TW202102676A

TW202102676A - 調節atxn2表現之寡核苷酸

Info

Publication number: TW202102676A
Application number: TW109111432A
Authority: TW
Inventors: 彼得哈吉朵恩; 丹尼斯丘爾漢生; 海蒂萊胡朵布希; 萊可佩得森; 蘇倫Ｖ萊斯繆森; 麥特萊德弗吉德
Original assignee: 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
Priority date: 2019-04-04
Filing date: 2020-04-06
Publication date: 2021-01-16
Also published as: EP3947677A1; JP2022527529A; CN113785060A; WO2020201339A1

Abstract

本發明係關於能夠調節靶細胞中ATXN2表現之反義寡核苷酸。該等寡核苷酸雜交至ATXN2 mRNA。本發明進一步係關於該寡核苷酸之偶聯物及醫藥組合物，及使用該寡核苷酸治療神經退化性疾病之方法，該等神經退化性疾病係諸如：2型脊髓小腦性失調症(SCA2)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease)、額顳葉失智症(frontotemporal dementia (FTD))、帕金森症(parkinsonism)及具有TDP-43蛋白病變之病狀。

Description

調節ATXN2表現之寡核苷酸

本發明係關於與編碼失調症蛋白2 (ATXN2)之核酸互補且靶向其以減小ATXN2表現之寡核苷酸(寡聚物)。減小ATXN2表現有益於多種醫學病症，例如神經退化性疾病，包含2型脊髓小腦性失調症(SCA2)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默氏症、額顳葉失智症(frontotemporal dementia (FTD))、帕金森症(parkinsonism)及具有TDP-43蛋白病變之病狀。

失調症蛋白2 (ATXN2)之擴增之麩醯胺酸重複(源自ATXN2基因中之31個或更多個CAG重複)會引起2型脊髓小腦性失調症(SCA2)，該疾病係一種罕見神經退化性病症。另外，擴增之CAG重複係肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)之基因風險因子，此乃因其與TAR DNA結合蛋白43 (TDP-43)發生RNA依賴性相互作用。其他與TDP-43蛋白病變相關之神經退化性疾病係(例如)阿茲海默氏症、額顳葉失智症(FTD)及帕金森症。最近，TDP-43轉基因小鼠(TDP-43^T/Tg ，其係ALS相關小鼠模型)與Atxn2 陰性小鼠雜交，此會顯著增加TDP-43^T/Tg Atxn2^-/ 小鼠之壽命且改良其運動功能(Becker等人，2017 Nature 544:367-371)。在同一文章中展示，使用靶向ATXN2之反義寡核苷酸治療之TDP-43^T/Tg 小鼠具有延長之存活期及改良之運動功能。

靶向ATXN2之反義寡核苷酸亦闡述於US 2017/175113、WO 2015/143246及WO 2017/117496中，其中WO 2017/117496特定地係關於ALS治療。Scoles等人，2017 Nature 544:362評估了反義寡核苷酸減少小腦中之ATXN2之能力且展示其局部化至浦肯野細胞(purkinje cell)，從而指示用於SCA2之潛在療法。

本發明目標本發明提供在活體內及在活體外皆調節ATXN2之反義寡核苷酸。本發明鑑別存在於人類ATXN2 mRNA前體之內含子9中之特異性靶序列，該靶序列可由反義寡核苷酸靶向以有效抑制ATXN2。特定而言，靶向SEQ ID NO: 1之位置83118-83146有利於減小ATXN2。

本發明亦提供能夠抑制ATXN2之有效反義寡核苷酸序列及化合物及其在治療諸如神經退化性疾病等疾病或病症中之用途，該等神經退化性疾病包含2型脊髓小腦性失調症(SCA2)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默氏症、額顳葉失智症(FTD)、帕金森症及具有TDP-43蛋白病變之病狀。

本發明係關於靶向智人失調症蛋白2 (ATXN2)轉錄物且能夠抑制ATXN2表現之反義寡核苷酸。

本發明提供下式之反義寡核苷酸： TCAcAttttactttaacCTC (SEQ ID NO 15_4) 其中大寫字母係β-D-氧基LNA核苷，小寫字母係DNA核苷，所有LNA C皆係5-甲基胞嘧啶，所有核苷間鍵聯皆係硫代磷酸酯核苷間鍵聯。

本發明提供下式之寡核苷酸：

或其醫藥上可接受之鹽。

在一些實施例中，反義寡核苷酸係呈醫藥上可接受之鹽之形式。

在一些實施例中，反義寡核苷酸係呈醫藥上可接受之鈉鹽之形式。

在一些實施例中，反義寡核苷酸係呈醫藥上可接受之鉀鹽之形式。

本發明提供包括本發明之反義寡核苷酸及至少一個共價附接至該寡核苷酸偶聯物部分之偶聯物。換言之，在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸係呈偶聯寡核苷酸形式。在一些實施例中，寡核苷酸並不偶聯。

本發明提供包括本發明之反義寡核苷酸或偶聯物及醫藥上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑之醫藥組合物。

在一些實施例中，組合物包括醫藥上可接受之稀釋劑，例如無菌磷酸鹽緩衝鹽水。

在一些實施例中，反義寡核苷酸以50 - 300µM溶液之濃度調配於醫藥上可接受之稀釋劑中。稀釋劑可為磷酸鹽緩衝鹽水。

在一些實施例中，反義寡核苷酸以1 - 100mg/mL (例如2 - 30或2 - 50 mg/mL或例如4 - 30mg/ml)之濃度調配於醫藥上可接受之稀釋劑中。稀釋劑可為磷酸鹽緩衝鹽水。

本發明提供在表現ATXN2之靶細胞中調節ATXN2表現之方法，該方法包括向該細胞投與有效量之本發明之反義寡核苷酸或偶聯物或醫藥組合物。在一些實施例中，該方法係活體外方法。在一些實施例中，該方法係活體內方法。在一些實施例中，細胞係神經元細胞，例如小腦細胞(例如浦肯野細胞)或皮質細胞。

本發明提供用於醫學中之本發明之寡核苷酸、偶聯物或醫藥組合物。

本發明提供用於治療選自由神經退化性疾病組成之群之疾病之本發明之寡核苷酸、偶聯物或醫藥組合物，該神經退化性疾病選自由以下組成之群：2型脊髓小腦性失調症(SCA2)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默氏症、額顳葉失智症(FTD)、帕金森症及具有TDP-43蛋白病變之病狀。

本發明提供本發明之寡核苷酸、偶聯物或醫藥組合物之用途，其用以製備用於治療或預防神經退化性疾病之藥劑，該神經退化性疾病係(例如)選自由以下組成之群之疾病：2型脊髓小腦性失調症(SCA2)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默氏症、額顳葉失智症(FTD)、帕金森症及具有TDP-43之病狀。

本發明提供治療或預防疾病之方法，其包括向患有或易感該疾病之個體投與治療或防治有效量之本發明之反義寡核苷酸、偶聯物或醫藥組合物，其中該疾病係選自由神經退化性疾病組成之群，該神經退化性疾病選自由以下組成之群：2型脊髓小腦性失調症(SCA2)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默氏症、額顳葉失智症(FTD)、帕金森症及具有TDP-43蛋白病變之病狀。

在一些實施例中，疾病係2型脊髓小腦性失調症(SCA2)。

在一些實施例中，疾病係肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)。

在另一態樣中，本發明提供包括本發明寡核苷酸及醫藥上可接受之稀釋劑、載劑、鹽及/或佐劑之醫藥組合物。

在另一態樣中，本發明提供在表現ATXN2之靶細胞中調節ATXN2表現之活體內或活體外方法，其係藉由向該細胞投與有效量之本發明之寡核苷酸或組合物來達成。

在另一態樣中，本發明提供治療或預防與ATXN2活體內活性有關之疾病、病症或功能障礙之方法，其包括向患有或易感該疾病、病症或功能障礙之個體投與治療或防治有效量之本發明寡核苷酸。

在另一態樣中，本發明之寡核苷酸或組合物係用於治療或預防神經退化性疾病，例如選自由以下組成之群之神經退化性疾病：2型脊髓小腦性失調症(SCA2)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默氏症、額顳葉失智症(FTD)、帕金森症及具有TDP-43蛋白病變之病狀。

在另一態樣中，本發明之寡核苷酸或組合物係用於治療或預防2型脊髓小腦性失調症(SCA2)或肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)。

定義寡核苷酸本文所用之術語「寡核苷酸」定義為包括兩個或更多個共價連接之核苷之分子，如由熟習此項技術者通常所理解。該等共價結合之核苷亦可稱為核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常實驗室中藉由固相化學合成及隨後之純化及分離來製得。在提及寡核苷酸之序列時，提及共價連接之核苷酸或核苷之核鹼基部分或其修飾之序列或順序。本發明寡核苷酸係人工製得，且係以化學方式合成，並通常進行純化或分離。本發明寡核苷酸可包括一或多個經修飾核苷或核苷酸(例如2’糖修飾性核苷)。

反義寡核苷酸本文所用之術語「反義寡核苷酸」定義為能夠藉由雜交至靶核酸、尤其靶核酸上之鄰接序列來調節靶基因表現之寡核苷酸。反義寡核苷酸在本質上並非雙鏈且由此並非siRNA或shRNA。

鄰接核苷酸序列術語「鄰接核苷酸序列」係指寡核苷酸中與靶核酸互補之區域。該術語可在本文中與術語「鄰接核鹼基序列」及術語「寡核苷酸基序序列」互換使用。在一些實施例中，寡核苷酸之所有核苷酸構成鄰接核苷酸序列。在一些實施例中，寡核苷酸包括鄰接核苷酸序列(例如F-G-F’間隙聚體區)且可視情況包括其他核苷酸(例如可用於將官能基附接至鄰接核苷酸序列之核苷酸連接體區)。核苷酸連接體區可或可不與靶核酸互補。

核苷酸核苷酸係寡核苷酸及多核苷酸之組成單元，且出於本發明目的其包含天然及非天然核苷酸。在性質上，核苷酸(例如DNA及RNA核苷酸)包括核糖糖部分體、核鹼基部分及一或多個磷酸基(其不存在於核苷中)。核苷及核苷酸亦可互換地稱為「單元」或「單體」。

經修飾核苷本文所用之術語「經修飾核苷」或「核苷修飾」係指與等效DNA或RNA核苷相比藉由引入一或多個糖部分體或(核)鹼基部分之修飾而加以修飾之核苷。在一較佳實施例中，經修飾核苷包括經修飾糖部分體。術語經修飾核苷亦可在本文中與術語「核苷類似物」或經修飾「單元」或經修飾「單體」互換使用。具有未修飾DNA或RNA糖部分體之核苷在本文中稱為DNA或RNA核苷。若容許沃森-克裡克鹼基配對(Watson Crick base pairing)，則在DNA或RNA核苷之鹼基區中具有修飾之核苷通常仍稱為DNA或RNA。

有利的是，寡核苷酸之鄰接核苷酸序列之所有核苷間鍵聯皆係硫代磷酸酯，或寡核苷酸之所有核苷間鍵聯皆係硫代磷酸酯鍵聯。

硫代磷酸酯鍵聯可以不同互變異構體形式存在，例如如下文所圖解說明：

核鹼基術語核鹼基包含存在於核苷及核苷酸中之在核酸雜交中形成氫鍵之嘌呤(例如腺嘌呤及鳥嘌呤)及嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶及胞嘧啶)部分。在本發明背景中，術語核鹼基亦涵蓋經修飾核鹼基，該等經修飾核鹼基可不同於天然核鹼基，但在核酸雜交期間具有功能性。在此背景中，「核鹼基」係指天然核鹼基(例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黃嘌呤及次黃嘌呤)以及非天然變體。該等變體(例如)闡述於Hirao等人(2012) Accounts of Chemical Research第45卷第2055頁及Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry增刊37 1.4.1中。

在一些實施例中，藉由將嘌呤或嘧啶變成經修飾嘌呤或嘧啶(例如經取代嘌呤或經取代嘧啶)來修飾核鹼基部分，例如選自異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑基-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、2’硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二胺基嘌呤、6-胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤及2-氯-6-胺基嘌呤之核鹼基。

