KR20200104302A - 신규 티오포스포르아미다이트 - Google Patents

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마르티나 브리기테 뒤슈말레
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트뢸스 코크
메이링 리
아드리안 쇼이블린
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Abstract

본 발명은 화학식 (II) 또는 (IIb) 의 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00113

Figure pct00114

[식 중, X, Y, Rx, Ry, R5 및 Nu 는 설명 및 청구범위에 정의된 바와 같음].
화학식 (II) 의 화합물은 올리고뉴클레오티드의 제조에 사용될 수 있다.

Description

신규 티오포스포르아미다이트
치료제로서 합성 올리고뉴클레오티드의 사용은 최근 수십 년에 걸쳐 RNase H 활성화 갭머, 스플라이스 스위칭 올리고뉴클레오티드, 마이크로RNA 저해제, siRNA 또는 압타머를 포함한 다양한 메커니즘에 의해 작용하는 분자의 발달로 이어지는 현저한 진보를 목격했다 (S. T. Crooke, Antisense drug technology: principles, strategies, and applications, 2nd ed. ed., Boca Raton, FL: CRC Press, 2008). 그러나, 올리고뉴클레오티드는 생물학적 시스템에서 핵분해에 대해 본질적으로 불안정하다. 뿐만 아니라, 이들은 매우 불리한 약동학적 거동을 나타낸다. 이러한 단점을 개선하기 위해 최근 수십 년 동안 다양한 화학적 개질이 연구되어 왔다. 가장 성공적인 개질 중 하나는 포스포로티오에이트 연결의 도입인데, 여기서 비-가교 포스페이트 산소 원자 중 하나가 황 원자로 대체된다 (F. Eckstein, Antisense and Nucleic Acid Drug Development 2009, 10, 117-121.). 이러한 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드는 증가된 단백질 결합뿐만 아니라 핵분해에 대한 현저하게 보다 높은 안정성을 나타내므로 개질되지 않은 포스포디에스테르 유사체보다 혈장, 조직 및 세포에서 실질적으로 보다 높은 반감기를 나타낸다. 이러한 중요한 특징은 1 세대 올리고뉴클레오티드 치료제의 개발을 가능하게 했을 뿐만 아니라 잠금 핵산 (LNA) 과 같은 차세대 개질을 통해 추가 개선을 위한 문을 열었다. 그러나, 포스포디에스테르 연결을 포스포로티오에이트로 대체하면, 인 원자에 카이랄 중심이 생성된다. 그 결과, 모든 승인된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 치료제는 다량의 부분입체 이성질체 화합물의 혼합물로서 사용되며, 이들은 모두 잠재적으로 상이한 (및 가능하게는 반대되는) 물리화학적 및 약리학적 특성을 갖는다.
단일 입체 화학적으로 정의된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 입체 특이적 합성이 이제 가능하지만 (N. Oka, M. Yamamoto, T. Sato, T. Wada, J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 16031-16037), 다수의 가능한 부분입체 이성질체 내에서 최적의 특성을 갖는 입체 이성질체를 확인하는 것은 여전히 어려운 과제이다. 이와 관련하여, 비-카이랄 티오포스페이트 연결의 사용에 의한 부분입체 이성질체 복잡성의 감소가 큰 관심 대상이다. 예를 들어, 포스페이트 연결 내의 둘 모두의 비-가교 산소 원자가 황으로 대체된 대칭 비-가교 디티오에이트 개질 (예를 들어 W. T. Wiesler, M. H. Caruthers, J. Org. Chem. 1996, 61, 4272-4281 참조) 은 면역 자극 올리고뉴클레오티드 (A. M. Krieg, S. Matson, E. Fisher, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1996, 6, 133-139), siRNA (예를 들어 X. Yang, M. Sierant, M. Janicka, L. Peczek, C. Martinez, T. Hassell, N. Li, X. Li, T. Wang, B. Nawrot, ACS Chem. Biol. 2012, 7, 1214-1220) 및 압타머 (예를 들어 X. Yang, S. Fennewald, B. A. Luxon, J. Aronson, N. K. Herzog, D. G. Gorenstein, Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999, 9, 3357-3362) 에 적용되었다. 흥미롭게도, 안티센스 올리고뉴클레오티드와 관련하여 이러한 비-카이랄 개질을 사용하려는 시도는 현재까지 제한된 성공을 거두었다 (예를 들어 M. K. Ghosh, K. Ghosh, O. Dahl, J. S. Cohen, Nucleic Acids Res. 1993, 21, 5761-5766. 및 J. P. Vaughn, J. Stekler, S. Demirdji, J. K. Mills, M. H. Caruthers, J. D. Iglehart, J. R. Marks, Nucleic Acids Res. 1996, 24, 4558-4564 참조).
놀랍게도, 본 발명자들은 비-가교 포스포로디티오에이트가 올리고뉴클레오티드, 특히 올리고뉴클레오티드 갭머 또는 믹스머 일반적으로 및 LNA-DNA-LNA 갭머 또는 특히 LNA/DNA 믹스머에 도입될 수 있음을 발견하였다. 개질은 매우 내성이며 생성된 분자는 치료 적용에 큰 잠재력을 나타내지만, 모든 비-가교 포스포로디티오에이트 개질은 가능한 부분입체 이성질체의 전체 라이브러리 크기를 50% 줄인다. 개질이 갭머의 LNA 플랭크에 위치될 때, 생성된 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 상응하는 모든 포스포로티오에이트 모체보다 더 강력한 것으로 밝혀졌다. 일반적으로, 개질은 갭 영역 내에서 추가로 매우 내성이며 더욱 놀랍게도 적절하게 위치될 때 개선된 효능을 야기할 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 놀랍게도 본 발명이 예를 들어 개선된 효능을 포함하여 개선된 물리 화학적 및 약리학적 특성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 제공한다는 것을 발견하였다. 일부 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 활성 또는 효능을 보유하며, 화학식 (IA 또는 IB) 의 포스포디티오에이트 연결이 통상적인 입체 랜덤 포스포로티오에이트 연결로 대체된 동일한 화합물 (포스포로티오에이트 기준 화합물) 만큼 강력할 수 있거나 또는 보다 강력하다. 비-가교 포스포로디티오에이트 개질의 모든 도입은 인에서 카이랄 중심 중 하나를 제거함으로써 화합물의 부분입체 이성질체 복잡성을 50% 감소시킨다. 또한, 디티오에이트 개질이 도입될 때마다, 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 세포, 특히 간세포, 근육 세포, 심장 세포로 극적으로 더 잘 흡수되는 것으로 보인다.
갭머의 LNA 플랭크에의 비-가교 디티오에이트 개질의 도입은 특히 유리한 것으로 보이며, 분자가 더 높은 표적 감소 및 실질적으로 더 우수한 흡수 거동, 더 높은 안정성 및 양호한 안전 프로파일을 나타내는 것으로 이끈다.
올리고뉴클레오티드에서 비-가교 포스포로디티오에이트 연결의 화합적 합성은 적절한 티오포스포르아미다이트 빌딩 블록을 사용하는 고체 상 올리고뉴클레오티드 합성 기술에 의해 가장 잘 달성된다. 이러한 티오포스포르아미다이트의 성공적인 적용은 일반 DNA (X. Yang, Curr Protoc Nucleic Acid Chem 2016, 66, 4.71.71-74.71.14.) 뿐만 아니라 RNA (X. Yang, Curr Protoc Nucleic Acid Chem 2017, 70, 4.77.71-74.77.13.) 에 대하여 기술되어 왔으며 필요한 빌딩 블록은 상업적 공급원으로부터 입수 가능하다. 흥미롭게도, 상응하는 LNA 티오포스포르아미다이트의 더욱 도전적인 합성은 보고되지 않았다. 본 출원에서, 본 발명자들은 또한 모든 4 개의 LNA 티오포스포르아미다이트의 성공적인 합성 및 올리고뉴클레오티드로의 이들의 혼입을 보고한다.
본 발명은 화학식 (I) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다:
Figure pct00001
식 중, 2 개의 산소 원자 중 하나는 인접 뉴클레오시드 (A1) 의 3'탄소 원자에 연결되고 다른 하나는 또 다른 인접 뉴클레오시드 (A2) 의 5'탄소 원자에 연결되고, 이때 2 개의 뉴클레오시드 (A1) 및 (A2) 중 적어도 하나는 LNA 뉴클레오시드이고, R 은 수소 또는 포스페이트 보호기이다. 본 발명은 또한 특히 화학식 (I) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 갭머 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 제조 방법 및 특히 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 제조에 유용한 LNA 뉴클레오시드 단량체에 관한 것이다.
본 발명은 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다:
Figure pct00002
식 중, 2 개의 산소 원자 중 하나는는 인접 뉴클레오시드 (A1) 의 3'탄소 원자에 연결되고 다른 하나는 또 다른 인접 뉴클레오시드 (A2) 의 5'탄소 원자에 연결되고, (IA) 에서 R 은 수소 또는 포스페이트 보호기이고, (IB) 에서 M+ 은 양이온, 예컨대 금속 양이온, 예컨대 알칼리금속 양이온, 예컨대 Na+ 또는 K+ 양이온이거나; 또는 M+ 은 암모늄 양이온이다.
대안적으로 언급된 M 은 금속, 예컨대 알칼리금속, 예컨대 Na 또는 K 이거나; 또는 M 은 NH4 이다.
본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 화학식 IA 또는 IB 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드이며, 이는 하나 이상의 2'당 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 하나 이상의 LNA 뉴클레오시드 또는 하나 이상의 2' MOE 뉴클레오시드를 포함한다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 생체내 또는 시험관내에서 표적 RNA 를 발현하는 세포에서 표적 핵산, 예컨대 표적 pre-mRNA, 또는 표적 마이크로RNA 의 발현을 조절할 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 추가로 포함한다. 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 갭머 올리고뉴클레오티드, 믹스머 올리고뉴클레오티드 또는 토탈머 올리고뉴클레오티드의 형태일 수 있다. 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드 믹스머는 표적 pre-mRNA 에서 스플라이싱 이벤트를 조절하는데 사용될 수 있다. 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드 믹스머는 표적 마이크로RNA 의 발현을 저해하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 치료제로서 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드와 같은 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 특히 화학식 (IA 또는 IB) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 믹스머 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 특히 화학식 (IA 또는 IB) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 토탈머 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 제조 방법 및 특히 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 제조에 유용한 LNA 뉴클레오시드 단량체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 제조 방법 및 특히 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 제조에 유용한 MOE 뉴클레오시드 단량체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 제조에 사용될 수 있는 신규 MOE 및 LNA 단량체를 제공한다.
올리고뉴클레오티드 합성 동안, 보호 R 기가 종종 사용된다. 올리고뉴클레오티드 합성 후, 예를 들어 올리고뉴클레오티드가 염의 형태인 경우 보호기는 전형적으로 수소 원자 또는 양이온, 예컨대 알칼리금속 또는 암모늄 양이온으로 교환된다. 염은 전형적으로 양이온, 예컨대 금속 양이온, 예를 들어 소듐 또는 포타슘 양이온 또는 암모늄 양이온을 함유한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관련하여, 바람직하게는 R 은 수소이거나, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 염의 형태이다 (IB 에 도시된 바와 같음).
화학식 (IB) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 예를 들어 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00003
식 중, M+ 은 양이온, 예컨대 금속 양이온, 예컨대 알칼리금속 양이온, 예컨대 Na+ 또는 K+ 양이온이거나; 또는 M+ 은 암모늄 양이온이다. 따라서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 염, 알칼리금속 염, 예컨대 소듐 염, 포타슘 염 또는 암모늄 염의 형태일 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 화학식 IA' 또는 IB' 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함할 수 있다:
Figure pct00004
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본 발명은 또한 특히 화학식 IA 또는 IB, 또는 화학식 IA' 또는 화학식 IB' 에 대하여 화학식 (I) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 갭머 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 특히 화학식 IA 또는 IB, 또는 화학식 IA' 또는 화학식 IB' 에 대하여 화학식 (I) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 믹스머 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 특히 화학식 IA 또는 IB, 또는 화학식 IA' 또는 화학식 IB' 에 대하여 화학식 (I) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 토탈머 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 바람직한 구현예에서, 2 개의 뉴클레오시드 (A1) 및 (A2) 중 적어도 하나는 LNA 뉴클레오시드이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 바람직한 구현예에서, 2 개의 뉴클레오시드 (A1) 및 (A2) 중 적어도 하나는 2'-O-MOE 뉴클레오시드이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 바람직한 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드이고, 2 개의 뉴클레오시드 (A1) 및 (A2) 중 적어도 하나는 LNA 뉴클레오시드이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 바람직한 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드이고, 2 개의 뉴클레오시드 (A1) 및 (A2) 중 적어도 하나는 2'-O-MOE 뉴클레오시드이다.
본 발명은 세포에서 표적 RNA 를 저해하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하고, 안티센스 갭머 올리고뉴클레오티드는 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함한다:
Figure pct00005
(IA) 에서 R 은 수소 또는 포스페이트 보호기이고, (IB) 에서 M+ 은 양이온, 예컨대 금속 양이온, 예컨대 알칼리금속 양이온, 예컨대 Na+ 또는 K+ 양이온이거나; 또는 M+ 은 암모늄 양이온이고, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 안티센스 갭머 올리고뉴클레오티드 (본원에서 갭머 또는 갭머 올리고뉴클레오티드로 지칭됨) 이거나 이를 포함한다.
따라서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 갭머를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
본 발명은 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다:
Figure pct00006
식 중, 2 개의 산소 원자 중 하나는 인접 뉴클레오시드 (A1) 의 3'탄소 원자에 연결되고 다른 하나는 또 다른 인접 뉴클레오시드 (A2) 의 5'탄소 원자에 연결되고, 이때 2 개의 뉴클레오시드 (A1) 및 (A2) 중 적어도 하나는 LNA 뉴클레오시드이고, (IA) 에서 R 은 수소 또는 포스페이트 보호기이고, (IB) 에서 M+ 은 양이온, 예컨대 금속 양이온, 예컨대 알칼리금속 양이온, 예컨대 Na+ 또는 K+ 양이온이거나; 또는 M+ 은 암모늄 양이온이고, A2 는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 뉴클레오시드이다.
본 발명은 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다:
Figure pct00007
식 중, 2 개의 산소 원자 중 하나는 인접 뉴클레오시드 (A1) 의 3'탄소 원자에 연결되고 다른 하나는 또 다른 인접 뉴클레오시드 (A2) 의 5'탄소 원자에 연결되고, 이때 2 개의 뉴클레오시드 (A1) 및 (A2) 중 적어도 하나는 LNA 뉴클레오시드이고, (IA) 에서 R 은 수소 또는 포스페이트 보호기이고, (IB) 에서 M+ 은 양이온, 예컨대 금속 양이온, 예컨대 알칼리금속 양이온, 예컨대 Na+ 또는 K+ 양이온이거나; 또는 M+ 은 암모늄 양이온이고, A1 은 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 뉴클레오시드이다.
본 발명은 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다:
Figure pct00008
식 중, 2 개의 산소 원자 중 하나는 인접 뉴클레오시드 (A1) 의 3'탄소 원자에 연결되고 다른 하나는 또 다른 인접 뉴클레오시드 (A2) 의 5'탄소 원자에 연결되고, 이때 2 개의 뉴클레오시드 (A1) 및 (A2) 중 적어도 하나는 2-O-MOE 뉴클레오시드이고, (IA) 에서 R 은 수소 또는 포스페이트 보호기이고, (IB) 에서 M+ 은 양이온, 예컨대 금속 양이온, 예컨대 알칼리금속 양이온, 예컨대 Na+ 또는 K+ 양이온이거나; 또는 M+ 은 암모늄 양이온이고, A2 는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 뉴클레오시드이다.
본 발명은 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다:
Figure pct00009
식 중, 2 개의 산소 원자 중 하나는 인접 뉴클레오시드 (A1) 의 3'탄소 원자에 연결되고 다른 하나는 또 다른 인접 뉴클레오시드 (A2) 의 5'탄소 원자에 연결되고, 이때 2 개의 뉴클레오시드 (A1) 및 (A2) 중 적어도 하나는 2-O-MOE 뉴클레오시드이고, (IA) 에서 R 은 수소 또는 포스페이트 보호기이고, (IB) 에서 M+ 은 양이온, 예컨대 금속 양이온, 예컨대 알칼리금속 양이온, 예컨대 Na+ 또는 K+ 양이온이거나; 또는 M+ 은 암모늄 양이온이고, A1 은 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 뉴클레오시드이다.
본 발명은 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다:
Figure pct00010
식 중, 2 개의 산소 원자 중 하나는 인접 뉴클레오시드 (A1) 의 3'탄소 원자에 연결되고 다른 하나는 또 다른 인접 뉴클레오시드 (A2) 의 5'탄소 원자에 연결되고, 이때 2 개의 뉴클레오시드 (A1) 및 (A2) 중 적어도 하나는 2' 당 개질된 뉴클레오시드이고, (IA) 에서 R 은 수소 또는 포스페이트 보호기이고, (IB) 에서 M+ 은 양이온, 예컨대 금속 양이온, 예컨대 알칼리금속 양이온, 예컨대 Na+ 또는 K+ 양이온이거나; 또는 M+ 은 암모늄 양이온이고, A2 는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 뉴클레오시드이다.
본 발명은 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다:
Figure pct00011
식 중, 2 개의 산소 원자 중 하나는 인접 뉴클레오시드 (A1) 의 3'탄소 원자에 연결되고 다른 하나는 또 다른 인접 뉴클레오시드 (A2) 의 5'탄소 원자에 연결되고, 이때 2 개의 뉴클레오시드 (A1) 및 (A2) 중 적어도 하나는 2' 당 개질된 뉴클레오시드이고, (IA) 에서 R 은 수소 또는 포스페이트 보호기이고, (IB) 에서 M+ 은 양이온, 예컨대 금속 양이온, 예컨대 알칼리금속 양이온, 예컨대 Na+ 또는 K+ 양이온이거나; 또는 M+ 은 암모늄 양이온이고, A1 은 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 뉴클레오시드이다.
2' 당 개질된 뉴클레오시드는 2'-알콕시-RNA, 2'-알콕시알콕시-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA, 2'-플루오로-ANA 및 LNA 뉴클레오시드로 이루어진 군으로부터 선택되는 2' 당 개질된 뉴클레오시드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
본 발명은 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 적어도 하나의 단일 가닥 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다:
Figure pct00012
식 중, 2 개의 산소 원자 중 하나는 인접 뉴클레오시드 (A1) 의 3'탄소 원자에 연결되고 다른 하나는 또 다른 인접 뉴클레오시드 (A2) 의 5'탄소 원자에 연결되고, (IA) 에서 R 은 수소 또는 포스페이트 보호기이고, (IB) 에서 M+ 은 양이온, 예컨대 금속 양이온, 예컨대 알칼리금속 양이온, 예컨대 Na+ 또는 K+ 양이온이거나; 또는 M+ 은 암모늄 양이온이고, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결, (Sp, S) 또는 (Rp, R) 을 추가로 포함한다:
Figure pct00013
식 중, N1 및 N2 는 뉴클레오시드이다.
본 발명은 또한 세포에서 RNA 표적의 조절을 위한 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하고, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 길이가 10 - 30 개의 뉴클레오티드인 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 인접 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 2'당 개질된 뉴클레오시드를 포함하고, 인접 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오시드 사이에 존재하는 뉴클레오시드간 연결 중 적어도 하나는 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 연결이다:
Figure pct00014
식 중, 2 개의 산소 원자 중 하나는 인접 뉴클레오시드 (A1) 의 3'탄소 원자에 연결되고 다른 하나는 또 다른 인접 뉴클레오시드 (A2) 의 5'탄소 원자에 연결되고, R 은 수소 또는 포스페이트 보호기이다.
본 발명은 또한 세포에서 RNA 표적의 조절을 위한 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하고, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 길이가 10 - 30 개의 뉴클레오티드인 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 인접 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 2'당 개질된 뉴클레오시드를 포함하고, 인접 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오시드 사이에 존재하는 뉴클레오시드간 연결 중 적어도 하나는 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 연결이다:
Figure pct00015
식 중, 2 개의 산소 원자 중 하나는 인접 뉴클레오시드 (A1) 의 3'탄소 원자에 연결되고 다른 하나는 또 다른 인접 뉴클레오시드 (A2) 의 5'탄소 원자에 연결되고; (IA) 에서 R 은 수소 또는 포스페이트 보호기이고, (IB) 에서 M+ 은 양이온, 예컨대 금속 양이온, 예컨대 알칼리금속 양이온, 예컨대 Na+ 또는 K+ 양이온이거나; 또는 M+ 은 암모늄 양이온이고, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드는 pre-mRNA 표적 RNA 의 스플라이싱을 조절하는데 사용된다.
본 발명은 또한 세포에서 RNA 표적의 조절을 위한 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하고, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 길이가 10 - 30 개의 뉴클레오티드인 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 인접 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 2'당 개질된 뉴클레오시드를 포함하고, 인접 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오시드 사이에 존재하는 뉴클레오시드간 연결 중 적어도 하나는 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 연결이다:
Figure pct00016
식 중, 2 개의 산소 원자 중 하나는 인접 뉴클레오시드 (A1) 의 3'탄소 원자에 연결되고 다른 하나는 또 다른 인접 뉴클레오시드 (A2) 의 5'탄소 원자에 연결되고; (IA) 에서 R 은 수소 또는 포스페이트 보호기이고, (IB) 에서 M+ 은 양이온, 예컨대 금속 양이온, 예컨대 알칼리금속 양이온, 예컨대 Na+ 또는 K+ 양이온이거나; 또는 M+ 은 암모늄 양이온이고, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드는 긴 비-코팅 RNA 의 발현을 저해하는데 사용된다. 본 발명의 화합물에 의해 표적화될 수 있는 lncRNA 의 예는 WO 2012/065143 참조.
본 발명은 또한 세포에서 RNA 표적의 조절을 위한 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하고, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 길이가 10 - 30 개의 뉴클레오티드인 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 인접 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 2'당 개질된 뉴클레오시드를 포함하고, 인접 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오시드 사이에 존재하는 뉴클레오시드간 연결 중 적어도 하나는 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 연결이다:
Figure pct00017
식 중, 2 개의 산소 원자 중 하나는 인접 뉴클레오시드 (A1) 의 3'탄소 원자에 연결되고 다른 하나는 또 다른 인접 뉴클레오시드 (A2) 의 5'탄소 원자에 연결되고; (IA) 에서 R 은 수소 또는 포스페이트 보호기이고, (IB) 에서 M+ 은 양이온, 예컨대 금속 양이온, 예컨대 알칼리금속 양이온, 예컨대 Na+ 또는 K+ 양이온이거나; 또는 M+ 은 암모늄 양이온이고, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인간 mRNA 또는 pre-mRNA 표적의 발현을 저해하는데 사용된다.
본 발명은 또한 세포에서 RNA 표적의 조절을 위한 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하고, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 길이가 10 - 30 개의 뉴클레오티드인 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 인접 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 2'당 개질된 뉴클레오시드를 포함하고, 인접 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오시드 사이에 존재하는 뉴클레오시드간 연결 중 적어도 하나는 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 연결이다:
Figure pct00018
식 중, 2 개의 산소 원자 중 하나는 인접 뉴클레오시드 (A1) 의 3'탄소 원자에 연결되고 다른 하나는 또 다른 인접 뉴클레오시드 (A2) 의 5'탄소 원자에 연결되고; (IA) 에서 R 은 수소 또는 포스페이트 보호기이고, (IB) 에서 M+ 은 양이온, 예컨대 금속 양이온, 예컨대 알칼리금속 양이온, 예컨대 Na+ 또는 K+ 양이온이거나; 또는 M+ 은 암모늄 양이온이고, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드는 바이러스 RNA 표적의 발현을 저해하는데 사용된다. 적합한 바이러스 RNA 표적은 예를 들어 HCV 또는 HBV 일 수 있다.
본 발명은 또한 세포에서 RNA 표적의 조절을 위한 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하고, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 길이가 7 - 30 개의 뉴클레오티드인 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 인접 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 2'당 개질된 뉴클레오시드를 포함하고, 인접 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오시드 사이에 존재하는 뉴클레오시드간 연결 중 적어도 하나는 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 연결이다:
Figure pct00019
식 중, 2 개의 산소 원자 중 하나는 인접 뉴클레오시드 (A1) 의 3'탄소 원자에 연결되고 다른 하나는 또 다른 인접 뉴클레오시드 (A2) 의 5'탄소 원자에 연결되고; (IA) 에서 R 은 수소 또는 포스페이트 보호기이고, (IB) 에서 M+ 은 양이온, 예컨대 금속 양이온, 예컨대 알칼리금속 양이온, 예컨대 Na+ 또는 K+ 양이온이거나; 또는 M+ 은 암모늄 양이온이고, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드는 마이크로RNA 의 발현을 저해하는데 사용된다.
RNA 표적, 예를 들어 pre-mRNA 표적, mRNA 표적, 바이러스 RNA 표적, 마이크로RNA 또는 긴 비-코딩 RNA 표적을 표적화하기 위해, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA 의 발현을 적합하게 저해할 수 있다. 이는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 표적 RNA 사이의 상보성에 의해 달성된다. RNA 표적의 저해는 RNA 표적의 수준을 감소시키거나 RNA 표적의 기능을 차단함으로써 달성될 수 있다. RNA 표적의 RNA 저해는 적합하게 예를 들어 갭머의 사용을 통해 세포 RNAse, 예컨대 RNaseH 의 동원을 통해 달성될 수 있거나, 또는 비-뉴클레아제 매개 메커니즘, 예컨대 입체 차단 메커니즘 (예컨대 마이크로RNA 저해, pre-mRNA 의 스플라이스 조절, 또는 긴 비-코딩 RNA 와 크로마틴 사이의 상호 작용 차단) 을 통해 달성될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 제조 방법 및 특히 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 제조에 유용한 LNA 또는 MOE 뉴클레오시드 단량체에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 약학적으로 허용되는 염, 또는 이의 컨쥬게이트, 특히 소듐 또는 포타슘 염 또는 암모늄 염을 제공한다.
본 발명은 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 컨쥬게이트, 및 임의로 링커 모이어티를 통해 상기 올리고뉴클레오티드 또는 상기 약학적으로 허용되는 염에 공유 부착된 적어도 하나의 컨쥬게이트 모이어티를 제공한다.
본 발명은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드, 약학적으로 허용되는 염 또는 컨쥬게이트 및 치료적으로 불활성인 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 치료적으로 활성인 물질로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드, 약학적으로 허용되는 염 또는 컨쥬게이트를 제공한다.
본 발명은 RNA 를 발현하는 세포에서 표적 RNA 의 조절 방법을 제공하고, 상기 방법은 유효량의 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드, 약학적으로 허용되는 염, 컨쥬게이트 또는 조성물을 세포에 투여하는 단계를 포함하고, 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA 에 상보적이다.
본 발명은 표적 pre-mRNA 를 발현하는 세포에서 표적 pre-RNA 의 스플라이싱 조절 방법을 제공하고, 상기 방법은 유효량의 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드, 약학적으로 허용되는 염, 컨쥬게이트 또는 조성물을 세포에 투여하는 단계를 포함하고, 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA 에 상보적이고 pre-mRNA 에서 스플라이싱 이벤트를 조절할 수 있다.
본 발명은 세포, 예컨대 인간 세포에서 pre-mRNA, mRNA, 또는 긴 비-코딩 RNA 의 저해를 위한 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 약학적 염, 컨쥬게이트, 또는 조성물의 용도를 제공한다.
상기 방법 또는 용도는 시험관내 방법 또는 생체내 방법일 수 있다.
본 발명은 약제의 제조에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 약학적 염, 컨쥬게이트, 또는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 단일 가닥 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드의 시험관내 또는 생체내 안정성을 향상시키기 위해 사용하기 위한 화학식 IA 또는 IB 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결의 용도를 제공한다.
본 발명은 단일 가닥 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드의 시험관내 또는 생체내 작용 기간을 향상시키기 위해 사용하기 위한 화학식 IA 또는 IB 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결의 용도를 제공한다.
본 발명은 단일 가닥 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드의 세포 흡수 또는 조직 분포를 향상시키기 위해 사용하기 위한 화학식 IA 또는 IB 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결의 용도를 제공한다.
본 발명은 골격근, 심장, 망막 상피 세포를 포함하는 상피 세포 (예를 들어 Htra1 표적화 화합물에 대하여), 간, 신장, 또는 비장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조직에의 단일 가닥 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드의 흡수를 향상시키기 위해 사용하기 위한 화학식 IA 또는 IB 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결의 용도를 제공한다.
생체내 사용을 위해 단일 가닥 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드는 치료용 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
도 1-4 는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 투여 24 시간 및 74 시간 후 1차 랫트 간세포에서의 표적 mRNA 수준을 도시한다.
도 1 은 갭에서 본 발명에 따른 단일 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드 간 연결을 갖는 올리고뉴클레오티드 갭머의 24 및 74 시간의 투여 후 1차 랫트 간세포에서의 표적 mRNA 수준을 보여준다.
도 2 는 갭에서 본 발명에 따른 다수의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 갖는 올리고뉴클레오티드 갭머의 24 및 74 시간의 투여 후 1차 랫트 간세포에서의 표적 mRNA 수준을 보여준다.
도 3 은 갭에서 본 발명에 따른 다수의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 갖는 올리고뉴클레오티드 갭머의 24 및 74 시간의 투여 후 1차 랫트 간세포에서의 표적 mRNA 수준을 보여준다.
도 4 는 플랭크에서 본 발명에 따른 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 갖는 올리고뉴클레오티드 갭머의 24 및 74 시간의 투여 후 1차 랫트 간세포에서의 표적 mRNA 수준을 보여준다.
도 5 는 RNA 및 DNA 에 하이브리드화된 본 발명에 따른 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 함유하는 올리고뉴클레오티드의 열 용융 (Tm) 을 나타낸다.
도 6 은 랫트 혈청에서 본 발명에 따른 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 함유하는 올리고뉴클레오티드의 안정성을 나타낸다.
도 7: 갭머의 갭 및 플랭크 영역에서 아카이랄 포스포디티오에이트의 탐색 - 1차 랫트 간세포의 처리 후 잔류 mRNA 수준.
도 8: 갭머의 갭 영역에서 아카이랄 포스포디티오에이트의 위치 의존성 및 최적화 탐색 - 1차 랫트 간세포의 처리 후 잔류 mRNA 수준.
도 9A 및 9B: 갭머의 갭 영역에서 아카이랄 포스포디티오에이트의 탐색 - 세포 흡수에 대한 효과.
도 10A 및 10B: 갭머의 플랭크 영역에의 아카이랄 포스포로디티오에이트의 도입은 증가된 효능을 갖는 포스포로티오에이트 로드 사이의 상관 관계와 함께 증가된 효능을 제공한다 (4 연결 > 3 연결 >2 연결 >1 연결>플랭크에 포스포로디티오에이트 연결 없음).
도 11: 상이한 세포 유형에서의 IC50 값
도 12: 3' 말단 보호된 LNA 올리고뉴클레오티드의 시험관내 랫트 혈청 안정성.
도 13: 플랭크 및 갭 영역에 아카이랄 포스포로디티오에이트 연결을 함유하는 갭머의 생체내 평가 - 표적 저해.
도 14A: 플랭크 및 갭 영역에 아카이랄 포스포로디티오에이트 연결을 함유하는 갭머의 생체내 평가 - 조직 흡수.
도 14B: 플랭크 및 갭 영역에 아카이랄 포스포로디티오에이트 연결을 함유하는 갭머의 생체내 평가 - 간/신장 비.
도 15A 및 15B: 플랭크 및 갭 영역에 아카이랄 포스포로디티오에이트 연결을 함유하는 갭머의 생체내 평가 - 대사 산물 분석.
도 16: 아카이랄 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 지속되는 작용 기간은 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결과의 조합에 의해 추가로 향상될 수 있다.
도 17A: MALAT-1 을 표적으로 하는 아카이랄 포스포로디티오에이트 갭머의 시험관내 EC50 측정.
도 17B: MALAT-1 을 표적으로 하는 아카이랄 포스포로디티오에이트 갭머의 생체내 효능.
도 17C: MALAT-1 을 표적으로 하는 아카이랄 포스포로디티오에이트 갭머의 생체내 연구 - 조직 함량
도 18A: ApoB 를 표적으로 하는 아카이랄 모노포스포로티오에이트 개질된 갭머 올리고뉴클레오티드의 시험관내 연구. 활성 데이터.
도 18B: ApoB 를 표적으로 하는 아카이랄 모노포스포로티오에이트 개질된 갭머 올리고뉴클레오티드의 시험관내 연구. 세포 함량 데이터.
도 19A: ApoB 를 표적으로 하는 카이랄 포스포로디티오에이트 개질된 갭머 올리고뉴클레오티드의 시험관내 연구. 활성 데이터.
도 19B: ApoB 를 표적으로 하는 카이랄 포스포로디티오에이트 개질된 갭머 올리고뉴클레오티드의 시험관내 연구. 세포 함량 데이터.
도 20: TNFRSF1B 의 3'스플라이스 부위를 표적으로 하는 스플라이스-스위칭 올리고뉴클레오티드에 존재하는 아카이랄 포스포로디티오에이트 (P2S) 뉴클레오시드간 연결의 효과. 인간 Colo 205 세포를 96 웰 플레이트에 시딩하고 각각 5 μM (A) 및 25 μM (B) 의 올리고에 적용하였다. 엑손 7 스키핑의 백분율을 엑손 6-8 접합부를 표적으로 하는 프로브를 사용하여 액적 디지털 PCR 에 의해 분석하고 엑손 2-3 을 표적으로 하는 검정에 의해 TNFRSF1B 의 총량과 비교하였다. SSO#26 은 모체 올리고이고, SSO#27 은 TNFRSF1B 를 표적으로 하지 않는 음성 대조군이다.
도 21: S1 뉴클레아제를 사용한 안정성 분석. 디티오에이트 함유 올리고를 각각 30 분 및 120 분 동안 S1 뉴클레아제와 배양하였다. 올리고를 15% TBE-우레아 겔에서 시각화하였다. 온전한 올리고 (SSO#14) 의 이동의 마커로서 S1 뉴클레아제에 적용하지 않고 포함시켰다.
정의
본 명세서에서 용어 "알킬" 은 단독으로 또는 조합으로 1 내지 8 개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬 기, 특히 1 내지 6 개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬 기 및 보다 특히 1 내지 4 개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬 기를 의미한다. 직쇄 및 분지쇄 C1-C8 알킬 기의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, tert.-부틸, 이성질체 펜틸, 이성질체 헥실, 이성질체 헵틸 및 이성질체 옥틸, 특히 메틸, 에틸, 프로필, 부틸 및 펜틸이다. 알킬의 특정 예는 메틸, 에틸 및 프로필이다.
용어 "시클로알킬" 은 단독으로 또는 조합으로 3 내지 8 개의 탄소 원자를 갖는 시클로알킬 고리 및 특히 3 내지 6 개의 탄소 원자를 갖는 시클로알킬 고리를 의미한다. 시클로알킬의 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸 및 시클로옥틸, 보다 특히 시클로프로필 및 시클로부틸이다. "시클로알킬" 의 특정 예는 시클로프로필이다.
용어 "알콕시" 는 단독으로 또는 조합으로 화학식 알킬-O- 의 기를 의미하며, 여기서 용어 "알킬" 은 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, sec.부톡시 및 tert.부톡시와 같은 앞서 주어진 의미를 갖는다. 특정 "알콕시" 는 메톡시 및 에톡시이다. 메톡시에톡시는 "알콕시알콕시" 의 특정 예이다.
용어 "옥시" 는 단독으로 또는 조합으로 -O- 기를 의미한다.
용어 "알케닐" 은 단독으로 또는 조합으로 올레핀 결합 및 8 개 이하, 바람직하게는 6 개 이하, 특히 바람직하게는 4 개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 잔기를 의미한다. 알케닐 기의 예는 에테닐, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 이소프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 3-부테닐 및 이소부테닐이다.
용어 "알키닐" 은 단독으로 또는 조합으로 삼중 결합 및 8 개 이하, 특히 2 개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 잔기를 의미한다.
용어 "할로겐" 또는 "할로" 는 단독으로 또는 조합으로 불소, 염소, 브롬 또는 요요드 및 특히 불소, 염소 또는 브롬, 보다 특히 불소를 의미한다. 용어 "할로" 는 다른 기와 조합으로 적어도 1 개의 할로겐, 특히 1 내지 5 개의 할로겐, 특히 1 내지 4 개의 할로겐, 즉 1, 2, 3 또는 4 개의 할로겐으로 치환된 상기 기의 치환을 의미한다.
용어 "할로알킬" 은 단독으로 또는 조합으로 적어도 1 개의 할로겐으로 치환된, 특히 1 내지 5 개의 할로겐, 특히 1 내지 3 개의 할로겐으로 치환된 알킬 기를 의미한다. 할로알킬의 예는 모노플루오로-, 디플루오로- 또는 트리플루오로-메틸, -에틸 또는 -프로필, 예를 들어 3,3,3-트리플루오로프로필, 2-플루오로에틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 플루오로메틸 또는 트리플루오로메틸을 포함한다. 플루오로메틸, 디플루오로메틸 및 트리플루오로메틸이 특정 "할로알킬" 이다.
용어 "할로시클로알킬" 은 단독으로 또는 조합으로 적어도 1 개의 할로겐으로 치환된, 특히 1 내지 5 개의 할로겐, 특히 1 내지 3 개의 할로겐으로 치환된 상기 정의된 바와 같은 시클로알킬 기를 의미한다. "할로시클로알킬" 의 특정 예는 할로시클로프로필, 특히 플루오로시클로프로필, 디플루오로시클로프로필 및 트리플루오로시클로프로필이다.
용어 "하이드록실" 및 "하이드록시" 는 단독으로 또는 조합으로 -OH 기를 의미한다.
용어 "티오하이드록실" 및 "티오하이드록시" 는 단독으로 또는 조합으로 -SH 기를 의미한다.
용어 "카르보닐" 은 단독으로 또는 조합으로 -C(O)- 기를 의미한다.
용어 "카복시" 또는 "카르복실" 은 단독으로 또는 조합으로 -COOH 기를 의미한다.
용어 "아미노" 는 단독으로 또는 조합으로 1차 아미노 기 (-NH2), 2차 아미노 기 (-NH-), 또는 3차 아미노 기 (-N-) 를 의미한다.
용어 "알킬아미노" 는 단독으로 또는 조합으로 상기 정의된 바와 같은 1 또는 2 개의 알킬 기로 치환된 상기 정의된 바와 같은 아미노 기를 의미한다.
용어 "설포닐" 은 단독으로 또는 조합으로 -SO2 기를 의미한다.
용어 "설피닐" 은 단독으로 또는 조합으로 -SO- 기를 의미한다.
용어 "설파닐" 은 단독으로 또는 조합으로 -S- 기를 의미한다.
용어 "시아노" 는 단독으로 또는 조합으로 -CN 기를 의미한다.
용어 "아지도" 는 단독으로 또는 조합으로 -N3 기를 의미한다.
용어 "니트로" 는 단독으로 또는 조합으로 NO2 기를 의미한다.
용어 "포르밀" 은 단독으로 또는 조합으로 -C(O)H 기를 의미한다.
용어 "카르바모일" 은 단독으로 또는 조합으로 -C(O)NH2 기를 의미한다.
용어 "카바미도" 는 단독으로 또는 조합으로 -NH-C(O)-NH2 기를 의미한다.
용어 "아릴" 은 단독으로 또는 조합으로 할로겐, 하이드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알콕시알킬, 알케닐옥시, 카르복실, 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐 및 포르밀로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3 개의 치환기로 임의 치환된 6 내지 10 개의 탄소 고리 원자를 포함하는 1가 방향족 카르보시클릭 모노- 또는 바이시클릭 고리 시스템을 의미한다. 아릴의 예는 페닐 및 나프틸, 특히 페닐을 포함한다.
용어 "헤테로아릴" 은 단독으로 또는 조합으로 할로겐, 하이드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알콕시알킬, 알케닐옥시, 카르복실, 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐 및 포르밀로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3 개의 치환기로 임의 치환된, N, O 및 S 에서 선택되는 1, 2, 3 또는 4 개의 헤테로원자를 포함하며, 나머지 고리 원자는 탄소인, 5 내지 12 개의 고리 원자의 1가 방향족 헤테로시클릭 모노- 또는 바이시클릭 고리 시스템을 의미한다. 헤테로아릴의 예는 피롤릴, 푸라닐, 티에닐, 이미다졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 트리아졸릴, 옥사디아졸릴, 티아디아졸릴, 테트라졸릴, 피리디닐, 피라지닐, 피라졸릴, 피리다지닐, 피리미디닐, 트리아지닐, 아제피닐, 디아제피닐, 이속사졸릴, 벤조푸라닐, 이소티아졸릴, 벤조티에닐, 인돌릴, 이소인돌릴, 이소벤조푸라닐, 벤즈이미다졸릴, 벤족사졸릴, 벤조이속사졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조이소티아졸릴, 벤조옥사디아졸릴, 벤조티아디아졸릴, 벤조트리아졸릴, 푸리닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 푸리닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 카바졸릴 또는 아크리디닐을 포함한다.
용어 "헤테로시클릴" 은 단독으로 또는 조합으로 할로겐, 하이드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알콕시알킬, 알케닐옥시, 카르복실, 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐 및 포르밀로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3 개의 치환기로 임의 치환된, N, O 및 S 에서 선택되는 1, 2, 3 또는 4 개의 헤테로원자이며, 나머지 고리 원자는 탄소인, 4 내지 12, 특히 4 내지 9 개의 고리 원자의 1가 포화 또는 부분 불포화 모노- 또는 바이시클릭 고리 시스템을 의미한다. 모노시클릭 포화 헤테로시클릴의 예는 아제티디닐, 피롤리디닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로-티에닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리디닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 티아졸리디닐, 피페리디닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로티오피라닐, 피페라지닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 1,1-디옥소-티오모르폴린-4-일, 아제파닐, 디아제파닐, 호모피페라지닐, 또는 옥사제파닐이다. 바이시클릭 포화 헤테로시클로알킬의 예는 8-아자-바이시클로[3.2.1]옥틸, 퀴누클리디닐, 8-옥사-3-아자-바이시클로[3.2.1]옥틸, 9-아자-바이시클로[3.3.1]노닐, 3-옥사-9-아자-바이시클로[3.3.1]노닐, 또는 3-티아-9-아자-바이시클로[3.3.1]노닐이다. 부분 불포화 헤테로시클로알킬의 예는 디하이드로푸릴, 이미다졸리닐, 디하이드로-옥사졸릴, 테트라하이드로-피리디닐 또는 디하이드로피라닐이다.
용어 "약학적으로 허용되는 염" 은 생물학적으로 또는 그 외에 바람직하지 않은 유리 염기 또는 유리 산의 생물학적 효과 및 특성을 보유하는 염을 지칭한다. 염은 무기 산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 특히 염산, 및 유기 산, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말레산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 살리실산, N-아세틸 시스테인에 의해 형성된다. 또한 이들 염은 유리 산에 무기 염기 또는 유기 염기를 첨가하여 제조될 수 있다. 무기 염기로부터 유도된 염은 소듐, 포타슘, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘 염을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 유기 염기로부터 유도된 염은 1차, 2차, 및 3차 아민, 자연 발생 치환된 아민을 포함하는 치환된 아민, 시클릭 아민 및 염기성 이온 교환 수지, 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 리신, 아르기닌, N-에틸피페리딘, 피페리딘, 폴리아민 수지의 염을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 또한 양쪽성 이온의 형태로 존재할 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 약학적으로 허용되는 염은 소듐, 리튬, 포타슘 및 트리알킬암모늄 염이다.
용어 "보호기" 는 단독으로 또는 조합으로 다작용성 화합물에서 반응성 부위를 선택적으로 차단하여 화학 반응이 다른 비보호된 반응성 부위에서 선택적으로 수행될 수 있게 하는 기를 의미한다. 보호기는 제거될 수 있다. 예시적인 보호기는 아미노-보호기, 카복시-보호기 또는 하이드록시-보호기이다.
"포스페이트 보호기" 는 포스페이트 기의 보호기이다. 포스페이트 보호기의 예는 2-시아노에틸 및 메틸이다. 포스페이트 보호기의 특정 예는 2-시아노에틸이다.
"하이드록실 보호기" 는 하이드록실 기의 보호기이며 또한 티올 기를 보호하는데 사용된다. 하이드록실 보호기의 예는 아세틸 (Ac), 벤조일 (Bz), 벤질 (Bn), β-메톡시에톡시메틸 에테르 (MEM), 디메톡시트리틸 (또는 비스-(4-메톡시페닐)페닐메틸) (DMT), 트리메톡시트리틸 (또는 트리스-(4-메톡시페닐)페닐메틸) (TMT), 메톡시메틸 에테르 (MOM), 메톡시트리틸 [(4-메톡시페닐)디페닐메틸 (MMT), p-메톡시벤질 에테르 (PMB), 메틸티오메틸 에테르, 피발로일 (Piv), 테트라하이드로피라닐 (THP), 테트라하이드로푸란 (THF), 트리틸 또는 트리페닐메틸 (Tr), 실릴 에테르 (예를 들어 트리메틸실릴 (TMS), tert-부틸디메틸실릴 (TBDMS), 트리-이소-프로필실릴옥시메틸 (TOM) 및 트리이소프로필실릴 (TIPS) 에테르), 메틸 에테르 및 에톡시에틸 에테르 (EE) 이다. 하이드록실 보호기의 특정 예는 DMT 및 TMT, 특히 DMT 이다.
"티오하이드록실 보호기" 는 티오하이드록실 기의 보호기이다. 티오하이드록실 보호기의 예는 "하이드록실 보호기" 의 것들이다.
본 발명의 출발 물질 또는 화합물 중 하나가 하나 이상의 반응 단계의 반응 조건 하에서 안정하지 않거나 반응성인 하나 이상의 작용기를 함유하는 경우, 적절한 보호기 (예를 들어 "Protective Groups in Organic Chemistry" by T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3rd Ed., 1999, Wiley, New York 에 기재되어 있는 바와 같음) 가 당업계에 익히 공지된 방법을 적용하는 중요한 단계 전에 도입될 수 있다. 이러한 보호기는 문헌에 기재된 표준 방법을 사용하여 합성의 후기 단계에서 제거될 수 있다. 보호기의 예는 tert-부톡시카르보닐 (Boc), 9-플루오레닐메틸 카바메이트 (Fmoc), 2-트리메틸실릴에틸 카바메이트 (Teoc), 카르보벤질옥시 (Cbz) 및 p-메톡시벤질옥시카르보닐 (Moz) 이다.
본원에 기재된 화합물은 여러 비대칭 중심을 함유할 수 있고 광학적으로 순수한 거울상 이성질체, 거울상 이성질체의 혼합물, 예를 들어 라세미체, 부분 입체 이성질체의 혼합물, 부분 입체 이성질체 라세미체 또는 부분 입체 이성질체 라세미체의 혼합물로 존재할 수 있다.
올리고뉴클레오티드
본원에서 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드" 는 2 개 이상의 공유 결합으로 연결된 뉴클레오시드를 포함하는 분자로서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같이 정의된다. 이러한 공유 결합으로 연결된 뉴클레오시드는 또한 핵산 분자 또는 올리고머로 지칭될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 통상적으로 고체-상 화학 합성 이후 정제에 의해 실험실에서 제조된다. 올리고뉴클레오티드의 서열을 언급할 때, 공유 결합으로 연결된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 핵염기 모이어티, 또는 이의 개질물의 서열 또는 순서가 언급된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 인공적이고, 화학적으로 합성되고, 전형적으로 정제 또는 단리된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 개질된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드
