO序列”是指指定序列中核苷酸(例如DNA)和核苷酸类似物(例如LNA)的形式。如本文所用，寡聚体的设计用大写字母和小写字母的组合表示。例如，tatttccaaattcactttta的寡聚体序列(SEQ ID NO: 573)可具有以下的寡聚体设计：ASO-002350 (TAtTTccaaattcactTTTA)、ASO-002374(TAtTTccaaattcacTtTTA)、ASO-002386 (TATTtccaaattcaCTttTA)、ASO-002227(TATtTccaaattcactTTTA)、ASO-002245 (TAttTCcaaattcactTTTA)、ASO-002261(TATtTccaaattcacTTtTA)、ASO-002276 (ATttCcaaattcactTTTA)、ASO-002228(TATTtccaaattcaCtTtTA)、ASO-002255 (TATTtccaaattcactTTTA)、ASO-002285(TATTtccaaattcacTTtTA)、ASO-002230 (TATTtccaaattcacTtTTA)、ASO-002256(TATTtccaaattcAcTttTA)或ASO-002279 (TATTtccaaattcActTtTA)，其中大写字母表示核苷酸类似物(例如LNA)，小写字母表示核苷酸(例如DNA)。
本文所用术语寡聚体的“化学结构”是指例如核苷酸(例如DNA)、核苷酸类似物(例如β-D-氧基-LNA)、核苷酸碱基(例如A、T、G、C、U或MC)等寡聚体和骨架结构(例如硫代磷酸酯或磷酸二酯)的组分的详细描述。例如，ASO-002350的化学结构可以是OxyTsOxyAsDNAtsOxyTsOxyTsDNAcsDNAcsDNAasDNAasDNAasDNAtsDNAtsDNAcsDNAasDNAcsDNAtsOxyTsOxyTsOxyTsOxyAs。
“效能”通常表示为IC50或EC50值，单位为nM或pM，除非另有说明。IC50是治疗性分子的中值抑制浓度。EC50是治疗性分子相对于溶媒或盐水对照的中值有效浓度。在功能测定中，IC50是降低例如mRNA转录或蛋白质表达等生物反应达没有治疗性分子时达到的生物反应50%的浓度。在功能测定中，EC50是产生例如mRNA转录或蛋白质表达等生物反应的50%的治疗性分子的浓度。IC50或EC50可通过本领域已知的多种方法计算。
所谓“毒副作用”意指引起活的受试者虚弱的作用，包括但不限于死亡、疼痛、震颤、惊厥、癫痫发作、运动抑制或记忆丧失。当受试者例如通过注射、摄入、吸入或其它途径暴露于毒性化合物时，“毒性”化合物可引起毒副作用，并且不适于给予哺乳动物，例如啮齿动物。在一个实施方案中，毒副作用包括体内神经毒性。在另一个实施方案中，毒副作用是体内急性神经毒性。“神经毒性”化合物可以损害神经组织(包括脑组织，例如神经元和外周神经组织)的方式改变神经系统的正常活性。
所谓“可耐受的”意指活的受试者所充分耐受的分子，例如当给予时不引起是可见的或采用通用生命质量试验或如本文所述通过测量体内耐受性评分可检测到的有害作用的分子。
所谓“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”意指需要对其进行诊断、预后或疗法的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、驯养动物、农场动物、运动动物和动物园动物，包括例如人、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、熊等。
本文公开的治疗性分子的“有效量”是足以实现明确指定的目的的量。“有效量”可凭经验和以与指定目的有关的常规方式确定。
术语例如“治疗”或“医治”或“处理”或“减轻”或“缓解”是指(1)医治、减慢、减轻确诊的病理病况或病症的症状和/或结束其进展的治疗措施；和(2)预防和/或减慢靶定病理病况或病症的发生的预防或预防性措施两者。因此，治疗需要治疗的受试者包括已患病症的受试者、易患病症的受试者和其病症待预防的受试者。在某些实施方案中，按照本文提供的方法如果患者显示例如与疾病或病症有关的症状完全、部分或暂时减轻或消除，则针对本文其它部分公开的疾病或病况受试者被成功“治疗”。
II.采用钙波动测定法测定体内神经毒性的方法
本公开内容提供通过测量所述分子的某些特征用于测试或测定分子的毒性(例如体内急性神经毒性)的方法。本公开内容还提供用于选择毒副作用降低的分子的方法。所述方法有助于在测试所述分子毒性时减少对动物的不必需的杀害和/或提高所述分子对于体内给药会是安全的可能性。本发明方法还可通过缩短用于选择不显示体内急性神经毒性的分子的筛选时期，来提高候选分子评价周期的效率(即缩短)。本发明方法包括鉴定毒性降低或减少的分子。例如，可对分子进行测定以确定它们是否具有低的毒性(例如体内急性神经毒性)，并且是否发现它们具有低毒性，选出所述分子用于进一步测试或给予受试者，例如哺乳动物。在一些实施方案中，如果发现所述分子具有低毒性，则将它给予实验室动物用于所述分子的进一步测试。
不受任何理论的束缚，本公开内容鉴定出(i)体外神经元细胞中分子的钙波动和所述分子(例如包含某一序列的多核苷酸)的序列评分之间的相关性，(ii)分子的钙波动和所述分子的体内神经毒性之间的相关性；(iii)分子(例如包含某一序列的多核苷酸)的序列评分和所述分子的体内神经毒性之间的相关间，或(iv)其任何组合。在一个实施方案中，本公开内容表明当体内给予哺乳动物时，显示神经元细胞中的钙波动与未显露于所述分子的神经元细胞中的钙波动相当(即与之相比小于30%或更小)的分子显示较少的体内神经毒性。在另一个实施方案中，本公开内容表明，显示神经元细胞中的钙波动与未暴露于所述分子的神经元细胞中的钙波动相当(即与之相比小于30%或更小)的分子具有等于或大于0.2的序列评分。在其它实施方案中，本公开内容表明，当将所述分子体内给予哺乳动物时，序列评分等于或大于0.2的分子显示较少的体内神经毒性。因此，钙波动测定法、序列评分和体内神经毒性的相关性的鉴定允许根据体外钙波动测定和序列评分，预测体内神经毒性。在又一个实施方案中，如上文进一步的论述，本发明允许根据体外钙波动测定、序列评分和细胞中微管蛋白强度的改变预测体内神经毒性。
一方面，本公开内容提出钙波动测定法作为测量或预测分子毒性的一种方法。另一方面，本公开内容提供序列评分方法以测量或预测分子的毒性。在其它方面，本公开内容提供采用钙波动测定法和序列评分方法的联合方法。本公开内容还提供可单独或与钙波动测定法和/或序列评分方法联合使用的体内耐受性测定法。本申请公开和/或本领域已知的任何其它方法可进一步与钙波动测定法和/或序列评分方法联合。
II.A. 钙波动测定法
在一个实施方案中，所述分子的毒性(例如体内急性神经毒性)通过体外测量与所述分子接触或已与所述分子接触的神经元细胞中的胞内游离钙波动(钙波动)来测试。下面更详尽地论述测量钙波动的测定法的实例。在一些实施方案中，如果与对照细胞中的钙波动相比，所述分子不显著降低暴露于所述分子的细胞中的钙波动，则所述分子被视为具有可接受的毒性(例如体内急性神经毒性)。在一些实施方案中，对照细胞是未暴露于试验分子，但除此之外处于与暴露于试验分子的细胞相同条件下的细胞。在一些实施方案中，钙波动测定法可包括阳性对照细胞(即暴露于已知降低钙波动至不可耐受水平的分子的细胞)或阴性对照细胞(即暴露于已知不影响细胞中的钙波动的分子的细胞)。在另一个实施方案中，对照细胞暴露于将受测分子带入神经元细胞培养物中、不含试验分子的例如水、缓冲液或盐水等介质(即溶媒对照)。
在一个实施方案中，本公开内容提供测试、鉴定或测定分子的体内急性神经毒性的方法，所述方法包括体外测量与所述分子接触或已与所述分子接触的神经元细胞中的钙波动。在另一个实施方案中，本公开内容包括测试、鉴定或测定分子的体内急性神经毒性的方法，所述方法包括(1)将所述分子加入神经元细胞培养物中，并(2)体外测量神经元细胞中的钙波动。在另一个实施方案中，本公开内容提供预测分子的体内急性神经毒性的方法，其包括以下步骤：(1)将所述分子加入神经元细胞培养物中，和(2)体外测量神经元细胞中的钙波动。
在某些实施方案中，本公开内容提供测试、鉴定或测定分子的体内急性神经毒性或选择或鉴定具有可耐受的体内急性神经毒性的分子的方法，所述方法包括(i)在将所述分子加入神经元细胞的培养物中后，体外测量神经元细胞中的钙波动，其中神经元细胞中的钙波动相当于或高于溶媒对照的钙波动，(ii)将所述分子给予有需要的人。
在其它实施方案中，本公开内容包括选择或鉴定具有可耐受的体内急性神经毒性的分子的方法，所述方法包括体外测量与分子接触的神经元细胞中的钙波动，其中所接触的神经元细胞显示水平相当于或高于对照细胞的水平的钙波动。在一些实施方案中，本公开内容提供选择或鉴定具有可耐受的体内急性神经毒性的分子的方法，所述方法包括以下步骤：(i)将分子加入神经元细胞培养物中，(ii)体外测量神经元细胞中的钙波动，其中含所述分子的神经元细胞显示水平相当于或高于对照细胞的水平的钙波动。
钙波动对神经元细胞的正常功能是重要的。皮层神经元网络显示进行导致神经递质谷氨酸释放的自发钙波动。除网络中的其它相关神经元以外，钙波动还可调节神经元与相关神经胶质的相互作用，以释放谷氨酸以外的神经递质。受调节的钙波动是对于正常脑功能的神经元网络的体内稳态所必需的(参见Shashank等, Brain Research, 1006(1):8–17 (2004)；Rose等, Nature Neurosci., 4:773 – 774 (2001)；Zonta等, J Physiol Paris., 96(3-4):193-8 (2002)；Pasti等, J. Neurosci., 21(2): 477-484 (2001))。谷氨酸还激活两个不同的通道，α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸(AMPA)受体和N-甲基-D-天冬氨酸酯(NMDA)受体。
在一些实施方案中，本发明方法测量的钙波动是依赖AMPA的钙波动。在一些实施方案中，钙波动是依赖NMDA的钙波动。在一些实施方案中，钙波动是依赖γ-氨基丁酸(GABA)的钙波动。在一些实施方案中，钙波动可以是依赖AMPA、依赖NMDA或依赖GABA的钙波动的两个或更多个的组合。
在某些实施方案中，本发明方法测量的钙波动是依赖AMPA的钙波动。为了测量依赖AMPA的钙波动，钙波动可在Mg2+离子(例如MgCl2)存在下测量。在某些实施方案中，所述方法进一步包括以允许检测依赖AMPA的钙波动的量加入Mg2+离子(例如MgCl2)。在一些实施方案中，依赖AMPA的钙波动的有效的离子浓度为至少约0.5 mM。在其它实施方案中，为诱导依赖AMPA的钙波动的Mg2+离子(例如MgCl2)的有效离子浓度为至少约0.6 mM、至少约0.7 mM、至少约0.8 mM、至少约0.9 mM、至少约1 mM、至少约1.5 mM、至少约2.0 mM、至少约2.5 mM、至少约3.0 mM、至少约4 mM、至少约5 mM、至少约6 mM、至少约7 mM、至少约8 mM、至少约9mM或至少约10mM。在一个具体的实施方案中，可用于该方法的Mg2+离子的浓度是1mM。在某些实施方案中，可用于本发明方法的Mg2+离子(例如MgCl2)的浓度为约1 mM-约10 mM、约1 mM-约15mM、约1 mM-约20 mM或约1 mM-约25 mM。可通过加入例如碳酸镁、氯化镁、柠檬酸镁、氢氧化镁、氧化镁、硫酸镁和七水硫酸镁等镁盐，来加入Mg2+离子。
在一些实施方案中，在本发明方法中通过使用检测胞内钙水平波动的荧光探针来测量钙波动。例如，胞内钙流量的检测可通过使细胞用与钙离子结合的荧光染料(称为荧光钙指示剂)染色来实现，因此产生可检出的荧光变化(例如可获自Molecular Probes.Eugene, OR, United States of America的Fluo-4 AM和Fura Red AM染料)。
可用于钙波动测定法的荧光染料常常通过校正测量波长的荧光强度对胞内钙流量提供比例检测。在一些实施方案中，可任选在多个时间点或连续(例如实时)，通过共焦或标准荧光显微镜测量染色细胞(包括染色的单个细胞)的荧光，以提供例如时滞测量。本领域技术人员应认识到，还可能是用于测量胞内钙流量的其它合适方法，例如通过遗传编码的钙指示剂的病毒转导等。
在一个实施方案中，本发明方法测量的钙波动是神经元细胞培养物内钙波动的累积增加，籍以达到最大荧光信号的时间构成钙反应的幅度。可对荧光测量进行分析以鉴定胞内钙流量的波动和/或代表指定波动中的胞内钙流量进行到最大或最小的点的“阈值”。在另一个实施方案中，本发明方法中测量的钙波动是钙波动的频率。术语“波动频率”是指波动之间的时间。在一个实施方案中，波动频率可通过胞内钙流量中的第一波动的开始到胞内钙流量中的第二波动的开始的时间间隔确定。在其它实施方案中，本发明方法中测量的钙波动是波动频率和幅度的组合。
在一些实施方案中，采用本文已知的任何方法测量钙波动。在某些实施方案中，可通过荧光读板仪，例如Flexstation 2和3读板仪或FLIPR™ (Fluorescence ImagingPlate Reader)，测量钙波动。在其它实施方案中，可按Murphy等, J. Neurosci. 12,4834-4845 (1992)中所示测量钙波动。
可从哺乳动物神经元细胞，例如小鼠神经元细胞、大鼠神经元细胞、人神经元细胞或其它神经元细胞中分离可用于本发明的神经元细胞。在某些实施方案中，神经元细胞不表达编码蛋白质的内源转录物，例如，如果人蛋白质在小鼠细胞中被靶定，则小鼠细胞的转录物的内源形式自其基因组缺失。在某些实施方案中，按照生产商的方案，通过木瓜蛋白酶消化产生原代神经元(Worthington Biochemical Corporation, LK0031050)。在一个实施方案中，前脑按下列实施例制备。前脑可从在鼠MAPT失效背景下表达完整靶基因的hTau小鼠E18 BAC-Tg胚胎中切下，并且可在木瓜蛋白酶/DNA酶/Earle平衡盐溶液(EBSS)中在37℃下孵育30-45分钟。在细胞沉淀研磨和离心后，反应通过与含有蛋白酶抑制剂、牛血清白蛋白(BSA)和DNA酶的EBSS一起孵育来结束。细胞可用补充2% B-27、100 μg/ml青霉素、85 μg/ml链霉素、0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal (NB, Invitrogen)研磨和洗涤。将细胞以15,000个细胞/孔接种在补充的NB培养基上聚D-赖氨酸包被的96孔光学成像板(BD Biosciences)上。
在一些实施方案中，将具有可耐受的体内急性神经毒性的分子的钙波动与未暴露于所述分子的细胞的钙波动进行比较。在一些实施方案中，具有可耐受的体内急性毒性的分子的钙波动大于或等于溶媒对照细胞(例如水或盐水)中的钙波动的约250%、大于或等于约240%，大于或等于约230%、大于或等于约220%，大于或等于约210%、大于或等于约200%、大于或等于约190%、大于或等于约180%、大于或等于约170%、大于或等于约160%、大于或等于约150%、大于或等于约140%、大于或等于约130%、大于或等于约120%、大于或等于约110%、大于或等于约100%、大于或等于约99%、大于或等于约98%、大于或等于约97%、大于或等于约96%、大于或等于约95%、大于或等于约90%、大于或等于约85%、大于或等于约80%、大于或等于约75%或者大于或等于约70%。本文所用术语“大于或等于”可与“至少”互换使用。在其它实施方案中，具有可耐受的体内急性毒性的钙波动大于或等于溶媒对照细胞中的钙波动的100%。在某些实施方案中，具有可耐受的体内急性毒性的钙波动大于或等于溶媒对照细胞中的钙波动的约70%。在某些实施方案中，具有可耐受的体内急性毒性的钙波动大于或等于溶媒对照细胞中的钙波动的约75%。在其它实施方案中，具有可耐受的体内急性毒性的钙波动是溶媒对照细胞中的钙波动的约70%-约250%、约70%-约200%、约75%-约200%、约70%-约180%、约75%-约150%、约80%-约200%、约90%-约200%、约100%-约200%或约80%-约250%。
在一些实施方案中，与溶媒对照细胞中的钙波动相比，暴露于具有可耐受的体内急性神经毒性的分子的细胞中的钙波动显示小于约25%、小于约20%、小于约15%、小于约10%、小于约5%或小于约1%降低。在其它实施方案中，与溶媒对照细胞中的钙波动相比，暴露于具有可耐受的体内急性神经毒性的分子的细胞中的钙波动降低小于约30%、小于约25%、约20%、约15%、约10%、约5%、约4%、约3%、约2%或约1%。
在某些实施方案中，引起大于所需的钙波动降低的分子被视为具有不可接受的神经毒性的分子。在这些实施方案中，如果给予受试者，则引起大于所需的钙波动降低的分子被视为具有毒副作用的风险。在某些实施方案中，本公开内容提供鉴定或测定具有不可耐受的体内神经毒性的分子的方法，所述方法包括在神经元细胞中与所述分子接触后体外测量神经元细胞中的钙波动。在一些实施方案中，具有不可耐受的体内神经毒性的分子的钙波动小于溶媒对照细胞中的钙波动的70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%或1%。在某些实施方案中，本公开内容包括鉴定或测定具有不可耐受的体内神经毒性的分子的方法，所述方法包括在神经元细胞中与所述分子接触后体外测量神经元细胞中的钙波动，其中所述分子的钙波动等于或小于溶媒对照细胞中的钙波动的50%。
在一些实施方案中，所述分子是治疗性分子。在其它实施方案中，所述分子包括小分子、多核苷酸、蛋白质、肽或其任何组合。本文其它部分描述了所述分子的非限制性实例。
II.B. 序列评分方法
本公开内容还涉及测试或测定包含核苷酸序列的分子(例如多核苷酸)的体内神经毒性的方法。在一些实施方案中，所述方法包括测量通过下式(I)计算的序列评分：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
在其它实施方案中，本发明的寡聚体具有大于或等于0.2的序列评分。
在一些实施方案中，所述方法包括测量通过下式(IA)计算的序列：
Figure 777294DEST_PATH_IMAGE002
。
在其它实施方案中，本发明的寡聚体具有大于或等于0.2的序列评分。
在这些实施方案中，大于或等于截止值的序列评分相当于寡聚体的神经毒性降低。
例如，ATGCATGCATGCATGC (SEQ ID NO: 3)的核苷酸序列具有0 ((4C – 4G)/16)的序列评分。GTGCGTGCGTGCGTGC (SEQ ID NO: 732)的序列具有的-0.25 ((4C – 8G)/16)序列评分。CTGCCTGCCTGCCTGC (SEQ ID NO: 733)的序列具有0.25 ((8C – 4G)/16)的序列评分。在某些实施方案中，如果包含核苷酸序列的多核苷酸(例如寡聚体)具有大于或等于约0.2、大于或等于约0.25、大于或等于约0.3、大于或等于约0.35、大于或等于约0.4、大于或等于约0.45、大于或等于约0.5、大于或等于约0.55、大于或等于约0.6、大于或等于约0.65、大于或等于约0.7、大于或等于约0.75、大于或等于约0.8、大于或等于约0.85、大于或等于约0.9、大于或等于约0.95,大于或等于约1.0、大于或等于约1.5、大于或等于约2.0、大于或等于约3.0或大于或等于约4.0的序列评分，则被视为具有可接受的神经毒性。在某些实施方案中，如果多核苷酸具有大于或等于0.2、大于或等于0.25、大于或等于0.3、大于或等于0.35、大于或等于0.4、大于或等于0.45、大于或等于0.5、大于或等于0.55、大于或等于0.6、大于或等于0.65、大于或等于0.7、大于或等于0.75、大于或等于0.8、大于或等于0.85、大于或等于0.9、大于或等于0.95,大于或等于1.0、大于或等于1.5、大于或等于2.0、大于或等于3.0或大于或等于4.0的序列评分，则被视为具有可接受的神经毒性。在一些实施方案中，具有可接受的神经毒性的多核苷酸的序列评分等于或大于0.2。
在某些实施方案中，序列评分低于设定阈值的包含核苷酸序列的分子被视为是具有不可接受的神经毒性的分子。在这些实施方案中，如果给予受试者，则序列评分低于设定阈值的分子被视为具有毒副作用的风险。
在某些实施方案中，用于选择分子的上述方法的任一种可组合使用。当组合使用时，如果所述分子被选为具有可接受的神经毒性用于一种以上方法的分子，则当给予试验受试者或患者时，所述分子被视为具有较大机会具有可接受的神经毒性。
在某些实施方案中，本公开内容包括选择具有可耐受的体内急性神经毒性的多核苷酸的方法，所述方法包括(i)进行本文公开的钙波动测定法，(ii)计算本文公开的序列评分，其中多核苷酸的钙波动等于或大于溶媒细胞中的钙波动的75%，且多核苷酸的序列评分大于或等于0.25。在一些实施方案中，钙波动测定法和/或序列评分方法足以预测、鉴定或测定分子的体内急性神经毒性，且不需要额外的体内耐受性研究。钙波动测定法和/或序列评分方法尤其可用于筛选多种候选分子以测定其体内神经毒性。
II.C. 体内耐受性测定法
在其它实施方案中，本发明还涉及通过进行体内耐受性研究选择或鉴定具有可耐受的体内神经毒性的分子的方法。当候选分子的数目少时，体内耐受性研究可提供体内神经毒性的直接指示。在其它实施方案中，体内耐受性研究可与钙波动测定法和/或序列评分方法联用。在进行钙波动测定法和/或序列评分计算选出少数候选分子后，还可采用体内耐受性研究。在一些实施方案中，例如通过脑室内(ICV)给药或鞘内(IT)给药将所述分子给予哺乳动物(例如给予哺乳动物的脑)，来测量体内耐受性评分。
例如，可通过ICV或IT将分子注射到实验室动物中。实验室动物可以是啮齿动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠或仓鼠，但也可以是常用于实验室试验的另一种动物。在某些实施方案中，在分子注射后0.5小时、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时或5小时观察动物。针对行为副作用观察动物，并针对副作用的严重程度以零(无副作用)至20 (以安乐死为结局的惊厥)的标度进行评分。耐受性标度可分成下列神经行为类别的至少1种：1)活动过度，2)活动和觉醒降低，3)运动功能障碍/共济失调，4)姿势和呼吸异常，和5)震颤/惊厥。在一些实施方案中，耐受性标度包括至少2个、至少3个、至少4个或至少5个神经行为类别。以0-4的标度对各类别进行评分，最差可能总评分为20，最佳可能总评分为0。观察动物在例如养育笼中的行为改变，但可在其它环境中观察动物。在一些实施方案中，将动物从养育笼中取出用于更细致的观察，这包括握力和翻正反射的测量。
在某些实施方案中，在分子注射后体内累积耐受性阈值设定为4。例如，图3的相关分析显示，体内耐受性低于4的分子往往具有等于或高于0.2的序列评分。
在其它实施方案中，本公开内容包括鉴定或选择具有可耐受的体内神经毒性的分子的方法，所述方法包括(i)进行钙波动测定法，(ii)计算序列评分，(iii)进行体内耐受性研究，和(iv)将所述分子给予需要治疗疾病或病况的哺乳动物。
II.D. 微管蛋白强度测定法
在某些实施方案中，本公开内容的方法进一步包括测量分子的长期体内毒性。例如，长期毒性通过测量当细胞与分子接触时由所述分子引起的细胞中微管蛋白强度的改变来测定。在某些实施方案中，微管蛋白强度的改变与钙波动的改变、序列评分和/或体内耐受性测定法的一种或两种一起测量。下面提供测量细胞中微管蛋白强度改变的测定法的实例。在一些实施方案中，所述分子显示细胞中的微管蛋白强度大于或等于不暴露于所述分子的细胞(即上文定义的对照细胞)中的微管蛋白强度的99%、大于或等于98%、大于或等于97%、大于或等于96%、大于或等于95%、大于或等于90%、大于或等于85%、大于或等于80%、大于或等于75%或者大于或等于70%。在一些实施方案中，不暴露于受测分子的细胞中的微管蛋白强度被称为对照细胞的微管蛋白强度。在一些实施方案中，所述分子降低微管蛋白强度小于溶媒对照细胞中的微管蛋白强度的约30%、小于约25%、小于约20%、小于约15%、小于约10%、小于约5%或小于约1%。
II.E. 行为测验
本发明方法可进一步包括测量因分子所致动物的行为表现。在一个实施方案中，所述方法包括行为测验评分，其可通过将所述分子给予哺乳动物，并对哺乳动物的行为表现分级来测量。在某些实施方案中，行为测验是短期记忆测验、空间学习和记忆测验、步态分析测验或其任何组合。在一个实施方案中，通过将分子注射到哺乳动物，例如哺乳动物的脑，例如脑室内(ICV)或鞘内(IT)给药，并按0-4的标度对哺乳动物的行为表现分级，来测量行为表现。在某些实施方案中，行为评分小于或等于3的总分、2的总分、1的总分或0的总分。在一些实施方案中，行为评分按下文实施例5中所述测定。
在一些实施方案中，通过下列方法，包括新物体排斥试验、水迷宫试验、步态分析测验和/或其任何组合，来测量行为评分。通过ICV或IT给实验室动物注射治疗性分子。实验室动物可以是哺乳动物，例如啮齿动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠或仓鼠，但也可以是常用于实验室测试的动物。在某些实施方案中，在分子注射后约0.5小时、约1小时、约1.5小时、约2小时、约2.5小时、约3小时、约3.5小时、约4小时、约4.5小时或约5小时时观察动物。
在一个实施方案中，行为评分以新物体识别试验获得。短期识别记忆利用新物体识别(NOR)任务测量。NOR测试基于啮齿动物探索新物体超过熟悉物体的自发行为(Dodart等, Neuroreport (1997) 8(5): 1173-8；Ennaceur和Delacour, Behav. Brain Res.(1988) 31 (1):47-59)。NOR测试可按实施例5中所示试验类似地应用，或可按需改动。
在一个实施方案中，行为评分以水迷宫试验(例如Morris Water Maze)获得。空间学习和记忆可根据如Morris J. Neurosci. (1984) 11(1):47-60)所示Morris水迷宫试验或本文实施例5所示试验评价。在另一个实施方案中，空间学习和记忆测验按需可通过改良的Morris水迷宫试验评价。
在一个实施方案中，行为评分可以步态分析测验(例如Catwalk)获得。Catwalk(Noldus，Netherlands)是一项自动化和计算机化步态分析技术，允许客观地定量测定多个静态和动态步态参数。步态分析测验可通过实施例5中所示Catwalk测定法或需要时通过改良的Catwalk试验测量。
行为测验数据的统计分析可应用本领域技术人员已知的统计分析方法进行分析。在一些实施方案中，行为测验的统计分析应用GraphPad Prism (GraphPad Software，Inc.，La Jolla，CA)进行。对于NOR，数据应用用于组内分析的配对t检验或通过用于组间分析的ANOVA接着Dunnett事后检验进行分析。对于Morris Water Maze (MWM)，应用反复的MWM ANOVA以分析采集阶段，且应用单因素ANOVA接着Dunnett事后用于探测分析。
不受任何理论的束缚，与对照(例如盐水)相比钙波动较小降低(70%或更高)的分子具有较高的序列评分(例如高于0.2)。同样不受任何理论的束缚，与对照相比较小钙波动降低(70%或更高)和较高序列评分(高于0.2)的分子具有较低的体内行为评分(例如小于4)。在其它实施方案中，与对照相比较小钙波动降低(70%或更高)和较高序列评分(高于0.2)的分子具有可耐受的体内急性神经毒性。
II.F. 诊断或治疗方法
按照本发明方法选择的分子可用作例如诊断法、治疗法和预防法的研究试剂。在某些实施方案中，本发明提供既选择分子又使用分子的方法。
在其它实施方案中，按照本发明方法选择的分子是治疗性分子。在其它另外的实施方案中，所述方法包括钙波动测定法、序列评分方法和/或体内耐受性试验可进一步包括将所选分子给予需要治疗的受试者。
因此，对于疑似患有疾病或病症的动物或人的治疗可通过给予本公开内容的分子治疗。进一步提供通过给予治疗或预防有效量的本公开内容的一种或多种分子治疗疑似患有或易患疾病或病况的哺乳动物(例如治疗人)的方法。在一些实施方案中，本公开内容提供治疗哺乳动物(例如人)的方法，所述方法包括(1)如本文其它部分所述选择具有可耐受的体内急性神经毒性的分子(例如钙波动测定法、序列评分计算和/或体内耐受性研究)，和(2)将所述分子给予哺乳动物。通常以有效量给予本发明的所述分子、缀合物或药物组合物。在一些实施方案中，将本发明的分子或缀合物用于疗法中。
本公开内容还提供将分子给予受试者用于治疗神经疾病或病况的方法。在某些实施方案中，神经病症为神经变性病症、癫痫病症、特发性成人癫痫病症或其任何组合。在其它实施方案中，疾病或病况是神经变性病症伴τ蛋白病(tauopathy) (即涉及脑中τ蛋白蓄积的神经变性疾病)、癫痫病症伴τ蛋白病(涉及脑中τ蛋白蓄积的癫痫病症)、无τ蛋白病的癫痫病症(不涉及脑中τ蛋白蓄积的癫痫病症)、特发性成人无τ蛋白病的癫痫病症(不涉及脑中τ蛋白蓄积的特发性成人癫痫病症)或其任何组合。在某些实施方案中，治疗或预防的疾病或病况是神经变性疾病伴τ蛋白病。
