KR20200015608A - Htra1 발현을 조절하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, HTRA1의 발현의 조절을 야기하는, HTRA1에 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오티드(올리고머)에 관한 것이다. HTRA1 발현의 조절은 다양한 질병, 예컨대 황반 변성, 예를 들어 연령-관련 황반 변성에 유익하다.
Description
본 발명은, HTRA1의 발현의 조절을 야기하는, HTRA1에 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오티드(올리고머)에 관한 것이다. HTRA1 발현의 조절은 다양한 질병, 예컨대 황반 변성, 예를 들어 연령-관련 황반 변성에 유익하다.
세린 프로테아제의 인간 고온 리콰이어먼트 A(high temperature requirement A; HTRA) 패밀리는, 프로테아제 및 샤페론(chaperone)의 이중 기능을 조합함으로써 세포외 구간에서 단백질 항상성을 유지하는 데 관련되는 보편적으로 발현된 PDZ-프로테아제이다. HTRA 프로테아제는 세포외 기질의 구성, 세포 증식 및 노화에 관련된다. HTRA 활성의 조절은 뒤시엔느 근육퇴행위축(문헌[Bakay et al. 2002, Neuromuscul. Disord. 12: 125-141]), 관절염, 예컨대 골관절염(문헌[Grau et al. 2006, JBC 281: 6124-6129]), 암, 가족성 허혈성 뇌 소형-혈관 질병 및 연령-관련 황반 변성, 뿐만 아니라 파킨슨병 및 알츠하이머병을 포함하는 여러 질병과 관련된다. 인간 HTRA1은 인슐린-유사 성장 인자(IGF) 결합 도메인을 함유한다. 이는 IGF 이용률 및 세포 성장을 조절하고(문헌[Zumbrunn and Trueb, 1996, FEES Letters 398:189-192]) 종양 억제 특성을 나타내는 것으로 제시되었다. HTRA1 발현은 전이성 흑색종에서 하향-조절되고, 이에 따라 흑색종 진행의 정도를 나타낼 수 있다. 전이성 흑색종 세포주에서 HTRA1의 과발현은 시험관내 증식 및 침입을 감소시키고 이종이식 마우스 모델에서 종양 성장을 감소시켰다(문헌[Baldi et al., 2002, Oncogene 21:6684-6688]). 또한, HTRA1 발현은 난소암에서 하향-조절된다. 난소암 세포주에서, HTRA1 과발현은 세포사를 유도하는 반면에, 안티센스 HTRA1 발현은 앵커리지(anchorage)-독립적 성장을 촉진한다(문헌[Chien et al., 2004, Oncogene 23:1636-1644]).
IGF 경로에 대한 이의 효과에 더하여, HTRA1은 또한 성장 인자의 TGFβ 패밀리에 의한 신호전달을 억제한다(문헌[Oka et al., 2004, Development 131:1041-1053]). HTRA1은 아밀로이드 전구체 단백질(APP)을 절단할 수 있고, HTRA1 억제제는 배양된 세포에서 Aβ 펩티드의 축적을 야기한다. 따라서, HTRA1은 또한 알츠하이머병과 관련된다(문헌[Grau et al.,2005, Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 102:6021-6026]).
또한, HTRA1 상향-조절이 관찰되었고, 뒤시엔느 근육퇴행위축(문헌[Bakay et al. 2002, Neuromuscul. Disord. 12: 125-141]), 골관절염(문헌[Grau et al. 2006, JBC 281: 6124-6129]) 및 AMD(문헌[Fritsche, et al. Nat Gen 2013 45(4):433-9])에 연관된 것으로 보인다.
HTRA1 프로모터 영역의 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)(rs11200638)은 연령-관련 황반 변성(AMD) 발생의 10배 증가된 위험성과 연관된다. 또한, HTRA1 SNP는 연령-관련 황반 변성(AMD) 발생의 증가된 위험과 연관된 ARMS2 SNP(rs10490924)와의 연쇄 불균형에 있다. 위험성 대립형질은 2 내지 3배 증가된 HTRA1 mRNA 및 단백질 발현에 연관되고, HTRA1은 AMD 환자의 드루젠에 존재한다(문헌[Dewan et al., 2006, Science 314:989-992]; [Yang et al., 2006, Science 314:992-993]). HtrA1의 과발현이 마우스에서 AMD-유사 표현형을 유도함을 확인하였다. hHTRA 유전자 도입된 마우스(문헌[Veierkottn, PlosOne 2011])는 브루크막의 탄력판의 저하를 나타내고 맥락막 혈관 이상(문헌[Jones, PNAS 2011])을 확정하고 폴립모양 맥락막 혈관병(PCV) 병소(문헌[Kumar, IOVS 2014])를 증가시킨다. 추가적으로, 담배 연기에 노출시 결정된 hHTRA1 Tg 마우스에서 브루크막 손상은 CNV를 3배 증가시키는 것으로 보고되었다(문헌[Nakayama, IOVS 2014]).
연령-관련 황반 변성(AMD)은 65세 이상의 인간에서 비가역적인 시력 손실의 선두적인 원인이다. AMD의 발병과 함께, 눈의 뒤쪽의 감광성 광수용기 세포, 이를 대사적으로 지지하는 아래에 있는 색소 상피 세포, 및 이것이 제공하는 날카로운 중심시가 점전적으로 손실된다. 연령은 AMD 발병의 주요 위험 인자이다: AMD 발생의 가능성은 55세 이후 3배가 된다. 흡연, 옅은 홍채색, 성별(여성이 보다 큰 위험에 있다), 비만 및 자외선 방사에 반복적인 노출이 또한 AMD의 위험을 증가시킨다. AMD는 진행은 3개의 단계로 정의될 수 있다: 1) 초기, 2) 중기 및 3) 후기 AMD. 후기 AMD의 두가지 형태가 존재한다: 건성 AMD(지도모양위축(GA)으로도 지칭됨) 및 습성 AMD(삼출성 AMD로도 공지됨). 건성 AMD는 시력 손실을 야기하는 광수용기의 손실 및 망막 색소 상피 세포의 손실을 특징으로 한다. 습성 AMD는 병리학적 맥락막(망막하로도 지칭됨) 혈관신생과 연관된다. 이러한 과정에서 비정상적인 혈관 형성으로부터의 누출은 황반을 손상시키고 시력을 악화시켜, 궁극적으로 맹증을 야기한다. 일부 경우에, 환자는 후기 AMD의 모든 유형과 연관된 병리학을 나타낼 수 있다. 습성 AMD에 대한 치료 전략은 눈 내로의 빈번한 주사를 필요로 하고 주로 질병 진행의 지연에 초점을 맞춘다. 현재, 건성 AMD에 대한 이용가능한 치료는 없다. 따라서, 황반 변성 질환, 예컨대 습성 및 건성 AMD를 치료하는 데 효과적인 약물의 제공을 위한 충족되지 않은 의료적 요구가 존재한다. WO 2008/013893은 HTRA1 유전자 또는 mRNA를 혼성화시키는 안티센스 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는, 연령-관련 황반 변성을 앓는 개체의 치료용 조성물을 주장한다: 안티센스 분자는 개시되지 않는다.
WO 2009/006460은 HTRA1을 표적화하는 siRNA, 및 AMD의 치료에서 이의 용도를 제공한다.
본 발명은 생체내 또는 시험관내 HTRA1을 조절하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화되어 효과적인 HTRA1 억제를 제공할 수 있는 인간 HTRA1 mRNA(미성숙 mRNA(미성숙 mRNA)를 포함함)에 존재하는 은성 표적 서열 모티프를 동정하였다. 또한, 본 발명은 HTRA1을 억제할 수 있는 효과적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열 및 화합물, 및 HTRA1이 지시되는 질병 또는 장애의 치료에서 이들의 용도를 제공한다.
본 발명은 포유류 HTRA1 핵산을 표적화하는, 즉, HTRA1 발현을 억제할 수 있고 HTRA1의 기능과 관련된 질병을 치료하거나 예방하는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. HTRA1을 표적화하는 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다, 즉, 이의 HTRA1 핵산 표적에 상보성이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 약학적으로 허용되는 염, 예컨대 나트륨 염 또는 칼륨 염의 형태일 수 있다.
따라서, 본 발명은 포유류 HTRA1 핵산, 예컨대 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4에 90% 이상 상보성인, 예컨대 완전히 상보성인 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
추가적 양상에서, 본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 및 약학적으로 허용되는 희석제, 담체, 염 및/또는 보조제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 HTRA1 핵산, 예컨대 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 90% 이상 상보성인, 예컨대 완전히 상보성인 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하는 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드, 예컨대 LNA 갭머 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 10 내지 30개, 예컨대 12 내지 22개의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하되, 상기 인접 뉴클레오티드 영역은 서열번호 113에 대해 90% 이상, 예컨대 100% 상보성이다.
본 발명은 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하되, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하기 서열번호 113에 대해 90% 이상, 예컨대 100% 상보성인 10 내지 30개, 예컨대 12 내지 22의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함한다:
서열번호 113의 역 보체는 서열번호 119이다:
본 발명은 10 내지 30개, 예컨대 12 내지 22개의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하되, 상기 인접 뉴클레오티드 영역은 서열번호 114에 대해 90% 이상, 예컨대 100% 상보성이다.
본 발명은 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하되, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 114에 대해 90% 이상, 예컨대 100% 상보성인 10 내지 30개, 예컨대 12 내지 22개의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함한다:
서열번호 114의 역 보체는 서열번호 120이다:
본 발명은 10 내지 30개, 예컨대 12 내지 22개의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하되, 상기 인접 뉴클레오티드 영역은 서열번호 115에 대해 90% 이상, 예컨대 100% 상보성이다.
본 발명은 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하되, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 115에 90% 이상, 예컨대 100% 상보성인 10 내지 30개, 예컨대 12 내지 22개의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함한다:
서열번호 115의 역 보체는 서열번호 121이다:
본 발명은 10 내지 30개, 예컨대 12 내지 22개의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하되, 상기 인접 뉴클레오티드 영역은 서열번호 116에 대해 90% 이상, 예컨대 100% 상보성이다.
본 발명은 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하되, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 116에 대해 90% 이상, 예컨대 100% 상보성인 10 내지 30개, 예컨대 12 내지 22개의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함한다:
서열번호 116의 역 보체는 서열번호 122이다:
본 발명은 10 내지 30개, 예컨대 12 내지 22개의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하되, 상기 인접 뉴클레오티드 영역은 서열번호 117에 대해 90% 이상, 예컨대 100% 상보성이다.
본 발명은 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하되, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 117에 대해 90% 이상, 예컨대 100% 상보성인 10 내지 30개, 예컨대 12 내지 22개의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함한다:
서열번호 117의 역 보체는 서열번호 123이다:
일부 실시양태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 5' gcaatgtgtaagaagt 3'(서열번호 112)의 것이 아니다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 5' gcaatgtgtaagaagt 3'을 포함하지 않거나 이로 이루어지지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 5' gcaatgtgtaagaagt 3'에 존재하는 10개 이상의 인접 뉴클레오티드를 포함하지 않거나 이로 이루어지지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 5' GCAatgtgtaagaAGT 3'이 아니되, 여기서 대문자는 LNA 뉴클레오시드를 나타내고(베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드가 사용되었다), 모든 LNA 사이토신은 5-메틸 사이토신이고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드를 나타내고, 위첨자 m이 선행하는 DNA 사이토신은 5-메틸 C-DNA 뉴클레오시드를 나타낸다. 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기이다.
본 발명은 서열번호 5 내지 111 중 어느 하나에 존재하는 10개 이상의 인접 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 서열번호 5 내지 111 중 어느 하나에 존재하는 12개 이상의 인접 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 서열번호 5 내지 111 중 어느 하나에 존재하는 14개 이상의 인접 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 서열번호 5 내지 111 중 어느 하나에 존재하는 15 또는 16개 이상의 인접 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하되, 상기 올리고뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5 내지 111 중 어느 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 핵염기 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 발명은 서열번호 118(5' CTTCTTCTATCTACGCATTG 3')에 존재하는 10개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상 또는 16개 이상의 인접 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 서열번호 118의 역 보체는 서열번호 231이다: CAATGCGTAGATAGAAGAAG.
본 발명은 서열번호 231에 대해 상보성인 10개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상 또는 16개 이상의 인접 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 서열번호 67에 존재하는 10개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상 또는 16개 이상의 인접 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 서열번호 86에 존재하는 10개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상 또는 16개 이상의 인접 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 서열번호 73에 존재하는 10개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상 또는 18개 이상의 인접 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 서열번호 186에 대해 상보성인 10개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상 또는 16개 이상의 인접 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 서열번호 205에 대해 상보성인 10개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상 또는 16개 이상의 인접 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 서열번호 192에 대해 상보성인 10개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상 또는 18개 이상의 인접 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 제공한다:
TsTs mCstsastscstsas mcsgscsasTsTsG(서열번호 67,1),
mCsTsTs mCststscstsastscstsas mcsgscsAsT(서열번호 73,1), 및
TsAs mCsTststsasastsasgscsTs mCsAsA(서열번호 86,1)
상기 식에서, 대문자는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 나타내고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드이고, 아래첨자 s는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기를 나타내고, mC는 5 메틸 사이토신 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 나타내고, mc는 5 메틸 사이토신 DNA 뉴클레오시드를 나타낸다.
본 발명은 하기 식의 올리고뉴클레오티드를 제공한다:
TsTs mCstsastscstsas mcsgscsasTsTsG(서열번호 67,1)
상기 식에서, 대문자는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 나타내고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드이고, 아래첨자 s는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기를 나타내고, mC는 5 메틸 사이토신 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 나타내고, mc는 5 메틸 사이토신 DNA 뉴클레오시드를 나타낸다.
본 발명은 하기 식의 올리고뉴클레오티드를 제공한다:
mCsTsTs mCststscstsastscstsas mcsgscsAsT(서열번호 73,1)
상기 식에서, 대문자는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 나타내고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드이고, 아래첨자 s는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기를 나타내고, mC는 5 메틸 사이토신 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 나타내고, mc는 5 메틸 사이토신 DNA 뉴클레오시드를 나타낸다.
본 발명은 하기 식의 올리고뉴클레오티드를 제공한다:
TsAs mCsTststsasastsasgscsTs mCsAsA(서열번호 86,1)
상기 식에서, 대문자는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 나타내고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드이고, 아래첨자 s는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기를 나타내고, mC는 5 메틸 사이토신 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 나타내고, mc는 5 메틸 사이토신 DNA 뉴클레오시드를 나타낸다.
본 발명은은 실시예에 제공된 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 및 상기 올리고뉴클레오티드에 공유결합으로 부착된 하나 이상의 접합체 모이어티를 포함하는 접합체를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 접합체의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.
추가적 양상에서, 본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 접합체 또는 조성물의 효과량을 HTRA1을 발현하는 세포에 투여하는 단계를 포함하는, HTRA1을 발현하는 세포에서 HTRA1 발현을 조절하는 생체내 또는 시험관내 방법을 제공한다.
추가적 양상에서, 본 발명은 치료적 효과량 또는 예방적 효과량의 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 이의 접합체를 HTRA1의 생체내 활성과 연관된 질병, 장애 또는 기능장애를 앓거나 이에 걸리기 쉬운 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, HTRA1의 생체내 활성과 연관된 질병, 장애 또는 기능장애의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
추가적 양상에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 조성물은 황반 변성, 및 HTRA1이 관련된 다른 장애의 치료 또는 예방에 사용된다.
본 발명은 뒤시엔느 근육퇴행위축, 관절염, 예컨대 골관절염, 가족성 허혈성 뇌 소형-혈관 질병, 알츠하이머병 및 파킨슨병으로 이루어진 군으로부터 선택된 질병 또는 장애의 치료에서 사용하기 위한 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 접합체를 제공한다.
본 발명은 황반 변성, 예컨대 습성 또는 건성 연령-관련 황반 변성(예를 들어 wAMD, dAMD, 지도모양위축, 초기 AMD, 중기 AMD) 또는 당뇨병성 망막증의 치료에서 사용하기 위한 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 접합체를 제공한다.
본 발명은 황반 변성, 예컨대 습성 또는 건성 연령-관련 황반 변성(예를 들어 wAMD, dAMD, 지도모양위축, 중기 dAMD) 또는 당뇨병성 망막증의 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 접합체 또는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 뒤시엔느 근육퇴행위축, 관절염, 예컨대 골관절염, 가족성 허혈성 뇌 소형-혈관 질병, 알츠하이머병 및 파킨슨병으로 이루어진 군으로부터 선택된 질병 또는 장애의 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 접합체 또는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 뒤시엔느 근육퇴행위축, 관절염, 예컨대 골관절염, 가족성 허혈성 뇌 소형-혈관 질병, 알츠하이머병 및 파킨슨병으로 이루어진 군으로부터 선택된 질병 또는 장애를 앓는 개체의 치료 방법을 제공하되, 상기 방법은 효과량의 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 접합체 또는 조성물을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 안질환, 예컨대 황반 변성, 예컨대 습성 또는 건성 연령-관련 황반 변성(예를 들어 wAMD, dAMD, 지도모양위축, 중기 dAMD) 또는 당뇨병성 망막증을 앓는 개체의 치료 방법을 제공하되, 상기 방법은 효과량의 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 접합체 또는 조성물을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 안질환, 예컨대 황반 변성, 예컨대 습성 또는 건성 연령-관련 황반 변성(예를 들어 wAMD, dAMD, 지도모양위축, 중기 AMD) 또는 당뇨병성 망막증을 앓는 개체의 치료 방법을 제공하되, 상기 방법은 2개 이상의 투여량의 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 안내 주사로 약 10 내지 200 μg의 투여량으로 투여하는 단계를 포함하되, 연속적인 투여 사이의 투여량 간격은 4주 이상(즉, 투여량 간격은 4주 이상이다) 또는 1개월 이상(즉, 투여량 간격은 1개월 이상이다)이다.
도 1: n=231 HTRA1 LNA 올리고뉴클레오티드의 라이브러리를 U251 세포주에서 5 μM에서 선별하였다. 잔여 HTRA1 mRNA 발현 수준을 qPCR에 의해 측정하고, 대조군(PBS-처리된 세포)의 %로 나타냈다. 위치 53113과 53384 사이에 위치된 n=10 올리고가 비교적 활성이었다.