본원에서 사용된 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드" 는 표적 핵산, 특히 표적 핵산 상의 인접 서열에 대한 하이브리드화에 의한 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 올리고뉴클레오티드로서 정의된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 본질적으로 이중 가닥이 아니므로 siRNA 또는 shRNA 가 아니다. 바람직하게는, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥이다. 본 발명의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는, 내부 또는 상호 자기 상보성(intra or inter self complementarity)의 정도가 올리고뉴클레오티드의 전체 길이에 걸쳐 50% 미만인 한, 헤어핀 또는 분자간 듀플렉스 구조 (동일한 올리고뉴클레오티드 분자 2 개 사이의 듀플렉스) 를 형성할 수 있는 것으로 이해된다.
발현의 조절
본원에서 사용된 용어 "발현의 조절" 은 표적 핵산의 발현을 변화시키거나 표적 핵산의 수준을 변화시키는 올리고뉴클레오티드의 능력에 대한 전반적인 용어로 이해되어야 한다. 발현의 조절은 올리고뉴클레오티드의 투여 이전의 표적 핵산의 발현 또는 수준과 비교하여 결정될 수 있거나, 발현의 조절은 본 발명의 올리고뉴클레오티드가 투여되지 않은 대조군 실험을 참조하여 결정될 수 있다. 일반적으로 대조군은 염수 조성물로 처리된 개체 또는 표적 세포 또는 비-표적화 올리고뉴클레오티드 (모의 (mock)) 로 처리된 개체 또는 표적 세포인 것으로 이해된다.
조절의 한 유형은 예를 들어 표적 핵산의 분해 (예를 들어 RNaseH1 매개 분해를 통해) 또는 전사의 차단에 의해 표적 핵산의 발현을 저해, 하향-조정, 감소, 억제, 제거, 중단, 차단, 방지, 경감, 저하, 회피 또는 종료시키는 올리고뉴클레오티드의 능력이다. 조절의 또 다른 유형은 예를 들어 표적 pre-mRNA 에서의 스플라이싱 이벤트의 조절, 또는 mRNA 의 마이크로RNA 억제와 같은 저해 메커니즘의 차단을 통해 표적 RNA 의 발현을 회복, 증가 또는 향상시키는 올리고뉴클레오티드의 능력이다.
인접 뉴클레오티드 서열
용어 "인접 뉴클레오티드 서열" 은 표적 핵산에 상보적인, 예컨대 완전히 상보적인 올리고뉴클레오티드의 영역을 지칭한다. 상기 용어는 본원에서 용어 "인접 핵염기 서열" 및 용어 "올리고뉴클레오티드 모티프 서열" 과 상호 교환적으로 사용된다. 일부 구현예에서 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드는 인접 뉴클레오티드 서열을 구성한다. 일부 구현예에서 올리고뉴클레오티드는 인접 뉴클레오티드 서열, 예컨대 F-G-F' 갭머 영역을 포함하고, 추가의 뉴클레오티드(들), 예를 들어 작용기를 인접 뉴클레오티드 서열에 부착시키는데 사용될 수 있는 뉴클레오티드 링커 영역, 예를 들어 영역 D 또는 D' 를 임의로 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 링커 영역은 표적 핵산에 상보적일 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 본원에서 언급된 안티센스 올리고뉴클레오티드 믹스머는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다.
뉴클레오티드
뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드의 빌딩 블록이고, 본 발명의 목적 상, 자연 발생 및 비-자연 발생 뉴클레오티드 둘 모두를 포함한다. 자연에서, 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 및 RNA 뉴클레오티드는 리보오스 당 모이어티, 핵염기 모이어티 및 하나 이상의 포스페이트 기 (이는 뉴클레오시드에는 없음) 를 포함한다. 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 또한 "단위" 또는 "단량체" 로 상호 교환적으로 지칭될 수 있다.
개질된 뉴클레오시드
본원에서 사용되는 용어 "개질된 뉴클레오시드" 또는 "뉴클레오시드 개질" 은 당 모이어티 또는 (핵)염기 모이어티의 하나 이상의 개질의 도입에 의해 동등한 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드와 비교하여 개질된 뉴클레오시드를 지칭한다. 바람직한 구현예에서 개질된 뉴클레오시드는 개질된 당 모이어티를 포함한다. 용어 개질된 뉴클레오시드는 또한 본원에서 용어 "뉴클레오시드 유사체" 또는 개질된 "단위" 또는 개질된 "단량체" 와 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 개질되지 않은 DNA 또는 RNA 당 모이어티는를 갖는 뉴클레오시드는 본원에서 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드로 지칭된다. DNA 또는 RNA 뉴클레오시드의 염기 영역에서 개질된 뉴클레오시드는 이들이 왓슨 크릭 염기쌍을 허용하는 경우 여전히 일반적으로 DNA 또는 RNA 로 지칭된다.
개질된 뉴클레오시드간 연결
용어 "개질된 뉴클레오시드간 연결" 은 2 개의 뉴클레오시드를 함께 공유결합적으로 커플링시키는 포스포디에스테르 (PO) 연결 이외의 연결로서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같이 정의된다. 따라서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 개질된 뉴클레오시드간 연결을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 개질된 뉴클레오시드간 연결은 포스포디에스테르 연결에 비해 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 내성을 증가시킨다. 자연 발생 올리고뉴클레오티드의 경우, 뉴클레오시드간 연결은 인접 뉴클레오시드 사이에 포스포디에스테르 결합을 발생시키는 포스페이트 기를 포함한다. 개질된 뉴클레오시드간 연결은 생체내 사용을 위한 올리고뉴클레오티드를 안정화시키는데 있어서 특히 유용하고, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에서의 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드의 영역에서, 예를 들어 갭머 올리고뉴클레오티드의 갭 영역 내에서, 뿐만 아니라 개질된 뉴클레오시드의 영역, 예컨대 영역 F 및 F' 에서 뉴클레아제 절단에 대해 보호하는 역할을 할 수 있다.
일 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 뉴클레아제 공격에 대해 더 내성인 하나 이상의 개질된 뉴클레오시드간 연결과 같은 천연 포스포디에스테르로부터 개질된 하나 이상의 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 뉴클레아제 내성은 혈청 중 올리고뉴클레오티드의 배양에 의해 또는 뉴클레아제 내성 검정 (예를 들어 뱀독 포스포디에스테라제 (SVPD)) 을 사용하여 측정될 수 있는데, 둘 모두는 당업계에 공지되어 있다. 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 내성을 향상시킬 수 있는 뉴클레오시드간 연결은 뉴클레아제 내성 뉴클레오시드간 연결로 지칭된다. 일부 구현예에서 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오시드간 연결 중 적어도 50% 가 개질되고, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오시드간 연결 중 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80% 또는 예컨대 적어도 90% 는 뉴클레아제 내성 뉴클레오시드간 연결이다. 일부 구현예에서 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 모든 뉴클레오시드간 연결은 뉴클레아제 내성 뉴클레오시드간 연결이다. 일부 구현예에서 컨쥬게이트와 같은 비-뉴클레오티드 작용기에 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 연결하는 뉴클레오시드는 포스포디에스테르일 수 있음이 인식될 것이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드에서의 사용에 바람직한 개질된 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트이다.
포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 뉴클레아제 내성, 유익한 약동학 및 제조의 용이함으로 인해 특히 유용하다. 일부 구현예에서 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오시드간 연결 중 적어도 50% 는 포스포로티오에이트이고, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오시드간 연결 중 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80% 또는 예컨대 적어도 90% 는 포스포로티오에이트이다. 일부 구현예에서, 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결 이외의, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 모든 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 포스포로디티오에이트 연결(들)에 추가하여 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 및 적어도 하나의 포스포디에스테르 연결, 예컨대 2, 3 또는 4 개의 포스포디에스테르 연결을 포함한다. 갭머 올리고뉴클레오티드에서, 포스포디에스테르 연결은, 존재하는 경우, 갭 영역 G 에서 인접 DNA 뉴클레오시드 사이에 적절하게 위치하지 않는다.
뉴클레아제 내성 연결, 예컨대 포스포로티오에이트 연결은 갭머를 위한 영역 G 와 같은 표적 핵산과 듀플렉스를 형성할 때 뉴클레아제를 동원할 수 있는 올리고뉴클레오티드 영역에서 특히 유용하다. 그러나, 포스포로티오에이트 연결은 또한 갭머를 위한 영역 F 및 F' 와 같은 비-뉴클레아제 동원 영역 및/또는 친화도 향상 영역에서 유용할 수 있다. 갭머 올리고뉴클레오티드는 일부 구현예에서 영역 F 또는 F' 에서, 또는 영역 F 및 F' 둘 다에서 하나 이상의 포스포디에스테르 연결을 포함할 수 있으며, 영역 G 에서의 뉴클레오시드간 연결은 완전히 포스포로티오에이트일 수 있다.
유리하게는, 올리고뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열에서 모든 뉴클레오시드간 연결, 또는 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
EP 2 742 135 에 개시된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 다른 뉴클레오시드간 연결 (포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 이외의), 예를 들어 알킬 포스포네이트/메틸 포스포네이트 뉴클레오시드간 연결을 포함할 수 있으며, 이는 EP 2 742 135 에 따라 예를 들어 그렇지 않으면 DNA 포스포로티오에이트 갭 영역에서 용인될 수 있는 것으로 인식된다.
입체 랜덤 포스포로티오에이트 연결
포스포로티오에이트 연결은 비-가교 산소 중 하나가 황으로 치환된 뉴클레오시드간 포스페이트 연결이다. 비-가교 산소 중 하나의 황으로의 치환은 카이랄 중심을 도입하고, 단일 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 내에서와 같이, 각각의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 S (Sp) 또는 R (Rp) 입체 이성질체 형태일 것이다. 이러한 뉴클레오시드간 연결은 "카이랄 뉴클레오시드간 연결" 로 지칭된다. 그에 비해, 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결은 이들이 2 개의 비-말단 산소 원자를 갖기 때문에 비-카이랄이다.
입체 중심의 카이랄성의 지정은 표준 Cahn- Ingold-Prelog rules (CIP priority rules) first published in Cahn, R.S.; Ingold, C.K.; Prelog, V. (1966) "Specification of Molecular Chirality" Angewandte Chemie International Edition 5 (4): 385-415. doi:10.1002/anie.196603851 에 의해 결정된다.
표준 올리고뉴클레오티드 합성 동안 커플링 및 후속 황화의 입체 선택성은 제어되지 않는다. 이러한 이유로, 각각의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결의 입체 화학은 랜덤하게 Sp 또는 Rp 이고, 전통적인 올리고뉴클레오티드 합성에 의해 제조된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 실제로 2X 개의 상이한 포스포로티오에이트 부분입체 이성질체 (여기서 X 는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결의 수임) 가 존재할 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 입체 랜덤 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 본원에서 지칭되고, 임의의 입체 정의된 뉴클레오시드간 연결을 함유하지 않는다. 따라서, 입체 랜덤 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 비-입체 정의된 합성에서 유래하는 개별 부분입체 이성질체의 혼합물이다. 이러한 맥락에서 혼합물은 최대 2X 개의 상이한 포스포로티오에이트 부분입체 이성질체로 정의된다.
입체 정의된 뉴클레오시드간 연결
입체 정의된 뉴클레오시드간 연결은 2 개의 부분입체 이성질체 형태 중 하나, Rp 또는 Sp 에 대해 부분입체 이성질체 과잉을 갖는 카이랄 뉴클레오시드간 연결이다.
당업계에서 사용되는 입체 선택적 올리고뉴클레오티드 합성 방법은 전형적으로 각각의 카이랄 뉴클레오시드간 연결에서 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95% 부분입체 선택성을 제공하고, 약 10% 이하, 예컨대 약 5% 의 올리고뉴클레오티드 분자는 대안적인 부분입체 이성질체 형태를 가질 수 있다는 것이 인식되어야 한다.
일부 구현예에서 각각의 입체 정의된 카이랄 뉴클레오시드간 연결의 부분입체 이성질체 비는 적어도 약 90:10 이다. 일부 구현예에서 각각의 카이랄 뉴클레오시드간 연결의 부분입체 이성질체 비는 적어도 약 95:5 이다.
입체 정의된 포스포로티오에이트 연결은 입체 정의된 뉴클레오시드간 연결의 특정 예이다.
입체 정의된 포스포로티오에이트 연결
입체 정의된 포스포로티오에이트 연결은 2 개의 부분입체 이성질체 형태 중 하나, Rp 또는 Sp 에 대해 부분입체 이성질체 과잉을 갖는 포스포로티오에이트 연결이다.
포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결의 Rp 및 Sp 배열은 하기에 제시되어 있다:
Figure pct00020
여기서 3' R 기는 인접뉴클레오시드 (5' 뉴클레오시드) 의 3' 위치를 나타내고, 5' R 기는 인접 뉴클레오시드 (3' 뉴클레오시드) 의 5' 위치를 나타낸다.
Rp 뉴클레오시드간 연결은 또한 srP 표현될 수 있고, Sp 뉴클레오시드간 연결은 본원에서 ssP 로 표현될 수 있다.
특정 구현예에서, 각각의 입체 정의된 포스포로티오에이트 연결의 부분입체 이성질체 비는 적어도 약 90:10 또는 적어도 95:5 이다.
일부 구현예에서 각각의 입체 정의된 포스포로티오에이트 연결의 부분입체 이성질체 비는 적어도 약 97:3 이다. 일부 구현예에서 각각의 입체 정의된 포스포로티오에이트 연결의 부분입체 이성질체 비는 적어도 약 98:2 이다. 일부 구현예에서 각각의 입체 정의된 포스포로티오에이트 연결의 부분입체 이성질체 비는 적어도 약 99:1 이다.
일부 구현예에서 입체 정의된 뉴클레오시드간 연결은 올리고뉴클레오티드 분자의 집단에 존재하는 올리고뉴클레오티드 분자 중 적어도 97%, 예컨대 적어도 98%, 예컨대 적어도 99%, 또는 (본질적으로) 전부가 동일한 부분입체 이성질체 형태 (Rp 또는 Sp) 로 존재한다.
부분입체 이성질체 순도는 아카이랄 백본만 갖는 모델 시스템 (즉 포스포디에스테르) 에서 측정될 수 있다. 예를 들어 입체 정의된 뉴클레오시드간 연결을 갖는 단량체를 하기 모델 시스템 "5' t-po-t-po-t-po 3'" 에 커플링시킴으로써 각각의 단량체의 부분입체 이성질체 순도를 측정할 수 있다. 이의 결과는 다음과 같다: HPLC 를 사용하여 분리될 수 있는 5' DMTr-t-srp-t-po-t-po-t-po 3' 또는 5' DMTr-t-ssp-t-po-t-po-t-po 3'. 부분입체 이성질체 순도는 2 개의 가능한 부분입체 이성질체로부터의 UV 신호를 통합하고 예를 들어 98:2, 99:1 또는 >99:1 의 이들의 비를 제공함으로써 결정된다.
특정 단일 부분입체 이성질체 (단일 입체 정의된 올리고뉴클레오티드 분자) 의 부분입체 이성질체 순도는 각각의 뉴클레오시드간 위치에서 정의된 입체 중심에 대한 커플링 선택성, 및 도입될 입체 정의된 뉴클레오시드간 연결의 수의 함수인 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 각각의 위치에서 커플링 선택성이 97% 인 경우, 15 개의 입체 정의된 뉴클레오시드간 연결을 갖는 입체 정의된 올리고뉴클레오티드의 수득되는 순도는 0.9715, 즉 37% 의 다른 부분입체 이성질체와 비교하여 63% 의 원하는 부분입체 이성질체이다. 정의된 부분입체 이성질체의 순도는 합성 후 정제에 의해, 예를 들어 HPLC, 예컨대 이온 교환 크로마토그래피 또는 역상 크로마토그래피에 의해 개선될 수 있다.
일부 구현예에서, 입체 정의된 올리고뉴클레오티드는 집단 중 적어도 약 40%, 예컨대 적어도 약 50% 가 원하는 부분입체 이성질체인 올리고뉴클레오티드의 집단을 지칭한다.
대안적으로 언급하면, 일부 구현예에서, 입체 정의된 올리고뉴클레오티드는 집단 중 적어도 약 40%, 예컨대 적어도 약 50% 가 원하는 (특정) 입체 정의된 뉴클레오시드간 연결 모티프 (입체 정의된 모티프라고도 함) 로 이루어진 올리고뉴클레오티드의 집단을 지칭한다.
입체 랜덤 및 입체 정의된 뉴클레오시드간 카이랄 중심 둘 모두를 포함하는 입체 정의된 올리고뉴클레오티드의 경우, 입체 정의된 올리고뉴클레오티드의 순도는 원하는 입체 정의된 뉴클레오시드간 연결 모티프(들)을 유지하는 올리고뉴클레오티드의 집단의 % 에 대하여 측정된다 (입체 랜덤 연결은 계산에서 무시됨).
핵염기
용어 핵염기는 핵산 하이브리드화에서 수소 결합을 형성하는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드에 존재하는 푸린 (예를 들어 아데닌 및 구아닌) 및 피리미딘 (예를 들어 우라실, 티민 및 시토신) 모이어티를 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 핵염기는 또한 자연 발생 핵염기와 상이할 수 있지만 핵산 하이브리드화 동안 기능적인 개질된 핵염기를 포함한다. 이러한 맥락에서, "핵염기" 는 자연 발생 핵염기, 예컨대 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘, 우라실, 잔틴 및 하이포잔틴, 뿐만 아니라 비-자연 발생 변이체 모두를 나타낸다. 이러한 변이체는 예를 들어 Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 및 Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1 에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 핵염기 모이어티는 푸린 또는 피리미딘을 개질된 푸린 또는 피리미딘, 예컨대 치환된 푸린 또는 치환된 피리미딘으로 바꿈으로써 개질되고, 예컨대 이소시토신, 슈도이소시토신, 5-메틸 시토신, 5-티오졸로-시토신, 5-프로피닐-시토신, 5-프로피닐-우라실, 5-브로모우라실 5-티아졸로-우라실, 2-티오-우라실, 2'티오-티민, 이노신, 디아미노푸린, 6-아미노푸린, 2-아미노푸린, 2,6-디아미노푸린 및 2-클로로-6-아미노푸린으로부터 선택되는 핵염기이다.
핵염기 모이어티는 각각의 상응하는 핵염기에 대하여 문자 코드, 예를 들어 A, T, G, C 또는 U 로 나타내어질 수 있고, 여기서 각각의 문자는 임의로는 동등한 기능의 개질된 핵염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 예시된 올리고뉴클레오티드에서, 핵염기 모이어티는 A, T, G, C, 및 5-메틸 시토신으로부터 선택된다. 임의로는, LNA 갭머의 경우, 5-메틸 시토신 LNA 뉴클레오시드가 사용될 수 있다.
개질된 올리고뉴클레오티드
용어 개질된 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 당-개질된 뉴클레오시드 및/또는 개질된 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 설명한다. 용어 "키메라성 올리고뉴클레오티드" 는 개질된 뉴클레오시드를 갖는 올리고뉴클레오티드를 기재하기 위해 문헌에서 사용되는 용어이다.
입체 정의된 올리고뉴클레오티드
입체 정의된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오시드간 연결 중 적어도 하나가 입체 정의된 뉴클레오시드간 연결인 올리고뉴클레오티드이다.
입체 정의된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오시드간 연결 중 적어도 하나가 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인 올리고뉴클레오티드이다.
상보성
용어 "상보성" 은 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 왓슨-크릭 (Watson-Crick) 염기쌍의 용량 (capacity) 을 기재하고 있다. 왓슨-크릭 염기쌍은 구아닌 (G)-시토신 (C) 및 아데닌 (A) - 티민 (T)/우라실 (U) 이다. 올리고뉴클레오티드는 개질된 핵염기를 갖는 뉴클레오시드를 포함할 수 있고, 예를 들어 5-메틸 시토신이 흔히 시토신 대신에 사용되고, 이와 같이 용어 상보성은 비-개질된 핵염기와 개질된 핵염기 사이에 왓슨 크릭 염기쌍을 포함하는 것으로 이해될 것이다 (예를 들어 Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 및 Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1 참조).
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "% 상보성" 은 별개의 핵산 분자 (예를 들어 표적 핵산) 의 주어진 위치에서, 인접 뉴클레오티드 서열과 주어진 위치에서 상보적인 (즉, 이와 왓슨 크릭 염기쌍을 형성함) 핵산 분자 (예를 들어 올리고뉴클레오티드) 중 인접 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드의 비율을 나타낸다. 백분율은 두 서열 사이에서 쌍을 형성하는 정렬된 염기의 수를 계수하고 (표적 서열 5'-3' 및 3'-5' 의 올리고뉴클레오티드 서열과 정렬될 때), 올리고뉴클레오티드 중 뉴클레오티드의 총 수로 나누고 100 을 곱함으로써 계산된다. 상기 비교에서, 정렬되지 않은 핵염기/뉴클레오티드 (염기쌍을 형성함) 는 미스매치 (mismatch) 로 지칭된다. 바람직하게는, 인접 뉴클레오티드 서열의 % 상보성의 계산에서 삽입 및 결실이 허용되지 않는다.
용어 "완전히 상보적" 은 100% 상보성을 나타낸다.
동일성
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "동일성" 은, 별개의 핵산 분자 (예를 들어 표적 핵산) 의 주어진 위치에서 인접 뉴클레오티드 서열과 주어진 위치에서 동일한 (즉, 상보적 뉴클레오시드와 왓슨 크릭 염기쌍을 형성하는 이의 능력에 있어서) 핵산 분자 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드) 중 인접 뉴클레오티드 서열의 백분율로의 뉴클레오티드의 수를 나타낸다. 백분율은 두 서열 사이에서 동일한 정렬된 염기의 수를 계수하고, 올리고뉴클레오티드 중 뉴클레오티드의 총 수로 나누고 100 을 곱함으로써 계산된다. % 동일성 = (일치 × 100)/정렬된 영역의 길이. 바람직하게는, 인접 뉴클레오티드 서열의 % 상보성의 계산에서 삽입 및 결실이 허용되지 않는다.
하이브리드화
본원에 사용된 바와 같은 용어 "하이브리드화하는" 또는 "하이브리드화" 는 반대편 가닥 상의 염기쌍 사이에 수소 결합을 형성하여 듀플렉스를 형성하는 2 개의 핵산 가닥 (예를 들어 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산) 으로서 이해되어야 한다. 2 개의 핵산 가닥 사이의 결합의 친화성은 하이브리드화의 강도이다. 이는 흔히 올리고뉴클레오티드의 절반이 표적 핵산과 듀플렉스되는 온도로서 정의된 용융 온도 (Tm) 에 관하여 기재된다. 생리학적 조건에서, Tm 은 친화성에 엄격하게 비례하지는 않는다 (Mergny and Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13:515-537). 표준 상태 깁스 자유 에너지 (Gibbs free energy) △G°는 결합 친화성의 더 정확한 표현이고, △G°= -RTln(Kd) (여기서, R 은 기체 상수이고, T 는 절대 온도임) 에 의한 반응의 해리 상수 (Kd) 와 관련된다. 따라서, 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이의 반응의 초저 △G°는 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산 사이의 강한 하이브리화를 반영한다. △G°는 수성 농도가 1 M 이고, pH 가 7 이고, 온도가 37 ℃ 인 반응과 관련된 에너지이다. 올리고뉴클레오티드의 표적 핵산에 대한 하이브리드화는 자발적 반응이고, 자발적 반응의 경우 △G°는 0 미만이다. △G°는 예를 들어 Hansen et al., 1965, Chem. Comm. 36-38 및 Holdgate et al., 2005, Drug Discov Today 에 기재되어 있는 바와 같은 등온 적정 열량 측정법 (ITC) 방법을 사용하여 실험적으로 측정될 수 있다. 당업자는 시판 장비가 △G°측정에 이용가능함을 알 것이다. △G°는, 또한 Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216 및 McTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405 에 의해 기재된 적절하게 유래된 열역학적 파라미터를 사용하여, SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465 에 의해 기재된 바와 같은 가장 가까운 이웃 모델을 사용하여 수치적으로 추정될 수 있다. 하이브리드화에 의해 이의 의도된 핵산 표적을 조절할 가능성을 갖기 위해, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 길이가 10-30 개의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드에 대해 -10 kcal 미만의 추정된 △G°값을 갖는 표적 핵산에 하이브리드화된다. 일부 구현예에서, 하이브리드화의 정도 또는 강도는 표준 상태 깁스 자유 에너지 △G°에 의해 측정된다. 올리고뉴클레오티드는 길이가 8-30 개의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드에 대해 -10 kcal 의 범위 미만, 예컨대 -15 kcal 미만, 예컨대 -20 kcal 미만 및 예컨대 -25 kcal 미만의 추정된 △G°값을 갖는 표적 핵산에 대해 하이브리드화될 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 -10 내지 -60 kcal, 예컨대 -12 내지 -40, 예컨대 -15 내지 -30 kcal 또는 -16 내지 -27 kcal, 예컨대 -18 내지 -25 kcal 의 추정된 △G°값을 갖는 표적 핵산에 대해 하이브리드화된다.
당 개질물
본 발명의 올리고머는 개질된 당 모이어티, 즉 DNA 및 RNA 에서 발견되는 리보오스 당 모이어티와 비교했을 때 당 모이어티의 개질물을 갖는 하나 이상의 뉴클레오시드를 포함할 수 있다.
리보오스 당 모이어티의 개질물을 갖는 수많은 뉴클레오시드는 주로 올리고뉴클레오티드의 특정 특성, 예컨대 친화성 및/또는 뉴클레아제 내성의 개선을 목적으로 제조된다.
상기 개질물은 리보오스 고리 구조가 예를 들어 헥소오스 고리 (HNA), 또는 바이시클릭 고리 (이는 전형적으로 리보오스 고리 (LNA) 상의 C2 탄소와 C4 탄소 사이에 바이라디칼 가교를 가짐) 또는 C2 탄소와 C3 탄소 사이에 결합이 전형적으로 결여된 비연결된 리보오스 고리 (예를 들어 UNA) 로의 대체에 의해 개질된 것이다. 다른 당 개질된 뉴클레오시드는 예를 들어 바이시클로헥소오스 핵산 (WO2011/017521) 또는 트리시클릭 핵산 (WO2013/154798) 을 포함한다. 개질된 뉴클레오시드는 또한 당 모이어티가 예를 들어 펩티드 핵산 (PNA), 또는 모르폴리노 핵산의 경우 비(非)-당 모이어티로 대체되는 뉴클레오시드를 포함한다.
당 개질물은 또한 리보오스 고리 상의 치환기를 DNA 및 RNA 뉴클레오시드에서 자연적으로 발견되는 2'-OH 기 또는 수소 이외의 기로 바꾸는 것을 통해 제조된 개질물을 포함한다. 치환기는 예를 들어 2', 3', 4' 또는 5' 위치에서 도입될 수 있다.
2' 당 개질된 뉴클레오시드
2' 당 개질된 뉴클레오시드는 2' 위치에 H 또는 -OH 이외의 치환기를 갖는 뉴클레오시드 (2' 치환된 뉴클레오시드) 이거나 또는 리보오스 고리에서 2' 탄소와 제 2 탄소 사이에서 가교를 형성할 수 있는 2' 연결된 바이라디칼, 예컨대 LNA (2' - 4' 바이라디칼 가교된) 뉴클레오시드를 포함한다.
실제로, 2' 치환된 뉴클레오시드의 개발에 많은 관심이 집중되어 왔으며, 다수의 2' 치환된 뉴클레오시드는 올리고뉴클레오티드에 혼입될 때 유리한 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 2' 개질된 당은 올리고뉴클레오티드에 대해 향상된 결합 친화성 및/또는 증가된 뉴클레아제 내성을 제공할 수 있다. 2' 치환된 개질된 뉴클레오시드의 예는 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA (MOE), 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA 및 2'-F-ANA 뉴클레오시드이다. 추가 예는 예를 들어 Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 및 Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213 및 Deleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937 에서 확인할 수 있다. 하기는 일부 2' 치환된 개질된 뉴클레오시드의 예시이다.
Figure pct00021
본 발명과 관련하여, 2'치환은 LNA 와 같은 2' 가교된 분자를 포함하지 않는다.
잠금 핵산 뉴클레오시드 (LNA 뉴클레오시드)
"LNA 뉴클레오시드" 는 상기 뉴클레오시드의 리보오스 당 고리의 C2' 및 C4' 를 연결하는 바이라디칼 ("2'- 4' 가교" 로도 지칭됨) 을 포함하는 2'-개질된 뉴클레오시드이며, 리보오스 고리의 형태를 제한하거나 잠근다. 이러한 뉴클레오시드는 또한 문헌에서 가교된 핵산 또는 바이시클릭 핵산 (BNA) 으로 지칭된다. 리보오스의 형태의 잠금은 LNA 가 상보적 RNA 또는 DNA 분자를 위해 올리고뉴클레오티드에 혼입될 때 하이브리드화 (듀플렉스 안정화) 의 향상된 친화도와 관련이 있다. 이는 올리고뉴클레오티드/상보적 듀플렉스의 용융 온도를 측정함으로써 일상적으로 결정될 수 있다.
비제한적이고 예시적인 LNA 뉴클레오시드는 WO 99/014226, WO 00/66604, WO 98/039352, WO 2004/046160, WO 00/047599, WO 2007/134181, WO 2010/077578, WO 2010/036698, WO 2007/090071, WO 2009/006478, WO 2011/156202, WO 2008/154401, WO 2009/067647, WO 2008/150729, Morita et al., Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76, Seth et al. J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81 및 Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238 에 개시되어 있다.
2'-4' 가교는 2 내지 4 개의 가교 원자를 포함하고 특히 X 는 C4' 에 연결되어 있고 Y 는 C2' 에 연결되어 있는 화학식 -X-Y- 을 갖는다.
식 중,
X 는 산소, 황, -CRaRb-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(=CRaRb)-, -C(Ra)=N-, -Si(Ra)2-, -SO2-, -NRa-; -O-NRa-, -NRa-O-, -C(=J)-, Se, -O-NRa-, -NRa-CRaRb-, -N(Ra)-O- 또는 -O-CRaRb- 이고;
Y 는 산소, 황, -(CRaRb)n-, -CRaRb-O-CRaRb-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -Si(Ra)2-, -SO2-, -NRa-, -C(=J)-, Se, -O-NRa-, -NRa-CRaRb-, -N(Ra)-O- 또는 -O-CRaRb- 이고;
단, -X-Y- 는 -O-O-, Si(Ra)2-Si(Ra)2-, -SO2-SO2-, -C(Ra)=C(Rb)-C(Ra)=C(Rb), -C(Ra)=N-C(Ra)=N-, -C(Ra)=N-C(Ra)=C(Rb), -C(Ra)=C(Rb)-C(Ra)=N- 또는 -Se-Se- 가 아니고;
J 는 산소, 황, =CH2 또는 =N(Ra) 이고;
Ra 및 Rb 는 수소, 할로겐, 하이드록실, 시아노, 티오하이드록실, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알콕시알킬, 알케닐옥시, 카르복실, 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐, 포르밀, 아릴, 헤테로시클릴, 아미노, 알킬아미노, 카르바모일, 알킬아미노카르보닐, 아미노알킬아미노카르보닐, 알킬아미노알킬아미노카르보닐, 알킬카르보닐아미노, 카르바미도, 알카노일옥시, 설포닐, 알킬설포닐옥시, 니트로, 아지도, 티오하이드록실설파이드알킬설파닐, 아릴옥시카르보닐, 아릴옥시, 아릴카르보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시카르보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카르보닐, -OC(=Xa)Rc, -OC(=Xa)NRcRd 및 -NReC(=Xa)NRcRd 로부터 독립적으로 선택되고;
또는 2 개의 제미날 Ra 및 Rb 는 함께 임의 치환된 메틸렌을 형성하고;
또는 2 개의 제미날 Ra 및 Rb 는, 이들이 부착된 탄소 원자와 함께, -X-Y- 의 오직 하나의 탄소 원자와 시클로알킬 또는 할로시클로알킬을 형성하고;
치환된 알킬, 치환된 알케닐, 치환된 알키닐, 치환된 알콕시 및 치환된 메틸렌은 할로겐, 하이드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알콕시알킬, 알케닐옥시, 카르복실, 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐, 포르밀, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3 개의 치환기로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐 및 메틸렌이고;
Xa 는 산소, 황 또는 -NRc 이고;
Rc, Rd 및 Re 는 수소 및 알킬로부터 독립적으로 선택되고;
n 은 1, 2 또는 3 이다.
본 발명의 추가의 특정 구현예에서, X 는 산소, 황, -NRa-, -CRaRb- 또는 -C(=CRaRb)-, 특히 산소, 황, -NH-, -CH2- 또는 -C(=CH2)-, 보다 특히 산소이다.
본 발명의 또 다른 특정 구현예에서, Y 는 -CRaRb-, -CRaRb-CRaRb- 또는 -CRaRb-CRaRb-CRaRb-, 특히 -CH2-CHCH3-, -CHCH3-CH2-, -CH2-CH2- 또는 -CH2-CH2-CH2- 이다.
본 발명의 특정 구현예에서, -X-Y- 는 -O-(CRaRb)n-, -S-CRaRb-, -N(Ra)CRaRb-, -CRaRb-CRaRb-, -O-CRaRb-O-CRaRb-, -CRaRb-O-CRaRb-, -C(=CRaRb)-CRaRb-, -N(Ra)CRaRb-, -O-N(Ra)-CRaRb- 또는 -N(Ra)-O-CRaRb- 이다.
본 발명의 특정 구현예에서, Ra 및 Rb 는 수소, 할로겐, 하이드록실, 알킬 및 알콕시알킬, 특히 수소, 할로겐, 알킬 및 알콕시알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, Ra 및 Rb 는 수소, 플루오로, 하이드록실, 메틸 및 -CH2-O-CH3, 특히 수소, 플루오로, 메틸 및 -CH2-O-CH3 로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
유리하게는, -X-Y- 의 Ra 및 Rb 중 하나는 상기 정의된 바와 같고 다른 것들은 모두 동시에 수소이다.
본 발명의 추가의 특정 구현예에서, Ra 는 수소 또는 알킬, 특히 수소 또는 메틸이다.
본 발명의 또 다른 특정 구현예에서, Rb 는 수소 또는 또는 알킬, 특히 수소 또는 메틸이다.
본 발명의 특정 구현예에서, Ra 및 Rb 중 하나 또는 모두는 수소이다.
본 발명의 특정 구현예에서, Ra 및 Rb 중 오직 하나는 수소이다.
본 발명의 한 특정 구현예에서, Ra 및 Rb 중 하나는 메틸이고 다른 하나는 수소이다.
본 발명의 특정 구현예에서, Ra 및 Rb 는 모두 동시에 메틸이다.
본 발명의 특정 구현예에서, -X-Y- 는 -O-CH2-, -S-CH2-, -S-CH(CH3)-, -NH-CH2-, -O-CH2CH2-, -O-CH(CH2-O-CH3)-, -O-CH(CH2CH3)-, -O-CH(CH3)-, -O-CH2-O-CH2-, -O-CH2-O-CH2-, -CH2-O-CH2-, -C(=CH2)CH2-, -C(=CH2)CH(CH3)-, -N(OCH3)CH2- 또는 -N(CH3)CH2- 이고;
본 발명의 특정 구현예에서, -X-Y- 는 -O-CRaRb- 이고, 여기서 Ra 및 Rb 는 수소, 알킬 및 알콕시알킬, 특히 수소, 메틸 및 -CH2-O-CH3 로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구현예에서, -X-Y- 는 -O-CH2- 또는 -O-CH(CH3)-, 특히 -O-CH2- 이다.
2'- 4' 가교는 각각 화학식 (A) 및 화학식 (B) 에 예시된 바와 같이 리보오스 고리의 평면 아래 (베타-D-배열), 또는 고리의 평면 위 (알파-L-배열) 에 위치할 수 있다.
본 발명에 따른 LNA 뉴클레오시드는 특히 화학식 (B1) 또는 (B2) 을 갖는다:
Figure pct00022
식 중,
W 는 산소, 황, -N(Ra)- 또는 -CRaRb-, 특히 산소이고;
B 는 핵염기 또는 개질된 핵염기이고;
Z 는 인접 뉴클레오시드에 대한 뉴클레오시드간 연결 또는 5'-말단기이고;
Z* 는 인접 뉴클레오시드에 대한 뉴클레오시드간 연결 또는 3'-말단기이고;
R1, R2, R3, R5 및 R5* 는 수소, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 알키닐, 하이드록시, 알콕시, 알콕시알킬, 아지도, 알케닐옥시, 카르복실, 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐, 포르밀 및 아릴로부터 독립적으로 선택되고;
X, Y, Ra 및 Rb 는 상기 정의된 바와 같다.
특정 구현예에서, -X-Y- 의 정의에서, Ra 는 수소 또는 알킬, 특히 수소 또는 메틸이다. 또 다른 특정 구현예에서, -X-Y- 의 정의에서, Rb 는 수소 또는 알킬, 특히 수소 또는 메틸이다. 추가의 특정 구현예에서, -X-Y- 의 정의에서, Ra 및 Rb 중 하나 또는 둘 모두는 수소이다. 특정 구현예에서, -X-Y- 의 정의에서, Ra 및 Rb 중 오직 하나는 수소이다. 한 특정 구현예에서, -X-Y- 의 정의에서, Ra 및 Rb 중 하나는 메틸이고 다른 하나는 수소이다. 특정 구현예에서, -X-Y- 의 정의에서, Ra 및 Rb 둘 모두는 동시에 메틸이다.
추가의 특정 구현예에서, X 의 정의에서, Ra 는 수소 또는 알킬, 특히 수소 또는 메틸이다. 또 다른 특정 구현예에서, X 의 정의에서, Rb 는 수소 또는 알킬, 특히 수소 또는 메틸이다. 특정 구현예에서, X 의 정의에서, Ra 및 Rb 중 하나 또는 둘 모두는 수소이다. 특정 구현예에서, X 의 정의에서, Ra 및 Rb 중 오직 하나는 수소이다. 한 특정 구현예에서, X 의 정의에서, Ra 및 Rb 중 하나는 메틸이고 다른 하나는 수소이다. 특정 구현예에서, X 의 정의에서, Ra 및 Rb 둘 모두는 동시에 메틸이다.
추가의 특정 구현예에서, Y 의 정의에서, Ra 는 수소 또는 알킬, 특히 수소 또는 메틸이다. 또 다른 특정 구현예에서, Y 의 정의에서, Rb 는 수소 또는 알킬, 특히 수소 또는 메틸이다. 특정 구현예에서, Y 의 정의에서, Ra 및 Rb 중 하나 또는 둘 모두는 수소이다. 특정 구현예에서, Y 의 정의에서, Ra 및 Rb 중 오직 하나는 수소이다. 한 특정 구현예에서, Y 의 정의에서, Ra 및 Rb 중 하나는 메틸이고 다른 하나는 수소이다. 특정 구현예에서, Y 의 정의에서, Ra 및 Rb 둘 모두는 동시에 메틸이다.
본 발명의 특정 구현예에서, R1, R2, R3, R5 및 R5* 는 수소 및 알킬, 특히 수소 및 메틸로부터 독립적으로 선택된다.
본 발명의 추가의 특정 유리한 구현예에서, R1, R2, R3, R5 및 R5* 는 동시에 모두 수소이다.
본 발명의 또 다른 특정 구현예에서, R1, R2, R3 은 동시에 모두 수소이고, R5 및 R5* 중 하나는 수소이고 다른 하나는 상기 정의된 바와 같이, 특히 알킬, 보다 특히 메틸이다.
본 발명의 특정 구현예에서, R5 및 R5* 는 수소, 할로겐, 알킬, 알콕시알킬 및 아지도, 특히 수소, 플루오로, 메틸, 메톡시에틸 및 아지도로부터 독립적으로 선택된다. 본 발명의 특정 유리한 구현예에서, R5 및 R5* 중 하나는 수소이고 다른 하나는 알킬, 특히 메틸, 할로겐, 특히 플루오로, 알콕시알킬, 특히 메톡시에틸 또는 아지도이거나; 또는 R5 및 R5* 둘 모두는 동시에 수소 또는 할로겐, 특히 둘 모두는 동시에 수소 또는 플루오로이다. 이러한 특정 구현예에서, W 는 유리하게는 산소일 수 있고, -X-Y- 는 유리하게는 -O-CH2- 일 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, -X-Y- 는 -O-CH2- 이고, W 는 산소이고, R1, R2, R3, R5 및 R5* 는 동시에 모두 수소이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 모두 본원에 참조로 포함되는 WO 99/014226, WO 00/66604, WO 98/039352 및 WO 2004/046160 에 개시되어 있고 베타-D-옥시 LNA 및 알파-L-옥시 LNA 뉴클레오시드로 당업계에 통상적으로 공지된 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 특정 구현예에서, -X-Y- 는 -S-CH2- 이고, W 는 산소이고, R1, R2, R3, R5 및 R5* 는 동시에 모두 수소이다. 이러한 티오 LNA 뉴클레오시드는 본원에 참조로 포함되는 WO 99/014226 및 WO 2004/046160 개시되어 있다.
본 발명의 또 다른 특정 구현예에서, -X-Y- 는 -NH-CH2- 이고, W 는 산소이고, R1, R2, R3, R5 및 R5* 는 동시에 모두 수소이다. 이러한 아미노 LNA 뉴클레오시드는 본원에 참조로 포함되는 WO 99/014226 및 WO 2004/046160 에 개시되어 있다.
본 발명의 또 다른 특정 구현예에서, -X-Y- 는 -O-CH2CH2- 또는 -OCH2CH2CH2- 이고, W 는 산소이고, R1, R2, R3, R5 및 R5* 는 동시에 모두 수소이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 본원에 참조로 포함되는 WO 00/047599 및 Morita et al., Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76 에 개시되어 있고, 2'-O-4'C-에틸렌 가교 핵산 (ENA) 으로 당업계에 통상적으로 공지된 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 특정 구현예에서, -X-Y- 는 -O-CH2- 이고, W 는 산소이고, R1, R2, R3 은 동시에 모두 수소이고, R5 및 R5* 중 하나는 수소이고 다른 하나는 수소가 아니고, 예컨대 알킬, 예를 들어 메틸이다. 이러한 5' 치환된 LNA 뉴클레오시드는 본원에 참조로 포함되는 WO 2007/134181 에 개시되어 있다.
본 발명의 또 다른 특정 구현예에서, -X-Y- 는 -O-CRaRb- 이고, Ra 및 Rb 중 하나 또는 둘 모두는 수소가 아니고, 특히 알킬, 예컨대 메틸이고, W 는 산소이고, R1, R2, R3 은 동시에 모두 수소이고, R5 및 R5* 중 하나는 수소이고 다른 하나는 수소가 아니고, 특히 알킬, 예를 들어 메틸이다. 이러한 비스 개질된 LNA 뉴클레오시드는 본원에 참조로 포함되는 WO 2010/077578 에 개시되어 있다.
본 발명의 또 다른 특정 구현예에서, -X-Y- 는 -O-CHRa- 이고, W 는 산소이고, R1, R2, R3, R5 및 R5* 는 동시에 모두 수소이다. 이러한 6'-치환된 LNA 뉴클레오시드는 모두 본원에 참조로 포함되는 WO 2010/036698 및 WO 2007/090071 에 개시되어 있다. 이러한 6'-치환된 LNA 뉴클레오시드에서, Ra 는 특히 C1-C6 알킬, 예컨대 메틸이다.
본 발명의 또 다른 특정 구현예에서, -X-Y- 는 -O-CH(CH2-O-CH3)- ("2' O-메톡시에틸 바이시클릭 핵산" Seth et al. J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81) 이다.
본 발명의 또 다른 특정 구현예에서, -X-Y- 는 -O-CH(CH2CH3)- 이고;
본 발명의 또 다른 특정 구현예에서, -X-Y- 는 -O-CH(CH2-O-CH3)- 이고, W 는 산소이고, R1, R2, R3, R5 및 R5* 는 동시에 모두 수소이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 또한 시클릭 MOE (cMOE) 로 당업계에 공지되어 있고, WO 2007/090071 에 개시되어 있다.
본 발명의 또 다른 특정 구현예에서, -X-Y- 는 -O-CH(CH3)- ("2'O-에틸 바이시클릭 핵산" Seth at al., J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81) 이다.
본 발명의 또 다른 특정 구현예에서, -X-Y- 는 -O-CH2-O-CH2- (Seth et al., J. Org. Chem 2010 op. cit.) 이다.
본 발명의 또 다른 특정 구현예에서, -X-Y- 는 -O-CH(CH3)- 이고, W 는 산소이고, R1, R2, R3, R5 및 R5* 는 동시에 모두 수소이다. 이러한 6'-메틸 LNA 뉴클레오시드는 또한 cET 뉴클레오시드로 당업계에 공지되어 있고, 모두 본원에 참조로 포함되는 WO 2007/090071 (베타-D) 및 WO 2010/036698 (알파-L) 에 개시되어 있는 바와 같이 (S)-cET 또는 (R)-cET 부분입체 이성질체일 수 있다.
본 발명의 또 다른 특정 구현예에서, -X-Y- 는 -O-CRaRb- 이고, Ra 또는 Rb 둘 모두는 수소가 아니고, W 는 산소이고, R1, R2, R3, R5 및 R5* 는 동시에 모두 수소이다. 특정 구현예에서, Ra 및 Rb 둘 모두는 동시에 알킬, 특히 둘 모두는 동시에 메틸이다. 이러한 6'-디-치환된 LNA 뉴클레오시드는 본원에 참조로 포함되는 WO 2009/006478 에 개시되어 있다.
본 발명의 또 다른 특정 구현예에서, -X-Y- 는 -S-CHRa- 이고, W 는 산소이고, R1, R2, R3, R5 및 R5* 는 동시에 모두 수소이다. 이러한 6'-치환된 티오 LNA 뉴클레오시드는 본원에 참조로 포함되는 WO 2011/156202 에 개시되어 있다. 이러한 6'-치환된 티오 LNA 의 특정 구현예에서, Ra 는 알킬, 특히 메틸이다.
본 발명의 특정 구현예에서, -X-Y- 는 -C(=CH2)C(RaRb)-, -C(=CHF)C(RaRb)- 또는 -C(=CF2)C(RaRb)- 이고, W 는 산소이고, R1, R2, R3, R5 및 R5* 는 동시에 모두 수소이다. Ra 및 Rb 는 유리하게는 수소, 할로겐, 알킬 및 알콕시알킬, 특히 수소, 메틸, 플루오로 및 메톡시메틸로부터 독립적으로 선택된다. Ra 및 Rb 둘 모두는 동시에 특히 수소 또는 메틸이거나 또는 Ra 및 Rb 중 하나는 수소이고 다른 하나는 메틸이다. 이러한 비닐 카르보 LNA 뉴클레오시드는 본원에 참조로 포함되는 WO 2008/154401 및 WO 2009/067647 에 개시되어 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, -X-Y- 는 -N(ORa)-CH2- 이고, W 는 산소이고, R1, R2, R3, R5 및 R5* 는 동시에 모두 수소이다. 특정 구현예에서, Ra 는 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 N 치환된 LNA 로도 공지되어 있고 본원에 참조로 포함되는 WO 2008/150729 에 개시되어 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, -X-Y- 는 -O-N(Ra)-, -N(Ra)-O-, -NRa-CRaRb-CRaRb- 또는 -NRa-CRaRb- 이고, W 는 산소이고, R1, R2, R3, R5 및 R5* 는 동시에 모두 수소이다. Ra 및 Rb 는 유리하게는 수소, 할로겐, 알킬 및 알콕시알킬, 특히 수소, 메틸, 플루오로 및 메톡시메틸로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, Ra 는 알킬, 예컨대 메틸이고, Rb 는 수소 또는 메틸, 특히 수소이다 (Seth et al., J. Org. Chem 2010 op. cit.).
본 발명의 특정 구현예에서, -X-Y- 는 -O-N(CH3)- 이다 (Seth et al., J. Org. Chem 2010 op. cit.).
본 발명의 특정 구현예에서, R5 및 R5* 둘 모두는 동시에 수소이다. 본 발명의 또 다른 특정 구현에서, R5 및 R5* 중 하나는 수소이고 다른 하나는 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 구현예에서, R1, R2 및 R3 는 특히 수소일 수 있고 -X-Y- 는 특히 -O-CH2- 또는 -O-CHC(Ra)3-, 예컨대 -O-CH(CH3)- 일 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, -X-Y- 는 -CRaRb-O-CRaRb-, 예컨대 -CH2-O-CH2- 이고, W 는 산소이고, R1, R2, R3, R5 및 R5* 는 동시에 모두 수소이다. 이러한 특정 구현예에서, Ra 는 특히 알킬, 예컨대 메틸일 수 있고, Rb 는 수소 또는 메틸, 특히 수소일 수 있다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 형태적으로 제한된 뉴클레오티드 (CRN) 로도 알려져 있고 본원에 참조로 포함되는 WO 2013/036868 에 개시되어 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, -X-Y- 는 -O-CRaRb-O-CRaRb-, 예컨대 -O-CH2-O-CH2- 이고, W 는 산소이고, R1, R2, R3, R5 및 R5* 는 동시에 모두 수소이다. Ra 및 Rb 는 유리하게는 수소, 할로겐, 알킬 및 알콕시알킬, 특히 수소, 메틸, 플루오로 및 메톡시메틸로부터 독립적으로 선택된다. 이러한 특정 구현예에서, Ra 는 특히 알킬, 예컨대 메틸일 수 있고, Rb 는 수소 또는 메틸, 특히 수소일 수 있다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 COC 뉴클레오티드로도 공지되어 있고 본원에 참조로 포함되는 Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238 에 개시되어 있다.
달리 명시되지 않는 한, LNA 뉴클레오시드는 베타-D 또는 알파-L 입체 이성질체 형태일 수 있음이 인식될 것이다.
본 발명의 LNA 뉴클레오시드의 특정 예는 반응식 1 에 제시되어 있다 (여기서 B 는 상기 정의된 바와 같음).
반응식 1
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
특정 LNA 뉴클레오시드는 베타-D-옥시-LNA, 6'-메틸-베타-D-옥시 LNA, 예컨대 (S)-6'-메틸-베타-D-옥시-LNA ((S)-cET) 및 ENA 이다.
MOE 뉴클레오시드
용어 "MOE" 는 "메톡시-에틸" 을 나타내고, 하기에 나타낸 바와 같이 메톡시-에톡시 기로 2 '위치에서 치환된 뉴클레오시드에 대한 약어를 의미한다.
Figure pct00026
따라서, 상기 뉴클레오시드는 "MOE" 또는 "2'-O-MOE 뉴클레오시드" 로 명명될 수 있다.
RNase H 활성 및 동원
안티센스 올리고뉴클레오티드의 RNase H 활성은 상보적 RNA 분자와의 듀플렉스일 때 RNase H 를 동원하는 이의 능력을 지칭한다. WO01/23613 은 RNaseH 를 동원하는 능력을 측정하는데 사용될 수 있는 RNaseH 활성을 측정하기 위한 시험관내 방법을 제공한다. 전형적으로 올리고뉴클레오티드는 이것이 상보적 표적 핵산 서열과 함께 제공될 때, 시험되는 개질된 올리고뉴클레오티드와 동일한 염기 서열을 갖지만 올리고뉴클레오티드에서의 모든 단량체 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖는 DNA 단량체만을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 사용하고, WO01/23613 (본원에서 참조 인용됨) 의 실시예 91-95 에 의해 제공된 방법론을 사용하였을 때 측정된 초기 속도의 적어도 5%, 예컨대 적어도 10% 또는 20% 초과의 초기 속도 (pmol/l/min 으로 측정됨) 를 갖는다. RHase H 활성을 측정하는데 사용하기 위해, 재조합 인간 RNase H1 은 Lubio Science GmbH, Lucerne, Switzerland 로부터 입수 가능하다.
갭머
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열은 갭머일 수 있다. 안티센스 갭머는 RNase H 매개 분해를 통해 표적 핵산을 저해하기 위해 일반적으로 사용된다. 갭머 올리고뉴클레오티드는 '5 -> 3' 방향으로 적어도 3 개의 별개의 구조 영역 5'-플랭크, 갭 및 3'-플랭크, F-G-F' 를 포함한다. "갭" 영역 (G) 은 올리고뉴클레오티드가 RNase H 를 동원할 수 있게 하는 인접 DNA 뉴클레오티드의 스트레치를 포함한다. 갭 영역은 하나 이상의 당 개질된 뉴클레오시드, 유리하게는 높은 친화도 당 개질된 뉴클레오시드를 포함하는 5' 플랭킹 영역 (F) 에 의해, 및 하나 이상의 당 개질된 뉴클레오시드, 유리하게는 높은 친화도 당 개질된 뉴클레오시드를 포함하는 3' 플랭킹 영역 (F') 에 의해 플랭킹된다. 영역 F 및 F' 에서 하나 이상의 당 개질된 뉴클레오시드는 표적 핵산에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화도를 향상시킨다 (즉, 친화도 향상 당 개질된 뉴클레오시드임). 일부 구현예에서, 영역 F 및 F' 에서 하나 이상의 당 개질된 뉴클레오시드는 2' 당 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 높은 친화도 2' 당 개질물, 예컨대 LNA 및 2'-MOE 로부터 독립적으로 선택되는 것이다.
갭머 디자인에서, 갭 영역의 5' 및 3' 말단 뉴클레오시드는 DNA 뉴클레오시드이고, 각각 5' (F) 또는 3' (F') 영역의 당 개질된 뉴클레오시드에 인접하여 위치한다. 플랭크는 갭 영역으로부터 가장 먼 말단, 즉 5' 플랭크의 5' 말단 및 3' 플랭크의 3' 말단에 적어도 하나의 당 개질된 뉴클레오시드를 갖는 것에 의해 추가로 정의될 수 있다.
영역 F-G-F' 는 인접 뉴클레오티드 서열을 형성한다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열은 화학식 F-G-F' 의 갭머 영역을 포함할 수 있다.
갭머 디자인 F-G-F' 의 전체 길이는 예를 들어 12 내지 32 개의 뉴클레오시드, 예컨대 13 내지 24 개, 예컨대 14 내지 22 개의 뉴클레오시드, 예컨대 14 내지 17 개, 예컨대 16 내지 18 개의 뉴클레오시드일 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 갭머 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식으로 나타낼 수 있다:
F1-8-G5-16-F'1-8, 예컨대
F1-8-G7-16-F'2-8
단, 갭머 영역 F-G-F' 의 전체 길이는 적어도 12 개, 예컨대 적어도 14 개의 뉴클레오티드 길이이다.