在某些实施方案中，疾病或病况是进行性核上性麻痹、唐氏综合征、拳击运动员痴呆(慢性创伤性脑病和其它创伤性脑损伤)、连锁于染色体17的额颞痴呆合并帕金森综合征(FTDP-17)、Lytico-Bodig病(关岛型帕金森综合征-痴呆复合征)、缠结主导型痴呆、神经节神经胶质瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、铅毒性脑病、半侧巨脑症、结节性脑硬化、哈勒沃登-施帕茨病、皮克病、皮质基底神经节变性、嗜银颗粒病、皮质基底节变性、脂褐质沉积症、额颞痴呆、核上麻痹和额颞叶变性、脑网络络功能障碍疾病(例如所有形式的癫痫和抑郁)、dravet综合征、脊髓病症、外周神经病、颅神经病症(例如三叉神经痛)、自主神经系统病症(例如家族性自主神经机能异常或多系统萎缩)、中枢和外周神经系统运动障碍(例如帕金森病、特发性震颤、肌萎缩性侧索硬化、图雷特综合征、多发性硬化或不同类型的外周神经病)、睡眠障碍(例如发作性睡病)、偏头痛或其它类型的头痛(例如丛集性头痛和紧张型头痛)、下背部和颈部疼痛、中枢神经病、神经精神疾病、注意力缺陷障碍伴多动症、孤独症、亨廷顿舞蹈病、雷特综合征、安格曼综合征、器质性精神病、脑或骨髓感染(包括脑膜炎)或朊病毒病)、贫血、癌症、白血病、炎症性病况或自身免疫性疾病(例如关节炎、银屑病、红斑狼疮、多发性硬化)、细菌感染及其任何组合。
在某些实施方案中，疾病或病况是神经变性疾病伴τ蛋白病，例如进行性核上性麻痹、额颞痴呆-τ (FTD-τ)、连锁于染色体17的额颞痴呆和帕金森综合征(FTDP-17)、皮质基底节变性(CBD)、创伤性脑损伤、慢性创伤性脑病、HIV相关神经认知障碍、嗜银颗粒病、唐氏综合征-阿尔茨海默氏痴呆、遗忘性轻度认知障碍-阿尔茨海默氏痴呆、帕金森病痴呆、哈勒沃登-施帕茨病(泛酸激酶相关神经变性)、C型尼曼-皮克病、强直性肌营养不良、肌萎缩性侧索硬化、帕金森病或亨廷顿舞蹈病。在某些实施方案中，疾病或病况是癫痫病症伴τ蛋白病，例如半侧巨脑症、结节性脑硬化复征、2b型局灶性皮质发育不良或神经节细胞肿瘤。在某些实施方案中，疾病或病况是无τ蛋白病的癫痫病症，例如Dravet综合征(婴儿期重度阵挛性癫痫)、颞叶癫痫、Ohtahara综合征(早期婴儿型癫痫性脑病合并压抑爆发)、Lafora体病、广泛性癫痫伴热性癫痫发作、婴儿痉挛(韦斯特综合征)、Lennox Gastaut综合征、安格曼综合征、雷特综合征、Landau Kleffner综合征。在某些实施方案中，疾病或病况是特发性成人无τ蛋白病的癫痫病症，例如局灶性颠痫、单纯局灶性颠痫(不丧失意识)、局灶性认知障碍颠痫(意识障碍)、发展成全身性强直阵挛性(GTC)惊厥的局灶性颠痫、全身性癫痫发作(惊厥或非惊厥、带有涉及皮层下结构的两侧放电)、失神发作、肌阵挛发作、阵挛发作、强直发作、强直-阵挛发作或强直发作。在某些实施方案中，疾病或病况是孤独症、孤独症谱系障碍(例如Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders V (DSM-V)的定义)、阿斯珀格病症或广泛性发育障碍。
本发明进一步提供用于治疗与神经元细胞有关的一种或多种疾病或本文提及的例如选自以下的疾病的本发明的分子：阿尔茨海默氏痴呆、进行性核上性麻痹、唐氏综合征、拳击运动员痴呆(慢性创伤性脑病和其它创伤性脑损伤)、连锁于染色体17的额颞痴呆合并帕金森综合征(FTDP-17)、Lytico-Bodig病(关岛型帕金森综合征-痴呆复合征)、缠结主导型痴呆、神经节神经胶质瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、铅毒性脑病、半侧巨脑症、结节性脑硬化、哈勒沃登-施帕茨病、皮克病、皮质基底神经节变性、嗜银颗粒病、皮质基底节变性、脂褐质沉积症、额颞痴呆、核上麻痹和额颞叶变性(综述见Frost等, Trends Cell Biol (2015) 25: 216-53；Dyment等, Neurobiol. Aging (2014)Sept 6: S0197-4580；Moussaud等, Mol. Neurodeg (2014) 29:43 Ross等, South Med.J. (2014) 107: 715-21)、亨廷顿舞蹈病、雷特综合征和安格曼综合征。另外，本发明提供用于治疗包括所有形式的癫痫和抑郁的在内的脑网络功能障碍的疾病的治疗性分子(Inoue等, Epilepsy (2012) 102: 8-12；Xi等, Med Hypotheses (2011) 76: 897-900；Hou等, Can. J. Psychiatry (2004) 3: 164-71)。
本公开内容还提供本文本发明的分子或缀合物用于制备治疗本文提及的疾病或病症的药物的用途，或用于治疗本文提及的病症的方法。还提供用于治疗本文提及的疾病或病症的组合物。
III.分子(例如治疗性分子)
待按照本发明筛选或选择的分子包括治疗性分子。在一个实施方案中，治疗性所述分子包括蛋白质、肽、多核苷酸(例如寡聚体)、糖、脂质、脂质体和粒子、生物材料、药物、维生素、核酸、氨基酸、多肽、酶辅因子、类固醇、碳水化合物、肝素、含金属作用剂、受体拮抗剂、受体激动剂、受体或受体的一部分、胞外基质蛋白、细胞表面分子、抗原、半抗原、小分子或其任何组合。
在某些实施方案中，治疗性分子是蛋白质，包括细胞因子、酶、生长因子、单克隆抗体、抗体片段、单链抗体、白蛋白、免疫球蛋白、凝血因子、促生长素、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、纤维素、尿激酶、半乳糖苷酶、葡萄球菌激酶、透明质酸酶、组织纤溶酶原激活物或其任何组合。
在一个实施方案中，本发明的分子包含是抗原结合部位(例如抗体、抗体变体或抗体片段的抗原结合部位)、配体的受体结合部分或配体的结合受体部分的治疗性分子的至少1种。
在另一个实施方案中，本发明的分子靶向体内一种或多种内源产生的蛋白质或肽、编码蛋白质或肽的一种或多种mRNA或pre-mRNA或者编码蛋白质或肽的一种或多种基因。在一些实施方案中，所述分子包括多核苷酸(例如寡聚体)、核苷酸或小分子。
分子还可包括任何治疗小分子或药物作为可用于本文公开的方法的治疗性分子。小分子可包括不是肽、多肽、蛋白质和多核苷酸的任何治疗性分子。小分子可包括单个核苷酸或核苷，例如RNA或DNA。
在一个实施方案中，治疗性分子调节细胞活化或抑制(例如通过与细胞表面受体结合，且导致激活或抑制信号的传递)。在一个实施方案中，治疗性分子能够启动信号的转导，这导致细胞的死亡(例如通过细胞信号诱导的途径、补体结合或暴露于结合分子中存在的有效负荷(例如毒性有效负荷))，或这调理受试者的疾病或病症(例如通过介导或促进细胞杀伤，或通过调节生物可利用的物质的量(例如通过提高或降低受试者中的配体例如TNFα的量))。在另一个实施方案中，本发明的分子具有对抗原有特异性的至少1个结合部位，目标在于降低或清除例如细胞表面抗原或可溶性抗原。
在另一个实施方案中，本发明的治疗性分子与靶分子(例如抗原)的结合导致靶分子或表达靶分子的细胞减少或例如从组织或循环中消除。在另一个实施方案中，治疗性分子具有对可用于检测靶分子的存在(例如检测污染物或诊断病况或病症)的靶分子有特异性的至少1个结合部位。下面进一步论述示例性的治疗性分子。
III.A. 抗原结合部分
在某些实施方案中，可用于本公开内容的分子包含是结合部位(例如抗体的抗原结合部分)的至少1种治疗性分子。在一个实施方案中，本文公开的方法的分子是多肽。
在其它实施方案中，本发明分子的结合部位包括抗体的抗原结合部分。术语“抗原结合部分”是指免疫球蛋白、抗体或结合抗原或与完整抗体(即与它们来源于其中的完整抗体)竞争抗原结合(即特异性结合)的抗体变体的多肽片段。例如，抗原结合部分可来源于本领域已知的抗体或抗体变体的任一种。抗原结合部分可通过本领域众所周知的重组或生物化学方法产生。示例性抗原结合片段包括VH和VL区、Fv、Fab、Fab’和(Fab’)2。
在其它实施方案中，本发明的治疗性分子包含来自单链结合分子的结合部位(例如单链可变区或scFv)。可改编所述用于产生单链抗体的技术(美国专利号4,694,778；Bird, Science 242:423-442 (1988)；Huston等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)；以及Ward等, Nature 334:544-554 (1989))以产生单链分子。单链抗体通过氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段形成，导致单链抗体。还可采用在大肠杆菌中组装功能性Fv片段的技术(Skerra等，Science 242:1038-1041 (1988))。
可用于本公开内容的多肽可包括采用本领域公认的方案自抗体的可变区或其部分(例如VL和/或VH结构域)得到或可采用标准分子生物学技术自本领域公认的抗体获得。
在一个实施方案中，可用于本发明的分子与可用于治疗癌症的分子结合。
在其它另外的实施方案中，可用于本发明的分子与可用于与治疗自身免疫性或炎性疾病或病症的分子结合。
例如，分子(例如多肽)可与存在于免疫细胞(例如B或T细胞)的抗原或造成自身免疫性疾病或病症的自身抗原结合。可通过本发明的方法和组合物诊断、预防或治疗的自身免疫性疾病的实例包括但不限于克罗恩病(Crohn’s disease)；炎性肠病(IBD)；系统性红斑狼疮；溃疡性结肠炎；类风湿性关节炎；古德帕斯彻综合征(Goodpasture's syndrome)；格雷夫斯病(Grave's disease)；桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)；寻常性天疱疮；重症肌无力；硬皮病；自身免疫性溶血性贫血；自身免疫性血小板减少性紫癜；多肌炎和皮肌炎；恶性贫血；斯耶格伦综合征(Sjögren's syndrome)；关节强硬性脊椎炎；血管炎；I型糖尿病；因自身免疫性疾病所引起的神经障碍、多发性硬化和继发性疾病。
在其它实施方案中，本发明的治疗性分子结合与炎性疾病或病症有关的靶分子。本文所用术语“炎性疾病或病症”包括至少部分由炎症引起或被炎症加重的疾病或病症，例如血流增加、水肿、免疫细胞活化(例如增殖、细胞因子产生或吞噬作用提高)。例如，本发明的分子可以异常的量(例如以可能是有利改变例如有益于受试者的量)与包括或存在于某一区域的炎性因子(例如基质金属蛋白酶(MMP)、TNFα、白介素、血浆蛋白质、细胞因子、脂质代谢物、蛋白酶、毒性基团、线粒体蛋白质、凋亡蛋白质、粘附分子等)结合。炎症过程是活组织对损害的响应。炎症的起因可归因于身体损害、化学物质、微生物、组织坏死、癌症或其它成分。急性炎症是短暂的，例如仅持续几天。然而，如果是长期的，则可指慢性炎症。
炎性病症包括急性炎性病症、慢性炎性病症和复发性炎性病症。急性炎性病症通常具有相对短的时间，持续约几分钟至约1-2天，尽管它们可持续几周。急性炎性病症的主要特征包括血流增加、体液和血浆蛋白质渗出(水肿)和白细胞(例如嗜中性粒细胞)迁移。慢性炎性病症一般具有较长的持续时间，例如几周到几月到几年或甚至更长，并且在组织学上与淋巴细胞和巨噬细胞并与血管和结缔组织的增殖有关。复发性炎性病症包括在一段时间后复发或有周期性发作的病症。复发性炎性病症的实例包括哮喘和多发性硬化。一些病症可列入一个或多个类别中。炎性病症的特征一般是发热、发红、肿胀、疼痛和丧失功能。炎性病症病因的实例包括但不限于微生物感染(例如细菌、病毒和真菌感染)、身体因素(例如烧伤、幅射和创伤)、化学作用剂(例如毒素和腐蚀物质)、组织坏死和不同类型的免疫反应。炎性病症的实例包括但不限于骨关节炎、类风湿性关节炎、急性和慢性感染(细菌、病毒和真菌)；急性和慢性支气管炎、鼻窦炎及其它呼吸道感染，包括感冒；急性和慢性胃肠炎和结肠炎；急性和慢性膀胱炎和尿道炎；急性呼吸窘迫综合征；囊性纤维化；急性和慢性皮炎；急性和慢性结膜炎；急性和慢性浆膜炎(心包炎、腹膜炎、滑膜炎、胸膜炎和腱炎)；尿毒症心包炎；急性和慢性胆囊炎；急性和慢性阴道炎；急性和慢性葡萄膜炎；药物反应；和烧伤(热、化学和电)。
在另外其它的实施方案中，本发明的治疗性分子与可用于治疗神经疾病或病症的分子结合。例如，多肽可与存在于神经细胞(例如神经元或神经胶质细胞)上的抗原结合。在某些实施方案中，与神经病症有关的抗原可以是上述自身免疫性或炎性病症。本文所用术语“神经疾病或病症”包括其中神经系统退化(例如神经变性病症)的病症或病况以及其中神经系统无法正常发育或在损伤(例如骨髓损伤)后无法再生的受试者的病症。可通过本发明的方法和组合物诊断、预防或治疗的神经障碍的实例包括但不限于多发性硬化、亨廷顿舞蹈病、雷特综合征、安格曼综合征、阿尔茨海默氏痴呆、帕金森病、进行性核上性麻痹、癫痫、dravet综合征、神经性疼痛、创伤性脑损伤、Guillain-Barré综合征和慢性炎性脱髓鞘性多神经病(CIDP)。
在其它方面，本发明的治疗性分子包括来源于抗体的修饰形式的抗原结合部位或其部分。示例性的这类形式包括例如微型抗体(minibody)、双抗体(diabody)、三抗体、纳米体(nanobody)、camelids、Dab、四价抗体、intradiabodies (例如Jendreyko等, 2003. J.Biol. Chem. 278:47813)、融合蛋白(例如抗体细胞因子融合蛋白、与Fc受体的至少一部分融合的蛋白)和双特异性抗体。
III.B. 非免疫球蛋白结合分子
在某些实施方案中，本发明的治疗性分子包括来源于非免疫球蛋白结合分子的一个或多个结合部位。本文所用术语“非免疫球蛋白结合分子”是其结合部位包含来源于免疫球蛋白以外的多肽，但可工程改造(例如诱变)以赋予所需结合特异性的部分(例如支架或构架)的结合分子。
非来源于抗体分子的治疗性分子的其它实例包括下文更详细论述的受体结合部位和配体结合部位。
非免疫球蛋白治疗部分可包括来源于不是免疫球蛋白的免疫球蛋白超家族成员的结合部位部分(例如T-细胞受体或细胞粘附蛋白(例如CTLA-4、N-CAM、端蛋白))。这类结合分子包括保留免疫球蛋白折叠的构象并且能够特异性结合IGF1-R表位的结合部位部分。在其它实施方案中，结合本发明分子的非免疫球蛋白还包括具有不以免疫球蛋白折叠为基础(例如例如锚蛋白重复蛋白或纤连蛋白)但尽管如此能够与靶标(例如IGF-1R表位)特异性结合的蛋白质拓扑结构的结合部位。
在一个实施方案中，治疗部分来源于纤连蛋白结合分子。纤连蛋白结合分子(例如包含纤连蛋白I、II或III型结构域的分子)显示CDR样环，其与免疫球蛋白相反，不依赖于链内二硫键。在一个示例性实施方案中，纤连蛋白多肽为AdNectin®(AdnexusTherpaeutics，Waltham，MA)。
在另一个实施方案中，本发明的治疗性分子包含来自Affibody® (Abcam，Cambridge，MA)的结合部位。在另一个实施方案中，本发明的治疗性分子包含来自Anticalin® (Pieris AG，Friesing，Germany)的结合部位。在另一个实施方案中，本发明的治疗性分子包含来自富含半胱氨酸的多肽的结合部位。在其它实施方案中，本发明的治疗性分子包含来自重复蛋白的结合部位。可用于本发明的分子的其它非免疫球蛋白结合部包括来源于Src同源性结构域(例如SH2或SH3结构域)、PDZ结构域、β-内酰胺酶、高亲和力蛋白酶抑制剂或小的二硫键结合蛋白支架(例如蝎毒素)的结合部位。
III.C.受体或配体的结合部分
在其它方面，本发明的分子包含受体的配体结合部位和/或配体的受体结合部分。下面列出可存在于本发明分子中的受体或配体的示例性结合部分：
III.C.1. 细胞因子和细胞因子受体
细胞因子对淋巴细胞的增殖、分化和功能活化具有多效作用。不同的细胞因子或其受体结合部分可用于本发明的融合蛋白作为治疗性分子、结合部位和/或结构域。示例性细胞因子包括白介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13和IL-18)、集落刺激因子(CSF) (例如粒细胞CSF (G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF (GM-CSF)和单核细胞巨噬细胞CSF (M-CSF))、肿瘤坏死因子(TNF)α和β、细胞毒性T淋巴细胞抗原4 (CTLA-4)和干扰素例如干扰素-α、β或γ (美国专利号4,925,793和4,929,554)。
细胞因子受体通常由配体特异性α链和通用β链组成。示例性细胞因子受体包括GM-CSF、IL-3 (美国专利号5,639,605)、IL-4 (美国专利号5,599,905)、IL-5 (美国专利号5,453,491)、IL10受体、IFNγ (EP0240975)和受体TNF家族(例如TNFα (例如TNFR-1 (EP417,563)、TNFR-2 (EP 417,014)、淋巴毒素β受体)的那些。
III.C.2. 粘附蛋白
粘附分子是允许细胞彼此相互作用的膜结合蛋白。不同的粘附蛋白，包括白细胞归巢受体和细胞粘附分子或其受体结合部分，可掺入本发明的融合蛋白中作为治疗性分子、结合部位和/或结构域。白细胞归巢受体在炎症期间在白细胞细胞表面上表达，包括介导与胞外基质组分结合的β-1整联蛋白(例如VLA-1、2、3、4、5和6)和结合血管内皮上的细胞粘附分子(CAM)的β2-整联蛋白(例如LFA-1、LPAM-1、CR3和CR4)。示例性CAM包括ICAM-1、ICAM-2、VCAM-1和MAdCAM-1。其它CAM包括选择蛋白家族包括E-选择蛋白、L-选择蛋白和P-选择蛋白的CAM。
III.C.3. 趋化因子
趋化因子，刺激白细胞向感染部位迁移的趋化性蛋白，也可掺入本发明的融合蛋白中。示例性趋化因子包括巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α和MIP-1-β)、嗜中性粒细胞趋化因子和RANTES (调节激活正常T-细胞分泌和表达)。
III.C.4. 激素
本发明的融合蛋白中用作治疗部分的示例性生长激素包括肾素、人生长激素(HGH；美国专利号5,834,598)、N-甲硫氨酰人生长激素；牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺素(PTH)；促甲状腺激素(TSH)；甲状腺素；胰岛素原和胰岛素(美国专利号5,157,021和6,576,608)；促卵泡激素(FSH)；降钙素，促黄体激素(LH)，瘦蛋白，胰高血糖素；铃蟾肽；促生长素；mullerian抑制性物质；松弛素和松弛素原；促性腺激素相关肽；催乳素；胎盘催乳激素；OB蛋白或mullerian抑制性物质。
III.C.5. 受体和配体
在一个实施方案中，本发明的多肽将使配体或受体的结合部位(例如的胞外域(ECD)与至少1个遗传融合的Fc区(即scFc区)结合。在某些实施方案中，配体结合受体的一部分来源于选自以下的受体：免疫球蛋白(Ig)超家族(例如可溶性T-细胞受体，例如mTCR®(Medigene AG，Munich，Germany)的受体、上述TNF受体超家族的受体(例如免疫黏附素的可溶性TNFα受体)、神经胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)受体家族(例如GFRα3)的受体、G蛋白偶联受体(GPCR)超家族的受体、酪氨酸激酶(TK)受体超家族的受体、配体门控(LG)超家族的受体、趋化因子受体超家族、IL-1/Toll样受体(TLR)超家族和细胞因子受体超家族的受体。
在其它实施方案中，配体的受体结合部分的结合部位或结构域来源于由上文所述抗体或抗体变体结合的配体。例如，配体可结合选自以下的受体：免疫球蛋白(Ig)超家族的受体、TNF受体超家族的受体、G蛋白偶联的受体(GPCR)超家族的受体、酪氨酸激酶(TK)受体超家族的受体、配体门控(LG)超家族的受体、趋化因子受体超家族、IL-1/Toll样受体(TLR)超家族和细胞因子受体超家族的受体。在一个示例性实施方案中，配体的受体结合部分的结合部位来源于属于上述TNF配体超家族的配体(例如CD40L)。
生长因子或其受体(或其受体结合或配体结合部分)可掺入本发明的融合蛋白中。示例性生长因子包括血管内皮生长因子(VEGF)及其同种型(美国专利号5,194,596)；成纤维细胞生长因子(FGF)，包括aFGF和bFGF；心房钠尿因子(ANF)；肝生长因子(HGF；美国专利号5,227,158和6,099,841)、神经营养因子例如骨衍生神经营养因子(BDNF)、神经胶质细胞1衍生神经营养因子配体(例如GDNF、神养蛋白、artemin和外周营养因子)、神经营养蛋白-3、-4、-5或-6 (NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神经生长因子，例如NGF-β血小板衍生生长因子(PDGF) (美国专利号4,889,919、4,845,075、5,910,574和5,877,016)；转化生长因子(TGF)例如TGF-α和TGF-β (WO 90/14359)；骨诱导因子，包括骨形态发生蛋白(BMP)；胰岛素样生长因子-I和-II (IGF-I和IGF-II；美国专利号6,403,764和6,506,874)；红细胞生成素(EPO)；血小板生成素(TPO；干细胞因子(SCF)；血小板生成素(TPO、c-Mpl配体)和Wnt多肽(美国专利号6,159,462)。
可用作本发明的治疗部分的示例性生长因子受体包括EGF受体；VEGF受体(例如Flt1或Flk1/KDR)；PDGF受体(WO 90/14425)；HGF受体(美国专利号5,648,273和5,686,292)和神经营养受体，包括结合NGF、BDNF和NT-3的低亲和力受体(LNGFR)，亦称为p75NTR或p75，以及是受体酪氨酸激酶trk家族的成员(例如trkA、trkB (EP 455,460)、trkC (EP 522,530))的高亲和力受体。
III.C.6. 异二聚体受体
在一个实施方案中，利用β特异性决定性组分当与细胞因子组合时与第一β信号转导组分结合形成无功能中间体，中间体然后第二β信号转导组分结合引起β-受体二聚化和随后的信号转导的细胞因子的拮抗剂可采用本发明的方法制备。本领域描述了这类分子(参见例如美国专利6,927,044)。在一个实例中，将受体的可溶性特异性决定组分和细胞因子受体的第一β信号转导组分的胞外域结合形成异二聚体，其结合细胞因子形成无功能的复合体。可使用异二聚体受体抑制的示例性细胞因子包括：IL1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-3、IL-4、IL-5、IL-11、IL-15、GMCSF、LIF、INFα和TGFβ。
III.D. 包含多核苷酸的分子
本公开内容的分子还可包含多核苷酸(例如寡聚体)。在一些实施方案中，该核苷酸序列编码上文第III.A、III.B和III.C.1-III.C.5节中公开的任何多肽。在某些实施方案中，该核苷酸序列与编码上文第III.A.、III.B.和III.C.1-III.C.5节中公开的一种或多种多肽的核酸序列(DNA或RNA，例如pre-mRNA或mRNA)结合或杂交。本文术语“核苷酸序列”意指其中超过2个核苷酸彼此连接作为一个序列的分子。在一个实施方案中，本公开内容的核苷酸序列是DNA。在另一个实施方案中，本公开内容的核苷酸序列是RNA。在其它实施方案中，本公开内容的核苷酸序列是DNA和RNA的组合。在其它另外的实施方案中，本公开内容的核苷酸序列包括一个或多个化学修饰的核苷酸。在另外其它的实施方案中，核苷酸序列包括至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸或至少11个核苷酸的长度。在其它实施方案中，核苷酸序列包括至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少30个核苷酸、至少35个核苷酸、至少40个核苷酸、至少45个核苷酸、至少50个核苷酸、至少55个核苷酸、至少60个核苷酸、至少65个核苷酸、至少70个核苷酸、至少80个核苷酸、至少90个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、至少900个核苷酸、至少1000个核苷酸、至少2000个核苷酸、至少3000个核苷酸或至少4000个核苷酸。在这一方面，本发明的核苷酸序列可通过降低通常在哺乳动物细胞(例如人细胞，例如神经元细胞)中的mRNA水平以发挥对蛋白质的间接抑制作用。可采用本发明的方法分析任何类型的核苷酸序列。在某些实施方案中，针对本文其它部分论述的所选特征，对靶向主要在神经元细胞中作为蛋白质分泌的pre-mRNA或mRNA的核苷酸序列进行分析。可被通过本发明的方法选出的核苷酸序列靶定的基因的实例包括但不限于微管相关蛋白τ (由MAPT基因编码)、脑酸溶性蛋白1 (由BASP1基因编码)或淀粉状蛋白前体蛋白(由APP基因编码)。在一些实施方案中，用于本发明方法的核苷酸序列是寡聚体。
III.D.1.寡聚体(反义寡核苷酸)
在某些实施方案中，可用于本发明的治疗性分子是寡聚体。寡聚体具有长为10 –50，例如10 – 30个核苷酸的核苷酸序列，其包含共计10 – 30个核苷酸的连续核苷酸序列。
在某些实施方案中，寡聚体靶向微管相关蛋白τ (MAPT)。在与疾病有关的病理状态下，MAPT亦称为神经原纤维缠结蛋白或配对螺旋样纤维-τ (PHF-τ)。可在可公开获取的登记号NC_000017.11下查到MAPT基因的序列，且可在可公开获取的登记号NG_007398下查到MAPT pre-mRNA转录物的序列。可在可公开获取的登记号：P10636、P18518、Q14799、Q15549、Q15550、Q15551、Q1RMF6、Q53YB1、Q5CZI7、Q5XWF0、Q6QT54、Q9UDJ3、Q9UMH0、Q9UQ96下查到τ蛋白的序列，其每一个通过引用以其整体结合到本文中。MAPT基因产物的天然变体是已知的。例如，τ蛋白的天然变体可含有选自以下的一个或多个氨基酸取代：R5H、R5L、D285N、V289A、K574T、L583V、G589V、N596K、N613H、P618L、P618S、G620V、S622N、K634M、S637F、V654M、E659V、K686I、G706R、R723W或其任何组合。因此，可设计本发明的寡聚体以降低或抑制τ蛋白天然变体的表达。τ蛋白序列以SEQ ID NO: 1提供，核苷酸序列以SEQ IDNO: 2提供。
在某些实施方案中，寡聚体靶向编码脑酸溶性蛋白1 (BASP1)的pre-mRNA或mRNA。BASP1亦称为22 kDa富含神经元组织的酸性蛋白、神经元轴突膜蛋白NAP-22、NAP22、CAP-23、NAP-22、CAP23或富含神经元组织的酸性蛋白。BASP1基因编码具有若干瞬时磷酸化位点和PEST基序的膜结合蛋白。不同物种间具有PEST序列的蛋白质的保守性支持其功能重要性。PEST序列通常存在于具有高周围率的蛋白质中。这种蛋白质的免疫性质是物种特异性的。这种蛋白质还进行N端豆蔻酰化。
寡聚体的靶核酸序列的另一个实例是BASP1 pre-mRNA或BASP1 mRNA。对应于BASP1 mRNA的BASP1 cDNA名为GenBank登记号NM_006317.4。
在某些实施方案中，治疗性分子(例如寡聚体)靶向编码淀粉状蛋白前体蛋白的pre-mRNA。淀粉状蛋白前体蛋白(APP)是在许多组织中分泌的必要膜蛋白，并集中在神经元的突触中。其功能涉及作为突触形成、神经塑性和铁输出的调节因子。APP以其蛋白酶解产生β淀粉状蛋白(Aβ)的前体分子最为著名，β淀粉状蛋白是一种37-49氨基酸肽，其淀粉状蛋白纤维形式(fibrillar form)是存在于阿尔茨海默氏痴呆患者脑中的淀粉状蛋白斑的主要组分。
在人中，APP的基因位于染色体21上，含有18个跨越290千碱基的外显子。在人中发现APP的几个可变剪接同种型，长度范围为365-770个氨基酸，其中某些同种型在神经元中优先表达；这些同种型中神经元比率的变化与阿尔茨海默氏痴呆有关。淀粉状蛋白前体蛋白的关键区域(包括产生淀粉状蛋白β (Aβ)的区域)中的突变引起阿尔茨海默氏痴呆的家族易感性。例如，发现与家族性阿尔茨海默氏痴呆有关的Aβ区以外的几个突变显著增加Aβ的产生。
寡聚体靶核酸序列的又一个实例是APP pre-mRNA或APP mRNA。对应于APP mRNA的APP cDNA名为GenBank登记号Y00264。
在一些实施方案中，利用本发明方法选择包含与MAPT转录物(例如SEQ ID NO: 2(如果“t”用“u”置换，则SEQ ID NO: 2可以是mRNA)、BASP1转录物或APP转录物的区域杂交的核苷酸序列(例如寡聚体)的任何治疗性分子。
在一个实施方案中，制备包含靶向编码MAPT、BASP1或APP的pre-mRNA或mRNA的某些区域的核苷酸序列(例如寡聚体)的任意治疗性分子以测试其毒性。然后可对包含核苷酸序列的治疗性分子进行本文其它部分描述的本发明的方法。在某些实施方案中，寡聚体(即反义寡核苷酸)的实例包括但不限于列于图4和5的寡聚体。