核鹼基部分可藉由用於每一相應核鹼基之字母代碼(例如A、T、G、C或U)來指示，其中每一字母可視情況包含具有等效功能之經修飾核鹼基。舉例而言，在所例示寡核苷酸中，核鹼基部分係選自A、T、G、C及5-甲基胞嘧啶。視情況，對於LNA間隙聚體而言，可使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。

經修飾寡核苷酸術語經修飾寡核苷酸闡述包括一或多種糖修飾性核苷及/或經修飾核苷間鍵聯之寡核苷酸。術語「嵌合」寡核苷酸係在文獻中用於闡述具有經修飾核苷之寡核苷酸之術語。

互補性 術語「互補性」闡述核苷/核苷之沃森-克裡克鹼基配對之能力。沃森-克裡克鹼基對係鳥嘌呤(G)-胞嘧啶(C)及腺嘌呤(A) -胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。應理解，寡核苷酸可包括具有經修飾核鹼基之核苷，舉例而言，通常使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶，且由此術語互補性涵蓋未修飾核鹼基與經修飾核鹼基之間之沃森-克裡克鹼基配對(例如參見Hirao等人(2012) Accounts of Chemical Research第45卷第2055頁及Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry增刊37 1.4.1)。

本文所用之術語「互補%」係指核酸分子(例如寡核苷酸)中與參考序列(例如靶序列或序列基序)互補之鄰接核苷酸序列之核苷酸比例(以百分比表示)，該核酸分子橫跨該鄰接核苷酸序列。因此，藉由以下方式來計算互補性百分比：計數在兩個序列之間互補(來自沃森-克裡克鹼基對)之所比對核鹼基之數量(在與靶序列5’-3’及3’-5’之寡核苷酸序列比對時)，使該數量除以寡核苷酸中之核苷酸總數量且乘以100。在此一對比中，並不對準(形成鹼基對)之核鹼基/核苷酸可視為失配。在計算鄰接核苷酸序列之互補性%時，不容許插入及缺失。應理解，在測定互補性時，忽略核鹼基之化學修飾，只要核鹼基形成沃森-克裡克鹼基對之功能能力得以保留即可(舉例而言，出於計算一致性%之目的，5’-甲基胞嘧啶可視為與胞嘧啶相同)。

術語「完全互補」係指100%互補性。

下文係與靶序列完全互補之寡核苷酸實例。

下文係與靶序列(SEQ ID NO: 6)完全互補之寡核苷酸(SEQ ID NO: 15)之實例。 5’ ttaaggaggttaaagtaaaatgtgaattt 3’ (SEQ ID NO:6) 3’ ctccaatttcattttacact 5’ (SEQ ID NO: 15)

一致性 本文所用之術語「一致性」係指核酸分子(例如寡核苷酸)中與參考序列(例如序列基序)一致之鄰接核苷酸序列之核苷酸比例(以百分比表示)，該核酸分子橫跨該鄰接核苷酸序列。因此，藉由以下方式來計算一致性百分比：計數兩個序列(在本發明化合物之鄰接核苷酸序列中及在參考序列中)之間一致(匹配)之所比對核鹼基之數量，使該數量除以寡核苷酸中之核苷酸總數並乘以100。因此，一致性百分比= (匹配× 100)/比對區域長度(例如鄰接核苷酸序列)。在計算鄰接核苷酸序列之一致性百分比時，不容許插入及缺失。應理解，在測定一致性時，忽略核鹼基之化學修飾，只要核鹼基形成沃森-克裡克鹼基對之功能能力得以保留即可(舉例而言，出於計算一致性%之目的，5-甲基胞嘧啶可視為與胞嘧啶相同)。

雜交本文所用之術語「雜交(hybridizing或hybridizes)」應理解為兩條核酸鏈(例如寡核苷酸與靶核酸)在相對鏈上之鹼基對之間形成氫鍵，由此形成雙鏈體。兩條核酸鏈之間之結合親和力係雜交強度。其通常係針對熔融溫度(T_m )來進行闡述，熔融溫度定義為一半寡核苷酸與靶核酸形成雙鏈體之溫度。在生理學條件下，T_m 並不與親和力嚴格成正比(Mergny及Lacroix, 2003,Oligonucleotides 13:515-537)。標準態吉布斯自由能(Gibbs free energy) ΔG°係結合親和力之更準確代表且與反應之解離常數(K_d )以ΔG° =-RTln(K_d )形式相關，其中R係氣體常數且T係絕對溫度。因此，寡核苷酸與靶核酸之間之反應之極低ΔG°反映了寡核苷酸與靶核酸之間的強烈雜交。ΔG°係與其中水性濃度為1M、pH為7且溫度為37℃之反應有關之能量。寡核苷酸至靶核酸之雜交係自發反應且自發反應之ΔG°小於零。可以實驗方式藉由(例如)使用等溫滴定量熱(ITC)方法來量測ΔG°，如Hansen等人，1965,Chem. Comm. 36-38及Holdgate等人，2005,Drug Discov Today 中所闡述。熟習此項技術者應知曉，可利用商業設備來量測ΔG°。亦可在數值上藉由使用最近鄰居模型(如由SantaLucia, 1998,Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460–1465所闡述)使用適當導出之熱動力學參數(由Sugimoto等人，1995,Biochemistry 34:11211–11216及McTigue等人，2004,Biochemistry 43:5388–5405所闡述)來估計ΔG°。為可藉由雜交來調節其預期核酸靶，本發明寡核苷酸以低於-10 kcal之估計ΔG°值(對於長10-30個核苷酸之寡核苷酸)雜交至靶核酸。在一些實施例中，藉由標準態吉布斯自由能ΔG°來量測雜交之程度或強度。對於長8-30個核苷酸之寡核苷酸而言，寡核苷酸可以低於-10 kcal範圍(例如低於-15 kcal、例如低於-20 kcal及例如低於-25 kcal)之估計ΔG°值雜交至靶核酸。在一些實施例中，寡核苷酸以(-10 kcal至-60 kcal、例如-12 kcal至-40 kcal、例如-15 kcal至-30 kcal或-16 kcal至-27 kcal、例如-18 kcal至-25 kcal)之估計ΔG°值雜交至靶核酸。

靶核酸 根據本發明，靶核酸係編碼哺乳動物ATXN2之核酸且可為(例如)基因、RNA、mRNA及mRNA前體、成熟mRNA或cDNA序列。靶可由此稱為ATXN2靶核酸。表1.人類ATXN2外顯子及內含子

人類ATXN2 RNA前體(SEQ ID NO 1)中之外顯子區域	人類ATXN2 RNA前體(SEQ ID NO 1)中之內含子區域
ID	起點	終點	ID	起點	終點
e1	1	893	i1	894	43757
e2	43758	43794	i2	43795	45459
e3	45460	45519	i3	45520	46699
e4	46700	46771	i4	46772	47246
e5	47247	47397	i5	47398	74360
e6	74361	74485	i6	74486	78703
e7	78704	78795	i7	78796	79600
e8	79601	79798	i8	79799	81249
e9	81250	81428	i9	81429	83313
e10	83314	83523	i10	83524	86137
e11	86138	86320	i11	86321	89094
e12	89095	89292	i12	89293	89678
e13	89679	89786	i13	89787	90057
e14	90058	90128	i14	90129	110896
e15	110897	111201	i15	111202	112852
e16	112853	112916	i16	112917	113811
e17	113812	113964	i17	113965	114345
e18	114346	114406	i18	114407	128934
e19	128935	129119	i19	129120	129436
e20	129437	129569	i20	129570	134961
e21	134962	135015	i21	135016	142317
e22	142318	142463	i22	142464	143420
e23	143421	143648	i23	143649	145831
e24	145832	146000	i24	146001	146836
e25	146837	147463

適宜地，靶核酸編碼提供用於人類、猴、大鼠及豬ATXN2之mRNA及mRNA前體序列之ATXN2蛋白，尤其係哺乳動物ATXN2，例如人類ATXN2 (例如參見表2及3)。

在一些實施例中，靶核酸係選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 1、2、3、4及5或其天然變體(例如編碼哺乳動物失調症蛋白2之序列)。

若在研究或診斷中採用本發明寡核苷酸，則靶核酸可為cDNA或衍生自DNA或RNA之合成核酸。

對於活體內或活體外應用而言，本發明寡核苷酸通常能夠抑制表現ATXN2靶核酸之細胞中之ATXN2靶核酸表現。本發明寡核苷酸之核鹼基之鄰接序列通常與ATXN2靶核酸互補，如橫跨寡核苷酸之長度所量測，視情況一或兩個失配除外，且視情況排除可將寡核苷酸連接至可選官能基(例如偶聯物)或其他非互補性末端核苷酸之基於核苷酸之連接體區(例如區域D’或D’’)。在一些實施例中，靶核酸可為RNA或DNA，例如信使RNA，例如成熟mRNA或mRNA前體。

在一些實施例中，靶核酸係編碼哺乳動物失調症蛋白2 (例如人類ATXN2)之RNA或DNA，例如人類ATXN2 mRNA序列，例如揭示為SEQ ID NO 1者。關於實例性靶核酸之其他資訊提供於表2及3中。表2.各物種中之ATXN2之基因體及組合體資訊。

物種	Chr.	鏈	基因體坐標起點終點	組合體	mRNA 之NCBI 參考序列* 登錄號
人類	12	Rv	111452214	111599676	GRCh38	NM_002973.3
食蟹猴	11	Rv	115099975	115257793	Macaca_fascicularis_5.0	XM_005572266.2
小鼠	5	Fwd	121711609	121814950	GRCm38	NM_009125.2
大鼠	12	Rv	40264601	40335637	Rnor_6.0	XM_008760500.2
豬	14	Rv	32656537	32772082	Sscrofa11.1	XM_021072908.1

Fwd =正向鏈。基因體坐標提供mRNA前體序列(基因體序列)。NCBI參考提供mRNA序列(cDNA序列)。

*國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)參考序列資料庫係參考序列(包含基因體、轉錄物及蛋白質)之綜合性、整合、非冗餘、充分注釋性集合。其寄存於www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq處。表3.各物種中之ATXN2之序列細節。

物種	RNA 類型	長度 (nt)	SEQ ID NO
人類	mRNA前體	147463	1
食蟹猴	mRNA前體	155409	2
小鼠	mRNA前體	103342	3
大鼠	mRNA前體	69817	4
豬	mRNA前體	115546	5

靶序列 本文所用之術語「靶序列」係指存在於靶核酸中之包括與本發明寡核苷酸互補之核鹼基序列的核苷酸序列。在一些實施例中，靶序列由靶核酸上具有與本發明寡核苷酸之鄰接核苷酸序列互補之核鹼基序列之區域組成。此靶核酸區域可互換地稱為靶核苷酸序列、靶序列或靶區域。在一些實施例中，靶序列長於單一寡核苷酸之互補序列，且可(例如)代表靶核酸中可由若干本發明寡核苷酸靶向之較佳區域。

在一些實施例中，靶序列係選自人類ATXN2 mRNA內含子9 (參見上文表1)之序列。

在本發明之一實施例中，靶序列係SEQ ID NO: 6。

本發明寡核苷酸包括與靶核酸(例如本文所闡述之靶序列)互補或雜交之鄰接核苷酸序列。

與寡核苷酸互補或雜交之靶序列通常包括具有至少10個核苷酸之鄰接核鹼基序列。鄰接核苷酸序列具有介於10至50個核苷酸，例如12至30、例如14至20、例如15至18個鄰接核苷酸。

靶細胞 本文所用之術語「靶細胞」係指表現靶核酸之細胞。在一些實施例中，靶細胞可為活體內或活體外靶細胞。在一些實施例中，靶細胞係哺乳動物細胞，例如齧齒類動物細胞(例如小鼠細胞或大鼠細胞)或靈長類動物細胞(例如猴細胞或人類細胞)。