영역 F, G 및 F' 는 하기에 추가로 정의되고 F-G-F' 화학식에 혼입될 수 있다.
갭머 - 영역 G
갭머의 영역 G (갭 영역) 는 RNaseH, 예컨대 인간 RNase H1, 전형적으로 DNA 뉴클레오시드를 동원할 수 있게 하는 뉴클레오시드의 영역이다. RNaseH 는 DNA 와 RNA 사이의 듀플렉스를 인식하고 RNA 분자를 효소적으로 절단하는 세포 효소이다. 적합한 갭머는 적어도 5 또는 6 개의 인접 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 5 - 16 개의 인접 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 6 - 15 개의 인접 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 7 - 14 개의 인접 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 8 - 12 개의 인접 DNA 뉴클레오티드, 예컨대 8 - 12 개의 인접 DNA 뉴클레오티드 길이의 갭 영역 (G) 일 수 있다. 갭 영역 G 는 일부 구현예에서 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 개의 인접 DNA 뉴클레오시드로 이루어질 수 있다. 갭 영역의 시토신 (C) DNA 는 일부 경우 메틸화될 수 있으며, 이러한 잔기는 5-메틸-시토신으로 (meC 또는 c 대신에 e 로) 주석을 달 수 있다. 갭의 시토신 DNA 의 메틸화는 cg 디뉴클레오티드가 갭에 존재하여 잠재적 독성을 감소시키는 경우 유리하며, 개질은 올리고뉴클레오티드의 효능에 큰 영향을 미치지 않는다.
일부 구현예에서 갭 영역 G 은 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 개의 인접 포스포로티오에이트 연결된 DNA 뉴클레오시드로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 갭의 모든 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
전통적인 갭머는 DNA 갭 영역을 갖지만, 갭 영역 내에서 사용될 때 RNaseH 동원을 가능하게 하는 개질된 뉴클레오시드의 많은 예가 존재한다. 갭 영역 내에 포함될 때 RNaseH 를 동원할 수 있는 것으로 보고된 개질된 뉴클레오시드는 예를 들어, 알파-L-LNA, C4' 알킬화 DNA (본원에 참조로 포함되는 PCT/EP2009/050349 및 Vester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300 에 기재되어 있는 바와 같음), 아라비노스 유래 뉴클레오시드, 예컨대 ANA 및 2'F-ANA (Mangos et al. 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661), UNA (비잠금 핵산) (본원에 참조로 포함되는 Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039 에 기재되어 있는 바와 같음) 를 포함한다. UNA 는 비잠금 핵산이고, 전형적으로 여기서 리보오스의 C2 와 C3 사이의 결합이 제거되어, 비잠금 "당" 잔기를 형성한다. 이러한 갭머에 사용된 개질된 뉴클레오시드는 갭 영역으로 도입될 때 2' 엔도 (DNA 유사) 구조를 채택하는 뉴클레오시드일 수 있으며, 즉 개질은 RNaseH 동원을 허용한다. 일부 구현예에서 본원에 기재된 DNA 갭 영역 (G) 은 임의로 갭 영역으로 도입될 때 2' 엔도 (DNA 유사) 구조를 채택하는 1 내지 3 개의 당 개질된 뉴클레오시드를 함유할 수 있다.
영역 G - "갭-브레이커"
대안적으로, 일부 RNaseH 활성을 유지하면서, 갭머의 갭 영역으로 3' 엔도 형태를 부여하는 개질된 뉴클레오사시의 삽입에 대한 수많은 보고가 있다. 이러한 하나 이상의 3'엔도 개질된 뉴클레오시드를 포함하는 갭 영역을 갖는 갭머는 "갭-브레이커" 또는 "갭-분열된" 갭머로 지칭된다 (예를 들어 WO2013/022984 참조). 갭-브레이커 올리고뉴클레오티드는 RNaseH 동원을 허용하기 위해 갭 영역 내에 충분한 DNA 뉴클레오시드 영역을 보유한다. RNaseH 를 동원하는 갭브레이커 올리고뉴클레오티드 디자인의 능력은 전형적으로 서열 또는 심지어 화합물 특이적이다 (일부 경우에서 표적 RNA 의 더 많은 특이적 절단을 제공하는 RNaseH 를 동원하는 "갭브레이커" 올리고뉴클레오티드를 개시하고 있는 Rukov et al. 2015 Nucl. Acids Res. Vol. 43 pp. 8476-8487 참조). 갭-브레이커 올리고뉴클레오티드의 갭 영역 내에 사용된 개질된 뉴클레오시드는 예를 들어 3'엔도 형태를 부여한는 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 2'-O-메틸 (OMe) 또는 2'-O-MOE (MOE) 뉴클레오시드, 또는 베타-D LNA 뉴클레오시드 (뉴클레오시드의 리보오스 당 고리의 C2' 와 C4' 사이의 가교는 베타 형태임), 예컨대 베타-D-옥시 LNA 또는 ScET 뉴클레오시드일 수 있다.
상기 기재된 영역 G 를 함유하는 갭머와 마찬가지로, 갭-브레이커 또는 갭-분열된 갭머의 갭 영역은 갭의 5' 말단에 DNA 뉴클레오시드 (영역 F 의 3' 뉴클레오시드에 인접함), 및 갭의 3' 말단에 DNA 뉴클레오시드 (영역 F' 의 5' 뉴클레오시드에 인접함) 을 갖는다. 분열된 갭을 포함하는 갭머는 전형적으로 갭 영역의 5' 말단 또는 3' 말단에 적어도 3 또는 4 개의 인접 DNA 뉴클레오시드의 영역을 보유한다.
갭-브레이커 올리고뉴클레오티드에 대한 예시적인 디자인은 하기를 포함한다:
Figure pct00027
여기서, 영역 G 는 괄호 [Dn-Er- Dm] 안에 있고, D 는 DNA 뉴클레오시드의 인접 서열이고, E 는 개질된 뉴클레오시드 (갭-브레이커 또는 갭-분열 뉴클레오시드) 이고, F 및 F' 는 본원에서 정의된 바와 같은 플랭킹 영역이고, 단, 갭머 영역 F-G-F' 의 전체 길이는 적어도 12 개, 예컨대 적어도 14 개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 구현예에서, 갭 분열된 갭머의 영역 G 는 적어도 6 개의 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 개의 DNA 뉴클레오시드를 포함한다. 상기 기재한 바와 같이, DNA 뉴클레오시드는 인접일 수 있거나 또는 임의로 하나 이상의 개질된 뉴클레오시드함께 산재될 수 있으며, 단, 갭 영역 G 는 RNaseH 동원을 매개할 수 있다.
갭머 - 플랭킹 영역, F 및 F'
영역 F 는 영역 G 의 5' DNA 뉴클레오시드에 바로 인접하여 위치한다. 영역 F 의 3' 말단 뉴클레오시드는 당 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 고 친화도 당 개질된 뉴클레오시드, 예를 들어 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 MOE 뉴클레오시드, 또는 LNA 뉴클레오시드이다.
영역 F' 는 영역 G 의 3' DNA 뉴클레오시드에 바로 인접하여 위치한다. F' 영역의 5' 말단 뉴클레오시드는 당 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 고 친화도 당 개질된 뉴클레오시드, 예를 들어 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 MOE 뉴클레오시드, 또는 LNA 뉴클레오시드이다.
영역 F 는 1-8 개의 인접 뉴클레오티드 길이, 예컨대 2-6 개, 예컨대 3-4 개의 인접 뉴클레오티드 길이이다. 유리하게는 영역 F 의 5' 말단 뉴클레오시드는 당 개질된 뉴클레오시드이다. 일부 구현예에서 영역 F 의 2 개의 5' 말단 뉴클레오시드는 당 개질된 뉴클레오시드이다. 일부 구현예에서 영역 F 의 5' 말단 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 일부 구현예에서 영역 F 의 2 개의 5' 말단 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 일부 구현예에서 영역 F 의 2 개의 5' 말단 뉴클레오시드는 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 2 개의 3' MOE 뉴클레오시드이다. 일부 구현예에서 영역 F 의 5' 말단 뉴클레오시는 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 MOE 뉴클레오시드이다.
영역 F' 는 2-8 개의 인접 뉴클레오티드 길이, 예컨대 3-6 개, 예컨대 4-5 개의 인접 뉴클레오티드 길이이다. 유리하게는, 영역 F' 의 3' 말단 뉴클레오시드는 당 개질된 뉴클레오시드이다. 일부 구현예에서 F' 영역의 2 개의 3' 말단 뉴클레오시드는 당 개질된 뉴클레오시드이다. 일부 구현예에서 F' 영역의 2 개의 3' 말단 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 일부 구현예에서 영역 F' 의 3' 말단 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 일부 구현예에서 F' 영역의 2 개의 3' 말단 뉴클레오시드는 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 2 개의 3' MOE 뉴클레오시드이다. 일부 구현예에서 영역 F' 의 3' 말단 뉴클레오시드는 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 MOE 뉴클레오시드이다.
영역 F 또는 F' 의 길이가 1 인 경우, 이는 유리하게는 LNA 뉴클레오시드인 것이 주목되어야 한다.
일부 구현예에서, 영역 F 및 F' 는 독립적으로 당 개질된 뉴클레오시드의 인접 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 영역 F 의 당 개질된 뉴클레오시드는 2'-O-알킬-RNA 단위, 2'-O-메틸-RNA, 2'-아미노-DNA 단위, 2'-플루오로-DNA 단위, 2'-알콕시-RNA, MOE 단위, LNA 단위, 아라비노 핵산 (ANA) 단위 및 2'-플루오로-ANA 단위로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 영역 F 및 F' 는 독립적으로 LNA 및 2' 치환된 개질된 뉴클레오시드 (혼합 윙 디자인) 를 포함한다.
일부 구현예에서, 영역 F 및 F' 는 오직 한 유형의 당 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 MOE 만 또는 베타-D-옥시 LNA 만 또는 ScET 만으로 이루어진다. 이러한 디자인은 또한 균일한 플랭크 또는 균일한 갭머 디자인으로 지칭된다.
일부 구현예에서, 영역 F 또는 F', 또는 F 및 F' 의 모든 뉴클레오시드는 베타-D-옥시 LNA, ENA 또는 ScET 뉴클레오시드로부터 독립적으로 선택되는 것과 같은 LNA 뉴클레오시드이다. 일부 구현예에서 영역 F 는 1-5 개, 예컨대 2-4 개, 예컨대 3-4 개, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 인접 LNA 뉴클레오시드로 이루어진다. 일부 구현예에서, 영역 F 및 F' 의 모든 뉴클레오시드는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드이다.
일부 구현예에서, 영역 F 또는 F', 또는 F 및 F' 의 모든 뉴클레오시드는 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 OMe 또는 MOE 뉴클레오시드이다. 일부 구현예에서 영역 F 는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 개의 인접 OMe 또는 MOE 뉴클레오시드로 이루어진다. 일부 구현예에서 플랭킹 영역 중 오직 하나만 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 OMe 또는 MOE 뉴클레오시드로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 OMe 또는 MOE 뉴클레오시드를 이루는 것은 5' (F) 플랭킹 영역이고, 3' (F') 플랭킹 영역은 적어도 하나의 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드 또는 cET 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 OMe 또는 MOE 뉴클레오시드를 이루는 것은 3' (F') 플랭킹 영역이고, 5' (F) 플랭킹 영역은 적어도 하나의 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드 또는 cET 뉴클레오시드를 포함한다.
일부 구현예에서, 영역 F 및 F' 의 모든 개질된 뉴클레오시드는 베타-D-옥시 LNA, ENA 또는 ScET 뉴클레오시드로부터 독립적으로 선택되는 것과 같은 LNA 뉴클레오시드이고, 영역 F 또는 F', 또는 F 및 F' 는 임의로 DNA 뉴클레오시드 (교대 플랭크, 자세한 내용은 이들의 정의 참조) 를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 영역 F 및 F' 의 모든 개질된 뉴클레오시드는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드이고, 영역 F 또는 F', 또는 F 및 F' 는 임의로 DNA 뉴클레오시드 (교대 플랭크, 자세한 내용은 이들의 정의 참조) 를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서 영역 F 및 F' 의 5' 말단 및 3' 말단 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드 또는 ScET 뉴클레오시드이다.
일부 구현예에서, 영역 F 와 영역 G 사이의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다. 일부 구현예에서, 영역 F' 와 영역 G 사이의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다. 일부 구현예에서, 영역 F 또는 F', F 및 F' 의 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다.
추가의 갭머 디자인은 본원에 참조로 포함되는 WO 2004/046160, WO 2007/146511 및 WO 2008/113832 에 개시되어 있다.
LNA 갭머
LNA 갭머는 영역 F 및 F' 중 하나 또는 둘 모두가 LNA 뉴클레오시드를 포함하거나 이로 이루어지는 갭머이다. 베타-D-옥시 갭머는 영역 F 및 F' 중 하나 또는 둘 모두가 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 포함하거나 이로 이루어지는 갭머이다.
일부 구현예에서, LNA 갭머는 화학식: [LNA]1-5-[영역 G] -[LNA]1-5 (여기서, 영역 G 는 갭머 영역 G 정의에 정의된 바와 같음) 을 갖는다.
MOE 갭머
MOE 갭머는 영역 F 및 F' 가 MOE 뉴클레오시드로 이루어진 갭머이다. 일부 구현예에서 MOE 갭머는 디자인 [MOE]1-8-[영역 G]-[MOE] 1-8, 예컨대 [MOE]2-7-[영역 G]5-16-[MOE] 2-7, 예컨대 [MOE]3-6-[영역 G]-[MOE] 3-6 를 갖고, 여기서 영역 G 는 갭머 정의에 정의된 바와 같다. 5-10-5 디자인 (MOE-DNA-MOE) 을 갖는 MOE 갭머는 당업계에서 널리 사용되어 왔다.
혼합 윙 갭머
혼합 윙 갭머는 영역 F 및 F' 중 하나 또는 둘 모두가 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 2'-O-알킬-RNA 단위, 2'-O-메틸-RNA, 2'-아미노-DNA 단위, 2'-플루오로-DNA 단위, 2'-알콕시-RNA, MOE 단위, 아라비노 핵산 (ANA) 단위 및 2'-플루오로-ANA 단위, 예컨대 MOE 뉴클레오시드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 2' 치환된 뉴클레오시드를 포함하는 LNA 갭머이다. 일부 구현예에서, 영역 F 및 F' 중 적어도 하나, 또는 영역 F 및 F' 둘 모두는 적어도 하나의 LNA 뉴클레오시드를 포함하고, 영역 F 및 F' 의 나머지 뉴클레오시드는 MOE 및 LNA 로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 영역 F 및 F' 중 적어도 하나, 또는 영역 F 및 F' 둘 모두는 적어도 2 개의 LNA 뉴클레오시드를 포함하고, 영역 F 및 F' 의 나머지 뉴클레오시드는 MOE 및 LNA 로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 혼합 윙 구현예에서, 영역 F 및 F' 중 하나 또는 둘 모두는 하나 이상의 DNA 뉴클레오시드를 추가로 포함할 수 있다.
혼합 윙 갭머 디자인은 본원에 참조로 포함되는 WO 2008/049085 및 WO 2012/109395 에 개시되어 있다.
교대 플랭크 갭머
플랭킹 영역은 LNA 및 DNA 뉴클레오시드 둘 모두를 포함할 수 있고 이들이 LNA-DNA-LNA 뉴클레오시드의 교대 모티프를 포함하기 때문에 "교대 플랭크" 로 지칭된다. 이러한 교대 플랭크를 포함하는 갭머는 "교대 플랭크 갭머" 로 지칭된다. 따라서, "대안적인 플랭크 갭머" 는 플랭크 (F 또는 F') 중 적어도 하나가 LNA 뉴클레오시드(들) 이외에 DNA 를 포함하는 LNA 갭머 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서 영역 F 또는 F' 중 적어도 하나, 또는 영역 F 및 F' 둘 모두는 LNA 뉴클레오시드 및 DNA 뉴클레오시드 둘 모두를 포함한다. 이러한 구현예에서, 플랭킹 영역 F 또는 F', 또는 F 및 F' 둘 모두는 적어도 3 개의 뉴클레오시드를 포함하고, F 및/또는 F' 영역의 5' 및 3' 말단 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다.
교대 플랭크 LNA 갭머는 WO 2016/127002 에 개시되어 있다.
교대 플랭크 영역은 3 개 이하의 인접 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 1 내지 2 개 또는 1 또는 2 개 또는 3 개의 인접 DNA 뉴클레오시드를 포함할 수 있다.
교대 플랭크 영역은 예를 들어 다음과 같이 LNA 뉴클레오시드 (L) 의 수 다음에 DNA 뉴클레오시드 (D) 의 수를 나타내는 일련의 정수로 주석을 달 수 있다:
Figure pct00028
올리고뉴클레오티드 디자인에서, 이들은 종종 2-2-1 이 5' [L]2-[D]2-[L] 3' 를 나타내고, 1-1-1-1-1 이 5' [L]-[D]-[L]-[D]-[L] 3' 을 나타내도록 숫자로 표현될 것이다. 교대 플랭크를 갖는 올리고뉴클레오티드에서 플랭크 (영역 F 및 F') 의 길이는 독립적으로 3 내지 10 개의 뉴클레오시드, 예컨대 4 내지 8 개, 예컨대 5 내지 6 개의 뉴클레오시드, 예컨대 4, 5, 6 또는 7 개의 개질된 뉴클레오시드일 수 있다. 일부 구현예에서 갭머 올리고뉴클레오티드에서 플랭크 중 오직 하나만 교대인 반면, 다른 하나는 LNA 뉴클레오티드로 구성된다. 추가적인 엑소뉴클레아제 내성을 부여하기 위해, 플랭크 (F') 의 3' 말단에 적어도 2 개의 LNA 뉴클레오시드를 갖는 것이 유리할 수 있다. 교대 플랭크를 갖는 올리고뉴클레오티드의 일부 예는 다음과 같다:
Figure pct00029
단, 갭머의 전체 길이는 적어도 12 개, 예컨대 적어도 14 개의 뉴클레오티드 길이이다.
올리고뉴클레오티드의 영역 D' 또는 D"
일부 구현예에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산, 예컨대 갭머 F-G-F' 에 상보적인 올리고뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열, 및 추가의 5' 및/또는 3' 뉴클레오시드를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 추가의 5' 및/또는 3' 뉴클레오시드는 표적 핵산에 완전히 상보적이거나 상보적이지 않을 수 있다. 이러한 추가의 5' 및/또는 3' 뉴클레오시드는 본원에서 영역 D' 및 D" 로 지칭될 수 있다.
영역 D' 또는 D" 의 첨가는 인접 뉴클레오티드 서열, 예컨대 갭머를, 컨쥬게이트 모이어티 또는 또 다른 작용기에 결합시키기 위해 사용될 수 있다. 인접 뉴클레오티드 서열을 컨쥬게이트 모이어티와 결합시키기 위해 사용되는 경우 이는 생물 절단성 링커로서 작용할 수있다. 대안적으로, 이는 엑소뉴클레아제 보호를 제공하거나 또는 합성 또는 제조의 용이함을 위해 사용될 수 있다.
영역 D' 및 D" 는 영역 F 의 5' 말단 또는 영역 F' 의 3' 말단에 부착되어 각각 하기 화학식 D'-F-G-F', F-G-F'-D" 또는 D'-F-G-F'-D" 의 디자인을 생성할 수 있다. 이러한 경우에, F-G-F' 는 올리고뉴클레오티드의 갭머 부분이고 영역 D' 또는 D" 는 올리고뉴클레오티드의 개별 부분을 구성한다.
영역 D' 또는 D" 는 독립적으로 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 추가 뉴클레오티드를 포함할 수 있거나 또는 이로 이루어질 수 있고, 이는 표적 핵산에 대해 상보적 또는 비-상보적일 수 있다. F 또는 F' 영역에 인접한 뉴클레오티드는 당-개질된 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 또는 RNA 또는 이들의 염기 개질된 버젼이 아니다. D' 또는 D' 영역은 뉴클레아제 민감성 생물 절단성 링커로서 작용할 수 있다 (링커의 정의 참조). 일부 구현예에서, 추가의 5' 및/또는 3' 말단 뉴클레오티드는 포스포디에스테르 연결로 연결되고, DNA 또는 RNA 이다. 영역 D' 또는 D" 로 사용하기에 적합한 뉴클레오티드 기반 생물 절단성 링커는 예를 들어 포스포디에스테르 연결된 DNA 디뉴클레오티드를 포함하는 WO 2014/076195 에 개시되어 있다. 폴리-올리고뉴클레오티드 구조물에서 생물 절단성 링커의 사용은 단일 올리고뉴클레오티드 내에서 다수의 안티센스 구조물 (예를 들어 갭머 영역) 을 연결하는데 사용되는 WO 2015/113922 에 개시되어 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 갭머를 구성하는 인접 뉴클레오티드 서열 이외에 영역 D' 및/또는 D" 를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식으로 나타낼 수 있다:
F-G-F'; 특히 F1-8-G5-16-F'2-8
D'-F-G-F', 특히 D'1-3-F1-8-G5-16-F'2-8
F-G-F'-D", 특히 F1-8-G5-16-F'2-8-D"1-3
D'-F-G-F'-D", 특히 D'1-3- F1-8-G5-16-F'2-8-D"1-3
일부 구현예에서, 영역 D' 와 영역 F 사이에 위치한 뉴클레오시드간 연결은 포스포디에스테르 연결이다. 일부 구현예에서 영역 F' 와 영역 D" 사이에 위치한 뉴클레오시드간 연결은 포스포디에스테르 연결이다.
토탈머
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 모든 뉴클레오시드는 당 개질된 뉴클레오시드이다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 본원에서 토탈머로 지칭된다.
일부 구현예에서 토탈머의 모든 당 개질된 뉴클레오시드는 동일한 당 개질을 포함하며, 예를 들어 이들은 모두 LNA 뉴클레오시드일 수 있거나, 또는 모두 2'O-MOE 뉴클레오시드일 수 있다. 일부 구현예에서 토탈머의 당 개질된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드 및 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA (MOE), 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA, 및 2'-F-ANA 뉴클레오시드로 이루어진 군으로부터 선택되는 2' 치환된 뉴클레오시드로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서 올리고뉴클레오티드는 LNA 뉴클레오시드 및 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA (MOE), 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA, 및 2'-F-ANA 뉴클레오시드로 이루어진 군으로부터 선택되는 2' 치환된 뉴클레오시드 둘 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 LNA 뉴클레오시드 및 2'-O-MOE 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 (S)cET LNA 뉴클레오시드 및 2'-O-MOE 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 각각의 뉴클레오시드 단위는 2'치환된 뉴클레오시드이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 각각의 뉴클레오시드 단위는 2'-O-MOE 뉴클레오시드이다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 모든 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 베타-D-옥시-LNA 뉴클레오시드 및/또는 (S)cET 뉴클레오시드이다. 일부 구현예에서 이러한 LNA 토탈머 올리고뉴클레오티드는 7 - 12 개의 뉴클레오시드 길이이다 (예를 들어, WO 2009/043353 참조). 이러한 짧은 완전 LNA 올리고뉴클레오티드는 특히 마이크로RNA 의 저해에 효과적이다.
다양한 토탈머 화합물은 특히 마이크로RNA (antimiR) 를 표적화할 때 치료용 올리고머로서 또는 스플라이스 스위칭 올리고머 (SSO) 로서 매우 효과적이다.
일부 구현예에서, 토탈머는 적어도 하나의 XYX 또는 YXY 서열 모티프, 예컨대 반복 서열 XYX 또는 YXY 를 포함하거나 이로 이루어지고, X 는 LNA 이고 Y 는 대안적인 (즉 비-LNA) 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 2'-OMe RNA 단위 및 2'-플루오로 DNA 단위이다. 상기 서열 모티프는 일부 구현예에서 예를 들어 XXY, XYX, YXY 또는 YYX 일 수 있다.
일부 구현예에서, 토탈머는 7 내지 24 개의 뉴클레오티드, 예컨대 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23 개의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, 토탈머의 인접 뉴클레오티드 서열은 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 95%, 예컨대 100% 의 LNA 단위를 포함한다. 완전 LNA 화합물의 경우, 12 개 미만, 예컨대 7 - 10 개의 뉴클레오티드 길이인 것이 유리하다.
나머지 단위는 2'-O-알킬-RNA 단위, 2'-OMe-RNA 단위, 2'-아미노-DNA 단위, 2'-플루오로-DNA 단위, LNA 단위, PNA 단위, HNA 단위, INA 단위 및 2' MOE RNA 단위로 이루어지는 군, 또는 2'-OMe RNA 단위 및 2'-플루오로 DNA 단위로 이루어지는 군으로부터 선택된 것들과 같은 본원에서 언급되는 비-LNA 뉴클레오티드 유사체로부터 선택될 수 있다.
믹스머
용어 '믹스머' 는 DNA 뉴클레오시드 및 당 개질된 뉴클레오시드 둘 모두를 포함하는 올리고머를 지칭하며, 여기서 RNaseH 를 동원하기에는 불충분한 길이의 인접 DNA 뉴클레오시드가 존재한다. 적합한 믹스머는 3 개 이하 또는 4 개 이하의 인접 DNA 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 믹스머, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열은 DNA 뉴클레오시드 및 당 개질된 뉴클레오시드의 교대 영역을 포함한다. DNA 뉴클레오시드의 짧은 영역과 함께 올리고뉴클레오티드 내로 혼입될 때 RNA 유사 (3'엔도) 형태를 형성하는 당 개질된 뉴클레오시드의 교대 영역에 의해, 비-RNaseH 동원 올리고뉴클레오티드가 제조될 수 있다. 유리하게는, 당 개질된 뉴클레오시드는 친화도 향상 당 개질된 뉴클레오시드이다.
올리고뉴클레오티드 믹스머는 종종 스플라이스 조절제 또는 마이크로RNA 저해제와 같은 표적 유전자의 점유 기반 조절을 제공하기 위해 사용된다.
일부 구현예에서 믹스머, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열에서 당 개질된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 (S)cET 또는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 포함하거나 모두 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 (S)cET 또는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드이다.
일부 구현예에서 믹스머의 모든 당 개질된 뉴클레오시드는 동일한 당 개질을 포함하며, 예를 들어 이들은 모두 LNA 뉴클레오시드일 수 있거나, 또는 모두 2'O-MOE 뉴클레오시드일 수 있다. 일부 구현예에서 믹스머의 당 개질된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드 및 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA (MOE), 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA, 및 2'-F-ANA 뉴클레오시드로 이루어진 군으로부터 선택되는 2' 치환된 뉴클레오시드로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 일부 구현예에서 올리고뉴클레오티드는 LNA 뉴클레오시드 및 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA (MOE), 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA, 및 2'-F-ANA 뉴클레오시드로 이루어진 군으로부터 선택되는 2' 치환된 뉴클레오시드 둘 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 LNA 뉴클레오시드 및 2'-O-MOE 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 (S)cET LNA 뉴클레오시드 및 2'-O-MOE 뉴클레오시드를 포함한다.
일부 구현예에서, 믹스머, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열은 LNA 및 DNA 뉴클레오시드만 포함하며, 이러한 LNA 믹스머 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 8 - 24 개의 뉴클레오시드 길이일 수 있다 (예를 들어, 마이크로RNA 의 LNA antmiR 저해제를 개시하는 WO2007112754 참조).
다양한 믹스머 화합물은 특히 마이크로RNA (antimiR) 를 표적화할 때 치료용 올리고머로서 또는 스플라이스 스위칭 올리고머 (SSO) 로서 매우 효과적이다.
일부 구현예에서, 믹스머는 하기 모티프를 포함한다:
Figure pct00030
여기서, L 은 당 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 LNA 또는 2' 치환된 뉴클레오시드 (예를 들어 2'-O-MOE) 를 나타내고, D 는 DNA 뉴클레오시드를 나타내고, 각각의 m 은 1 - 6 으로부터 독립적으로 선택되고, 각각의 n 은 1, 2, 3 및 4, 예컨대 1- 3 으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서 각각의 L 은 LNA 뉴클레오시드이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 L 은 LNA 뉴클레오시드이고 적어도 하나의 L 은 2'-O-MOE 뉴클레오시드이다. 일부 구현예에서, 각각의 L 은 LNA 및 2'-O-MOE 뉴클레오시드로부터 독립적으로 선택된다.
일부 구현예에서, 믹스머는 10 내지 24 개의 뉴클레오티드, 예컨대 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23 개의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, 믹스머의 인접 뉴클레오티드 서열은 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50% 의 LNA 단위를 포함한다.
일부 구현예에서, 믹스머는 뉴클레오티드 유사체 및 자연 발생 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 유사체의 하나의 유형 및 뉴클레오티드 유사체의 두 번째 유형의 반복 패턴의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 반복 패턴은, 예를 들어 매 두 번째 또는 매 세 번째 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 LNA 이고, 나머지 뉴클레오티드는 자연 발생 뉴클레오티드, 예를 들어 DNA 이거나, 2' 치환된 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 본원에서 언급된 2' 플루오로 유사체의 2' MOE 이거나, 일부 구현예에서, 본원에서 언급된 뉴클레오티드 유사체의 군으로부터 선택된다. 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA 단위의 반복 패턴은 고정 위치에서 - 예를 들어 5' 또는 3' 말단에서 - 뉴클레오티드 유사체와 조합될 수 있는 것으로 인지된다.
일부 구현예에서, 3' 말단으로부터 세는 올리고머의 제 1 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA 뉴클레오티드 또는 2'-O-MOE 뉴클레오시드이다.
일부 구현예에서, 동일하거나 상이할 수 있는, 3' 말단으로부터 세는 올리고머의 두 번째 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA 뉴클레오티드 또는 2'-O-MOE 뉴클레오시드이다.
일부 구현예에서, 동일하거나 상이할 수 있는, 올리고머의 5' 말단은 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA 뉴클레오티드 또는 2'-O-MOE 뉴클레오시드이다.
일부 구현예에서, 믹스머는 2 개 이상의 연속적 뉴클레오티드 유사체 단위, 예를 들어 2 개 이상의 연속적 LNA 단위를 포함하는 영역을 적어도 포함한다.
일부 구현예에서, 믹스머는 3 개 이상의 연속적 뉴클레오티드 유사체 단위, 예를 들어 3 개 이상의 연속적 LNA 단위를 포함하는 영역을 적어도 포함한다.
엑소좀
엑소좀은 기능적으로 활성인 카고 (예컨대 miRNA, mRNA, DNA 및 단백질) 를 통한 세포-세포 통신에 관여하는 전형적으로 30 내지 500 nm 범위의 천연 생물학적 나노 소포이다.
엑소좀은 모든 유형의 세포에 의해 분비되며 타액, 혈액, 소변 및 젖과 같은 체액에서 풍부하게 발견된다. 엑소좀의 주요 역할은 특정 세포 사이에 다양한 이펙터 또는 신호 분자를 전달하여 정보를 전달하는 것이다 (Acta Pol Pharm. 2014 Jul-Aug;71(4):537-43.). 이러한 이펙터 또는 신호 분자는 예를 들어 단백질, miRNA 또는 mRNA 일 수 있다. 엑소좀은 현재 이러한 분자의 치료 및 진단 적용을 확장시키기 위해 RNA 치료 분자를 포함하는 다양한 약물 분자에 대한 전달 비히클로서 탐구되고 있다. 유리 약물 분자와 비교하여 이러한 분자의 전달 및 효능면에서 이점을 제시하거나 나타내는 siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 소분자와 같은 합성 분자가 로딩된 엑소좀의 개시가 선행 기술에 있다 (예를 들어 Andaloussi et al 2013 Advanced Drug Delivery Reviews 65: 391-397, WO2014/168548, WO2016/172598, WO2017/173034 및 WO 2018/102397 참조).
엑소좀은 생물학적 공급원, 예컨대 젖 (젖 엑소좀) 으로부터 단리될 수 있으며, 특히 소 젖은 소 젖 엑소좀 단리에 대한 풍부한 공급원이다. 예를 들어 Manca et al., Scientific Reports (2018) 8:11321 참조.
본 발명의 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 엑소좀 (엑소좀 제형) 으로 캡슐화되고, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드로 엑소좀을 로딩하는 예는 EP 출원 No. 18192614.8 에 기재되어 있다. 본 발명의 방법에서 안티센스 올리고뉴클레오티드는 엑소좀 제형의 형태로 세포 또는 대상에게 투여될 수 있으며, 특히 엑소좀 제형의 경구 투여가 예상된다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 콜레스테롤과 같은 친유성 컨쥬게이트와 컨쥬게이트될 수 있으며, 이는 생물 절단성 링커 (예를 들어, 포스포디에스테르 연결된 DNA 뉴클레오티드의 영역) 를 통해 안티센스 올리고뉴클레오티드에 공유 부착될 수 있다. 이러한 친유성 컨쥬게이트는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 엑소좀으로의 제형화를 용이하게 할 수 있고 표적 세포로의 전달을 추가로 향상시킬 수 있다.
컨쥬게이트
본원에서 사용된 용어 컨쥬게이트는 비-뉴클레오티드 모이어티 (컨쥬게이트 모이어티 또는 영역 C 또는 제 3 영역) 에 공유 결합으로 연결된 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 비-뉴클레오티드 모이어티에의 컨쥬게이션은 예를 들어 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포, 세포 흡수 또는 안정성에 영향을 미침으로써 올리고뉴클레오티드의 약리학을 개선할 수 있다. 일부 구현예에서 컨쥬게이트 모이어티는 올리고뉴클레오티드의 세포 분포, 생체이용률, 대사, 배설, 투과성, 및/또는 세포 흡수를 개선함으로써 올리고뉴클레오티드의 약동학적 특성을 변경 또는 개선한다. 특히 컨쥬게이트는 표적 올리고뉴클레오티드를 특정 기관, 조직 또는 세포 유형에 표적화하여 기관, 조직 또는 세포 유형에서 올리고뉴클레오티드의 효과를 향상시킬 수 있다. 이때, 컨쥬게이트는 올리고뉴클레오티드의 활성을 감소시키는 역할을 할 수 있으며, 예를 들어 비-표적 세포 유형, 조직 또는 기관에서 표적 활성 또는 활성을 제거하는 역할을 할 수 있다.
WO 93/07883 및 WO 2013/033230 은 본원에 참조로 포함되는 적합한 컨쥬게이트 모이어티를 제공한다. 추가의 적합한 컨쥬게이트 모이어티는 아시알로당단백질 수용체 (ASGPR) 에 결합할 수 있는 것들이다. 특히 3가 N-아세틸갈락토사민 컨쥬게이트 모이어티는 ASGPR 에 결합하기에 적합하다 (예를 들어 WO 2014/076196, WO 2014/207232 및 WO 2014/179620 (본원에 참조로 포함됨) 참조). 이러한 컨쥬게이트는 신장에서 그의 존재를 감소시키면서 올리고뉴클레오티드의 간으로의 흡수를 향상시켜, 컨쥬게이트되지 않은 버전의 동일한 올리고뉴클레오티드와 비교하여 컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드의 간/신장 비를 증가시키는 역할을 한다.
올리고뉴클레오티드 컨쥬게이트 및 그 합성은 또한 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 [Manoharan in Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001 and Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103] 에 의한 포괄적 검토에서 보고되어 있다.
일 구현예에서, 비-뉴클레오티드 모이어티 (컨쥬게이트 모이어티) 는 탄수화물, 세포 표면 수용체 리간드, 약물 물질, 호르몬, 친유성 물질, 중합체, 단백질, 펩티드, 독소 (예를 들어 박테리아 독소), 비타민, 바이러스 단백질 (예를 들어 캡시드) 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
링커
연결 또는 링커는 하나 이상의 공유 결합을 통해 관심 대상의 하나의 화학기 또는 분절을 관심 대상의 또 다른 화학기 또는 분절에 연결하는 2 개의 원자 사이의 연결이다. 컨쥬게이트 모이어티는 올리고뉴클레오티드에 직접 또는 연결 모이어티 (예를 들어 링커 또는 테더) 를 통해 부착될 수 있다. 링커는 제 3 영역, 예를 들어 컨쥬게이트 모이어티 (영역 C) 를 제 1 영역, 예를 들어 표적 핵산에 상보적인 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열 (영역 A) 에 공유적으로 연결시키는 역할을 한다.
본 발명의 일부 구현예에서 본 발명의 컨쥬게이트 또는 올리고뉴클레오티드 컨쥬게이트는 임의로 표적 핵산에 상보적인 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열 (영역 A 또는 제 1 영역) 과 컨쥬게이트 모이어티 (영역 C 또는 제 3 영역) 사이에 위치한 링커 영역 (제 2 영역 또는 영역 B 및/또는 영역 Y) 를 포함할 수 있다.
영역 B 는 포유류 신체 내에서 일반적으로 발생되거나 또는 발생되는 것들과 유사한 조건 하에서 절단될 수 있는 생리학적으로 불안정한 결합을 포함하거나 이로 이루어지는 생물 절단성 링커를 지칭한다. 생리학적으로 불안정한 링커가 화학적 변형 (예를 들어, 절단) 되는 조건은, 화학적 조건, 예컨대 pH, 온도, 산화 또는 환원 조건 또는 작용제, 및 포유류 세포에서 발견되는 염 농도 또는 포유류 세포에서 발생되는 것들과 유사한 염 농도를 포함한다. 포유류의 세포내 조건은 또한 단백분해 효소 또는 가수분해 효소 또는 뉴클레아제로부터와 같은 포유류 세포에 정상적으로 존재하는 효소 활성의 존재를 포함한다. 일 구현예에서, 생물 절단성 링커는 S1 뉴클레아제 절단되기 쉽다. 바람직한 구현예에서, 뉴클레아제 민감성 링커는 1 내지 10 개의 뉴클레오시드, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 뉴클레오시드, 더 바람직하게는 2 내지 6 개의 뉴클레오시드 및 가장 바람직하게는 2 내지 4 개의 연결된 뉴클레오시드 (적어도 2 개의 연속적 포스포디에스테르 연결, 예컨대 적어도 3 또는 4 또는 5 개의 연속적 포스포디에스테르 연결을 포함함) 를 포함한다. 바람직하게는, 뉴클레오시드는 DNA 또는 RNA 이다. 포스포디에스테르 함유 생물 절단성 링커는 WO 2014/076195 (본원에 참조로 포함됨) 에 더 상세하게 기재되어 있다.
영역 Y 는 반드시 생물 절단성일 필요는 없지만 주로 컨쥬게이트 모이어티 (영역 C 또는 제 3 영역) 를 올리고뉴클레오티드 (영역 A 또는 제 1 영역) 에 공유 연결하는 역할을 하는 링커를 지칭한다. 영역 Y 링커는 사슬 구조 또는 에틸렌 글리콜, 아미노산 단위 또는 아미노 알킬 기와 같은 반복 단위의 올리고머를 포함할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 컨쥬게이트는 하기 영역 요소 A-C, A-B-C, A-B-Y-C, A-Y-B-C 또는 A-Y-C 로 구성될 수 있다. 일부 구현예에서 링커 (영역 Y) 는 예를 들어 C6 내지 C12 아미노 알킬 기를 포함하는 C2 - C36 아미노 알킬 기와 같은 아미노 알킬이다. 바람직한 구현예에서 링커 (영역 Y) 는 C6 아미노 알킬 기이다.
투여
본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 약학적 조성물은 국소 (예컨대, 피부, 흡입, 눈 또는 귀) 또는 장내 (예컨대, 경구 또는 위장관을 통해) 또는 비경구 (예컨대, 정맥 내, 피하, 근육 내, 대뇌 내, 뇌실 내 또는 뇌척수 내) 로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 약학적 조성물은 정맥 내, 동맥 내, 피하, 복강 내 또는 근육 내 주사 또는 주입, 척추 강내 또는 두개 내, 예를 들어 대뇌 내 또는 뇌실 내, 유리 체내 투여를 포함하는 비경구 경로에 의해 투여된다. 일 구현예에서, 활성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 컨쥬게이트 정맥 내 투여된다. 또 다른 구현예에서, 활성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 컨쥬게이트는 피하 투여된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 컨쥬게이트 또는 약학 조성물은 0.1 - 15 mg/kg, 예컨대 0.2 - 10 mg/kg, 예컨대 0.25 - 5 mg/kg 의 용량으로 투여된다. 투여는 1 주일에 1 회, 2 주 마다, 3 주 마다 또는 1 개월에 1 회 또는 2 개월에 1 회일 수 있다.
본 발명은 또한 약제가 유리 체내 주사와 같은 안과용 투여 형태인 약제의 제조를 위해 기재된 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 컨쥬게이트의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 안과 표적용 올리고뉴클레오티드는 Htra-1 이다.
본 발명은 또한 약제가 정맥 내, 피하, 근육 내, 대뇌 내, 뇌실 내 또는 뇌척수 내 투여 (예를 들어 주사) 를 위한 투여 형태인 약제의 제조를 위해 기재된 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 컨쥬게이트의 용도를 제공한다.
예시적인 장점
본원에 예시된 바와 같이, 본 발명의 화합물에 사용된 아카이랄 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 비-입체 정의된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 복잡성을 감소시키면서 올리고뉴클레오티드의 활성, 효능 또는 효력을 유지하게 한다.
실제로, 본원에 예시된 바와 같이, 본 발명의 화합물에 사용된 것은 입체 정의된 포스포로티오에이트와 조합으로 독특한 이점을 제공하여, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 복잡성을 추가로 감소시키면서 올리고뉴클레오티드의 활성, 효능 또는 효력을 유지 또는 개선할 수 있는 기회를 제공한다.
본원에 예시된 바와 같이, 본 발명의 화합물에 사용된 아카이랄 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 시험관내 또는 생체내 세포 흡수의 개선을 허용한다.
본원에 예시된 바와 같이, 본 발명의 화합물에 사용된 아카이랄 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 시험관내 생체 분포의 변경 또는 개선을 허용한다 (조직 또는 세포 함량, 또는 표적 조직에서의 활성/효능으로 측정됨). 특히, 본 발명자들은 골격근, 심장, 비장, 간, 신장, 섬유아세포, 상피 세포에서 조직 흡수, 함량 및/또는 효능의 개선을 관찰하였다.
믹스머 올리고뉴클레오티드와 관련하여, 본 발명자들은 포스포로디티오에이트 연결 (IA 또는 IB 에 도시됨) 을 하나 이상의 DNA 뉴클레오시드의 사이 또는 이에 인접하여 혼입시키는 것이 향상된 안정성 및/또는 개선된 효능과 같은 개선을 제공한다는 것을 확인하였다. 갭머 올리고뉴클레오티드와 관련하여, 본 발명자들은 포스포로디티오에이트 연결 (IA 또는 IB 에 도시됨) 을 플랭크 영역의 뉴클레오시드 사이 (예컨대 2'당 개질된 뉴클레오시드 사이) 에 혼입시키는 것도 향상된 안정성 및/또는 개선된 효능과 같은 개선을 제공한다는 것을 확인하였다.
본원에 예시된 바와 같이, 본 발명의 화합물에 사용된 아카이랄 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 올리고뉴클레오티드 안정성의 개선을 허용한다. 본 발명의 화합물에서 아카이랄 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간의 혼입은 혈청 및 세포 엑소뉴클레아제, 특히 3' 엑소뉴클레아제, 뿐만 아니라 5'엑소뉴클레아제에 대한 향상된 내성을 제공하고, 본 발명의 화합물의 현저한 안정성은 아카이랄 포스포로디티오에이트 연결을 포함하는 화합물의 엔도뉴클레아제에 대한 내성을 추가로 나타낸다. 올리고뉴클레오티드의 안정화는 독성 분해 산물의 축적을 감소 또는 예방하고 안티센스 올리고뉴클레오티드의 작용 기간을 연장시키는데 특히 중요하다. 실시예에 예시된 바와 같이, 랫트 혈청 안정성은 개선된 안정성을 분석하기 위해 사용될 수 있다. 세포 안정성의 평가를 위해, 조직 (예를 들어 간) 균질액 추출물이 사용될 수 있다 (예를 들어 이러한 방법을 제공하는 WO2014076195 참조). 올리고뉴클레오티드 안정성의 측정을 위한 다른 분석은 뱀독 포스포디에스테라제 안정성 분석 및 S1 뉴클레아제 안정성을 포함한다.
청구된 올리고뉴클레오티드의 감소된 독성 위험은 시험관내 간독성 분석 (예를 들어 WO 2017/067970 에 개시된 바와 같음) 또는 시험관내 신독성 분석 (예를 들어 WO 2017/216340 에 개시된 바와 같음), 또는 시험관내 신경독성 분석 (예를 들어 WO2016127000 에 개시된 바와 같음) 으로 시험된다. 대안적으로 독성은 생체내, 예를 들어 마우스 또는 랫트에서 분석될 수 있다.
향상된 안정성은 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 작용 기간에 이점을 제공할 수 있으며, 이는 투여 경로가 침습성인 경우, 예를 들어 비경구 투여, 예컨대, 정맥 내, 피하, 근육 내, 대뇌 내, 안구 내, 뇌실 내 또는 뇌척수 내 투여인 경우, 특히 유리하다.
일반적인 올리고뉴클레오티드 구현예
1. 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오티드:
Figure pct00031
식 중, 2 개의 산소 원자 중 하나는 인접 뉴클레오시드 (A1) 의 3'탄소 원자에 연결되고 다른 하나는 또 다른 인접 뉴클레오시드 (A2) 의 5'탄소 원자에 연결되고, 이때 2 개의 뉴클레오시드 (A1) 및 (A2) 중 적어도 하나는 LNA 뉴클레오시드이고, (IA) 에서 R 은 수소 또는 포스페이트 보호기이고, (IB) 에서 M+ 은 양이온, 예컨대 금속 양이온, 예컨대 알칼리금속 양이온, 예컨대 Na+ 또는 K+ 양이온이거나; 또는 M+ 은 암모늄 양이온이다.
2. 구현예 1 에 있어서, (A1) 및 (A2) 중 하나는 LNA 뉴클레오시드이고 다른 하나는 DNA 뉴클레오시드, RNA 뉴클레오시드 또는 당 개질된 뉴클레오시드인, 올리고뉴클레오티드.
3. 구현예 1 또는 2 에 있어서, (A1) 및 (A2) 중 하나는 LNA 뉴클레오시드이고 다른 하나는 DNA 뉴클레오시드 또는 당 개질된 뉴클레오시드인, 올리고뉴클레오티드.
4. 구현예 1 - 3 중 어느 하나에 있어서, (A1) 및 (A2) 중 하나는 LNA 뉴클레오시드이고 다른 하나는 DNA 뉴클레오시드인, 올리고뉴클레오티드.
6. 구현예 1 - 3 중 어느 하나에 있어서, (A1) 및 (A2) 중 하나는 LNA 뉴클레오시드이고 다른 하나는 당 개질된 뉴클레오시드인, 올리고뉴클레오티드.
7. 구현예 2 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 당 개질된 뉴클레오시드는 2'-당 개질된 뉴클레오시드인, 올리고뉴클레오티드.
8. 구현예 7 에 있어서, 상기 2'-당 개질된 뉴클레오시드는 2'-알콕시-RNA, 2'-알콕시알콕시-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA, 2'-플루오로-ANA 또는 LNA 뉴클레오시드인, 올리고뉴클레오티드.
9. 구현예 7 또는 8 에 있어서, 상기 2'-당 개질된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드인, 올리고뉴클레오티드.
10. 구현예 1 - 9 중 어느 하나에 있어서, LNA 뉴클레오시드는 베타-D-옥시 LNA, 6'-메틸-베타-D-옥시 LNA 및 ENA 로부터 독립적으로 선택되는, 올리고뉴클레오티드.
11. 구현예 9 또는 10 에 있어서, LNA 뉴클레오시드 둘 모두는 베타-D-옥시 LNA 인, 올리고뉴클레오티드.
12. 구현예 7 또는 8 에 있어서, 상기 2'-당 개질된 뉴클레오시드는 2'-알콕시알콕시-RNA 인, 올리고뉴클레오티드.
13. 구현예 10 에 있어서, 2'-알콕시-RNA 는 2'-메톡시-RNA 인, 올리고뉴클레오티드.
14. 구현예 1 - 12 중 어느 하나에 있어서, 2'-알콕시알콕시-RNA 는 2'-메톡시에톡시-RNA 인, 올리고뉴클레오티드.
15. 구현예 1 - 14 중 어느 하나에 있어서, 1 내지 15 개, 특히 1 내지 5 개, 보다 특히 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 구현예 1 에 정의된 바와 같은 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
16. 구현예 1 - 15 중 어느 하나에 있어서, 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 및 구현예 1 에 정의된 바와 같은 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결로부터 독립적으로 선택되는 뉴클레오시드간 연결을 추가로 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
17. 구현예 16 에 있어서, 추가의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 및 구현예 1 에 정의된 바와 같은 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결로부터 독립적으로 선택되는, 올리고뉴클레오티드.
18. 구현예 16 또는 17 에 있어서, 추가의 뉴클레오시드간 연결은 모두 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 올리고뉴클레오티드.
19. 구현예 16 또는 17 에 있어서, 추가의 뉴클레오시드간 연결은 모두 구현예 1 에 정의된 바와 같은 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 올리고뉴클레오티드.
20. 구현예 1 - 19 중 어느 하나에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 7 내지 30 개의 뉴클레오티드인, 올리고뉴클레오티드.
21. 구현예 1 - 20 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오시드는 핵염기 개질된 뉴클레오시드인, 올리고뉴클레오티드.
22. 구현예 1 - 21 중 어느 하나에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, 마이크로RNA 미믹 또는 리보자임인, 올리고뉴클레오티드.
23. 구현예 1 - 22 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드의 약학적으로 허용되는 염, 특히 소듐 또는 포타슘 염 또는 암모늄 염.
24. 구현예 1 - 23 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드 또는 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 컨쥬게이트 및 임의로 링커 모이어티를 통해 상기 올리고뉴클레오티드 또는 상기 약학적으로 허용되는 염에 공유 부착된 적어도 하나의 컨쥬게이트 모이어티.
25. 구현예 1 - 24 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드, 약학적으로 허용되는 염 또는 컨쥬게이트 및 치료적으로 불활성인 담체를 포함하는 약학 조성물.
26. 치료적으로 활성인 물질로서 사용하기 위한, 구현예 1 - 24 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드, 약학적으로 허용되는 염 또는 컨쥬게이트.
27. 하기 단계를 포함하는 구현예 1 - 24 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드의 제조 방법:
(a) 티오포스포르아미다이트 뉴클레오시드를 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 말단 5' 산소 원자에 커플링시켜 티오포스파이트 트리에스테르 중간체를 생성하는 단계;
(b) 단계 a) 에서 수득된 티오포스파이트 트리에스테르 중간체를 티오산화시키는 단계; 및
(c) 임의로 올리고뉴클레오티드를 추가로 연장하는 단계.
28. 구현예 27 의 방법에 따라 제조된 올리고뉴클레오티드.
갭머 구현예
1. 세포에서 표적 RNA 의 저해를 위한, 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는, 안티센스 갭머 올리고뉴클레오티드:
Figure pct00032
(IA) 에서 R 은 수소 또는 포스페이트 보호기이고, (IB) 에서 M+ 은 양이온, 예컨대 금속 양이온, 예컨대 알칼리금속 양이온, 예컨대 Na+ 또는 K+ 양이온이거나; 또는 M+ 은 암모늄 양이온이다.
2. 구현예 1 에 있어서, 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 화학식 (IA) 을 갖고, R 은 수소이거나; 또는 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 화학식 (IB) 을 갖고, M+ 은 Na+, K+ 또는 암모늄인, 안티센스 갭머 올리고뉴클레오티드.
3. 구현예 1 또는 2 에 있어서, 상기 화학식 (I) 의 적어도 하나의 뉴클레오시드간 연결의 2 개의 산소 원자 중 하나는 인접 뉴클레오시드 (A1) 의 3'탄소 원자에 연결되고 다른 하나는 또 다른 뉴클레오시드 (A2) 의 5'탄소 원자에 연결되고, 2 개의 뉴클레오시드 (A1) 및 (A2) 중 적어도 하나는 2'-당 개질된 뉴클레오시드인, 갭머 올리고뉴클레오티드.
4. 구현예 1 - 3 중 어느 하나에 있어서, (A1) 및 (A2) 중 하나는 2'-당 개질된 뉴클레오시드이고 다른 하나는 DNA 뉴클레오시드인, 갭머 올리고뉴클레오티드.
5.구현예 1 - 3 중 어느 하나에 있어서, (A1) 및 (A2) 둘 모두는 동시에 2'- 개질된 뉴클레오시드인, 갭머 올리고뉴클레오티드.