寡聚体可包括任何寡聚体设计，例如核苷糖修饰的形式。在一个实施方案中，寡聚体包括至少1个修饰的核苷，例如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个修饰的核苷。
在一个实施方案中，本发明的寡聚体包含修饰，其独立选自这3种修饰的类型(修饰的糖、修饰的碱基和修饰的核苷间键)或其组合。
在又一个实施方案中，寡核苷酸包含至少1个修饰的核苷间键。在其它实施方案中，连续核苷酸序列内的核苷间键是硫代磷酸酯或硼代磷酸酯核苷间键。
在一些实施方案中，本发明的寡聚体包含至少1个LNA单元或至少1个2’取代的修饰核苷。
本发明的寡聚体可包含含有核苷酸和核苷酸类似物两者的核苷酸序列，并且可为gapmer、blockmer、mixmer、headmer、tailmer或totalmer的形式。可与本发明寡聚体一起使用的gapmer、blockmer、mixmer、headmer、tailmer或totalmer的构型的实例描述于美国专利申请公布号2012/0322851。
本发明的寡聚体的核苷酸或其连续核苷酸序列可通过连接基偶联。各个核苷酸适宜通过连接基与3'相邻核苷酸连接。合适的核苷酸间键包括列于WO2007/031091的那些，例如WO2007/031091第34页第一段的核苷酸间键。
2011年6月2日公开的美国公布号2011/0130441提及具有通过中性核苷间键与3'或5'端连接的至少1个二环核苷的寡聚化合物。本发明的寡聚体因此可具有通过中性核苷间键与3'或5'端连接的至少1个二环核苷，例如一个或多个磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI、酰胺-3、甲缩醛(formacetal)或硫代甲缩醛。其余的键可以是硫代磷酸酯。
在本文中，术语“缀合物”旨在表明通过本文所述寡聚体与一个或多个非核苷酸或非多核苷酸部分共价或非共价连接(“缀合”)形成的异源分子。非核苷酸或非多核苷酸部分的实例包括大分子物质，例如蛋白质、脂肪酸链、糖残基、糖蛋白、聚合物或其组合。通常蛋白质可以是针对靶蛋白的抗体。在一些实施方案中，典型的聚合物是聚乙二醇。
因此，在不同的实施方案中，本发明的寡聚体包括通常由核苷酸的连续序列组成的多核苷酸区和另外的非核苷酸区两者。在提及包含连续核苷酸序列的本发明的寡聚体时，化合物可包含非核苷酸组分，例如缀合物组分。
本发明还提供包含本文所述的本发明的寡聚体的缀合物和与所述寡聚体共价连接的至少1个非核苷酸或非多核苷酸部分。因此，在其中本发明的寡聚体包含本文公开的指定核酸或核苷酸序列的不同实施方案中，化合物还可包含与所述寡聚体共价连接的至少1个非核苷酸或非多核苷酸部分(例如不包含一个或多个核苷酸或核苷酸类似物)。
缀合(与缀合物部分)可提高本发明的寡聚体的活性、细胞分布或细胞摄取。所述部分包括但不限于抗体、多肽、脂质部分例如胆固醇部分、胆酸、硫醚。
本发明的寡聚体还可与活性药物物质缀合，例如阿司匹林、布洛芬、磺胺药物、抗糖尿病药、抗菌药或抗生素。
在某些实施方案中，缀合的部分是甾醇，例如胆固醇。
IV.药物组合物和给药途径
本发明的治疗性分子可用于药物制剂和组合物。所述组合物适宜包含药学上可接受的稀释剂、载体、盐或辅助剂。
本发明的治疗性分子可包括在单位制剂例如在药学上可接受的载体或稀释剂中、量足以向患者递送治疗有效量而不在接受治疗的患者中引起严重副作用。然而，在某些治疗形式中，就治疗处理的积极结果而言，严重的副作用可为可接受的。
配制的药物可包含药学上可接受的粘合剂和辅助剂。胶囊剂、片剂或丸剂可含有例如下列化合物：微晶纤维素、树胶或明胶作为粘合剂；淀粉或乳糖作为赋形剂；硬脂酸盐作为润滑剂；不同的甜味剂或矫味剂。对于胶囊剂，剂量单位可含有液体载体像脂肪油。同样地，糖包衣材料或肠溶剂可以是剂量单位的一部分。治疗性分子制剂还可以是活性药物成分和形成胶束乳状液的脂质的乳剂。
根据是需要局部还是全身治疗且根据待治疗的部位，可以多种方式给予本发明的药物组合物。给药可以是(a)口服，(b)经肺，例如通过散剂或气雾剂的吸入法或吹入法，包括通过雾化器；气管内、鼻内，(c)局部包括表皮、经皮、经眼和至粘膜，包括阴道和直肠递送；或(d)胃肠外，包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或颅内，例如脑室内鞘内或心室内给药。在一个实施方案中，治疗性分子经IV、IP、口服、局部或作为推注给予或直接给予靶器官。在另一个实施方案中，治疗性分子作为推注经鞘内或脑室内给予。
用于局部给药的药物组合物和制剂可包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、喷雾剂、栓剂、液体剂和散剂。常规药用载体、水溶液、粉末或油性基料、增稠剂等可能是必需的或合乎需要的。局部制剂的实例包括其中本发明的寡聚体与例如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂等局部递送物质混合的那些。对于口服给药的组合物和制剂包括但不限于散剂或颗粒剂、微颗粒剂、纳米粒剂、水或非水性介质中的混悬剂或溶液剂、胶囊剂、软胶囊剂、小药囊剂、片剂或小片。用于胃肠外、鞘内、脑室内或心室内给药的组合物和制剂可包括还可含有缓冲液、稀释剂和其它合适的添加剂的无菌水性溶液剂，例如但不限于渗透促进剂、载体化合物和其它药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的药物组合物包括但不限于溶液剂、乳剂和含脂质体的制剂。这些组合物可由不同的组分产生，所述组分包括但不限于预制的液体、自乳化固体和自乳化半固体。药物向靶组织的递送可通过载体介导的递送来提高，包括但不限于阳离子脂质体、环糊精、卟啉衍生物、支链树枝状聚体(dendrimer)、聚乙烯亚胺聚合物、纳米微粒和微球(Dass CR. JPharm Pharmacol 2002；54(l):3-27)。
可方便地以单位剂型提供的本发明的药物制剂可按照制药业众所周知的常规技术制备。所述技术包括将活性成分与药用载体或赋形剂混合的步骤。一般而言，制剂如下制备：通过将活性成分与液体载体或细碎的固体载体或两者充分均匀地混合，然后如有需要定形成产品。
对于胃肠外、皮下、皮内或局部给药，制剂可包括无菌稀释剂、缓冲剂、张度改性剂和抗菌药剂。治疗性分子可用防止降解或从体内立即清除的载体制备，包括具有控释性质的植入剂或微囊剂。对于静脉内给药，载体可为生理盐水或磷酸缓冲盐水。2007年3月22日公开的国际公布号WO2007/031091 (A2)，进一步提供合适的药学上可接受的稀释剂、载体和辅助剂。
除非另有说明，否则本发明的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些都在本领域技能以内。文献中全面解释了这类技术。参见例如Sambrook等编辑(1989) Molecular Cloning A LaboratoryManual (2nd ed.；Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook等编辑(1992)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY)；D. N. Glover编辑(1985) DNA Cloning, 第I和II卷；Gait编辑(1984) OligonucleotideSynthesis；Mullis等美国专利号4,683,195；Hames和Higgins编辑(1984) Nucleic AcidHybridization；Hames和Higgins编辑(1984) Transcription And Translation；Freshney(1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.)；Immobilized Cells AndEnzymes (IRL Press) (1986)；Perbal (1984) A Practical Guide To MolecularCloning；专著Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)；Miller和Calos编辑(1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring HarborLaboratory)；Wu等编辑, Methods In Enzymology, 第154和155卷；Mayer和Walker编辑(1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press,London)；Weir和Blackwell编辑(1986) Handbook Of Experimental Immunology, 第I-IV卷；Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, N.Y., (1986))；Crooks, Antisense drug Technology: Principles,strategies and applications, 2nd Ed. CRC Press (2007)以及Ausubel等(1989)Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)。
上文引述的所有参考文献以及其中提及的所有参考文献均通过引用以其整体结合到本文中。
具体实施方式
1. 一种测试或测定分子的体内急性神经毒性的方法，所述方法包括体外测量与所述分子接触的神经元细胞中的钙波动。
2. 实施方案1的方法，其中与溶媒对照细胞中的钙波动相比，与所述分子接触的神经元细胞中的钙波动为约70%或更高、约75%或更高、约80%或更高、约85%或更高、约90%或更高、约95%或更高、约96%或更高、约97%或更高、约98%或更高、约99%或更高、约100%或更高、约120%或更高、约140%或更高、约160%或更高、约180%或更高、约200%或更高、约220%或更高、约240%或更高或约250%或更高。
3. 一种选择或鉴定具有可耐受的体内急性神经毒性的分子的方法，所述方法包括体外测量与所述分子接触的神经元细胞中的钙波动，其中与所述分子接触的神经元细胞显示水平相当于或高于溶媒对照细胞的水平的钙波动。
4. 实施方案3的方法，其中与溶媒对照细胞中的钙波动相比，与所述分子接触的神经元细胞中的钙波动为约70%或更高、约75%或更高、约80%或更高、约85%或更高、约90%或更高、约95%或更高、约96%或更高、约97%或更高、约98%或更高、约99%或更高、约100%或更高、约120%或更高、约140%或更高、约160%或更高、约180%或更高、约200%或更高、约220%或更高、约240%或更高或约250%或更高。
5. 实施方案1-4中任一项的方法，其中所述分子包括小分子、多核苷酸、蛋白质、肽或其任何组合。
6. 实施方案1-5中任一项的方法，其中所述钙波动为AMPA受体依赖性钙波动。
7. 实施方案1-6中任一项的方法，其中所述钙波动在Mg2+离子存在下测量。
8. 实施方案1或3的方法，其中所述分子包括多核苷酸，所述方法还包括计算序列评分，其中所述序列评分通过下式(I)计算：
(多核苷酸中C核苷酸或其类似物的数目 - 多核苷酸中G核苷酸或其类似物的数 目)/多核苷酸的总核苷酸长度(数目) (I)。
9. 一种测定包含多核苷酸的分子的体内急性神经毒性的方法，所述方法包括计算序列评分，其中所述序列评分通过下式(I)计算：
(多核苷酸中C核苷酸或其类似物的数目 - 多核苷酸中G核苷酸或其类似物的数 目)/多核苷酸的总核苷酸长度(数目) (I)。
10. 一种选择包含具有可耐受的体内急性神经毒性的多核苷酸的分子的方法，所述方法包括应用下式(I)计算序列评分：
(多核苷酸中C核苷酸或其类似物的数目 - 多核苷酸中G核苷酸或其类似物的数 目)/多核苷酸的总核苷酸长度(数目) (I)，
其中所述多核苷酸具有大于或等于0.2的序列评分。
11. 实施方案1-10中任一项的方法，所述方法进一步包括测量所述分子的体内耐受性。
12. 实施方案11的方法，其中所述耐受性类别选自：1)活动过度；2)活动和觉醒降低；3)运动功能障碍和/或共济失调；4)姿势和呼吸异常；5)震颤和/或惊厥，及其两种或更多种的组合。
13. 实施方案12的方法，其中所述分子显示合计介于0和8之间的体内耐受性评分。
14. 实施方案1-13中任一项的方法，所述方法进一步包括测量所述分子的行为测验评分。
15. 实施方案14的方法，其中所述行为测验是短期记忆测验、空间学习和记忆测验、步态分析测验或其任何组合。
16. 实施方案1-15中任一项的方法，所述方法进一步包括测量神经元细胞培养物中所述分子的微管蛋白强度。
17. 实施方案16的方法，其中所述分子降低神经元细胞培养物中的微管蛋白强度小于约25%、小于约20%、小于约15%、小于约10%、小于约5%或小于约1%。
18. 实施方案1-17中任一项的方法，其中当将所述分子给予实验室动物时，超过20%的动物存活。
19. 自实施方案1-18中任一项的方法选择的分子。
20. 一种治疗疾病或病况的方法，所述方法包括给予实施方案19的分子。
通过举例说明而非作为限制提供下列实施例。
实施例
实施例1：分子的构建
设计了多种分子(例如寡聚体)以靶向MAPT pre-mRNA的3' UTR。例如，构建了寡聚体以靶向SEQ ID NO: 2的核苷酸134,821-138,940和72,802-73,072。寡聚体的示例性序列描述于图4、5和6。在一些实施方案中，寡聚体被设计成gapmer或mixmer。相同方法可应用于本文公开的任何其它序列。gapmer被构建成含有LNA (大写字母)，例如位于5'端和3'端的β-脱氧LNA并含有硫代磷酸酯骨架，但是LNA可被任何其它核苷酸类似物取代，且骨架可以是其它的骨架类型(例如磷酸二酯键、磷酸三酯键、甲基膦酸酯键、氨基磷酸酯键或其组合)。
寡聚体采用本领域众所周知的方法合成。制备这类寡聚体的示例性方法描述于Barciszewski等, 第10章 – "Locked Nucleic Acid Aptamers", 载于Nucleic Acid andPeptide Aptamers: Methods and Protocols, vol. 535, Gunter Mayer (编辑)(2009)。
实施例2：反义寡核苷酸的自发钙波动测量
为了测量原代皮质神经元自发钙波动，自Sprague-Dawley大鼠胚胎(E19)制备大鼠原代皮质神经元。按25,000个细胞/孔将细胞接种在384孔聚D-赖氨酸包被的FLIPR板(Greiner Bio-One)上的25 µl/孔Neurobasal培养基中，培养基含有B27补充剂和2 mM谷氨酰胺(第1天体外，DIV1)。使细胞在37℃下在5% CO2中生长11天，并在第4天体外(“DIV04”)和第8天体外(“DIV08”)提供25 µl额外的培养基以供第11天体外(“DIV11”)使用。在实验日，将培养基从板中取出，且细胞用50 µl/孔的37℃测定缓冲液(含2 mM CaCl2和10 mMHopes pH 7.4的Hank平衡盐溶液)洗涤一次。在1mM MgCl2存在或不存在时测试波动(图1)。向细胞加载细胞永久荧光钙染料，fluo-4 AM (Life Technologies)。在含有20% plutonicF-127的DMSO中制备2.5 mm的Fluo-4 AM，然后在测定缓冲液中1:1000稀释。将细胞与20 µl的2.5 µM fluo-4 AM一起在37℃下在5% CO2中孵育1小时。在1小时后，加入20 µl的室温测定缓冲液，使细胞平衡至室温持续额外的10分钟，并置于荧光成像读板仪(FLIPR)中。在加入反义寡聚体之前，读取基线信号(胞内钙的测量) 100秒钟(1次读取/秒)。用384孔头将寡聚体加入含20 µl 75 µM测定缓冲液的FLIPR中达25 µM的终浓度。在加入寡聚体之后，再读取FLIPR信号200秒钟(1次读取/秒钟)。在添加后的第二个5分钟，进行FLIPR上的读板(300次，1秒钟点)以允许额外的数据捕获。应用Excel输出来自5分钟读数的原始数据，计算波尖幅度和频率。通过测量对照(非处理)孔的300秒钟读数内的平均FLIPR信号进行计算。对于处理孔，开发了在信号增强大于平均对照值(上文计算)的50%时针对每1秒钟读数指定评分为1的评分系统。增强小于平均对照值的50%的每1秒钟读数指定为评分为0。对于每种处理，计算总评分，并转化成对照%用于绘图目的。如果反义寡聚体产生大于未处理细胞的钙波动，则对照的百分比表示为大于100% (图4)。
如前所述在1mM MgCl2存在和不存在的两种条件下，测量寡聚体对原代神经元自发钙波动的作用(Murphy等, 1992, J. Neurosci. 12:4834-4845)。对于分离的N-甲基-D-天冬氨酸酯(NMDA)和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸(AMPA)受体介导的钙波动同样进行。图1提供的数据显示，添加AMPA受体拮抗剂6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(CNQX；3µM)降低钙波动达表示测定法中总AMPA反应的20% (图1AMPA标记线条所示)。当(NMDA)受体功能被1mM MgCl2阻断时，钙波动进一步降低达约80% (图1 NMDA标记线条所示)。
在1mM MgCl2存在或不存在时评价由NMDA或AMPA介导的自发钙波动的反义寡聚体抑制(在每种情况下表示100%对照；图2)。添加25 μM反义寡聚体(ASO)抑制AMPA受体而非NMDA受体介导的波动(图2)。ASO和表现类似的其它寡聚体，显示负面影响体内中枢神经系统(CNS)网活性和体外电生理学自发神经元活性(数据未显示)。τ反义寡核苷酸对原代神经元中自发钙波动的影响概括于图4。参见Murphy等, J. Neurosci. 12, 4834 – 4845(1992)。
针对本发明的寡聚体测量神经元细胞中的钙波动降低，并且与对照细胞(即未用寡聚体处理的神经元细胞中的钙波动)的进行了比较。τ反义寡核苷酸对原代神经元中自发钙波动影响见图4。选择神经元细胞中显示等于或大于未处理对照细胞中钙波动75%的AMPA介导的波动的寡聚体用于进一步分析。
实施例3：使用小分子的钙波动测量
小分子对钙波动的作用可采用实施例2提供的基本相同的方法测量。为了测量原代皮质神经元自发钙波动，可制备大鼠原代皮质神经元。可接种细胞，并使之生长待适当日期使用。如实施例2中所述，小分子对原代神经元自发钙波动的作用可如前所述在1mMMgCl2存在或不存在的两种条件下测量(Murphy等, 1992, J. Neurosci. 12:4834-4845)。细胞可加载细胞永久荧光钙染料。可将细胞混孵育，并使之平衡至室温以测量荧光强度。可输出原始数据，并计算波尖幅度和频率。
可评价由NMDA或AMPA介导的自发钙波动的小分子抑制。小分子的添加将抑制AMPA受体介导的波动。可预期降低钙波动至对照70%以下水平的小分子负面影响体内CNS网活性和体外电生理学自发神经元活性。
实施例4：使用治疗性蛋白质的钙波动测量
例如抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、细胞因子、细胞表面受体、激素或生长因子等治疗性蛋白质对钙波动的作用可采用实施例2中提供的基本相同的方法测量。为了测量原代皮质神经元自发钙波动，可制备大鼠原代皮质神经元。可接种细胞，并使之生长待适当日期使用。如实施例2中所述，治疗性蛋白质对原代神经元自发钙波动的作用可如前所述在1mM MgCl2存在和不存在的两种条件下测量(Murphy等, 1992, J. Neurosci. 12:4834-4845)。细胞可加载细胞永久荧光钙染料。可将细胞孵育，并使之平衡至室温以测量荧光强度。可输出原始数据，并计算波尖幅度和频率。
可评价由NMDA或AMPA介导的自发钙波动的治疗性蛋白质抑制。治疗性蛋白质的添加将抑制AMPA受体介导的波动。可预期降低钙波动至低于对照70%水平的治疗性蛋白质负面影响体内CNS网活性和体外电生理学自发神经元活性。
实施例5：序列评分计算
计算各寡聚体的序列评分以预测寡聚体的适合性。序列评分是针对所有寡聚体测定的数学计算，并基于指定寡聚体序列内G和C核苷酸或其类似物的百分比。将下式应用于所有寡聚体以计算序列评分：
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。
针对寡聚体ASO-000013 (SEQ ID NO: 686；序列评分0.25)给出实例计算：ATTtccaaattcaCTT：4-0/16= 0.25的序列评分。
计算所选寡聚体的序列评分用于进一步研究。为了测定序列评分的截止值，如实施例6所示进行体内耐受性研究。
实施例6：体内耐受性
测试寡聚体的体内耐受性以察看当寡聚体被注射动物时如何耐受。
受试者
在小鼠和大鼠中测试寡聚体的体内耐受性。用于Τ qPCR和行为研究的动物是每笼3-4只关养的成年C57Bl/6J雌性小鼠(20-30g；Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)。将动物关在保持在恒温(21 ± 2℃)和湿度(50 ± 10%)下且每天照明12小时(0600时开灯)的群体室。在某些情况下，表达来源于被τ启动子驱动的人PAC，H1单元型的τ转基因(Polydoro等, J. Neurosci. (2009) 29(34): 10741-9)，且其中天然小鼠Τ基因缺失的雄性和雌性转基因小鼠(30-40g)被用于评价药效学终点和组织药物浓度。对于鞘内输注研究，将雌性Sprague-Dawley大鼠(测试时180-225 g；Harlan)单独关养在保持在恒温(21±2℃)和湿度(50±10%)下并每天照明12小时(0600时开灯)的群体室中。所有动物在整个研究中随意进食进水。行为研究在0700和1500时之间进行。动物按照Bristol-Myers Squibb公司动物管理和使用委员会的准则和美国国立卫生研究院公布的“实验室动物管理和使用指导”养护。研究方案经由Bristol-Myers Squibb公司动物管理和使用委员会批准。
给药途径—脑室内或鞘内注射。
通过脑室内(i.c.v.)注射或鞘内注射将寡聚体给予小鼠。按照Haley和McCormick的方法，使用配备27或30号针的Hamilton微注射器进行脑室内注射。针在距针头2.5 mm处配备聚乙烯护器以限制其穿透进入脑。小鼠使用异氟烷麻醉剂(1.5-4%)麻醉。通过用一只手的拇指和食指松开颈后部的皮肤来揪住待注射、重20-30g的小鼠。施加轻柔但实在的压力，然后通过按压在结实的平坦水平表面使动物的头固定。然后将针尖插入头皮和颅骨，距前囟外侧约1 mm，距后侧1 mm。一旦把针定位，便给予5微升体积盐水溶媒中的反义寡核苷酸，并在20-30秒钟内注射到右(或左)侧脑室。将针留在原处10秒钟后取出。这个过程不需要手术或切口。使动物在加热垫上保暖直到它们从该过程中恢复。将脑组织(右前皮层区)收集在干冰或RNAlater上用于分别在给药后的多个时间点(例如给药后1周-16周)上进行药物浓度分析和Τ qPCR。
对于小鼠的鞘内(IT)注射，将动物在轻微异氟烷麻醉(1.5-5%)下养护。通过骨盆带在一只手中牢牢抓住小鼠，并且将与Hamilton注射器连接的30G 1/2英寸针插入与脊柱垂直的L5和L6背面之间的组织中。当针进入蛛网膜下隙时，观察到尾的突然横向运动。这种反射被用作针成功放置用于IT给药的指示。将5-10 µL体积的反义寡核苷酸慢慢(在约60秒钟)注射入蛛网膜下隙。
对于大鼠中的鞘内注射，采用Yaksh和Rudy, Physiol. Behav. (1976) 17(6):1031-6描述的方法，经手术植入鞘内套管。将通过头锥体保持异氟烷麻醉的大鼠装在立体定位框上。大致在连接耳的线上开始并沿中线向尾延伸约3 cm进行皮肤切口。在肌肉中线两侧侧面约3 mm切开其中与颅骨的枕冠连接的肌肉。使用牵开器或钳，近尾部剥开肌肉以暴露颅骨基部的池膜。小心从膜上摘除筋膜和组织。16-22号针的弯斜面端用来在池膜中形成1-2 mm侧切口。将由聚乙烯管制成的灭菌IT套管材(拉伸至约1.3 mm外径的PE10管材)通过切口插入，并小心地通过蛛网膜下隙近尾部推进，同时将其在拇指和食指间旋转，并且同时用另一只手轻轻拉动尾端部以对齐骨髓。如果遇到任何阻力，稍稍拉回导管，并慢慢再次推进。一旦套管被推进到所需区域，便用20 µL无菌盐水冲洗，使用19号针自切口约1 cm通过皮肤穿过颅端。将导管用钉塞住。术后，口服给予大鼠抗生素5天。在手术后至少5天，将单一反义寡核苷酸注射剂在水中稀释，并通过可编程输注泵(Knopf)以10 µl/分钟的速率以10-50 µl的体积递送。临在反义寡核苷酸递送之前给予简短的5ul盐水冲洗，并且恰在寡核苷酸递送后以10 µl/分钟的速率给予10µl盐水冲洗以覆盖套管的死体积(6-7µl)。还给予动物1-2X/周20ul的盐水冲洗直到用于实验。
急性耐受性行为评价
反义寡核苷酸ICV或IT单次注射后持续1小时，观察的动物行为副作用，并在零(无副作用)-20 (以安乐死为结局的惊厥)的标度上对副作用的严重程度评分。将耐受性标度分成5个神经行为类别：1)活动过度，2)活动和觉醒降低，3)运动功能障碍/共济失调，4)姿势和呼吸异常，和5)震颤/惊厥。各类别按0-4的标度评分，其中20为最差可能总评分。观察养育笼中动物行为的改变，然后将它们从养育笼取出用于更详尽的观察，这包括握力和翻正反射的测量。
新物体识别
短期识别记忆利用新物体识别(NOR)任务测量。NOR测试基于啮齿动物探索新物体超过熟悉物体的自发行为(Dodart等, Neuroreport (1997) 8(5): 1173-8；Ennaceur和Delacour, Behav. Brain Res. (1988) 31 (1):47-59)。在训练(T1)和测试(T2)时段之间的1小时滞留间期之后，记忆来自训练时段的物体的小鼠会显示对试验时段中的新物体的偏好。对于这些实验，对动物处理3天，并在试验时段前日使之习惯测试室(48 cm x 38 cmx 20 cm)。测试室由聚乙烯制成，内衬有乙烯板材。在试验日，将动物放入矩形试验室，使之探索2个相同的物体(7.6 cm高x 5.1 cm宽)达15分钟训练期。1小时后，把小鼠放回试验室达10分钟试验时段，这次有训练期间它们观察过的一个物体和一个新的物体。在训练和测试时段之间和受试者之间将物体用25%乙醇彻底清洗，并且在每天结束时再次用温和去垢剂清洗。当动物的鼻子指向物体时，才视为物体探索。探索应用ObjectScan跟踪软件(Cleversys，Reston，VA)记录。数据报告为花在探索物体的时间的百分比(即新的时间/新的+熟悉的时间*100)。
Morris水迷宫
根据Morris水迷宫测定法(Morris J. Neurosci. (1984) 11(1):47-60)评价空间学习和记忆。水迷宫表现为直径为120 cm的水池。使用白色的无毒壁画漆使水不透光(20℃±1)。水池被不同的迷宫外记号围绕。
在隐藏平台训练之前，通过允许所有小鼠在2次提前训练试验期间游向矩形通道下方，使它们暴露于水迷宫池。逃脱平台放置在通道中央。如果小鼠不能够在60秒钟试验期间找到并登上平台，则将它引向平台，并允许坐最多10秒钟。在提前训练后，小鼠进行隐藏平台训练，期间将10x10 cm平台沉在表面以下1.5 cm处。平台位置在整个训练中保持相同，而下降位置在4个每日试验中以及在4天的训练之间随机改变。小鼠接受每天两个时段连续4天。每个时段由两次试验组成，其中有10分钟试验间间隔。每次试验允许的最大时间为60秒钟。如果小鼠找不到或登不上平台，则由实验者将它引向平台。在各训练试验之后，允许所有小鼠坐在平台上10秒钟。
对于探测试验，除去平台，允许各小鼠游动60秒钟。探测试验的下降位置距隐藏平台训练期间所用平台位置的180°。在60秒钟后，在从水池中取回之前，将小鼠引向平台位置。对于早期记忆提取，在最后一次隐藏平台训练后2小时，探测小鼠；在最后一次隐藏平台训练后16小时，对长期记忆回忆进行了评价。在16小时探测试验后2小时，所有小鼠进行了可见平台训练，其中将局部记号(使用乐高建造的杆)放置在隐藏的平台之上。给予小鼠两次训练试验。用视频跟踪系统(CleversysInc)记录全部行为。自动记录逃脱潜伏期、游走的距离、游动路径、游动速度和平台交叉口用于后续分析。
Catwalk
Catwalk (Noldus，Netherlands)是一项自动化和计算机化步态分析技术，允许客观定量测定多个静态和动态步态参数。将小鼠放于catwalk的一端，允许自由探索3分钟或直到它们有5次遵从试验，不论哪个先发生。数据应用Catwalk软件报告并分类。分类试验的平均值用于数据分析。目标度量包括但不限于：印迹位置或后爪位置和同侧前爪之前位置之间的距离、开始和终末双足站立、爪摆动速度和爪站立或行走循环中爪与玻璃板接触的持续时间。