在一些實施例中，靶細胞可為浦肯野神經元，例如浦肯野細胞。其他相關靶細胞係運動神經元，例如上運動神經元及下運動神經元。

對於活體外評價而言，靶細胞可為確立細胞系，例如A431或U2-OS細胞。或者，衍生自人類經誘導多潛能幹細胞(iPCS)之運動神經元(例如參見Sances等人，2016 Nat Neurosci. 19(4): 542-553)或iPCS源浦肯野細胞(Wang等人，2015 Scientific Reports 5:9232)可用於活體外篩選。

在較佳實施例中，靶細胞表現ATXN2 mRNA，例如ATXN2 mRNA前體或ATXN2成熟mRNA。ATXN2 mRNA之聚A尾部通常忽略反義寡核苷酸靶向。

天然變體 術語「天然變體」係指ATXN2基因或轉錄物之如下變體：其與靶核酸源自相同基因座，但可(例如)因產生多種編碼相同胺基酸之密碼子之基因代碼之簡並性或因mRNA前體之替代剪接或存在多型性(例如單一核苷酸多型性(SNP))而有所不同，且係指等位基因變體。基於寡核苷酸之充分互補序列之存在，本發明寡核苷酸可由此靶向靶核酸及其天然變體。

在一些實施例中，天然變體與哺乳動物ATXN2靶核酸(例如選自由SEQ ID NO: 1、2、3、4及5組成之群之靶核酸)具有至少95% (例如至少98%或至少99%)之同源性。在一些實施例中，天然變體與SEQ ID NO: 1之人類ATXN2靶核酸具有至少99%之同源性。

表現之調節 本文所用之術語「表現之調節」欲理解為關於寡核苷酸改變ATXN2量(與投與寡核苷酸之前之ATXN2量相比)之能力之概括性術語。或者，可藉由參照對照實驗來測定表現之調節。通常應理解，對照組係使用生理鹽水組合物治療或處理之個體或靶細胞或使用非靶向性寡核苷酸(模擬)治療或處理之個體或靶細胞。

一種調節作用係寡核苷酸(例如)藉由降解mRNA或阻斷轉錄，來抑制、下調、降低、阻抑、去除、停止、阻斷、預防、減弱、減小、避免或終止ATXN2表現的能力。本發明之反義寡核苷酸能夠有利地抑制哺乳動物ATXN2 (例如人類ATXN2)之表現。

高親和力修飾性核苷 高親和力修飾性核苷係在納入寡核苷酸中時會增強寡核苷酸對其互補靶之親和力(例如如藉由熔融溫度(T^m )所量測)之經修飾核苷酸。本發明之高親和力修飾性核苷較佳地使得每一經修飾核苷之熔融溫度增加+0.5℃至+12℃、更佳地+1.5℃至10℃及最佳地+3℃至+8℃。諸多高親和力修飾性核苷為業內所已知且包含(例如)許多2’取代核苷以及鎖核酸(LNA) (例如參見Freier & Altmann；Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及Uhlmann；Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213)。

糖修飾 本發明寡聚物可包括一或多個具有經修飾糖部分體(亦即與DNA及RNA中所發現之核糖糖部分體相比之糖部分體修飾)之核苷。

已製備諸多具有核糖糖部分體修飾之核苷，其目的主要在於改良寡核苷酸之某些性質(例如親和力及/或核酸酶抗性)。

該等修飾包括彼等其中核糖環結構被(例如)使用以下結構置換來修飾者：己糖環(HNA)；或通常在核糖環上之C2碳與C4碳之間具有雙基橋之雙環(LNA)；或通常在C2碳與C3碳之間缺乏鍵之未連接核糖環(例如UNA)。其他糖修飾性核苷包含(例如)雙環己糖核酸(WO2011/017521)或三環核酸(WO2013/154798)。經修飾核苷亦包括其中糖部分體被非糖部分體置換之核苷，例如在肽核酸(PNA)或嗎啉基核酸之情形下。

糖修飾亦包含經由將核糖環上之取代基改變成除氫外之基團或改變DNA及RNA核苷中天然發現之2’-OH基團而進行之修飾。可(例如)在2’、3’、4’或5’位置處引入取代基。

2’ 糖修飾性核苷 2’糖修飾性核苷係在2’位具有除H或–OH外之取代基(2’取代核苷)或包括能夠在核糖環之2’碳與第二碳之間形成橋之2’連接雙基(例如LNA (2’ – 4’ 雙基橋接)核苷)之核苷。

實際上，高度關注研發2’糖取代性核苷，且已發現諸多2’取代核苷在納入寡核苷酸中時具有有益性質。舉例而言，2’修飾糖可向寡核苷酸提供增強之結合親和力及/或增加之核酸酶抗性。2’取代修飾性核苷之實例係2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2’-胺基-DNA、2’-氟-RNA及2’-F-ANA核苷。關於其他實例，請參見(例如) Freier & Altmann；Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及Uhlmann；Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213以及Deleavey及Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937。下文闡釋一些2’取代修飾性核苷。

就本發明而言，2’取代糖修飾性核苷不包含2’橋接核苷(如LNA)。

鎖核酸核苷 (LNA 核苷 ) 「LNA核苷」係2’-修飾核苷，其包括連接該核苷之核糖糖環之C2’及C4’之雙基(亦稱為「2’- 4’橋」)，此限制或鎖定了核糖環之構形。該等核苷在文獻中亦稱為橋接核酸或雙環核酸(BNA)。在將LNA納入寡核苷酸中時，核糖之構形鎖定與針對互補RNA或DNA分子之增強之雜交親和力(雙鏈體穩定化)有關。此通常可藉由量測寡核苷酸/補體雙鏈體之熔融溫度來測定。

非限制性、實例性LNA核苷揭示於以下文獻中：WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO 2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO 2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、 WO 2009/067647、WO 2008/150729、Morita等人，Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76、Seth等人，J. Org. Chem. 2010，第75卷(5) pp. 1569-81及Mitsuoka等人，Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238以及Wan及Seth, J. Medical Chemistry 2016, 59, 9645-9667。

其他非限制性、實例性LNA核苷揭示於示意圖1中。

示意圖 1 ：

特定LNA核苷係β-D-氧基-LNA、6’-甲基-β-D-氧基LNA(例如(S)-6’-甲基-β-D-氧基-LNA (ScET))及ENA。

尤其有利之LNA係β-D-氧基-LNA。

本文所闡述之化合物可含有若干不對稱中心且可以下列形式存在：光學純對映異構體、對映異構體混合物(例如外消旋物)、非對映異構體之混合物、非對映異構體外消旋物或非對映異構體外消旋物之混合物。

術語「不對稱碳原子」意指具有4個不同取代基之碳原子。根據Cahn-Ingold-Prelog慣例，不對稱碳原子可具有「R」或「S」構形。

醫藥上可接受之鹽 術語「醫藥上可接受之鹽」係指彼等保留游離鹼或游離酸之生物有效性及性質但未在生物學上或其他方面不合意之鹽。

保護基團 術語「保護基團」 (單獨或組合)表示選擇性阻斷多官能化合物中之反應性位點以便可在另一未保護反應性位點處選擇性實施化學反應之基團。可去除保護基團。實例性保護基團係胺基-保護基團、羧基-保護基團或羥基-保護基團。

核酸酶調介之降解核酸酶調介之降解係指，寡核苷酸能夠在與互補核苷酸序列形成雙鏈體時調介此一序列之降解。

在一些實施例中，寡核苷酸可經由靶核酸之核酸酶調介之降解來發揮作用，其中本發明寡核苷酸能夠募集核酸酶、尤其內核酸酶、較佳地內核糖核酸酶(RNase) (例如RNase H)。經由核酸酶調介機制作用之寡核苷酸設計之實例係通常包括至少5或6個連續DNA核苷之區域且在一側或兩側側接有親和力增強性核苷(例如間隙聚體、頭聚體及尾聚體)的寡核苷酸。

RNase H 活性及募集 反義寡核苷酸之RNase H活性係指其在呈與互補RNA分子之雙鏈體形式時募集RNase H之能力。WO01/23613提供測定RNaseH活性之活體外方法，該等方法可用於測定募集RNaseH之能力。通常，寡核苷酸在以下情況下可視為能夠募集RNase H：在與互補靶核酸序列一起提供時，其初始速率(如以pmol/l/min形式所量測)為在使用與所測試經修飾寡核苷酸具有相同鹼基序列但僅含有DNA單體且在寡核苷酸中之所有單體間具有硫代磷酸酯鍵聯之寡核苷酸且使用由WO01/23613 (以引用方式併入本文中)中實例91 - 95提供之方法時所測定初始速率的至少5% (例如至少10%或大於20%)。為用於測定RHase H活性，可自Lubio Science GmbH, Lucerne，瑞士獲得重組人類RNase H1。

間隙聚體 本發明之反義寡核苷酸或其鄰接核苷酸序列可為間隙聚體，亦稱為間隙聚體寡核苷酸或間隙聚體設計。通常使用反義間隙聚體經由RNase H調介之降解來抑制靶核酸。間隙聚體寡核苷酸包括至少三個不同結構區域：5’-側翼、間隙及3’-側翼(F-G-F’，以「5 -＞ 3」定向)。「間隙」區(G)包括使得寡核苷酸能夠募集RNase H之鄰接DNA核苷酸之片段。間隙區側接有5’側接區(F) (包括一或多個糖修飾性核苷、有利地高親和力糖修飾性核苷)及3’側接區(F’) (包括一或多個糖修飾性核苷、有利地高親和力糖修飾性核苷)。區域F及F’中之一或多個糖修飾性核苷增強了寡核苷酸對靶核酸之親和力(亦即係增強親和力之糖修飾性核苷)。在一些實施例中，區域F及F’中之一或多個糖修飾性核苷係2’糖修飾性核苷，例如高親和力2’糖修飾，例如獨立地選自LNA及2’-MOE。

在間隙聚體設計中，間隙區之最5’及3’核苷係DNA核苷，且分別經定位毗鄰5’ (F)或3’ (F’)區域之糖修飾性核苷。側翼可進一步定義為在距間隙區之最遠端處(亦即在5’側翼之5’端處及在3’側翼之3’端處)具有至少一個糖修飾性核苷。

區域F-G-F’形成鄰接核苷酸序列。本發明之反義寡核苷酸或其鄰接核苷酸序列可包括式F-G-F’之間隙聚體區。

間隙聚體設計F-G-F’之總長度可為(例如) 12至32個核苷，例如13至24個核苷、例如14至22個核苷、例如14至17個核苷、例如16至18個核苷。

舉例而言，本發明之間隙聚體寡核苷酸可由下式代表： F_1-8 -G_6-16 -F’_1-8 ，例如 F_1-8 -G_8-16 -F’_2-8 條件係間隙聚體區F-G-F’之總長度為至少12個核苷酸，例如長至少14個核苷酸。

在本發明之一態樣中，反義寡核苷酸或其鄰接核苷酸序列由式5’-F-G-F’-3’之間隙聚體組成或包括該間隙聚體，其中區域F及F’獨立地包括1- 8 (例如2-6，例如3-4)個2’糖修飾性核苷或由其組成，其中至少一個2’糖修飾性核苷定位於區域F之3’端處(毗鄰區域G之DNA核苷)，且至少一個2’糖修飾性核苷定位於區域F’之5’端處(經定位毗鄰區域G之DNA核苷)，且G係具有6至16個能夠募集RNaseH之核苷之區域，例如6 - 16個DNA核苷(例如10 - 15個鄰接DNA核苷、例如10 - 14個鄰接DNA核苷酸、例如11 - 15個鄰接DNA核苷酸、例如13 - 15個鄰接DNA核苷酸)之區域。

LNA 間隙聚體 LNA間隙聚體係其中區域F及F’中之一或兩者包括LNA核苷或由其組成之間隙聚體。β-D-氧基間隙聚體係其中F及F’中之一或兩者區域包括β-D-氧基LNA核苷或由其組成之間隙聚體。