6. 구현예 1 - 3 중 어느 하나에 있어서, (A1) 및 (A2) 둘 모두는 동시에 DNA 뉴클레오시드인, 갭머 올리고뉴클레오티드.
7. 구현예 1 - 6 중 어느 하나에 있어서, 갭머 올리고뉴클레오티드는 화학식 5'-F-G-F'-3' 의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하고, G 는 RNaseH 를 동원할 수 있는 5 내지 18 개의 뉴클레오시드의 영역이고, 상기 영역 G 는 플랭킹 영역 F 및 F' 각각에 의해 5' 및 3' 플랭킹되고, 영역 F 및 F' 는 독립적으로 1 내지 7 개의 2'-당 개질된 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어지고, 영역 G 에 인접한 영역 F 의 뉴클레오시드는 2'-당 개질된 뉴클레오시드이고, 영역 G 에 인접한 영역 F' 의 뉴클레오시드는 2'-당 개질된 뉴클레오시드인, 갭머 올리고뉴클레오티드.
8. 구현예 1 - 7 중 어느 하나에 있어서, 2'-당 개질된 뉴클레오시드는 2'-알콕시-RNA, 2'-알콕시알콕시-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA, 2'-플루오로-ANA 및 LNA 뉴클레오시드로부터 독립적으로 선택되는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
9.구현예 8 에 있어서, 2'-알콕시알콕시-RNA 는 2'-메톡시에톡시-RNA (2'-O-MOE) 인, 갭머 올리고뉴클레오티드.
10. 구현예 7 또는 8 에 있어서, 영역 F 및 영역 F' 는 2'-메톡시에톡시-RNA 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어지는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
11. 구현예 7 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 영역 F 또는 영역 F', 또는 영역 F 및 F' 둘 모두의 2'-당 개질된 뉴클레오시드 중 적어도 하나 또는 전부가 LNA 뉴클레오시드인, 갭머 올리고뉴클레오티드.
12. 구현예 7 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 영역 F 또는 영역 F', 또는 영역 F 및 F' 둘 모두가 적어도 하나의 LNA 뉴클레오시드 및 적어도 하나의 DNA 뉴클레오시드를 포함하는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
13. 구현예 7 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 영역 F 또는 영역 F', 또는 영역 F 및 F' 둘 모두가 적어도 하나의 LNA 뉴클레오시드 및 적어도 하나의 비-LNA 2'-당 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 적어도 하나의 2'-메톡시에톡시-RNA 뉴클레오시드를 포함하는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
14. 구현예 1 - 13 중 어느 하나에 있어서, 갭 영역이 5 내지 16 개, 특히 8 내지 16 개, 보다 특히 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 개의 인접 DNA 뉴클레오시드를 포함하는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
15. 구현예 1 - 14 중 어느 하나에 있어서, 영역 F 및 영역 F' 가 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 개의 뉴클레오시드 길이인, 갭머 올리고뉴클레오티드.
16. 구현예 1 - 15 중 어느 하나에 있어서, 영역 F 및 영역 F' 가 각각 독립적으로 1, 2, 3 또는 4 개의 LNA 뉴클레오시드를 포함하는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
17. 구현예 8 내지 16 중 어느 하나에 있어서, LNA 뉴클레오시드가 베타-D-옥시 LNA, 6'-메틸-베타-D-옥시 LNA 및 ENA 로부터 독립적으로 선택되는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
18. 구현예 8 - 18 중 어느 하나에 있어서, LNA 뉴클레오시드가 베타-D-옥시 LNA 인, 갭머 올리고뉴클레오티드.
19. 구현예 1 - 18 중 어느 하나에 있어서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열 (F-G-F') 이, 10 내지 30 개의 뉴클레오티드 길이, 특히 12 내지 22 개, 보다 특히 14 내지 20 개의 올리고뉴클레오티드 길이인, 갭머 올리고뉴클레오티드.
20. 구현예 1 - 19 중 어느 하나에 있어서, 영역 F 및 F' 와 같은 플랭크 영역 중 적어도 하나가 구현예 1 - 19 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 연결을 포함하는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
21. 구현예 1 - 19 중 어느 하나에 있어서, 영역 F 및 F' 와 같은 플랭크 영역 둘 모두가 구현예 1 - 19 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 연결을 포함하는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
22. 구현예 1 - 21 중 어느 하나에 있어서, F 또는 F' 와 같은 플랭크 영역 중 적어도 하나가 구현예 1 - 19 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 적어도 2 개의 포스포로디티오에이트 연결을 포함하는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
23. 구현예 1 - 21 중 어느 하나에 있어서, 플랭크 영역, F 및 F' 둘 모두가 구현예 1 - 19 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 적어도 2 개의 포스포로디티오에이트 연결을 포함하는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
24. 구현예 1 - 23 중 어느 하나에 있어서, 플랭크 영역 중 하나 또는 둘 모두가 각각 LNA 를 3' 뉴클레오시드에 연결하는 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 연결을 갖는 LNA 뉴클레오시드를 포함하는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
25. 구현예 1 - 24 중 어느 하나에 있어서, 플랭크 영역 중 하나 또는 둘 모두가 각각 LNA 를 3' 뉴클레오시드에 연결하는 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 연결에 의해 연결된 2 개 이상의 인접 LNA 뉴클레오시드를 포함하는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
26. 구현예 1 - 25 중 어느 하나에 있어서, 플랭크 영역 중 하나 또는 둘 모두가 각각 MOE 를 3' 뉴클레오시드에 연결하는 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 연결을 갖는 MOE 뉴클레오시드를 포함하는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
27. 구현예 1 - 26 중 어느 하나에 있어서, 플랭크 영역 중 하나 또는 둘 모두가 각각 MOE 를 3' 뉴클레오시드에 연결하는 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 연결에 의해 연결된 2 개 이상의 인접 MOE 뉴클레오시드를 포함하는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
28. 구현예 1 - 27 중 어느 하나에 있어서, 플랭크 영역, F 및 F' 가 함께 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하고, 임의로, 영역 F 의 3' 말단 뉴클레오시드와 영역 G 의 5' 말단 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오시드간 연결은 또한 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 갭머 올리고뉴클레오티드.
29. 구현예 1 - 28 중 어느 하나에 있어서, 영역 F 또는 영역 F', 영역 F 와 영역 G 사이 또는 영역 G 와 영역 F' 사이의 인접 뉴클레오시드에 위치한 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 1 개의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
30. 구현예 1 - 29 중 어느 하나에 있어서, 갭 영역이 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 1, 2, 3 또는 4 개의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하고, 나머지 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 갭머 영역
31. 구현예 1 - 30 중 어느 하나에 있어서, 갭 영역이 적어도 5 개의 인접 DNA 뉴클레오티드의 영역, 예컨대 6 - 18 개의 DNA 인접 뉴클레오티드, 또는 8 - 14 개의 인접 DNA 뉴클레오티드의 영역을 포함하는, 갭머.
32. 구현예 1 - 31 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 (Sp, S) 또는 (Rp, R) 을 추가로 포함하는, 갭머:
Figure pct00033
여기서, N1 및 N2 는 뉴클레오시드이다.
33. 구현예 32 에 있어서, 갭머가 2 개의 DNA 뉴클레오시드 사이, 예컨대 갭 영역에서 2 개의 DNA 뉴클레오시드 사이에 적어도 하나의 입체 정의된 뉴클레오시드간 연결 (Sp, S) 또는 (Rp, R) 을 포함하는, 갭머.
34. 구현예 32 또는 33 에 있어서, 갭 영역이 Rp 및 Sp 뉴클레오시드간 연결로부터 독립적으로 선택되는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 개의 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
35. 구현예 32 - 33 중 어느 하나에 있어서, 영역 G 가 화학식 IB 의 적어도 2, 3, 또는 4 개의 뉴클레오시드간 연결을 추가로 포함하는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
34. 구현예 32 - 35 중 어느 하나에 있어서, (i) 영역 G 내의 모든 나머지 뉴클레오시드간 연결 (즉 영역 G 에서의 뉴클레오시드 사이) 이 Rp 및 Sp 뉴클레오시드간 연결로부터 독립적으로 선택되는 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이거나, 또는 (ii) 영역 G 내의 모든 뉴클레오시드간 연결이 Rp 및 Sp 뉴클레오시드간 연결로부터 독립적으로 선택되는 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 갭머 올리고뉴클레오티드.
35. 구현예 1 - 34 중 어느 하나에 있어서, 플랭크 영역 내의 모든 뉴클레오시드간 연결이 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결이고, 임의로 영역 F 의 3' 말단 뉴클레오시드와 영역 G 의 5' 말단 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오시드간 연결이 또한 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결이고, 영역 G 의 3' 말단 뉴클레오시드와 영역 F' 의 5' 말단 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오시드간 연결이 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 갭머 올리고뉴클레오티드.
36. 구현예 6 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 영역 G 의 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 및 구현예 1 에 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결로부터 독립적으로 선택되는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
37. 구현예 7 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 영역 G 의 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오시드간 연결이 구현예 1 에 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 0, 1, 2 또는 3 개의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결, 특히 화학식 (I) 의 0 개의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
38. 구현예 1 - 37 중 어느 하나에 있어서, 나머지 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트, 포스포디에스테르 및 구현예 1 에 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
39. 구현예 7 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 영역 F 의 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오시드간 연결 및 영역 F' 의 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트 및 구현예 1 에 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결로부터 독립적으로 선택되는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
40. 구현예 7 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 각각의 플랭킹 영역 F 및 F' 는 구현예 1 에 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 개의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 독립적으로 포함하는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
41. 구현예 7 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 플랭킹 영역 F 및/또는 F' 의 모든 뉴클레오시드간 연결은 구현예 1 에 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 포스포르디티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 갭머 올리고뉴클레오티드.
42. 구현예 1 - 41 중 어느 하나에 있어서, 갭머 올리고뉴클레오티드가 적어도 하나의 입체 정의된 뉴클레오시드간 연결, 예컨대 적어도 하나의 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
43. 구현예 1 - 42 중 어느 하나에 있어서, 갭 영역이 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
44. 구현예 1 - 43 중 어느 하나에 있어서, 갭 영역의 뉴클레오시드 사이의 모든 뉴클레오시드간 연결이 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 갭머 올리고뉴클레오티드.
45. 구현예 7 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 영역 F 의 뉴클레오시드 사이, 또는 영역 F' 의 뉴클레오시드 사이, 또는 영역 F 와 영역 G 사이, 또는 영역 G 와 영역 F' 사이에 위치하고, 영역 F 및 F' 내, 영역 F 와 영역 G 사이 및 영역 G 와 영역 F' 사이의 나머지 뉴클레오시드간 연결은 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결, 입체 랜덤 뉴클레오시드간 연결, 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결 및 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결로부터 독립적으로 선택되는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
46. 구현예 45 에 있어서, 영역 F 내, 영역 F' 내 또는 영역 F 및 영역 F' 내의 나머지 뉴클레오시드간 연결은 모두 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 갭머 올리고뉴클레오티드.
47. 구현예 6 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 영역 G 의 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오시드간 연결은 구현예 1 에 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 0, 1, 2 또는 3 개의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하고, 영역 G 내의 나머지 뉴클레오시드간 연결은 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결, 입체 랜덤 뉴클레오시드간 연결 및 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결로부터 독립적으로 선택되는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
48. 구현예 1 - 47 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드 또는 2'-O-MOE 뉴클레오시드인, 갭머 올리고뉴클레오티드.
49. 구현예 1 - 48 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드 또는 2'-O-MOE 뉴클레오시드인, 갭머 올리고뉴클레오티드.
50. 구현예 1 - 49 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 2 개의 3' 최말단 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드 및 2'-O-MOE 뉴클레오시드로부터 독립적으로 선택되는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
51. 구현예 1 - 50 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 2 개의 5' 최말단 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드 및 2'-O-MOE 뉴클레오시드로부터 독립적으로 선택되는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
52. 구현예 1 - 51 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3 개의 3' 최말단 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드 및 2'-O-MOE 뉴클레오시드로부터 독립적으로 선택되는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
53. 구현예 1 - 52 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3 개의 5' 최말단 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드 및 2'-O-MOE 뉴클레오시드로부터 독립적으로 선택되는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
54. 구현예 1 - 53 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 2 개의 3' 최말단 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드인, 갭머 올리고뉴클레오티드.
55. 구현예 1 - 54 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 2 개의 5' 최말단 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드인, 갭머 올리고뉴클레오티드.
56. 구현예 1 - 55 중 어느 하나에 있어서, 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 뉴클레오시드 (A2) 는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 뉴클레오시드인, 갭머 올리고뉴클레오티드.
57. 구현예 1 - 56 중 어느 하나에 있어서, 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 뉴클레오시드 (A1) 는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 뉴클레오시드인, 갭머 올리고뉴클레오티드.
58. 구현예 7 - 57 중 어느 하나에 있어서, 갭머 올리고뉴클레오티드는 화학식 5'-D'-F-G-F'-D"-3' 의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하고, F, G 및 F' 는 구현예 7 내지 45 중 어느 하나에 정의된 바와 같고, 영역 D' 및 D" 는 각각 독립적으로 0 내지 5 개의 뉴클레오티드, 특히 2, 3 또는 4 개의 뉴클레오티드, 특히 DNA 뉴클레오티드, 예컨대 포스포디에스테르 연결된 DNA 뉴클레오시드로 이루어지는, 갭머 올리고뉴클레오티드 [갭머 올리고뉴클레오티드, 및 플랭킹 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드].
59. 구현예 1 - 58 중 어느 하나에 있어서, 갭머 올리고뉴클레오티드는 인간 RNaseH1 를 동원할 수 있는, 갭머 올리고뉴클레오티드.
60. 구현예 1 - 59 중 어느 하나에 있어서, 갭머 올리고뉴클레오티드는 포유류, 예컨대 인간, mRNA 또는 pre-mRNA 표적, 또는 바이러스 표적, 또는 긴 비-코딩 RNA 의 시험관내 또는 생체내 저해를 위한 것인, 갭머 올리고뉴클레오티드.
61. 구현예 1 - 60 중 어느 하나에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드의 약학적으로 허용되는 염, 특히 소듐 또는 포타슘 염.
62. 구현예 1 - 61 중 어느 하나에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드 또는 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 컨쥬게이트 및 임의로 링커 모이어티를 통해 상기 올리고뉴클레오티드 또는 상기 약학적으로 허용되는 염에 공유 부착된 적어도 하나의 컨쥬게이트 모이어티.
63. 구현예 1 - 62 중 어느 하나에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드, 약학적으로 허용되는 염 또는 컨쥬게이트 및 치료적으로 불활성인 담체를 포함하는 약학 조성물.
64. 치료적으로 활성인 물질로서 사용하기 위한 구현예 1 내지 63 중 어느 하나에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드, 약학적으로 허용되는 염 또는 컨쥬게이트.
안티센스 올리고뉴클레오티드 구현예
본 발명은 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다:
Figure pct00034
식 중, 2 개의 산소 원자 중 하나는 인접 뉴클레오시드 (A1) 의 3'탄소 원자에 연결되고 다른 하나는 또 다른 인접 뉴클레오시드 (A2) 의 5'탄소 원자에 연결되고, (IA) 에서 R 은 수소 또는 포스페이트 보호기이고, (IB) 에서 M+ 은 양이온, 예컨대 금속 양이온, 예컨대 알칼리금속 양이온, 예컨대 Na+ 또는 K+ 양이온이거나; 또는 M+ 은 암모늄 양이온이다.
대안적으로 언급하면 M 은 금속, 예컨대 알칼리금속, 예컨대 Na 또는 K 이거나; 또는 M 은 NH4 이다.
올리고뉴클레오티드는 예를 들어 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 이는 표적 핵산, 예컨대 표적 마이크로RNA 의 발현을 조절할 수 있거나 또는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하는 표적 pre-mRNA 의 스플라이싱을 조절할 수 있다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산에 상보적이고 표적 핵산에 하이브리드화될 수 있고 표적 핵산의 발현을 조절할 수 있는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열은 (A1) 또는 (A2) 가 DNA 뉴클레오시드이거나, 또는 (A1) 및 (A2) 둘 모두가 DNA 뉴클레오시드인 믹스머 올리고뉴클레오티드이다.
본 발명의 맥락에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 핵산 표적, 예컨대 표적 RNA 에 상보적이고 핵산 표적 (예를 들어 mRNA 표적, premRNA 표적, 바이러스 RNA 표적, 또는 긴 비-코딩 RNA 표적) 의 발현을 조절 (예를 들어 pre-mRNA 표적의 스플라이스 조절) 또는 저해할 수 있는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다. 표적에 따라, 올리고뉴클레오티드의 길이 또는 그에 상보적인 영역의 길이 (즉 안티센스 - 바람직하게는 상보적 영역은 표적에 완전히 상보적임) 는 7 - 30 개의 뉴클레오티드 (인접 뉴클레오티드 서열로 지칭되는 영역) 일 수 있다. 예를 들어, 마이크로RNA 의 LNA 뉴클레오티드 저해제는 7 개의 인접 상보적 뉴클레오티드만큼 짧을 수 있고 (및 30 개의 뉴클레오티드만큼 길 수 있음), RNaseH 동원 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 적어도 12 개의 인접 상보적 뉴클레오티드 길이, 예컨대 12- 26 개의 뉴클레오티드 길이이다. 스플라이스 조절 안티센스 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 10 - 30 개의 상보적 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 갖는다.
스플라이스-스위칭 올리고뉴클레오티드 (SSO) 로도 알려진 스플라이스 조절 올리고뉴클레오티드는 pre-mRNA 와 염기쌍을 이루고 스플라이싱 머시너리 구성 요소와 pre-mRNA 사이에 일어나는 단백질-RNA 결합 상호 작용 또는 RNA-RNA 염기쌍을 차단하여 전사체의 정상적인 스플라이싱 레퍼토리를 방해하는 짧은 합성, 안티센스, 개질된 핵산이다. pre-mRNA 의 스플라이싱은 다수의 단백질 코딩 유전자의 적절한 발현을 위해 필요하므로, 표적화 방법은 유전자에서 단백질 생산을 조작하는 수단을 제공한다. 스플라이싱 조절은 정상 스플라이싱을 방해하는 돌연변이에 의해 야기된 질환의 경우 특히 가치가 있거나 또는 유전자 전사체의 정상 스플라이싱 과정을 방해하는 경우 치료적일 수 있다. SSO 는 치료 방식으로 스플라이싱을 표적화하고 변경하는 효과적이고 구체적인 방법을 제공한다. Haven's and Hasting NAR (2016) 44, 6549-6563 참조. SSO 는 표적 pre-mRNA 에서 엑손/인트론 경계에 상보적일 수 있거나 또는 pre-mRNA 의 스플라이싱을 조절하는 pre-mRNA 내의 표적 스플라이싱 향상된 또는 사일렌서 요소 (총체적으로 시스-작용 스플라이스 요소로 지칭됨) 를 표적으로 할 수 있다. 스플라이스 조절은 엑손 스키핑, 또는 엑손 포함을 야기할 수 있으며, 이에 의해 pre-mRNA 의 대안적 스플라이싱을 조절한다. SSO 는 표적 pre-mRNA 의 비-뉴클레아제 매개 조절에 의해 기능하며, 따라서 RNaseH 를 동원할 수 없으며, 이들은 종종 완전히 개질된 올리고뉴클레오티드이며, 즉 각각의 뉴클레오시드는 개질된 당 모이어티, 예컨대 2'당 치환된 당 모이어티 (예를 들어 포스포로티오에이트 백본을 기준으로 예를 들어 15 - 25 개의 뉴클레오티드 길이, 종종 18 - 22 개 또는 20 개의 뉴클레오티드 길이의 완전히 2'-O-MOE 올리고뉴클레오티드), 또는 LNA 믹스머 올리고뉴클레오티드 (DNA 및 LNA 뉴클레오시드를 포함하는 10 - 30 개의 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드), 및 임의로 다른 2' 당 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 2'-O-MOE 를 포함한다. DNA 뉴클레오시드를 포함하지 않지만, LNA 및 다른 2'당 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 2'-O-MOE 뉴클레오시드는 포함하는 LNA 올리고뉴클레오티드가 또한 예상된다. 본원에 참조로 포함되는 Haven's and Hasting NAR (2016) 44, 6549-6563 의 표 1 은 생체내 활성을 보고하고 하기 표 A 에 재현된 사용된 올리고뉴클레오티드의 화학 및 SSO 표적의 범위를 예시한다:
표 A
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
본 발명의 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 HBB, FKTN, LMNA, CEP290, CLCN1, USH1C, BTK, LRP8, CTLA4, BCL2L1, ERBB4, MDM4, STAT3, IL1RAP, TNFRSF1B, FLT1, KDR, SMN2, MYBPC3, TTN, DMD, NBN, IL10, HTT, APOB, MSTN, GYS2, 및 ATXN3 로 이루어진 군으로부터 선택되는 pre-mRNA 에 상보적인 스플라이스 조절 올리고뉴클레오티드이다. 표적 기준으로 본 발명의 SSO 로 치료될 수 있는 예시적인 질환이 표 A 에 제공되어 있다.
하기 구현예는 일반적으로 본 발명의 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 특히 스플라이스 조절 안티센스 올리고뉴클레오티드 (SSO) 에 관한 것이다:
1. 세포에서 RNA 표적의 조절을 위한 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드로서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 길이가 10 - 30 개의 뉴클레오티드인 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 인접 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 2'당 개질된 뉴클레오시드를 포함하고, 인접 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오시드 사이에 존재하는 뉴클레오시드간 연결 중 적어도 하나는 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 연결인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드:
Figure pct00039
식 중, 2 개의 산소 원자 중 하나는 인접 뉴클레오시드 (A1) 의 3'탄소 원자에 연결되고 다른 하나는 또 다른 인접 뉴클레오시드 (A2) 의 5'탄소 원자에 연결되고, R 은 수소 또는 포스페이트 보호기이다.
2. 구현예 1 에 있어서, 2 개의 뉴클레오시드 (A1) 및 (A2) 중 적어도 하나는 2' 당 개질된 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
3. 구현예 1 에 있어서, 뉴클레오시드 (A1) 및 (A2) 둘 모두는 2' 당 개질된 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
4. 구현예 1 - 3 중 어느 하나에 있어서, 2 개의 뉴클레오시드 (A1) 및 (A2) 중 적어도 하나, 또는 뉴클레오시드 (A1) 및 (A2) 둘 모두는 DNA 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
5. 구현예 1 - 4 중 어느 하나에 있어서, (A1) 및 (A2) 중 적어도 하나는 2'-당 개질된 뉴클레오시드 또는 2'-알콕시-RNA, 2'-알콕시알콕시-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA, 2'-플루오로-ANA 또는 LNA 뉴클레오시드로부터 독립적으로 선택된 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
6. 구현예 1 - 5 중 어느 하나에 있어서, (A1) 및 (A2) 중 적어도 하나는 LNA 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
7. 구현예 1 - 5 중 어느 하나에 있어서, (A1) 및 (A2) 둘 모두는 LNA 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
8. 구현예 1 - 6 중 어느 하나에 있어서, (A1) 및 (A2) 중 적어도 하나는 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
9. 구현예 1 - 5 중 어느 하나에 있어서, (A1) 및 (A2) 둘 모두는 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
10. 구현예 1 - 8 중 어느 하나에 있어서, LNA 뉴클레오시드는 베타-D-옥시 LNA, 6'-메틸-베타-D-옥시 LNA 및 ENA 로 이루어진 군으로부터 선택되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
11. 구현예 1 - 8 중 어느 하나에 있어서, LNA 뉴클레오시드는 베타-D-옥시 LNA 인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
12. 구현예 1 - 11 중 어느 하나에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열이 하나 이상의 추가의 2'-당 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 2'-알콕시-RNA, 2'-알콕시알콕시-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA, 2'-플루오로-ANA 또는 LNA 뉴클레오시드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 2'당 개질된 뉴클레오시드를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
13. 구현예 1 - 12 중 어느 하나에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열이 LNA 뉴클레오시드 및 DNA 뉴클레오시드 둘 모두를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
14. 구현예 1 - 12 중 어느 하나에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열이 LNA 뉴클레오시드 및 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오시드 둘 모두를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
15. 구현예 1 - 13 중 어느 하나에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열이 LNA 뉴클레오시드 및 2'플루오로 RNA 뉴클레오시드 둘 모두를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
16. 구현예 1 - 13 중 어느 하나에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열이 하기를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드:
(i) LNA 및 DNA 뉴클레오시드만
(ii) LNA 및 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오시드만
(iii) LNA, DNA 및 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오시드만
(iv) LNA, 2'플루오로 RNA 및 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오시드만
(v) LNA, DNA, 2'플루오로 RNA 및 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오시드만 또는 LNA, 2'플루오로 RNA 및 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오시드만
(vi) 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오시드만.
17. 구현예 1 - 16 중 어느 하나에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열이 4 개 이상의 인접 DNA 뉴클레오시드의 서열을 포함하지 않거나, 또는 3 개 이상의 인접 DNA 뉴클레오시드의 서열을 포함하지 않는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
18. 구현예 1 - 17 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열이 믹스머 올리고뉴클레오티드 또는 토탈머 올리고뉴클레오티드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
19. 구현예 1 - 18 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 인간 RNAseH1 을 동원할 수 없는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
20. 구현예 1 - 19 중 어느 하나에 있어서, 뉴클레오시드 (A2) 가 인접 뉴클레오티드 서열 또는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
21. 구현예 1 - 20 중 어느 하나에 있어서, 뉴클레오시드 (A1) 가 인접 뉴클레오티드 서열 또는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
22. 구현예 1 - 21 중 어느 하나에 있어서, 화학식 I 의 적어도 2 개의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결, 예컨대 화학식 I 의 2, 3, 4, 5, 또는 6 개의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
23. 구현예 1 - 22 중 어느 하나에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열의 2 개의 3' 말단 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오시드간 연결이 화학식 I 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결이고, 인접 뉴클레오티드 서열의 2 개의 5' 말단 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오시드간 연결이 화학식 I 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
24. 구현예 1 - 23 중 어느 하나에 있어서, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 추가로 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
25. 구현예 1 - 24 중 어느 하나에 있어서, 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 추가로 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
26. 구현예 1 - 25 중 어느 하나에 있어서, 나머지 뉴클레오시드간 연결이 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결, 및 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
27. 구현예 1 - 26 중 어느 하나에 있어서, 나머지 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
28. 구현예 1 - 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 인접 뉴클레오티드 서열이 포유류 pre-mRNA, 포유류 성숙 mRNA 표적, 바이러스 RNA 표적, 또는 포유류 긴 비-코딩 RNA 에 상보적, 예컨대 100% 상보적인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
29. 구현예 28 에 있어서, RNA 표적이 인간 RNA 표적인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
30. 구현예 1 - 29 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 포유류, 예컨대 인간 pre-mRNA 표적의 스플라이싱을 조절하며, 예를 들어 스플라이스 스키핑 또는 스플라이스 조절 안티센스 올리고뉴클레오티드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
31. 구현예 1 - 30 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 인간 pre-mRNA 의 인트론/엑손 스플라이스 부위, 또는 인간 pre-mRNA 의 스플라이스 조절 영역에 상보적, 예컨대 100% 상보적인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
32. 구현예 1 - 30 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열이 TNFR2, HBB, FKTN, LMNA, CEP290, CLCN1, USH1C, BTK, LRP8, CTLA4, BCL2L1, ERBB4, MDM4, STAT3, IL1RAP, TNFRSF1B, FLT1, KDR, SMN2, MYBPC3, TTN, DMD, NBN, IL10, HTT, APOB, MSTN, GYS2, 및 ATXN3 로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 pre-mRNA 서열에 상보적, 예컨대 완전히 상보적인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
33. 구현예 1 - 32 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 SSO#1 - SSO#25 로 이루어진 군으로부터 선택된 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
34. 구현예 1 - 33 중 어느 하나에 있어서, 세포가 인간 세포인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
35. 구현예 1 - 34 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이가 10 - 30 개의 뉴클레오티드 길이인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
36. 구현예 1 - 34 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이가 12 - 24 개의 뉴클레오티드 길이인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
37. 구현예 1 - 36 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 뉴클레오시드가 LNA 뉴클레오시드 또는 2-O-메톡시에틸 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
38. 구현예 1 - 27 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 5' 말단 뉴클레오시드가 LNA 뉴클레오시드 또는 2-O-메톡시에틸 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
39. 구현예 1 - 38 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 5' 말단 뉴클레오시드 및 3' 말단 뉴클레오시드 둘 모두가 LNA 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
40. 구현예 1 - 39 중 어느 하나에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열이 2 또는 3 개의 LNA 인접 뉴클레오티드의 적어도 하나의 영역, 및/또는 2 또는 3 개의 인접 2'-O-메톡시에틸 인접 뉴클레오티드의 적어도 하나의 영역을 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
41. 구현예 1 - 40 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드의 약학적으로 허용되는 염, 특히 소듐 또는 포타슘 염 또는 암모늄 염.
42. 구현예 1 - 41 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드 또는 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 컨쥬게이트 및 임의로 링커 모이어티를 통해 상기 올리고뉴클레오티드 또는 상기 약학적으로 허용되는 염에 공유 부착된 적어도 하나의 컨쥬게이트 모이어티.
43. 구현예 1 - 42 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드, 약학적으로 허용되는 염 또는 컨쥬게이트 및 치료적으로 불활성인 담체를 포함하는 약학 조성물.
44. 치료적으로 활성인 물질로서 사용하기 위한 구현예 1 - 43 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드, 약학적으로 허용되는 염 또는 컨쥬게이트.
45. 유효량의 구현예 1 - 44 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드, 약학적으로 허용되는 염, 컨쥬게이트 또는 조성물을 세포에 투여하는 단계를 포함하는, RNA 를 발현하는 세포에서 표적 RNA 의 조절 방법.
46. 유효량의 구현예 1 - 44 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드, 약학적으로 허용되는 염, 컨쥬게이트 또는 조성물을 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 표적 pre-mRNA 를 발현하는 세포에서 표적 pre-RNA 의 스플라이싱의 조절 방법.
47. 구현예 45 또는 46 에 있어서, 상기 방법이 시험관내 방법 또는 생체내 방법인, 방법.
48. 세포에서, 예컨대 인간 세포에서 RNA 의 저해를 위한, 구현예 1 - 44 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드, 약학적 염, 컨쥬게이트, 또는 조성물의 용도로서, 상기 용도는 시험관내 또는 생체내인 용도.
특정 믹스머 구현예
1. 세포에서 RNA 표적의 조절을 위한, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드로서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 10 - 30 개의 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 인접 뉴클레오티드 서열은 2'당 개질된 뉴클레오시드의 교대 영역을 포함하고, 인접 뉴클레오티드 서열을 갖는 인접 DNA 뉴클레오시드의 최대 길이는 3 또는 4 이고, 인접 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오시드 사이에 존재하는 뉴클레오시드간 연결 중 적어도 하나는 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 연결인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드:
Figure pct00040
식 중, 2 개의 산소 원자 중 하나는 인접 뉴클레오시드 (A1) 의 3'탄소 원자에 연결되고 다른 하나는 또 다른 인접 뉴클레오시드 (A2) 의 5'탄소 원자에 연결되고, R 은 수소 또는 포스페이트 보호기이다.
2. 구현예 1 에 있어서, 2 개의 뉴클레오시드 (A1) 및 (A2) 중 적어도 하나는 2' 당 개질된 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
3. 구현예 1 에 있어서, 뉴클레오시드 (A1) 및 (A2) 둘 모두는 2' 당 개질된 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
4. 구현예 1 - 3 중 어느 하나에 있어서, 2 개의 뉴클레오시드 (A1) 및 (A2) 중 적어도 하나, 또는 뉴클레오시드 (A1) 및 (A2) 둘 모두는 DNA 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
5. 구현예 1 - 4 중 어느 하나에 있어서, (A1) 및 (A2) 중 적어도 하나는 2'-당 개질된 뉴클레오시드 또는 2'-알콕시-RNA, 2'-알콕시알콕시-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA, 2'-플루오로-ANA 또는 LNA 뉴클레오시드로부터 독립적으로 선택된 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
6. 구현예 1 - 5 중 어느 하나에 있어서, (A1) 및 (A2) 중 적어도 하나는 LNA 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
7. 구현예 1 - 5 중 어느 하나에 있어서, (A1) 및 (A2) 둘 모두는 LNA 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
8. 구현예 1 - 6 중 어느 하나에 있어서, (A1) 및 (A2) 중 적어도 하나는 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
9. 구현예 1 - 5 중 어느 하나에 있어서, (A1) 및 (A2) 둘 모두는 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
10. 구현예 1 - 8 중 어느 하나에 있어서, LNA 뉴클레오시드는 베타-D-옥시 LNA, 6'-메틸-베타-D-옥시 LNA 및 ENA 로 이루어진 군으로부터 선택되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
11. 구현예 1 - 8 중 어느 하나에 있어서, LNA 뉴클레오시드는 베타-D-옥시 LNA 인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
12. 구현예 1 - 11 중 어느 하나에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열이 하나 이상의 추가의 2'-당 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 2'-알콕시-RNA, 2'-알콕시알콕시-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA, 2'-플루오로-ANA 또는 LNA 뉴클레오시드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 2'당 개질된 뉴클레오시드를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
13. 구현예 1 -12 중 어느 하나에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열이 LNA 뉴클레오시드 및 DNA 뉴클레오시드 둘 모두를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
14. 구현예 1 - 12 중 어느 하나에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열이 LNA 뉴클레오시드 및 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오시드 둘 모두를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
15. 구현예 1 - 13 중 어느 하나에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열이 LNA 뉴클레오시드 및 2'플루오로 RNA 뉴클레오시드 둘 모두를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
16. 구현예 1 - 13 중 어느 하나에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열이 하기를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드:
(i) LNA 및 DNA 뉴클레오시드
(ii) LNA, DNA 및 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오시드
(iii) LNA, DNA, 2'플루오로 RNA 및 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오시드.
17. 구현예 1 - 16 중 어느 하나에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열이 3 개 이상의 인접 DNA 뉴클레오시드의 서열을 포함하지 않거나, 또는 2 개 이상의 인접 DNA 뉴클레오시드의 서열을 포함하지 않는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
18. 구현예 1 - 17 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열이 믹스머 올리고뉴클레오티드, 예컨대 스플라이스 조절 올리고뉴클레오티드 또는 마이크로RNA 저해제 올리고뉴클레오티드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
19. 구현예 18 에 있어서, 믹스머가 교대 영역 모티프를 포함하거나 이로 이루어지는, 안티센스 올리고뉴클레오티드:
Figure pct00041
여기서, L 은 2' 당 개질된 뉴클레오시드를 나타내고, D 는 DNA 뉴클레오시드를 나타내고, 각각의 m 은 1 - 6 으로부터 독립적으로 선택되고, 각각의 n 은 1, 2, 3 및 4, 예컨대 1 - 3 으로부터 독립적으로 선택된다.
20. 구현예 19 에 있어서, 각각의 L 뉴클레오시드는 LNA, 2'-O-MOE 또는 2'플루오로 뉴클레오시드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 각각의 L 은 독립적으로 LNA 또는 2'-O-MOE 인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
21. 구현예 20 에 있어서, 각각의 L 은 LNA 인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
22. 구현예 1 - 21 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인간 RNAseH1 을 동원할 수 없는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
23. 구현예 1 - 22 중 어느 하나에 있어서, 뉴클레오시드 (A2) 가 인접 뉴클레오티드 서열 또는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
24. 구현예 1 - 23 중 어느 하나에 있어서, 뉴클레오시드 (A1) 가 인접 뉴클레오티드 서열 또는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
25. 구현예 1 - 24 중 어느 하나에 있어서, 화학식 I 의 적어도 2 개의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결, 예컨대 화학식 I 의 2, 3, 4, 5, 또는 6 개의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
26. 구현예 1 - 25 중 어느 하나에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열이 2 개의 인접 DNA 뉴클레오티드를 포함하고, 2 개의 인접 DNA 뉴클레오티드 사이의 뉴클레오시드 연결이 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결, 즉 P2S 연결된 DNA 뉴클레오티드 쌍인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
27. 구현예 1 - 26 중 어느 하나에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열이 1 개 초과의 P2S 연결된 DNA 뉴클레오티드 쌍을 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
28. 구현예 1 - 26 중 어느 하나에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열에 존재하는 2 개의 인접 DNA 뉴클레오티드 사이의 모든 뉴클레오시드 연결이 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
29. 구현예 1 - 27 중 어느 하나에 있어서, 2'당 개질된 뉴클레오시드와 DNA 뉴클레오시드 사이의 적어도 하나의 뉴클레오시드간 연결이 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
30. 구현예 1 - 27 중 어느 하나에 있어서, 2'당 개질된 뉴클레오시드와 DNA 뉴클레오시드 사이의 1 개 초과의 뉴클레오시드간 연결이 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