行为统计
所有行为测验的统计分析应用GraphPad Prism GraphPad Software, Inc., LaJolla, CA)进行。对于NOR，应用用于组内分析的配对t检验或通过用于组间分析的ANOVA接着Dunnett事后检验分析数据。对于MWM，应用反复的MWM ANOVA分析采集阶段，且应用单因素ANOVA接着Dunnett事后用于探测分析。
结果
根据上述测定法测定的寡聚体的体内急性耐受性见图5。在ICV注射100 μg寡聚体后体内累积耐受性阈值设置为4。
此外，研究了各寡聚体序列评分和寡聚体的体内急性耐受性之间的相关性。相关分析显示，体内耐受性低于4的寡聚体趋于具有等于或高于0.2的序列评分。参见图3。因此，图3表示寡聚体的序列评分可用于预测寡聚体的体内耐受性。
实施例7：τ蛋白的体外降低
针对在表达完整人MAPT基因的小鼠原代神经元中作为含有转基因的杆粒降低τ蛋白的能力，对靶向MAPT转录物的3' UTR的各寡聚体进行了测试(C57-bl6 BAC-TghTau；Polydoro等, J. Neurosci. (2009) 29 (34): 10747-9)。原代hTau小鼠胚胎前脑神经元培养物不表达内源小鼠τ，因为小鼠τ被敲除。按照生产商的方案(WorthingtonBiochemical Corporation, LK0031050)，通过木瓜蛋白酶消化产生原代神经元。简单地说，从在鼠MAPT失效背景下表达完整人微管相关蛋白Τ (MAPT)基因的hTau小鼠E18 BAC-Tg胚胎中切下前脑，并在木瓜蛋白酶/DNA酶/Earle平衡盐溶液(EBSS)溶液中在37℃下孵育30-45分钟。在研磨和细胞沉淀离心后，通过用含有蛋白酶抑制剂、牛血清白蛋白(BSA)和DNA酶的EBSS孵育结束反应。将细胞用补充2% B-27、100 μg/ml青霉素、85 μg/ml链霉素和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal (NB，Invitrogen)研磨和洗涤。将细胞以15,000个细胞/孔接种在聚D-赖氨酸包被的96孔光学成像板(BD Biosciences)的补充NB培养基中。
在获得表达人MAPT基因的原代hTau小鼠胚胎前脑神经元培养物后，将培养物用寡聚体处理以抑制τ mRNA和蛋白质表达。然后对培养物进行免疫细胞化学和成像以测量抑制。接种后的1天(DIV 1)，取出原代hTau小鼠胚胎前脑神经元培养物中一半的补充neurobasal (NB)培养基，并用含有不同浓度的LNA寡聚体的补充NB培养基更换。将原代hTau神经元培养物用LNA寡聚体培养直到接种后13天(DIV 13)。在DIV 13，将培养物用缺钙和镁的Dulbecco磷酸缓冲盐水(DPBS，Invitrogen)漂洗，并在4%低聚甲醛/4%蔗糖/DPBS中固定15分钟。将培养物漂洗，然后在加0.1% Triton X-100 (TX-100)和3% BSA的DPBS中在室温下1小时阻断并透化。将培养物漂洗，然后在DPBS加3% BSA和0.1% TX-100中的第一抗体1:500，Tau5抗体(以测量τ蛋白，Invitrogen AHB0042)和1:500，β-III微管蛋白(TuJ-1)抗体(以测量神经突区)，Abcam ab41489)在室温下孵育2小时。将培养物漂洗，并与DPBS加3% BSA和0.1% TX-100中的Hoeschst 33342核染料(1:800，Invitrogen)和AlexaFluor荧光缀合的第二抗体(Invitrogen，1:500)一起在室温下孵育1小时。将培养物充分漂洗并保存在DPBS中直到成像。成像采用CellomicsVTi自动化免疫荧光成像系统进行。简而言之，使用未处理孔，将各荧光团通道的饱和水平设为70%。然后从每孔获取12个连续图像，并应用Cellomics VTi SpotDetector (4版)图像分析软件，计算τ蛋白和TuJ-1蛋白的总荧光强度和总荧光面积。为了评价产生自寡聚体处理的τ蛋白降低，产生各孔的Tau5总荧光强度与Tuj-1总荧光面积比(Tau/TuJ-1)，然后将所有数据归一化至未处理孔的平均Tau/Tuj-1比率。TuJ-1强度用作各样品的内标。为了评价来自寡聚体处理的神经突/神经元毒性，将各孔的Tuj-1总荧光面积归一化至未处理孔的平均Tuj-1总荧光面积。还获得各孔的核计数作为与LNA寡聚体处理有关的毒性的备选度量。数据表示为均值± S.D。对于免疫细胞化学，数据点表示来自一式三份处理孔的均值± S.D。效能值由用大浓度范围的LNA寡聚体处理的孔产生，从其分析所得归一化Tau/Tuj-1和Tuj-1值，并与盐水对照样品的归一化值进行比较。分析应用具有分别设为100%和0%的固定值的最高和最低值的非线性归回进行，其中100%抑制表示与对照样品相比信号完全降低(图3)。对于qPCR，数据应用单因素ANOVA与Dunnett多项比较检验分析，以对盐水和LNA寡聚体处理组进行比较。统计显著性设为p<0.05的值。
将τ蛋白被各寡聚体的降低与盐水进行比较。与盐水比较的τ蛋白降低的结果见图6。如果反义寡核苷酸处理的神经元的τ蛋白水平等于或高于对照细胞中的水平，则%抑制表示为零抑制。如存在的话，“N.D.”表示“未测定”，“TBD”表示“待测定”。
实施例8：寡聚体优先选择
可如表1所示描述所选寡聚体的性质。根据这些标准，选择某些寡聚体用于另外的体外和体内剂量反应测试。
表1：对于其它测试，用于优先选择寡聚体的标准的概要
测定法 优先选择标准
τ蛋白降低 τ蛋白降低>70% (5μM寡聚体)
钙波动 钙波动降低<25%
序列评分 序列评分≥0.20
在其它实施方案中，可根据下列特征选择寡聚体：(1)在τ蛋白中τ蛋白>30%降低(5μM寡聚体)；(2)在钙波动中钙波动<25%降低；和(3)序列评分等于或高于0.2。
序列表
<110> 百时美施贵宝公司
罗氏有限公司哥本哈根创新中心
<120> 选择治疗性分子的方法
<130> 3338.035PC03/ELE/C-K/SAS
<150> 62/279,610
<151> 2016-01-15
<150> 62/112,058
<151> 2015-02-04
<150> 62/156,684
<151> 2015-05-04
<160> 805
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 758
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 微管相关蛋白τ (Tau)蛋白序列
<400> 1
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
35 40 45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
50 55 60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val
65 70 75 80
Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu
85 90 95
Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro
100 105 110
Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Glu Pro Glu Ser
115 120 125
Gly Lys Val Val Gln Glu Gly Phe Leu Arg Glu Pro Gly Pro Pro Gly
130 135 140
Leu Ser His Gln Leu Met Ser Gly Met Pro Gly Ala Pro Leu Leu Pro
145 150 155 160
Glu Gly Pro Arg Glu Ala Thr Arg Gln Pro Ser Gly Thr Gly Pro Glu
165 170 175
Asp Thr Glu Gly Gly Arg His Ala Pro Glu Leu Leu Lys His Gln Leu
180 185 190
Leu Gly Asp Leu His Gln Glu Gly Pro Pro Leu Lys Gly Ala Gly Gly
195 200 205
Lys Glu Arg Pro Gly Ser Lys Glu Glu Val Asp Glu Asp Arg Asp Val
210 215 220
Asp Glu Ser Ser Pro Gln Asp Ser Pro Pro Ser Lys Ala Ser Pro Ala
225 230 235 240
Gln Asp Gly Arg Pro Pro Gln Thr Ala Ala Arg Glu Ala Thr Ser Ile
245 250 255
Pro Gly Phe Pro Ala Glu Gly Ala Ile Pro Leu Pro Val Asp Phe Leu
260 265 270
Ser Lys Val Ser Thr Glu Ile Pro Ala Ser Glu Pro Asp Gly Pro Ser
275 280 285
Val Gly Arg Ala Lys Gly Gln Asp Ala Pro Leu Glu Phe Thr Phe His
290 295 300
Val Glu Ile Thr Pro Asn Val Gln Lys Glu Gln Ala His Ser Glu Glu
305 310 315 320
His Leu Gly Arg Ala Ala Phe Pro Gly Ala Pro Gly Glu Gly Pro Glu
325 330 335
Ala Arg Gly Pro Ser Leu Gly Glu Asp Thr Lys Glu Ala Asp Leu Pro
340 345 350
Glu Pro Ser Glu Lys Gln Pro Ala Ala Ala Pro Arg Gly Lys Pro Val
355 360 365
Ser Arg Val Pro Gln Leu Lys Ala Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp
370 375 380
Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Thr Ser Thr Arg Ser Ser
385 390 395 400
Ala Lys Thr Leu Lys Asn Arg Pro Cys Leu Ser Pro Lys His Pro Thr
405 410 415
Pro Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ile Gln Pro Ser Ser Pro Ala Val Cys
420 425 430
Pro Glu Pro Pro Ser Ser Pro Lys His Val Ser Ser Val Thr Ser Arg
435 440 445
Thr Gly Ser Ser Gly Ala Lys Glu Met Lys Leu Lys Gly Ala Asp Gly
450 455 460
Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys
465 470 475 480
Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro
485 490 495
Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser
500 505 510
Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg
515 520 525
Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala
530 535 540
Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu
545 550 555 560
Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys
565 570 575
Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val
580 585 590
Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys
595 600 605
Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln
610 615 620
Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly
625 630 635 640
Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val
645 650 655
Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly
660 665 670
Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile
675 680 685
Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp
690 695 700
His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr
705 710 715 720
Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met
725 730 735
Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser
740 745 750
Leu Ala Lys Gln Gly Leu
755
<210> 2
<211> 140924
<212> DNA
<213> 人(Homo Sapiens)
<400> 2
gggattacag gcgtgagcca ccacacccag cccagaatgt ttattagaat gcacaattaa 60
taccagaggc agtggggaag gaaggactga gcagaggagg aagttgagtt gtgattcaac 120
ccaacaactg cctggctggc atggggagct ctggagttaa atagggccat cagactttcc 180
cagtgtgggg ccaacatgac tgggtcttta tacccccacc tctgtcagtc actcaacgtg 240
gtctccctgc aacaaggtga ctcttgcagc cgagacaatc cctgaaggga cagaggctga 300
agcctgtctg ccaacagcac tcccagtggc tggaacaagt ccttccctat aggggaatct 360
gggcggcaca cctccatctc catgtccatc acatacgata tcacagacat ttaaatattt 420
tgataactgt acataagagt ttcctttata atcttataga tcttatttta tgcatttgaa 480
aatattcttc tgagacaggg cttttatcat attgccatag ggtgccacga tataaaaaag 540
gttaaatact ctctgattca gaagtatcca atgatgactt ctctctcatg catttaattg 600
aaaatctggt ttttctcctt ctctgctagt tctctacctc tctccccacc tcccacatca 660
tagcctattc acatatgtct gaatctcatg atagacaagt tcaggttctt ttcccaggtt 720
ctttttacca catcccccca cccccacata aaaagtatat atggcacagc ctaggttcca 780
cccaaatcct ttctcctctt cttcctgggc ccacaactct cctacataca ttggtatacc 840
ttgcgcttag ggatggccat gtgactaagt tctaacagtg gaacatgatc agatgccact 900
tccagcctct aagacagcca gtgtgtttcc tccataagct ccttctcttc ctcccaactg 960
gagactctaa atgatgaccc tgcctcaagc aagcaaacaa caagtccctc aggggtggtg 1020
taggctgcaa atggaaggag cttgagtccc aaaccttcca cggagaaggc tggctaccaa 1080
cctggatcac tcacccaaga ctgctcgaag agttggtttg aaccattgtg ttttggggtc 1140
tatttattac aacagtttag cttgctttgt gaatagattt agtggcagag cctccaaatt 1200
ctatagatac attgatctca gtcctaaccg catctggaac accattaaat aaaggaattg 1260
caaacccaga gaaggtaatg aatttgtcta aggtcataca agatggctag gatcaggacc 1320
caactctcca gttttctttc ttctctgcta ttctgccttc tgtgatccta cataagtggg 1380
catgattgta taacatatgc ggccatgaga tttctctttc agcaagagaa agggacagga 1440
agaaagagag ggaatgcatt ttcttggcct gaattagtgt gagccattag ttacctacat 1500
tgactaaatt atctggaatg aacattcaac tctacatcac atatagttaa aatgacagat 1560
ctgcttaaga ttgtttctag catacgttat ttcaatttag gcaaatgtga ccattcagtg 1620
tgaggggacc atactgtcat taggtccctg tcagttctca attatactgt tatcttagag 1680
ggggaaaaat gtgaaatttg aatgtagacg agtgttgatt tgactgctac agtttatttt 1740
acgtatagaa ataaaataat gtgtagcaaa agcattatta caaagatgat aatgaaataa 1800
ctagtattta taatagtata atagtatagt atttataata gtatgatagt ttaatgacta 1860
tttgtcagat gttgtgtaag aaactttata cacacacaca cacacacctc atttaattcc 1920
tgtatcaatc aggatacagg acgctgtggt aacaactcct caaatctcgg tggcttgcac 1980
aacaaatgct tatttctttt ttttttttga caccaagtct tgctctgtaa caggctggag 2040
tgcaatggtg caatctcggc tcactgcagc ctctgcctcc tgggttcaag cgattctcct 2100
gcctcagtct ctcgagtagc tgggaacaca ggcacgcgcc accacatctg gctaattttt 2160
gtgattttag tagagatggg atttcaccat gttgctcagg ctggccttga actcctgacc 2220
tcaagcgatc cacccacctc agcctcccaa agtgctggga ttacaggcat gagccactgc 2280
gcccagcccc aaatgtttat ttcttgctca tgtgacatgt acttcctcga gtttttcctt 2340
cctgagatct aagctgaagg aacagctctc tggagccacg ccattctggt ggcggaaagg 2400
aagagtaaaa gtggtagaac cttgcaatgc tcttgaagcg cctatttgga atgtctacat 2460
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ttcagaaaga agaagagtaa ttttgctgaa ctccttctag agactggaaa tgtcccttcc 2640
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actactggtg ggtgaagaaa gaacaaggac ctttgtaggc aaaggaaaac ctcagaatta 2760
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tttaagattt ttttttctga cgtaacggtt agattcacgt ttcttttttt ttaagtacag 4440
ttctactgta ttgtaactga gttagcttgc tttaagccga tttgttaagg aaaggattca 4500
ccttggtcag taacaaaaaa ggtgggaaaa aagcaaggag aaaggaagca gcctggggga 4560
aagagacctt agccaggggg gcggtttcgg gactacgaag ggtcggggcg gacggactcg 4620
agggccggcc acgtggaagg ccgctcagga cttctgtagg agaggacacc gccccaggct 4680
gactgaaagt aaagggcagc ggacccagcg gcggagccac tggccttgcc ccgaccccgc 4740
atggcccgaa ggaggacacc cacccccaca acgacacaaa gactccaact acaggaggtg 4800
gagaaagcgc gtgcgccacg gaacgcgcgt gcgcgctgcg gtcagcgccg cggcctgagg 4860
cgtagcggga gggggaccgc gaaagggcag cgccgagagg aacgagccgg gagacgccgg 4920
acggccgagc ggcagggcgc tcgcgcgcgc ccactagtgg ccggaggaga aggctcccgc 4980
ggaggccgcg ctgcccgccc cctcccctgg ggaggctcgc gttcccgctg ctcgcgcctg 5040
cgccgcccgc cggcctcagg aacgcgccct cttcgccggc gcgcgccctc gcagtcaccg 5100
ccacccacca gctccggcac caacagcagc gccgctgcca ccgcccacct tctgccgccg 5160
ccaccacagc caccttctcc tcctccgctg tcctctcccg tcctcgcctc tgtcgactat 5220
caggtaagcg ccgcggctcc gaaatctgcc tcgccgtccg cctctgtgca cccctgcgcc 5280
gccgcccctc gccctccctc tccgcagact ggggcttcgt gcgccgggca tcggtcgggg 5340
ccaccgcagg gcccctccct gcctcccctg ctcgggggct ggggccaggg cggcctggaa 5400
agggacctga gcaagggatg cacgcacgcg tgagtgcgcg cgtgtgtgtg tgctggaggg 5460
tcttcaccac cagattcgcg cagaccccag gtggaggctg tgccggcagg gtggggcgcg 5520
gcggcggtga cttgggggag ggggctgccc ttcactctcg actgcagcct tttgccgcaa 5580
tgggcgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg gaggggtccg 5640
ataacgaccc ccgaaaccga atctgaaatc cgctgtccct gccgctgttc gccatcagct 5700
ctaagaaaga cgtggatcgg gttctagaaa agatgactcc ctgcacgccc ctccctgcac 5760
ctcccgagca gtgattccga cagggccttc actgcccctg attttaggcg ggggccggcc 5820
ccctcccctt ttcctccttc agaaacccgt aggggacatt tgggggctgg gagaaatcga 5880
ggagatgggg aggggtccac gcgctgtcac tttagttgcc cttccccctg cgcacgcctg 5940
gcacagagac gcgagcagcg ccgtgcctga gaacagtgcg cggatcccac tgtgcacgct 6000
cgcaaaggca gggttcacct ggcctggcga tgtggacgga ctcggcggcc gctggtcccc 6060
gttcgcgggc acgcacagcc gcagccacgc acggatgggc gcggggctgc aggtgcatct 6120
cggggcggat ttctttctca gcgctcggag cgcagggcgc ccggcgtgtg cgctccctgc 6180
cggaggcgcg gggctggcgc gcagggctcg cccctcactg cggcagtggg tgtggaccct 6240
ggtgggcgag gaagggggag gataggctgt gcctcctccc actcccgccc ccagcccccc 6300
tttttttccc cctcggaacg cgaggtgcca tcttttttcg gcgtgtcacg tctttacggt 6360
gccatgccaa accgggtggc cgggcttcat aggacagggc ggggcctggc attaaaggga 6420
gggggacaat cagcgctgaa atcttggcgt tttgctgctg cgggcgtgag cactgggggc 6480
gttcgcccag caccttcttc gggggctctt tgctttgtct gtagaggtta cgtgatctgc 6540
gctcccagcc ctggtttctg gcttttattc tgagggtgtt cagtcaacct cccccctacg 6600
cccatgcgcc tctctttcct ttttcgctcc tcatttccga gcccattgtt ggatctcgag 6660
gcttgctggg ttcgatgaac tcgagtcaac cccccgaccc ccggcacgca tggaacgggc 6720
gtgaccgcgc gcagcctcgt ctcggagtct gccggcgccg ggaagcttct gaagggatgg 6780
gattcgagtc tccgtgcgcg ctgcgggcgg cggcagaggg atctcgcccc tccctacacc 6840
ccaagtgtcc tgagggccac gccacaccag gttgcccagc gagggacgct ggctacccat 6900
ccggggatgg gtggggagcc ctggcggggc ctctccggct ttacgccctg ttgcttcgcc 6960