도 2: n=210 HTRA1 LNA 올리고뉴클레오티드의 라이브러리를 U251 세포주에서 5 μM에서 선별하였다. 잔여 HTRA1 mRNA 발현 수준을 qPCR에 의해 측정하고, 대조군(PBS-처리된 세포)의 %로 나타냈다. 위치 53113과 53384 사이에 위치된 n=33 올리고가 비교적 활성이었다.
도 3: n=305 HTRA1 LNA 올리고뉴클레오티드의 라이브러리를 U251 및 ARPE19 세포주에서 각각 5 및 25 μM에서 선별하였다. 잔여 HTRA1 mRNA 발현 수준을 qPCR에 의해 측정하고, 대조군(PBS-처리된 세포)의 %로 나타냈다. 위치 53113과 53384 사이에 위치된 n=95 올리고가 나머지와 비교하여 비교적 활성이었다.
도 4: 인간 일차 RPE 세포를 LNA 올리고뉴클레오티드로 10일의 처리시 HTRA1 mRNA 수준의 투여량 반응. 스크램블드(Scrambled)는 Htra1 표적 서열에 관련 있지 않은 스크램블드 서열을 갖는 대조군 올리고이다.
도 5: NHP PK/PD 연구, IVT 투여, 25 μg/눈. A) qPCR에 의해 망막에서 측정된 HTRA1 mRNA 수준. B) 올리고 ELISA에 의해 측정된 망막에서 올리고 함량. C) ISH에 의해 실증된 HTRA1 mRNA 수준. D 및 E) IP-MS에 의해 측정된 망막 및 유리체 각각에서 HTRA1 단백질 수준의 정량화. 점은 개별적 동물에 대한 데이터를 보여준다. 오차 막대는 기술 복제물에 대한 표준 오차를 나타낸다(n=3). F 및 G) 웨스턴 블롯(western blot)의해 실증된 망막 및 유리체 각각에서 HTRA1 단백질 수준의 감소.
도 6: 본 발명의 화합물(화합물 번호 67,1). 상기 화합물은 약학 염, 예컨대 나트륨 염 또는 칼륨 염의 형태일 수 있다.
도 7: 본 발명의 화합물(화합물 번호 86,1). 상기 화합물은 약학 염, 예컨대 나트륨 염 또는 칼륨 염의 형태일 수 있다.
도 8: 본 발명의 화합물(화합물 번호 73,1). 상기 화합물은 약학 염, 예컨대 나트륨 염 또는 칼륨 염의 형태일 수 있다.
도 9: 화합물 67,1의 약학 염의 예. M+는 적합한 양이온, 전형적으로 양성 금속 이온, 예컨대 나트륨 또는 칼륨 이온이다. 양이온 대 올리고뉴클레오티드 음이온의 화학양론적 비는 사용되는 양이온의 전하에 좌우될 것이다. 적합하게, 1, 2 또는 3의 양전하를 갖는 양이온(M+, M++ 또는 M+++)이 사용될 수 있다. 예시의 목적을 위해, 이가 양이온(예컨대 Ca2+)과 비교하여, 2배 많은 단일 + 하전된 양이온(일가)(예컨대 Na+ 또는 K+)이 필요하다.
도 10: 화합물 86,1의 약학 염의 예. 양이온 M+에 대한 설명에 대해 도 9의 도면 범례를 참조한다.
도 11: 화합물 73,1의 약학 염의 예. 양이온 M+에 대한 설명에 대해 도 9의 도면 범례를 참조한다.
도 12a: 화합물 번호 15,3 및 17을 시노몰구스 원숭이에게 유리체내 투여하고, 안방수(aqueous humor) 샘플을 주사 후 제3일, 제8일, 제15일 및 제22일에 수집하였다. 희석하지 않은 샘플의 단백질을 페기 수(Peggy Sue) 장치(프로틴 심플(Protein Simple))를 사용하여 모세관 전기영동에 의해 분석하였다. HTRA1을 주문 제작한 다클론 토끼 항혈청을 사용하여 검출하였다. 동물 번호 J60154(비히클), J60158(화합물 번호 15,3) 및 J60162(화합물 번호 17)의 데이터가 제공된다.
도 12b: 신호 강도를 정제된 재조합(S328A 돌연변이체) HTRA1 단백질(오리진(Origene), #TP700208)에 대해 비교하여 정량화하였다. 검량선을 본 도면에 나타냈다.
도 12c 내지 12e: 상부 패널: 개별적 동물의 계산된 HTRA1 안방수 농도를 주사 후 시간에 대해 플롯팅하였다. 하부 패널: 각각의 시점에서 비히클 군에 대한 평균 HTRA1 농도를 결정하고 처리된 동물의 상응하는 상대 농도를 계산하였다. 뚫린 원: 개별적 값, 막힌 원: 제22일의 군 평균 % HTRA1 감소를 나타냈다.
도 13: HTRA1 전사체를 표적화하는 다양한 LNA 분자로 처리된 시노몰구스 원숭이의 안방수(청색 다이아몬드) 또는 망막(적색 사각형)에서 HTRA1 단백질 수준에 대해 플롯팅된 HTRA1 mRNA. 값을 PBS 대조군에 대해 정규화된 평균으로서 나타냈다.
도 14: HTRA1 전사체를 표적화하는 다양한 LNA 분자로 처리된 시노몰구스 원숭이의 안방수의 HTRA1 단백질과 (A) 망막의 HTRA1 단백질 및 (B) 망막의 HTRA1 mRNA의 상관관계. 값을 PBS 대조군에 대해 정규화된 평균으로서 나타냈다.
도 2: n=210 HTRA1 LNA 올리고뉴클레오티드의 라이브러리를 U251 세포주에서 5 μM에서 선별하였다. 잔여 HTRA1 mRNA 발현 수준을 qPCR에 의해 측정하고, 대조군(PBS-처리된 세포)의 %로 나타냈다. 위치 53113과 53384 사이에 위치된 n=33 올리고가 비교적 활성이었다.
도 3: n=305 HTRA1 LNA 올리고뉴클레오티드의 라이브러리를 U251 및 ARPE19 세포주에서 각각 5 및 25 μM에서 선별하였다. 잔여 HTRA1 mRNA 발현 수준을 qPCR에 의해 측정하고, 대조군(PBS-처리된 세포)의 %로 나타냈다. 위치 53113과 53384 사이에 위치된 n=95 올리고가 나머지와 비교하여 비교적 활성이었다.
도 4: 인간 일차 RPE 세포를 LNA 올리고뉴클레오티드로 10일의 처리시 HTRA1 mRNA 수준의 투여량 반응. 스크램블드(Scrambled)는 Htra1 표적 서열에 관련 있지 않은 스크램블드 서열을 갖는 대조군 올리고이다.
도 5: NHP PK/PD 연구, IVT 투여, 25 μg/눈. A) qPCR에 의해 망막에서 측정된 HTRA1 mRNA 수준. B) 올리고 ELISA에 의해 측정된 망막에서 올리고 함량. C) ISH에 의해 실증된 HTRA1 mRNA 수준. D 및 E) IP-MS에 의해 측정된 망막 및 유리체 각각에서 HTRA1 단백질 수준의 정량화. 점은 개별적 동물에 대한 데이터를 보여준다. 오차 막대는 기술 복제물에 대한 표준 오차를 나타낸다(n=3). F 및 G) 웨스턴 블롯(western blot)의해 실증된 망막 및 유리체 각각에서 HTRA1 단백질 수준의 감소.
도 6: 본 발명의 화합물(화합물 번호 67,1). 상기 화합물은 약학 염, 예컨대 나트륨 염 또는 칼륨 염의 형태일 수 있다.
도 7: 본 발명의 화합물(화합물 번호 86,1). 상기 화합물은 약학 염, 예컨대 나트륨 염 또는 칼륨 염의 형태일 수 있다.
도 8: 본 발명의 화합물(화합물 번호 73,1). 상기 화합물은 약학 염, 예컨대 나트륨 염 또는 칼륨 염의 형태일 수 있다.
도 9: 화합물 67,1의 약학 염의 예. M+는 적합한 양이온, 전형적으로 양성 금속 이온, 예컨대 나트륨 또는 칼륨 이온이다. 양이온 대 올리고뉴클레오티드 음이온의 화학양론적 비는 사용되는 양이온의 전하에 좌우될 것이다. 적합하게, 1, 2 또는 3의 양전하를 갖는 양이온(M+, M++ 또는 M+++)이 사용될 수 있다. 예시의 목적을 위해, 이가 양이온(예컨대 Ca2+)과 비교하여, 2배 많은 단일 + 하전된 양이온(일가)(예컨대 Na+ 또는 K+)이 필요하다.
도 10: 화합물 86,1의 약학 염의 예. 양이온 M+에 대한 설명에 대해 도 9의 도면 범례를 참조한다.
도 11: 화합물 73,1의 약학 염의 예. 양이온 M+에 대한 설명에 대해 도 9의 도면 범례를 참조한다.
도 12a: 화합물 번호 15,3 및 17을 시노몰구스 원숭이에게 유리체내 투여하고, 안방수(aqueous humor) 샘플을 주사 후 제3일, 제8일, 제15일 및 제22일에 수집하였다. 희석하지 않은 샘플의 단백질을 페기 수(Peggy Sue) 장치(프로틴 심플(Protein Simple))를 사용하여 모세관 전기영동에 의해 분석하였다. HTRA1을 주문 제작한 다클론 토끼 항혈청을 사용하여 검출하였다. 동물 번호 J60154(비히클), J60158(화합물 번호 15,3) 및 J60162(화합물 번호 17)의 데이터가 제공된다.
도 12b: 신호 강도를 정제된 재조합(S328A 돌연변이체) HTRA1 단백질(오리진(Origene), #TP700208)에 대해 비교하여 정량화하였다. 검량선을 본 도면에 나타냈다.
도 12c 내지 12e: 상부 패널: 개별적 동물의 계산된 HTRA1 안방수 농도를 주사 후 시간에 대해 플롯팅하였다. 하부 패널: 각각의 시점에서 비히클 군에 대한 평균 HTRA1 농도를 결정하고 처리된 동물의 상응하는 상대 농도를 계산하였다. 뚫린 원: 개별적 값, 막힌 원: 제22일의 군 평균 % HTRA1 감소를 나타냈다.
도 13: HTRA1 전사체를 표적화하는 다양한 LNA 분자로 처리된 시노몰구스 원숭이의 안방수(청색 다이아몬드) 또는 망막(적색 사각형)에서 HTRA1 단백질 수준에 대해 플롯팅된 HTRA1 mRNA. 값을 PBS 대조군에 대해 정규화된 평균으로서 나타냈다.
도 14: HTRA1 전사체를 표적화하는 다양한 LNA 분자로 처리된 시노몰구스 원숭이의 안방수의 HTRA1 단백질과 (A) 망막의 HTRA1 단백질 및 (B) 망막의 HTRA1 mRNA의 상관관계. 값을 PBS 대조군에 대해 정규화된 평균으로서 나타냈다.
<정의>
올리고뉴클레오티드
본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 2개 이상의 공유결합으로 연결된 뉴클레오시드를 포함하는 분자로서 당업자에게 일반적으로 이해되는 바와 같이 정의된다. 이러한 공유결합으로 연결된 뉴클레오시드는 또한 핵산 분자 또는 올리고머로서 지칭될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 고상 화학 합성 후에 정제에 의해 실험실에서 통상적으로 제조된다. 올리고뉴클레오티드의 서열을 언급하는 경우, 공유결합으로 연결된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 핵염기 모이어티 또는 이의 변형의 서열 또는 순서를 지칭한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 인공적이고 화학적으로 합성되고 전형적으로 정제되거나 단리된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드
본원에 사용된 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 표적 핵산, 특히 표적 핵산 상의 인접 서열에 혼성화함으로써 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 올리고뉴클레오티드로서 정의된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 본질적으로 이중가닥이 아니고, 이에 따라 siRNA가 아니다. 바람직하게는, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 단일가닥이다.
인접 뉴클레오티드 영역
용어 "인접 뉴클레오티드 영역"은 표적 핵산에 상보성인 올리고뉴클레오티드의 영역을 지칭한다. 이러한 용어는 본원에서 용어 "인접 뉴클레오티드 서열", "인접 핵염기 서열" 또는 "올리고뉴클레오티드 모티프 서열"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드는 인접 뉴클레오티드 영역에 존재한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하고, 추가의 뉴클레오티드, 예를 들어 작용기를 인접 뉴클레오티드 서열에 부착하는 데 사용될 수 있는 뉴클레오티드 연결기 영역을 임의적으로 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 연결기 영역은 표적 핵산에 상보성이지 않거나 상보성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 인접 뉴클레오티드 영역의 뉴클레오티드 사이에 존재하는 뉴클레오시드간 연결기는 모두 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기이다. 일부 실시양태에서, 인접 뉴클레오티드 영역은 하나 이상의 당 변형된 뉴클레오시드를 포함한다.
뉴클레오티드
뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드의 빌딩 블록이고, 본 발명의 목적을 위하여 천연 발생 및 비-천연 발생 뉴클레오티드를 둘 다 포함한다. 천연적으로, 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 및 RNA 뉴클레오티드는 리보스 당 모이어티, 핵염기 모이어티 및 하나 이상의 포스페이트 기(뉴클레오시드에는 부재함)를 포함한다. 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 또한 "단위체" 또는 "단량체"와 상호교환적으로 지칭될 수 있다.
변형된 뉴클레오시드
본원에 사용된 용어 "변형된 뉴클레오시드" 또는 "뉴클레오시드 변형"은, 당 모이어티 또는 (핵)염기 모이어티의 하나 이상의 변형을 도입함으로써, 등가의 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드와 비교하여 변형된 뉴클레오시드를 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드는 변형된 당 모이어티를 포함한다. 용어 "변형된 뉴클레오시드"는 또한 본원에서 용어 "뉴클레오시드 유사체", 변형된 "단위체" 또는 변형된 "단량체"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
변형된 뉴클레오시드간 연결기
용어 "변형된 뉴클레오시드간 연결기"는 2개의 뉴클레오시드를 함께 공유결합으로 커플링시키는, 포스포다이에스터(PO) 연결기 이외의 연결기로서, 당업자에게 일반적으로 이해되는 바와 같이 정의된다. 변형된 뉴클레오시드간 연결기를 갖는 뉴클레오티드는 또한 "변형된 뉴클레오티드"로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드간 연결기는 포스포다이에스터 연결기와 비교하여, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 내성을 증가시킨다. 천연 발생 올리고뉴클레오티드의 경우, 뉴클레오시드간 연결기는 인근 뉴클레오시드 사이에 포스포다이에스터 결합을 생산하는 포스페이트 기를 포함한다. 변형된 뉴클레오시드간 연결기는 생체내 사용을 위해 올리고뉴클레오티드를 안정화시키는 데 특히 유용하고, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 중 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드의 영역에서, 예를 들어 변형된 뉴클레오시드의 영역뿐만 아니라 갭머 올리고뉴클레오티드의 갭 영역 내에서 뉴클레아제 절단에 대해 보호하는 역할을 할 수 있다.
한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 천연 포스포다이에스터로부터, 예를 들어 뉴클레아제 공격에 대해 더욱 내성인 연결기로 변형된 하나 이상의 뉴클레오시드간 연결기를 포함한다. 뉴클레아제 내성은 혈청 중 올리고뉴클레오티드를 항온처리함으로써 또는 뉴클레아제 내성 검정(예컨대, 뱀 독액 포스포다이에스터라제(SVPD))(둘 다 당분야에 널리 공지됨)을 사용함으로써 측정될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 내성을 강화시킬 수 있는 뉴클레오시드간 연결기는 뉴클레아제 내성 뉴클레오시드간 연결기로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 변형된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 비-뉴클레오티드 작용기, 예컨대 접합체에 연결하는 뉴클레오시드가 포스포다이에스터일 수 있음이 인정될 것이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 뉴클레아제 내성 뉴클레오시드간 연결기이다.
일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드간 연결기는 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 RNaseH 모집과 상용성이고, 예를 들어 포스포로티오에이트이다.
일부 실시양태에서, 뉴클레오시드간 연결기는 황(S)을 포함한다(예컨대, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기).
포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기는 뉴클레아제 내성, 이로운 약동학 및 제조 용이성에 기인하여 특히 유용하다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트이다.
핵염기
용어 "핵염기"는 핵산 혼성화에서 수소결합을 형성하는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드에 존재하는 푸린(예컨대, 아데닌 및 구아닌) 및 피리미딘(예컨대, 우라실, 티민 및 사이토신) 모이어티를 포함한다. 본 발명에 있어서, 용어 "핵염기"는 또한 천연 발생 핵염기와 상이할 수 있지만 핵산 혼성화 동안 작용성인 변형된 핵염기를 포함한다. 이러한 맥락에서, "핵염기"는 천연 발생 핵염기, 예컨대 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티미딘, 우라실, 잔틴 및 하이포잔틴, 및 비-천연 발생 변이체를 둘 다 지칭한다. 이러한 변이체는, 예를 들어 문헌[Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055] 및 문헌[Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1]에 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 핵염기 모이어티는 푸린 또는 피리미딘을 변형된 푸린 또는 피리미딘, 예컨대 치환된 푸린 또는 치환된 피리미딘, 예컨대 이소사이토신, 슈도이소사이토신, 5-메틸-사이토신, 5-티오졸로-사이토신, 5-프로핀일-사이토신, 5-프로핀일-우라실, 5-브로모-우라실, 5-티아졸로-우라실, 2-티오-우라실, 2'-티오-티민, 이노신, 다이아미노푸린, 6-아미노푸린, 2-아미노푸린, 2,6-다이아미노푸린 및 2-클로로-6-아미노푸린으로부터 선택되는 핵염기로 바꿈으로써 변형된다.