31. 구현예 1 - 27 중 어느 하나에 있어서, 2'당 개질된 뉴클레오시드와 DNA 뉴클레오시드 사이의 모든 뉴클레오시드간 연결이 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
32. 구현예 1 - 27 중 어느 하나에 있어서, 2 개의 2'당 개질된 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오시드간 연결 중 적어도 하나가 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결이 아니고, 예컨대 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
33. 구현예 1 - 27 중 어느 하나에 있어서, 2 개의 2'당 개질된 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오시드간 연결 모두가 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결이 아니고, 예컨대 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
34. 구현예 1 - 33 중 어느 하나에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열의 2 개의 3' 말단 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오시드간 연결이 화학식 I 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결이고, 인접 뉴클레오티드 서열의 2 개의 5' 말단 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오시드간 연결이 화학식 I 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
35. 구현예 1 - 34 중 어느 하나에 있어서, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 추가로 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
36. 구현예 1 - 35 중 어느 하나에 있어서, 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 추가로 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
37. 구현예 1 - 35 중 어느 하나에 있어서, 나머지 뉴클레오시드간 연결이 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결, 및 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
38. 구현예 1 -36 중 어느 하나에 있어서, 나머지 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
39. 구현예 1 -37 중 어느 하나에 있어서, 상기 인접 뉴클레오티드 서열이 포유류, 예컨대 인간 pre-mRNA 에 상보적, 예컨대 100% 상보적인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
40. 구현예 1 - 38 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 포유류, 예컨대 인간 pre-mRNA 표적의 스플라이싱을 조절하며, 예를 들어 스플라이스 스키핑 또는 스플라이스 조절 안티센스 올리고뉴클레오티드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
41. 구현예 1 - 39 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 인간 pre-mRNA 의 인트론/엑손 스플라이스 부위, 또는 인간 pre-mRNA 의 스플라이스 조절 영역에 상보적, 예컨대 100% 상보적인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
42. 구현예 1 - 41 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열이 TNFR2, HBB, FKTN, LMNA, CEP290, CLCN1, USH1C, BTK, LRP8, CTLA4, BCL2L1, ERBB4, MDM4, STAT3, IL1RAP, TNFRSF1B, FLT1, KDR, SMN2, MYBPC3, TTN, DMD, NBN, IL10, HTT, APOB, MSTN, GYS2, 및 ATXN3 로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 pre-mRNA 서열에 상보적, 예컨대 완전히 상보적인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
43. 구현예 1 - 42 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 SSO#1 - SSO#25 로 이루어진 군으로부터 선택된 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
44. 구현예 1 - 43 중 어느 하나에 있어서, 세포가 포유류 세포인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
45. 구현예 1 - 44 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이가 10 - 30 개의 뉴클레오티드 길이인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
46. 구현예 1 - 44 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이가 12 - 24 개의 뉴클레오티드 길이인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
47. 구현예 1 - 46 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 뉴클레오시드가 LNA 뉴클레오시드 또는 2-O-메톡시에틸 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
48. 구현예 1 - 47 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 5' 말단 뉴클레오시드가 LNA 뉴클레오시드 또는 2-O-메톡시에틸 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
49. 구현예 1 - 48 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 5' 말단 뉴클레오시드 및 3' 말단 뉴클레오시드 둘 모두가 LNA 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
50. 구현예 1 - 49 중 어느 하나에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열이 2 또는 3 개의 LNA 인접 뉴클레오티드의 적어도 하나의 영역, 및/또는 2 또는 3 개의 인접 2'-O-메톡시에틸 인접 뉴클레오티드의 적어도 하나의 영역을 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
51. 구현예 1 - 50 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드의 약학적으로 허용되는 염, 특히 소듐 또는 포타슘 염 또는 암모늄 염.
52. 구현예 1 - 51 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드 또는 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 컨쥬게이트 및 임의로 링커 모이어티를 통해 상기 올리고뉴클레오티드 또는 상기 약학적으로 허용되는 염에 공유 부착된 적어도 하나의 컨쥬게이트 모이어티.
53. 구현예 1 - 52 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드, 약학적으로 허용되는 염 또는 컨쥬게이트 및 치료적으로 불활성인 담체를 포함하는 약학 조성물.
54. 치료적으로 활성인 물질로서 사용하기 위한 구현예 1 - 53 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드, 약학적으로 허용되는 염 또는 컨쥬게이트.
55. 유효량의 구현예 1 - 54 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드, 약학적으로 허용되는 염, 컨쥬게이트 또는 조성물을 세포에 투여하는 단계를 포함하는, RNA 를 발현하는 세포에서 표적 RNA 의 조절 방법.
56. 유효량의 구현예 1 - 54 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드, 약학적으로 허용되는 염, 컨쥬게이트 또는 조성물을 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 표적 pre-mRNA 를 발현하는 세포에서 표적 pre-RNA 의 스플라이싱의 조절 방법.
57. 구현예 55 또는 56 에 있어서, 상기 방법이 시험관내 방법 또는 생체내 방법인, 방법.
58. 세포에서, 예컨대 포유류 세포에서 RNA 의 저해를 위한, 구현예 1 - 54 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드, 약학적 염, 컨쥬게이트, 또는 조성물의 용도로서, 상기 용도는 시험관내 또는 생체내인 용도.
3' 말단 보호에 관한 특정 구현예
1. 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드:
Figure pct00042
식 중, 2 개의 산소 원자 중 하나는 인접 뉴클레오시드 (A1) 의 3'탄소 원자에 연결되고 다른 하나는 또 다른 인접 뉴클레오시드 (A2) 의 5'탄소 원자에 연결되고, (IA) 에서 R 은 수소 또는 포스페이트 보호기이고, (IB) 에서 M+ 은 양이온, 예컨대 금속 양이온, 예컨대 알칼리금속 양이온, 예컨대 Na+ 또는 K+ 양이온이거나; 또는 M+ 은 암모늄 양이온이고, 2 개의 뉴클레오시드 (A1) 및 (A2) 중 적어도 하나는 2' 당 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 LNA 뉴클레오시드 또는 2'-O-MOE 뉴클레오시드이고, R 은 수소 또는 포스페이트 보호기이고, A2 는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 뉴클레오시드이다.
2. 구현예 1 에 있어서, (A2) 는 LNA 뉴클레오시드이거나, 또는 (A1) 및 (A2) 둘 모두는 LNA 뉴클레오시드인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
3. 구현예 1 에 있어서, (A2) 는 LNA 뉴클레오시드이고 (A1) 는 당 개질된 뉴클레오티드인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
4.구현예 1 에 있어서, (A2) 는 LNA 뉴클레오시드이고 (A1) 는 DNA 뉴클레오티드인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
5.구현예 1 에 있어서, (A1) 는 LNA 뉴클레오시드이고 (A2) 는 당 개질된 뉴클레오티드인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
6.구현예 1 에 있어서, (A1) 는 LNA 뉴클레오시드이고 (A2) 는 DNA 뉴클레오티드인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
7. 구현예 3 또는 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 당 개질된 뉴클레오시드는 2'-당 개질된 뉴클레오시드인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
8. 구현예 7 에 있어서, 상기 2'-당 개질된 뉴클레오시드는 2'-알콕시-RNA, 2'-알콕시알콕시-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA, 2'-플루오로-ANA 또는 LNA 뉴클레오시드인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
9. 구현예 7 또는 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 2'-당 개질된 뉴클레오시드는 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오시드인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
10. 구현예 1 - 9 중 어느 하나에 있어서, LNA 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드는 베타-D 배열인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
11. 구현예 1 - 10 중 어느 하나에 있어서, LNA 뉴클레오시드는 베타-D-옥시 LNA, 6'-메틸-베타-D-옥시 LNA 및 ENA 로부터 독립적으로 선택되는, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
12. 구현예 1 - 11 중 어느 하나에 있어서, LNA 는 베타-D-옥시 LNA 인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
13. 구현예 1 - 12 중 어느 하나에 있어서, 단일 가닥 안티센스가 표적 핵산, 예컨대 pre-mRNA, 및 mRNA, 마이크로RNA, 바이러스 RNA, 및 긴 비-코딩 RNA 로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적 핵산에 상보적인 7 - 30 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어지는 [안티센스 단일 가닥 안티센스의 인접 뉴클레오티드 서열로 지칭됨], 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
14. 구현예 1 - 13 중 어느 하나에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열은 화학식 5'-F-G-F'-3' 의 갭머 영역을 포함하고, G 는 RnaseH 를 동원할 수 있는 5 내지 18 개의 뉴클레오시드의 영역이고, 상기 영역 G 는 플랭킹 영역 F 및 F' 각각에 의해 5' 및 3' 플랭킹되고, 영역 F 및 F' 는 독립적으로 1 내지 7 개의 2'-당 개질된 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어지고, 영역 G 에 인접한 영역 F 의 뉴클레오시드는 2'-당 개질된 뉴클레오시드이고, 영역 G 에 인접한 영역 F' 의 뉴클레오시드는 2'-당 개질된 뉴클레오시드인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
14. 구현예 1 - 13 중 어느 하나에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열은 믹스머 올리고뉴클레오티드이고, 믹스머 올리고뉴클레오티드는 LNA 뉴클레오시드 및 DNA 뉴클레오시드 둘 모두, 및 임의로 2'당 개질된 뉴클레오시드 [예컨대 구현예 8 - 9 에 따른 것들] 를 포함하고, 단일 가닥 안티센스는 4 개 이상의 인접 DNA 뉴클레오시드의 영역을 포함하지 않는, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
15. 구현예 1 - 13 중 어느 하나에 있어서, 인접 뉴클레오티드 서열은 당 개질된 뉴클레오시드만 포함하는, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
16. 구현예 14 또는 15 에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 스플라이스 조절 올리고뉴클레오티드 [pre-mRNA 스플라이스 이벤트의 스플라이싱을 조절할 수 있음] 인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
17. 구현예 14 또는 15 에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 마이크로RNA 에 상보적이며, 예컨대 마이크로RNA 저해제인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
18. 구현예 1 - 17 중 어느 하나에 있어서, 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 및 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결로부터 독립적으로 선택되는 뉴클레오시드간 연결; 또는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 및 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결로부터 독립적으로 선택되는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열 내의 추가의 뉴클레오시드간 연결을 추가로 포함하는, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
18. 구현예 1 - 18 중 어느 하나에 있어서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 추가의 뉴클레오시드간 연결이 모두 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
19. 구현예 1 - 18 중 어느 하나에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 인접 뉴클레오티드 서열에 대한 5' 영역 위치 5' 를 포함하고, 5' 뉴클레오시드 영역은 적어도 하나의 포스포디에스테르 연결을 포함하는, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
20. 구현예 19 에 있어서, 5' 영역은 1 - 5 개의 포스포디에스테르 연결된 DNA 뉴클레오시드를 포함하고, 임의로 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열을 컨쥬게이트 모이어티에 연결할 수 있는, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
21. 구현예 1 - 20 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오시드가 핵염기 개질된 뉴클레오시드인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
22. 구현예 1 - 21 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오시드가 5-메틸 시토신, 예컨대 LNA 5-메틸 시토신 또는 DNA 5-메틸 시토신인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
23. 구현예 1 - 22 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드의 약학적으로 허용되는 염, 특히 소듐 또는 포타슘 염 또는 암모늄 염.
24. 구현예 1 - 23 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드 또는 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 컨쥬게이트 및 임의로 링커 모이어티를 통해 상기 올리고뉴클레오티드 또는 상기 약학적으로 허용되는 염에 공유 부착된 적어도 하나의 컨쥬게이트 모이어티.
25. 구현예 1 - 24 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드, 약학적으로 허용되는 염 또는 컨쥬게이트 및 치료적으로 불활성인 담체를 포함하는 약학 조성물.
26. 치료적으로 활성인 물질로서 사용하기 위한 구현예 1 - 25 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드, 약학적으로 허용되는 염 또는 컨쥬게이트.
27. 비경구 투여, 예컨대, 정맥 내, 피하, 근육 내, 대뇌 내, 뇌실 내 또는 뇌척수 내 투여를 통해 대상에게 투여하기 위한, 치료에 사용하기 위한, 구현예 1 - 24 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드, 약학적으로 허용되는 염 또는 컨쥬게이트.
아카이랄 포스포로디티오에이트 및 입체 정의된 포스포로티오에이트 연결을 갖는 올리고뉴클레오티드에 관한 구현예
1. 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드:
Figure pct00043
식 중, 2 개의 산소 원자 중 하나는 인접 뉴클레오시드 (A1) 의 3'탄소 원자에 연결되고 다른 하나는 또 다른 인접 뉴클레오시드 (A2) 의 5'탄소 원자에 연결되고, (IA) 에서 R 은 수소 또는 포스페이트 보호기이고, (IB) 에서 M+ 은 양이온, 예컨대 금속 양이온, 예컨대 알칼리금속 양이온, 예컨대 Na+ 또는 K+ 양이온이거나; 또는 M+ 은 암모늄 양이온이고, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결, (Sp, S) 또는 (Rp, R) 을 추가로 포함한다:
Figure pct00044
여기서, N1 및 N2 는 뉴클레오시드이다. (참고: 일부 비제한적인 구현예에서 N1 및/또는 N2 는 DNA 뉴클레오티드이다).
2. 구현예 1 에 있어서, A2 가 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 뉴클레오시드인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
3. 구현예 1 에 있어서, A1 이 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 뉴클레오시드인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
4. 구현예 1 - 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 단일 가닥 올리고뉴클레오티드가 화학식 IB 의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 개의 뉴클레오시드간 연결을 포함하는, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
5. 구현예 1 - 4 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 뉴클레오시드간 연결 및 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 뉴클레오시드간 연결 둘 모두가 화학식 IB 의 뉴클레오시드간 연결인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
6. 구현예 1 - 5 중 어느 하나에 있어서, 화학식 IB 의 뉴클레오시드간 연결 중 적어도 하나에서, 2 개의 뉴클레오시드 (A1) 및 (A2) 중 적어도 하나는 2' 당 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 2'-알콕시-RNA, 2'-알콕시알콕시-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA, 2'-플루오로-ANA 및 LNA 뉴클레오시드로 이루어진 군으로부터 선택되는 2' 당 개질된 뉴클레오시드인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
7. 구현예 1 - 6 중 어느 하나에 있어서, 화학식 IB 의 뉴클레오시드간 연결 중 적어도 하나에서, 2 개의 뉴클레오시드 (A1) 및 (A2) 중 적어도 하나는 LNA 뉴클레오시드인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
8. 구현예 1 - 6 중 어느 하나에 있어서, 화학식 IB 의 뉴클레오시드간 연결 중 적어도 하나에서, 2 개의 뉴클레오시드 (A1) 및 (A2) 중 적어도 하나는 2'-O-MOE 뉴클레오시드인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
9. 구현예 1 - 8 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 뉴클레오시드가 LNA 뉴클레오시드 또는 2'-O-MOE 뉴클레오시드인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
10. 구현예 1 - 9 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 뉴클레오시드가 LNA 뉴클레오시드 또는 2'-O-MOE 뉴클레오시드인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
11. 구현예 1 - 10 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 2 개의 3' 최말단 뉴클레오시드가 LNA 뉴클레오시드 및 2'-O-MOE 뉴클레오시드로부터 독립적으로 선택되는, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
12. 구현예 1 - 11 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 2 개의 5' 최말단 뉴클레오시드가 LNA 뉴클레오시드 및 2'-O-MOE 뉴클레오시드로부터 독립적으로 선택되는, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
13. 구현예 1 - 12 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3 개의 3' 최말단 뉴클레오시드가 LNA 뉴클레오시드 및 2'-O-MOE 뉴클레오시드로부터 독립적으로 선택되는, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
14. 구현예 1 - 13 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3 개의 5' 최말단 뉴클레오시드가 LNA 뉴클레오시드 및 2'-O-MOE 뉴클레오시드로부터 독립적으로 선택되는, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
15. 구현예 1 - 14 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 2 개의 3' 최말단 뉴클레오시드가 LNA 뉴클레오시드인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
16. 구현예 1 - 15 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 2 개의 5' 최말단 뉴클레오시드가 LNA 뉴클레오시드인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
17. 구현예 1 - 16 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 2 - 16 개의 DNA 뉴클레오티드의 영역을 추가로 포함하고, DNA 뉴클레오티드 사이의 뉴클레오시드간 연결은 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
18. 구현예 1 - 17 중 어느 하나에 있어서, LNA 뉴클레오시드는 베타-D-옥시 LNA, 6'-메틸-베타-D-옥시 LNA 및 ENA 로부터 독립적으로 선택되는, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
19. 구현예 1 - 17 중 어느 하나에 있어서, LNA 뉴클레오시드는 베타-D-옥시 LNA 인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
20. 구현예 1 - 19 중 어느 하나에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 표적 핵산, 예컨대 pre-mRNA, 및 mRNA, 마이크로RNA, 바이러스 RNA, 및 긴 비-코딩 RNA 로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적 핵산에 상보적인, 예컨대 완전히 상보적인 7 - 30 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어지는 [안티센스 올리고뉴클레오티드], 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
21. 구현예 1 - 20 중 어느 하나에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드가 RNA 표적을 조절할 수 있는, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
22. 구현예 1 - 20 중 어느 하나에 있어서, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드는 예컨대 RNAseH1 동원을 통해 RNA 표적을 저해할 수 있는, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
23. 구현예 1 - 22 중 어느 하나에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열은 화학식 5'-F-G-F'-3' 의 갭머 영역을 포함하고, G 는 RnaseH1 를 동원할 수 있는 5 내지 18 개의 뉴클레오시드의 영역이고, 상기 영역 G 는 플랭킹 영역 F 및 F' 각각에 의해 5' 및 3' 플랭킹되고, 영역 F 및 F' 는 독립적으로 1 내지 7 개의 2'-당 개질된 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어지고, 영역 G 에 인접한 영역 F 의 뉴클레오시드는 2'-당 개질된 뉴클레오시드이고, 영역 G 에 인접한 영역 F' 의 뉴클레오시드는 2'-당 개질된 뉴클레오시드인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
24. 구현예 23 에 있어서, 영역 F 또는 영역 F' 는 구현예 1 - 19 중 어느 하나에 따른 화학식 IB 의 뉴클레오시드간 연결을 포함하는, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
25. 구현예 24 에 있어서, 영역 F 및 F' 둘 모두는 구현예 1 - 19 중 어느 하나에 따른 화학식 IB 의 뉴클레오시드간 연결을 포함하는, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
26. 구현예 23 - 25 중 어느 하나에 있어서, 영역 F 및/또는 F' 내의 모든 뉴클레오시드간 연결은 구현예 1 - 19 중 어느 하나에 따른 화학식 IB 의 뉴클레오시드간 연결인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
27. 구현예 23 - 26 중 어느 하나에 있어서, 영역 F 및 F' 둘 모두는 LNA 뉴클레오시드를 포함하거나 이로 이루어지는, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
28. 구현예 23 - 27 중 어느 하나에 있어서, 영역 F 및 F' 둘 모두는 MOE 뉴클레오시드를 포함하거나 이로 이루어지는, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
29. 구현예 23 - 28 중 어느 하나에 있어서, 영역 F 는 LNA 뉴클레오시드(들)을 포함하고 F' 는 MOE 뉴클레오시드를 포함하거나 이로 이루어지는, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
30. 구현예 23 - 29 중 어느 하나에 있어서, 영역 G 는 영역 F 의 3' 말단 뉴클레오시드와 영역 G 의 5' 말단 뉴클레오시드 사이에 위치한 화학식 IB 의 적어도 하나의 뉴클레오시드간 연결을 추가로 포함하는, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
31. 구현예 23 - 30 중 어느 하나에 있어서, 영역 G 는 2 개의 DNA 뉴클레오시드 사이에 위치한 적어도 하나의 입체 정의된 포스포로티오에이트 연결을 포함하는, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
32. 구현예 23 - 31 중 어느 하나에 있어서, 영역 G 는 2 개의 DNA 뉴클레오시드 사이에 위치한 화학식 IB 의 적어도 하나의 뉴클레오시드간 연결을 포함하는, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
33. 구현예 23 - 32 중 어느 하나에 있어서, 영역 G 는 화학식 IB 의 적어도 2, 3, 또는 4 개의 뉴클레오시드간 연결을 추가로 포함하는, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
34. 구현예 23 - 31 중 어느 하나에 있어서, 영역 G 내의 모든 나머지 뉴클레오시드간 연결은 Rp 및 Sp 뉴클레오시드간 연결로부터 독립적으로 선택되는 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
35. 구현예 23 - 31 중 어느 하나에 있어서, 영역 G 내의 모든 뉴클레오시드간 연결은 임의로 영역 F 의 3' 말단 뉴클레오시드와 영역 G 의 5' 말단 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오시드간 연결 이외의 Rp 및 Sp 뉴클레오시드간 연결로부터 독립적으로 선택되는 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
36. 구현예 1 - 22 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 4 개 미만의 인접 DNA 뉴클레오티드를 포함하는, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
37. 구현예 1 - 22 또는 36 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 믹스머 또는 토탈머 올리고뉴클레오티드인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
38. 구현예 37 에 있어서, 믹스머 올리고뉴클레오티드가 LNA 뉴클레오시드 및 DNA 뉴클레오시드 둘 모두, 및 임의로 2'당 개질된 뉴클레오시드 (예를 들어 구현예 6 의 목록 참조), 예컨대 2'-O-MOE 뉴클레오시드(들)를 포함하는, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
39. 구현예 1 - 38 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 3 개 이상의 인접 MOE 뉴클레오시드의 영역을 포함하고, 임의로 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오시드는 2'MOE 뉴클레오시드인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
40. 구현예 1 - 39 중 어느 하나에 있어서, 표적이 mRNA 또는 pre-mRNA 표적인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
41. 구현예 1 - 40 중 어느 하나에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 pre-mRNA 스플라이스 부위에서 스플라이싱 이벤트를 조절하는 pre-mRNA 의 영역 또는 pre-mRNA 스플라이스 부위를 표적으로 하는, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
42. 구현예 1 - 41 중 어느 하나에 있어서, pre-mRNA 표적의 스플라이싱을 조절할 수 있는 스플라이스 조절 올리고뉴클레오티드인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
43. 구현예 1 - 42 중 어느 하나에 있어서, 표적이 마이크로RNA 인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
44. 구현예 1 - 42 중 어느 하나에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 10 - 20 개의 뉴클레오티드 길이, 예컨대 12 - 24 개의 뉴클레오티드 길이인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
45. 구현예 43 에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이가 7 - 30 개, 예컨대 8 - 12 개 또는 12 내지 23 개의 뉴클레오티드 길이인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
46. 구현예 1 - 45 중 어느 하나에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드로서, 올리고뉴클레오티드는 인접 뉴클레오티드 서열에 대한 5' 영역 위치 5' 를 추가로 포함하고, 5' 뉴클레오시드 영역은 적어도 하나의 포스포디에스테르 연결을 포함하는, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
47. 구현예 46 에 있어서, 5' 영역은 1 - 5 개의 포스포디에스테르 연결된 DNA 뉴클레오시드를 포함하고, 임의로 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열을 컨쥬게이트 모이어티에 연결할 수 있는, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
48. 구현예 1 - 47 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오시드는 핵염기 개질된 뉴클레오시드인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
49. 구현예 1 - 48 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오시드는 5-메틸 시토신, 예컨대 LNA 5-메틸 시토신 또는 DNA 5-메틸 시토신인, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드.
50. 구현예 1 - 49 중 어느 하나에 따른 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드의 약학적으로 허용되는 염, 특히 소듐 또는 포타슘 염 또는 암모늄 염.
51. 구현예 1 - 49 중 어느 하나에 따른 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 컨쥬게이트 및 임의로 링커 모이어티를 통해 상기 올리고뉴클레오티드 또는 상기 약학적으로 허용되는 염에 공유 부착된 적어도 하나의 컨쥬게이트 모이어티.
52. 구현예 1 - 51 중 어느 하나에 따른 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드, 약학적으로 허용되는 염 또는 컨쥬게이트 및 치료적으로 불활성인 담체를 포함하는 약학 조성물.
53. 치료적으로 활성인 물질로서 사용하기 위한 구현예 1 - 52 중 어느 하나에 따른 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드, 약학적으로 허용되는 염 또는 컨쥬게이트.
54. 비경구 투여, 예컨대, 정맥 내, 피하, 근육 내, 대뇌 내, 뇌실 내 또는 뇌척수 내 투여를 통해 대상에게 투여하기 위한, 치료에 사용하기 위한, 구현예 1 - 53 중 어느 하나에 따른 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드, 약학적으로 허용되는 염 또는 컨쥬게이트.
55. 세포에서 표적 RNA 의 저해에서 사용하기 위한 구현예 1 - 54 중 어느 하나에 따른 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드, 염, 또는 조성물의 시험관내 용도로서, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA 에 대하여 상보적, 예컨대 완전히 상보적인, 용도.
56. 유효량의 구현예 1 - 55 중 어느 하나에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드, 염, 컨쥬게이트 또는 조성물을 세포에 투여하여, 표적 RNA 를 저해하는 것을 포함하는, 표적 RNA 를 발현하는 세포에서 표적 RNA 의 저해를 위한 생체내 또는 시험관내 방법.
57. 세포에서 표적 pre-mRNA 의 스플라이싱을 조절하는데 사용하기 위한, 구현예 1 - 56 중 어느 하나에 따른 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드, 염, 또는 조성물의 시험관내 또는 생체내 용도.
58. 유효량의 구현예 1 - 57 중 어느 하나에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드, 염, 컨쥬게이트 또는 조성물을 세포에 투여하여, 표적 RNA 의 스플라이싱을 조절하는 것을 포함하는, 표적 pre-RNA 를 발현하는 세포에서 표적 pre-RNA 의 스플라이싱을 조절하기 위한 생체내 또는 시험관내 방법.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 표적으로 하는 Htra-1
일부 구현예에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인간 고온 요건 A1 세린 프로테아제 (Htra1) 를 코딩하는 mRNA 또는 pre-mRNA 에 상보적이다 － 예를 들어 WO 2018/002105 참조. Htra1 mRNa 또는 premRNA 를 표적으로 하는 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하는 Htra1 발현의 저해는 황반 변성, 예를 들어 연령 관련 황반 변성 (지도형 위축) 과 같은 다양한 의학적 장애의 치료에 유익하다. 인간 Htra1 pre-mRNA 및 mRNA 표적 서열은 다음과 같이 이용 가능하다:
Figure pct00045
Htra-1 을 표적으로 하는 본 발명의 화합물은 실시예에서 Htra1#1 - 38 로 열거된다.
1. 길이가 10 - 30 개의 뉴클레오티드인 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드로서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인간 HTRA1 mRNA 또는 pre-mRNA 를 표적으로 하고, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 SEQ ID NO 9 및 10 로서 서열 목록에 개시되어 있는 WO 2018/002105 의 SEQ ID NO 1 또는 2 에 대하여 적어도 90%, 예컨대 100% 상보성인 10 - 22 개 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하고, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 화학식 IA 또는 화학식 IB 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
2. 구현예 1 또는 2 에 있어서, 인접 뉴클레오티드 영역이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 존재하는 서열과 동일한, 안티센스 올리고뉴클레오티드:
Figure pct00046
3. 구현예 1 - 3 중 어느 하나에 있어서, 인접 뉴클레오티드 영역이 하기 서열을 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드:
Figure pct00047
4. 구현예 1 - 4 중 어느 하나에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역이 SEQ ID NO 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18 중 어느 하나로부터 선택된 서열로 이루어지거나 또는 이를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
5. 구현예 1 - 5 중 어느 하나에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역이 하나 이상의 2' 당 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-DNA, 아라비노 핵산 (ANA), 2'-플루오로-ANA 및 LNA 뉴클레오시드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 2' 당 개질된 뉴클레오시드를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
6. 구현예 1 - 5 중 어느 하나에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역이 적어도 하나의 개질된 뉴클레오시드간 연결, 예컨대 하나 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하거나, 또는 예컨대 인접 뉴클레오티드 영역 내 모든 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
7. 구현예 1 - 6 중 어느 하나에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열이 갭머, 예컨대 화학식 5'-F-G-F'-3' 의 갭머이거나 또는 이를 포함하고, 여기서 영역 F 및 F' 는 독립적으로 1 - 7 개의 당 개질된 뉴클레오시드를 포함하고, G 는 RNaseH 를 동원할 수 있는 6 - 16 개의 뉴클레오시드 영역이고, 영역 G 에 인접한 영역 F 및 F' 의 뉴클레오시드는 당 개질된 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
8. 구현예 7 에 있어서, 영역 F 및 F' 중 적어도 하나 또는 둘 모두가 각각 적어도 하나의 LNA 뉴클레오시드를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
9. 구현예 1 - 8 중 어느 하나에 있어서, 하기로부터 선택된 군으로부터 선택된, 안티센스 올리고뉴클레오티드:
Htra1#1 - 38, 여기서 대문자는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드 단위를 나타내고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드 단위를 나타내고, 아래 첨자 s 는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 나타내고, 모든 LNA 시토신은 5-메틸 시토신이고, P 는 화학식 IB 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 나타내고, S 는 Sp 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 나타내고, R 은 Rp 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 나타내고, X 는 입체 랜덤 포스포로티오에이트 연결을 나타냄.
10. 구현예 1 - 9 중 어느 하나에 있어서, 염, 예컨대 소듐 염, 포타슘 염 또는 암모늄 염 (예를 들어 약학적으로 허용되는 염) 의 형태인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
11. 구현예 1 - 10 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드를 포함하는 컨쥬게이트, 및 상기 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 염에 공유 부착된 적어도 하나의 컨쥬게이트 모이어티.
12. 구현예 1 - 10 의 올리고뉴클레오티드 또는 구현예 11 의 컨쥬게이트 및 약학적으로 허용되는 희석제, 용매, 담체, 염 및/또는 아쥬반트를 포함하는 약학 조성물.
13. HTRA1 을 발현하는 표적 세포에서 HTRA1 발현을 조절하기 위한 생체내 또는 시험관내 방법으로서, 상기 방법은 구현예 1 - 10 중 어느 하나의 올리고뉴클레오티드 또는 구현예 11 에 따른 컨쥬게이트 또는 구현예 12 의 약학 조성물을 상기 세포에 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
14. 치료적 또는 예방적 유효량의 구현예 1 - 10 중 어느 하나의 올리고뉴클레오티드 또는 구현예 11 에 따른 컨쥬게이트 또는 구현예 12 의 약학 조성물을 질환을 앓고 있거나 질환에 걸리기 쉬운 대상에게 투여하는 것을 포함하는 질환의 치료 또는 예방 방법.
15. 의약에 사용하기 위한 구현예 1 - 10 중 어느 하나의 올리고뉴클레오티드 또는 구현예 11 에 따른 컨쥬게이트 또는 구현예 12 의 약학 조성물.
16. 황반 변성 (예컨대 wetAMD, dryAMD, 지도형 위축, 중간체 dAMD, 당뇨 망막병증), 파킨슨병, 알츠하이머병, 뒤쉔 근육 영양장애, 관절염, 예컨대 골관절염, 및 가족 허혈성 뇌 소혈관 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 구현예 1 - 10 중 어느 하나의 올리고뉴클레오티드 또는 구현예 11 에 따른 컨쥬게이트 또는 구현예 12 의 약학 조성물.
17. 황반 변성 (예컨대 wetAMD, dryAMD, 지도형 위축, 중간체 dAMD, 당뇨 망막병증), 파킨슨병, 알츠하이머병, 뒤쉔 근육 영양장애, 관절염, 예컨대 골관절염, 및 가족 허혈성 뇌 소혈관 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환의 치료 또는 예방을 위한, 약제의 제조를 위한, 구현예 1 - 10 의 올리고뉴클레오티드 또는 구현예 11 에 따른 컨쥬게이트 또는 구현예 12 의 약학 조성물의 용도.
18. 지도형 위축의 치료에 사용하기 위한, 구현예 1 - 17 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드, 컨쥬게이트, 염 또는 조성물 또는 용도.
본 발명의 추가 구현예
따라서 본 발명은 특히 하기에 관한 것이다:
올리고뉴클레오티드가 상기 표적 RNA 를 발현하는 세포에서 표적 RNA 의 발현을 조절할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드;
올리고뉴클레오티드가 상기 표적 RNA 를 발현하는 세포에서 표적 RNA 의 발현을 저해할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드;
(A1) 및 (A2) 중 하나는 LNA 뉴클레오시드이고 다른 하나는 DNA 뉴클레오시드, RNA 뉴클레오시드 또는 당 개질된 뉴클레오시드인 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드;
(A1) 및 (A2) 중 하나는 LNA 뉴클레오시드이고 다른 하나는 DNA 뉴클레오시드 또는 당 개질된 뉴클레오시드인 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드;
(A1) 및 (A2) 중 하나는 LNA 뉴클레오시드이고 다른 하나는 DNA 뉴클레오시드인 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드;
(A1) 및 (A2) 중 하나는 LNA 뉴클레오시드이고 다른 하나는 당 개질된 뉴클레오시드인 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드;
상기 당 개질된 뉴클레오시드가 2'-당 개질된 뉴클레오시드인 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드;
상기 2'-당 개질된 뉴클레오시드가 2'-알콕시-RNA, 2'-알콕시알콕시-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA, 2'-플루오로-ANA 또는 LNA 뉴클레오시드인 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드;
상기 2'-당 개질된 뉴클레오시드가 LNA 뉴클레오시드인 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드;
LNA 뉴클레오시드가 베타-D-옥시 LNA, 6'-메틸-베타-D-옥시 LNA 및 ENA 로부터 독립적으로 선택되는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드;
LNA 뉴클레오시드가 모두 베타-D-옥시 LNA 인 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드;
상기 2'-당 개질된 뉴클레오시드가 2'-알콕시알콕시-RNA 인 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드;
2'-알콕시-RNA 가 2'-메톡시-RNA 인 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드;
2'-알콕시알콕시-RNA 가 2'-메톡시에톡시-RNA 인 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드;
1 내지 15, 특히 1 내지 5, 보다 특히 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드;
포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 및 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결로부터 독립적으로 선택되는 뉴클레오시드간 연결을 추가로 포함하는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드;
추가의 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 및 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결로부터 독립적으로 선택되는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드;
추가의 뉴클레오시드간 연결이 모두 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드;
추가의 뉴클레오시드간 연결이 모두 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결인 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드;
올리고뉴클레오티드가 갭머, 특히 LNA 갭머, 혼합 윙 갭머, 교대 플랭크 갭머, 스플라이스 스위칭 올리고머, 믹스머 또는 토탈머인 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드;
갭머이고 화학식 (I) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결이 갭머의 하나 이상의 플랭킹 영역 및/또는 갭 영역에 포함되는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드;
포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결을 통해 올리고뉴클레오티드의 나머지에 연결된 하나 이상의 DNA 뉴클레오시드를 포함하는, 인접 뉴클레오티드 서열, 예컨대 갭머 영역 F-G-F' 가 플랭킹 영역 D' 또는 D" 또는 D' 및 D" 에 의해 플랭킹된, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드;
플랭킹 영역 F 및 F' 중 하나 또는 둘 모두, 특히 하나가 포스포디에스테르 연결된 DNA 뉴클레오시드, 특히 1 내지 5 개의 포스포디에스테르 연결된 DNA 뉴클레오시드 (영역 D' 및 D") 에 의해 추가로 플랭킹된 갭머인, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드;
올리고뉴클레오티드가 7 내지 30 개의 뉴클레오티드 길이인, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드.
본 발명의 올리고뉴클레오티드가 갭머인 경우, 이는 유리하게는 12 내지 26 개의 뉴클레오티드 길이이다. 16 개의 뉴클레오티드가 특히 유리한 갭머 올리고뉴클레오티드 길이이다.
올리고뉴클레오티드가 완전한 LNA 올리고뉴클레오티드인 경우, 이는 유리하게는 7 내지 10 개의 뉴클레오티드 길이이다.
올리고뉴클레오티드가 믹스머 올리고뉴클레오티드인 경우, 이는 유리하게는 8 내지 30 개의 뉴클레오티드 길이이다.
따라서 본 발명은 특히 하기에 관한 것이다:
하나 이상의 뉴클레오시드가 핵염기 개질된 뉴클레오시드인 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드;
올리고뉴클레오티드가 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, 마이크로RNA 미믹 또는 리보자임인 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드;
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 약학적으로 허용되는 염, 특히 소듐 또는 포타슘 염;
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 또는 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 컨쥬게이트 및 임의로 링커 모이어티를 통해 상기 올리고뉴클레오티드 또는 상기 약학적으로 허용되는 염에 공유 부착된 적어도 하나의 컨쥬게이트 모이어티;
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드, 약학적으로 허용되는 염 또는 컨쥬게이트 및 치료적으로 불활성인 담체를 포함하는 약학 조성물;
치료적으로 활성인 물질로서 사용하기 위한, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드, 약학적으로 허용되는 염 또는 컨쥬게이트; 및
약제로서의 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드, 약학적으로 허용되는 염 또는 컨쥬게이트의 용도;