在一些實施例中，LNA間隙聚體具有式：[LNA]_{1- 5} -[區域G] -[LNA]_1-5 ，其中區域G係如間隙聚體區G定義中所定義。

交替側翼間隙聚體側翼區可包括LNA及DNA核苷二者且稱為「交替側翼」，此乃因其包括LNA-DNA-LNA核苷之交替基序。包括該等交替側翼之間隙聚體稱為「交替側翼間隙聚體」。「交替側翼間隙聚體」由此係LNA間隙聚體寡核苷酸，其中至少一個側翼(F或F’)除LNA核苷外亦包括DNA。在一些實施例中，區域F或F’中之至少一者或區域F及F’二者包括LNA核苷及DNA核苷二者。在該等實施例中，側接區F或F’或F及F’二者包括至少三個核苷，其中F及/或F’區域之最5’及3’核苷係LNA核苷。

交替側翼區可包括最多3個鄰接DNA核苷，例如1至2或1或2或3個鄰接DNA核苷。

寡核苷酸中之區域D’或D’’ 本文所揭示之寡核苷酸可包括與靶核酸互補之寡核苷酸之鄰接核苷酸序列(例如間隙聚體F-G-F’)及其他5’及/或3’核苷或由其組成。其他5’及/或3’核苷可或可不與靶核酸完全互補。該等其他5’及/或3’核苷可在本文中稱為區域D’及D’’。

增加區域D’或D’’可用於接合鄰接核苷酸序列(例如間隙聚體)與偶聯物部分或另一官能基之目的。在用於接合鄰接核苷酸序列與偶聯物部分時，其可用作生物可裂解連接體。或者，其可用於提供外核酸酶保護或便於合成或製造。

區域D’及D’’可分別附接至區域F之5’端或區域F’之3’端以生成具有下列各式之設計：D’-F-G-F’、F-G-F’-D’’或D’-F-G-F’-D’’。在此情況下，F-G-F’係寡核苷酸之間隙聚體部分且區域D’或D’’構成寡核苷酸之單獨部分。

區域D’或D’’可獨立地包括1、2、3、4或5個可與靶核酸互補或不互補之額外核苷酸或由其組成。毗鄰F或F’區域之核苷酸並非糖修飾性核苷酸，例如DNA或RNA或該等物質之鹼基修飾形式。D’或D’區域可用作核酸酶易感性生物可裂解連接體(參見連接體之定義)。在一些實施例中，額外5’及/或3’端核苷酸與磷酸二酯鍵聯連接，且係DNA或RNA。適於用作區域D’或D’’之基於核苷酸之生物可裂解連接體揭示於WO2014/076195中，包含(例如)磷酸二酯連接之DNA二核苷酸。生物可裂解連接體在多-寡核苷酸構築體中之應用揭示於WO2015/113922中，其中其用於連接單一寡核苷酸內之多個反義構築體(例如間隙聚體區)。

在一實施例中，除構成間隙聚體之鄰接核苷酸序列外，本發明寡核苷酸亦包括區域D’及/或D’’。

寡核苷酸間隙聚體可由下列各式代表： F-G-F’、尤其F_1-8 -G_6-16 -F’_2-8 D’-F-G-F’、尤其D’_1-3 -F_1-8 -G_6-16 -F’_2-8 F-G-F’-D’’、尤其F_1-8 -G_6-16 -F’_2-8 -D’’_1-3 D’-F-G-F’-D’’、尤其D’_1-3 - F_1-8 -G_6-16 -F’_2-8 -D’’_1-3 在一些實施例中，定位於區域D’與區域F之間之核苷間鍵聯係磷酸二酯鍵聯。在一些實施例中，定位於區域F’與區域D’’之間之核苷間鍵聯係磷酸二酯鍵聯。

偶聯物 本文所用之術語偶聯物係指以共價方式連接至非核苷酸部分(偶聯物部分或區域C或第三區域)之寡核苷酸。

本發明寡核苷酸與一或多個非核苷酸部分之偶聯可(例如)藉由影響寡核苷酸之活性、細胞分佈、細胞攝取或穩定性來改良寡核苷酸之藥理學。在一些實施例中，偶聯物部分藉由改良寡核苷酸之細胞分佈、生物可用性、代謝、排泄、滲透性及/或細胞攝取來改質或增強寡核苷酸之藥物動力學性質。特定而言，偶聯物可使寡核苷酸靶向特定器官、組織或細胞類型且由此增強寡核苷酸在該器官、組織或細胞類型中之有效性。同時，偶聯物可用於減小寡核苷酸在非靶細胞類型、組織或器官中之活性，例如脫靶活性或非靶細胞類型、組織或器官中之活性。

在一實施例中，非核苷酸部分(偶聯物部分)係選自由以下組成之群：碳水化合物、細胞表面受體配體、藥物物質、激素、親脂性物質、聚合物、蛋白質、肽、毒素(例如細菌毒素)、維他命、病毒蛋白(例如衣殼)或其組合。

在一些實施例中，偶聯物係對轉鐵蛋白受體具有特異性親和力之抗體或抗體片段，例如如WO 2012/143379 (以引用方式併入本文中)中所揭示。在一些實施例中，非核苷酸部分係抗體或抗體片段，例如有利於遞送穿過血腦障壁之抗體或抗體片段，尤其係靶向轉鐵蛋白受體之抗體或抗體片段。

連接體 鍵聯或連接體係兩個原子之間經由一或多個共價鍵連接一個所關注化學基團或區段與另一所關注化學基團或區段之連結。偶聯物部分可直接或經由連接部分(例如連接體或結合體)附接至寡核苷酸。連接體用於以共價方式將第三區域(例如偶聯物部分，區域C)連結至與靶核酸互補之第一區域(例如寡核苷酸或鄰接核苷酸序列，區域A)。

在本發明之一些實施例中，本發明之偶聯物或寡核苷酸偶聯物可視情況包括連接體區(第二區域或區域B及/或區域Y)，該區域定位於與靶核酸互補之寡核苷酸或鄰接核苷酸序列(區域A或第一區域)與偶聯物部分(區域C或第三區域)之間。

區域B係指包括生理上不穩定鍵或由其組成之生物可裂解連接體，該生理上不穩定鍵可在哺乳動物體內通常所遇到或類似於哺乳動物體內所遇到之條件下裂解。生理上不穩定連接體發生化學轉變(例如裂解)之條件包含化學條件，例如pH、溫度、氧化或還原條件或試劑及在哺乳動物細胞中所發現鹽濃度或類似於在哺乳動物細胞中所遇到鹽濃度之鹽濃度。哺乳動物細胞內條件亦包含在哺乳動物細胞中通常存在之酶促活性(例如來自蛋白水解酶或水解酶或核酸酶)。在一實施例中，生物可裂解連接體易於發生S1核酸酶裂解。在一較佳實施例中，核酸酶易感連接體包括1至10個包括至少兩個連續磷酸二酯鍵聯(例如至少3或4或5個連續磷酸二酯鍵聯)之核苷(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷、更佳地2至6個核苷及最佳地2至4個經連接核苷)。較佳地，核苷係DNA或RNA。含有磷酸二酯之生物可裂解連接體更詳細地闡述於WO 2014/076195 (以引用方式併入本文中)中-亦參見本文之區域D’或D’’。

區域Y係指未必生物可裂解但主要用於以共價方式連結偶聯物部分(區域C或第三區域)與寡核苷酸(區域A或第一區域)之連接體。區域Y連接體可包括諸如乙二醇、胺基酸單元或胺基烷基等重複單元之鏈結構或寡聚物。本發明之寡核苷酸偶聯物可由下列區域要素構成：A-C、A-B-C、A-B-Y-C、A-Y-B-C或A-Y-C。在一些實施例中，連接體(區域Y)係胺基烷基，例如C2 － C36胺基烷基，包含(例如) C6至C12胺基烷基。在一較佳實施例中，連接體(區域Y)係C6胺基烷基。

治療本文所用之術語「治療」係指治療現有疾病(例如如本文所提及之疾病或病症)或預防疾病(亦即防治)。因此應認識到，如本文所提及之治療可在一些實施例中為防治性。

在一些實施例中，對已經診斷患有神經學病症之患者實施治療，神經學病症係(例如)選自由包含以下之神經退化性疾病組成之群： 2型脊髓小腦性失調症(SCA2)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默氏症、額顳葉失智症(FTD)、帕金森症及具有TDP-43蛋白病變之病狀。

在一些實施例中，本發明化合物係用於治療2型脊髓小腦性失調症(SCA2)或肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)。

本發明寡核苷酸 本發明提供下式之反義寡核苷酸： TCAcAttttactttaacCTC (SEQ ID NO 15_4) 其中大寫字母係β-D-氧基LNA核苷，小寫字母係DNA核苷，所有LNA C皆係5-甲基胞嘧啶，所有核苷間鍵聯皆係硫代磷酸酯核苷間鍵聯。

本發明提供包括本發明之寡核苷酸或反義寡核苷酸及至少一個共價附接至該寡核苷酸之偶聯物部分之偶聯物。在一些實施例中，偶聯物部分係有利於遞送穿過血腦障壁之偶聯物，例如靶向轉鐵蛋白受體之抗體或抗體片段。

製造方法在另一態樣中，本發明提供製造本發明寡核苷酸之方法，其包括使核苷酸單元進行反應且由此形成包括於寡核苷酸中之以共價方式連接之鄰接核苷酸單元。較佳地，該方法使用亞磷醯胺化學(例如參見Caruthers等人，1987, Methods in Enzymology第154卷，第287-313頁)。在另一實施例中，該方法進一步包括使鄰接核苷酸序列與偶聯物部分(配體)進行反應以使偶聯物部分共價附接至寡核苷酸。在另一態樣中，提供製造本發明組合物之方法，其包括混合本發明之寡核苷酸或偶聯寡核苷酸與醫藥上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑。

醫藥鹽 在另一態樣中，本發明提供反義寡核苷酸或其偶聯物之醫藥上可接受之鹽。在一較佳實施例中，醫藥上可接受之鹽係鈉鹽或鉀鹽。

醫藥組合物在另一態樣中，本發明提供醫藥組合物，其包括上文所提及寡核苷酸及/或寡核苷酸偶聯物或其鹽中之任一者及醫藥上可接受之稀釋劑、載劑、鹽及/或佐劑。醫藥上可接受之稀釋劑包含磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)且醫藥上可接受之鹽包含(但不限於)鈉鹽及鉀鹽。在一些實施例中，醫藥上可接受之稀釋劑係無菌磷酸鹽緩衝鹽水。在一些實施例中，寡核苷酸以50 - 300µM溶液之濃度使用於醫藥上可接受之稀釋劑中。

用於本發明中之適宜調配物參見Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa.，第17版，1985。關於藥物遞送方法之簡單綜述，參見(例如) Langer (Science 249:1527-1533, 1990)。WO 2007/031091提供醫藥上可接受之稀釋劑、載劑及佐劑之其他適宜及較佳實例(以引用方式併入本文中)。適宜劑量、調配物、投與途徑、組合物、劑型、與其他治療劑之組合、前藥調配物亦提供於WO2007/031091中。

可混合本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物與醫藥上可接受之活性或惰性物質以用於製備醫藥組合物或調配物。組合物及調配醫藥組合物之方法取決於諸多準則，包含(但不限於)投與途徑、疾病程度或擬投與劑量。

該等組合物可藉由習用滅菌技術滅菌，或可經無菌過濾。可將所得水溶液包裝以供按原樣使用或將其凍乾，將凍乾製劑在投與之前與無菌水性載劑組合。製劑之pH通常介於3與11之間，更佳地介於5與9之間或介於6與8之間，且最佳地介於7與8之間(例如7至7.5)。可將呈固體形式之所得組合物包裝成多個單一劑量單元，每一單元含有固定量之上文所提及之一或多種藥劑，例如呈錠劑或膠囊之密封包裝形式。亦可將呈固體形式之組合物包裝成用於撓性量之容器，例如呈設計用於局部施加之乳霜或軟膏之可擠壓管形式。

在一些實施例中，本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物係前藥。特定而言，對於寡核苷酸偶聯物而言，一旦將前藥遞送至作用位點(例如靶細胞)，偶聯物部分立即與寡核苷酸分離。