핵염기 모이어티는 각각의 상응하는 핵염기에 대한 문자 부호, 예컨대 A, T, G, C 또는 U로 표시될 수 있고, 이때 각각의 문자는 임의적으로 균등한 기능의 변형된 핵염기를 포함한다. 예를 들어, 예시적인 올리고뉴클레오티드에서, 핵염기 모이어티는 A, T, G, C 및 5-메틸-사이토신으로부터 선택된다. 임의적으로, LNA 갭머의 경우, 5-메틸-사이토신 LNA 뉴클레오시드가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 5'cg3' 모티프의 사이토신 핵염기는 5-메틸 사이토신이다.
변형된 올리고뉴클레오티드
용어 "변형된 올리고뉴클레오티드"는 하나 이상의 당-변형된 뉴클레오시드 및/또는 변형된 뉴클레오시드간 연결기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 기술한다. 용어 "키메라" 올리고뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오시드를 갖는 올리고뉴클레오티드를 기술하기 위해 문헌에서 사용되는 용어이다.
상보성
용어 "상보성"은 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기-대합을 위한 자격을 기술한다. 왓슨-크릭 염기 쌍은 구아닌(G)-사이토신(C) 및 아데닌(A)-티민(T)/우라실(U)이다. 올리고뉴클레오티드가 변형된 핵염기를 갖는 뉴클레오시드를 포함할 수 있고, 예를 들어 5-메틸 사이토신이 종종 사이토신 대신에 사용되고, 상기 용어 "상보성"은 비-변형된 핵염기와 변형된 핵염기 사이의 왓슨-크릭 염기-대합을 포괄함이 이해될 것이다(예를 들어, 문헌[Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055] 및 문헌[Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1] 참고).
본원에 사용된 용어 "% 상보성"은 소정 위치에서, 별개의 핵산 분자(예컨대, 표적 핵산)의 소정 위치의 인접 뉴클레오티드 서열에 상보성인(즉, 왓슨-크릭 염기 쌍을 형성하는) 핵산 분자(예컨대, 올리고뉴클레오티드) 내의 인접 뉴클레오티드 영역 또는 서열의 %인 뉴클레오티드의 수를 지칭한다. %는 2개의 서열 사이에 쌍을 형성하는 정렬된 염기의 수를 세고, 올리고뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드의 총 수로 나누고, 100을 곱함으로써 계산된다. 이러한 비교에서, 정렬(염기 쌍을 형성)되지 않는 핵염기/뉴클레오티드는 미스매치(mismatch)로 지칭된다.
2개의 서열 사이의 상보성을 언급할 때, 상보성의 결정은 2개의 서열 중 짧은 것의 길이, 예컨대 인접 뉴클레오티드 영역 또는 서열의 길이에 걸쳐 측정되는 것으로 이해될 것이다.
용어 "완전히 상보성"은 100% 상보성을 지칭한다. 미스매치의 % 값 또는 표시의 부재 하에, 상보성은 완전한 상보성을 지칭한다.
동일성
본원에 사용되는 용어 "동일성"은 소정 위치에서, 개별적인 핵산 분자(예를 들어 표적 핵산)의 소정 위치에서 인접 서열에 동일한(즉, 상보성인 뉴클레오시드를 갖는 왓슨-크릭 염기 쌍을 형성하는 이들의 능력의 면에서) 핵산 분자(예컨대, 올리고뉴클레오티드)의 인접 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드(예를 들어 올리고뉴클레오티드)의 수(%)를 지칭한다. %는 동일성은, 2개의 서열 사이에 동정된 정렬된 염기의 수를 세고(갭을 포함함), 올리고뉴클레오티드 내 뉴클레오티드의 총 수로 나누고 100을 곱하여 계산된다. % 동일성 = (매치 x 100)/정렬된 영역의 길이(갭을 포함함).
올리고뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역의 동일성을 결정할 때, 동일성은 인접 뉴클레오티드 영역의 길이에 걸쳐 계산된다. 올리고뉴클레오티드의 전체 인접 뉴클레오티드 서열이 인접 뉴클레오티드 영역인 실시양태에서, 동일성은 이에 따라 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열의 길이에 걸쳐 계산된다. 이와 관련하여, 인접 뉴클레오티드 영역은 기준 핵산 서열의 영역에 동일할 수 있거나, 일부 실시양태에서 전체 기준 핵산과 동일할 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, 기준 서열에 대해 100%의 동일성을 갖는 서열은 동일한 것으로 지칭된다.
예를 들어, 기준 서열은 서열번호 5 내지 111 중 어느 하나로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
그러나, 올리고뉴클레오티드가 인접 뉴클레오티드 영역, 예를 들어 영역 D' 또는 D''를 플랭킹하는 추가적 뉴클레오티드를 포함하는 경우, 동일성을 결정할 때 이들 추가적 플랭킹 뉴클레오티드를 무시할 수 있다. 일부 실시양태에서, 동일성은 전체 올리고뉴클레오티드 서열에 걸쳐 계산될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 5 내지 111로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 동일한 10개 이상의 인접 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 5 내지 111로 이루어진 군으로부터 선택된 서열와 동일한 12개 이상의 인접 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 5 내지 111로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 동일한 13개 이상의 인접 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 5 내지 111로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 동일한 14개 이상의 인접 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 5 내지 111로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 동일한 15개 이상의 인접 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 5 내지 111로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 동일한 16개 이상의 인접 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인접 뉴클레오티드 영역은 서열번호 113 내지 118 또는 서열번호 5 내지 111로 이루어진 군으로부터 선택된 서열의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드, 예컨대 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 인접 뉴클레오티드, 예컨대 12 내지 22개, 예컨대 14 내지 18개의 인접 뉴클레오티드로 이루어지거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 전체 인접 서열은 서열번호의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드, 예컨대 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 인접 뉴클레오티드, 예컨대 12 내지 22개, 예컨대 14 내지 18개의 인접 뉴클레오티드로 이루어지거나 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 인접 서열은 서열번호 119의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드, 예컨대 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 인접 뉴클레오티드, 예컨대 12 내지 22개, 예컨대 14 내지 18개의 인접 뉴클레오티드로 이루어지거나 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 인접 서열은 서열번호 120의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드, 예컨대 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 인접 뉴클레오티드, 예컨대 12 내지 22개, 예컨대 14 내지 18개의 인접 뉴클레오티드로 이루어지거나 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 인접 서열은 서열번호 121의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드, 예컨대 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 인접 뉴클레오티드, 예컨대 12 내지 22개, 예컨대 14 내지 18개의 인접 뉴클레오티드로 이루어지거나 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 인접 서열은 서열번호 122의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드, 예컨대 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 인접 뉴클레오티드, 예컨대 12 내지 22개, 예컨대 14 내지 18개의 인접 뉴클레오티드로 이루어지거나 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 인접 서열은 서열번호 123의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드, 예컨대 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 인접 뉴클레오티드, 예컨대 12 내지 22개, 예컨대 14 내지 18개의 인접 뉴클레오티드로 이루어지거나 이를 포함한다.
본 발명은 서열번호 118(5' CTTCTTCTATCTACGCATTG 3')에 존재하는 10개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상 또는 18개 이상의 인접 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
일부 실시양태에서, 인접 뉴클레오티드 영역은 서열번호 67에 동일한 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 인접 뉴클레오티드을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인접 뉴클레오티드 영역은 서열번호 73에 동일한 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인접 뉴클레오티드 영역은 서열번호 86에 동일한 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명은 11 내지 30개의 뉴클레오티드 길이, 예컨대 12 내지 20개의 뉴클레오티드 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하되, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 5 내지 111로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 동일한 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명은 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하되, 상기 인접 뉴클레오티드 서열은 기준 서열의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드에 걸쳐 서열번호 5 내지 111로 이루어진 군으로부터 선택된 기준 서열에 동일하다.
본 발명은 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하되, 상기 인접 뉴클레오티드 서열은 기준 서열의 12개 이상의 인접 뉴클레오티드에 걸쳐 서열번호 5 내지 111로 이루어진 군으로부터 선택된 기준 서열에 동일하다.
본 발명은 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하되, 상기 인접 뉴클레오티드 서열은 기준 서열의 14개 이상의 인접 뉴클레오티드에 걸쳐 서열번호 5 내지 111로 이루어진 군으로부터 선택된 기준 서열에 동일하다.
본 발명은 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하되, 상기 인접 뉴클레오티드 서열은 기준 서열의 길이에 걸쳐 서열번호 5 내지 111로 이루어진 군으로부터 선택된 기준 서열에 동일하다.
혼성화
본원에 사용된 용어 "혼성화함" 또는 "혼성화하다"는 대향하는 가닥 상의 염기 쌍 사이에 수소결합을 형성하고 이에 의해 듀플렉스를 형성하는 2개의 핵산 가닥(예컨대, 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산)으로 이해되어야 한다. 2개의 핵산 가닥 사이의 결합의 친화도는 혼성화의 강도이다. 이것은 종종 올리고뉴클레오티드의 절반이 표적 핵산과 듀플렉싱된 온도로서 정의되는 용융 온도(Tm)에 의하여 기술된다. 생리학적 조건에서 Tm은 친화도에 엄격히 비례하지는 않는다(문헌[Mergny and Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13:515-537]). 표준 상태 깁스(Gibbs) 자유 에너지 ΔG°는 결합 친화도의 더욱 정확한 표현이고, ΔG°= -RTln(Kd)(이때, R은 기체 상수이고, T는 절대 온도임)에 의해 반응의 해리 상수(Kd)와 관련된다. 따라서, 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이의 반응의 매우 낮은 ΔG°는 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이의 강한 혼성화를 반영한다. ΔG°는 수성 농도가 1 M이고, pH가 7이고, 온도가 37℃인 반응과 연관된 에너지이다. 표적 핵산으로의 올리고뉴클레오티드의 혼성화는 자발적인 반응이고, 자발적인 반응의 경우, ΔG°는 0 미만이다. ΔG°는, 예를 들어, 문헌[Hansen et al., 1965, Chem. Comm. 36-38] 및 문헌[Holdgate et al., 2005, Drug Discov Today]에 기술된 등온 적정 열량계(ITC) 방법을 사용함으로써 실험적으로 측정될 수 있다. 당업자는 시판 중인 장비가 ΔG° 측정에 이용가능함을 알 것이다. ΔG°는 또한 문헌[Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216] 및 문헌[McTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405]에 기술된 대략적으로 유도된 열역학 파라미터를 사용하는 문헌[SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465]에 기술된 최근접 이웃 모델(nearest neighbor model)을 사용함으로써, 수치적으로 추정될 수 있다. 혼성화에 의해 의도된 핵산 표적을 조절할 가능성을 갖기 위하여, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드에 대해 -10 kcal 미만의 추정된 ΔG° 값을 갖는 표적 핵산에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 혼성화의 정도 또는 강도는 표준 상태 깁스 자유 에너지 ΔG°에 의해 측정된다. 올리고뉴클레오티드는 8 내지 30개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드에 대해 -10 kcal 미만, 예컨대 -15 kcal 미만, 예컨대 -20 kcal 미만, 예컨대 -25 kcal 미만의 추정된 ΔG° 값을 갖는 표적 핵산에 혼성화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 -10 내지 -60 kcal, 예컨대 -12 내지 -40 kcal, 예컨대 -15 내지 -30 kcal 또는 -16 내지 -27 kcal, 예컨대 -18 내지 -25 kcal의 추정된 ΔG° 값을 갖는 표적 핵산에 혼성화한다.
표적 서열
올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 분자의 하위-서열에 상보성이거나 이로 혼성화되는 인접 뉴클레오티드 영역을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "표적 서열"은 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역 또는 서열에 상보성인 핵염기 서열을 포함하는 표적 핵산에 존재하는 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 표적 서열은 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역 또는 서열에 상보성인 표적 핵산 상의 영역으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 표적 서열은 단일 올리고뉴클레오티드의 상보성 서열보다 길고, 예를 들어 다수의 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화될 수 있는 표적 핵산의 바람직한 영역을 나타낼 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산, 예컨대 표적 서열에 상보성인 인접 뉴클레오티드 영역을 포함한다.
올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 분자에 존재하는 표적 서열에 상보성이거나 이로 혼성화되는 10개 이상의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함한다. 인접 뉴클레오티드 서열(및, 이에 따라 표적 서열)은 10개 이상의 인접 뉴클레오티드, 예컨대 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22개의 인접 뉴클레오티드, 예컨대 12 내지 22개, 예컨대 14 내지 18개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적 서열은 서열번호 113, 114, 115, 116, 117 및 118로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 내에 존재한다.
표적 세포
본원에 사용된 용어 "표적 세포"는 표적 핵산을 발현하는 세포를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 생체내 또는 시험관내의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 포유류 세포, 예컨대 영장류 세포, 예컨대 원숭이 세포 또는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 망막 세포, 예컨대 망막 색소 상피(PRE) 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 RPE 세포, 양극 세포, 아마크린 세포, 내피 세포, 신경절 세포 및 소교 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 시험관내 평가를 위해, 표적 세포는 일차 세포 또는 주화 세포주, 예컨대 U251 또는 ARPE19일 수 있다.
표적 핵산
본 발명에 따라서, 표적 핵산은 포유류 HTRA1을 암호화하고, 예를 들어 유전자, RNA, mRNA 및 미성숙 mRNA, 성숙 mRNA 또는 cDNA 서열일 수 있는 핵산이다. 따라서, 표적은 HTRA1 표적 핵산으로서 지칭될 수 있다.
적합하게는, 표적 핵산은 HTRA1 단백질, 특히 포유류 HTRA1, 예컨대 인간 HTRA1을 암호화한다(예를 들어, 인간 및 래트 HTRA1에 대한 mRNA 및 미성숙 mRNA 서열을 제공하는 표 1 및 2 참고).
일부 실시양태에서, 표적 핵산은 서열번호 1, 2, 3 및 4 또는 이의 천연 발생 변이체(예컨대, 포유류 HTRA1 단백질을 암호화하는 서열)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
표적 세포는 HTRA1 표적 핵산을 발현하는 세포이다. 바람직한 실시양태에서, 표적 핵산은 HTRA1 mRNA, 예컨대 HTRA1 미성숙 mRNA 또는 HTRA1 성숙 mRNA이다. HTRA1 mRNA의 poly A 테일은 전형적으로 안티센스 올리고뉴클레오티드 표적화에 대해 무시된다.
연구 또는 진단에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 경우, 표적 핵산은 cDNA, 또는 DNA 또는 RNA로부터 유도된 합성 핵산일 수 있다.
표적 서열은 표적 핵산의 하위-서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 영역은 HTRA1 하위-서열, 예컨대 서열번호 113, 114, 115, 116, 117 또는 231로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 완전히 상보성이거나 이에 대해 단지 1 또는 2개의 미스매치를 포함한다.
표적 서열은 표적 핵산의 하위-서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 영역은 HTRA1 하위-서열, 예컨대 서열번호 124 내지 230으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 완전히 상보성이거나 이에 대해 단지 1 또는 2개의 미스매치를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 영역은 HTRA1 하위-서열 서열번호 231에 대해 완전히 상보성이거나 이에 대해 단지 1 또는 2개의 미스매치를 포함한다.
표적 서열 또는 이의 하위-서열에 대한 상보성은 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 영역의 길이에 걸쳐 측정된다.
생체내 또는 시험관내 적용의 경우, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 HTRA1 표적 핵산을 발현하는 세포에서 HTRA1 표적 핵산의 발현을 억제할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 핵염기의 인접 서열은 전형적으로 1 또는 2개의 미스매치를 임의적으로 제외하고, 올리고뉴클레오티드를 임의적인 작용기, 예컨대 접합체, 또는 다른 비-상보성 종결 뉴클레오티드(예컨대, 영역 D')에 연결할 수 있는 뉴클레오티드 기반 연결기 영역을 임의적으로 제외하면서 올리고뉴클레오티드의 길이에 따라 측정된 바와 같이, HTRA1 표적 핵산에 상보성이다. 표적 핵산은, 일부 실시양태에서, RNA 또는 DNA, 예컨대 메신저 RNA, 예컨대 성숙 mRNA 또는 미성숙 mRNA일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 포유류 HTRA1 단백질, 예컨대 인간 HTRA1, 예컨대 인간 HTRA1 미성숙 mRNA 서열, 예컨대 서열번호 1로 개시된 서열(NM_002775.4, GI: 190014575)을 암호화하는 RNA 또는 DNA이다. 예시적인 표적 핵산에 대한 추가 정보는 표 1 및 2에 제공된다.
종 | Chr. | 가닥 | 게놈 좌표 | 어셈블리 | mRNA에 대한 NCBI 기준 서열* 수탁 번호 | |
개시 | 종결 | |||||
인간 |
10 | fwd | 122461525 | 122514908 | GRCh38.p2 release 107 | NM_002775.4 |
시노 |
9 | fwd | 121764994 | 121817518 | Macaca_fascicularis_5.0 | NC_022280.1** |
Fwd = 정방향 가닥. 게놈 좌표는 미성숙 mRNA 서열(게놈 서열)을 제공한다. NCBI 기준은 mRNA 서열(cDNA 서열)을 제공한다. *미국 국립 생물 정보 센터(The National Center for Biotechnology Information) 기준 서열 데이터 베이스는 게놈, 전사체 및 단백질을 비롯한 포괄적이고 통합되고 중복되지 않고 주석이 잘 달린 기준 서열의 집합이다. 이는 웹사이트[www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq]에서 호스팅된다. **NCBI 기준 서열에서, 위치 126 내지 위치 227의 100개의 뉴클레오티드의 스트레치가 존재하고, 이의 동일성은 알려져 있지 않다. 서열번호 3 및 4에서, 상기 스트레치는 이러한 영역에서 인간 및 마카카 물라타(Macaca mulatta) HTRA1 미성숙 mRNA 서열 모두에서 나타나는 뉴클레오티드에 의해 대체되었다. |
종 | RNA 유형 | 길이 (nt) | 서열번호 |
인간 | mRNA | 2138 | 1 |
인간 | 미성숙 mRNA | 53384 | 2 |
시노 | mRNA | 2123 | 3 |
시노 | 미성숙 mRNA | 52575 | 4 |
천연 발생 변이체
용어 "천연 발생 변이체"는 표적 핵산과 동일한 유전자 자리로부터 유래하지만, 예를 들어, 동일한 아미노산을 암호화하는 코돈의 다양성을 야기하는 유전자 코드의 퇴화에 기인하여, 또는 미성숙 mRNA의 대체적인 스플라이싱(splicing), 또는 다형태, 예컨대 단일 뉴클레오티드 다형태, 및 대립형질 변이체의 존재에 기인하여 상이할 수 있는 HTRA1 유전자 또는 전사체의 변이체를 지칭한다. 따라서, 올리고뉴클레오티드에 대한 충분한 상보성 서열의 존재에 근거하여, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 및 이의 천연 발생 변이체를 표적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 천연 발생 변이체는 포유류 HTRA1 표적 핵산, 예컨대 서열번호 1, 2, 3 또는 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적 핵산에 대해 95% 이상, 예컨대 98% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 가진다.