일부 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 상응하는 완전 포스포로티오에이트 연결된 올리고뉴클레오티드와 비교하여 표적 핵산을 조절하는데 보다 높은 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명은 향상된 활성, 향상된 효능, 향상된 특이적 활성 또는 향상된 세포 흡수를 갖는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 변경된 시험관내 또는 생체내 작용 기간, 예컨대 지속되는 시험관내 또는 생체내 작용 기간을 갖는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 일부 구현예에서, 표적 핵산 조절에서 보다 높은 활성은 표적 핵산을 발현하는 세포에서 시험관내 또는 생체내에서 결정된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 변경된 약리학적 특성, 예컨대 감소된 독성, 예를 들어 감소된 신독성, 감소된 간독성 또는 감소된 면역 자극을 갖는다. 간독성은 예를 들어 생체내에서, 또는 본원에 참조로 포함되는 WO 2017/067970 에 개시된 시험관내 분석을 사용하여 결정될 수 있다. 신독성은 예를 들어 시험관내에서, 또는 본원에 참조로 포함되는 PCT/EP2017/064770 에 개시된 분석을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 5' CG 3' 디뉴클레오티드, 예컨대 DNA 5' CG 3' 디뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 C 와 G 사이의 뉴클레오시드간 연결은 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 혈청에서 개선된 생체 안정성과 같은 개선된 뉴클레아제 내성을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 뉴클레오시드는 A 또는 G 염기, 예컨대 3' 말단 LNA-A 또는 LNA-G 뉴클레오시드를 갖는다. 적합하게는, 올리고뉴클레오티드의 2 개의 3' 말단 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오시드간 연결은 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 에 따른 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결일 수 있다.
일부 구현예에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 향상된 생체이용률을 갖는다. 일부 구현예에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 혈액에서 보다 긴 체류 시간과 같은 보다 큰 혈액 노출을 갖는다.
비-가교 포스포로디티오에이트 개질은 포스포르아미다이트 방법을 사용하여 고체 상 합성에 의해 올리고뉴클레오티드에 도입된다. 합성은 범용 링커가 장착된 제어된 기공 유리 (CPG) 를 지지체로 사용하여 수행된다. 이러한 고체 지지체 상에 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 5'O-DMT 보호된 뉴클레오시드 포스포르아미다이트 빌딩 블록의 커플링 이어서 DMT 기의 (티오)산화, 캡핑 및 탈보호로 이루어진 순차적 사이클에 의해 3' 에서 5' 방향으로 형성된다. 비-가교 포스포로디티오에이트의 도입은 적절한 티오포스포르아미다이트 빌딩 블록 이어서 1차 중간체의 티오산화를 사용하여 달성된다.
상응하는 DNA 티오포스포르아미다이트는 상업적으로 입수 가능하지만, 각각의 LNA 빌딩 블록은 이전에 설명되지 않았다. 이들은 5'-O-DMT-보호된 뉴클레오시드 3'-알코올로부터 예를 들어 모노-벤조일 보호된 에탄디티올 및 트리피롤리딘-1-일포스판과의 반응에 의해 제조될 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 반응식 2 에 따라 제조될 수 있으며, 여기서 R1, R2a, R2b, R4a, R4b, R5, Rx, Ry 및 V 는 아래에 정의된 바와 같다.
반응식 2
Figure pct00048
따라서 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 제조 방법에 관한 것이다:
(a) 티오포스포르아미다이트 뉴클레오시드를 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 말단 5' 산소 원자에 커플링시켜 티오포스파이트 트리에스테르 중간체를 생성하는 단계;
(b) 단계 (a) 에서 수득된 티오포스파이트 트리에스테르 중간체를 티오산화시키는 단계; 및
(c) 임의로 올리고뉴클레오티드를 추가로 연장하는 단계.
본 발명은 특히 하기 단계를 포함하는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 제조 방법에 관한 것이다:
(a1) 하기 화학식 (A) 의 화합물을 하기 화학식 (B) 의 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 5' 산소 원자에 커플링시키는 단계:
Figure pct00049
Figure pct00050
(b1) 단계 (a1) 에서 수득된 티오포스파이트 트리에스테르 중간체를 티오산화시키는 단계; 및
(c1) 임의로 올리고뉴클레오티드를 추가로 연장하는 단계;
[식 중,
R2a 및 R4a 는 함께 상기 정의된 바와 같은 -X-Y- 를 형성하거나; 또는
R4a 는 수소이고 R2a 는 알콕시, 특히 메톡시, 할로겐, 특히 플루오로, 알콕시알콕시, 특히 메톡시에톡시, 알케닐옥시, 특히 알릴옥시 및 아미노알콕시, 특히 아미노에틸옥시로부터 선택되고;
R2b 및 R4b 는 함께 상기 정의된 바와 같은 -X-Y- 를 형성하거나; 또는
R2b 및 R4b 둘 모두는 동시에 수소이거나; 또는
R4b 는 수소이고 R2b 는 알콕시, 특히 메톡시, 할로겐, 특히 플루오로, 알콕시알콕시, 특히 메톡시에톡시, 알케닐옥시, 특히 알릴옥시 및 아미노알콕시, 특히 아미노에틸옥시로부터 선택되고;
V 는 산소 또는 황이고; 및
R5, Rx, Ry 및 Nu 는 아래에 정의된 바와 같음].
본 발명은 특히 하기 단계를 포함하는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 제조 방법에 관한 것이다:
(a2) 하기 화학식 (A1) 의 화합물을 하기 화학식 (B1) 의 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 5' 산소 원자에 커플링시키는 단계:
Figure pct00051
Figure pct00052
(b2) 단계 (a2) 에서 수득된 티오포스파이트 트리에스테르 중간체를 티오산화시키는 단계; 및
(c2) 임의로 올리고뉴클레오티드를 추가로 연장하는 단계;
[식 중,
R2b 및 R4b 는 함께 상기 정의된 바와 같은 -X-Y- 를 형성하거나; 또는
R2b 및 R4b 둘 모두는 동시에 수소이거나; 또는
R4b 는 수소이고 R2b 는 알콕시, 특히 메톡시, 할로겐, 특히 플루오로, 알콕시알콕시, 특히 메톡시에톡시, 알케닐옥시, 특히 알릴옥시 및 아미노알콕시, 특히 아미노에틸옥시로부터 선택되고;
R5, Rx, Ry 및 Nu 는 아래에 정의된 바와 같음].
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 따라 제조된 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하기에 관한 것이다:
화학식 (I) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 갭머 올리고뉴클레오티드:
Figure pct00053
[식 중, R 은 수소 또는 포스페이트 보호기임];
올리고뉴클레오티드가 상기 표적 RNA 를 발현하는 세포에서 표적 RNA 의 발현을 조절할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 상기 정의된 바와 같은 갭머 올리고뉴클레오티드;
올리고뉴클레오티드가 상기 표적 RNA 를 발현하는 세포에서 표적 RNA 의 발현을 저해할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 상기 정의된 바와 같은 갭머 올리고뉴클레오티드;
RNAseH, 예컨대 인간 RNaseH1 를 동원할 수 있는 상기 정의된 바와 같은 갭머 올리고뉴클레오티드;
상기 화학식 (I) 의 적어도 하나의 뉴클레오시드간 연결의 2 개의 산소 원자 중 하나는 인접 뉴클레오시드 (A1) 의 3'탄소 원자에 연결되고 다른 하나는 또 다른 뉴클레오시드 (A2) 의 5'탄소 원자에 연결되고, 2 개의 뉴클레오시드 (A1) 및 (A2) 중 적어도 하나는 2'-당 개질된 뉴클레오시드인 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
(A1) 및 (A2) 중 하나는 2'-당 개질된 뉴클레오시드이고 다른 하나는 DNA 뉴클레오시드인 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
(A1) 및 (A2) 둘 모두는 동시에 2'- 개질된 뉴클레오시드인, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
(A1) 및 (A2) 둘 모두는 동시에 DNA 뉴클레오시드인, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
갭머 올리고뉴클레오티드는 화학식 5'-F-G-F'-3' 의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하고, G 는 RnaseH 를 동원할 수 있는 5 내지 18 개의 뉴클레오시드의 영역이고, 상기 영역 G 는 플랭킹 영역 F 및 F' 각각에 의해 5' 및 3' 플랭킹되고, 영역 F 및 F' 는 독립적으로 1 내지 7 개의 2'-당 개질된 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어지고, 영역 G 에 인접한 영역 F 의 뉴클레오시드는 2'-당 개질된 뉴클레오시드이고, 영역 G 에 인접한 영역 F' 의 뉴클레오시드는 2'-당 개질된 뉴클레오시드인, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
2'-당 개질된 뉴클레오시드가 2'-알콕시-RNA, 2'-알콕시알콕시-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA, 2'-플루오로-ANA 및 LNA 뉴클레오시드로부터 독립적으로 선택되는, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
2'-알콕시알콕시-RNA 가 2'-메톡시에톡시-RNA (2'-O-MOE) 인, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
영역 F 및 영역 F' 가 2'-메톡시에톡시-RNA 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어지는, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
영역 F 및 F' 둘 모두가 2'-메톡시에톡시-RNA 뉴클레오티드, 예컨대 화학식 [MOE]3-8[DNA]8-16[MOE]3-8, 예를 들어 [MOE]5[DNA]10[MOE]5 (즉, 여기서 영역 F 및 F' 는 각각 5 개의 2'-메톡시에톡시-RNA 뉴클레오티드로 이루어지고, 영역 G 는 10 개의 DNA 뉴클레오티드로 이루어짐) 의 F-G-F' 를 포함하는 갭머로 이루어지는, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
영역 F 또는 영역 F' 내, 또는 영역 F 및 F' 내의 2'-당 개질된 뉴클레오시드 중 적어도 하나 또는 모두가 LNA 뉴클레오시드인, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
영역 F 또는 영역 F', 또는 영역 F 및 F' 가 적어도 하나의 LNA 뉴클레오시드 및 적어도 하나의 DNA 뉴클레오시드를 포함하는, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
영역 F 또는 영역 F', 또는 영역 F 및 F' 가 적어도 하나의 LNA 뉴클레오시드 및 적어도 하나의 비-LNA 2'-당 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 적어도 하나의 2'-메톡시에톡시-RNA 뉴클레오시드를 포함하는, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
갭 영역이 5 내지 16 개, 특히 8 내지 16 개, 보다 특히 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 개의 인접 DNA 뉴클레오시드를 포함하는, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
영역 F 및 영역 F' 가 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 개의 뉴클레오시드 길이인, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
영역 F 및 영역 F' 가 각각 독립적으로 1, 2, 3 또는 4 개의 LNA 뉴클레오시드를 포함하는, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
LNA 뉴클레오시드가 베타-D-옥시 LNA, 6'-메틸-베타-D-옥시 LNA 및 ENA 로부터 독립적으로 선택되는 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
LNA 뉴클레오시드가 베타-D-옥시 LNA 인, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
올리고뉴클레오티드, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열 (F-G-F') 이 10 내지 30 개의 뉴클레오티드 길이, 특히 12 내지 22 개, 보다 특히 14 내지 20 개의 올리고뉴클레오티드 길이인, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
갭머 올리고뉴클레오티드는 화학식 5'-D'-F-G-F'-D"-3' 의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하고, F, G 및 F' 는 제 4 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같고, 영역 D' 및 D" 는 각각 독립적으로 0 내지 5 개의 뉴클레오티드, 특히 2, 3 또는 4 개의 뉴클레오티드, 특히 DNA 뉴클레오티드, 예컨대 포스포디에스테르 연결된 DNA 뉴클레오시드로 이루어지는, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
갭머 올리고뉴클레오티드가 인간 RNaseH1 을 동원할 수 있는 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 상기 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결이 영역 F 또는 영역 F', 영역 F 와 영역 G 사이 또는 영역 G 와 F' 영역 사이의 인접 뉴클레오시드 사이에 위치하는, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 추가로 포함하는, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
영역 G 의 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 및 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결로부터 독립적으로 선택되는, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
영역 G 의 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오시드간 연결이 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 0, 1, 2 또는 3 개의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
나머지 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트, 포스포디에스테르 및 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
영역 F 의 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오시드간 연결 및 영역 F' 의 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트 및 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결로부터 독립적으로 선택되는, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
각각의 플랭킹 영역 F 및 F' 가 독립적으로 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 개의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
플랭킹 영역 F 및 F' 가 함께 또는 개별적으로 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하거나, 또는 영역 F 및/또는 영역 F' 의 모든 뉴클레오시드간 연결이 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 포스포르디티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
플랭킹 영역 F 및 F' 가 함께 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 1, 2, 3 또는 4 개의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
플랭킹 영역 F 및 F' 가 각각 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 2 개의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
플랭킹 영역 F 및/또는 F' 의 모든 뉴클레오시드간 연결이 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 포스포르디티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
갭머 올리고뉴클레오티드가 적어도 하나의 입체 정의된 뉴클레오시드간 연결, 예컨대 적어도 하나의 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
갭 영역이 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
갭 영역의 뉴클레오시드 사이의 모든 뉴클레오시드간 연결이 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 영역 F 의 뉴클레오시드 사이, 또는 영역 F' 의 뉴클레오시드 사이, 또는 영역 F 와 영역 G 사이, 또는 영역 G 와 영역 F' 사이에 위치하고, 영역 F 및 F' 내, 영역 F 와 영역 G 사이 및 영역 G 와 영역 F' 사이의 나머지 뉴클레오시드간 연결은 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결, 입체 랜덤 뉴클레오시드간 연결, 화학식 (I) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결 및 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결로부터 독립적으로 선택되는, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 영역 F 의 적어도 2 개의 인접 뉴클레오시드 사이, 또는 영역 F', 또는 영역 F 와 영역 G 사이, 또는 영역 G 와 영역 F' 사이의 2 개의 인접 뉴클레오시드 사이에 위치하고, 영역 F 및 F' 의 뉴클레오티드 사이의 나머지 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결, 화학식 (I) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결 및 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결로부터 독립적으로 선택되고, 영역 F 및 F' 의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 입체 랜덤 또는 입체 정의일 수 있거나, 또는 입체 랜덤 및 입체 정의로부터 독립적으로 선택될 수 있는, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 영역 F 의 적어도 2 개의 인접 뉴클레오시드 사이, 또는 영역 F', 또는 영역 F 와 영역 G 사이, 또는 영역 G 와 영역 F' 사이의 적어도 2 개의 인접 뉴클레오시드 사이에 위치하고, 영역 F 및 F' 의 뉴클레오티드 사이의 나머지 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결, 및 화학식 (I) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결로부터 독립적으로 선택되고, 영역 F 및 F' 의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 입체 랜덤 또는 입체 정의일 수 있거나, 또는 입체 랜덤 및 입체 정의로부터 독립적으로 선택될 수 있는, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 영역 F 의 적어도 2 개의 인접 뉴클레오시드 사이, 또는 영역 F', 또는 영역 F 와 영역 G 사이, 또는 영역 G 와 영역 F' 사이의 적어도 2 개의 인접 뉴클레오시드 사이에 위치하고, 영역 F 및 F' 의 뉴클레오티드 사이, 영역 F 와 영역 G 사이 및 영역 G 와 영역 F' 사이의 나머지 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 및 화학식 (I) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결로부터 독립적으로 선택되고; 영역 F 및 F' 의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 입체 랜덤 또는 입체 정의일 수 있거나, 또는 입체 랜덤 및 입체 정의로부터 독립적으로 선택될 수 있는, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 영역 F 의 적어도 2 개의 인접 뉴클레오시드 사이, 또는 영역 F', 또는 영역 F 와 영역 G 사이, 또는 영역 G 와 영역 F' 사이의 적어도 2 개의 인접 뉴클레오시드 사이에 위치하고, 영역 F 및 F' 의 뉴클레오티드 사이 및 영역 F 와 영역 G 사이 및 영역 G 와 영역 F' 사이의 나머지 뉴클레오시드간 연결은 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 및 화학식 (I) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결로부터 독립적으로 선택되는, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 영역 F 의 적어도 2 개의 인접 뉴클레오시드 사이, 또는 영역 F', 또는 영역 F 와 영역 G 사이, 또는 영역 G 와 영역 F' 사이의 적어도 2 개의 인접 뉴클레오시드 사이에 위치하고, 영역 F 및 F' 내, 영역 F 와 영역 G 사이 및 영역 G 와 영역 F' 사이의 나머지 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이며, 이는 모두 입체 랜덤 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결, 모두 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결일 수 있거나, 또는 입체 랜덤 및 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결로부터 독립적으로 선택될 수 있는, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
영역 F 내, 영역 F' 내 또는 영역 F 및 영역 F' 내의 나머지 뉴클레오시드간 연결은 모두 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
영역 G 의 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오시드간 연결은 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 0, 1, 2 또는 3 개의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하고, 영역 G 내의 나머지 뉴클레오시드간 연결은 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 및 입체 랜덤 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결로부터 독립적으로 선택되는, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
영역 G 의 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오시드간 연결은 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 0, 1, 2 또는 3 개의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하고, 영역 G 내의 나머지 뉴클레오시드간 연결 중 적어도 하나, 또는 영역 G 내의 모든 나머지 뉴클레오시드간 연결은 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
영역 G 의 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오시드간 연결은 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 0, 1, 2 또는 3 개의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하고, 영역 G 내의 나머지 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결, 예컨대 입체 랜덤 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
영역 F 또는 F' 중 적어도 하나는 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하고, 영역 G 내의 모든 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결, 예컨대 입체 랜덤 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
영역 F 또는 F' 중 적어도 하나는 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하고, 영역 G 내의 모든 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이고, 영역 G 내의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결중 적어도 하나는 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
영역 F 또는 F' 중 적어도 하나는 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하고, 영역 G 내의 모든 뉴클레오시드간 연결은 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
영역 F 와 G 사이의 뉴클레오시드간 연결, 또는 영역 G 와 F' 사이의 뉴클레오시드간 연결, 또는 영역 F 와 G 사이 및 영역 G 와 F' 사이의 뉴클레오시드간 연결은 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결이고, 영역 F 와 G 사이 및 영역 G 와 F' 사이의 뉴클레오시드간 연결 중 하나만 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결인 경우, 영역 F 와 G 사이 또는 영역 G 와 F' 사이의 다른 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
영역 F 또는 F' 중 적어도 하나는 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하고, 영역 F 와 G 사이의 뉴클레오시드간 연결, 또는 영역 G 와 F' 사이의 뉴클레오시드간 연결, 또는 영역 F 와 G 사이 및 영역 G 와 F' 사이의 뉴클레오시드간 연결은 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결이고, 영역 F 와 G 사이 및 영역 G 와 F' 사이의 뉴클레오시드간 연결 중 하나만 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결인 경우, 영역 F 와 G 사이 또는 영역 G 와 F' 사이의 다른 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
영역 G 의 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오시드간 연결은 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 0, 1, 2 또는 3 개의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하고, 영역 G 내의 나머지 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이고, 영역 F 와 G 사이의 뉴클레오시드간 연결, 또는 영역 G 와 F' 사이의 뉴클레오시드간 연결, 또는 영역 F 와 G 사이 및 영역 G 와 F' 사이의 뉴클레오시드간 연결은 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결이고, 영역 F 와 G 사이 및 영역 G 와 F' 사이의 뉴클레오시드간 연결 중 하나만 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결인 경우, 영역 F 와 G 사이 또는 영역 G 와 F' 사이의 다른 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
영역 F 또는 F' 중 적어도 하나는 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하고, 영역 G 의 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오시드간 연결은 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 0, 1, 2 또는 3 개의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하고, 영역 G 내의 나머지 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이고, 영역 F 와 G 사이의 뉴클레오시드간 연결, 또는 영역 G 와 F' 사이의 뉴클레오시드간 연결, 또는 영역 F 와 G 사이 및 영역 G 와 F' 사이의 뉴클레오시드간 연결은 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결이고, 영역 F 와 G 사이 및 영역 G 와 F' 사이의 뉴클레오시드간 연결 중 하나만 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결인 경우, 영역 F 와 G 사이 또는 영역 G 와 F' 사이의 다른 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
영역 F 또는 영역 F' 은 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하거나, 또는 영역 F 와 영역 G 사이, 또는 영역 G 와 영역 F' 사이의 뉴클레오시드간 연결은 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하고, 영역 G 는 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 1, 2 또는 3 개의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하고, 영역 G 내의 나머지 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
영역 F 또는 영역 F' 은 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하거나, 또는 영역 F 와 영역 G 사이, 또는 영역 G 와 영역 F' 사이의 뉴클레오시드간 연결은 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하고, 영역 G 내의 모든 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이고, 영역 G 내의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결중 적어도 하나는 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
영역 F 또는 영역 F' 은 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하거나, 또는 영역 F 와 영역 G 사이, 또는 영역 G 와 영역 F' 사이의 뉴클레오시드간 연결은 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하고, 영역 G 내의 모든 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이고, 영역 G 내의 모든 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결 이외의 갭머 영역 F-G-F' 내의 모든 나머지 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
영역 F 또는 F' 중 적어도 하나는 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하고 영역 G 내의 모든 뉴클레오시드간 연결은 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
화학식 (I) 의 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결 이외의 갭머 영역 F-G-F' 내의 모든 나머지 뉴클레오시드간 연결은 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
LNA 갭머, 혼합 윙 갭머, 교대 플랭크 갭머 또는 갭-브레이커 갭머인, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드;
본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드의 약학적으로 허용되는 염, 특히 소듐 또는 포타슘 염;
본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드 또는 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 컨쥬게이트 및 임의로 링커 모이어티를 통해, 특히 생물 절단성 링커를 통해, 특히 2 내지 4 개의 포스포디에스테르 연결된 DNA 뉴클레오시드 (예를 들어 영역 D' 또는 D") 를 통해 상기 올리고뉴클레오티드 또는 상기 약학적으로 허용되는 염에 공유 부착된 적어도 하나의 컨쥬게이트 모이어티;
본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드, 약학적으로 허용되는 염 또는 컨쥬게이트 및 치료적으로 불활성인 담체를 포함하는 약학 조성물;
치료적으로 활성인 물질로서 사용하기 위한, 본 발명에 따른 갭머 올리고뉴클레오티드, 약학적으로 허용되는 염 또는 컨쥬게이트;
약제로서의 갭머 올리고뉴클레오티드, 약학적으로 허용되는 염 또는 컨쥬게이트의 용도;
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 또는 갭머 올리고뉴클레오티드를 표적 RNA 를 발현하는 세포에 투여하여 상기 표적 RNA 의 발현을 조절하는 것을 포함하는, 세포에서 표적 RNA 의 발현의 조절 방법;
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 또는 갭머 올리고뉴클레오티드를 표적 RNA 를 발현하는 세포에 투여하여 상기 표적 RNA 의 발현을 저해하는 것을 포함하는, 세포에서 표적 RNA 의 발현의 저해 방법; 및
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 또는 갭머 올리고뉴클레오티드를 표적 RNA 를 발현하는 세포에 투여하여 상기 세포에서 상기 표적 RNA 를 조절 또는 저해하는 것을 포함하는, 세포에서 표적 RNA 의 조절 또는 저해하는 시험관내 방법.
표적 RNA 는 예를 들어 포유류 mRNA, 예컨대 pre-mRNA 또는 성숙 mRNA, 인간 mRNA, 바이러스 RNA 또는 비-코딩 RNA, 예컨대 마이크로RNA 또는 긴 비-코딩 RNA 일 수 있다.
일부 구현예에서, 조절은 표적 pre-mRNA 의 스플라이싱 패턴을 변경하는 pre-mRNA 의 스플라이스 조절이다.
일부 구현예에서, 조절은 표적 분해를 통해 (예를 들어 RNaseH, 예컨대 RNaseH1 또는 RISC 의 동원을 통해) 일어날 수 있는 저해, 또는 표적 RNA 의 정상적인 생물학적 기능을 억제하는 점유 매개 메커니즘을 통해 일어날 수 있는 저해 (예를 들어 마이크로RNA 또는 긴 비-코딩 RNA 의 믹스머 또는 토탈머 저해) 이다.
인간 mRNA 는 성숙 RNA 또는 pre-mRNA 일 수 있다.
본 발명은 또한 화학식 (II) 의 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00054
식 중,
X 는 산소, 황, -CRaRb-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(=CRaRb)-, -C(Ra)=N-, -Si(Ra)2-, -SO2-, -NRa-; -O-NRa-, -NRa-O-, -C(=J)-, Se, -O-NRa-, -NRa-CRaRb-, -N(Ra)-O- 또는 -O-CRaRb- 이고;
Y 는 산소, 황, -(CRaRb)n-, -CRaRb-O-CRaRb-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -Si(Ra)2-, -SO2-, -NRa-, -C(=J)-, Se, -O-NRa-, -NRa-CRaRb-, -N(Ra)-O- 또는 -O-CRaRb- 이고;
단, -X-Y- 는 -O-O-, Si(Ra)2-Si(Ra)2-, -SO2-SO2-, -C(Ra)=C(Rb)-C(Ra)=C(Rb), -C(Ra)=N-C(Ra)=N-, -C(Ra)=N-C(Ra)=C(Rb), -C(Ra)=C(Rb)-C(Ra)=N- 또는 -Se-Se- 가 아니고;
J 는 산소, 황, =CH2 또는 =N(Ra) 이고;
Ra 및 Rb 는 수소, 할로겐, 하이드록실, 시아노, 티오하이드록실, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알콕시알킬, 알케닐옥시, 카르복실, 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐, 포르밀, 아릴, 헤테로시클릴, 아미노, 알킬아미노, 카르바모일, 알킬아미노카르보닐, 아미노알킬아미노카르보닐, 알킬아미노알킬아미노카르보닐, 알킬카르보닐아미노, 카르바미도, 알카노일옥시, 설포닐, 알킬설포닐옥시, 니트로, 아지도, 티오하이드록실설파이드알킬설파닐, 아릴옥시카르보닐, 아릴옥시, 아릴카르보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시카르보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카르보닐, -OC(=Xa)Rc, -OC(=Xa)NRcRd 및 -NReC(=Xa)NRcRd 로부터 독립적으로 선택되거나;
또는 2 개의 제미날 Ra 및 Rb 는 함께 임의 치환된 메틸렌을 형성하거나;
또는 2 개의 제미날 Ra 및 Rb 는, 이들이 부착된 탄소 원자와 함께, -X-Y- 의 오직 하나의 탄소 원자와 시클로알킬 또는 할로시클로알킬을 형성하고;
치환된 알킬, 치환된 알케닐, 치환된 알키닐, 치환된 알콕시 및 치환된 메틸렌은 할로겐, 하이드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알콕시알킬, 알케닐옥시, 카르복실, 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐, 포르밀, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3 개의 치환기로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐 및 메틸렌이고;
Xa 는 산소, 황 또는 -NRc 이고;
Rc, Rd 및 Re 는 수소 및 알킬로부터 독립적으로 선택되고;
n 은 1, 2 또는 3 이고;
R5 는 하이드록실 보호기이고;
Rx 는 페닐, 니트로페닐, 페닐알킬, 할로페닐알킬, 시아노알킬, 페닐카르보닐설파닐알킬, 할로페닐카르보닐설파닐알킬 알킬카르보닐설파닐알킬 또는 알킬카르보닐카르보닐설파닐알킬이고;
Ry 는 디알킬아미노 또는 피롤리디닐이고;
Nu 는 핵염기 또는 보호된 핵염기이다.
본 발명은 또한 하기에 관한 것이다:
-X-Y- 는 -CH2-O-, -CH(CH3)-O- 또는 -CH2CH2-O- 인 화학식 (II) 의 화합물;
본 발명은 또한 화학식 (IIb) 의 화합물을 제공한다:
Figure pct00055
식 중, R5 는 하이드록실 보호기이고,
Rx 는 페닐, 니트로페닐, 페닐알킬, 할로페닐알킬, 시아노알킬, 페닐카르보닐설파닐알킬, 할로페닐카르보닐설파닐알킬 알킬카르보닐설파닐알킬 또는 알킬카르보닐카르보닐설파닐알킬이고;
Ry 는 디알킬아미노 또는 피롤리디닐이고;
Nu 는 핵염기 또는 보호된 핵염기이다.
화학식 (III) 또는 (IV) 를 갖는 화학식 (II) 의 화합물:
Figure pct00056
식 중, R5, Rx, Ry 및 Nu 는 상기와 같다;
식 중, Rx 는 페닐, 니트로페닐, 페닐메틸, 디클로로페닐메틸, 시아노에틸, 메틸카르보닐설파닐에틸, 에틸카르보닐설파닐에틸, 이소프로필카르보닐설파닐에틸, tert.-부틸카르보닐설파닐에틸, 메틸카르보닐카르보닐설파닐에틸 또는 디플루오로페닐카르보닐설파닐에틸인, 화학식 (II), (IIb), (III) 또는 (IV) 의 화합물;
식 중, Rx 는 페닐, 4-니트로페닐, 2,4-디클로로페닐메틸, 시아노에틸, 메틸카르보닐설파닐에틸, 에틸카르보닐설파닐에틸, 이소프로필카르보닐설파닐에틸, tert.-부틸카르보닐설파닐에틸, 메틸카르보닐카르보닐설파닐에틸 또는 2,4-디플루오로페닐카르보닐설파닐에틸인, 화학식 (II), (IIb), (III) 또는 (IV) 의 화합물;
식 중, Rx 는 페닐카르보닐설파닐알킬인, 화학식 (II), (IIb), (III) 또는 (IV) 의 화합물;
식 중, Rx 는 페닐카르보닐설파닐에틸인, 화학식 (II), (IIb), (III) 또는 (IV) 의 화합물;
식 중, Ry 는 디이소프로필아미노 또는 피롤리디닐인, 화학식 (II), (IIb), (III) 또는 (IV) 의 화합물;
식 중, Ry 는 피롤리디닐인, 화학식 (II), (IIb), (III) 또는 (IV) 의 화합물;
화학식 (V) 을 갖는 화학식 (II) 의 화합물:
Figure pct00057
식 중, R5 및 Nu 는 상기 정의된 바와 같다;
화학식 (Vb) 을 갖는 화학식 (IIb) 의 화합물:
Figure pct00058
식 중, R5 및 Nu 는 상기 정의된 바와 같다;
Nu 는 티민, 보호된 티민, 아데노신, 보호된 아데노신, 시토신, 보호된 시토신, 5-메틸시토신, 보호된 5-메틸시토신, 구아닌, 보호된 구아닌, 우라실 또는 보호된 우라실인, 화학식 (II), (IIb), (III), (IV) 또는 (V) 또는 (Vb) 의 화합물;
Nu 는 티민, 보호된 티민, 아데노신, 보호된 아데노신, 시토신, 보호된 시토신, 5-메틸시토신, 보호된 5-메틸시토신, 구아닌, 보호된 구아닌, 우라실 또는 보호된 우라실인, 화학식 (IIb) 의 화합물;
Nu 는 티민, 보호된 티민, 아데노신, 보호된 아데노신, 시토신, 보호된 시토신, 5-메틸시토신, 보호된 5-메틸시토신, 구아닌, 보호된 구아닌, 우라실 또는 보호된 우라실인, 화학식 (Vb) 의 화합물;
하기로부터 선택되는 화학식 (II) 의 화합물:
Figure pct00059
Figure pct00060
하기로부터 선택되는 화학식 (IIb) 의 화합물:
Figure pct00061
Figure pct00062
화학식 (II) 및 (IIb) 의 화합물에서 불순물의 존재는 올리고뉴클레오티드의 제조 동안 부산물을 생성하고 합성의 성공을 방해한다. 또한, 불순물이 존재하는 경우, 화학식 (II) 또는 (IIb) 의 화합물은 저장시 불안정하다.
화학식 (X1), (X2), (X11) 및 (X21) 의 화합물은 특히 이러한 불순물의 예이다:
Figure pct00063
따라서, 저장 및 올리고뉴클레오티드 제조 목적을 위해 충분히 순수한 형태의 화학식 (II) 또는 (IIb) 의 화합물이 필요하다.
따라서, 본 발명은 또한 적어도 98 %, 특히 99 %, 보다 특히 100 % 의 순도를 갖는 화학식 (II) (IIb) 의 화합물에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 특히 불순물로서 1 % 미만, 특히 0 % 의 화학식 (X1) 의 화합물 및/또는 (X2) 의 화합물을 포함하는 화학식 (II) 의 화합물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 산성 커플링제 및 실릴화제의 존재하의 5'-보호된 LNA 뉴클레오시드와 포스핀 및 모노-보호된 디티올의 반응을 포함하는 상기 정의된 바와 같은 화학식 (II) 의 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 산성 커플링제 및 실릴화제의 존재하의 5'-보호된 MOE 뉴클레오시드와 포스핀 및 모노-보호된 디티올의 반응을 포함하는 상기 정의된 바와 같은 화학식 (IIb) 의 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 산성 커플링제 및 실릴화제의 존재하의 화학식 (C) 의 화합물과 화학식 P(Ry)3 의 화합물 및 화학식 HSRx 의 화합물의 반응을 포함하는 화학식 (II) 의 화합물의 제조 방법에 관한 것이다:
Figure pct00064
식 중, X, Y, R5, Nu, Rx 및 Ry 는 상기 정의된 바와 같다.
본 발명은 또한 산성 커플링제 및 실릴화제의 존재하의 화학식 (C1) 의 화합물과 화학식 P(Ry)3 의 화합물 및 화학식 HSRx 의 화합물의 반응을 포함하는 화학식 (II) 의 화합물의 제조 방법에 관한 것이다:
Figure pct00065
식 중, R5, Nu, Rx 및 Ry 는 상기 정의된 바와 같다.
본 발명은 또한 산성 커플링제 및 실릴화제의 존재하의 화학식 (Cb) 의 화합물과 화학식 P(Ry)3 의 화합물 및 화학식 HSRx 의 화합물의 반응을 포함하는 화학식 (IIb) 의 화합물의 제조 방법에 관한 것이다:
Figure pct00066
식 중, R5, Nu, Rx 및 Ry 는 상기 정의된 바와 같다.
산성 활성화제로도 알려진 산성 커플링제의 예는 아졸 기반 활성화제, 예컨대 테트라졸, 5-니트로페닐-1H-테트라졸 (NPT), 5-에틸티오-1H-테트라졸 (ETT), 5-벤질티오-1H-테트라졸 (BTT), 5-메틸티오-1H-테트라졸 (MTT), 5-머캡토-테트라졸 (MCT), 5-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-테트라졸 및 4,5-디시아노이미다졸 (DCI), 또는 산성 염, 예컨대 피리디늄 하이드로클로라이드, 이미다졸리늄 트리플레이트, 벤지미다졸륨 트리플레이트, 5-니트로벤지미다졸륨 트리플레이트, 또는 약산, 예컨대 2,4-디니트로벤조산 또는 2,4-디니트로페놀이다. 테트라졸은 특정 산성 커플링제이다.
하이드록실 기 소광제로도 알려진 실릴화제의 예는 비스(디메틸아미노)디메틸실란, N,O-비스(트리메틸실릴)아세트아미드 (BSA), N,O-비스(트리메틸실릴)카바메이트 (BSC), N,N-비스(트리메틸실릴)메틸아민, N,O-비스(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드 (BSTFA), N,N-비스(트리메틸실릴)우레아 (BSU), 브로모트리메틸실란 (TMBS), N-tert-부틸디메틸실릴-N-메틸트리플루오로아세트아미드 (MTBSTFA), 클로로디메틸(펜타플루오로페닐)실란, 클로로트리에틸실란 (TESCI), 클로로트리메틸실란 (TMCS), 1,3-디메틸-1,1,3,3-테트라페닐디실라잔 (TPDMDS), N,N-디메틸트리메틸실릴아민 (TMSDMA), 헥사메틸디실라잔 (HMDS), 헥사메틸디실록산 (HMDSO), N-메틸-N-트리메틸실릴아세트아미드 (MSA), N-메틸-N-트리메틸실릴헵타플루오로부티르아미드 (MSHFA), N-메틸-N-(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드 (MSTFA), 1,1,3,3-테트라메틸-1,3-디페닐디실라잔 (DPTMDS), 4-(트리메틸실록시)-3-펜텐-2-온 (TMS acac), 1-(트리메틸실릴)이미다졸 (TMSI) 또는 트리메틸실릴 메탈릴설피네이트 (SILMAS-TMS) 이다. 1-(트리메틸실릴)이미다졸은 특정 실릴화제이다.
본 발명은 또한 화학식 (II) 또는 (IIb) 의 미정제 화합물이 분취용 HPLC 에 의해 정제되는 화학식 (II), (IIb) 또는 (III) 의 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 미정제 화학식 (II), (IIb) 또는 (III) 의 화합물이 분취용 HPLC 에 의해 정제되고 아세토니트릴 대 물 중 암모늄 하이드록사이드의 구배로 용리되는 화학식 (II), (IIb) 또는 (III) 의 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.
물 중 암모늄 하이드록사이드 함량은 특히 적어도 약 0.05 % v/v, 특히 약 0.0 5% 내지 1 % v/v, 보다 특히 약 0.05 % 내지 0.5 % v/v, 보다 특히 약 0.05 % v/v 이다.
아세토니트릴의 구배는 특히 0 % 에서 25 % 내지 75 % 에서 100 % 아세토니트릴, 특히 20 min 내지 120 min 이내, 보다 특히 10 % 에서 20 % 내지 75 % 에서 90 % 아세토니트릴, 특히 25 min 내지 60 min 이내, 보다 특히 약 25 % 내지 75 % 아세토니트릴, 특히 30 min 이내이다.
본 발명은 또한 올리고뉴클레오티드, 특히 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 또는 갭머 올리고뉴클레오티드의 제조에서의 화학식 (II), (IIb) 또는 (III) 의 화합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 이제 제한적인 특성을 갖지 않는 하기 실시예에 의해 설명될 것이다.
실시예
실시예 1: 단량체 합성
1.1: S-(2-설파닐에틸) 벤젠카르보티오에이트
Figure pct00067
클로로포름 (200 mL) 중 1,2-에탄디티올 (133.57 mL, 1592 mmol, 1 eq) 및 피리딘 (64.4 mL, 796 mmol, 0.5 eq) 의 용액에 클로로포름 (200 mL) 중 벤조일 클로라이드 (92.4 mL, 796 mmol, 0.5 eq) 를 1 시간 동안 적가하고, 반응물을 0 ℃ 에서 1 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물 (300 mL) 및 염수 (300 mL) 로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시키고 황색 오일로 농축시켰다. 오일을 증류 (135~145℃) 하여 S-(2-설파닐에틸) 벤젠카르보티오에이트 (40 g, 202 mmol, 13% 수율) 를 무색 오일로 수득하였다.
Figure pct00068
1.2: S-[2-[[(1R,3R,4R,7S)-1-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]-3-(5-메틸-2,4-디옥소-피리미딘-1-일)-2,5-디옥사바이시클로[2.2.1]헵탄-7-일]옥시-피롤리딘-1-일-포스파닐]설파닐에틸] 벤젠카르보티오에이트
Figure pct00069
1-[(1R,4R,6R,7S)-4-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]-7-하이드록시-2,5-디옥사바이시클로[2.2.1]헵탄-6-일]-5-메틸-피리미딘-2,4-디온 (2.29 g, 4.00 mmol, 1.0 eq) 을 3 Å 분자체 한 스패츌라를 첨가한 60 mL 의 무수 디클로로메탄에 용해시켰다. 트리피롤리딘-1-일포스판 (960 mg, 3.98 mmol, 0.99 eq) 을 주사기를 통해 첨가한 후 0.1 mmol 분취량의 테트라졸 (7 * 3 Å 분자체에 저장된 무수 아세토니트릴 중 0.5 M 용액 0.4 mL) 을 2 min 간격으로 7 회 첨가하였다. 이어서, N-트리메틸실릴이미다졸 (56.0 mg, 0.400 mmol, 0.1 eq) 을 반응에 첨가하였다. 5 min 후, 테트라졸 (무수 아세토니트릴 중 0.5 M 용액 21.6 mL) 을 첨가한 후, 즉시 S-(2-설파닐에틸) 벤젠카르보티오에이트 (1.04 g, 5.24 mmol, 1.31 eq) 를 첨가하였다. 반응을 120 초 동안 진행시켰다. 4 개의 동일한 배치의 반응을 합치고 40 mL 의 트리에틸아민을 함유하는 600 mL 의 디클로로메탄에 용액을 부어 켄칭시켰다. 포화 소듐 바이카르보네이트 (800 mL) 이어서 10% 소듐 카르보네이트 (2 * 800 mL) 및 염수 (800 mL) 로 혼합물을 즉시 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 10-15 min 후, 여과에 의해 건조제를 제거하였다. 트리에틸아민 (40 mL) 을 용액에 첨가하고 회전 증발기를 사용하여 용액을 시럽으로 농축시켰다. 시럽을 톨루엔 (200 mL) 및 트리에틸아민 (40mL) 에 용해시키고 이 용액을 4500 mL 의 격렬하게 교반된 헵탄에 피펫팅하여 솜털 같은 백색 생성물을 침전시켰다. 대부분의 헵탄을 디캔팅한 후, 백색 침전물을 중간 소결된(medium sintered) 유리 깔때기를 통한 여과에 의해 수집한 후 진공하에 건조시켜 백색 고체를 수득하였다. 고체를 prep-HPLC (Phenomenex Gemini C18, 250x50 mm, 10 mm 컬럼, 물 중 0.05% 암모늄 하이드록사이드 / CH3CN) 에 의해 정제하고, 동결 건조시켜 4.58 g 의 표적 화합물을 백색 고체로 수득하였다.
Figure pct00070
1.3: S-[2-[[(1R,3R,4R,7S)-3-(6-벤즈아미도푸린-9-일)-1-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]-2,5-디옥사바이시클로[2.2.1]헵탄-7-일]옥시-피롤리딘-1-일-포스파닐]설파닐에틸] 벤젠카르보티오에이트
Figure pct00071
N-[9-[(1R,4R,6R,7S)-4-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]-7-하이드록시-2,5-디옥사바이시클로[2.2.1]헵탄-6-일]푸린-6-일]벤즈아미드 (2.74g, 4.00 mmol, 1.0 eq) 를 3 Å 분자체 한 스패츌라를 첨가한 60 mL 의 무수 디클로로메탄에 용해시켰다. 트리피롤리딘-1-일포스판 (960 mg, 3.98 mmol, 0.99 eq) 을 주사기를 통해 첨가한 후 0.1 mmol 분취량의 테트라졸 (7 * 3 Å 분자체에 저장된 무수 아세토니트릴 중 0.5 M 용액 0.4 mL) 을 2 min 간격으로 7 회 첨가하였다. 이어서, 1-(트리메틸실릴)-1H-이미다졸 (56.0 mg, 0.400 mmol, 0.1 eq) 을 반응에 첨가하였다. 5 min 후, 테트라졸 (무수 아세토니트릴 중 0.5 M 용액 21.6 mL) 을 첨가한 후, 즉시 S-(2-설파닐에틸) 벤젠카르보티오에이트 (1.04 g, 5.24 mmol, 1.31 eq) 를 첨가하였다. 반응을 120 초 동안 진행시켰다. 4 개의 동일한 배치의 반응을 합치고 40 mL 의 트리에틸아민을 함유하는 600 mL 의 디클로로메탄에 용액을 부어 켄칭시켰다. 포화 소듐 바이카르보네이트 (800 mL) 이어서 10% 소듐 카르보네이트 (2 * 800 mL) 및 염수 (800 mL) 로 혼합물을 즉시 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 10-15 min 후, 여과에 의해 건조제를 제거하였다. 트리에틸아민 (10 mL) 을 용액에 첨가하고 회전 증발기를 사용하여 용액을 시럽으로 농축시켰다. 시럽을 톨루엔 (100 mL) 및 트리에틸아민 (20mL) 에 용해시키고 이 용액을 4500 mL 의 격렬하게 교반된 헵탄에 피펫팅하여 솜털 같은 백색 생성물을 침전시켰다. 대부분의 헵탄을 디캔팅한 후, 백색 침전물을 중간 소결된 유리 깔때기를 통한 여과에 의해 수집한 후 진공하에 건조시켜 백색 고체를 수득하였다. 고체를 prep-HPLC (Phenomenex Gemini C18, 250x50 mm, 10 mm 컬럼, 물 중 0.05% 암모늄 하이드록사이드 / CH3CN) 에 의해 정제하고, 동결 건조시켜 5.26 g 의 표적 화합물을 백색 고체로 수득하였다.
Figure pct00072
1.4: S-[2-[[(1R,3R,4R,7S)-3-(4-벤즈아미도-5-메틸-2-옥소-피리미딘-1-일)-1-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]-2,5-디옥사바이시클로[2.2.1]헵탄-7-일]옥시-피롤리딘-1-일-포스파닐]설파닐에틸] 벤젠카르보티오에이트
Figure pct00073
N-[1-[(1R,4R,6R,7S)-4-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]-7-하이드록시-2,5-디옥사바이시클로[2.2.1]헵탄-6-일]-5-메틸-2-옥소-피리미딘-4-일]벤즈아미드 (2.70 g, 4.00 mmol, 1.0 eq) 를 3 Å 분자체 한 스패츌라를 첨가한 60 mL 의 무수 디클로로메탄에 용해시켰다. 트리피롤리딘-1-일포스판 (965 mg, 4.00 mmol, 1.0 eq) 을 주사기를 통해 첨가한 후 0.1 mmol 분취량의 테트라졸 (7 * 3 Å 분자체에 저장된 무수 아세토니트릴 중 0.5 M 용액 0.4 mL) 을 2 min 간격으로 7 회 첨가하였다. 이어서, 1-(트리메틸실릴)-1H-이미다졸 (56.0 mg, 0.400 mmol, 0.1 eq) 을 반응에 첨가하였다. 5 min 후, 테트라졸 (무수 아세토니트릴 중 0.5 M 용액 21.6 mL) 을 첨가한 후, 즉시 S-(2-설파닐에틸) 벤젠카르보티오에이트 (1.04 g, 5.24 mmol, 1.31 eq) 를 첨가하였다. 반응을 120 초 동안 진행시켰다. 4 개의 동일한 배치의 반응을 40 mL 의 트리에틸아민을 함유하는 600 mL 의 디클로로메탄에 용액을 부어 켄칭시키고 합쳤다. 포화 소듐 바이카르보네이트 (800 mL) 이어서 10% 소듐 카르보네이트 (2 * 800 mL) 및 염수 (800 mL) 로 혼합물을 즉시 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 10-15 min 후, 여과에 의해 건조제를 제거하였다. 트리에틸아민 (40 mL) 을 용액에 첨가하고 회전 증발기를 사용하여 용액을 시럽으로 농축시켰다. 시럽을 톨루엔 (100 mL) 및 트리에틸아민 (30 mL) 에 용해키시고, 이 용액을 4500 mL 의 격렬하게 교반된 헵탄에 피펫팅하여 솜털 같은 백색 생성물을 침전시켰다. 대부분의 헵탄을 디캔팅한 후, 백색 침전물을 중간 소결된 유리 깔때기를 통한 여과에 의해 수집한 후 진공하에 건조시켜 백색 고체를 수득하였다. 고체를 prep-HPLC (Phenomenex Gemini C18, 250x50 mm, 10 mm 컬럼, 물 중 0.05% 암모늄 하이드록사이드 / CH3CN) 에 의해 정제하고, 동결 건조시켜 2.05 g 의 표적 화합물을 백색 고체로 수득하였다.