tggccggaga atgtgaggaa ggggcataag gttactggtg cttcggccac acccatcttt 7020
ctgagcccac tggactgggc gcagaggggg gattgccatg gaaaccacag gtgtccggag 7080
aggggatctt ggggctggcc tcaccccttc cctgcggaga ttggggaccc tggggtaggg 7140
ggagccgcgc ccagtcggcc tcctggagga cacgggagga agccccgaac ccccgcgcct 7200
gaggctgttt ctgattggcc cctggaggcc gcagacacgc agataggcgg ccctgggtgt 7260
atttttatta atattatgtc cgtactgatt aatattattt atcttaaata aatttcaccc 7320
gtgtccaagt tcaccgcgcc cccaaaaccg agtctggggc ggcaggggga actcctggcc 7380
aacgaatcca tgcctcgccc tcctgtgatg aacctggtac gcacggtttt ctggttaatt 7440
ctatcgctga aaactggtgc ggggggcgca cttctgagac ggaagagcat ctaggagctg 7500
aatcctccac gcgggtcgcc caggttgatc tgaatttctg gggaatggct tggctgcccg 7560
cccgggacca ggccgaccct ccttgacggt ggcgtagagg gctggagcct gggtactgcg 7620
aggctcctcg catggctggg cccgccgcga ggggttgcag agcggctcag ggatcgattc 7680
aagcatcgtc tctcctccct cgcccccaga cagagctggg cgcggggttc cccttccaga 7740
tggagcgagg gtctcggggt ggccccggaa aaggggagcc cgcggccacg gctacgtatt 7800
gccatctcgc gagcagagat gtcacctcct gcctttggag gaaagggagc ccggtgggga 7860
tgagcgcatt tagcccaatg ctgggaacaa agcgcactcc gcgcttctgc gatttcgctc 7920
cattttgaaa tgtgttggcg ctttggtggg gccgctgcgg tgggcaaggc cgggggcgct 7980
gttaatggag gaacctcagg gggacggtcc ttcgtaggaa actctatcct ggctctgcgc 8040
gcgctttaag gaaatggctt ccctccagga cctcgaggga tgcagctttt gcgcggatga 8100
cggtggggtg ctgaaccagc cggtgcgcct ctggaaatgt ctgggcacgg atcctggggc 8160
catcgacgac tcctccccat tcccagcagg cgggagctct tacattccga gcgagtgacc 8220
cctctcaccc tctggcgctc acacacctgt aactccaaac ctccgtctca gaatggtcca 8280
ggctggaagg gatgatgggg gctccgacag cgactgccta gctcacccct ctgcgtgctc 8340
aggctccagg ctcagcagga ccaatttgag ttctatctga tccccctcgg ccccttaact 8400
gacccatcct acaggagaca gggaaatgtc tttcctaccg cggttgattc tggggtgtca 8460
ttttgtgttt tgtgatggct gcttatattt actgtataag cattgtattt actgtataag 8520
cattgtatta taattactgt ataagctgct tatatttact gtataagcat ctccaaatcc 8580
tccctctacg taaacaaatt aatggataaa cagataagtg tatcccctgc ccccacccct 8640
gctacgcagg tccggagtga ctcttgaagc tcatacattc cttggccaag tttgcttctc 8700
taacagatgt ttatatagca ataacctggc ttggctcttg ggttcacctt tggacgattt 8760
ggggaagggg cttgttggct ttgctgggtt ttggatgagt gacagtccat gactgttcct 8820
gctggaaggg cgtgactttt aagtggtttc taatatcagg cattgctcct ccgacaggaa 8880
caaaagaaat ggatactgcc cataaattgt tagaaaactt agaatcgctt tgattgagga 8940
aaggttagat ttattccggt tggaaaaagt ggcctttcta ttaaacgtgc cctttgaccc 9000
tcatgccctt ggaggtcggt gccagcctgg agatgggata agattgtggt tttccttctg 9060
cctttttaac atctgttgtt acagtccatt tgttgaaaat ttaaagaaac tgttttattc 9120
cactttccct cagcatttat gtgtgtggtt tcagtagctc tgtggctata tgtacgaaca 9180
cgtgttattt ttccaattgg acatgtgata attttccaac tggaccttgc cttctattga 9240
tgtatttatt tagcatcttc cttactccct ccttgaaaaa gaatcactca aaaacaaata 9300
aaaacagccg taggggccta atacagtgct agacatacaa gaggtattcg gtccatacca 9360
aatggatttt atccatgaag gataaatggg gaaatacagt gggaagcagg tgggaaactg 9420
cgtttgactc tgctctttcc tccaccacca ctttcctcat caccgtgttc agagaccccc 9480
aaagccccct cacactccca gaaacacccc cctggccact cctaacttgc catgcccagg 9540
agttaggtgc ttccactagt gacatggagc tggcgtttgg ggggcacctc agcaggtgac 9600
gggaagagaa gaccccagcc tcaccagctg ggctgcagca gggagaggag tcctcatgtt 9660
ccagcaggga ctctcagctg ttttcctgta aaaccatggt tctcaactgg gggccactga 9720
gatgtctaga gagatgtttt tgttttcaca actcggggag ggtgctactg acatcttgtg 9780
ggtagaggcc aggaatgctg ttaaacatcc tacaaggaag gcacaggaca gtctcctaca 9840
tcaaaatatg acccagtccc aatgtcacca ctgctggggt tgacactggc actgctatct 9900
taattacatt cattgagtgt cttttaggag gccctattct aagtgcttgc taagattatc 9960
tcatttaatc ctcacaacac ttccgctatg tagcaggtgc tgttattatc tccgtgatgg 10020
ggaaactgaa gcacagagag ggttagtaac ttgctaaagg tcacagagcc agtgggtggt 10080
ggagctggtt gcctgacact agttccctcc cctctcagcc acatgtgggt ttacttggcc 10140
attgtggact agtctgggaa cccagatatg atctataaca ttgacccagt agaatattga 10200
ttccaaaacc actgtctcac aaatgaattt ttacaagagt ctgtaatcgg agcatgaccc 10260
agaataaggt tagggagatg tggagttaaa gctctcaatt tcttatctgg ccccgacaca 10320
gagagcaagg catttcactc tacattggtg ctctgtttat aaaacaaaga gcaaatatct 10380
cttcctaagg tccttaaacc tcttccccca atccagggtt tctggactgc tctgccatat 10440
gacggggcag ctggtttgat tgacccaggg aaggctggaa atcaagactg ggggatcaag 10500
acgtagattc agtgtggcca aggtcaagtc tctgaggttt agggacatca gatccccagc 10560
ttaggttctg tacctcggca aggtgaaagc gttggcgccc actgatgagg cctgctctga 10620
gattgtgggt gtgggttgag ttgggtgggc ataggcaagt cctcttgtaa gaatcttttg 10680
gcaaagatgg gcctgggagg cttttctcac ttcctggggc ccaggctttg caataagtat 10740
tccattatac tgtggtacct tggggctacc tgagaatcct ctgtctcgcc cctgttgcct 10800
tgccaaagag tttgctgtcc aagaattcct ttcctgtctc caggtgccat gctcctgcca 10860
cctctgccag gttccctgcc tgcccagatg gctcccaact gagtgtgagg aggaatttga 10920
gacaggtttt gagctttctg ggttctccag ttaggaaact ttctgtaagc atgcagatag 10980
aatgggcttc agcaaaatac aaactcgaac aacttccatg tatagtccct taattttctt 11040
tgcttttttc atatttcatc aggctccatg ctgagcccaa tcagggaccc gatagaaatc 11100
caaacaccat gtcagcgagt ccccaagaaa tgcattttgt gccaaggcta ttcaaggaag 11160
gtttgggagc agctcaaggg cagacactgt taccctcccc caggtcccca gtgcagggca 11220
gtgttctgca tgtggaggca gtttggccta atggttaagg aggtaggctc tgatcgggcc 11280
tcctgggcac aaatcccagc tccctgctca ctgtgagacc taagccatat tgtttagctg 11340
cttggagagt tttttgtcat ccacaacttg gagtatgatg gtacctgtct cacgggttgc 11400
catggggttc acacaagcta acccggtact cactagggcc aagcacatag taactgctca 11460
gtaaatggca tcatcggcgg tgtcctgtgg atgagtgctt gtgattggct gaatgaccag 11520
aggggtctaa agatcctggt gatggaatca gttgtacaga taaattgtta cactgagtag 11580
ggatcaagat aggaaaagtc ggcaactacc cagctcccct gcaccaaact gggcagaagt 11640
ggatcctctg aaaattgcac acacccatgt ttaaatgtac acacagaact cttgccacag 11700
gcaagcggag atttgtcatc tgctgtccct gcctcatctt cttcctgaaa tccactccat 11760
gccaggaata aactgcatgc tctccaccag cccaaactga cctgccttcc cgccagccat 11820
cccgggcagg gtgacctggc ttagtacatc gggttcagag atctttccag tttactcgtt 11880
gaataaaaag tgagggctga tcgagaaagt aatggcagtc agggaaggcg aaggaggtaa 11940
agaagagatt ttacaaatga agtaattcaa cagagtgctg acattggtaa actggcaaac 12000
agatttcagg gtggttggtt gagagtagag tagaaaagga ttaaataaag caaacttgtg 12060
gtgtactgaa tcttaggaat tccatgtatc caataagtat agtcatttat gaattaataa 12120
attcggccta agaagccttc ttatcgctta aatcaagact aagtaacaat atatcagttt 12180
taaaaagtca ttatatcaga aaatcattta aatgatacac atagatttcc aagattttac 12240
tttaaccgaa actatataaa tgtgaatttg ttcacccatc ttttgacaca gggctcaggt 12300
cttctcttgg tgtctggatc agccagttga aatttcttgt ctgttttgcc tatgccacat 12360
taataatgca ctgtctgggt cctccgattt cagtttggat tttgggttta cattgtggag 12420
tcatctgaat gcagaatcct tcagggattt tacttttttt tttttttttc atggtcttta 12480
ccatcccatt tgatagtaaa tattactcac ctttatgaag tctttccaaa acattcaact 12540
aaattttctt aaaatcattg aatgatttga agagcttatt cctcagcact tttactccat 12600
cagcttgcac cttatttttt aatctttttt tgagacggag tctcgctcta tcgcccaggc 12660
ttaagtgcaa tggcgcgatc ttggctcact gcgacctcca cctcctgggt tcaagcaatt 12720
ccgcctcagc ctccgccgta gccgggacta caggtacaca ccataatgct cggctgattt 12780
ttgtattttt gtagggatgg ggtatcgcca tgttggccag gctggtcccg aacttctgac 12840
ccaagtgatc cacccacctc ggcctcccaa agtgctggga ttacaggtgt gagccaccgc 12900
gcccggccag cttgcacctt atttaggata tgtgattatt atagcaagtc tggtgtacat 12960
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ttattcttac agggtatcag aagaacacct actggggaaa cttataaatt agtaaaaggt 13140
gggcattctc cccgcccatc ttctgtctgt ctgccaggac tagcacagca ctttgaagtc 13200
attcacatag aatcccaact taagagggta aaatcctcct caacagactg aaaataagtt 13260
taaattccct ttgctatatt aactcccctg aggaaagagt cttagatcaa tgtccaacac 13320
taaaaacagt tttaaatcag caagtgagaa ttaaatctga agcaattgat aataatgttt 13380
cattcattcc tctcctttgg ccccgtccac cctactgcta aatccaggca tcaaagagaa 13440
gagggacata attatctcta gtcccagctg ctggttttcc ttccagccta tggcccagtt 13500
ttctgtttta ctgagaaggc tggtgatgtt atcttgggat ctaagtctgc agtttcacca 13560
caaaaagtcc agggatgcac tttcatgctt gtgtcctcct ccctgggata gcaaggatat 13620
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aaaattagcc gggcgtggtg gcgggcgcct gtagtcccag ctactcgaga ggctgaggca 14160
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tctagcctgg gcgacagagc tagacttctt ctcaaaaaaa aaaaaaaaaa ggaatctctt 14280
tggttttata tatttttttt tatatatata atatatatta aaatataata tatatattta 14340
tataatataa tatataaata tattatatat tatatatttt tatatattat atattatata 14400
tattatatat tatatattta tatatttata tattatatat atttatatat tatatattta 14460
tatatattat atatttatat ataatatata ttatatatta tatattatat attatatatt 14520
atatatttat atatattata tattatatat attatatatt atatatttat atattatata 14580
tttatatata ttatatatta tatattatat atttatatat tatatattta tatattatat 14640
atatttatat atattatata ttatatatta tatatgtata tattatatat gttatatatt 14700
atatatattt atatatataa tatattgtat atattatata tctaatatat tatatatatt 14760
atatatatta tatattataa tatatattat atattatata tatttttata tatataatat 14820
gtataatata taatatatat aaaaacatat ataatatata ttatatatta tatatatatt 14880
atatatatta tatatattaa atatatttta tatatattat atatattata tatattaaat 14940
atattttata tatattatat atatatacac atatatatat ataaatgagg ccaggctcgg 15000
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gagcccagga gttcaaggct acagtgagct atgattgtcc catagcactc cagcctgggt 15240
aacacagcaa ggccctgtct ctaaactttt tttttttaat tctatttata tttacatgta 15300
tttaaatgtg aatattcact acctatttgt tgcatgcctg cattttttat actgggcttg 15360
ccaaaaaccc gaacagcttt ctactttgac aatgtatcag aatttaaatc agcaatatgt 15420
taataagcca agcaaaggtt atatatgcaa ataaaactgt tgtctataac ctcctgttac 15480
actggggcac agcaaaagtc atggtgtagt cgcatgtgaa cctgtccctt tcatagctgc 15540
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aggagcagcc tctccccacc actcacagtg tttagcatgt gacaggaatc gattaaggca 16980
tgagtgatta aattaaagcc aggcattgac ttggatggtg taatattctg acatctgttt 17040
ggtgtcaaag gcacggggca ggcgcgttaa ttgaactgct tgcacctggc atttgaattg 17100
agccagagcg gggctaaagt cagtttgcct tcaccctgta aatggagggt ttctccggag 17160
cgtggatggt gggaggtatt tcagggtgta tgcataaccc ccaccctgac aatggcccat 17220
ctcttctcca gcgtggccag gtttgagtgc cagtcctggg tgtccagtgg ccccatagcc 17280
ttgcgtttta gtaaaatgct gcccccatta ccacctggtc tgtgcacttc ggtcactgga 17340
atttgccatc ttccagtccc gaatgtggca agccatggag ccttaagctc ttctccctcc 17400
acatcctgga acagacccgc cagtttcttc caggcattgc ctcagtttgc ccctctgttt 17460
ccagtcacac tctcaccagc gataaaatga ttttagacct tatcatctca ccctcggatc 17520
cttatggaaa caataatgag ttgttccctg tttcaattcc aaaattcata tccaatccgt 17580
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aagtgtggtc ctgccatggg catcgcctgc taagccaagc tggcctcgag ctgcctgccc 17700
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actcatctgc ccacaggttg cacgtcctgt gagggcaagg actgtgtctt atgtgacttt 18060
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tggatgttga gaaatcaaac aggccaatgt caaatgagct ctccttattt aaatcaagtc 18180
agttctccac ctcctagcac tcagttccag tactctatat acatggaaat aataaaaaac 18240
acatttcctt tgaaacattc tataatcgtt cctttgccct acttcagacc aacttaacgc 18300
actccccatt ggtccaaatg agttttgcta tacgaagatg ctgataataa tagcagcagt 18360
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gagcatcccc catctggttc tactgcctgt gctagtcgtg caggagccaa aagacacgtc 18600
tttagtgcta aggactggag aagccatgcc ctccagcctc tgtgaatggg tcatatgtaa 18660
catgagcctg gagaaattat ttgaaaccaa aggcaagcct ctaaaccagg ctgctgcttc 18720
atggcgccgg tgacggcaga accaaattta gtgctgtggg caggtccaca cttatcaaat 18780
agagaagctc atttttcttc cggctcacat caagcatgaa aaatgttcac acataccccc 18840
cacacacaca tgctttccgg aggggtccat gtggctagag gctggaagat gtggatgaga 18900
ggagcctggc aggtaagccc agggaagatg acattcagct tcccagacag catctacagg 18960
gagaaattta attaaaagtg gggcggtttc cctgagcaag gcagacaaag tcagccctct 19020
actgttaaga aaaagggtca cagtgagagg ggaggtgagg agactgagtc tgtattttct 19080
agtctgttgg gctacactac ctgatccccc ttcctcaaaa atccacttta ctttccccat 19140
gtctacacca atgtggttca cactctggga ccaggaaaag ggggagtgat ggggaacaga 19200
gaagggagga gctcacacag ctgaggctgg ggttatgcat atcgaattac ttagaatttg 19260
caacctcaca gggtactttc atggcgttga aatacacttc ccacagccac cctccctcta 19320
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attaagggtg agtactgagt cattcttcaa gaaaagtttt agaagcatcc aaaactgaag 19560
ggtggagcca cctggagaca gtatcatcag tcctggcccc gagcatggcc tgcataggcc 19620
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aaattaggag ctgggcagag ggcatctctc tgtcgccatt gggcagccca gggcacactg 19740
gtcatagcct tagaccacga acaccctgtg cccgggggac agatgcaacc agtgtgccct 19800
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caatgtgcag agaacacttg ggactacctg gctttctgga tacacaaata ttgatccaat 19980
ctggactaat tagaaggtca gtcccaataa caaatcgaag tcagctgggc gtgatggctc 20040
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gctgggtgtg gtggctcatg cctgtaatcc caacagtttg ggaggctgag gcaggtggtc 20220