발현의 조절
본원에 사용된 용어 "발현의 조절"은 올리고뉴클레오티드의 투여 전의 HTRA1의 양과 비교될 때 HTRA1의 양을 변화시키는 올리고뉴클레오티드 능력에 대한 전반적인 용어로서 이해되어야 한다. 다르게는, 발현의 조절은 본 발명의 올리고뉴클레오티드가 투여되지 않은 대조군 실험을 참고하여 결정될 수 있다. 조절의 하나의 유형은, 예컨대 mRNA의 분해 또는 전사의 봉쇄에 의해, HTRA1의 발현을 억제하거나 하향-조절하거나 감소시키거나 저해시키거나 제거하거나 중단시키거나 차단시키거나 예방하거나 줄이거나 저하시키거나 회피하거나 종결하는 올리고뉴클레오티드의 능력이다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 HTRA1의 발현을 억제하거나 하향-조절하거나 감소시키거나 저해시키거나 제거하거나 중단시키거나 차단시키거나 예방하거나 줄이거나 저하시키거나 회피하거나 종결할 수 있다.
고친화도 변형된 뉴클레오시드
고친화도 변형된 뉴클레오시드는, 예를 들어 용융 온도(Tm)에 의해 측정시, 올리고뉴클레오티드 내로 혼입될 때, 상보성 표적에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화도를 강화시키는 변형된 뉴클레오티드이다. 본 발명의 고친화도 변형된 뉴클레오시드는 바람직하게는 변형된 뉴클레오시드 당 +0.5 내지 +12℃, 더욱 바람직하게는 +1.5 내지 +10℃, 가장 바람직하게는 +3 내지 +8℃의 용융 온도 증가를 야기한다. 수많은 고친화도 변형된 뉴클레오시드가 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 많은 2' 치환된 뉴클레오시드 및 잠금 핵산(LNA)을 포함한다(예컨대, 문헌[Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443] 및 문헌[Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213] 참고).
당 변형
본 발명의 올리고머는 DNA 및 RNA에서 발견되는 리보스 당 모이어티와 비교시, 변형된 당 모이어티, 즉, 당 모이어티의 변형을 갖는 하나 이상의 뉴클레오시드를 포함할 수 있다.
리보스 당 모이어티의 변형을 갖는 수많은 뉴클레오시드는 주로 올리고뉴클레오티드의 특정 특성, 예컨대 친화도 및/또는 뉴클레아제 내성을 개선할 목적으로 제조되었다.
이러한 변형은, 예컨대, 헥소스 고리(HNA), 리보스 고리 상의 C2와 C4 탄소 사이에 바이라디칼 가교를 전형적으로 갖는 이환형 고리(LNA), 또는 C2와 C3 탄소 사이에 결합이 전형적으로 결핍된 연결되지 않은 리보스 고리(예컨대, UNA)에 의한 치환에 의해, 리보스 고리 구조가 변형된 것들을 포함한다. 다른 당 변형된 뉴클레오시드는, 예를 들어, 바이사이클로헥소스 핵산(국제 공개공보 제2011/017521호) 또는 삼환형 핵산(국제 공개공보 제2013/154798호)을 포함한다. 변형된 뉴클레오시드는 또한, 예를 들어 펩티드 핵산(PNA) 또는 모폴리노 핵산의 경우, 당 모이어티가 비-당 모이어티로 대체되는 뉴클레오시드를 포함한다.
당 변형은 또한 리보스 고리 상의 치환기를 수소 이외의 기, 또는 DNA 및 RNA 뉴클레오시드에서 천연 발견되는 2'-OH 기로 변경함으로써 제조된 변형을 포함한다. 치환기는, 예를 들어 2', 3', 4' 또는 5' 위치에서 도입될 수 있다. 변형된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오시드는 또한 2' 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2' 치환된 뉴클레오시드를 포함한다. 실제로, 2' 치환된 뉴클레오시드를 개발하는 데 많은 초점이 맞춰졌고, 올리고뉴클레오티드 내로 혼입될 때, 강화된 뉴클레오시드 내성 및 강화된 친화도를 갖는 수많은 2' 치환된 뉴클레오시드가 발견되었다.
2' 변형된 뉴클레오시드
2' 당 변형된 뉴클레오시드는 2' 위치에서 H 또는 -OH 이외의 치환기를 갖거나(2' 치환된 뉴클레오시드) 2' 연결된 바이라디칼을 포함하는 뉴클레오시드이고, 2' 치환된 뉴클레오시드 및 LNA(2'-4' 바이라디칼 가교된) 뉴클레오시드를 포함한다. 예를 들어, 2' 변형된 당은 강화된 결합 친화도 및/또는 증가된 뉴클레아제 내성을 올리고뉴클레오티드에 제공할 수 있다. 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드의 예는 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA(MOE), 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA 및 2'-F-ANA 뉴클레오시드이다. 추가 예의 경우, 문헌[Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443], 문헌[Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213], 및 문헌[Deleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937]을 참고한다. 일부 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드가 하기 제시된다:
잠금 핵산 뉴클레오시드(LNA)
LNA 뉴클레오시드는 뉴클레오티드의 리보스 당 고리의 C2'와 C4' 사이에 연결기(바이라디칼 또는 가교로서 지칭됨)를 포함하는 변형된 뉴클레오시드이다. 이러한 뉴클레오시드는 또한 문헌에서 가교된 핵산 또는 이환형 핵산(BNA)으로 지칭된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고머의 변형된 뉴클레오시드 또는 LNA 뉴클레오시드는 하기 화학식 I 또는 II의 일반적인 구조를 가진다:
[화학식 I]
[화학식 II]
상기 식에서,
W는 -O-, -S-, -N(Ra)-, -C(RaRb)-로부터 선택되고, 예컨대, 일부 실시양태에서 -O-이고;
B는 핵염기 모이어티이고;
Z는 인근 뉴클레오시드에 대한 뉴클레오시드간 연결기, 또는 5'-말단 기이고;
Z*는 인근 뉴클레오시드에 대한 뉴클레오시드간 연결기 또는 3'-말단 기이고;
X는 -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)- 및 >C=Z로 이루어진 군으로부터 선택되는 기이고(일부 실시양태에서, X는 -O-, -S-, NH-, NRaRb, -CH2-, CRaRb, -C(=CH2)- 및 -C(=CRaRb)-로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, X는 -O-이다),
Y는 -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)- 및 >C=Z로 이루어진 군으로부터 선택되는 기이거나(일부 실시양태에서, Y는 -CH2-, -C(RaRb)-, -CH2CH2-, -C(RaRb)-C(RaRb)-, -CH2CH2CH2-, -C(RaRb)C(RaRb)C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)- 및 -C(Ra)=N-으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, Y는 -CH2-, -CHRa-, -CHCH3- 및 CRaRb-로 이루어진 군으로부터 선택된다),
-X-Y-는 함께 2가 연결기(또한 라디칼로 지칭됨)이거나, -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)- 및 >C=Z로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 기/원자로 이루어진 2가 연결기이고(일부 실시양태에서, -X-Y-는 -X-CH2-, -X-CRaRb-, -X-CHRa-, -X-C(HCH3)-, -O-Y-, -O-CH2-, -S-CH2-, -NH-CH2-, -O-CHCH3-, -CH2-O-CH2, -O-CH(CH3CH3)-, -O-CH2-CH2-, OCH2-CH2-CH2-, -O-CH2OCH2-, -O-NCH2-, -C(=CH2)-CH2-, -NRa-CH2-, N-O-CH2, -S-CRaRb- 및 -S-CHRa-로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이라디칼이다. 일부 실시양태에서, -X-Y-는 -O-CH2- 또는 -O-CH(CH3)-이다. 이때 Z는 -O-, -S- 및 -N(Ra)-로부터 선택된다);
Ra, 및 존재하는 경우 Rb는 각각 수소, 임의적으로 치환된 C1-6-알킬, 임의적으로 치환된 C2-6-알켄일, 임의적으로 치환된 C2-6-알킨일, 하이드록시, 임의적으로 치환된 C1-6-알콕시, C2-6-알콕시알킬, C2-6-알켄일옥시, 카복시, C1-6-알콕시카보닐, C1-6-알킬카보닐, 폼일, 아릴, 아릴옥시-카보닐, 아릴옥시, 아릴카보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카보닐, 아미노, 모노- 및 다이(C1-6-알킬)아미노, 카바모일, 모노- 및 다이(C1-6-알킬)-아미노카보닐, 아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐, 모노- 및 다이(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐, C1-6-알킬-카보닐아미노, 카브아미도, C1-6-알카노일옥시, 설포노, C1-6-알킬설포닐옥시, 니트로, 아지도, 설파닐, C1-6-알킬티오 및 할로겐으로부터 독립적으로 선택되고, 이때 아릴 및 헤테로아릴은 임의적으로 치환될 수 있고, 2개의 같은자리 치환기 Ra 및 Rb는 함께 임의적으로 치환된 메틸렌(=CH2)을 나타낼 수 있고, 모든 키랄 중심에 대하여, 비대칭 기는 R 또는 S 배향으로 발견될 수 있고;
R1, R2, R3, R5 및 R5*는 수소, 임의적으로 치환된 C1-6-알킬, 임의적으로 치환된 C2-6-알켄일, 임의적으로 치환된 C2-6-알킨일, 하이드록시, C1-6-알콕시, C2-6-알콕시알킬, C2-6-알켄일옥시, 카복시, C1-6-알콕시카보닐, C1-6-알킬카보닐, 폼일, 아릴, 아릴옥시-카보닐, 아릴옥시, 아릴카보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카보닐, 아미노, 모노- 및 다이(C1-6-알킬)아미노, 카바모일, 모노- 및 다이(C1-6-알킬)-아미노카보닐, 아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐, 모노- 및 다이(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐, C1-6-알킬-카보닐아미노, 카브아미도, C1-6-알카노일옥시, 설포노, C1-6-알킬설포닐옥시, 니트로, 아지도, 설파닐, C1-6-알킬티오 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 이때 아릴 및 헤테로아릴은 임의적으로 치환될 수 있고, 2개의 같은자리 치환기는 함께 옥소, 티오옥소, 이미노 또는 임의적으로 치환된 메틸렌을 나타낼 수 있다.
일부 실시양태에서, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸, 및 수소로부터 독립적으로 선택된다.
일부 실시양태에서, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다.
일부 실시양태에서, R1, R2 및 R3은 모두 수소이고, R5 또는 R5*는 또한 수소이고, R5 및 R5* 중 나머지 하나는 수소가 아닌 것, 예컨대 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다.
일부 실시양태에서, Ra는 수소 또는 메틸이다. 일부 실시양태에서, 존재하는 경우, Rb는 수소 또는 메틸이다.
일부 실시양태에서, Ra 및 Rb 중 하나 또는 둘 다는 수소이다.
일부 실시양태에서, Ra 및 Rb 중 하나는 수소이고, 다른 하나는 수소가 아니다.
일부 실시양태에서, Ra 및 Rb 중 하나는 메틸이고, 다른 하나는 수소이다.
일부 실시양태에서, Ra 및 Rb는 둘 다 메틸이다.
일부 실시양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CH2-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제99/014226호, 국제 공개공보 제00/66604호, 국제 공개공보 제98/039352호 및 국제 공개공보 제2004/046160호(모두 본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있고, 베타-D-옥시 LNA 및 알파-1-옥시 LNA 뉴클레오시드로서 공지된 것들을 포함한다.
일부 실시양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -S-CH2-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 티오 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제99/014226호 및 국제 공개공보 제2004/046160호(본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -NH-CH2-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 아미노 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제99/014226호 및 국제 공개공보 제2004/046160호(본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CH2-CH2- 또는 -O-CH2-CH2-CH2-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제00/047599호 및 문헌[Morita et al, Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12 73-76](본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있고, 2'-O-4'C-에틸렌 가교 핵산(ENA)으로 통상적으로 공지된 것들을 포함한다.
일부 실시양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CH2-이고, W는 O이고, R1, R2 및 R3 모두 및 R5 및 R5* 중 하나는 수소이고, R5 및 R5* 중 다른 하나는 수소가 아닌 것, 예컨대 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 5' 치환된 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제2007/134181호(본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CRaRb-이고, 이때 Ra 및 Rb 중 하나 또는 둘 다는 수소가 아닌 것, 예컨대 메틸이고, W는 O이고, R1, R2 및 R3 모두 및 R5 및 R5* 중 하나는 수소이고, R5 및 R5* 중 다른 하나는 수소가 아닌 것, 예컨대 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 비스 변형된 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제2010/077578호(본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 2가 연결기 -O-CH(CH2OCH3)-(2' O-메톡시에틸 이환형 핵산, 문헌[Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81])을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 2가 연결기 -O-CH(CH2CH3)-(2'O-에틸 이환형 핵산, 문헌[Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81])을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CHRa-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 6' 치환된 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제10/036698호 및 국제 공개공보 제07/090071호(둘 다 본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CH(CH2OCH3)-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 또한 당분야에서 환형 MOE(cMOE)로 공지되어 있고, 국제 공개공보 제07/090071호에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 2가 연결기 -O-CH(CH3)-을 나타낸다(R- 또는 S-배열). 일부 실시양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 함께 2가 연결기 -O-CH2-O-CH2-를 나타낸다(문헌[Seth at al., 2010, J. Org. Chem]). 일부 실시양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CH(CH3)-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 6' 메틸 LNA 뉴클레오시드는 당분야에서 cET 뉴클레오시드로 공지되어 있고, 국제 공개공보 제07/090071호(베타-D) 및 국제 공개공보 제2010/036698호(알파-L)(둘 다 본원에 참고로서 혼입됨)에 개시된 바와 같이, (S)cET 또는 (R)cET 입체 이성질체일 수 있다.
일부 실시양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CRaRb-이고, 이때 Ra 및 Rb는 모두 수소가 아니고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 일부 실시양태에서, Ra 및 Rb는 둘 다 메틸이다. 이러한 6' 다이-치환된 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제2009/006478호(본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -S-CHRa-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 6' 치환된 티오 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제11/156202호(본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다. 일부 6' 치환된 티오 LNA 실시양태에서, Ra는 메틸이다.
일부 실시양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -C(=CH2)-C(RaRb)-, 예컨대 -C(=CH2)-CH2- 또는 -C(=CH2)-CH(CH3)-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 비닐 카보 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제08/154401호 및 국제 공개공보 제09/067647호(둘 다 본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -N(-ORa)-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 일부 실시양태에서, Ra는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 또한 N 치환된 LNA로 공지되어 있고, 국제 공개공보 제2008/150729호(본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 함께 2가 연결기 -O-NRa-CH3-을 나타낸다(문헌[Seth at al., 2010, J. Org. Chem]). 일부 실시양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -N(Ra)-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 일부 실시양태에서, Ra는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다.
일부 실시양태에서, R5 및 R5* 중 하나 또는 둘 다는 수소이고, 치환되는 경우, R5 및 R5* 중 다른 하나는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 실시양태에서, R1, R2 및 R3은 모두 수소일 수 있고, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CH2- 및 -O-C(HCRa)-, 예컨대 -O-C(HCH3)-으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 바이라디칼은 -CRaRb-O-CRaRb-, 예컨대 CH2-O-CH2-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 일부 실시양태에서, Ra는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 또한 형태적으로 제한된 뉴클레오티드(CRN)로 공지되어 있고, 국제 공개공보 제2013/036868호(본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 바이라디칼은 -O-CRaRb-O-CRaRb-, 예컨대 O-CH2-O-CH2-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 일부 실시양태에서, Ra는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 또한 COC 뉴클레오티드로 공지되어 있고, 문헌[Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009 37(4), 1225-1238](본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다.
달리 지시되지 않는 한, LNA 뉴클레오시드가 베타-D 또는 알파-L 입체 이성질형일 수 있음이 인정될 것이다.
LNA 뉴클레오시드의 예는 하기 도식 1에 지시된다.
[도식 1]
상기 예에 예시된 바와 같이, 본 발명의 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 중 LNA 뉴클레오시드는 베타-D-옥시-LNA 뉴클레오시드이다.
뉴클레아제 매개된 분해
뉴클레아제 매개된 분해는 상보성 뉴클레오티드 서열과 듀플렉스를 형성할 때, 상보성 뉴클레오티드 서열의 분해를 매개할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산의 뉴클레아제 매개된 분해를 통해 작용할 수 있고, 여기서 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제, 특히 엔도뉴클레아제, 바람직하게는 엔도리보뉴클레아제(RNase), 예컨대 RNase H를 모집할 수 있다. 뉴클레아제 매개된 기전을 통해 작동하는 올리고뉴클레오티드 디자인의 예는 전형적으로 5 또는 6개 이상의 DNA 뉴클레오시드의 영역을 포함하고 친화도 강화 뉴클레오시드, 예를 들어 갭머, 헤드머 및 테일머에 의해 한 측면 또는 양 측면 상에 접하는 올리고뉴클레오티드이다.
RNase H 활성 및 모집
안티센스 올리고뉴클레오티드의 RNase H 활성은 상보성 RNA 분자와의 듀플렉스에서 RNase H를 모집하는 이의 능력을 지칭한다. 국제 공개공보 제01/23613호는 RNase H를 모집하는 능력을 측정하는 데 사용될 수 있는 RNase H 활성을 측정하기 위한 시험관내 방법을 제공한다. 전형적으로, 상보성 표적 핵산 서열과 함께 제공될 때, 시험되는 변형된 올리고뉴클레오티드와 동일한 염기 서열을 갖지만, 올리고뉴클레오티드 내의 모든 단량체 사이에 포스포로티오에이트 연결기를 갖는 DNA 단량체만을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 사용하고, 국제 공개공보 제01/23613호(본원에 참고에 의해 혼입됨)의 실시예 91 내지 95에 제공된 방법을 사용하여 측정된 초기 속도의 5% 이상, 예컨대 10% 이상 또는 20% 초과의 초기 속도(pmol/L/분으로 측정됨)를 가진다면, 올리고뉴클레오티드는 RNase H를 모집할 수 있는 것으로 간주된다.