應用本發明寡核苷酸可用作用於(例如)診斷、治療及防治之研究試劑。

在研究中，可使用該等寡核苷酸來特異性調節失調症蛋白2在細胞(例如活體外細胞培養物)及實驗動物中之合成，由此促進靶之功能分析或其作為用於治療干預之靶之有用性的評價。通常，藉由降解或抑制產生蛋白質之mRNA (由此防止形成蛋白質)或藉由降解或抑制產生蛋白質之基因或mRNA之調節劑來達成靶調節。

本發明提供在表現ATXN2之靶細胞中調節ATXN2表現之活體內或活體外方法，該方法包括向該細胞投與有效量之本發明寡核苷酸。

在一些實施例中，靶細胞係哺乳動物細胞、尤其人類細胞。靶細胞可為活體外細胞培養物或哺乳動物中之組織之活體內細胞形成部分。在較佳實施例中，靶細胞存在於腦或中樞神經系統(包含腦幹及脊髓)中。特定而言，小腦中之細胞係相關靶細胞，例如浦肯野神經元或浦肯野細胞，尤其在受2型脊髓小腦性失調症(SCA2)影響之個體中。

其他相關靶細胞係位於腦皮質及脊髓中之運動神經元。運動皮質中之上運動神經元以及腦幹及脊髓中之下運動神經元係本發明靶細胞。特定而言，受肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)影響之個體中之運動神經元係相關靶細胞。

在診斷中，可使用寡核苷酸藉由北方印漬(northern blotting)、原位雜交或類似技術來檢測及量化細胞及組織中之ATXN2表現。

在治療中，可將寡核苷酸投與動物或人類，該動物或人類懷疑患有疾病或病症且可藉由調節ATXN2表現來予以治療。

本發明提供治療或預防疾病之方法，其包括向患有或易感該疾病之個體投與治療或防治有效量之本發明之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物。

本發明亦係關於如本文所定義之寡核苷酸、組合物或偶聯物，其用作藥劑。

本發明之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物通常係以有效量投與。

本發明亦提供如所闡述本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物之用途，其用於製造用於治療如本文中提及之病症之藥劑，或用於治療如本文中提及之病症之方法。

如本文所提及之疾病或病症與ATXN2表現有關。在一些實施例中，疾病或病症可與ATXN2基因中之突變(例如經擴增CAG重複區)有關。疾病或病症可與蛋白質產物與ATXN2締合或相互作用之基因有關。特定而言，在與TDP-43蛋白病變有關之疾病中，減少ATXN2可具有有益效應，例如在肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默氏症、額顳葉失智症(FTD)及帕金森症中。

本發明方法較佳地用於治療或防治由ATXN2之異常含量及/或活性引起之疾病。

本發明進一步係關於如本文所定義之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物之用途，其用以製造用於治療ATXN2之異常含量及/或活性之藥劑。

在一實施例中，本發明係關於用於治療選自神經退化性疾病之疾病或病症之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物，該等神經退化性疾病包含2型脊髓小腦性失調症(SCA2)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默氏症、額顳葉失智症(FTD)、帕金森症及具有TDP-43蛋白病變之病狀。特定而言，可有利地使用本發明之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物來治療2型脊髓小腦性失調症(SCA2)或肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)。

投與本發明之寡核苷酸或醫藥組合物可經由非經腸投與(例如靜脈內、皮下、肌內、大腦內、腦室內、眼內或鞘內投與)。

在一些實施例中，經由鞘內投與進行投與。

有利的是，舉例而言，為治療神經學病症，經鞘內或經顱內投與(例如經由大腦內或腦室內投與)本發明之寡核苷酸或醫藥組合物。

本發明亦提供寡核苷酸或其偶聯物(例如本發明之醫藥鹽或組合物)用於製造藥劑之用途，其中該藥劑呈用於皮下投與之劑型。

本發明亦提供本發明寡核苷酸或其偶聯物(例如本發明之醫藥鹽或組合物)用於製造藥劑之用途，其中該藥劑呈用於鞘內投與之劑型。

本發明亦提供如本發明所闡述之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物用於製造藥劑之用途，其中該藥劑呈用於鞘內投與之劑型。

組合療法在一些實施例中，將本發明之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物與另一治療劑用於組合治療。治療劑可為(例如)用於上述疾病或病症之標準護理。

實例 材料及方法 寡核苷酸基序序列及寡核苷酸化合物 表4：寡核苷酸基序序列(由SEQ ID NO指示)、該等序列之設計以及基於基序序列設計之特定寡核苷酸化合物(由CMP ID NO指示)之列表。

SEQ ID NO	基序序列	SEQ ID NO: 1 上之位置	設計	CMP ID NO	寡核苷酸化合物
起點	終點
7	attttactttaacctcc	83122	83138	4-10-3	7_1	ATTTtactttaaccTCC
8	cattttactttaacctcc	83122	83139	4-12-2	8_1	CATTttactttaacctCC
9	cattttactttaacctcct	83121	83139	2-15-2	9_1	CAttttactttaacctcCT
10	acattttactttaacctcc	83122	83140	3-14-2	10_1	ACAttttactttaacctCC
11	cacattttactttaacctc	83123	83141	3-13-3	11_1	CACattttactttaacCTC
12	cacattttactttaacct	83124	83141	3-12-3	12_1	CACattttactttaaCCT
13	tcacattttactttaacct	83124	83142	4-13-2	13_1	TCACattttactttaacCT
14	tcacattttactttaacc	83125	83142	4-10-4	14_1	TCACattttactttAACC
15	tcacattttactttaacctc	83123	83142	4-14-2	15_1	TCACattttactttaaccTC
16	ttcacattttactttaacct	83124	83143	4-14-2	16_1	TTCAcattttactttaacCT
17	ttcacattttactttaac	83126	83143	4-10-4	17_1	TTCAcattttacttTAAC
18	ttcacattttactttaacc	83125	83143	4-12-3	18_1	TTCAcattttactttaACC
19	attcacattttactttaac	83126	83144	4-11-4	19_1	ATTCacattttacttTAAC
20	attttactttaacctcc	83122	83138	3-11-3	20_1	ATTttactttaaccTCC
21	cattttactttaacctcc	83122	83139	2-14-2	21_1	CAttttactttaacctCC
22	cacattttactttaacctc	83123	83141	2-14-3	22_1	CAcattttactttaacCTC
23	cacattttactttaacct	83124	83141	4-12-2	23_1	CACAttttactttaacCT
24	tcacattttactttaacct	83124	83142	3-14-2	24_1	TCAcattttactttaacCT
25	tcacattttactttaacc	83125	83142	3-12-3	25_1	TCAcattttactttaACC
26	tcacattttactttaacctc	83123	83142	2-16-2	26_1	TCacattttactttaaccTC
27	ttcacattttactttaacct	83124	83143	3-15-2	27_1	TTCacattttactttaacCT
28	ttcacattttactttaacc	83125	83143	3-13-3	28_1	TTCacattttactttaACC
29	attcacattttactttaacc	83125	83144	3-15-2	29_1	ATTcacattttactttaaCC
30	attttactttaacctcc	83122	83138	2-12-3	30_1	ATtttactttaaccTCC
31	acattttactttaacctcc	83122	83140	2-15-2	31_1	ACattttactttaacctCC
32	cacattttactttaacctc	83123	83141	3-14-2	32_1	CACattttactttaaccTC
33	tcacattttactttaacc	83125	83142	2-12-4	33_1	TCacattttactttAACC
34	ttcacattttactttaacc	83125	83143	3-14-2	34_1	TTCacattttactttaaCC
35	attcacattttactttaacc	83125	83144	2-15-3	35_1	ATtcacattttactttaACC

基序序列代表存在於寡核苷酸中之核鹼基之鄰接序列。

設計係指間隙聚體設計F-G-F’，其中每一數值代表連續經修飾核苷(例如2’修飾核苷)之數量(第一數值=5’側翼)，隨後係DNA核苷數量(第二數值=間隙區)，隨後係經修飾核苷(例如2’修飾核苷)之數量(第三數值=3’側翼)，視情況前接或後接有DNA及LNA之其他重複區域，該等重複區域未必係與靶核酸互補之鄰接核苷酸序列之一部分。

寡核苷酸化合物代表基序序列之特定設計。大寫字母代表β-D-氧基LNA核苷，小寫字母代表DNA核苷，所有LNA C皆係5-甲基胞嘧啶，且5-甲基DNA胞嘧啶由「e」表示，所有核苷間鍵聯皆係硫代磷酸酯核苷間鍵聯。

寡核苷酸合成 業內通常已知寡核苷酸合成。下文係可應用之方案。可藉由針對所使用裝置、載體及濃度略微改變之方法來產生本發明寡核苷酸。

在尿苷通用載體上，使用亞磷醯胺方式，在Oligomaker 48上，以1 μmol規模來合成寡核苷酸。在合成結束時，使用氨水溶液在60℃下歷經5-16小時，自固體載體裂解寡核苷酸。藉由反相HPLC (RP-HPLC)或藉由固相萃取法，純化寡核苷酸且藉由UPLC分析特徵，且藉由ESI-MS進一步證實分子質量。

寡核苷酸之延長 ：藉由使用經5’-O-DMT保護之亞醯胺化物於乙腈之0.1 M溶液及於乙腈中之DCI (4,5-二氰基咪唑) (0.25 M)作為活化劑，偶合β-氰基乙基-亞磷醯胺(DNA-A(Bz)、DNA- G(ibu)、DNA- C(Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C(Bz)、 LNA-A(Bz)、LNA- G(dmf)或LNA-T)。最後一個循環時，可使用具有所需修飾之亞磷醯胺，例如用於附接偶聯物基團之C6連接體或偶聯物基團本身。藉由使用氫化黃原素(0.01 M於9:1乙腈/吡啶中)來進行硫醇化，以引入硫代磷酸酯鍵聯。可使用於7:2:1 THF/吡啶/水中之0.02 M碘，以引入磷酸二酯鍵聯。其餘試劑係通常用於合成寡核苷酸者。

固相合成後之偶聯法，可將市售C6胺基連接體亞磷醯胺用於固相合成之最後循環中，且在脫除保護及自固體載體上裂解之後，單離胺基連接之脫除保護之寡核苷酸。經由使用標準合成方法活化官能基來引入偶聯物。

藉由 RP-HPLC 之純化 ：藉由製備型RP-HPLC，在Phenomenex Jupiter C18 10µ 150×10 mm管柱上純化粗製化合物。使用0.1 M pH 8乙酸銨及乙腈作為緩衝劑且流速為5 mL/min。凍乾所收集部分以得到通常呈白色固體形式之純化化合物。

縮寫： DCI： 4,5-二氰基咪唑 DCM：二氯甲烷 DMF：二甲基甲醯胺 DMT： 4,4’-二甲氧基三苯甲基 THF：四氫呋喃 Bz：苯甲醯基 Ibu：異丁醯基 RP-HPLC：反相高效液相層析

T_m 分析：將寡核苷酸及RNA靶(磷酸酯連接，PO)雙鏈體在500 ml無RNase水中稀釋至3 mM且與500 ml 2×T_m 緩衝液(200mM NaCl、0.2mM EDTA、20mM磷酸鈉(pH 7.0))混合。將溶液加熱至95℃並保持3 min，且然後將其在室溫下退火30 min。在配備有帕耳帖溫度程控器(Peltier temperature programmer) PTP6之λ 40 UV/VIS分光光度計上使用PE Templab軟體(Perkin Elmer)量測雙鏈體熔融溫度(T_m )。將溫度自20℃斜升至95℃且然後斜降至25℃，且在260 nm下記錄吸收。使用熔融及退火之第一導數及局部最大值來評價雙鏈體T_m 。