acctgaggtc aggagtttga gaccagcctg gccaacaggg tgaaaccccg tgtctactaa 20280
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tagttgttag aatttaaaga taattggtaa atgagtttct atccttctag tttcacatca 21660
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taagcactca gtaattgatt cacgagtgaa taaatggatg agtgggtgag ttcaatattg 21900
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aggtgaagga agacatgggc gtattggggg agcaggggct gctcagaggt gttccagaag 74580
ctctgggtga ggaggtgaga gggaccgggg aatgcagctc ggcccagcct ccctgcctga 74640
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gctgccagat tcagctcccc agggagggca cctgagaggc tccaagccag gagatctgtt 74760
ttctcctttg ttttgttttt ttttgttttg ttttgtttta ttatacttta agttctaggg 74820
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taggccactg agaatgaata acccctggca gctggtcagc agcttgcagt ttactaagca 102300
ctggagtctt cattgccttc tcagtccttt tgatttctga ggcaaatgtt gaatccctac 102360
cttttttttt ttttttcttt tgagacagag tttcgctttt gttatccagg ccggagtgca 102420
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agtatgtggc agatactgaa ttattgctta atgtcctttg attcatttgt ttaatttctt 115740
taatggatta gtacagaaaa caaagttctc ttccttgaaa aactggtaag ttttctttgt 115800
cagataagga gagttaaata acccatgaca tttccctttt tgcctcggct tccaggaagc 115860
tcaaagttaa atgtaatgat cactcttgta attatcagtg ttgatgccct tcccttcttc 115920
taatgttact ctttacattt tcctgcttta ttattgtgtg tgttttctaa ttctaagctg 115980
ttcccactcc tttctgaaag caggcaaatc ttctaagcct tatccactga aaagttatga 116040
ataaaaaatg atcgtcaagc ctacaggtgc tgaggctact ccagaggctg aggccagagg 116100
accacttgag cccaggaatt tgagacctgg gctgggcagc atagcaagac tctatctcca 116160
ttaaaactat ttttttttat ttaaaaaata atccgcaaag aaggagttta tgtgggattc 116220
cttaaaatcg gagggtggca tgaattgatt caaagacttg tgcagagggc gacagtgact 116280
ccttgagaag cagtgtgaga aagcctgtcc cacctccttc cgcagctcca gcctgggctg 116340
aggcactgtc acagtgtctc cttgctggca ggagagaatt tcaacattca ccaaaaagta 116400
gtattgtttt tattaggttt atgaggctgt agccttgagg acagcccagg acaactttgt 116460
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tgacctgaga aagttgcgga acctcagcga gcctcacatg gcctccttgt ccttaacgtg 116580
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atgtaggtca ggcgctcctg tgttgattgc agggctattc acaatagcca agatttggaa 116760
gcaacccaag tgtccatcaa cagacaaatg gataaagaaa atgtggtgca tatacacaat 116820
ggaatactat tcagccatga aaaagaatga gaatctgtca tttgaaacaa catggatgga 116880
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cagaggctga ggagggtgga ggggagcagg gagaaagtag ggatggttaa tgggtacaaa 117060
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agtaatttat agtacattta aaaacaacta aaagagtgta actggactgg ctaacatggt 117180
gaaaccccgt ctctactaaa aatacaaaaa ttagctgggc acggtggctc acgcctgtaa 117240
tcccagcact ttgggaggcc gaggcgggcc gatcacgagg tcaggagatc gagaccatcc 117300
tagctaacat ggtgaaaccc cgtctctact acaaatacaa aaaaaagaaa aaattagccg 117360
ggcatggtgg tgggcgcctg tagtcccagc tactcgggag gctgaggcag gagaatggcg 117420
tgaacccggg aggcggagct tgcagtgagc cgagatcgcg ccactgcact ccagcctggg 117480
cgacaaggca agattctatc tcaaaaaaat aaaaataaaa taaaataaaa taataaaata 117540
aaataaaata aaataaaata aaataaataa aataaaatgt ataattggaa tgtttataac 117600
acaagaaatg ataaatgctt gaggtgatag ataccccatt caccgtgatg tgattattgc 117660
acaatgtatg tctgtatcta aatatctcat gtaccccaca agtatataca cctactatgt 117720
acccatataa atttaaaatt aaaaaattat aaaacaaaaa taaataagta aattaaaatg 117780
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aatcacttga gcccaggagt ttgagaccgg cctgggtgac atagcgagac cccatcatca 117900
caaagaattt ttaaaaatta gctgggcgtg gtagcacata ccggtagttc cagctacttg 117960
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ggcgccactg cattccagcc tgggtgacag agtgagagct tgtctctatt ttaaaaataa 118080
taaaaagaat aaataaaaat aaattaaaat gtaaatatgt gcatgttaga aaaaatacac 118140
ccatcagcaa aaagggggta aaggagcgat ttcagtcata attggagaga tgcagaataa 118200
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acccagtgct ggcagcaatg tggtgaggct ggctctctca ccagggctca cagggaaaac 118320
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gttttttgta ttttgagacg aagtctcatt ctgtcaccca ggctggagtt cagtggcgcc 118740
atctcagctc actgcaacct ccatctcccg ggttcaagct attctccttc ctcaacctcc 118800
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cttcttagag caagatacaa aattgcatgt gcacaataat tctaccaagt ataggtatac 119040
aggggtagtt atatataaat gagacttcaa ggaaatacaa caaaatgcaa tcgtgattgt 119100
gttagggtgg taagaaaacg gtttttgctt tgatgagctc tgttttttaa aatcgttata 119160
ttttctaata aaaatacata gtcttttgaa ggaacataaa agattatgaa gaaatgagtt 119220
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cagggcagtg gtttccaccc agcattctca aaagagccac tgaggtctca gtgccatttt 119400
caagatttcg gaagcggcct gggcacggct ggtccttcac tgggatcacc acttggcaat 119460
tatttacacc tgagacgaat gaaaaccaga gtgctgagat tacaggcatg gtggcttacg 119520
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tatcctggac aacatagcat gacctcgtct ctacaaaaaa tacaaaaaat ttgccaggtg 119640
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cctggtgtct gcagaaagaa ccttccagaa atgcagtcgt gggagaccca tccaggccac 120060
ccctgcttat ggaagagctg agaaaaagcc ccacgggagc atttgctcag cttccgttac 120120
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atcaccaggg gaacttttca aaactagaga gactgaagcc agactcctag attctaattc 120360
taggtcaggg ctaggggctg agattgtaaa aatccacagg tgattctgat gcccggcagg 120420
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gtgaagtgag gacctgcaat cccagcttcg taaagcccgc tggaaatcac tcacacttct 120660
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cgtcactccc cagactgcct ctgccaagtc cgaaagtgga ggcatccttg cgagcaagta 120780
ggcgggtcca gggtggcgca tgtcactcat cgaaagtgga ggcgtccttg cgagcaagca 120840
ggcgggtcca gggtggcgtg tcactcatcc ttttttctgg ctaccaaagg tgcagataat 120900
taataagaag ctggatctta gcaacgtcca gtccaagtgt ggctcaaagg ataatatcaa 120960
acacgtcccg ggaggcggca gtgtgagtac cttcacacgt cccatgcgcc gtgctgtggc 121020
ttgaattatt aggaagtggt gtgagtgcgt acacttgcga gacactgcat agaataaatc 121080
cttcttgggc tctcaggatc tggctgcgac ctctgggtga atgtagcccg gctccccaca 121140
ttcccccaca cggtccactg ttcccagaag ccccttcctc atattctagg agggggtgtc 121200
ccagcatttc tgggtccccc agcctgcgca ggctgtgtgg acagaatagg gcagatgacg 121260
gaccctctct ccggaccctg cctgggaagc tgagaatacc catcaaagtc tccttccact 121320
catgcccagc cctgtcccca ggagccccat agcccattgg aagttgggct gaaggtggtg 121380
gcacctgaga ctgggctgcc gcctcctccc ccgacacctg ggcaggttga cgttgagtgg 121440
ctccactgtg gacaggtgac ccgtttgttc tgatgagcgg acaccaaggt cttactgtcc 121500
tgctcagctg ctgctcctac acgttcaagg caggagccga ttcctaagcc tccagcttat 121560
gcttagcctg cgccaccctc tggcagagac tccagatgca aagagccaaa ccaaagtgcg 121620
acaggtccct ctgcccagcg ttgaggtgtg gcagagaaat gctgcttttg gcccttttag 121680
atttggctgc ctcttgccag gagtggtggc tcgtgcctgt aattccagca ctttgggaga 121740
ctaaggcggg aggttcgctt gagcccagga gttcaagacc agcctgggca acaatgagac 121800
ccctgtgtct acaaaaagaa ttaaaattag ccaggtgtgg tggcacgcac ctgtagtccc 121860
agctacttgg gaggctgagg tgggaggatt gcctgagtcc gggaggcgga agttgcaagg 121920
agccatgatc gcgccactgc acttcaacct aggcaacaga gtgagacttt gtctcaaaaa 121980
acaatcatat aataatttta aaataaatag atttggcttc ctctaaatgt ccccggggac 122040
tccgtgcatc ttctgtggag tgtctccgtg agattcggga ctcagatcct caagtgcaac 122100
tgacccaccc gataagctga ggcttcatca tcccctggcc ggtctatgtc gactgggcac 122160
ccgaggctcc tctcccacca gctctcttgg tcagctgaaa gcaaactgtt aacaccctgg 122220
ggagctggac gtatgagacc cttggggtgg gaggcgttga tttttgagag caatcacctg 122280
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tgcttcctgc cctgagcacc tggatcccgg cttctgccct gaggcccctt gagtcccaca 122460
ggtagcaagc gcttgccctg cggctgctgc atggggctaa ctaacgcttc ctcaccagtg 122520
tctgctaagt gtctcctctg tctcccacgc cctgctctcc tgtcccccca gtttgtctgc 122580
tgtgagggga cagaagaggt gtgtgccgcc cccacccctg cccgggccct tgttcctggg 122640
attgctgttt tcagctgttt gagctttgat cctggttctc tggcttcctc aaagtgagct 122700
cggccagagg aggaaggcca tgtgctttct ggttgaagtc aagtctggtg ccctggtgga 122760
ggctgtgctg ctgaggcgga gctggggaga gagtgcacac gggctgcgtg gccaacccct 122820
ctgggtagct gatgcccaaa gacgctgcag tgcccaggac atctgggacc tccctggggc 122880
ccgcccgtgt gtcccgcgct gtgttcatct gcgggctagc ctgtgacccg cgctgtgctc 122940
gtctgcgggc tagcctgtgt cccgcgctct gcttgtctgc ggtctagcct gtgacctggc 123000
agagagccac cagatgtccc gggctgagca ctgccctctg agcaccttca caggaagccc 123060
ttctcctggt gagaagagat gccagcccct ggcatctggg ggcactggat ccctggcctg 123120
agccctagcc tctccccagc ctgggggccc cttcccagca ggctggccct gctccttctc 123180
tacctgggac ccttctgcct cctggctgga ccctggaagc tctgcagggc ctgctgtccc 123240
cctccctgcc ctccaggtat cctgaccacc ggccctggct cccactgcca tccactcctc 123300
tcctttctgg ccgttccctg gtccctgtcc cagcccccct ccccctctca cgagttacct 123360
cacccaggcc agagggaaga gggaaggagg ccctggtcat accagcacgt cctcccacct 123420
ccctcggccc tggtccaccc cctcagtgct ggcctcagag cacagctctc tccaagccag 123480
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gacacacatg ggtctcagcc atctctgccc cagttaactc cccatccata aagagcacat 123600
gccagccgac accaaaataa ttcgggatgg ttccagttta gacctaagtg gaaggagaaa 123660
ccaccacctg ccctgcacct tgttttttgg tgaccttgat aaaccatctt cagccatgaa 123720
gccagctgtc tcccaggaag ctccagggcg gtgcttcctc gggagctgac tgataggtgg 123780
gaggtggctg cccccttgca ccctcaggtg accccacaca aggccactgc tggaggccct 123840
ggggactcca ggaatgtcaa tcagtgacct gccccccagg ccccacacag ccatggctgc 123900
atagaggcct gcctccaagg gacctgtctg tctgccactg tggagtccct acagcgtgcc 123960
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ctttgttcct attgctaaag acaggaatgt ccaggacact gagtgtgcag gtgcctgctg 124200
gttctcacgt ccgagctgct gaactccgct gggtcctgct tactgatggt ctttgctcta 124260
gtgctttcca gggtccgtgg aagcttttcc tggaataaag cccacgcatc gaccctcaca 124320
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cagatgctgt gcatactcat catattgatc acttttttct tcatgcctga ttgtgatctg 124440
tcaatttcat gtcaggaaag ggagtgacat ttttacactt aagcgtttgc tgagcaaatg 124500
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gggattgaag acactccagt cccacagtcc ccagctcccc tggggcaggg ttggcagaat 124620
ttcgacaaca catttttcca ccctgactag gatgtgctcc tcatggcagc tgggaaccac 124680
tgtccaataa gggcctgggc ttacacagct gcttctcatt gagttacacc cttaataaaa 124740
taatcccatt ttatcctttt tgtctctctg tcttcctctc tctctgcctt tcctcttctc 124800
tctcctcctc tctcatctcc aggtgcaaat agtctacaaa ccagttgacc tgagcaaggt 124860
gacctccaag tgtggctcat taggcaacat ccatcataaa ccaggtagcc ctgtggaagg 124920
tgagggttgg gacgggaggg tgcagggggt ggaggagtcc tggtgaggct ggaactgctc 124980
cagacttcag aaggggctgg aaaggatatt ttaggtagac ctacatcaag gaaagtgttg 125040
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atgctgccca agacaaggtg aggcgggagt gaagtgaaat aaggcaggca cagaaagaaa 125160
gcacatattc tcggccgggc gctgtggctc acgcctgtaa ttccagcact ttgggaggcc 125220
aaggtgggtg gatcatgagg tcaggagatt gagaccatcc tggctaacac agtgaaaccc 125280
cgtctctact aaaaatacaa aaaattagcc gggcgtggtg gtgggcgcct gtagtcccag 125340
ctactccgga ggctgaggca ggaaaatggc gtgaacccgg aaggcggagc ttgcagtgag 125400
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tcaaaaaaaa aaagcacatg ttctcgcttc tttgtgggat ccaggagata gagaatagaa 125520
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acaaaaaaaa tagaataaga cctagtattt gatagtgcaa cagggtgact atagtcaata 125640
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actccgtctc aaaaaaaaaa aaaaagaaag aaaaagaaaa gaaagtgatc ctactggaac 127020
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agcctaggtg acagagtgag actcagcaaa aaaagaaaga aagaaagaaa gaaatcagtg 127380
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agccactagc tacatgtggc acttgaaaca tggctggtac agttgaggaa gagtggctgc 127500
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ttatatagat gaagcaaact attttcaaga gctttgcaag gacttacttg tatccaaaca 128940
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tggccctggt tcaagtcctg ctgcaaacct ggaagtcctg tcattgtctt cttccctcca 129060
gagcagtggc acccaatcta atttttgctg tgccccagca gcccctggca ctttgccctg 129120
tagactgcag acctcatgta atgtatgtta agtccacaga accacagaag atgatggcaa 129180
gatgctcttg tgtgtgttgt gttctaggag gtggccaggt ggaagtaaaa tctgagaagc 129240
ttgacttcaa ggacagagtc cagtcgaaga ttgggtccct ggacaatatc acccacgtcc 129300
ctggcggagg aaataaaaag gtaaaggggg tagggtgggt tggatgctgc ccttgggtat 129360
atgggcatta atcaagttga gtggacaaag gctggtccag ttcccagagg aggaaaacag 129420
aggcttctgt gttgactggc tggatgtggg ccctcagcag catccagtgg gtctccactg 129480
cctgtctcaa tcacctggag ctttagcacg tttcacacct gggccccaac ctggagaggc 129540
tgaccaatgg gtctcagggg cagctcggtt gctggagttt ttgtttttat ttatttttat 129600
gtatttaagg cagggtctct gtattagtcc attctcacac tgctaataaa gacataccca 129660
agactgggta atttataaag gaaagaggtt taatggactc acagttccac atggctgggg 129720