Figure pct00074
1.5: S-[2-[[(1R,3R,4R,7S)-1-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]-3-[2-[(E)-디메틸아미노메틸렌아미노]-6-옥소-1H-푸린-9-일]-2,5-디옥사바이시클로[2.2.1]헵탄-7-일]옥시-피롤리딘-1-일-포스파닐]설파닐에틸] 벤젠카르보티오에이트
Figure pct00075
N'-[9-[(1R,4R,6R,7S)-4-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]-7-하이드록시-2,5-디옥사바이시클로[2.2.1]헵탄-6-일]-6-옥소-1H-푸린-2-일]-N,N-디메틸-포름아미딘 (2.62 mg, 4.00 mmol, 1.0 eq) 를 3 Å 분자체 한 스패츌라를 첨가한 200 mL 의 무수 디클로로메탄에 용해시켰다. 트리피롤리딘-1-일포스판 (965 mg, 4.00 mmol, 1.0 eq) 을 주사기를 통해 첨가한 후 0.1 mmol 분취량의 테트라졸 (7 * 3 Å 분자체에 저장된 무수 아세토니트릴 중 0.5 M 용액 0.4 mL) 을 2 min 간격으로 7 회 첨가하였다. 이어서, 1-(트리메틸실릴)-1H-이미다졸 (56.0 mg, 0.400 mmol, 0.1 eq) 을 반응에 첨가하였다. 5 min 후, 테트라졸 (무수 아세토니트릴 중 0.5 M 용액 21.6 mL) 을 첨가한 후, 즉시 S-(2-설파닐에틸) 벤젠카르보티오에이트 (1.04 g, 5.24 mmol, 1.31 eq) 를 첨가하였다. 반응을 180 초 동안 진행시켰다. 4 개의 동일한 배치를 합치고 40 mL 의 트리에틸아민을 함유하는 600 mL 의 디클로로메탄에 용액을 부어 켄칭시켰다. 포화 소듐 바이카르보네이트 (800 mL) 이어서 10% 소듐 카르보네이트 (2 * 800 mL) 및 염수 (800 mL) 로 혼합물을 즉시 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 10-15 min 후, 여과에 의해 건조제를 제거하였다. 트리에틸아민 (40 mL) 을 용액에 첨가하고 회전 증발기를 사용하여 용액을 시럽으로 농축시켰다. 시럽을 톨루엔 (100 mL) 및 트리에틸아민 (30mL) 에 용해시키고 이 용액을 4500 mL 의 격렬하게 교반된 헵탄에 피펫팅하여 솜털 같은 백색 생성물을 침전시켰다. 대부분의 헵탄을 디캔팅한 후, 백색 침전물을 중간 소결된 유리 깔때기를 통한 여과에 의해 수집한 후 진공하에 건조시켜 백색 고체를 수득하였다. 고체를 prep-HPLC (Phenomenex Gemini C18, 250x50 mm, 10 mm 컬럼, 물 중 0.05% 암모늄 하이드록사이드 / CH3CN) 에 의해 정제하고, 동결 건조시켜 3.82 g 의 표적 화합물을 황색 고체로 수득하였다.
Figure pct00076
실시예 2: 올리고뉴클레오티드 합성
올리고뉴클레오티드는 Bioautomation 의 MerMade 12 자동 DNA 합성기를 사용하여 합성되었다. 범용 링커를 갖는 제어된 기공 유리 지지체 (500Å) 를 사용하여 1 μmol 규모로 합성을 수행하였다.
DNA 및 LNA 포스포르아미다이트의 커플링을 위한 표준 사이클 절차에서, DMT 탈보호는 CH2Cl2 중 3% (w/v) 트리클로로아세트산을 사용하여 30 초 동안 200 μL 의 3 회 적용으로 수행되었다. 각각의 포스포르아미다이트를 180 초의 커플링 시간 및 활성화제로서 아세토니트릴 중 5-(3,5-비스(트리플루오로메틸페닐))-1H-테트라졸의 0.1 M 용액 110 μL 및 아세토니트릴 (또는 LNA-MeC 빌딩 블록의 경우 아세토니트릴/CH2Cl2 1:1) 중 0.1 M 용액 100 μL 를 사용하여 3 회 커플링하였다. 티오산화를 위해, 아세토니트릴/피리딘 1:1 중 3-아미노-1,2,4-디티아졸-5-티온의 0.1m 용액을 사용하였다 (3x190 μL, 55 초). THF/루티딘/Ac2O 8:1:1 (CapA, 75 μmol) 및 THF/N-메틸이미다졸 8:2 (CapB, 75 μmol) 를 55 초 동안 사용하여 캡핑을 수행하였다.
티오포스포르아미다이트의 도입을 위한 합성 사이클은 CH2Cl2 중 3% (w/v) 트리클로로아세트산을 30 초 동안 200 μL 의 3 회 적용으로 사용하는 DMT 탈보호를 포함하였다. 상업적으로 입수 가능한 DNA 티오포스포르아미다이트 또는 갓 제조된 LNA 티오포스포르아미다이트는 각각 600 초의 커플링 시간 및 활성화제로서 아세토니트릴 중 10% (v/v) CH2Cl2 중 0.15 M 용액 100 μL 및 아세토니트릴 중 5-(3,5-비스(트리플루오로메틸페닐))-1H-테트라졸의 0.1 M 용액 110 μL 를 사용하여 3 회 커플링되었다. 티오산화는 아세토니트릴/피리딘 중 3-아미노-1,2,4-디티아졸-5-티온의 0.1 M 용액을 55 초 동안 3 회의 적용으로 사용하여 수행하였다. THF/루티딘/Ac2O 8:1:1 (CapA, 75 μmol) 및 THF/N-메틸이미다졸 8:2 (CapB, 75 μmol) 를 55 초 동안 사용하여 캡핑을 수행하였다.
자동 합성이 완료되면, 핵염기 보호기의 제거 및 고체 지지체로부터의 절단이 55℃ 에서 15-16 h 동안 20 mM DTT 를 함유하는 암모니아 (32%):에탄올 (3:1, v:v) 혼합물을 사용하여 수행되었다.
미정제 DMT-온 올리고뉴클레오티드는 고체 상 추출 카트리지 및 이온 교환 크로마토그래피에 의한 재정제를 사용하여 또는 C18 컬럼을 사용하는 RP-HPLC 정제에 의해 정제된 다음 80% 수성 아세트산 및 에탄올 침전으로 DMT 를 제거하였다.
하기 실시예에서 본 발명자들은 하기 티오 연결 화학을 사용하였다:
Figure pct00077
하기 실시예에서, 달리 지시되지 않는 한, 아카이랄 포스포로디티오에이트 연결 (P2S 로도 지칭됨) 은 비-가교 디티오에이트 (화학식 (IA) 또는 (IB) 에 예시된 바와 같음) 이며, * 로 표시되어 있다. 실시예에서 사용된 화합물은 하기 핵염기 서열을 갖는 화합물을 포함한다:
Figure pct00078
상기 절차에 따라 하기 분자가 제조되었다.
Figure pct00079
Figure pct00080
* 인접 뉴클레오티드 사이의 디티오에이트 개질
A, G, mC, T 는 LNA 뉴클레오티드를 나타냄
a, g, c, t 는 DNA 뉴클레오티드를 나타냄
모든 다른 연결은 포스포로티오에이트로서 제조됨
실시예 3: 시험관내 효능 및 세포 흡수 실험
1차 랫트 간세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고 항생제 없이 10% FCS 를 함유하는 윌리엄스 배지 E 에서 처리하였다. 세포를 전체 세포 배양 배지에서 지시된 농도의 LNA 용액으로 처리하였다. 각각, 24 및 72 시간의 배양 시간 후, Ca2+ 및 Mg2+ 를 함유하는 PBS 로 세포를 3 회 세척하고, 165 uL PureLink Pro 용해 완충액으로 용해시켰다. Thermo Fisher 의 PureLink PRO 96 RNA Kit 를 사용하여 제조사의 지침에 따라 전체 RNA 를 단리하고, RnApoB (Invitrogen) 에 대하여 Primer Primer Sets 와 LightCycler Multiplex RNA Virus Master (Roche) 를 사용하여 RT-qPCR 을 수행하였다. 수득된 데이터를 리보그린 (Ribogreen) 에 대하여 정규화하였다.
LNA 올리고뉴클레오티드의 세포내 농도는 다양한 화합물에 대하여 하이브리드화 기반 ELISA 분석을 사용하여 결정되었다. 모든 데이터 포인트는 3 회 수행되었고 데이터는 평균으로 제공된다.
결과는 도 1 내지 4 에 도시되어 있다.
실시예 4: RNA 및 DNA 에 하이브리드화된 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 함유하는 올리고뉴클레오티드의 열 용융 (Tm)
하기 올리고뉴클레오티드가 제조되었다. 포스포로티오에이트 연결은 아래 첨자 S 로 지정된다; 본 발명에 따른 포스포로디티오에이트 연결은 아래 첨자 PS2 로 지정된다.
Figure pct00081
화합물 1 - 6 은 서열 모티프 SEQ ID NO 1 을 갖는다.
RNA 및 DNA 에 하이브리드화된 화합물 1-6 의 열 용융 (Tm) 은 하기 절차에 따라 측정되었다.
완충액 (100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 10 mM Na2HPO4, pH 7) 중 등몰량의 RNA 또는 DNA 및 LNA 올리고뉴클레오티드 (1.5 μM) 의 용액을 1 분 동안 90 ℃ 로 가열한 다음 실온으로 냉각시켰다. Cary Series UV-Vis 분광 광도계를 사용하여 260 nm 에서의 UV 흡광도를 기록하였다 (가열 속도 1 분 당 1 ℃; 판독 속도 1 분 당 1 회). 흡광도는 온도에 대해 플롯팅되었고 Tm 값은 각 곡선의 1차 미분을 취함으로써 계산되었다.
결과는 아래 표와 도 5 에 요약되어 있다.
Figure pct00082
Td: 해리 (변성) 온도; Ta: 회합 (재생) 온도
본 발명에 따른 화합물은 대조군의 RNA 및 DNA 에 대한 높은 친화성을 유지한다.
실시예 5: 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 함유하는 올리고뉴클레오티드의 혈청 안정성
수컷 스프라그-다울링(Sprague-Dawling) 랫트로부터의 혈청에서의 올리고뉴클레오티드 1-6 의 안정성을 하기 절차에 따라 측정하였다.
뉴클레아제 완충액 (30 mM 소듐 아세테이트, 1 mM 아연 설페이트, 300 mM NaCl, pH 4.6) 와 3:1 혼합된 랫트 혈청 중 25 μM 올리고뉴클레오티드 용액을 37 ℃ 에서 0, 5, 25, 52 또는 74 시간 동안 배양하였다. UPLC-MS 분석을 위해 Water Acquity BEH C18, 1.7 μm 컬럼이 장착된 Water Acquity UPLC 에서 샘플 2μL 를 주입하였다. 상이한 분해 길이의 확장 상수로 보상된 260 nm 에서 측정된 유사체 피크 면적을 사용하여 절단되지 않은 올리고뉴클레오티드의 % 를 확립하였다.
UPLC 용리액: A: 2.5% MeOH, 0.2 M HEP, 16.3 mM TEA B: 60% MeOH, 0.2 M HEP, 16.3 mM TEA
Figure pct00083
결과는 도 6 에 요약되어 있다.
본 발명에 따른 적어도 하나의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 갖는 화합물은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결만 갖는 화합물보다 우수한 뉴클레아제 내성을 갖는다.
화합물 1-6 에서 5 시간 후에 나타나는 초기 올리고뉴클레오티드 분해는 모노티오에이트 불순물의 존재에 의해 야기되는 것으로 밝혀졌다.
실시예 7: 디티오에이트 개질된 갭머: LNA 갭머의 갭 영역에서 디티오에이트 탐색
시험된 화합물
Figure pct00084
실험: ApoB mRNA 를 표적으로 하는 상기 화합물은 짐노틱 흡수를 사용하여 2 μM 의 화합물 농도와 72 시간 동안의 배양에 의해 1차 랫트 간세포에서 시험되었다. 이어서, 표적 mRNA 수준을 RT-PCR 을 사용하여 측정하였다. 결과는 도 7 에 도시되어 있다.
도 7 에 도시된 결과는 단일 및 다수의 아카이랄 포스포로디티오에이트가 갭 및 플랭크 영역에 수용된다는 것을 예시한다. 갭에서 3 또는 4 개 초과의 아카이랄 포스포로디티오에이트를 사용하는 것은 플랭크 영역에서 다수의 아카이랄 포스포로디티오에이트를 사용하는 것에 비해 효능을 감소시키는 경향이 있을 수 있다.
실시예 8: 활성에 대한 위치 의존성 - 디자인 최적화
시험된 화합물
Figure pct00085
실험: ApoB mRNA 를 표적으로 하는 상기 화합물은 짐노틱 흡수를 사용하여 2 μM 의 화합물 농도와 72 시간 동안의 배양에 의해 1차 랫트 간세포에서 시험되었다. 이어서, 표적 mRNA 수준을 RT-PCR 을 사용하여 측정하였다. 결과는 도 8 에 도시되어 있다.
실시예 9: 아카이랄 포스포로디티오에이트 갭머의 세포 흡수
시험된 화합물
Figure pct00086
실험: ApoB mRNA 를 표적으로 하는 상기 화합물은 짐노틱 흡수를 사용하여 2 μM 의 화합물 농도와 72 시간 동안의 배양에 의해 1차 랫트 간세포에서 시험되었다. 올리고뉴클레오티드 함량은 하이브리드화 기반 ELISA 분석을 사용하여 결정되었다. 결과는 도 9A 및 9B 에 도시되어 있다.
예외 없이, 아카이랄 포스포로디티오에이트의 포함은 향상된 세포 흡수를 제공하였다. 그러나, 아카이랄 포스포로디티오에이트 연결의 위치에 따라 흡수 개선이 다양하였다.
실시예 10: 갭머의 플랭크 영역에서 아카이랄 포스포로디티오에이트 로드의 증가
시험된 화합물 (서열 모티프 = SEQ ID NO 1)
Figure pct00087
실험: ApoB mRNA 를 표적으로 하는 상기 화합물은 짐노틱 흡수를 사용하여 2 μM 의 화합물 농도와 72 시간 동안의 배양에 의해 1차 랫트 간세포에서 시험되었다. 이어서, 표적 mRNA 수준을 RT-PCR 을 사용하여 측정하였다. 결과는 도 10A 및 10B 에 도시되어 있다.
갭머의 플랭크 영역에서 아카이랄 포스포로디티오에이트 개질의 도입은 예외 없이 3 - 7 x 의 IC50 감소와 함께 현저한 효능 증가를 제공하였다. 흥미롭게도, 플랭크에서 카이랄 포스포로디티오에이트 개질의 수가 증가하면 IC50 은 낮아진다.
실시예 11: 시험관내에서 상이한 세포 유형에서의 아카이랄 포스포로디티오에이트 연결의 효과.
시험된 화합물 (서열 모티프 = SEQ ID NO 3)
Figure pct00088
Malat-1 을 표적으로 하는 상기 화합물을 화합물 효능 (IC50) 을 결정하기 위한 농도 범위에서 72 시간 동안 짐노틱 흡수를 사용하여 3 가지 시험관내 세포 시스템: 인간 1차 골격근, 인간 1차 기관지 상피 세포 및 마우스 섬유아세포 (LTK 세포) 에서 시험하였다.
LTK 세포에 대한 농도 범위: 50 μM, ½log 희석, 8 가지 농도.
Malat1 의 RNA 수준을 qPCR (GAPDH 수준에 대하여 정규화) 을 사용하여 정량화하고 IC50 값을 결정하였다.
IC50 결과는 도 11 에 도시되어 있다. 아카이랄 포스포로디티오에이트의 도입은 골격근 세포에서 신뢰할 수 있는 향상된 효능을 제공하였고, 일반적으로 마우스 섬유아세포에 개선된 효능을 제공하였다. 그러나, 인간 기관지 상피 세포에서의 효과는 보다 화합물 특이적이었지만, 일부 화합물 (#5) 에서는 기준 화합물보다 현저하게 더 강력하였다.
실시예 12: 5' 및 3' 말단 보호된 LNA 올리고뉴클레오티드의 시험관내 랫트 혈청 안정성.
시험된 화합물 (서열 모티프 = SEQ ID NO 1)
Figure pct00089
실험 - 실시예 5 참조.
결과는 도 12 에 도시되어 있다. 본 발명자들은 LNA 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 이전에 생각된 것보다 혈청 뉴클레아제에 더 민감하고 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에서 포스포로티오에이트 연결(들)의 카이랄성과 관련이 있는 것으로 보임 (50% 의 모체 올리고뉴클레오티드 #1 의 신속한 절단에 의해 설명되는 바와 같음) 을 확인하였다. 아카이랄 포스포로디티오에이트에 의한 5' 말단 보호는 개선된 보호를 제공하였다. 아카이랄 포스포로디티오에이트에 의한 3' 말단 보호는 랫트 혈청 엑소뉴클레아제에 대한 완전한 보호를 제공하였다 - 화합물 #4 - #8 에서 관찰되는 약간의 감소는 모노티오에이트 불순물과 상관 관계가 있었다.
따라서, 아카이랄 포스포로티오에이트 연결에 의한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 및/또는 3' 말단 보호는 입체 랜덤 및 입체 정의된 포스포로티오에이트와의 주요 불안정성 문제에 대한 해결책을 제공하는 것으로 간주된다.
실시예 13: 플랭크에 아카이랄 포스포로디티오에이트 연결을 갖는 갭머의 생체내 평가
시험된 화합물 (서열 모티프 = SEQ ID NO 1)
Figure pct00090
실험: ApoB 를 표적으로 하는 상기 화합물을 1 mg/kg 단일 iv 용량을 사용하여 암컷 C57BL/6JBom 마우스에 투여하고, 7 일 째에 희생시켰다, n=5. 간에서의 mRNA 감소는 RT-PCR 을 사용하여 측정되었고 그 결과는 도 13 에 도시되어 있다.
결과는 일반적으로 아카이랄 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결의 도입이 개선된 효능을 제공하고, 특히 플랭크 영역에 아카이랄 포스포로디티오에이트 연결을 갖는 모든 화합물이 개선된 효능을 나타낸다는 것을 보여준다. 시험관내 실험에 나타낸 바와 같이, 갭 영역 (#8) 에서의 다수의 포스포로디티오에이트 연결의 사용은 현저한 효능 손실 없이 수용되었다. 연결 기술을 안티센스 올리고뉴클레오티드와 조합할 때 시너지를 나타내는, 갭 영역에 입체 정의된 포스포로티오에이트 연결을 갖고 플랭크에 아카이랄 포스포로디티오에이트 연결을 갖는 갭머 디자인의 조합된 효과가 특히 흥미롭다.
실시예 14: 개질된 플랭크 및 갭 영역을 갖는 아카이랄 포스포로디티오에이트를 갖는 갭머의 간에서의 생체내 조직 함량.
화합물 및 실험 - 실시예 13 참조. 조직 함량의 결과 (희생된 동물로부터 간 및 신장 샘플에서의 함량을 측정하기 위해 하이브리드화 기반 ELISA 에 의해 결정됨) 가 도 14A 및 B 에 도시되어 있다. 화합물 #1 에 대하여 실험적 오류가 있음을 유의 - 도 14B 데이터 참조.
결과: 도 14A. 아카이랄 포스포로디티오에이트 연결을 함유한 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드는 기준 화합물과 비교하여 보다 높은 조직 흡수/함량을 가졌다. 도 14B 는 아카이랄 포스포로디티오에이트 연결의 도입이 모든 시험된 화합물의 생체 분포 (간/신장 비에 의해 결정됨) 을 향상시켰음을 보여준다.
실시예 15: 생체내 실험의 대사 산물 분석
화합물 및 실험 － 실시예 13 참조. 대사 산물 분석은 C. Husser et al., Anal. Chem. 2017, 89, 6821 에 개시된 방법을 사용하여 수행하였다.
결과는 도 15A 및 15B 에 도시되어 있다. 포스포로디티오에이트 개질은 생체내 3'-엑소핵산 분해(exonucleolytic degradation)를 효과적으로 방지한다. 일부 엔도뉴클레아제 절단이 남아있다 (시험된 화합물 #1 - 6 모두는 DNA 포스포로티오에이트 갭 영역을 가지므로 이는 예상되었음). 현저한 엑소뉴클레아제 보호가 주어지면, 안티센스 올리고뉴클레오티드 내 아카이랄 포스포로디티오에이트 연결의 사용은 엔도뉴클레아제 절단을 방지 또는 제한할 수 있는 것으로 고려된다. 아카이랄 포스포르디티오에이트의 향상된 뉴클레아제 내성은 눈에 띄는 약리학적 이점, 예컨대 향상된 활성 및 지속되는 작용 기간, 및 가능하게는 독성 분해 산물의 회피를 제공할 것으로 예상된다.
실시예 16: 생체내 - 장기간 간 활성 (ApoB)
시험된 화합물 (서열 모티프 = SEQ ID NO 1):
Figure pct00091
실험: 그러나, 실시예 13 에서와 같이, 희생은 7 일 또는 21 일에 수행되었다.
결과는 도 16 에 도시되어 있다. 포스포로티오에이트 기준 화합물과 비교하여, 아카이랄 포스포로디티오에이트의 도입은 간에서 지속되는 작용 기간을 제공하였고, 이는 21 일에 보다 높은 조직 함량과 상관 관계가 있었다. 특히, 갭 영역에서 입체 정의된 포스포로티오에이트 연결과 포스포로디티오에이트 연결된 플랭크 영역의 조합은 지속되는 효능 및 작용 기간과 관련하여 추가의 이점을 제공하였고, 안티센스 올리고뉴클레오티드에서 입체 정의된 포스포로티오에이트 연결과 아카이랄 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 조합하는 것에 있어서 현저한 시너지를 다시 강조한다.
실시예 17: 아카이랄 포스포로디티오에이트 개질된 갭머를 표적으로 하는 Malat-1 을 사용한 생체내 연구.
시험된 화합물 (서열 모티프 = SEQ ID NO 3)
Figure pct00092
실험:
시험관내: 마우스 LTK 세포를 사용하여 시험관내 농도 용량 반응 곡선을 결정하여 MALAT-1 mRNA 저해를 측정하였다.
생체내: 마우스 (C57/BL6) 에 1, 2 및 3 일에 3 회 용량으로 올리고뉴클레오티드의 15 mg/kg 용량을 피하 투여하였다 (n = 5). 마우스를 8 일에 희생시키고, MALAT-1 RNA 감소 및 조직 함량을 간, 심장, 신장, 비장 및 폐에 대해 측정하였다. 모체 화합물은 2 가지 용량 3*15mg/kg 및 3*30mg/kg 으로 투여되었다.
결과: 시험관내 결과는 도 17 에 도시되어 있다 - 플랭크에 1, 2, 3 및 4 개의 아카이랄 포스포로디티오에이트를 갖는 화합물은 시험관내에서 매우 강력한 것으로 밝혀졌다. 플랭크에 5 개의 아카이랄 포스포로디티오에이트를 갖는 화합물 #7 은 플랭크에 1 - 4 개의 아카이랄 포스포로디티오에이트를 갖는 것들보다 낮은 효능을 갖는 것으로 밝혀졌다. 가장 강력한 화합물 #1, #2 및 #6 이 생체내 연구를 위해 선택되었다. 생체내 결과는 도 17B (심장) 에 도시되어 있으며, 이는 기준 화합물로서 심장에서 MALAT-1 을 노킹 다운(knocking down)시키는데 약 2 배 강력함을 나타낸다. 특히 안티센스 올리고뉴클레오티드의 2 개의 3' 말단 뉴클레오시드 사이의 아카이랄 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결의 사용은 동등한 5' 말단 보호된 올리고뉴클레오티드에 비해 현저한 개선을 제공하였다.
도 17C 는 생체내 연구로부터의 조직 함량 분석의 결과를 도시한다. 아카이랄 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 함유하는 3 개의 올리고뉴클레오티드 모두 간에서 보다 높은 조직 함량을 가졌다. 디티오에이트는 심장 및 간에서 유사하거나 보다 높은 함량, 및 신장에서 보다 낮은 함량을 야기하여 PS-개질된 안티센스 올리고뉴클레오티드에 비해 우수성을 다시 나타낸다. 특히 심장에서 조직 함량은 화합물 1 에 대해서만 높았으며, 이는 향상된 생체내 효능이 조직 함량의 결과가 아니라, 보다 높은 특이적 활성일 수 있음을 나타낸다.
실시예 18: 시험된 아카이랄 모노포스포티오에이트 개질은 아카이랄 포스포로디티오에이트 연결로 관찰되는 이동성(portable) 이점을 제공하지 않는다.
시험된 화합물 (서열 모티프 = SEQ ID NO 1)
Figure pct00093
이 연구에서 본 발명자들은 ApoB 를 표적으로 하는 일련의 3' 또는 5' S 개질된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 갭머를 합성하였다 - 백본 연결에서 황의 위치는 아카이랄 뉴클레오시드간 연결을 야기한다. 합성 방법은 WO2018/019799 참조.
상기 기재된 바와 같이 화합물을 시험관내에서 시험하였다 - 예를 들어 실시예 8 참조.
결과는 도 18A 에 도시되어 있다: 결과는 일반적으로 아카이랄 모노포스포로티오에이트가 화합물의 효능에 대해 불리하였지만, 일부 경우에는 화합물이 효능을 유지하였음을 보여준다. 이는 세포 함량과 관련이 있는 것으로 보인다 (도 18B).
실시예 19: 카이랄 포스포로디티오에이트 개질은 안티센스 올리고뉴클레오티드 갭머에 이점을 제공할 수 있다.
시험된 화합물 (서열 모티프 = SEQ ID NO 1)
Figure pct00094
이 연구에서 본 발명자들은 ApoB 를 표적으로 하는 일련의 입체 랜덤 카이랄 포스포로디티오에이트 올리고뉴클레오티드 갭머를 합성하였다 - 백본 연결에서 황의 위치는 카이랄 뉴클레오시드간 연결을 야기한다.
상기 기재된 바와 같이 화합물을 시험관내에서 시험하였다 - 예를 들어 실시예 8 참조.
결과는 도 19A 에 도시되어 있다: 결과는 일부 위치에서 카이랄 포스포로디티오에이트 화합물이 기준 화합물만큼 강력하여, 카이랄 포스포로디티오에이트가 안티센스 기능과 양립할 수 없음을 나타내지만, 이점은 화합물 특이적이었다 (즉, 이동성을 나타내지 않음). 안티센스 활성과 세포 흡수 사이에는 상관 관계가 없는 것으로 보이지만, 세포 흡수와 관련하여 유사한 그림을 볼 수 있다 (도 19B).
실시예 20: 아카이랄 포스포로디티오에이트 개질된 갭머를 표적으로 하는 Htra-1 을 사용한 생체내 연구.
시험된 화합물
모든 화합물은 서열: TATttacctggtTGTT (SEQ ID NO 4) 를 가지며, 여기서 대문자는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드이고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드이다. 하기 표에서, 백본 모티프는 5' 디뉴클레오티드 사이의 연결에서 시작하여 3' 디뉴클레오티드 사이의 뉴클레오시드간 연결로 끝나는 (왼쪽에서 오른쪽으로) 각각의 뉴클레오시드간 연결에 대한 백본 개질의 패턴을 나타낸다. X = 입체 랜덤 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결, P = 아카이랄 포스포로디티오에이트 (*), S = Sp 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결, R = Rp 입체 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결.
Figure pct00095
Figure pct00096
Figure pct00097
실험:
인간 교모세포종 U251 세포주는 ECACC 에서 구입하였고 5% CO2 로 37℃ 에서 가습 인큐베이터에서 공급자가 권장한 대로 유지하였다. 분석을 위해, 15000 U251 세포/웰을 기아 배지에서 96 다중 웰 플레이트에 시딩하였다 (10% 대신 1% FBS 를 제외하고 공급자가 권장하는 배지). PBS 에 용해된 올리고뉴클레오티드를 첨가하기 전에 세포를 24 시간 동안 배양하였다. 올리고뉴클레오티드의 농도: 5, 1 및 0.2 μM. 올리고뉴클레오티드의 첨가 4 일 후, 세포를 수확하였다. PureLink Pro 96 RNA 정제 키트 (Ambion, 제조사의 지침에 따름) 를 사용하여 RNA 를 추출하였다. 이어서, cDNA 를 M-MLT 역전사 효소, 랜덤 데카머 RETRO스크립트, RNase 저해제 (Ambion, 제조사의 지침에 따름) 와 100mM dNTP 세트 PCR 등급 (Invitrogen) 및 DNase/RNase 유리수 (Gibco) 를 사용하여 합성하였다. 유전자 발현 분석을 위해, qPCR 을 이중 설정에서 TagMan Fast Advanced Master Mix (2X) (Ambion) 를 사용하여 수행하였다. 다음의 TaqMan 프라이머 분석을 qPCR 에 사용하였다: HTRA1, Hs01016151_ m1 (FAM-MGB) 및 하우스 키핑 유전자, TBP, Hs4326322E (VIC-MGB) (Life Technologies). EC50 결정은 Graph Pad Prism6 에서 수행되었다. 표에서 상대적 HTRA1 mRNA 발현 수준은 대조군 (PBS-처리된 세포) 의 % 로 표시된다.
결과:
Figure pct00098
Figure pct00099
실시예 21: TNFRSF1B 엑손 7 스키핑을 표적으로 하는 LNA 믹스머에서의 PS2 보행
믹스머 (13'mer) SSO#26 를 사용하는 TNFRSF1B 엑손 7 의 스키핑이 TNFRSF1B 의 인트론 6 - 엑손 7 의 3' 스플라이스 부위를 표적으로 하는데 매우 효과적임을 앞서 확인하였다 (배경 정보는 WO2008131807 & WO2007058894 참조).
이 실험은 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 연결 (PS2) 의 존재가 스플라이스 스위칭 올리고뉴클레오티드의 스플라이스 조절 활성을 추가로 향상시키는데 유용할 수 있는지를 결정하기 위해 확립되었다. 효과를 결정하기 위해, 모체 올리고뉴클레오티드 SSO#26 의 상이한 위치에 화학식 (IA) 또는 (IB) 의 포스포로디티오에이트 결합을 도입하고 하기 화합물을 합성하였다 (하기 표).
시험된 화합물: 모체 올리고뉴클레오티드 (SSO#26) 의 디티오에이트 개질된 올리고뉴클레오티드. 화학식 ((IA) 또는 (IB)) 의 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 * 로 표시된 위치에 도입되었고, 모든 다른 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 (입체 랜덤) 이고, 대문자는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 나타내고, LNA C 는 5-메틸-시토신이고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드를 나타낸다.
Figure pct00100
실험:
Colo 205 세포 (인간 결장 직장 선암종) 에서 올리고뉴클레오티드 흡수 및 엑손 스키핑은 두 가지 상이한 농도 (5 μM 및 25 μM) 에서 짐노틱 흡수에 의해 분석되었다. 세포를 96 웰 플레이트 (웰 당 25,000 세포) 에 시딩하고 올리고뉴클레오티드를 첨가하였다. 올리고뉴클레오티드의 첨가 3 일 후, Qiagen 설정을 사용하여 96 웰 플레이트로부터 전체 RNA 를 단리하였다. 스플라이스-스위칭의 백분율은 엑손 6-8 접합부 (엑손 7 스키핑) 에 걸쳐 FAM-표지된 프로브와 액적 디지털 PCR (BioRad) 에 의해 분석되었고 TNFRSF1B 의 총량 (야생형 및 스키핑된 엑손 7) 은 엑손 2-3 에 걸쳐 HEX-표지된 프로브 및 IDT 의 프라이머에 의해 분석되었다. 포스포로디티오에이트 연결의 존재는 올리고뉴클레오티드가 엑손 스키핑을 도입하는 능력에 영향을 미친다 (도 20). 5 μM 에서, 가장 강력한 PS2 올리고뉴클레오티드는 엑손 스키핑을 2 배 넘게 증가시키고, 모체 (SSO#26) 는 약 10% 엑손 스키핑을 나타내고, SSO#25 는 20% 초과의 엑손 7 스키핑을 나타낸다. 25 μM 에서, 가장 강력한 올리고뉴클레오티드는 60% 초과의 엑손 스키핑 (SSO#7) 에 도달하고, 마찬가지로 모체보다 2 배 넘게 증가시킨다. 모든 DNA 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 개질 (PS) 대신에 디티오에이트 개질 (PS2) 을 갖는 올리고뉴클레오티드 SSO#22 는 모체와 비교하여 증가된 활성을 나타내고, 세 번째로 가장 강력한 올리고뉴클레오티드는 5 μM 에서 나타내고, 두 번째로 가장 강력한 스플라이스 스위칭 올리고뉴클레오티드는 25 μM 에서 나타낸다 (도 20). 그러나, PS2 연결 (SSO#16) 로 LNA 뉴클레오시드 사이의 모든 연결을 교환하는 것은 모체 올리고뉴클레오티드와 비교하여 스플라이스 스위칭의 효능을 감소시켰다 (도 20). 뿐만 아니라, 특정 위치에 PS2 를 도입하는 것은 엑손 스키핑 활성에 유리하지 않을 수 있고 5 μM 에서, SSO#1, SSO#9, SSO#11, SSO#12 및 SSO#14 는 보다 낮은 농도에서 유의한 스플라이스 스위칭 활성을 나타내지 않지만, 모두 보다 높은 농도에서 효과적이었음은 명백하다 (도 20). 이 실시예는 PS2 연결이 스플라이스 조절 올리고뉴클레오티드와 양립될 수 있고 또한 LNA 믹스머와 같은 믹스머 올리고뉴클레오티드 내에서 DNA 뉴클레오시드에 인접하거나 또는 인접 DNA 뉴클레오시드 사이에 PS2 연결을 도입함에 있어서 명백한 이점을 강조한다 (이러한 디자인은 스플라이싱 조절에서 특히 더 효과적이었음).
재료 및 방법
액적 디지털 PCR 에 의한 TNFRSF1B 엑손 7 스키핑을 검출하기 위한 분석
Figure pct00101
TNFRSF1B 의 총량을 검출하기 위한 분석
엑손 2-3 에 걸친 Hs.PT.58.40638488 IDT 분석
실시예 22: 포스포로디티오에이트 개질을 함유하는 믹스머 올리고의 안정성
모체 올리고뉴클레오티드 (SSO#26) 의 3 가지 디티오에이트 개질된 올리고뉴클레오티드를 S1 뉴클레아제 (표 2) 를 사용한 안정성 분석에 선택하였다. 선택된 올리고뉴클레오티드를 제조사의 지침 (Invitrogen, Catalogue no. 18001-016) 에 따라 1x S1 뉴클레아제 완충액, 및 10U 의 S1 뉴클레아제를 함유하는 100 μL 반응 완충액에서 30 min 또는 2h 동안 25 μM 에서 37℃ 에서 배양하였다. 2 μL 의 500 mM EDTA 용액을 100 μL 반응 혼합물에 첨가하여 S1 뉴클레아제 반응을 중단시켰다. 2.5 μL 의 반응 혼합물을 Novex™ TBE-우레아 2x 샘플 완충액 (LC6876 Invitrogen) 에 희석하고 Novex™ 15% TBE-우레아 겔 (EC6885BOX, Invitrogen) 에 로딩 하였다. 180V 에서 약 1 시간 동안 겔을 작동시킨 후, SYBR 금 염색 (S11494, Invitrogen) 및 ChemiDoc™ Touch Imaging System (BIO-RAD) 으로 겔 이미지를 획득하였다.
PS2 함유 올리고뉴클레오티드의 안정성을 S1 뉴클레아제의 30 및 120 분 배양에 의해 시험하였다. PS2 연결의 위치는 안정성에 영향을 미치며, DNA 뉴클레오티드 (SSO#14) 에 대한 PS2 3' 의 존재가 가장 큰 영향을 미친다 (도 21). S1 뉴클레아제와의 함께 30 분의 배양 후, 모체 올리고뉴클레오티드는 거의 분해되는 반면, PS2 개질된 올리고는 13'mer 을 나타내는 강한 밴드를 나타낸다. 또한, SSO#14 는 S1 뉴클레아제에 의한 초기 절단 후에도, 잔류 올리고의 안정화를 나타내는 분해 산물을 나타내는 보다 강한 밴드를 나타낸다 (도 21, 레인 5+9).
이들 데이터는 믹스머 올리고뉴클레오티드와 같은 올리고뉴클레오티드에 도입될 때 포스포로디티오에이트의 존재가 엔도뉴클레아제 활성에 대한 보호를 제공하고 놀랍게도 이는 본 발명의 실험에 도시된 바와 같이 올리고뉴클레오티드의 효능을 유지하면서 스플라이스 조절 활성을 현저하게 개선한다는 것을 나타낸다. 본원에서 LNA 및 DNA 뉴클레오시드를 포함하는 믹스머에 의해 예시된 믹스머 올리고뉴클레오티드에서 DNA 뉴클레오시드에 인접하거나 DNA 뉴클레오시드 사이의 PS2 연결은 엔도뉴클레아제 안정성을 향상시키는 것으로 간주된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드, 예컨대 믹스머 (예를 들어 SSO 또는 antimiR) 에서의 사용을 위해, 따라서 인접 DNA 뉴클레오시드 사이의 PS2 연결을 사용하는 것이 유리한 것으로 간주된다. 이러한 이점은 또한 LNA 또는 MOE 와 같은 2'당 개질된 뉴클레오시드에 의해 (각각) 5' 또는 3' 플랭킹된 DNA 뉴클레오시드에 인접한 5' 또는 3' PS2 연결을 사용함으로써 제공될 수 있다.
따라서, 본 발명은 스플라이스 조절 또는 마이크로RNA 저해와 같은 점유 기반 메카니즘에 사용하기 위한 개선된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 추가로 제공한다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG Roche Innovation Center Copenhagen A/S <120> Novel thiophosphoramidites <130> P34610-WO-1 <150> PCT/CN2017/118043 <151> 2017-12-22 <150> EP18198487 <151> 2018-10-03 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide motif <400> 1 gcattggtat tca 13 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide motif <400> 2 tctcccagcg tgcgccat 18 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide motif <400> 3 gagttacttg ccaact 16 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> TATTTACCTGGTTGTT <400> 4 tatttacctg gttgtt 16 <210> 5 <211> 13 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide motif <400> 5 caatcagtcc tag 13 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer sequence <400> 6 caactccaga acccagcact 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer sequence <400> 7 cttatcggca ggcaagtgag 20 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> 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ggccgctcct cagagctgcg gccgggagag ttcgtggtcg ccatcggaag 45240 cccgttttcc cttcaaaaca cagtcaccac cgggatcgtg agcaccaccc agcgaggcgg 45300 caaagagctg gggctccgca actcagacat ggactacatc cagaccgacg ccatcatcaa 45360 cgtgagcctc tgtccctctg cgggtgggga ttggggcaga gttttgccag ggggagagga 45420 gtcagcatag gtcttagccc ctgactttgt tgtagtctgc gtgaagggat ggaactagac 45480 caagccatgt ggattctagt gccagcagca tggcaggggt cacatggcgg ggacggtgac 45540 accggagcag gtggacagcc agcctcctcc caggaggaag aagttgtatt gggtgcttta 45600 gggtgattgc agttggcttc tgggcttcag agagaaaatc tccctgttta cggcacctct 45660 aaaactttct gaaaattgtt aaggtcattt ttttccggca aaatattagg ttaatgggaa 45720 tgaatctcag agaagaatcg tgccccccac tctaggcacc gtgctcagga aacgaccagg 45780 cagggacata gattgaacca tgttatgaca cgatttgtaa ccttttcatt tctgtttaat 45840 tgcagtatgg aaactcggga ggcccgttag taaacctggt aaggtctttt aaacctatgt 45900 taggtcattt gtttttatct atgtatacgc tgttttttgt ttgtttgttt gttgtttgtt 45960 tgtttttgag gcagggggtc ttttcaaaca taaggttgcc aaagtgtatt ataaattcct 46020 ttaaaatggc tctgtaaatg tactgcgtgc ttgcaaatga ccctacggat cttttctgga 46080 aagagtaagg caggccggag gtgagggttg gaaatgttat gccagagaac acacttgtgt 46140 ctcagagtta caggtaaaca ccgtgaaatt cagggccaat gcaggagtaa ggtgaaggtc 46200 actaaaaatg ctggccagtc accgaaagca cctcctccaa attaaatctc ctgggctgct 46260 gaaggagctg gctgggctca tacacatttt ctcttggcca ggaatcctcc cttaaggcct 46320 ggctggaatg aggaggagtt acccacccac aaagatatca cttaagtctt cccttaaata 46380 cttgagcaga aaaagtgaag ccttagaaca cagaccagca gagctagagg gcagctctgg 46440 ggccatttat agagggcagc tctggggcca tttatagagg gcagctctgg ggccatttat 46500 aggggctgtc tttagcaagg cccagtgtga tggcacctcc tagatggtgc cttggcatca 46560 ggtactgaca tctcagcact cctgggaagt gtgcacttgg cagctttctc ttcccagcag 46620 aggggcagct gtgctcccag ctctgtcctc tgcctccccg cgcagcactt ggggatggag 46680 tggagatggc tttgctggta atgaagcatg acagccctaa gctctagggt tgtttccccc 46740 tgaagtcagc agagtcatct taagatcatt agacatggga gaagcaggaa ggtgtgggca 46800 gccacctaaa ggagtttgag cctttggaaa cgtattcctt gtgaaacagg agcaaatcat 46860 atcgtgcatt ttgaaactat ctgtgcttac cgtgaggtga gcacccagtg ccgacctgga 46920 gtatgtgcga ttcttccaca gctgcgcgtg gctcgcgctg cctgggtgtc ctgatgcctc 46980 tctccctgct gccacgggga tcccctcctt gcatctcccc acttcgatct ctgaaatagc 47040 tcagggactt ctttcaggca tattctctct gggtgtgtac ctgccggtaa agcttcacga 47100 ttcagtaagc cgtgtccttc ttgcttttca ggacggtgaa gtgattggaa ttaacacttt 47160 gaaagtgaca gctggaatct cctttgcaat cccatctgat aagattaaaa agttcctcac 47220 ggagtcccat gaccgacagg ccaaaggtag gcaaggccca cacagccctg gggactccgg 47280 agatggggcc tgaagctcag ctgccctttg ggacttgggg aagggaaaag cggcagcccc 47340 taggactagc caagccgtct ctgatccaga agtgaacggg aatgcacatt actaaatccc 47400 tcgcagaagg tcacagacat ttcaccattt ttgtcctctg atcatggcaa tgtcacttga 47460 gtcagtctaa tatgtaccag gcatgatcct aggtgacttg tgtacattat ttcactttct 47520 ttatgtatgt cacttaattc ttttgcccta tcagttagga attactagtc ccattttgct 47580 gatgagaaaa cggttcaggg agatcattct gcaaacgttt attgccccat ctgctctaag 47640 tcaagcaggg agcttggcag tggacagctc aactggggcc tggggctcaa caggggcctt 47700 tgccggtgtg acttttatgt tctgttgggg gatgggaagg ctgacagtaa ataatcaaac 47760 acataagata ctattagtgc tcccaagaaa acggatcagg gtggccgtca agggagcgac 47820 tggaggggca gctggtggag atggtgtggc caggaaatgc cttccaagct gaggtctgag 47880 tgaggaggaa ccagcgggca gggatgtggg gggaacactc cagaaggaaa gacagaggac 47940 tcagcatagt tgagtgagca caaggcccct gaagtggcct gagggccgga gcacagtgac 48000 agcatggagt tccccggggt ggaaagaggc caaggccggg cgagcaggct cacagcaggc 48060 cgtggtgagg gacctgggtt gcatcctaac gacatttaag aacagggaag tttatgatct 48120 gattgatgtc actgaaagga cactctgatg gctgcgggga gtctgctgga ggggttgctg 48180 gaagttgggg accggttaag gggctctccc agccatctgg atgagacatg ctggggtctc 48240 agacaagggt ggtggcagtg gaggtgggac agaggggtca cattccagat atatatgggg 48300 ggtagagcaa gcttggggaa gggccagctg tcaggatgag gccatgagga attaagggtc 48360 atgcccaggt acctgaccat taattgaaac aatgggactt tcccaaggtc ccccagaggg 48420 gaggggtcca gaccaggatt tgagccgcaa cctcagtgta cccttctgtg gcccttcctg 48480 caacctgggg gattgggccc ccggcccctg gtgtccccag cacccccacc aactgggctg 48540 accttctgct gtccctttgt tgtctcacca ggaaaagcca tcaccaagaa gaagtatatt 48600 ggtatccgaa tgatgtcact cacgtccagg tgggtaaaca ggatgcgtgt ctgtgtctta 48660 aattttaata aacctgaact tcagaaggtg ctcacgggca cccctgaaag agaaacctta 48720 tgctgcctta agacgtctca gtttctgctt ataatgaagt agcatcggga aagaggacag 48780 gtcattagcc ttggcccctt tgtttggttt taacctgtgt ttttgcattc tgagctggtt 48840 ttcttcactg gcagcaggcc ctccggtgta gaaggttctg ccctcctctt tgaaggcagg 48900 cctgaacagt gtgtgcgtgg tggggctgtt gattcactct ggctcacgtc ttccttaccc 48960 cacattctgt tgaaacccac attccaggag ggccccaagc ccctcccgca gctctaggca 49020 ctctgctttc gttgctctgc agctcgtggg ccgcggctcc aggaatgcca gggcaggtcc 49080 agcgcaggga agtgaatgac tgatgtgctt gttttccccg agctggtgga attgcggcct 49140 gtggttggca ggctcatggc atcctggtgt tctaaactgg atgaaaaatt ctggtgtaat 49200 ctcatgagtc ctggtagtag actcacctgg catggctaaa actgtcagag gtaaagtagg 49260 taaagactag aatatagtaa cagatagatt aatgtgttca ttactatgat gaattaatga 49320 ttcactcact gtgaaagtat taatatattt tgatacatgt tatgaatggt ggtccctttc 49380 ttagcactcc agaagatgga gccatttgtc aaggttaaag tgtcccctca gttgtttgcc 49440 tttggaacta cgaggtgtag ggaaagatgg taagcccttg gtgcccagct tcctgggttc 49500 ctgtccctgc tctgatatgt cctgccttgt gaccttggga acgatatgac ccctgagtgc 49560 ctcagtttcc tcctcttcag gatagggatg acagcgcagg tgcttctgat gtgtggccag 49620 gctcagatca gggagtggtg gcaggggtca ccagccacag tgatgccagc cactatgtat 49680 cacacgtact gggccaggtg ccttactggg atgatctcat ctgatcctca caactcatgt 49740 tgtagggtac tgttattatc cccattttgc aggtgaggaa atgaaggcac agagaagtta 49800 agcaactgtc cgaggtcaca cagctagcaa atggccgagc tagggctgca aaccaggcca 49860 accactgtac tttactgact ccttagtaat agctactatt aattaagaaa taataacaat 49920 gatgatggct gggtgcggtg gctcacatct gtaatcccag cactttggga ggccaaggcg 49980 ggcagatcac ttgaggccag gagttcgaga ccagcctggc caatttgtga aaccctgttt 50040 ctactaaaaa tataaaaaat tagccgggct tggtggcagg cacctgtaat cccagctact 50100 cgggtggctg aggcaggaga attgcttgaa cccgggatat gtaggttgca gtgaactgag 50160 atcgtaccac tgcactccag cctgggcgac agagcaagac tctgtctcaa aaaaaaaaaa 50220 ataaataaaa aaaataaata aataataaag cactttcctt gctgttacca agtaaatctt 50280 tgactctggt agacaggcaa ttttaatttt aaaataggat cagaattcct ggaggaattt 50340 taccttagac ctaaggagaa gacgggaact ggtgagagct gagttttgcg tgaggaaggc 50400 ctggtgtttc ttcacactaa cacgggtgct ttttctctgg agcagcaaag ccaaagagct 50460 gaaggaccgg caccgggact tcccagacgt gatctcagga gcgtatataa ttgaagtaat 50520 tcctgatacc ccagcagaag cgtgagttgg agtcgttttc tcttttccca atattcttgt 50580 tgttcctgtg ggggtagcag gaagagggag cgctgttcct tttctactgg ctcagatgat 50640 tatgttgatc cttgacagac gtggtcggac gttgcttgtc attcctgctg gccaggcctt 50700 ccgacctggc tcggctcggg actcatccat aggagggtgc cttctgtctt caaaagtcct 50760 tgctccacga ggaccctcca gatggacaga gcaatagcag actcgtaatg agtctctgag 50820 atggcccggc tggccagaga gagggtttca ggaacagtgt ccccaagccc tcacttggtg 50880 gtccttttct aggcttcagg acccttctct tcctggagtc ttccagaatg tctctgacaa 50940 ttaggcccat acctgtcaac acctccagaa aaataaccca agtgatatca aagtaacatg 51000 acaagaagta gctcaaccat ccatcagggt ttgttacctg tattggcgga atatccagag 51060 aaaagtgcga gaccagggac cagcaaatgt gccttggggg ctggatctgg cccactgcct 51120 gcttttatat ggagctgtgg gctaagaata gtttttgcat tttattttta tttttactta 51180 ttttttattt tcataggttt ttgggggaac aggtggtatt tggttacatg agtaagttct 51240 ttggtggtga tttgtgaggt tttggtgcac ccatcaccca agcagtgtac actgaaccca 51300 atttgtagtc ttttatccct catccctgtc ccagcctttc cccttgagtc cccagagtcc 51360 attgtatcat tcttatgcct ttgtgtcctc gtagcttagt tcccacttat gagaacattt 51420 aaatggttga aaaaatcctg aaataagaat agtattttgt gacatgttaa atttgtatga 51480 aattcaaatt tcagtgtcca ctgtaatttg gtttatgaca tctatggtgg cttttgtgct 51540 ggaacagcag agttgagtag cttcaacaga gaccatatgt actgcaaagc ctaaaatatt 51600 tcctatggag ccctttacag aaaaagtttg cagacccttg tgctagccca tgaaggacca 51660 tgacagcgtt ttgacgctga gctatataag agctacagtt atagtggcaa ccacacaaag 51720 gaagtgcctc ttaacagaaa cattccgccc acccctatag gaactgcatt ctgagttgca 51780 atacccatta taagcaagtt ggccagatag tggccaacta tctggcagat atctggccaa 51840 ctacgtggca gatagtacct ggtacatcct tccccacttt ggggtcaatc ttgacctttg 51900 atctccttgg ggtcataaag ccacacaagt gttagtaggc atttctacag tggacacaat 51960 ggatgattta gcctaaaaat ctcaaaagga gcccagcatc ctggcacatg catgtaatcc 52020 cagctactca ggaggctgaa gcagaaggat cccttgagcc caggagttcg agactagctt 52080 gggcaacaat tgagacccca tctcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaag agtggggaaa 52140 aaagaacatt attaaaaaaa aaaaccttaa aaagtaatcc aatctaccga tggtttattt 52200 tttattttat tttatttttt ttgagatgga atcccactct gtcacccagg ctggagtgca 52260 gtggcacaat cttggctcac tgcaacctcc acctcctggg ttcaagtgaa tctcttgcct 52320 cagcctctga gtagctggga ttacaggtgc ccaccaccaa acctggctct tttttttttt 52380 ttttttgtaa ttttagtaga gacggggctt caccatgttg gccaggctgg tcttgaactc 52440 ctgacctcag gtgatccacc tgcctcagcc tcccaaagtg ctgggattac aggcatgagc 52500 caccgtgcct gacccactga tggtttgaat tattctaagt tcgccaccgt ccaatcctgt 52560 ttgctctggg cttttaggtt ctaagctgtg cctctgtcca tgtaaagtca gaccaggagg 52620 aatggaaaca cgaaacattg ccattgtgtt tccctttgtg ttgcagtggt ggtctcaagg 52680 aaaacgacgt cataatcagc atcaatggac agtccgtggt ctccgccaat gatgtcagcg 52740 acgtcattaa aagggaaagc accctgaaca tggtggtccg caggggtaat gaagatatca 52800 tgatcacagt gattcccgaa gaaattgacc cataggcaga ggcatgagct ggacttcatg 52860 tttccctcaa agactctccc gtggatgacg gatgaggact ctgggctgct ggaataggac 52920 actcaagact tttgactgcc attttgtttg ttcagtggag actccctggc caacagaatc 52980 cttcttgata gtttgcaggc aaaacaaatg taatgttgca gatccgcagg cagaagctct 53040 gcccttctgt atcctatgta tgcagtgtgc tttttcttgc cagcttgggc cattcttgct 53100 tagacagtca gcatttgtct cctcctttaa ctgagtcatc atcttagtcc aactaatgca 53160 gtcgatacaa tgcgtagata gaagaagccc cacgggagcc aggatgggac tggtcgtgtt 53220 tgtgcttttc tccaagtcag cacccaaagg tcaatgcaca gagaccccgg gtgggtgagc 53280 gctggcttct caaacggccg aagttgcctc ttttaggaat ctctttggaa ttgggagcac 53340 gatgactctg agtttgagct attaaagtac ttcttacaca ttgc 53384 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide sequence motif <400> 11 caaatattta cctggttg 18 <210> 12 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide sequence motif <400> 12 tttacctggt tgttgg 16 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide sequence motif <400> 13 ccaaatattt acctggtt 18 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide sequence motif <400> 14 ccaaatattt acctggttgt 20 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide sequence motif <400> 15 atatttacct ggttgttg 18 <210> 16 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide sequence motif <400> 16 tatttacctg gttgtt 16 <210> 17 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide sequence motif <400> 17 atatttacct ggttgt 16 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide sequence motif <400> 18 atatttacct ggttgtt 17 <210> 19 <211> 11 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide sequence motif <400> 19 tttacctggt t 11