갭머
본원에 사용된 용어 "갭머"는 하나 이상의 친화도 강화 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 영역에 의해 5' 및 3' 측면(플랭크 또는 윙)에 위치하는 RNase H 모집 올리고뉴클레오티드의 영역(갭)을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 다양한 갭머 디자인이 본원에 기술되어 있다. 헤드머 및 테일머는 하나의 플랭크가 소실되는, 즉 올리고뉴클레오티드의 단부 중 1개만이 친화도 강화 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 RNase H를 모집할 수 있는 올리고뉴클레오티드이다. 헤드머의 경우, 3' 플랭크가 소실되고(즉, 5' 플랭크는 친화도 강화 변형된 뉴클레오시드를 포함함), 테일머의 경우, 5' 플랭크가 소실된다(즉, 3' 플랭크는 친화도 강화 변형된 뉴클레오시드를 포함함).
LNA 갭머
용어 "LNA 갭머"는 하나 이상의 친화도 강화 변형된 뉴클레오시드가 LNA 뉴클레오시드인 갭머 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, LNA 갭머의 LNA 뉴클레오시드는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드 및/또는 6'메틸 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 (S)cET 뉴클레오시드이다.
혼합된 윙 갭머
용어 "혼합된 윙 갭머"는 플랭크 영역이 하나 이상의 LNA 뉴클레오시드 및 하나 이상의 비-LNA 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 하나 이상의 DNA 뉴클레오시드 또는 하나 이상의 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드, 예컨대, 예를 들어, 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA(MOE), 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA 및 2'-F-ANA 뉴클레오시드를 포함하는 LNA 갭머를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 혼합된 윙 갭머는 LNA 뉴클레오시드를 포함하는 하나의 플랭크(예컨대, 5' 또는 3')를 갖고, 다른 플랭크(각각 3' 또는 5')는 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 혼합된 윙 갭머의 LNA 뉴클레오시드는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드 및/또는 6'메틸 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 (S)cET 뉴클레오시드이다.
접합체
본원에 사용된 용어 "접합체"는 비-뉴클레오티드 모이어티(접합체 모이어티 또는 영역 C 또는 제3 영역)에 공유결합으로 연결되는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "접합체"는 비-뉴클레오티드 모이어티(접합체 모이어티 또는 영역 C 또는 제3 영역)에 공유결합으로 연결되는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 모이어티는 단백질, 예컨대 효소, 항체 또는 항체 단편 또는 펩티드; 친유성 모이어티, 예컨대 지질, 인지질 또는 스테롤; 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜; 수용체 리간드; 소분자; 리포터 분자; 및 비-뉴클레오시드성 탄수화물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
연결기
연결기는 하나의 해당 화학적 기 또는 분절을 하나 이상의 공유결합을 통해 다른 해당 화학적 기 또는 분절에 연결하는 2개의 원자 사이의 결합이다. 접합체 모이어티는 직접적으로 또는 연결 모이어티(예컨대, 연결기 또는 테더)를 통해 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 연결기는 제3 영역, 예컨대 접합체 모이어티를 올리고뉴클레오티드에 공유결합으로 연결시키는 역할을 한다(예를 들어 영역 A 또는 C의 말단).
본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 접합체 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 임의적으로 연결기 영역을 포함할 수 있고, 이는 올리고뉴클레오티드와 접합체 모이어티 사이에 위치된다. 일부 실시양태에서, 접합체와 올리고뉴클레오티드 사이의 연결기는 생체절단성이다.
생체절단성 연결기는 포유류 신체 내에서 통상적으로 맞닥뜨리거나 통상적으로 맞닥뜨리는 것과 유사한 조건 하에 절단성 생리학적으로 불안정한 결합을 포함하거나 이로 이루어진다. 생리학적으로 불안정한 연결기가 화학적 변형(예컨대, 절단)을 겪는 조건은 포유류 세포에서 발견되거나 포유류 세포에서 맞닥뜨리는 바와 유사한 pH, 온도, 산화 또는 환원 조건 또는 약품, 및 염 농도와 같은 화학적 조건을 포함한다. 포유류 세포내 조건은 또한 포유류 세포에 통상적으로 존재하는 효소적 활성, 예컨대 단백질 분해 효소 또는 가수분해 효소 또는 뉴클레아제로부터의 효소적 활성의 존재를 포함한다. 한 실시양태에서, 생체절단성 연결기는 S1 뉴클레아제 절단에 민감하다. 바람직한 실시양태에서, 뉴클레아제 민감성 연결기는 2개 이상의 연속적인 포스포다이에스터 연결기, 예컨대 3개 이상 또는 4 또는 5개의 연속적인 포스포다이에스터 연결기를 포함하는 1 내지 10개의 뉴클레오시드, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오시드, 더욱 바람직하게는 2 내지 6개의 뉴클레오시드, 가장 바람직하게는 2 내지 4개의 연결된 뉴클레오시드를 포함한다. 바람직하게는, 뉴클레오시드는 DNA 또는 RNA이다. 포스포다이에스터 함유 생체절단성 연결기는 국제 공개공보 제2014/076195호(본원에 참고에 의해 혼입됨)에 더욱 상세히 기술되어 있고 본원에서 영역 D로서 지칭될 수 있다.
또한, 접합체는 비-생체절단성 연결기를 통해 올리고뉴클레오티드에 연결될 수 있거나, 일부 실시양태에서 접합체는 생체절단성 연결기에 공유결합으로 부착된 비-절단성 연결기를 포함할 수 있다. 연결기는 반드시 생체절단성인 것은 아니나 주로 접합체 모이어티를 올리고뉴클레오티드 또는 생체절단성 연결기에 공유결합으로 연결시킨다. 이러한 연결기는 반복 단위, 예컨대 에틸렌 글리콜, 아미노산 단위 또는 아미노 알킬 기의 쇄 구조 또는 또는 올리고머를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 연결기(영역 Y)는 아미노 알킬, 예컨대 C2-C36 아미노 알킬 기(예를 들어 C6 내지 C12 아미노 알킬 기를 포함함)이다. 일부 실시양태에서, 연결기(영역 Y)는 C6 아미노 알킬 기이다. 접합체 연결기는 아미노 변형된 올리고뉴클레오티드 및 접합체 기 상의 활성화된 에스터 기의 사용에 의해 올리고뉴클레오티드에 통상적으로 부착될 수 있다.
치료
본원에 사용된 용어 "치료"는 존재하는 질병(예컨대, 본원에서 질병 또는 장애로서 지칭됨)의 치료, 및 질병의 방지, 즉 예방 둘 다를 지칭한다. 따라서, 본원에 언급된 치료는, 일부 실시양태에서, 예방적일 수 있다.
<발명의 상세한 설명>
본 발명의 올리고뉴클레오티드
본 발명은 HTRA1의 발현을 억제할 수 있는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 조절은 HTRA1을 암호화하거나 HTRA1의 조절과 관련된 표적 핵산으로 혼성화시킴으로써 달성될 수 있다. 표적 핵산은 포유류 HTRA1 서열, 예컨대 서열번호 1, 2, 3 및 4로 이루어진 군으로부터 선택된 서열일 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 HTRA1, 예컨대 포유류 HTRA1을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적의 발현을 억제하거나 하향-조절함으로써 이를 조절할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 조절은 표적의 정상 발현 수준과 비교하여 20% 이상의 발현의 억제, 예컨대 표적의 정상 발현 수준과 비교하여 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상의 억제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 ARPE-19 세포를 시험관내 사용하여 적어도 60% 또는 70%만큼 HTRA1 mRNA의 발현 수준을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 ARPE-19 세포를 시험관내 사용하여 적어도 60% 또는 70%만큼 HTRA1 mRNA의 발현 수준을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 ARPE-19 세포를 시험관내 사용하여 50% 이상만큼 HTRA1 단백질의 발현 수준을 억제할 수 있다. 적합하게는, 실시예는 HTRA RNA 또는 단백질 억제를 측정하는 데 사용될 수 있는 검정을 제공한다. 표적 조절은 올리고뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열과 표적 핵산 사이의 혼성화에 의해 유발될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이의 미스매치를 포함한다. 미스매치에도 불구하고, 표적 핵산에 대한 혼성화는 HTRA1 발현의 목적 조절을 나타내기에 여전히 충분할 수 있다. 미스매치로부터 야기되는 감소된 결합 친화도는 올리고뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드의 증가된 수 및/또는 표적에 대한 결합 친화도를 증가시킬 수 있는 변형된 뉴클레오시드(예컨대, 올리고뉴클레오티드 서열 내에 존재하는 2' 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 LNA)의 증가된 수에 의해 유리하게 보충될 수 있다.
본 발명의 한 양상은 HTRA1 표적 서열에 90% 이상 상보성인, 예컨대 HTRA1 표적 서열, 예를 들어 서열번호 1, 2, 3 및 4로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산에 완전히 상보성인, 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산의 영역에 90% 이상, 예컨대 91% 이상, 예컨대 92% 이상, 예컨대 93% 이상, 예컨대 94% 이상, 예컨대 95% 이상, 예컨대 96% 이상, 예컨대 97% 이상, 예컨대 98% 이상 또는 100% 상보성인 인접 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열은 표적 핵산의 영역에 완전히 상보성이거나(100% 상보성), 일부 실시양태에서 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이에 1 또는 2개의 미스매치를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 12개 이상의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열은 서열번호 119, 120, 121, 122 또는 123으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열의 영역에 90% 이상 상보성, 예컨대 완전히(또는 100%) 상보성이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 12개 이상의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열은 서열번호 124 내지 230으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열의 영역에 90% 이상 상보성, 예컨대 완전히(또는 100%) 상보성이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 12개 이상의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열은 서열번호 186의 영역에 90% 이상 상보성, 예컨대 완전히(또는 100%) 상보성이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 12개 이상의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열은 서열번호 192의 영역에 90% 이상 상보성, 예컨대 완전히(또는 100%) 상보성이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 12개 이상의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열은 서열번호 205의 영역에 90% 이상 상보성, 예컨대 완전히(또는 100%) 상보성이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 13개 이상의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열은 서열번호 186의 영역에 90% 이상 상보성, 예컨대 완전히(또는 100%) 상보성이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 13개 이상의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열은 서열번호 192의 영역에 90% 이상 상보성, 예컨대 완전히(또는 100%) 상보성이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 13개 이상의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열은 서열번호 205의 영역에 90% 이상 상보성, 예컨대 완전히(또는 100%) 상보성이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 14개 이상의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열은 서열번호 113, 114, 115, 116, 117 및 231로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 완전히(또는 100%) 상보성이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 14개 이상의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열은 서열번호 186의 영역에 90% 이상 상보성, 예컨대 완전히(또는 100%) 상보성이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 14개 이상의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열은 서열번호 192의 영역에 90% 이상 상보성, 예컨대 완전히(또는 100%) 상보성이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 14개 이상의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열은 서열번호 205의 영역에 90% 이상 상보성, 예컨대 완전히(또는 100%) 상보성이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 15개 이상의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열은 서열번호 186의 영역에 90% 이상 상보성, 예컨대 완전히(또는 100%) 상보성이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 15개 이상의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열은 서열번호 192의 영역에 90% 이상 상보성, 예컨대 완전히(또는 100%) 상보성이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 15개 이상의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열은 서열번호 205의 영역에 90% 이상 상보성, 예컨대 완전히(또는 100%) 상보성이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 16개 이상의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열은 서열번호 113, 114, 115, 116, 117 및 231로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 완전히(또는 100%) 상보성이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 16개 이상의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열은 서열번호 186의 영역에 90% 이상 상보성, 예컨대 완전히(또는 100%) 상보성이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 16개 이상, 예컨대 16, 17 또는 18개의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열은 서열번호 192의 영역에 90% 이상 상보성, 예컨대 완전히(또는 100%) 상보성이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 16개 이상의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열은 서열번호 205의 영역에 90% 이상 상보성, 예컨대 완전히(또는 100%) 상보성이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 영역은 서열번호 113, 114, 115, 116, 117 및 231로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 완전히(또는 100%) 상보성이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 영역은 서열번호 124 내지 230으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 완전히(또는 100%) 상보성이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 영역은 서열번호 186에 완전히(또는 100%) 상보성이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 영역은 서열번호 192에 완전히(또는 100%) 상보성이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 영역은 서열번호 205에 완전히(또는 100%) 상보성이다.
올리고뉴클레오티드 모티프 서열은 변형되어 예를 들어 뉴클레아제 내성 및/또는 표적 핵산에 대한 결합 친화도를 증가시킬 수 있는 것으로 이해된다. 변형은 정의 및 "올리고뉴클레오티드 디자인" 섹션에서 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 영역은 표적 핵산의 영역에 대해 완전히 상보성(100% 상보성)이거나, 일부 실시양태에서 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이에 1 또는 2개의 미스매치를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 12개 이상의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열은 표적 핵산 서열에 대해 90% 이상 상보성, 예컨대 완전히(또는 100%) 상보성이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 12개 이상의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5 내지 111로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 100%의 동일성을 가진다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 14개 이상의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5 내지 111로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 100%의 동일성을 가진다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 16개 이상의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5 내지 111로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 100%의 동일성을 가진다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 영역은 서열번호 5 내지 111로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 하기 군 또는 이의 접합체로부터 선택된다(표적 하위-서열이 올리고뉴클레오티드 모티프의 역 보체임에 주의한다):
여기서, 화합물 디자인이라는 제목의 열에서, 대문자는 LNA 뉴클레오시드이고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드이고, 사이토신 뉴클레오시드는 임의적으로 5 메틸 사이토신이고, 뉴클레오시드간 연결기는 80% 이상, 예컨대 90% 이상 또는 100% 변형된 뉴클레오시드간 연결기, 예컨대 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기이다. 일부 실시양태에서, 상기 표의 화합물 디자인 열에서 화합물의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기이다. 모티프 및 표적 하위-서열은 핵염기 서열이다.
본 발명은 하기 올리고뉴클레오티드 또는 이의 접합체를 제공한다:
여기서, 상기 표의 화합물에서, 대문자는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 나타내고, 모든 LNA 사이토신은 5-메틸 사이토신이고(위첨자 m으로 표시됨), 소문자는 DNA 뉴클레오시드를 나타내고, 소문자 c 전의 위첨자 m은 5 메틸 사이토신 DNA 뉴클레오시드를 나타낸다. 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기이다.
올리고뉴클레오티드 디자인
올리고뉴클레오티드 디자인은 올리고뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오시드 당 변형의 패턴을 지칭한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 당 변형된 뉴클레오시드를 포함하고, DNA 또는 RNA 뉴클레오시드를 또한 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 당 변형된 뉴클레오시드 및 DNA 뉴클레오시드를 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드로의 변형된 뉴클레오시드의 혼입은 표적 핵산에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화도를 강화시킬 수 있다. 이러한 경우, 변형된 뉴클레오시드는 친화도 강화 변형된 뉴클레오티드로 언급될 수 있다.
한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 1개 이상의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상 또는 16개 이상의 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 1 내지 10개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2 내지 9개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 3 내지 8개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 4 내지 7개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 6 또는 7개의 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 3개의 유형의 변형(변형된 당, 변형된 핵염기 및 변형된 뉴클레오시드간 연결기) 또는 이들의 조합으로부터 독립적으로 선택된 변형을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2' 당 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-DNA, 아라비노 핵산(ANA), 2'-플루오로-ANA 및 LNA 뉴클레오시드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 2' 당 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 더욱 더 바람직하게는, 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드는 LNA이다.
일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드 중 하나 이상은 잠금 핵산(LNA)이고, 예컨대 변형된 뉴클레오시드 중 2개 이상, 예컨대 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상 또는 8개 이상은 LNA이다. 또 다른 추가적 실시양태에서, 모든 변형된 뉴클레오시드는 LNA이다.
추가 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결기를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 인접 뉴클레오티드 서열 내의 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트 뉴클레오시드간 연결기이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 인접 서열 내의 모든 뉴클레오티드간 연결기는 포스포로티오에이트 연결기이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 2'-MOE-RNA, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 2'-MOE-RNA 뉴클레오시드 단위인 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 변형된 뉴클레오시드 중 하나 이상이 2'-플루오로 DNA이고, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개가 2'-플루오로-DNA 뉴클레오시드 단위이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 LNA 단위, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 LNA 단위, 예컨대 2 내지 6개의 LNA 단위, 예컨대 3 내지 7개의 LNA 단위, 4 내지 8개의 LNA 단위, 또는 3, 4, 5, 6 또는 7개의 LNA 단위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 모든 변형된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 모든 LNA 사이토신 단위는 5-메틸-사이토신이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 영역은 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에서 1개 이상의 LNA 단위 및 3' 말단에서 2개 이상의 LNA 단위를 가진다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 존재하는 모든 사이토신 핵염기는 5-메틸-사이토신이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 LNA 단위 및 하나 이상의 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드를 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 2' 당 변형된 뉴클레오시드 및 DNA 단위 둘 다를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 RNase H를 모집할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 영역은 갭머 올리고뉴클레오티드이다.