aggcctcaaa atcatggcgg aaggcaaagg agaagcaaag gcatttctta catggcgaca 129780
ggcaagagag cgtgtgcagg ggaactccca tttataaaac catcagacct catgagattt 129840
attcactatc atgagaacag catgggaaag acccgccccc atgattcagt tacctcccac 129900
tgggtccctc ccatgacaca tggaattatg ggagctacaa ttcaagatga gatttgggtg 129960
gggacacagc caaaccatat cagtctccct ctgtcatcca ggctggagtg cactggcatg 130020
atctcggctc actgcagcct ctacctccct gggtcaggtg atcttcccac ctcagcctcc 130080
caggtagctg gaactacagg tacctgccac tatgcctggc taaatatttt gtatttcctg 130140
tggagacgag gttttgccac gttgcccagg ctggtcttga actcctgagg tcaagcaata 130200
tgcccacctc ggcctcccaa ggtgctggga ttacaggtgt gagccacagt gctcggccta 130260
agtcactgca gtttttaaag ctcccaggtg attcttcagt gcagtcaaaa gtgagaactg 130320
gctgggtgcg gtggctcatg cctgtaatcc cagcaccttg ggaggcgaag gtgggcagat 130380
ggcttgaggt caggagttca agaccagcct ggccaacatg gtaaaacccc atctctacta 130440
aaaatacaaa agttagctgg gtgtggtggt gcgtgcctgt aatcccagct acttgggagg 130500
ctgaggcatg agaattgctt gaacccaggg gacagaggtt gtagtgagcc gagatcgtgc 130560
cactgcactc cagcctgggc aacagagtga gattccatct cacaaaaaaa aaaaaaagcg 130620
agaaccactg tcctaggccc tgatgtttgc aggcaactaa aaaaggaagt ggacatcccc 130680
agtcagctgt ggcgcaccaa gaacaagtca tgggaacata acctaatttt ctaaatgggt 130740
tactaggcac ttagagcaaa acaatgatgc cgaaatcctg atttcagcaa agcctctgcc 130800
tgcctgtctt ggaagtatcc acatgaggct gctggggcct tggtgtcccc agcagtttct 130860
agtctctagg tcttgctgtg ggtgtctgtg cagtgagggt gtgtgtggcg ctgggtgagc 130920
tctgtctagg cctggcacag gatgcggtct ggtagctgct gcttctcttc tgcagaagcg 130980
cagccaagca ccctctgggg tttcaggccc acacccagcc tgaagttctg ggagtggctc 131040
actttccaac cttcagggtc tcccagcagc tgactgggga gtggtggagg gaaaagggat 131100
tgtattagtc cgttttcacg ccgctgatga agacataccc gatactgggc agtctaaaag 131160
atagaggtct gatggactca cagttccacg tgactgggga ggcctgacaa tcatggtgga 131220
aggtgaaagg cttgtctcac acggtggcag acaagagaaa agagcttgtg caggggaact 131280
cccctttata aaaccatcag atctcgggag acttattcac tatcatgaga acagcacggg 131340
aaagaccctc ctctatgatt caattacctc ccaccaggtc cctcccacaa catgtaggaa 131400
ttgtgggaac tacaattcaa gatgacattt gggtggggac acagccaaac catatcaggg 131460
cgtcccagaa agggtatagg gtctgagacc caagtcagca tgagaaagta tgcttctcat 131520
ggtggcccag ttgggtggaa gtggcagccg ggccgtcttt ccaccaggcc actcaagtag 131580
cagctgagag acccctgccc tggccagtcc ccgccctccc ctcttgccac tgcctctggt 131640
tctgaacaga tgggcaccct catcttgtat ttgtgattaa tgtctaacaa tgtagttttg 131700
tgagaagggt ttgctgatac agccttgctg cagatgctgc gaactgtggc ctggggcaga 131760
ccttacctcc agacacgccc tgaggcaggg gagggcactg gcccgtagct ggccgagagc 131820
tctcgggttg cgcgacaggg atacttttca gcggctgggt cgctatccaa agtgagaaaa 131880
cgaggaggga ccaggaggct gtccgcctca agagatgtgg gggccaggtc cagttatctg 131940
gggaagcagt aagcttctct gctgtttcta accccaggcc tcccctggtc taaggcaggg 132000
cctcccagcc tcggggcact ttaaagatat ctgggcctgg ccccatcccc acagtctgac 132060
tgagtgggtc tggatagggc ctgagcattg gtgatttcct gggtgaaagg aggcccctca 132120
cagtctctgg aagcttctct gtgttaggaa aagctctggg cttgactctg ctttgaaagt 132180
caagatccgc aaatcctctc agcctcagtt tctccttcag caagatgaaa tggaaatgct 132240
gtacctacgt cccggggtgg ttgtgagacc caaaaaagac aatgttctgg aaggttcctg 132300
gtgcgttgca gtcctctaag aacctgagtt agagccacgc tgagtctcag cttcttggct 132360
ccttctgttt caaactcgtc catgtgatag ctcaggaagg gtaggcaggg ccctgccccc 132420
tactcagaaa acaccatcct ggtcctgggg atccccgcag cattagtccc ctgttttccc 132480
agtgtattga gaaaaattgc taacaagcag tggggcacac caccagcctc ctgggttcct 132540
ttcagtttgg ggatttttgg acattcccag gaatgtctta aaaaacactt caaaaaacat 132600
taacataaat atttttatca aagcctgtat taaatggtct ttcaagaaaa tacagtaaca 132660
ggtcaggcat ggtggctcat gcctgtaacc ccagcacttt gggaggccaa ggcaggcaga 132720
tcacctgaaa tcaggagttc aagaccaacc tggccaacac agccaaatcc catctctaca 132780
aaaaatacaa aaattagctg ggtgtggtgg cacacacctg tagtcccagc tacttgggag 132840
gccgaggcag gagaattgct tgatcccgga ggcggaggtt gcagtgagcc gagatcgtgc 132900
cactgcactc cagcgtgggt gacaaggtga atctttgtct caaaaaaaaa aaaaaaaaaa 132960
agataaaata cagtatacag taatagagaa caatcctttt ttcaaagtag tgaccccaaa 133020
tgaacaaaat atgcatctag cttaaatgcg aacctggttt tctctacgcc cattcaagcc 133080
cctgcaatag gggcccttca ccccgcatcc atggactcct aaaattatat ggaaaatggc 133140
tgtgtgtgag tgtggatgga catgtgcaca catatttttg gctttaccag atgctcaaag 133200
agcctaggac ccaaaaaggg ctgagaatga ccgtgtcggc cacttcaggg tcatcaggaa 133260
ttgctgtgca ctgctcactt ctccagtgaa cactttctgc ttctgtgttt cctggtatcc 133320
tttgggactc ctggctaggt catgtgtttc tctactttca aaagggcttc agccaggcac 133380
gatggcatga gcctgtagtc ccagttgctc tggaggttaa ggtgggaaga ttgcttgagc 133440
ccaggaattt gaggccagcc tgggcaagta gataggtaga tgattgatag atagatagat 133500
agataaatag atggatagat aagtcgctag acagtcatcc atccacccat ccacacataa 133560
aaaggccttt gtcatgtcat gttttgtggc ccacctgcca gtgttgccca cagttgctgc 133620
ccctccaaac tcatcagtca ctggcaaaca ggaggaatgt gtggctcatg tctgggcatc 133680
agtggctgtg ggagacatcc ttgatcttct ccagcttctc cttccacatt ttcctttgca 133740
atctggcaat atctattaaa ataaaatgtg catgcctttt gacctaagag cttcacttct 133800
aggacccact tacacgtgtg tgacatgatg ttcatacggg tttatttatc tgaggttgtt 133860
catacacacc attgcctgta atcactaaag gcgggagcag cctacacatc catccacaga 133920
ggagtagatg ccttttggta catccgtggc gacggaatac taagcagcct gtgtatctat 133980
acactcacac gtgtttgttt atgtgtggaa tatctctgga gggtacacaa gaaacttaaa 134040
atgatcactg tctctgggga gggtacctgg gtgcctggga ggcaggtcag ggaaggagtg 134100
ggcacaggta ttaccaattg gaagacaata aaaacaacag ctcctggcca ggcgcagtgg 134160
ctcacgcctg taatggcagc actctgagag gctgaggcgg gcagattgct tgcgtccagg 134220
agttcaagac cagcctgggc aacatagcaa aaccccgttt ctattaaaaa tacaaaaaat 134280
tagccaggtg tggtggcatg cacctgtaat cccagctact cgggaggctg aggtgggaga 134340
atcacctgag cctgggaggt caaggctgca gtgaggtgag attgtgccac cgcactctag 134400
cctgggcgat agagcaagac cctgtctcaa aaacaaacaa aaaacagtcc ctggcactct 134460
gggccaggcc tggcagggca gttggcaggg ctggtctttc tctggcactt catctcaccc 134520
tccctccctt cctcttcttg cagattgaaa cccacaagct gaccttccgc gagaacgcca 134580
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cccagctcgc cacgctagct gacgaggtgt ctgcctccct ggccaagcag ggtttgtgat 134760
caggcccctg gggcggtcaa taattgtgga gaggagagaa tgagagagtg tggaaaaaaa 134820
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ggttaatcac ttaacctgct tttgtcactc ggctttggct cgggacttca aaatcagtga 134940
tgggagtaag agcaaatttc atctttccaa attgatgggt gggctagtaa taaaatattt 135000
aaaaaaaaac attcaaaaac atggccacat ccaacatttc ctcaggcaat tccttttgat 135060
tcttttttct tccccctcca tgtagaagag ggagaaggag aggctctgaa agctgcttct 135120
gggggatttc aagggactgg gggtgccaac cacctctggc cctgttgtgg gggtgtcaca 135180
gaggcagtgg cagcaacaaa ggatttgaaa cttggtgtgt tcgtggagcc acaggcagac 135240
gatgtcaacc ttgtgtgagt gtgacggggg ttggggtggg gcgggaggcc acgggggagg 135300
ccgaggcagg ggctgggcag aggggagagg aagcacaaga agtgggagtg ggagaggaag 135360
ccacgtgctg gagagtagac atccccctcc ttgccgctgg gagagccaag gcctatgcca 135420
cctgcagcgt ctgagcggcc gcctgtcctt ggtggccggg ggtgggggcc tgctgtgggt 135480
cagtgtgcca ccctctgcag ggcagcctgt gggagaaggg acagcgggta aaaagagaag 135540
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gtcttgagag cgctggcctc ttcctccctc cctgcagggt agggggcctg agttgagggg 135660
cttccctctg ctccacagaa accctgtttt attgagttct gaaggttgga actgctgcca 135720
tgattttggc cactttgcag acctgggact ttagggctaa ccagttctct ttgtaaggac 135780
ttgtgcctct tgggagacgt ccacccgttt ccaagcctgg gccactggca tctctggagt 135840
gtgtgggggt ctgggaggca ggtcccgagc cccctgtcct tcccacggcc actgcagtca 135900
cccctgtctg cgccgctgtg ctgttgtctg ccgtgagagc ccaatcactg cctatacccc 135960
tcatcacacg tcacaatgtc ccgaattccc agcctcacca ccccttctca gtaatgaccc 136020
tggttggttg caggaggtac ctactccata ctgagggtga aattaaggga aggcaaagtc 136080
caggcacaag agtgggaccc cagcctctca ctctcagttc cactcatcca actgggaccc 136140
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cttggttgtc agtggtggca ccaggatgga agggcaaggc acccagggca ggcccacagt 136380
cccgctgtcc cccacttgca ccctagcttg tagctgccaa cctcccagac agcccagccc 136440
gctgctcagc tccacatgca tagtatcagc cctccacacc cgacaaaggg gaacacaccc 136500
ccttggaaat ggttcttttc ccccagtccc agctggaagc catgctgtct gttctgctgg 136560
agcagctgaa catatacata gatgttgccc tgccctcccc atctgcaccc tgttgagttg 136620
tagttggatt tgtctgttta tgcttggatt caccagagtg actatgatag tgaaaagaaa 136680
aaaaaaaaaa aaaaaggacg catgtatctt gaaatgcttg taaagaggtt tctaacccac 136740
cctcacgagg tgtctctcac ccccacactg ggactcgtgt ggcctgtgtg gtgccaccct 136800
gctggggcct cccaagtttt gaaaggcttt cctcagcacc tgggacccaa cagagaccag 136860
cttctagcag ctaaggaggc cgttcagctg tgacgaaggc ctgaagcaca ggattaggac 136920
tgaagcgatg atgtcccctt ccctacttcc ccttggggct ccctgtgtca gggcacagac 136980
taggtcttgt ggctggtctg gcttgcggcg cgaggatggt tctctctggt catagcccga 137040
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ctgggttcct ctccaagctc gccctctgga ggggcagcgc agcctcccac caagggccct 137220
gcgaccacag cagggattgg gatgaattgc ctgtcctgga tctgctctag aggcccaagc 137280
tgcctgcctg aggaaggatg acttgacaag tcaggagaca ctgttcccaa agccttgacc 137340
agagcacctc agcccgctga ccttgcacaa actccatctg ctgccatgag aaaagggaag 137400
ccgcctttgc aaaacattgc tgcctaaaga aactcagcag cctcaggccc aattctgcca 137460
cttctggttt gggtacagtt aaaggcaacc ctgagggact tggcagtaga aatccagggc 137520
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tcctgaagtt cttgtgccct gctcttcagc accatgggcc ttcttatacg gaaggctctg 137820
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aacaggaaat gatagtatta ataaaagctg gacatcagga ttaacagctc tctctggggc 139080
cctgaaggtg agagttctca gacttgctca tttgcagttg cttctttgtg atgctggcaa 139140
accatcctag tcccattcaa agggcaatac aaagccttgt ggctgacctc acgatgcagc 139200
actcagtttg caagaccggc accagtgtat gcaaacctga gaaggttggg gatgaggata 139260
tgggatcttt catccctgga aatttagtcc agaggcctgg ggctggagca gaacaccaag 139320
ccaatcagct taatgaatgg cttagattcc tgctaggttt gcagagctgc cttctttcct 139380
ttggtacctt attatagatt gaggagtatt tctgctaaac caagataggg ataaccagat 139440
agcatcttca tagcaatgcc acaaaggaaa acaaaaacaa aacagtaatc catcatatta 139500
ttccttagta actatgccaa ggtcatgata ctgaatcctt agattgtttc aaaatactac 139560
ttttctttgc tcttcctgat gtgtttgcca ccgcaggcag atgtttaagt aaaacagatt 139620
ttaactgcag ctacaaaagc agcaacaggc cagcaaaaga gaagtgctat ctcagagagc 139680
atggctttca gagccacaag agacagcctc actggctgtt tcagcttgac tgccatgcaa 139740
agaagagagc agagggagaa ccagccccac ccacttattc atcttgtaca aaaaaaaagc 139800
acctaccagc ctaggctaca tagtgagaca ctatctccac aaaaaaccca cgaaaactag 139860
ctgggtatgg tggcacatgc ctacagtccc agctactggt aaggctgtgg tgggaggatc 139920
tcttgaggcc aggaaggaga tccaggctgc agtgagccaa gattgcacca ctgcactcca 139980
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aaagtgcatc aactgctttc actcaacaaa aagaaaaaag agatgatcaa tgcagatccc 140280
ctctcctcct ggcagccctt accctcagtg aaaagccacc accattctct ctctggtggc 140340
catcagatca acctgcggcg ttcccacaag acagaatgga gattttccaa ggtatagagc 140400
aagtcagagt accccaaaga acggcggcag agagccagct ccgaaactgc caacactacc 140460
atgcatacac agttcagtaa gtcaagaaag gcctggtaca cagcattctg taactttttt 140520
ttttattttt ttcaattttt ccttcttttt tttttttaag cactagtctg tgctttgcga 140580
acagaatcaa gacattaaca aagatcagct tctctgaaga aaagcatttc tatagaacaa 140640
agacagctac atgtttcgct gccattacac agctccaaag caggaaaaga aaatatttac 140700
aaaatacaag gttttttttt tccatttttt gtttttgttt tttttttcaa tgctaaaagg 140760
gttattcaga attttcaacc ttataaatag aagaagcact ttatgcatag ggatatggtg 140820
cattattgta ttttttttta aagaaacaat gacaaaccct ttaacttgca aacagaaaaa 140880
aaaatcacta atgttgaaaa ttgtgaaaaa accccaacca ttaa 140924
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 其它各种序列
<400> 3
atgcatgcat gcatgc 16
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-001167
<400> 4
aaagatgaaa tttgctctta 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-001168
<400> 5
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<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-001169
<400> 6
ggaaagatga aatttgctct 20
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000829
<400> 7
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<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-001170
<400> 8
tggaaagatg aaatttgctc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-001171
<400> 9
ttggaaagat gaaatttgct 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-001172
<400> 10
tttggaaaga tgaaatttgc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-001173
<400> 11
atttggaaag atgaaatttg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-001174
<400> 12
aatttggaaa gatgaaattt 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-001175
<400> 13
caatttggaa agatgaaatt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-001176
<400> 14
tcaatttgga aagatgaaat 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-001177