細胞系 表5 實例1及2中所使用之細胞系之相關細節

細胞系	細胞 / 孔 (96 孔板 )	處理前之細胞培育小時數	處理天數
名稱	供應商	目錄編號	細胞培養基
A431	ECACC	85090402	EMEM (目錄編號：M2279)、10% FBS (目錄編號：F7524)、2mM麩醯胺酸(目錄編號：G8541)、0.1 mM NEAA (目錄編號：M7145)、25µg/ml慶大黴素(Gentamicin) (目錄編號：G1397)	8000	24	3
NCI-H23	ATCC	CRL-5800	RPMI 1640 (目錄編號：R2405)、10% FBS (目錄編號：F7524)、10mM Hepes (目錄編號：H0887)、1mM丙酮酸鈉 (目錄編號：S8636)、25µg/ml慶大黴素(目錄編號：G1397)	10000	24	3
ARPE19	ATCC	CRL-2302	DMEM/F-12 HAM (目錄編號：D8437)、10% FBS (目錄編號：F7524)、25µg/ml慶大黴素(目錄編號：G1397)	2000	0	4
U251	ECACC	9063001	EMEM (目錄編號：M2279)、10% FBS (目錄編號：F7524)、2mM麩醯胺酸(目錄編號：G8541)、0.1 mM NEAA (目錄編號：M7145)、1mM丙酮酸鈉(目錄編號：S8636)、25µg/ml慶大黴素(目錄編號：G1397)	2000	0	4
U2-OS	ATCC	HTB-96	MCCoy 5A培養基(目錄編號：M8403)、10% FBS (目錄編號：F7524)、1.5mM麩醯胺酸(目錄編號：G8541)、25µg/ml慶大黴素(目錄編號：G1397)	7000	24	3

*所有培養基及添加劑皆購自Sigma Aldrich

實例 1 測試 25µM 及 5µM LNA 寡核苷酸在 A431 、 NCI-H23 及 ARPE19 細胞系中之活體外效能 在三種人類細胞系中使用表4中靶向SEQ ID NO: 1之位置83121至83144區域之LNA寡核苷酸進行寡核苷酸篩選。自表5中所列示之供應商購買人類細胞系A341、NCI-H23及ARPE19，根據供應商所推薦在37℃及5% CO2下維持於加濕培育器中。在篩選分析中，將細胞接種於96多孔板中之由供應商所推薦之培養基中(參見材料及方法部分中之表5)。每一細胞系之細胞數/孔已最佳化(參見材料及方法部分中之表5)。

將細胞培育0至24小時，然後添加5 µM或25 µM濃度之寡核苷酸(溶於PBS中)。在添加寡核苷酸之後3-4天，收穫細胞(每一細胞系之培育時間指示於材料及方法部分中之表5中)。

使用Qiagen RNeasy 96套組(74182)根據製造商說明書來提取RNA。使用qScript XLT一步法RT-qPCR ToughMix Low ROX，95134-100 (Quanta Biosciences)實施cDNA合成及qPCR。使用來自Thermo Fisher Scientific之經FAM標記之TaqMan分析在多重反應中利用經VIC標記之GUSB對照來量化靶轉錄物含量。TaqMan引子分析所關注靶轉錄物ATXN2 (Hs01002833_m1(FAM-MGB))及管家基因GUSB (4326320E VIC-MGB探針)。使用技術性雙鏈體設置，n=1個生物複製品。

相對ATXN2 mRNA表現含量以對照(經PBS處理之細胞) %形式展示於表6中，亦即，該值愈低，則抑制愈大。表 6 ：抗ATXN2化合物之活體外效能(使用雙鏈體qPCR之單一實驗)。將ATXN2 mRNA含量正規化至GUSB且展示為對照(經PBS處理之細胞) %。

CMP ID NO	化合物	ARPE19 殘餘 mRNA 含量，對照之 %	NCI-H23 殘餘 mRNA 含量，對照之 %	A431 殘餘 mRNA 含量，對照之 %
25 µM	5 µM	25 µM	5 µM	25 µM	5 µM
7_1	ATTTtactttaaccTCC	20	38	7	14	2	3
8_1	CATTttactttaacctCC	43	56	14	32	2	4
9_1	CAttttactttaacctcCT	93	102	77	99	66	70
10_1	ACAttttactttaacctCC	68	84	36	57	10	21
11_1	CACattttactttaacCTC	22	48	8	21	1	2
12_1	CACattttactttaaCCT	42	62	14	29	2	3
13_1	TCACattttactttaacCT	26	44	8	17	3	3
14_1	TCACattttactttAACC	14	37	4	6	3	10
15_1	TCACattttactttaaccTC	14	31	5	11	2	7
16_1	TTCAcattttactttaacCT	34	48	12	22	2	10
17_1	TTCAcattttacttTAAC	29	51	9	17	3	8
18_1	TTCAcattttactttaACC	21	47	6	14	2	2
19_1	ATTCacattttacttTAAC	39	72	12	24	4	6
20_1	ATTttactttaaccTCC	25	56	12	25	2	3
21_1	CAttttactttaacctCC	73	88	61	76	41	65
22_1	CAcattttactttaacCTC	57	79	35	59	9	16
23_1	CACAttttactttaacCT	56	77	23	44	8	13
24_1	TCAcattttactttaacCT	72	87	39	60	16	25
25_1	TCAcattttactttaACC	43	61	14	32	4	6
26_1	TCacattttactttaaccTC	72	97	53	80	25	37
27_1	TTCacattttactttaacCT	54	78	33	51	10	17
28_1	TTCacattttactttaACC	35	59	13	26	3	5
29_1	ATTcacattttactttaaCC	78	99	71	86	52	69
30_1	ATtttactttaaccTCC	52	55	25	51	4	8
31_1	ACattttactttaacctCC	69	60	49	70	18	29
32_1	CACattttactttaaccTC	50	67	24	44	5	8
33_1	TCacattttactttAACC	51	76	22	44	4	9
34_1	TTCacattttactttaaCC	72	84	39	63	12	27
35_1	ATtcacattttactttaACC	101	102	94	95	103	114

實例 2 測試選自實例 1 之化合物在 A431 、 NCI-H23 、 U251 及 U2-OS 細胞系中之活體外 EC50 及效能。 使用實例1中所闡述之分析利用下列寡核苷酸濃度：50、15.81、5.00、1.58、0.50、0.16、0.05及0.016 µM (半對數稀釋，自50 µM開始之8個點)測定實例1中在5µM下於NCI-H23細胞中展示小於20%之殘餘ATXN2 mRNA之寡核苷酸的EC50及效能(KD)，且n=1-2個生物複製品。

兩種其他細胞系之條件展示於材料及方法部分中之表5中且用於細胞系U2-OS之TaqMan引子分析物係ATXN2 (Hs00268077_m1，FAM-MGB)及管家GAPDH (4326137E，VIC-MGB)。用於實例1中所使用細胞系之TaqMan引子在此實例中相同。

使用GraphPad Prism6計算EC50值且ATXN2 mRNA在50µM下之最大減小(Max KD) 在表中展示為對照(經PBS處理之細胞) %。每一細胞系之結果呈現於表7-10中。表7：抗ATXN2化合物在A431細胞中之活體外EC50及最大效能。將ATXN2 mRNA含量正規化至GUSB，且展示為對照(經PBS處理之細胞) %。在雙鏈體中(試樣A及B)來實施實驗

CMP ID NO	化合物	EC50 [µM]	mRNA 含量 [ 對照之 %]
A	B	A	B
7_1	ATTTtactttaaccTCC	0.11	0.12	5	7
13_1	TCACattttactttaacCT	0.29	0.29	6	6
14_1	TCACattttactttAACC	0.07	0.08	7	7
15_1	TCACattttactttaaccTC	0.14	0.11	4	4
17_1	TTCAcattttacttTAAC	0.22	0.26	10	9
18_1	TTCAcattttactttaACC	0.16	0.17	5	5

表8：抗ATXN2化合物在NCI-H23細胞中之活體外EC50及最大效能。將ATXN2 mRNA含量正規化至GUSB，且展示為對照(經PBS處理之細胞) %。在雙鏈體中(試樣A及B)來實施實驗

CMP ID NO	化合物	EC50 [µM]	mRNA 含量 [ 對照之 %]
A	B	A	B
7_1	ATTTtactttaaccTCC	0.18	0.30	8	8
13_1	TCACattttactttaacCT	0.34	0.55	8	10
14_1	TCACattttactttAACC	0.14	0.20	5	7
15_1	TCACattttactttaaccTC	0.22	0.34	8	9
17_1	TTCAcattttacttTAAC	0.35	0.35	10	11
18_1	TTCAcattttactttaACC	0.39	0.33	7	8

表9：抗ATXN2化合物在U251細胞中之活體外EC50及最大效能。將ATXN2 mRNA含量正規化至GUSB，且展示為對照(經PBS處理之細胞) %。在雙鏈體中(試樣A及B)來實施實驗

CMP ID NO	化合物	EC50 [µM]	mRNA 含量 [ 對照之 %]
A	B	A	B
7_1	ATTTtactttaaccTCC	1.63	1.33	6	5
13_1	TCACattttactttaacCT	1.87	2.22	5	5
14_1	TCACattttactttAACC	1.02	1.21	4	3
15_1	TCACattttactttaaccTC	1.21	1.25	3	3
17_1	TTCAcattttacttTAAC	1.88	1.97	7	8
18_1	TTCAcattttactttaACC	1.45	1.74	4	3

表10：抗ATXN2化合物在US-O2細胞中之活體外EC50及最大效能。將ATXN2 mRNA含量正規化至GAPDH，且展示為對照(經PBS處理之細胞) %。

CMP ID NO	化合物	EC50 [µM]	mRNA 含量 [ 對照之 %]
7_1	ATTTtactttaaccTCC	0.17	2
13_1	TCACattttactttaacCT	0.20	2
14_1	TCACattttactttAACC	0.08	2
15_1	TCACattttactttaaccTC	0.12	1
17_1	TTCAcattttacttTAAC	0.24	2
18_1	TTCAcattttactttaACC	0.15	1

實例 3 ：靶向「區域 12 」 之化合物與靶向人類 AXTN2 之化合物之對比 跨越ATXN2 mRNA前體序列(SEQ ID NO 1)設計1500種以上LNA間隙聚體寡核苷酸且在A431及U2OS細胞中評估其在0.5µM低劑量下之活體外功效。結果匯總於圖2中。數據證實，熱點區(SEQ ID NO 6，表示為實心圓)提供高效化合物。圖3僅展示所選熱點區化合物。

實例 4 測試 0.5µM LNA 寡核苷酸在 U2OS 及 A431 細胞系中之活體外效能 在三種人類細胞系中使用表11中之LNA寡核苷酸(亦靶向SEQ ID NO: 1之位置83121至83144區域)進行寡核苷酸篩選。如上文實例中所闡述。相對ATXN2 mRNA表現含量以對照(經PBS處理之細胞) %形式展示於表11中，亦即，該值愈低，則抑制愈大。表 11

SEQ ID NO	CMP ID NO	化合物	U2OS mRNA 含量	A431 mRNA 含量
7	7_1	ATTTtactttaaccTCC	26	21
15	15_2	TCaCAttttactttaacCTC	13	14
15	15_3	TCAcAttttactttaAcCTC	13	13
15	15_4	TCAcAttttactttaacCTC	9	11
15	15_5	TCACattttactttaAcCTC	16	15
14	14_2	TCAcAttttacttTaACC	12	14
14	14_3	TCACattttacttTaACC	16	12

在該等化合物中，大寫字母代表β-D-氧基LNA核苷，小寫字母代表DNA核苷，所有LNA C皆係5-甲基胞嘧啶，所有核苷間鍵聯皆係硫代磷酸酯核苷間鍵聯。

實例 5 ： 測試所選化合物之活體外 EC50 及效能 使用如實例2中所闡述之方法且使用10mM作為起始濃度來測定實例3中所測試化合物之EC50。EC50值計算如下：表 12

SEQ ID NO	CMP ID NO	U2OS	A431
EC50 (µM)	最大KD下之 mRNA含量	EC50 (µM)	最大KD下之mRNA含量
7	7_1	0,16	4	0,083	5
15	15_2	0,092	2	0,041	3
15	15_3	0,067	4	0,031	8
15	15_4	0,085	2	0,041	3
15	15_5	0,079	5	0,034	8
14	14_2	0,079	3	0,035	6
14	14_3	0,088	3	0,027	6