갭머 디자인
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 영역은 본원에서 단지 "갭머"로도 지칭되는 갭머 디자인 또는 구조를 가진다. 갭머 구조에서, 올리고뉴클레오티드는 3개 이상의 별개의 구조 영역 5'-플랭크, 갭 및 3'-플랭크, F-G-F'를 '5 -> 3' 방향으로 포함한다. 이러한 디자인에서, 플랭킹 영역 F 및 F'(또한 윙 영역으로 지칭됨)는 영역 G에 인근한 하나 이상의 당 변형된 뉴클레오시드를 포함하고, 일부 실시양태에서 2 내지 7개의 당 변형된 뉴클레오시드의 인접 스트레치 또는 당 변형된 뉴클레오시드 및 DNA 뉴클레오시드의 인접 스트레치(당 변형된 뉴클레오시드 및 DNA 뉴클레오시드를 모두 포함하는 혼합된 윙)를 포함할 수 있다. 결과적으로, 갭 영역에 인근한 5' 플랭킹 영역 및 3' 플랭킹 영역의 뉴클레오시드는 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2' 변형된 뉴클레오시드이다. 갭 영역(G)은, 올리고뉴클레오티드가 HTRA1 표적 핵산과 듀플렉스로 존재할 때 RNase H를 모집할 수 있는 뉴클레오티드의 인접 스트레치를 포함한다. 일부 실시양태에서, 영역 G는 5 내지 16개의 DNA 뉴클레오시드의 인접 스트레치를 포함한다. 갭머 영역 F-G-F'는 HTRA1 표적 핵산에 상보성이고, 따라서 올리고뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역일 수 있다.
영역 G의 5' 및 3' 말단을 플랭킹하는 영역 F 및 F'는 하나 이상의 친화도 강화 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 3' 플랭크는 하나 이상의 LNA 뉴클레오시드, 바람직하게는 2개 이상의 LNA 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 5' 플랭크는 하나 이상의 LNA 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 5' 및 3' 플랭킹 영역 둘 다는 LNA 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 플랭킹 영역 내의 모든 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 다른 실시양태에서, 플랭킹 영역은 LNA 뉴클레오시드 및 다른 뉴클레오시드를 둘 다(예컨대, DNA 뉴클레오시드 및/또는 비-LNA 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2' 치환된 뉴클레오시드) 포함할 수 있다(혼합된 플랭크). 이러한 경우, 갭은 친화도 강화 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 LNA, 예컨대 베타-D-옥시-LNA에 의해 5' 및 3' 말단에서 플랭킹된 5개 이상의 RNase H 모집 뉴클레오시드(예컨대 5 내지 16개의 DNA 뉴클레오시드)의 인접 서열로 정의된다.
영역 F
영역 F(5' 플랭크 또는 5' 윙)는 영역 G의 5' 말단에 부착되고, 하나 이상의 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상 또는 7개 이상의 변형된 뉴클레오시드를 포함하거나 함유하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 영역 F는 1 내지 7개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2 내지 6개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2 내지 5개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2 내지 4개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 1 내지 3개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 1, 2, 3 또는 4개의 변형된 뉴클레오시드를 포함하거나 이로 이루어진다.
한 실시양태에서, 영역 F의 변형된 뉴클레오시드 중 하나 이상 또는 모두는 2' 변형된 뉴클레오시드이다.
추가적 실시양태에서, 영역 F의 2' 변형된 뉴클레오시드 중 하나 이상은 2'-O-알킬-RNA 단위, 2'-O-메틸-RNA, 2'-아미노-DNA 단위, 2'-플루오로-DNA 단위, 2'-알콕시-RNA, MOE 단위, LNA 단위, 아라비노 핵산(ANA) 단위 및 2'-플루오로-ANA 단위로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 영역 F 내의 모든 변형된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 추가 실시양태에서, 영역 F 내의 LNA 뉴클레오시드는 독립적으로 옥시-LNA, 티오-LNA, 아미노-LNA, cET 및/또는 ENA(베타-D 또는 알파-L 배열 또는 이들의 조합임)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 영역 F는 인접 서열의 5' 말단에서 1개 이상의 베타-D-옥시 LNA 단위를 갖는다.
영역 G
영역 G(갭 영역)는 RNaseH를 모집할 수 있는 5 내지 16개의 연속적인 DNA 뉴클레오시드를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 추가 실시양태에서, 영역 G는 RNaseH를 모집할 수 있는 5 내지 12개, 6 내지 10개 또는 7 내지 9개, 예컨대 8개의 연속적인 뉴클레오티드 단위를 포함하거나 함유하거나 이로 이루어진다.
또 다른 추가적 실시양태에서, 영역 G의 하나 이상의 뉴클레오시드 단위는 DNA 뉴클레오시드 단위, 예컨대 4 내지 20개 또는 6 내지 18개의 DNA 단위, 예컨대 5 내지 16개의 DNA 단위이고, 일부 실시양태에서, 영역 G의 모든 뉴클레오시드는 DNA 단위이다.
추가 실시양태에서, 영역 G는 RNase H 절단을 매개할 수 있는, DNA 및 다른 뉴클레오시드의 혼합물로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 영역 G의 뉴클레오시드의 50% 이상이 DNA, 예컨대 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상이 DNA이다.
영역 F'
영역 G의 3' 말단에 부착되는 영역 F'(3' 플랭크 또는 3' 윙)는 하나 이상의 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상 또는 7개 이상의 변형된 뉴클레오시드를 포함하거나 함유하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 영역 F'는 1 내지 7개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2 내지 6개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2 내지 5개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2 내지 4개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 1 내지 3개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 1, 2, 3 또는 4개의 변형된 뉴클레오시드를 포함하거나 이로 이루어진다.
한 실시양태에서, 영역 F'의 변형된 뉴클레오시드 중 하나 이상 또는 모두는 2' 변형된 뉴클레오시드이다.
추가적 실시양태에서, 영역 F'의 2' 변형된 뉴클레오시드 중 하나 이상은 2'-O-알킬-RNA 단위, 2'-O-메틸-RNA, 2'-아미노-DNA 단위, 2'-플루오로-DNA 단위, 2'-알콕시-RNA, MOE 단위, LNA 단위, 아라비노 핵산(ANA) 단위 및 2'-플루오로-ANA 단위로부터 선택된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 영역 F' 내의 모든 변형된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 추가 실시양태에서, 영역 F' 내의 LNA 뉴클레오시드는 독립적으로 옥시-LNA, 티오-LNA, 아미노-LNA, cET 및/또는 ENA(베타-D 또는 알파-L 배열 또는 이들의 조합)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 영역 F'는 인접 서열의 5' 말단에서 하나 이상의 1 베타-D-옥시 LNA 단위를 갖는다.
영역 D, D' 및 D''
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산에 상보성인 인접 뉴클레오티드 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 인접 뉴클레오티드 영역에 대해 5' 및/또는 3'에 위치된 추가적 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 이를 본원에서 영역 D로서 지칭한다. 영역 D' 및 D''는 각각 영역 F의 5' 말단 또는 영역 F'의 3' 말단에 부착될 수 있다. D 영역(영역 D' 또는 D'')은 표적 핵산에 상보성인 인접 뉴클레오티드 서열의 부분을 형성할 수 있거나, 다른 실시양태에서, D 영역은 표적 핵산에 비-상보성이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 인접 뉴클레오티드 영역 및 임의적으로 1 내지 5개의 추가적 5' 뉴클레오티드(영역 D')를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 인접 뉴클레오티드 영역 및 임의적으로 1 내지 5개의 추가적 3' 뉴클레오티드(영역 D'')를 포함하거나 이로 이루어진다.
영역 D' 또는 D"는 독립적으로 표적 핵산에 상보성이거나 비-상보성일 수 있는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가적인 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 관점에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 일부 실시양태에서 추가적인 뉴클레오티드에 의해 5' 및/또는 3' 말단에서 플랭킹되는 표적을 조절할 수 있는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 추가적인 뉴클레오티드는 생체절단성 연결기에 민감한 뉴클레아제로서 역할을 할 수 있고, 따라서 작용기, 예컨대 접합체 모이어티를 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 부착시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가적인 5' 및/또는 3' 말단 뉴클레오티드는 포스포다이에스터 연결기와 연결되고, DNA 또는 RNA일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 추가적인 5' 및/또는 3' 말단 뉴클레오티드는, 예를 들어 뉴클레아제 안정성을 강화시키기 위해 또는 합성의 용이함을 위해 포함될 수 있는 변형된 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 인접 뉴클레오티드 영역에 더하여 영역 D' 및/또는 D"를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 갭머 올리고뉴클레오티드는 하기 구조식으로 표시될 수 있다:
F-G-F'; 특히 F1-7-G4-12-F'1-7
D'-F-G-F', 특히 D'1-3-F1-7-G4-12-F'1-7
F-G-F'-D'', 특히 F1-7-G4-12-F'1-7-D''1-3
D'-F-G-F'-D'', 특히 D'1-3-F1-7-G4-12-F'1-7-D''1-3
제조 방법
추가적 양상에서, 본 발명은 뉴클레오티드 단위를 반응시켜, 올리고뉴클레오티드에 포함되는 공유결합으로 연결된 인접 뉴클레오티드 단위를 형성하는 단계를 포함하는 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 제조 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 방법은 포스포라미다이트 화학물질을 사용한다(예를 들어 문헌[Caruthers et al, 1987, Methods in Enzymology vol. 154, pages 287-313] 참조). 추가적 실시양태에서, 상기 방법은 인접 뉴클레오티드 서열을 접합성 모이어티(리간드)와 반응시키는 단계를 추가로 포함한다. 추가적 양상에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 접합된 올리고뉴클레오티드를 약학적으로 허용되는 희석제, 용매, 담체, 염 및/또는 보조제와 혼합하는 단계를 포함하는, 본 발명의 조성물의 제조 방법이 제공된다.
약학 염
치료로서 사용하기 위해, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 적합한 약학 염, 예컨대 나트륨 또는 칼륨 염으로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 나트륨 염이다.
약학 조성물
추가적 양상에서, 본 발명은 임의의 전술된 올리고뉴클레오티드 및/또는 올리고뉴클레오티드 접합체, 및 약학적으로 허용되는 희석제, 담체, 염 및/또는 보조제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 약학적으로 허용되는 희석제는 포스페이트-완충된 염수(PBS)를 포함하고, 약학적으로 허용되는 염은 비제한적으로 나트륨 및 칼륨 염을 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학적으로 허용되는 희석제는 멸균 포스페이트-완충된 염수이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 약학적으로 허용되는 희석제 중에서 50 내지 300 μM 농도의 용액으로 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 10 내지 1000 μg의 투여량으로 투여된다.
국제 공개공보 제2007/031091호는 약학적으로 허용되는 희석제, 담체 및 보조제의 적합하고 바람직한 예를 제공한다(본원에 참고로 혼입됨). 적합한 투여량, 제형, 투여 경로, 조성, 투여량 형태, 다른 치료제와의 조합, 전구약물 제형이 또한 국제 공개공보 제2007/031091호에 제공되어 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 약학 조성물 또는 제형의 제조를 위해 활성이거나 불활성인 약학적으로 허용되는 물질과 혼합될 수 있다. 조성물 및 약학 조성물의 제조 방법은 투여 경로, 질병의 정도 또는 투여할 양을 포함하는 많은 기준에 좌우된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 전구약물이다. 특히 올리고뉴클레오티드 접합체에 관하여, 접합체 모이어티는 전구약물이 작용 부위, 예를 들어 표적 세포에 전달된 후에 올리고뉴클레오티드로부터 절단된다.
적용례
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 진단, 치료 및 예방을 위한 연구용 시약으로서 사용될 수 있다.
연구에서, 이러한 올리고뉴클레오티드는 세포(예를 들어 시험관내 세포 배양물) 및 실험용 동물에서 HTRA1 단백질의 합성을 특이적으로 조절하여 표적의 기능적 분석 또는 치료적 개입을 위한 표적으로서 이의 유용성의 평가를 가능하게 하는 데 사용될 수 있다. 전형적으로, 표적 조절은 단백질을 생산하는 mRNA를 저하시키거나 억제하여 단백질 형성을 방지함으로써 또는 단백질을 형성하는 유전자 또는 mRNA의 조절자를 저하시키거나 억제함으로써 달성된다.
진단에서, 올리고뉴클레오티드는 노던 블롯팅(northern blotting), 동일반응계 혼성화 또는 유사한 기술에 의해 세포 및 조직에서 HTRA1 발현을 검출하고 정량화하는 데 사용될 수 있다.
치료를 위해, 질병 또는 장애에 걸린 것으로 추정되는 동물 또는 인간을 HTRA1의 발현을 조절함으로써 치료할 수 있다.
본 발명은 치료적 효과량 또는 예방적 효과량의 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물을 질병을 앓거나 질병에 걸리기 쉬운 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질병의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본원에 정의된 올리고뉴클레오티드, 조성물 또는 접합체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물은 전형적으로 효과량으로 투여된다.
또한, 본 발명은 본원에 언급된 장애의 치료용 약제의 제조 또는 본원에 언급된 장애의 치료 방법을 위한 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체의 용도를 제공한다.
본원에 언급된 질병 또는 장애는 HTRA1의 발현과 연관된다. 일부 실시양태에서, 질병 또는 장애는 HTRA1 유전자, 또는 단백질 생산이 HTRA1과 연관되거나 이와 상호작용하는 유전자의 돌연변이와 연관될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 HTRA1 서열의 돌연변이된 형태이고, 다른 실시양태, 표적 핵산은 HTRA1 서열의 조절자이다.
본 발명의 방법은 바람직하게는 HTRA1의 비정상적인 수준 및/또는 활성에 의해 야기되는 질병에 대한 치료 또는 예방에 사용된다.
본 발명은 HTRA1의 비정상적인 수준 및/또는 활성의 치료용 약제의 제조를 위한, 본원에 정의된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 눈 장애, 예컨대 황반 변성(연령-관련 황반 변성(AMD), 예컨대 건성 AMD 또는 습성 AMD를 포함함) 및 당뇨병성 망막증으로부터 선택된 질병 또는 장애의 치료에서 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물은 지도모양위축 또는 중기 dAMD의 치료에서 사용하기 위한 것일 수 있다. 또한, HTRA1은 알츠하이머병 및 파킨슨병에 나타났고, 따라서 일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물은 알츠하이머병 또는 파킨슨병의 치료에서 사용하기 위한 것일 수 있다. 또한, HTRA1은 뒤시엔느 근육퇴행위축, 관절염, 예컨대 골관절염, 가족성 허혈성 뇌 소형-혈관 질병에서 나타났고, 따라서 일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물은 뒤시엔느 근육퇴행위축, 관절염, 예컨대 골관절염, 또는 가족성 허혈성 뇌 소형-혈관 질병의 치료에서 사용하기 위한 것일 수 있다.
투여
본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 약학 조성물은 국소적으로(예컨대 흡입에 의해, 피부, 눈 또는 귀에), 장관내로(예컨대 경구적으로 또는 위장관을 통해) 또는 비경구적으로(예컨대 정맥내, 피하, 근육내, 대뇌내, 뇌실내 또는 경막내) 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 접합체 또는 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입, 경막내 또는 두개내(예를 들어 대뇌내) 또는 심실내 투여를 포함하는 비경구적 경로에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 활성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 정맥내 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 활성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 피하 투여된다.
눈 장애, 예컨대 황반 변성, 예를 들어 AMD(습성 또는 건성)의 치료에서 사용하기 위해, 안내 주사가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 약 10 내지 약 200 μg/눈, 예컨대 약 50 내지 약 150 μg/눈, 예컨대 약 100 μg/눈의 투여량으로 안내 주사를 통해 투여된다. 일부 실시양태에서, 투여량 간격, 즉, 연속적인 투여 사이의 기간은 적어도 1개월에 1회, 예컨대 적어도 2개월에 1회 또는 적어도 3개월에 1회이다.
병용 치료
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물은 또 다른 치료제와 병용 치료에서 사용하기 위한 것이다. 상기 치료제는 예를 들어 전술된 질병 또는 장애를 위한 치료 기준일 수 있다.
<실시예>
재료 및 방법
올리고뉴클레오티드 합성
올리고뉴클레오티드 합성은 일반적으로 당분야에 공지되어 있다. 적용될 수 있는 프로토콜이 후술된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 사용된 장치, 지지체 및 농도에 관하여 방법을 약간 바꿈으로써 생산될 수 있다.
올리고뉴클레오티드를, 올리고메이커(Oligomaker) 48에 대한 포스포라미다이트 접근법을 1 μmol 규모로 사용하여 우리딘 유니버셜 지지체 상에서 합성하였다. 합성의 종료시, 올리고뉴클레오티드를, 60℃에서 5 내지 16시간 동안 수성 암모니아를 사용하여 고체 지지체로부터 절단하였다. 올리고뉴클레오티드를 역상 HPLC(RP-HPLC) 또는 고상 추출에 의해 정제하고, UPLC에 의해 특성규명하였고, 분자 질량을 또한 ESI-MS에 의해 확인하였다.
올리고뉴클레오티드의 신장:
β-시아노에틸-포스포라미다이트(DNA-A(Bz), DNA-G(ibu), DNA-C(Bz), DNA-T, LNA-5-메틸-C(Bz), LNA-A(Bz), LNA-G(dmf) 또는 LNA-T)의 커플링을, 활성화제로서 아세토니트릴 중 DCI(4,5-다이시아노이미다졸)(0.25 M) 및 아세토니트릴 중 5'-O-DMT-보호된 아미다이트(0.1 M)의 용액을 사용하여 수행하였다. 최종 주기를 위해, 목적하는 변형을 갖는 포스포라미다이트, 예컨대 접합체 기를 부착하기 위한 C6 연결기 또는 접합체 기 자체를 사용할 수 있다. 포스포르티오에이트 연결기의 도입을 위한 티올화를, 잔탄 하이드라이드(아세토니트릴/피리딘 9:1 중 0.01 M)를 사용함으로써 수행하였다. 포스포르다이에스터 연결기를, THF/피리딘/물 7:2:1 중 0.02 M 요오드를 사용하여 도입할 수 있다. 나머지 시약은 올리고뉴클레오티드 합성에 전형적으로 사용되는 것이다.
고상 합성 후 접합을 위하여, 상업적으로 입수가능한 C6 아미노 연결기 포스포라미다이트를 고상 합성의 마지막 주기에 사용할 수 있고, 탈보호 및 고체 지지체로부터의 절단 후, 아미노연결되고 탈보호된 올리고뉴클레오티드를 단리하였다. 접합체를, 표준 합성 방법을 사용하는 작용기의 활성화에 의해 도입하였다.
RP-HPLC에 의한 정제:
조질 화합물을 페노메넥스 주피터(Phenomenex Jupiter) C18 10 μ 150 x 10 mm 컬럼 상에서 분취 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 0.1 M 암모늄 아세테이트 pH 8 및 아세토니트릴을 완충제로서 5 mL/분의 유량으로 사용하였다. 수집된 분획을 동결건조하여 정제된 화합물을 전형적으로 백색 고체로서 수득하였다.