<400> 15
atcaatttgg aaagatgaaa 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-001178
<400> 16
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<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-001179
<400> 17
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 35
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<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 37
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 40
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<400> 49
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 69
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 74
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 75
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 76
gaactggtta gcccta 16
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 79
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 80
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 81
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<210> 82
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 82
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 83
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 84
aagaggcaca agtcct 16
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000406
<400> 85
agaggcacaa gtcct 15
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 87
caagaggcac aagtc 15
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000443
<400> 88
cccaagaggc acaagt 16
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<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000450
<400> 89
caagaggcac aagt 14
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000321
<400> 94
tggtgaggct gggaat 16
<210> 95
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000226
<400> 95
ctcagtatgg agtagg 16
<210> 96
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000682
<400> 96
aatttcaccc tcagta 16
<210> 97
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000673
<400> 97
ttaatttcac cctcag 16
<210> 98
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000578
<400> 98
cttaatttca ccctca 16
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000540-21
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000540-22
<400> 100
ccttaatttc accctca 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000540-23
<400> 101
ccttaatttc accctca 17
<210> 102
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000540-24
<400> 102
tcccttaatt tcaccct 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000540-25
<400> 103
tcccttaatt tcaccct 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000540-26
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tcccttaatt tcaccct 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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tcccttaatt tcaccct 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000540-28
<400> 106
tcccttaatt tcaccct 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000540-29
<400> 107
tcccttaatt tcaccct 17
<210> 108
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000540-3
<400> 108
cccttaattt caccctc 17
<210> 109
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000540-42
<400> 109
cccttaattt caccctca 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000540-43
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cccttaattt caccctca 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000540-44
<400> 111
cccttaattt caccctca 18
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<211> 18
<212> DNA
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<220>
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<220>
<223> ASO-000540-33
<400> 206
tcccttaatt tcaccct 17
<210> 207
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000540-34
<400> 207
tcccttaatt tcaccct 17
<210> 208
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000540-35
<400> 208
tcccttaatt tcaccct 17
<210> 209
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000540-36
<400> 209
tcccttaatt tcaccct 17
<210> 210
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000540-38
<400> 211
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 213
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 242
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 257
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<400> 267
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 270
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 280
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000522
<400> 281
ctaatcctgt gcttc 15
<210> 282
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000513
<400> 282
cctaatcctg tgctt 15
<210> 283
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000640
<400> 283
tcctaatcct gtgctt 16
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<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000661
<400> 284
ctaatcctgt gctt 14
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000478
<400> 285
gtcctaatcc tgtgct 16
<210> 286
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000500
<400> 286
tcctaatcct gtgct 15
<210> 287
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000601
<400> 287
cctaatcctg tgct 14
<210> 288
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000643
<400> 288
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<210> 289
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000600
<400> 289
gtcctaatcc tgtgc 15
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<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000525
<400> 290
tcctaatcct gtgc 14
<210> 291
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000453
<400> 291
tcagtcctaa tcctgt 16
<210> 292
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000553
<400> 292
cttcagtcct aatcct 16
<210> 293
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000622
<400> 293
gcttcagtcc taatc 15
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 294
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000215
<400> 295
gccagaccag ccacaa 16
<210> 296
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000482
<400> 296
caggagttgt aagc 14
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000337
<400> 297
tgcaggagtt gtaagc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000480
<400> 298
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<210> 299
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000644
<400> 299
gatgcaggag ttgtaa 16
<210> 300
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000695
<400> 300
tgcaggagtt gtaa 14
<210> 301
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 301
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000531
<400> 302
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000651
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 353
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
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<220>
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 377
ctatctagcc caccc 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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tatcctatct agcc 14
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 379
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000230
<400> 380
attgataaag tgagt 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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aactattgat aaagt 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 382
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<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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aaatggaact attgat 16
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000349
<400> 387
gtcaatttaa atgga 15
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<212> DNA
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aatagcaaac aggata 16
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SPC-15667-01
<400> 771
taactttatt tccaaa 16
<210> 772
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SPC-15666-01
<400> 772
ataactttat ttccaa 16
<210> 773
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000118
<400> 773
aataacttta tttcca 16
<210> 774
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SPC-15665-01
<400> 774
aataacttta tttcca 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 775
taataacttt atttcc 16
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<212> DNA
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<220>
<223> SPC-15664-01
<400> 776
taataacttt atttcc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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gtaataactt tatttc 16
<210> 778
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000184
<400> 778
taataacttt atttc 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 779
gtaataactt tattt 15
<210> 780
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000170
<400> 780
agtaataact ttattt 16
<210> 781
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000154
<400> 781
gagtaataac tttatt 16
<210> 782
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000125
<400> 782
agtaataact ttatt 15
<210> 783
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000167
<400> 783
gagtaataac tttat 15
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000134
<400> 784
agagtaataa ctttat 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000175
<400> 785
cagagtaata acttta 16
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000178
<400> 786
agagtaataa cttta 15
<210> 787
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000138
<400> 787
cagagtaata acttt 15
<210> 788
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000171
<400> 788
tcagagtaat aacttt 16
<210> 789
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000236
<400> 789
atcagagtaa taactt 16
<210> 790
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000127
<400> 790
tcagagtaat aactt 15
<210> 791
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000177
<400> 791
cagagtaata actt 14
<210> 792
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000238
<400> 792
aatcagagta ataact 16
<210> 793
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000222
<400> 793
taatcagagt aataac 16
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000307
<400> 794
aatcagagta ataac 15
<210> 795
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000204
<400> 795
ttaatcagag taataa 16
<210> 796
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000330
<400> 796
taatcagagt aataa 15
<210> 797
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000326
<400> 797
tttaatcaga gtaata 16
<210> 798
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-000249
<400> 798
tttaatcaga gtaat 15
<210> 799
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002022
<400> 799
ttatttccaa attcactttt 20
<210> 800
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002026
<400> 800
ttatttccaa attcactttt 20
<210> 801
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002024
<400> 801
ttatttccaa attcactttt 20
<210> 802
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002049
<400> 802
actttatttc caaattcact tttac 25
<210> 803
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASO-002019
<400> 803
actttatttc caaattcact tttac 25
<210> 804
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 其它各种序列
<400> 804
gtgcgtgcgt gcgtgc 16
<210> 805
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 其它各种序列
<400> 805
ctgcctgcct gcctgc

Claims (10)

1.一种测试或测定分子的体内急性神经毒性的方法，所述方法包括体外测量与所述分子接触的神经元细胞中的钙波动。
2.权利要求1的方法，其中与溶媒对照细胞中的钙波动相比，与所述分子接触的神经元细胞中的钙波动为约70%或更高、约75%或更高、约80%或更高、约85%或更高、约90%或更高、约95%或更高、约96%或更高、约97%或更高、约98%或更高、约99%或更高、约100%或更高、约120%或更高、约140%或更高、约160%或更高、约180%或更高、约200%或更高、约220%或更高、约240%或更高或约250%或更高。
3.一种选择或鉴定具有可耐受的体内急性神经毒性的分子的方法，所述方法包括体外测量与所述分子接触的神经元细胞中的钙波动，其中与所述分子接触的神经元细胞显示水平相当于或高于溶媒对照细胞的水平的钙波动。
4.权利要求3的方法，其中与溶媒对照细胞中的钙波动相比，与所述分子接触的神经元细胞中的钙波动为约70%或更高、约75%或更高、约80%或更高、约85%或更高、约90%或更高、约95%或更高、约96%或更高、约97%或更高、约98%或更高、约99%或更高、约100%或更高、约120%或更高、约140%或更高、约160%或更高、约180%或更高、约200%或更高、约220%或更高、约240%或更高或约250%或更高。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述分子包括小分子、多核苷酸、蛋白质、肽或其任何组合。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述钙波动为AMPA受体依赖性钙波动。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述钙波动在Mg2+离子存在下测量。
8.权利要求1或3的方法，其中所述分子包括多核苷酸，所述方法还包括计算序列评分，其中所述序列评分通过下式(I)计算：
(多核苷酸中C核苷酸或其类似物的数目 - 多核苷酸中G核苷酸或其类似物的数目)/ 多核苷酸的总核苷酸长度(数目) (I)。
9.一种测定包含多核苷酸的分子的体内急性神经毒性的方法，所述方法包括计算序列评分，其中所述序列评分通过下式(I)计算：
(多核苷酸中C核苷酸或其类似物的数目 - 多核苷酸中G核苷酸或其类似物的数目)/ 多核苷酸的总核苷酸长度(数目) (I)。
10.一种选择包含具有可耐受的体内急性神经毒性的多核苷酸的分子的方法，所述方法包括应用下式(I)计算序列评分：
(多核苷酸中C核苷酸或其类似物的数目 - 多核苷酸中G核苷酸或其类似物的数目)/ 多核苷酸的总核苷酸长度(数目) (I)，
其中所述多核苷酸具有大于或等于0.2的序列评分。
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