實例 6 ： 在小鼠原代皮質神經元細胞中對比性評估所選擇化合物 7_1 及 15_4 與先前技術化合物 ASO7 ( 化合物 37_1) 。化合物37_1 = gtggg atacaaattc taggc ，其中粗體加下劃線字母代表2’-O-MOE核苷，且非粗體字母係DNA核苷，且所有核苷間鍵聯皆係硫代磷酸酯(如Scholes等人，Nature，第544卷，第362-366頁(2017年4月20日)中所揭示。

小鼠原代皮質神經元細胞培養物之製備 根據標準程序自15天齡小鼠之胚胎腦製備原代皮質神經元培養物。簡言之，使用聚L-離胺酸(50 µg/ml聚-L-離胺酸、10 mM四硼酸鈉，pH8緩衝液)將培養板在37℃及5% CO2下於加濕培育器中塗覆2-3 hr。在使用之前使用1×PBS洗滌板。藉由剃刀片解剖所收穫小鼠胚胎腦且均質化，並浸沒至38 ml解剖培養基(HBSS、0.01 M Hepes、青黴素(Penicillin)/鏈黴素(Streptomycin))中。添加2 ml胰蛋白酶且將細胞在37℃下培育30 min。在培育之後，添加4 ml胰蛋白酶抑制劑(stopper)且使細胞離心下來。

將細胞分散於20 ml DMEM (+ 10% FBS)中且經由具有13g針之注射器傳遞以用於進一步均質化。隨後在500 rpm下離心15分鐘。去除上清液且將細胞分散於DMEM (+10% FBS)中，並接種於96孔板中(0.1 × 10^6個細胞/孔/100 µl)。神經元細胞培養物在接種之後即可直接使用。

在小鼠原代皮質神經元細胞培養物中篩選寡核苷酸 第二天，將96孔板中之培養基更換為生長培養基(Gibco Neurobasal培養基、B27補充物、Glutamax、青黴素-鏈黴素)及5µM FdU且與寡核苷酸一起在期望濃度下培育6天。自細胞分離總RNA且藉由qPCR分析來量測敲低效能。在一步法qPCR (cDNA合成及qPCR)中，使用一種ATXN2探針組(IDT, Leuven, Belgium) (ATXN2_分析1，Mm.PT.58.7178341)一式兩份運行每一試樣，該探針組以與RPL4 (Mm.PT.58.17609218)或RPS29 (Mm.PT.58.21577577)之雙鏈體形式運行。向每一反應中添加4µL先前稀釋之RNA、0.5µL水及5.5µL TaqMan MasterMix。使板離心且在90℃下熱激40sek，隨後在冰上短暫培育，然後使用qPCR分析試樣(在50℃下培育15分鐘且在90℃下培育3分鐘，隨後在95℃下培育5 sec且在60℃下培育45sec並持續40個循環)。

使用相對標準曲線方法分析數據，其中首先將每一試樣正規化至兩種管家基因(RPL4及RPS29)之幾何平均值且然後表示為未治療對照動物之百分比。所用化合物：7_1、15_4及37_1 (ASO7) 結果展示於圖4中。

實例 7 ： 活體內 ICV 小鼠研究 動物護理 在C57BL/6JBomTac雌性小鼠(16-23g, Taconic Biosciences, Ejby, Denmark，以5-6隻/籠飼養)中測試化合物之活體內活性及耐受性。將動物保持於維持在恆定溫度(22 ± 2℃)及濕度(55 ± 10%)下且每天照明12小時(在0600小時開燈)之飼育室中。在整個研究期間，所有動物可隨意獲得食物及水。所有小鼠方案皆由丹麥國家動物實驗倫理委員會(Danish National Committee for Ethics in Animal Experiments)批準。

投與途徑 - 腦室內注射。 藉由腦室內(ICV)注射將化合物投與小鼠。在ICV投藥之前，對小鼠稱重且使用異氟醚或丙泊酚(Propofol) (30mg/kg)麻醉。使用具有FEP導管之Hamilton微型注射器實施腦室內注射，該FEP導管裝配有固定於支架中之23號針，可調節該支架以穿透皮膚及顱骨並進入右側腦室適當距離(3.9mm)。使用一隻手之拇指及食指固持擬注射小鼠之頸背。施加輕微但牢固的壓力，向上按壓頭部，從而針刺入顱骨中直至中線右側(中間外側) 1-2mm及眼後1-2mm。經30秒以預定速率注射測試化合物或媒劑之濃注液。為避免回流，使小鼠再保持於此位置5秒，然後小心地向下拉離針。此程序無需手術或切開。將動物置於加熱燈下直至其自該程序恢復為止。在投藥後2或4週，在乾冰上收集腦組織(皮質及小腦)以及肝及腎皮質以進行藥物濃度分析及ATXN2 mRNA及蛋白質分析。

使用如下表(表13)中所展示之不同化合物之組實施3個獨立實驗。

化合物36_1 = TCCattaactactCTTT，其中大寫字母代表β-D-氧基LNA核苷，小寫字母代表DNA核苷，所有LNA C皆係5-甲基胞嘧啶，所有核苷間鍵聯皆係硫代磷酸酯核苷間鍵聯。表 13

研究編號	化合物編號	劑量， µg	時間點	組員數
1	僅鹽水	0	2wk	5
7_1	50	2wk	10
14_1	50	2wk	10
15_1	50	2wk	10
僅鹽水	0	2wk	5
7_1	100	2wk	10
14_1	100	2wk	10
15_1	100	2wk	10
僅鹽水	0	4wk	5
7_1	100	4wk	10
14_1	100	4wk	10
15_1	100	4wk	10
2	僅鹽水	0	4wk	5
36_1	250	4wk	10
17_1	250	4wk	10
18_1	250	4wk	10
ASO7	200	4wk	10
3	僅鹽水	0	2wk	6
15_3	250	2wk	6
15_4	250	2wk	6
14_3	250	2wk	6
14_2	250	2wk	6
15_2	250	2wk	6
15_5	250	2wk	6

耐受性結果： 藉由監測動物行為來量測急性毒性，如WO2016/126995中所闡述(參見實例9)。藉由在實驗時程期間監測每一動物之體重來量測慢性毒性，其中＞5%之重量減小指示慢性毒性。應注意，對展現毒性體徵之動物實施安樂死，在一些情形下此會導致實驗提前終止(在較高比例之動物展現毒性體徵之情形下，對所有動物實施安樂死)。

實驗1 化合物7_1：沒有動物展示急性毒性體徵。1隻小鼠在實驗(27天)過程中展示重量減輕。化合物14_1：10隻動物中之2隻展現急性毒性，從而需要在投與之後1天實施安樂死。剩餘8隻動物中之5隻在實驗(終止於第8天)過程中展示重量減輕。化合物15_1：10隻動物中之1隻展現急性毒性，從而需要在投與之後1天實施安樂死。在所有剩餘8隻動物中，5隻在實驗(終止於第8天)過程中展示重量減輕。

實驗2 化合物37_1 (ASO7)對所有10隻動物具有急性毒性，且在投與之後30分鐘內具有嚴重抽搐，從而需要在投與之後1小時實施安樂死。化合物36_1：10隻動物中之3隻展現急性毒性，從而需要在投與之後1天實施安樂死。剩餘7隻動物中之4隻在實驗(終止於第12天)過程中展示重量減輕。化合物17_1：沒有動物展示急性毒性體徵。10隻動物中之2隻在實驗時程(29天)中展示重量減輕。化合物18_1：10隻動物中之1隻展示急性毒性且實施安樂死。剩餘9隻動物中之3隻在實驗時程(29天)中展示重量減輕。

實驗3 化合物15_3：6隻動物中之2隻展現急性毒性，從而需要在投與之後1天實施安樂死。在剩餘4隻動物中，2隻在實驗(終止於第15天)時程中展示體重減小。化合物15_4：6隻動物中之2隻展現急性毒性，從而需要在投與之後1天實施安樂死。剩餘4隻動物在實驗(完成於第14天)過程中皆不展現重量減輕。化合物14_3：6隻動物中之1隻展現急性毒性，從而需要在投與之後1天實施安樂死。在剩餘5隻動物中，3隻在實驗(終止於第9天)時程中展示體重減小。化合物14_2：6隻動物中之2隻展現急性毒性，從而需要在投與之後1天實施安樂死。在剩餘4隻動物中，3隻在實驗(終止於第15天)時程中展示體重減小。化合物15_2：6隻動物中之2隻展現急性毒性，從而需要在投與之後1天實施安樂死。在剩餘4隻動物中，3隻在實驗(終止於第10天)時程中展示體重減小。化合物15_5：所有6隻動物皆展現急性毒性，從而需要在投與之後1天實施安樂死。

用於寡核苷酸含量及 ATXN2 mRNA 分析之組織均質化 在MagNA Pure LC RNA分離組織裂解緩衝液(Roche, Indianapolis, IN)中使用Qiagen TissueLyzer II使小鼠腦、肝及腎試樣均質化。將均質物在室溫下培育30分鐘以達成完全裂解。在裂解之後，使均質物在13000rpm下離心3分鐘且使用上清液進行分析。留出一半用於生物分析且另一半直接繼續進行RNA提取。

寡核苷酸含量分析 對於生物分析而言，將試樣稀釋10-50倍以使用雜交ELISA方法量測寡核苷酸含量。將生物素化LNA捕獲探針及與地高辛(digoxigenin)偶聯之LNA檢測探針(皆35nM於5xSSCT中，各自與擬檢測LNA寡核苷酸之一端互補)與經稀釋均質物或相關標準品混合，在室溫下一起培育30分鐘且然後添加至經鏈黴抗生物素蛋白(streptavidine)塗覆之ELISA板(Nunc目錄編號：436014)中。

將板在室溫下培育1小時，在2xSSCT (300mM氯化鈉、30mM檸檬酸鈉及0,05% v/v Tween-20 (pH 7.0))中洗滌。使用與鹼性磷酸酶(Roche Applied Science目錄編號：11093274910)及鹼性磷酸酶受質系統(Blue Phos受質，KPL產品代碼：50-88-00)偶聯之抗DIG抗體檢測所捕獲LNA雙鏈體。在615 nm下在Biotek讀數儀上以吸光度形式來量測寡核苷酸複合物之量。

將數據正規化至組織重量且表示為nM寡核苷酸。

ATXN2 mRNA 減少使用MagNA Pure 96儀器且使用套組Cellular RNA Large Volume Kit (Roche, Indianapolis, IN)自350µL上清液純化RNA。將RNA試樣在無RNase水中正規化至2ng/µL且儲存於-20℃下直至進一步使用。

在一步法qPCR (cDNA合成及qPCR)中，使用4個探針組(IDT, Leuven, Belgium)一式兩份運行每一試樣，該等探針組係以雙鏈體形式(ATXN2_分析1 (Mm.PT.58.7178341)與RPL4 (Mm.PT.58.17609218)之雙鏈體及ATXN2_分析2 (Mm.PT.58.11673123)與RPS29 (Mm.PT.58.21577577)之雙鏈體)運行。向每一反應中添加4µL先前稀釋之RNA、0.5µL水及5.5µL TaqMan MasterMix。使板離心且在90℃下熱激40sek，隨後在冰上短暫培育，然後使用qPCR分析試樣(在50℃下培育15分鐘且在90℃下培育3分鐘，隨後在95℃下培育5 sec且在60℃下培育45sec並持續40個循環)。

使用相對標準曲線方法分析數據，其中首先將每一試樣(兩個ATXN2分析之幾何平均值)正規化至兩種管家基因(RPL4及RPS29)之幾何平均值且然後表示為未治療對照動物之百分比。

用於 ATXN2 蛋白分析之組織均質化 在含有1% Halt™蛋白酶及磷酸酶抑制劑(Thermo Fisher Scientific)之RIPA緩衝液中使用Qiagen TissueLyzer II將小鼠腦試樣均質化。將均質物在4℃下培育30分鐘以達成完全裂解。在裂解之後，使均質物在14000rcf下離心10分鐘且將上清液等分成較小體積，並儲存於-20℃下直至進一步使用。