약어:
DCI: 4,5-다이시아노이미다졸
DCM: 다이클로로메탄
DMF: 다이메틸폼아미드
DMT: 4,4'-다이메톡시트라이틸
THF: 테트라하이드로퓨란
Bz: 벤조일
Ibu: 이소부티릴
RP-HPLC: 역상 고성능 액체 크로마토그래피
T
m
검정
올리고뉴클레오티드 및 RNA 표적(포스페이트 연결된, PO) 듀플렉스를 500 mL RNase-부재 물 중에서 3 mM까지 희석하고, 500 mL 2x Tm-완충제(200 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 20 mM Na 포스페이트, pH 7.0)와 혼합하였다. 용액을 3분 동안 95℃까지 가열한 후에, 30분 동안 실온에서 어닐링하였다. 듀플렉스 용융 온도(Tm)를, 펠티어(Peltier) 온도 프로그래머 PTP6이 장착된 람다(Lambda) 40 UV/VIS 분광광도계 상에서 PE 템프랩(Templab) 소프트웨어(퍼킨 엘머(Perkin Elmer))를 사용하여 측정하였다. 온도를 20℃에서 95℃까지 상승시키고, 이어서 25℃까지 하락시켜 260 nm에서 흡광도를 기록하였다. 용융 및 어닐링 둘 다의 제1 미분계수 및 국소 최대치를 사용하여 듀플렉스 Tm을 평가하였다.
사용된 올리고뉴클레오티드:
상기 표의 화합물에서: 대문자는 LNA 뉴클레오시드를 나타내고(베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드가 사용되었다), 모든 LNA 사이토신은 5-메틸 사이토신이고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드를 나타내고, 위첨자 m이 선행하는 DNA 사이토신은 5-메틸 C-DNA 뉴클레오시드를 나타낸다. 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기이다. EP16177508.5 및 EP17170129.5에서 화합물 A가 화합물 143,1로 개시되어 있고, 화합물 B가 145,1로 개시되어 있고, 양성 대조군 화합물로서 사용되었다.
실시예 1: 단일 농도에서 U251 세포주에서 LNA 올리고뉴클레오티드의 시험관내 효능 시험
HTRA1에 대한 유망한 "핫스팟(hot spot)" 영역의 동정. HTRA1 LNA 올리고뉴클레오티드의 라이브러리(n=231)를 U251 세포주에서 5 μM에서 6일의 처리에 의해 선별하였다. 이러한 라이브러리로부터, 도 1에 나타낸 바와 같이 위치 53113과 53384 사이에 인간 HTRA1 미성숙 mRNA(서열번호 116 또는 117)를 표적화하는 일련의 활성 올리고뉴클레오티드를 동정하였다.
인간 교아종 U251 세포주를 ECACC로부터 구매하고 공급회사에 의해 권고되는 바와 같이 37℃에서 5% CO2를 함유하는 가습된 항온처리기에서 유지하였다. 검정을 위해, 15000 U251 세포/웰을 결핍 배지(starvation media)(10% 대신에 1% FBS를 함유함을 제외하고 공급회사에 의해 권고되는 바와 같은 배지)에서 96 멀티 웰 플레이트에 시딩하였다. PBS에 용해된 올리고뉴클레오티드의 첨가 전에 세포를 24시간 동안 항온처리하였다. 올리고뉴클레오티드의 농도: 5 μM. 올리고뉴클레오티드 첨가 3 내지 4일 후에, 배지를 제거하고, 새로운 배지(올리고뉴클레오티드를 미함유함)를 첨가하였다. 올리고뉴클레오티드 첨가 6일 후에, 세포를 채취하였다. RNA를 퓨어링크(PureLink) 프로 96 RNA 정제 키트(앰비온(Ambion), 제조회사의 설명서에 따름)를 사용하여 추출하였다. 이어서, cDNA를 M-MLT 역전사 효소, 랜덤 데카머 레트로스크립트(RETROscript), RNase 억제제(앰비온, 제조회사의 설명서에 따름)를 100 mM dNTP 세트 PCR 그레이드(인비트로겐(Invitrogen)) 및 DNase/RNase 자유수(깁코(Gibco))와 함께 사용하여 합성하였다. 유전자 발현 분석을 위해, qPCR을 TagMan 패스트 어드밴스드 마스터 믹스(Fast Advanced Master Mix)(2X)(앰비온)를 더블렉스 셋업으로 사용하여 수행하였다. 하기 TaqMan 프라이머 검정을 qPCR을 위해 사용하였다: HTRA1, Hs01016151_ m1(FAM-MGB) 및 하우스키핑 유전자, TBP, Hs4326322E(VIC-MGB)(라이프 테크놀로지스(Life Technologies)). n= 2 독립적 생물학적 복제물. 표에 잔여 HTRA1 mRNA 발현 수준을 대조군(PBS-처리된 세포)의 %로서 나타냈다.
실시예 2: 단일 농도에서 U251 세포주에서 LNA 올리고뉴클레오티드의 시험관내 효능 시험
실시예 1에 기재된 "핫스팟" 영역 53113 내지 53384를 U251 세포주에서 5 μM에서 선별된 HTRA1 LNA 올리고뉴클레오티드의 새로운 라이브러리(n=210)에서 추가로 입증하였다. n=33 LNA 올리고뉴클레오티드는 위치 53113과 53384 사이의 인간 HTRA1 미성숙 mRNA를 표적화하였고, 이들 올리고는 도 2에 나타낸 바와 같이 나머지와 비교하여 비교적 활성이었다. 검정을 실시예 1에 나타낸 바와 같이 수행하였다. n=2 독립적 생물학적 복제물. 표에 잔여 HTRA1 mRNA 발현 수준을 대조군(PBS-처리된 세포)의 %로서 나타냈다.
실시예 3: 단일 농도에서 U251 및 ARPE19 세포주에서 LNA 올리고뉴클레오티드의 시험관내 효능 시험
실시예 1 및 2에 기재된 "핫스팟" 영역 53113 내지 53384를 U251 및 ARPE19 세포주에서 각각 5 μM 및 25 μM에서 선별된 HTRA1 LNA 올리고뉴클레오티드의 새로운 라이브러리(n=305)에서 추가로 입증하였다. n=95 LNA 올리고뉴클레오티드는 위치 53113과 53384 사이의 인간 HTRA1 미성숙 mRNA를 표적화하였고, 이들 올리고는 도 3에 나타낸 바와 같이 나머지와 비교하여 비교적 활성이었다.
인간 망막 색소 상피 ARPE19 세포주를 ATCC로부터 구매하고 37℃에서 5% CO2를 함유하는 가습된 항온처리기에서 DMEM-F12(시그마(Sigma), D8437), 10% FBS, 1% pen/strep에서 유지하였다. U251 세포주는 실시예 1에 기재되어 있다. 검정을 위해, 2000 U251 또는 ARPE19세포/웰을 공급회사에 의해 권고되는 바와 같이 배양 배지에서 96 멀티 웰 플레이트에 시딩하였다. PBS에 용해된 올리고뉴클레오티드의 첨가 전에 세포를 2시간 동안 항온처리하였다. 올리고의 농도는 각각 U251 및 ARPE19 세포에서 5 및 25 μM이었다. 올리고뉴클레오티드 첨가 4일 후에, 세포를 채취하였다. RNA 추출을 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였고, cDNA 합성 및 qPCR을 qScript XLT 1-단계 RT-qPCR ToughMix Low ROX, 95134-100(퀀타 바이오사이언시즈(Quanta Biosciences))을 사용하여 수행하였다. 하기 TaqMan 프라이머 검정을 U251 및 ARPE19 세포에 대해 더플렉스(douplex) 셋업으로 사용하였다: HTRA1, Hs01016151_m1(FAM-MGB) 및 하우스키핑 유전자, GAPDH, Hs4310884E(VIC-MGB). 모든 프라이머 세트를 라이프 테크놀로지스로부터 구매하였다. n=1 생물학적 복제물. 표에서 상대적 HTRA1 mRNA 발현 수준을 대조군(PBS-처리된 세포)의 %로서 나타냈다.
실시예 4: 투여량 반응 곡선에서 U251 및 ARPE19 세포주에서 선택된 화합물의 시험관내 효력 및 효능 시험
U251 및 ARPE19 세포주는 각각 실시예 1 및 3에 기재되어 있다. U251 검정을 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다. ARPE19 검정을 하기와 같이 수행하였다: 5000 ARPE19 세포/웰을 공급회사에 의해 권고되는 배양 배지에서(10% 대신 5% FBS를 사용함) 96 멀티 웰 플레이트에 시딩하였다. 세포를 PBS에 용해된 올리고뉴클레오티드의 첨가 전에 2시간 동안 항온처리하였다. 올리고뉴클레오티드의 농도: 50 μM에서부터, 하프-로그 희석, 8개의 포인트. 올리고뉴클레오티드의 첨가 4일 후에, 세포를 채취하였다. RNA 추출, cDNA 합성 및 qPCR을 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다. n=2 독립적 생물학적 복제물. 50 μM에서 EC50 값 및 잔여 HTRA1 mRNA 수준을 대조군(PBS)의 %로 표에 나타냈다.
실시예 5: 투여량 반응 곡선에서 U251 및 ARPE19 세포주에서 선택된 화합물의 시험관내 효력 및 효능 시험
검정을 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행하였다. 올리고뉴클레오티드의 농도: 50 μM에서부터, 하프-로그 희석, 8개의 포인트. 각각 U251 및 ARPE19에 대해 n=2 및 n=1 독립적 생물학적 복제물. 50 μM에서 EC50 값 및 잔여 HTRA1 mRNA 수준을 대조군(PBS)의 %로 표에 나타냈다.
실시예 6: 투여량 반응 곡선에서 U251 및 ARPE19 세포주에서 선택된 화합물의 시험관내 효력 및 효능 시험
검정을 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행하였다. 올리고뉴클레오티드의 농도: 50 μM에서부터, 하프-로그 희석, 8개의 포인트. n=2 독립적 생물학적 복제물. 50 μM에서 EC50 값 및 잔여 HTRA1 mRNA 수준을 대조군(PBS)의 %로 표에 나타냈다.
실시예 7: 투여량 반응 곡선에서 U251 세포주에서 선택된 화합물의 시험관내 효력 및 효능 시험
ARPE19 세포주는 실시예 3에 기재되어 있다. 검정을 위해, ARPE19 세포를, 24000 세포/웰로 결핍 배지(10% 대신에 1% FBS를 함유함을 제외하고 공급회사에 의해 권고되는 바와 같은 배지)에서 96 멀티 웰 플레이트에 100 μL에 시딩하였다. PBS에 용해된 올리고뉴클레오티드의 첨가 전에 세포를 2시간 동안 항온처리하였다. 올리고뉴클레오티드의 농도: 50 μM에서부터, 하프-로그 희석, 8개의 포인트. 올리고뉴클레오티드 화합물 첨가 후에 제4일 및 제7일에, 올리고뉴클레오티드를 미함유하는 75 μL의 신선한 결핍 배지를 세포에 첨가하였다(오래된 배지를 제거하지 않음). RNA 추출, cDNA 합성 및 qPCR을 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행하였다. n=2 독립적 생물학적 복제물. 50 μM에서 EC50 값 및 잔여 HTRA1 mRNA 수준을 대조군(PBS)의 %로 표에 나타냈다.
실시예 8: 인간 일차 RPE 세포에서 시험관내 효능 시험
인간 일차 망막 색소 상피(hpRPE) 세포를 사이언셀(Sciencell)(카탈로그 번호 6540)로부터 구매하였다. 검정을 위해, 5000 hpRPE 세포/웰을 배양 배지(EpiCM, 사이언셀 카탈로그 번호 4101)에서 라미닌(Laminin)(라미닌 521, 바이오라미나(BioLamina) 카탈로그 번호 LN521-03) 코팅된 96 멀티 웰 플레이트에 시딩하였다. 이를 상기 배지에 의해 1주일 동안 확대시키고, 하기 배지를 사용하여 2주 동안 분화시켰다: N1 보충물(시그마 카탈로그 번호 N-6530), 글루타민-페니실린-스트렙토마이신(시그마 카탈로그 번호 G-1146), 비-필수 아미노산(NEAA, 시그마 카탈로그 번호 M-7145), 타우린(시그마 카탈로그 번호 T-0625), 하이드로코르티손(시그마 카탈로그 번호 H-03966), 트라이요오도-티로닌(시그마 카탈로그 번호 T-5516) 및 소혈청 알부민(BSA, 시그마 카탈로그 번호 A-9647)으로 보충된 MEM 알파 배지(시그마 카탈로그 번호 M-4526). 세포를 37℃에서 5% CO2를 함유하는 가습된 항온처리기에서 배양하였다.
실험하는 날에, 올리고뉴클레오티드 첨가 전에 세포를 1시간 동안 신선한 분화 배지와 함께 항온처리하였다. 이를 PBS에 용해시키고 제0일 제4일에 세포 상에 적용하였다. 제7일에, 세포를 β-머캅토-에탄올을 함유하는 50 μl의 RLT 완충제(퀴아젠(Qiagen) 카탈로그 번호 79216)에 의해 채취하였다. RNA의 추출을 DNase I 처리(카탈로그 번호 79254; 로트 151042674)를 포함하는 퀴아젠 RNeasy 미니 키트(카탈로그 번호 74104; 로트 151048073)의 이용자 매뉴얼에 따라 수행하였다. RNA 품질 관리를 애질런트(Agilent) 바이오분석기 나노 키트(애질런트; 카탈로그 번호 5067-1511; 로트 1446)에 의해 수행하였다. 전체 RNA의 cDNA로의 역전사(cDNA 합성)를 (랜덤 헥사머 올리고뉴클레오티드를 기반으로 하는) 고용량 cDNA 역전사 키트를 제조회사의 설명서에 따라(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 카탈로그 번호 4368814; 로트 00314158) 사용하여 수행하였다. cDNA 샘플의 측정을 7900HT 실시간 PCR 기기(써모 피셔 사이언티픽) 상에서 384-웰 플레이트 포맷으로 3회 수행하였다. 하기 TaqMan 프라이머 검정을 qPCR을 위해 사용하였다: HTRA1, Hs01016151_m1 and Hs00170197_m1, 하우스키핑 유전자, GAPDH, Hs99999905_m1 및 PPIA, Hs99999904_m1(라이프 테크놀로지스). n=3 생물학적 복제물. 잔여 HTRA1 mRNA 발현 수준을 도 4 및 하기 표에 대조군(PBS)의 %로서 나타냈다.
실시예 9: 시노몰구스 원숭이 생체내 약동학 및 약력학 연구, 21일의 처리, 유리체내(IVT) 주사, 단일 투여량
망막의 mRNA 및 망막 및 유리체의 단백질 수준 둘 다에서 녹 다운(knock down)이 위치 53113과 53384 사이의 인간 HTRA1 미성숙 mRNA의 "핫스팟"을 표적화하는 3개의 HTRA1 LNA 올리고뉴클레오티드에 대해 관찰되었다(도 5 참조).
동물
모든 실험을 시노몰구스 원숭이(Macaca fascicularis)에 대해 수행하였다.
4마리의 동물이 연구의 각각의 군에 포함되었고, 총 20마리였다.
화합물 및 투여 절차
시험 화합물 주사 전에 및 2일 후에 부프레놀핀 진통제를 투여하였다. 동물을 케타민 및 자일라진의 근육내 주사에 의해 마취시켰다. 시험 항목 및 음성 대조군(PBS)을 테트라카인 마취제의 국소 투여 후에 연구 제1일에 마취된 동물의 양쪽 눈에 유리체내 투여하였다(투여 당 50 μL).
안락사
인-라이프 상의 말에(제22일) 모든 원숭이를 펜토바르비탈의 과투여량 복강내 주사에 의해 안락사시켰다.
qPCR에 의한 올리고 함량 측정 및 Htra1 RNA 발현의 정량화
안락사 직후에, 눈 조직을 얼음 위에서 신속하게 주의하여 해부하고 출하 전까지 -80℃에서 저장하였다. 망막 샘플을 700 μL MagNa 퓨어 96 LC RNA 단리 조직 완충제에 용해시키고 프리셀라이즈 에볼루션 균질기(precellys evolution homogenizer)를 사용하여 2 ml 튜브 당 하나의 스테인리스강 비드를 첨가하여(2 x 1,5 min) 균질화시킨 후에, 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 샘플을 13000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 절반을 바이오분석을 위해 한쪽으로 치워 놓고 나머지 절반에 대해 RNA 추출을 바로 진행하였다.
바이오분석을 위해, 샘플을 혼성화 ELISA 방법에 의한 올리고 함량 측정을 위해 10 내지 50배 희석하였다. 비오티닐화된 LNA-포착 프로브 및 다이옥시제닌-접합된 LNA-검출 프로브(둘 다 5xSSCT에서 35 nM, 각각 검출할 LNA 올리고뉴클레오티드 중 하나의 말단에 상보성임)를 희석된 균질물 또는 관련 있는 기준물질과 혼합하고 30분 동안 실온에서 항온처리한 후에, 스트렙타비딘-코팅된 ELISA 플레이트(Nunc 카탈로그 번호 436014)에 첨가하였다.
플레이트를 1시간 동안 실온에서 항온처리하고 2xSSCT(300 mM 염화 나트륨, 30 mM 시트르산 나트륨 및 0,05% v/v 트윈(Tween)-20, pH 7.0)에서 세척하였다. 포착된 LNA 듀플렉스를 알칼리성 포스파타제와 접합된 항-DIG 항체(로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science) 카탈로그 번호 11093274910) 및 알칼리성 포스파타제 기질 시스템(블루 포스(Blue Phos) 기질, KPL 제품 코드 50-88-00)을 사용하여 검출하였다. 올리고 복합체의 양을 바이오테크(Biotek) 판독기 상에서 615 nm에서의 흡광도로서 측정하였다.