Claims (20)

  1. 화학식 (II) 의 화합물:
    Figure pct00102

    [식 중,
    X 는 산소, 황, -CRaRb-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(=CRaRb)-, -C(Ra)=N-, -Si(Ra)2-, -SO2-, -NRa-; -O-NRa-, -NRa-O-, -C(=J)-, Se, -O-NRa-, -NRa-CRaRb-, -N(Ra)-O- 또는 -O-CRaRb- 이고;
    Y 는 산소, 황, -(CRaRb)n-, -CRaRb-O-CRaRb-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -Si(Ra)2-, -SO2-, -NRa-, -C(=J)-, Se, -O-NRa-, -NRa-CRaRb-, -N(Ra)-O- 또는 -O-CRaRb- 이고;
    단, -X-Y- 는 -O-O-, Si(Ra)2-Si(Ra)2-, -SO2-SO2-, -C(Ra)=C(Rb)-C(Ra)=C(Rb), -C(Ra)=N-C(Ra)=N-, -C(Ra)=N-C(Ra)=C(Rb), -C(Ra)=C(Rb)-C(Ra)=N- 또는 -Se-Se- 가 아니고;
    J 는 산소, 황, =CH2 또는 =N(Ra) 이고;
    Ra 및 Rb 는 수소, 할로겐, 하이드록실, 시아노, 티오하이드록실, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알콕시알킬, 알케닐옥시, 카르복실, 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐, 포르밀, 아릴, 헤테로시클릴, 아미노, 알킬아미노, 카르바모일, 알킬아미노카르보닐, 아미노알킬아미노카르보닐, 알킬아미노알킬아미노카르보닐, 알킬카르보닐아미노, 카르바미도, 알카노일옥시, 설포닐, 알킬설포닐옥시, 니트로, 아지도, 티오하이드록실설파이드알킬설파닐, 아릴옥시카르보닐, 아릴옥시, 아릴카르보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시카르보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카르보닐, -OC(=Xa)Rc, -OC(=Xa)NRcRd 및 -NReC(=Xa)NRcRd 로부터 독립적으로 선택되거나;
    또는 2 개의 제미날(geminal) Ra 및 Rb 는 함께 임의 치환된 메틸렌을 형성하거나;
    또는 2 개의 제미날 Ra 및 Rb 는, 이들이 부착된 탄소 원자와 함께, -X-Y- 의 오직 하나의 탄소 원자와 시클로알킬 또는 할로시클로알킬을 형성하고;
    치환된 알킬, 치환된 알케닐, 치환된 알키닐, 치환된 알콕시 및 치환된 메틸렌은 할로겐, 하이드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알콕시알킬, 알케닐옥시, 카르복실, 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐, 포르밀, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3 개의 치환기로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐 및 메틸렌이고;
    Xa 는 산소, 황 또는 -NRc 이고;
    Rc, Rd 및 Re 는 수소 및 알킬로부터 독립적으로 선택되고;
    n 은 1, 2 또는 3 이고;
    R5 는 하이드록실 보호기이고;
    Rx 는 페닐, 니트로페닐, 페닐알킬, 할로페닐알킬, 시아노알킬, 페닐카르보닐설파닐알킬, 할로페닐카르보닐설파닐알킬 알킬카르보닐설파닐알킬 또는 알킬카르보닐카르보닐설파닐알킬이고;
    Ry 는 디알킬아미노 또는 피롤리디닐이고;
    Nu 는 핵염기 또는 보호된 핵염기임].
  2. 제 1 항에 있어서, -X-Y- 가 -CH2-O-, -CH(CH3)-O- 또는 -CH2CH2-O- 인 화합물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 화학식 (III) 또는 (IV) 의 화합물인 화합물:
    Figure pct00103

    [식 중, R5, Rx, Ry 및 Nu 는 제 1 항에 정의된 바와 같음].
  4. 화학식 (IIb) 의 화합물:
    Figure pct00104

    [식 중, R5 는 하이드록실 보호기이고,
    Rx 는 페닐, 니트로페닐, 페닐알킬, 할로페닐알킬, 시아노알킬, 페닐카르보닐설파닐알킬, 할로페닐카르보닐설파닐알킬 알킬카르보닐설파닐알킬 또는 알킬카르보닐카르보닐설파닐알킬이고;
    Ry 는 디알킬아미노 또는 피롤리디닐이고;
    Nu 는 핵염기 또는 보호된 핵염기임].
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, Rx 가 페닐, 니트로페닐, 페닐메틸, 디클로로페닐메틸, 시아노에틸, 메틸카르보닐설파닐에틸, 에틸카르보닐설파닐에틸, 이소프로필카르보닐설파닐에틸, tert.-부틸카르보닐설파닐에틸, 메틸카르보닐카르보닐설파닐에틸 또는 디플루오로페닐카르보닐설파닐에틸인 화합물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, Rx 가 페닐카르보닐설파닐알킬인 화합물.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, Rx 가 페닐카르보닐설파닐에틸인 화합물.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, Ry 가 디이소프로필아미노 또는 피롤리디닐인 화합물.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, Ry 가 피롤리디닐인 화합물.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (V) 의 화합물인 화합물:
    Figure pct00105

    [식 중, R5 및 Nu 는 제 1 항에 정의된 바와 같음].
  11. 제 4 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (Vb) 의 화합물인 화합물:
    Figure pct00106

    [식 중, R5 및 Nu 는 제 4 항에 정의된 바와 같음].
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, Nu 가 티민, 보호된 티민, 아데노신, 보호된 아데노신, 시토신, 보호된 시토신, 5-메틸시토신, 보호된 5-메틸시토신, 구아닌, 보호된 구아닌, 우라실 또는 보호된 우라실인 화합물.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기로부터 선택되는 화합물:
    Figure pct00107

    Figure pct00108
  14. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기로부터 선택되는 화합물:
    Figure pct00109

    Figure pct00110
  15. 산성 커플링제 및 실릴화제의 존재하의 5'-보호된 LNA 또는 MOE 뉴클레오시드와 포스핀 및 단일-보호된 디티올의 반응을 포함하는, 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 화학식 (II) 또는 (IIb) 의 화합물의 제조 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 산성 커플링제 및 실릴화제의 존재하의 화학식 (C) 또는 (Cb) 의 화합물과 화학식 P(Ry)3 의 화합물 및 화학식 HSRx 의 화합물의 반응을 포함하는, 화합물의 제조 방법:
    Figure pct00111

    [식 중, X, Y, R5, Nu, Rx 및 Ry 는 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같음].
  17. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 산성 커플링제 및 실릴화제의 존재하의 화학식 (C1) 의 화합물과 화학식 P(Ry)3 의 화합물 및 화학식 HSRx 의 화합물의 반응을 포함하는 화합물의 제조 방법:
    Figure pct00112

    [식 중, R5, Nu, Rx 및 Ry 는 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같음].
  18. 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (II) 또는 (IIb) 의 미정제 화합물이 분취용 HPLC 에 의해 정제되는 화합물의 제조 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 화학식 (II) 또는 (IIb) 의 미정제 화합물이 아세토니트릴 대 물 중 암모늄 하이드록사이드의 구배로 용리되는 화합물의 제조 방법.
  20. 올리고뉴클레오티드의 제조에서의 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019168687A1 (en) * 2018-03-02 2019-09-06 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting gys2 expression
TW202028222A (zh) * 2018-11-14 2020-08-01 美商Ionis製藥公司 Foxp3表現之調節劑
JPWO2021256297A1 (ko) * 2020-06-15 2021-12-23
JPWO2022065413A1 (ko) * 2020-09-25 2022-03-31

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5602244A (en) * 1988-05-26 1997-02-11 Competitive Technologies, Inc. Polynucleotide phosphorodithioate compounds
EP0463712A3 (en) 1990-06-27 1992-04-08 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates as therapeutic agents for retroviral infections
EP1331011A3 (en) 1991-10-24 2003-12-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
EP1557424A1 (en) 1997-09-12 2005-07-27 Exiqon A/S Bi-cyclic nucleoside, nucleotide and oligonucleoide analogues
US6020475A (en) * 1998-02-10 2000-02-01 Isis Pharmeuticals, Inc. Process for the synthesis of oligomeric compounds
US6867294B1 (en) * 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
ID30093A (id) 1999-02-12 2001-11-01 Sankyo Co Analog-analog nukleosida dan oligonukleotida baru
ES2283298T3 (es) 1999-05-04 2007-11-01 Santaris Pharma A/S Analogos de l-ribo-lna.
US6617442B1 (en) 1999-09-30 2003-09-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof
US6693187B1 (en) * 2000-10-17 2004-02-17 Lievre Cornu Llc Phosphinoamidite carboxlates and analogs thereof in the synthesis of oligonucleotides having reduced internucleotide charge
DK2284269T3 (en) 2002-11-18 2017-10-23 Roche Innovation Ct Copenhagen As Antisense design
CA2629323A1 (en) 2005-11-10 2007-05-24 The University Of North Carolina At Chapel Hill Splice switching oligomers for tnf superfamily receptors and their use in treatment of disease
AU2007211080B9 (en) 2006-01-27 2012-05-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
KR101407707B1 (ko) 2006-04-03 2014-06-19 산타리스 팔마 에이/에스 Ａｎｔｉ-ｍｉｒｎａ 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 약학적 조성물
AU2007257094B2 (en) 2006-05-05 2012-10-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating expression of SGLT2
US7547684B2 (en) 2006-05-11 2009-06-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5′-modified bicyclic nucleic acid analogs
US7666854B2 (en) 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
DK2092065T4 (da) 2006-10-18 2019-10-21 Ionis Pharmaceuticals Inc Antisense-forbindelser
WO2008113832A2 (en) 2007-03-22 2008-09-25 Santaris Pharma A/S SHORT RNA ANTAGONIST COMPOUNDS FOR THE MODULATION OF TARGET mRNA
KR101738655B1 (ko) 2007-05-01 2017-05-22 로슈 이노베이션 센터 코펜하겐 에이/에스 Ｔｎｆ 슈퍼패밀리 수용체에 대한 스플라이스 스위칭 올리고머 및 질병 치료에 있어서의 그의 용도
CA2688321A1 (en) 2007-05-30 2008-12-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
DK2173760T4 (en) 2007-06-08 2016-02-08 Isis Pharmaceuticals Inc Carbocyclic bicyclic nukleinsyreanaloge
ES2376507T5 (es) 2007-07-05 2015-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos 6-disustituidos
CN101821391B (zh) 2007-10-04 2016-04-27 桑塔里斯制药公司 微小聚体
US8546556B2 (en) 2007-11-21 2013-10-01 Isis Pharmaceuticals, Inc Carbocyclic alpha-L-bicyclic nucleic acid analogs
WO2009090182A1 (en) 2008-01-14 2009-07-23 Santaris Pharma A/S C4'-substituted - dna nucleotide gapmer oligonucleotides
EP2356129B1 (en) 2008-09-24 2013-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted alpha-l-bicyclic nucleosides
WO2011017521A2 (en) 2009-08-06 2011-02-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
WO2011156202A1 (en) 2010-06-08 2011-12-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted 2 '-amino and 2 '-thio-bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
EP3702460A1 (en) 2010-11-12 2020-09-02 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding rnas
EP3067421B1 (en) 2011-02-08 2018-10-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleotides and uses thereof
WO2013022966A1 (en) 2011-08-11 2013-02-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Linkage modified gapped oligomeric compounds and uses thereof
DK2751270T3 (en) 2011-08-29 2018-10-29 Ionis Pharmaceuticals Inc OLIGOMER-CONJUGATE COMPLEXES AND THEIR USE
US9751909B2 (en) 2011-09-07 2017-09-05 Marina Biotech, Inc. Synthesis and uses of nucleic acid compounds with conformationally restricted monomers
WO2013154798A1 (en) 2012-04-09 2013-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Tricyclic nucleic acid analogs
EP2920304B1 (en) 2012-11-15 2019-03-06 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotide conjugates
SG11201508433TA (en) 2013-04-12 2015-11-27 Andaloussi Samir El Therapeutic delivery vesicles
EP2992098B1 (en) 2013-05-01 2019-03-27 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating hbv and ttr expression
SG10201908122XA (en) 2013-06-27 2019-10-30 Roche Innovation Ct Copenhagen As Antisense oligomers and conjugates targeting pcsk9
JP2017505623A (ja) 2014-01-30 2017-02-23 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 生物切断性コンジュゲートを有するポリオリゴマー化合物
EP3020813A1 (en) * 2014-11-16 2016-05-18 Neurovision Pharma GmbH Antisense-oligonucleotides as inhibitors of TGF-R signaling
WO2016079181A1 (en) * 2014-11-19 2016-05-26 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Lna gapmer oligonucleotides comprising chiral phosphorothioate linkages
WO2016127002A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Lna oligonucleotides with alternating flanks
CN107636159B (zh) 2015-02-04 2022-06-14 百时美施贵宝公司 选择治疗性分子的方法
WO2016172598A1 (en) 2015-04-22 2016-10-27 The Broad Institute Inc. Exosomes and uses thereof
EP3394258B1 (en) 2015-10-22 2021-09-22 Roche Innovation Center Copenhagen A/S In vitro toxicity screening assay
WO2017173034A1 (en) 2016-03-30 2017-10-05 The University Of North Carolina At Chapel Hill Biological agent-exosome compositions and uses thereof
US10882884B2 (en) * 2016-05-18 2021-01-05 Eth Zurich Stereoselective synthesis of phosphorothioate oligoribonucleotides
US11105794B2 (en) 2016-06-17 2021-08-31 Hoffmann-La Roche Inc. In vitro nephrotoxicity screening assay
CN109415732B (zh) 2016-07-01 2024-01-02 豪夫迈·罗氏有限公司 用于调节htra1表达的反义寡核苷酸
EP3491002A2 (en) 2016-07-27 2019-06-05 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Synthesis of oligonucleotides comprising achiral 3'-s- or 5'-s-phosphorothiolate internucleoside linkage
JP2019535839A (ja) 2016-11-29 2019-12-12 ピュアテック ヘルス エルエルシー 治療剤の送達のためのエクソソーム
EP3620519A1 (en) 2018-09-04 2020-03-11 F. Hoffmann-La Roche AG Use of isolated milk extracellular vesicles for delivering oligonucleotides orally

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