ATXN2 蛋白減少 基於使用BCA套組(Thermo Fisher Scientific)量測之總蛋白質，將試樣正規化至0.05mg/ml。在雙鏈體(一級抗體：小鼠抗失調症蛋白-2 (1:50，第611378號，BD Bioscience)及抗HPRT (1:100，第ab109021號，Abcam)，二級抗體：抗小鼠及抗兔二級抗體，Protein Simple, San Jose, CA)中量測ATXN2蛋白減少且在毛細管西方免疫分析WES儀器(Protein Simple)上根據製造商標準方案進行分析。

以相對量形式分析數據，其中將每一試樣之ATXN2表現首先正規化至管家蛋白(HPRT)且然後表示為未治療對照動物之百分比。

結果展示於圖5-7中。

圖5：11種所選化合物之敲低(mRNA)之對比，所編譯數據來自三個實驗，研究1 =實心點，研究2 =空心點，研究3=半實心點。

圖6：蛋白質及mRNA含量之敲低及化合物7_1在皮質區、小腦區中之暴露。僅展示皮質之蛋白質數據。

圖7：蛋白質及mRNA含量之敲低及化合物15_4在皮質區、小腦區中之暴露。僅展示皮質之蛋白質數據。

實例 8 ： 活體內 ICV 小鼠研究 - 作用持續時間 設定新研究以探究化合物7_1之作用持續時間。包含15_4以僅用於一個時間點(7天)。程序係如實例7中所闡述且使用下列方案：表 14

研究編號	化合物編號	劑量， µg	時間點	組員數
4	僅鹽水	0	1wk	6
4	僅鹽水	0	8wk	6
4	7_1	150	24h	6
4	7_1	150	1wk	6
4	7_1	150	4wk	6
4	7_1	150	6wk	6
4	7_1	150	8wk	6
4	15_4	150	1wk	6

mRNA敲低結果展示於圖8中，其圖解說明皮質及尤其小腦組織二者中之ATXN2 mRNA穩健且強力地敲低至少56天(最大效能值維持7 - 56天)，從而指示有效作用持續時間遠長於56天。在一些小鼠中治療似乎不甚有效，且因此跨越時程與同一個別小鼠相關之此情況可能與程序有關。

實例 9 ：活體內食蟹猴研究 個體個體係在開始投藥時重2-4 kg之雄性及雌性食蟹猴。在每一個體之腰椎鞘內間隙中植入聚胺基甲酸酯導管。使導管之近端連結至皮下出入孔以容許注射至鞘內間隙中及汲取CSF試樣。

以0.33 ml/min向食蟹猴投與1.0ml體積之鹽水、化合物ID 7_1或化合物ID 15_4 (其溶於鹽水中)，隨後投與1.5ml CSF。總輸注時間為4.5min。關於劑量、持續時間、組員數及組織之資訊，參見表15。表 15

化合物編號	劑量， mg	時間點	組員數
僅鹽水	0	2wk	2
7_1	4	2wk	3
7_1	8	2wk	3
7_1	24	2wk	3
15_4	8	2wk	3

藉由重力流自腰椎出入孔收集CSF，每一試樣最大收集0.8 ml CSF。將CSF離心並將上清液保持於-80℃下直至分析。將自可用靜脈獲得之血漿保持於-80℃下直至分析。

在使用氯胺酮及異氟醚麻醉的同時向食蟹猴投與適當體積之市售安樂死溶液。然後立即獲得驗屍組織且將腦轉移至冷凍表面上以供解剖。使用清潔去除技術收集所有試樣，稱重且使用乾冰冷凍以進行藥物濃度分析及ATXN2 mRNA分析。

耐受性 在生活相期間，未報告不良臨床效應。組織病理學展示，任一化合物在所測試含量下並無問題。

用於寡核苷酸含量及 ATXN2 mRNA 分析之組織均質化 參見實例7 -使用相同程序。

寡核苷酸含量分析 對於生物分析而言，將試樣稀釋50-100倍以使用雜交ELISA方法量測寡核苷酸含量。將生物素化LNA捕獲探針及與地高辛偶聯之LNA檢測探針(皆35nM於5xSSCT中，各自與擬檢測LNA寡核苷酸之一端互補)與經稀釋均質物或相關標準品混合，在室溫下一起培育30分鐘且然後添加至經鏈黴抗生物素蛋白塗覆之ELISA板(Nunc目錄編號：436014)中。

將數據正規化至組織重量且表示為nM寡核苷酸。

在一步法qPCR (cDNA合成及qPCR)中，使用關於ATXN2之4個探針組(IDT, Leuven, Belgium) (參見表16)及關於不同管家基因之4個探針組(GAPDH (Mf04392546_g1)、POLR3F (Mf02860939_m1)、YWHAZ (Mf02920410_m1)及UBC (Mf02798368_m1)) (Thermo Fisher Scientific)一式兩份運行每一試樣，每一探針組係以單鏈體形式運行。表 16 ：用於Mf (長尾猴(macaca fascicularis)) ATXN2分析之引子及探針序列。

分析名稱	引子1 (5’- 3’)	引子2 (5’- 3’)	探針(5’- 3’)
Mf_ATXN2_分析1	CCAGCTTACTCCACGCAATA (SEQ ID NO 38)	CATGAGGATGCTGAGACTGATAA (SEQ ID NO 39)	56-FAM/TCCTCAGCA/ ZEN/GTTCCCAAATCAGCC/3IABkFQ (SEQ ID NO 40)
Mf_ATXN2_分析2	AGCTGTTGCCATGCCTATT (SEQ ID NO 41)	GGAGAGTTCTGCCTTTGATCTT (SEQ ID NO 42)	56-FAM/TGCTAGTCC/ ZEN/TGCATCGAACAGAGC/3IABkFQ (SEQ ID NO 43)
Mf_ATXN2_分析3	TTCAACCCACGTTCCTTCTC (SEQ ID NO 44)	GCTGTTGATGACCCACCATA (SEQ ID NO 45)	56-FAM/AACTTCACC/ ZEN/TCGGCCTCAAGCA/3IABkFQ (SEQ ID NO 46)
Mf_ATXN2_分析4	CTCCAGCTCCTGTCTCTACTAT (SEQ ID NO 47)	ACTCTGIGATTTCGAGGATGTC (SEQ ID NO 48)	56-FAM/TTCAGAAGG/ ZEN/GCCTCCAAGGATGTC/3IABkFQ (SEQ ID NO 49)

向每一反應中添加4µL先前稀釋之RNA、0.5µL水及5.5µL TaqMan MasterMix。使板離心且在90℃下熱激40sek，隨後在冰上短暫培育，然後使用qPCR分析試樣(在50℃下培育15分鐘且在90℃下培育3分鐘，隨後在95℃下培育5 sec且在60℃下培育45sec並持續40個循環)。

使用相對標準曲線方法分析數據，其中將每一試樣(4個ATXN2分析之平均值)首先正規化至每一組織之三種最佳功能性管家基因之平均值-藉由Vandesompele等人，2002, Genome Biology 2002, 3(7):research 0034.1-0034.11中所闡述之geNORM分析測得-且然後表示為未治療對照動物之百分比(參見圖9)。

用於 ATXN2 蛋白分析之組織均質化 與小鼠研究相同

ATXN2 蛋白減少 基於使用BCA套組(Thermo Fisher Scientific)量測之總蛋白質，將小腦及皮質試樣正規化至0.2mg/ml。在雙鏈體(一級抗體：小鼠抗失調症蛋白-2 (1:50，第611378號，BD Bioscience)及抗HPRT (1:50，第ab109021號，Abcam)，二級抗體：抗小鼠及抗兔二級抗體，Protein Simple, San Jose, CA)中量測ATXN2蛋白減少且在毛細管西方免疫分析WES儀器(Protein Simple)上根據製造商標準方案進行分析。

結果展示於圖9及10中。

圖 1 化合物15_4 (核鹼基之序列展示於SEQ ID NO 15中) 圖1中所圖解說明之化合物係以質子化形式展示-硫代磷酸酯鍵聯上之S原子發生質子化-應理解，質子之存在取決於環境分子之酸度及替代陽離子之存在(例如在寡核苷酸呈鹽形式時)。質子化硫代磷酸酯以互變異構體形式存在。圖 2 1500+種靶向人類細胞系中之人類失調症蛋白2 mRNA前體序列之化合物之篩選。化合物7_1指示為空心菱形。圖 3 根據圖6之僅熱點區SEQ ID NO 6靶向化合物。化合物7_1指示為空心菱形。圖 4 化合物7_1及15_4與化合物37_1 (ASO7)相比之活體外功效評價。圖 5 活體內小鼠研究-11種所選化合物之敲低(mRNA)之對比，所編譯數據來自三個實驗，研究1 =實心點，研究2 =空心點，研究3=半實心點。圖 6 活體內小鼠研究-蛋白質及mRNA含量之敲低及化合物7_1在皮質區、小腦區中之暴露。僅展示皮質之蛋白質數據。圖 7 活體內小鼠研究-蛋白質及mRNA含量之敲低及化合物15_4在皮質區、小腦區中之暴露。僅展示皮質之蛋白質數據。圖 8 小鼠活體內研究，經腦室內投與150μg化合物7_1及化合物15_4 (僅量測於7天時)之後之時程。圖 9 NHP活體內PK/PD研究-在投與4、8或24 mg (化合物7_1)及8mg化合物15_4之後關鍵組織中之mRNA及蛋白質表現含量(量測於治療後14天)。圖 10 N HP活體內PK/PD研究-在投與4、8或24 mg (化合物7_1)及8mg化合物15_4之後關鍵組織中之mRNA及蛋白質表現含量(量測於治療後14天)。呈現數據以闡釋兩種化合物之相對比活性。

Claims

一種下式之反義寡核苷酸， TCAcAttttactttaacCTC (SEQ ID NO 15_4) 其中大寫字母係β-D-氧基LNA核苷，小寫字母係DNA核苷，所有LNA C皆係5-甲基胞嘧啶，所有核苷間鍵聯皆係硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
如請求項1之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸具有下式：
或其醫藥上可接受之鹽。
如請求項1或2之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係呈醫藥上可接受之鹽之形式。
如請求項1或2之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係呈醫藥上可接受之鈉鹽之形式。
如請求項1或2之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係呈醫藥上可接受之鉀鹽之形式。
一種偶聯物，其包括如請求項1至5中任一項之反義寡核苷酸及至少一個共價附接至該寡核苷酸之偶聯物部分。
一種醫藥組合物，其包括如請求項1至5中任一項之反義寡核苷酸或如請求項6之偶聯物，及醫藥上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑。
如請求項7之醫藥組合物，其中該組合物包括醫藥上可接受之稀釋劑，諸如無菌磷酸鹽緩衝鹽水。
如請求項7或8之醫藥組合物，其中該反義寡核苷酸以1mg/mL溶液至100mg/mL溶液、諸如2 mg/mL至30 mg/mL之濃度，用於該醫藥上可接受之稀釋劑中。
一種在表現ATXN2之靶細胞中調節ATXN2表現之活體外方法，該方法包括向該細胞投與有效量之如請求項1至5中任一項之反義寡核苷酸或如請求項6之偶聯物或如請求項7至9中任一項之醫藥組合物。
一種如請求項1至5中任一項之寡核苷酸或如請求項6之偶聯物或如請求項7至9中任一項之醫藥組合物之用途，其用以製備用於調節靶細胞中之ATXN2表現之藥劑。
一種如請求項1至5中任一項之寡核苷酸或如請求項6之偶聯物或如請求項7之醫藥組合物之用途，其用以製備用於治療或預防神經退化性疾病之藥劑，該神經退化性疾病係諸如選自由以下組成之群之疾病：2型脊髓小腦性失調症(SCA2)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease)、額顳葉失智症(frontotemporal dementia (FTD))、帕金森症(parkinsonism)及具有TDP-43蛋白病變之病狀。
如請求項12之用途，其中該疾病係2型脊髓小腦性失調症(SCA2)。
如請求項12之用途，其中該疾病係肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)。