RNA 추출을 위해, 세포 RNA 대량 키트(05467535001, 로슈)를 하기 프로그램에 의해 MagNA 퓨어 96 시스템에 사용하였다: DNAse 처리를 포함하여 제조회사의 설명서에 따르는 조직 FF 표준 LV3.1. RNA 품질 관리 및 농도를 Eon 판독기(바이오테크)에 의해 측정하였다. RNA 농도를 샘플에 대해 정규화시키고, 후속적 cDNA 합성 및 qPCR을 qScript XLT 1-단계 RT-qPCR ToughMix Low ROX, 95134-100(퀀타 바이오사이언시즈)을 사용하여 1-단계 반응으로 수행하였다. 하기 TaqMan 프라이머 검정을 싱글플렉스 반응으로 사용하였다: Htra1, Mf01016150_, Mf01016152_m1 및 Rh02799527_m1 및 하우스키핑 유전자, ARFGAP2, Mf01058488_g1 및 Rh01058485_m1, 및 ARL1, Mf02795431_m1(라이프 테크놀로지스). qPCR 분석을 ViiA7 기계(라이프 테크놀로지스) 상에서 실행하였다. 눈/군: n=3 눈. 각각의 눈을 개별적인 샘플로서 처리하였다. 상대적 Htra1 mRNA 발현 수준을 대조군(PBS)의 %로서 나타냈다.
조직학
안구를 제거하고 10% 중성 완충된 포말린에 24시간 동안 고정시키고 다듬고 파라핀에 내장시켰다.
ISH 분석을 위해, 포말린-고정되고 파라핀-내장된 시노 망막 조직 절편(4 μm 두께)을 RNAscope 2.5 VS 프로브- Mmu-HTRA1, REF 486979(어드밴스드 셀 다이아그노스틱 인코포레이티드(Advanced Cell Diagnostics, Inc.))를 사용하여 완전히 자동화된 벤타나 디스커버리(Ventana Dicovery) ULTRA 염색 모듈(절차: mRNA 디스커버리 울트라 레드 4.0 - v0.00.0152)을 사용하여 처리하였다. 사용된 색소원은 패스트레드(Fastred), 헤마톡실린(Hematoxylin) II 대비염색제이다.
플레이트-기반 면역침강 질량 분석(IP-MS) 접근법을 사용한 HTRA1 단백질 정량화
샘플 준비, 망막
프리셀라이즈 24(5500, 15초, 2회의 사이클)를 사용하여 망막을 프로테아제 억제제(Complete EDTA-프리, 로슈)를 갖는 4-부피(w/v)의 RIPA 완충제(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.25% 데옥시콜산, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 밀리포어(Millipore))에 균질화시켰다. 균질물을 원심분리하고(13,000 rpm, 3분), 상청액의 단백질 함량을 결정하였다(피어스(Pierce) BCA 단백질 검정).
샘플 준비, 유리체
유리액(300 μl)을 프로테아제 억제제(Complete EDTA-프리, 로슈)를 갖는 5x RIPA 완충제(최종 농도: 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.25% 데옥시콜산, 1% NP-40, 1 mM EDTA)로 희석하고 프리셀라이즈 24(5500, 15초, 2회의 사이클)를 사용하여 균질화시켰다. 균질물을 원심분리하고(13,000 rpm, 3분), 상청액의 단백질 함량을 결정하였다(피어스 BCA 단백질 검정).
플레이트-기반 HTRA1 면역침강 및 트립신에 의한 소화
96 웰 플레이트(Nunc MaxiSorp)를 항-HTRA1 마우스 단클론성 항체(R&D MAB2916, 50 μl PBS 중에 500 ng/웰)로 코팅하고 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 플레이트를 2회 PBS(200 μl)로 세척하고 PBS 중의 3%(w/v) BSA로 30분 동안 20℃에서 차단시킨 후에, 2회 PBS 세척이 뒤따랐다. 샘플(50 μl PBS 중의 75 μg 망막, 100 μg 유리체)을 무작위화시키고 플레이트에 첨가한 후에, 밤새 4℃에서 진탕기(150 rpm) 상에서 항온처리하였다. 이어서, 플레이트를 2회 PBS로 세척하고 1회 물로 세척하였다. 이어서, 50 mM TEAB 중의 10 mM DTT(30 μl)를 각각의 웰에 첨가한 후에, 1시간 동안 20℃에서 항온처리하여 시스테인 설프히드릴을 환원시켰다. 이어서, 50 mM TEAB 중의 150 mM 요오도아세트아미드(5 μl)를 각각의 웰에 첨가한 후에, 30분 동안 20℃에서 암실에서 항온처리하여 시스테인 설프히드릴을 차단하였다. 10 μl의 소화 용액을 각각의 웰에 첨가한 후에(최종 농도: 1.24 ng/μl 트립신, 20 fmol/μl BSA 펩티드, 26 fmol/μl 동위원소-표지된 HTRA1 펩티드, 1 fmol/μl iRT 펩티드, Biognosys), 밤새 20℃에서 항온처리하였다.
표적화된 질량 분석(선택된 반응 모니터링, SRM)에 의한 HTRA1 펩티드 정량화
질량 분석을 TSQ 퀀티바(Quantiva) 삼중 사극 질량 분석기에 커플링된 얼티메이트(Ultimate) RSLCnano LC(써모 사이언티픽) 상에서 수행하였다. 샘플(20 μL)을 IP에 사용된 96 웰 플레이트로부터 직접 주입하고 5 μL/분으로 6분 동안 로딩 완충제(0.5% v/v 폼산, 2% v/v CAN) 중에 Acclaim Pepmap 100 트랩 컬럼(100 μm x 2 cm, C18, 5 μm, 100 A, 써모 사이언티픽) 상에 적재하였다. 이어서, 펩티드를 250 nL/분의 유속에서 하기 구배를 사용하여 40℃로 가열된 통합된 전자분무 이미터(emitter)를 갖춘 PepMap Easy-SPRAY 분석용 컬럼(75 μm x 15 cm, 3 μm, 100 A, 써모 사이언티픽) 상에서 분해하였다: 6분, 98% 완충제 A(2% ACN, 0.1% 폼산), 2% 완충제 B(ACN + 0.1% 폼산); 36분, 30% 완충제 B; 41분, 60% 완충제 B; 43분, 80% 완충제 B; 49분, 80% 완충제 B; 50분, 2% 완충제 B. TSQ 퀀티바를 하기 파라미터를 사용하여 SRM 모드로 작동시켰다: 사이클 시간, 1.5초; 스프레이 전압, 1800 V; 충돌 기체 압력, 2 mTorr; Q1 및 Q3 분해, 0.7 FWHM; 이온 수송 튜브 온도 300℃. SRM 전이를 HTRA1 펩티드 "LHRPPVIVLQR" 및 내부 표준으로서 사용된 동위원소-표지된 L-[U-13C, U-15N]R) 합성 버전에 대해 획득하였다.
데이터 분석을 스카이라인(Skyline) 버전 3.6을 사용하여 수행하였다.
웨스턴 블롯
0.5 프리셀라이즈 튜브(CK14_0.5ml, 버틴 테크놀로지스(Bertin Technologies))의 절개한 망막 샘플을, 프로테아제 억제제(Complete EDTA-프리 프로테아제-억제제 미니, 11 836 170 001, 로슈)를 갖는 RIPA 용해 완충제(20-188, 밀리포어)에서 용해시키고 균질화시켰다.
유리체 샘플을 0.5 프리셀라이즈 튜브(CK14_0.5ml, 버틴 테크놀로지스)에 첨가하고, 프로테아제 억제제(Complete EDTA-프리 프로테아제-억제제 미니, 11 836 170 001, 로슈)를 갖는 1/4x RIPA 용해 완충제(20-188, 밀리포어)에 용해시키고 균질화시켰다.
샘플(망막 20 μg 단백질, 유리체 40 μg 단백질)을 환원 조건 하에 4 내지 15% 구배 젤(#567-8084 바이오-라드(Bio-Rad)) 상에서 분석하고, 트랜스-블롯 터보(Trans-Blot Turbo) 장치(바이오-라드)를 사용하여 니트로셀룰로스(#170-4159 바이오-라드) 상에 옮겼다.
일차 항체: 토끼 항-인간 HTRA1(SF1)은 일종의 사샤 파우저(Sascha Fauser)(쾰른 대학교)의 기증품인 마우스 항-인간 Gapdh(#98795 시그마-알드리치)였다. 이차 항체: 염소 항-토끼 800CW 및 염소 항-마우스 680RD를 Li-Cor로부터 입수하였다.
블롯을 오디세(Odyssee) CLX(Li-Cor) 상에서 이미지화시키고 분석하였다.
실시예 10: 시노몰구스 원숭이 생체내 평가: 안방수의 HTRA1 단백질 결정 및 망막의 HTRA1 mRNA 및 단백질 억제에 대한 비교
실험 방법론: 상기 실시예를 참조한다. 안방수 샘플을 채취하고, 샘플을 실시예 9의 유리액 샘플에 따라 제조하였다. 시노몰구스 원숭이 안방수 샘플(AH)을 분석 방법론에 따라 크기-기반 분석에 의해 분석하였다: 모세관 전기영동 시스템(페기 수(상표), 프로틴심플).
샘플을 얼음 상에서 해동시키고 희석하지 않은 상태로 사용하였다. 정량화를 위한, 재조합 HTRA1-S328A 돌연변이체(오리진 #TP700208)를 제공업체가 기재한 바와 같이 준비하였다.
일차 토끼 항-인간 HTRA 항체 SF1을 사샤 파우저 교수가 제공해주었고, 1:300 희석하여 사용하였다. 모든 다른 시약을 프로틴심플로부터 입수하였다.
샘플을 12 내지 230 kDa 분리 모듈을 사용하여 이중 검량선을 사용하여 기술적으로 3회 처리하였다. 피크 아래 면적을 Xlfit(IDBS 소프트웨어)를 사용하여 컴퓨터 처리하고 분석하였다.
결과
주의: 도 12 내지 14에 나타낸 화합물 번호는 나머지 실시예와 상이한 넘버링 시스템을 사용한다. 상기 표는 이전 실시예 및 본원 다른 곳에 사용된 것과 비교한 도 12 내지 14에 사용된 넘버링에 대한 설명표를 제공한다.
도 12a는 화합물 B 및 73,1을 투여 받은 원숭이의 안방수의 HTRA1 단백질 수준의 시각화를 보여주되, 샘플은 주사후 제3일, 제8일, 제15일 및 제22일에 채취되었다. 도 12b는 HTRA1 단백질 수준을 계산하는 데 사용된 검량선을 제공한다. 도 12c 내지 12e는 주사 후 시간에 대해 플롯팅된 개별적 동물의 안방수의 계산된 HTRA1 수준을 제공한다.
도 13은 안방수의 HTRA1 단백질 수준과 망막의 HTRA1 mRNA 수준 사이의 직접적 상관관계를 보여준다. 따라서, 안방수 HTRA1 단백질 수준은 HTRA1 망막 mRNA 수준 또는 HTRA1 망막 mRNA 억제에 대한 바이오마커로서 사용될 수 있다.
또한, 도 14는 망막의 HTRA1 단백질 수준과 안방수의 HTRA1 단백질 수준 사이의 상관관계가 존재함을 보여주되, 본 실험에서 상기 상관관계는 망막에서 HTRA1 mRNA 억제와 안방수의 HTRA1 단백질 수준 사이의 상관관계만큼 강하지 않고, 이는 안방수 HTRA1 단백질 수준이 HTRA1 mRNA 길항제에 대한 바이오마커로서 특히 적합함을 시사한다.
SEQUENCE LISTING
<110> F. Hoffmann-La Roche AG
<120> ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES FOR MODULATING HTRA1 EXPRESSION
<130> P34287-WO
<140> PCT/EP2018/064221
<141> 2018-05-30
<150> EP17173964.2
<151> 2017-06-01
<150> EP17209407.0
<151> 2017-12-21
<150> EP17209535.8
<151> 2017-12-21
<160> 231
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2138
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 1
caatgggctg ggccgcgcgg ccgcgcgcac tcgcacccgc tgcccccgag gccctcctgc 60
actctccccg gcgccgctct ccggccctcg ccctgtccgc cgccaccgcc gccgccgcca 120
gagtcgccat gcagatcccg cgcgccgctc ttctcccgct gctgctgctg ctgctggcgg 180
cgcccgcctc ggcgcagctg tcccgggccg gccgctcggc gcctttggcc gccgggtgcc 240
cagaccgctg cgagccggcg cgctgcccgc cgcagccgga gcactgcgag ggcggccggg 300
cccgggacgc gtgcggctgc tgcgaggtgt gcggcgcgcc cgagggcgcc gcgtgcggcc 360
tgcaggaggg cccgtgcggc gaggggctgc agtgcgtggt gcccttcggg gtgccagcct 420
cggccacggt gcggcggcgc gcgcaggccg gcctctgtgt gtgcgccagc agcgagccgg 480
tgtgcggcag cgacgccaac acctacgcca acctgtgcca gctgcgcgcc gccagccgcc 540
gctccgagag gctgcaccgg ccgccggtca tcgtcctgca gcgcggagcc tgcggccaag 600
ggcaggaaga tcccaacagt ttgcgccata aatataactt tatcgcggac gtggtggaga 660
agatcgcccc tgccgtggtt catatcgaat tgtttcgcaa gcttccgttt tctaaacgag 720
aggtgccggt ggctagtggg tctgggttta ttgtgtcgga agatggactg atcgtgacaa 780
atgcccacgt ggtgaccaac aagcaccggg tcaaagttga gctgaagaac ggtgccactt 840
acgaagccaa aatcaaggat gtggatgaga aagcagacat cgcactcatc aaaattgacc 900
accagggcaa gctgcctgtc ctgctgcttg gccgctcctc agagctgcgg ccgggagagt 960
tcgtggtcgc catcggaagc ccgttttccc ttcaaaacac agtcaccacc gggatcgtga 1020
gcaccaccca gcgaggcggc aaagagctgg ggctccgcaa ctcagacatg gactacatcc 1080
agaccgacgc catcatcaac tatggaaact cgggaggccc gttagtaaac ctggacggtg 1140
aagtgattgg aattaacact ttgaaagtga cagctggaat ctcctttgca atcccatctg 1200
ataagattaa aaagttcctc acggagtccc atgaccgaca ggccaaagga aaagccatca 1260
ccaagaagaa gtatattggt atccgaatga tgtcactcac gtccagcaaa gccaaagagc 1320
tgaaggaccg gcaccgggac ttcccagacg tgatctcagg agcgtatata attgaagtaa 1380
ttcctgatac cccagcagaa gctggtggtc tcaaggaaaa cgacgtcata atcagcatca 1440
atggacagtc cgtggtctcc gccaatgatg tcagcgacgt cattaaaagg gaaagcaccc 1500
tgaacatggt ggtccgcagg ggtaatgaag atatcatgat cacagtgatt cccgaagaaa 1560
ttgacccata ggcagaggca tgagctggac ttcatgtttc cctcaaagac tctcccgtgg 1620
atgacggatg aggactctgg gctgctggaa taggacactc aagacttttg actgccattt 1680
tgtttgttca gtggagactc cctggccaac agaatccttc ttgatagttt gcaggcaaaa 1740
caaatgtaat gttgcagatc cgcaggcaga agctctgccc ttctgtatcc tatgtatgca 1800
gtgtgctttt tcttgccagc ttgggccatt cttgcttaga cagtcagcat ttgtctcctc 1860
ctttaactga gtcatcatct tagtccaact aatgcagtcg atacaatgcg tagatagaag 1920
aagccccacg ggagccagga tgggactggt cgtgtttgtg cttttctcca agtcagcacc 1980
caaaggtcaa tgcacagaga ccccgggtgg gtgagcgctg gcttctcaaa cggccgaagt 2040
tgcctctttt aggaatctct ttggaattgg gagcacgatg actctgagtt tgagctatta 2100
aagtacttct tacacattgc aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2138
<210> 2
<211> 53384
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 2
caatgggctg ggccgcgcgg ccgcgcgcac tcgcacccgc tgcccccgag gccctcctgc 60
actctccccg gcgccgctct ccggccctcg ccctgtccgc cgccaccgcc gccgccgcca 120
gagtcgccat gcagatcccg cgcgccgctc ttctcccgct gctgctgctg ctgctggcgg 180
cgcccgcctc ggcgcagctg tcccgggccg gccgctcggc gcctttggcc gccgggtgcc 240
cagaccgctg cgagccggcg cgctgcccgc cgcagccgga gcactgcgag ggcggccggg 300
cccgggacgc gtgcggctgc tgcgaggtgt gcggcgcgcc cgagggcgcc gcgtgcggcc 360
tgcaggaggg cccgtgcggc gaggggctgc agtgcgtggt gcccttcggg gtgccagcct 420
cggccacggt gcggcggcgc gcgcaggccg gcctctgtgt gtgcgccagc agcgagccgg 480
tgtgcggcag cgacgccaac acctacgcca acctgtgcca gctgcgcgcc gccagccgcc 540
gctccgagag gctgcaccgg ccgccggtca tcgtcctgca gcgcggagcc tgcggccaag 600
gtactccgcc gcgctcctgg gcagctcccc actctctcca tcccagctcg gacctgcttc 660
tgcgggactg gtgggcaggt tgaggggcag cgaagcgttg tggggtggcc agggcaactc 720
tcggggacag gcaggtgggc cccggggtgg cggatttccg cgggctgcct cggaaccgag 780
cttcgcgccc agcccggggc cggttctgcg cccagacgat gccagtacgc ccggcctgca 840
ctctggggct cgagacgccg ggcgaccggc catggagtgc cctgagggca accacacagc 900
gcggggaccc caggacaaat aagaggaatg ggggcataaa ggaaggagag aagttcagga 960
ctgggaattg gcgcctcgca gagcggcttc aggaccacaa gaagtcattt cggttgcttt 1020
ttcttctatt tacgtcctcc gtccccttta aaattcactg ctttgatcac gggaccgctc 1080
agtgaaaact gtatgtaact cttttggaaa ggaacagtgt ttgccggccc gccccggagt 1140
ttctccaaaa agtctacccc gagcagggaa cggtttggca ccgctctcgt ttcggcggcg 1200
ttgctgcctg tcttgctttc ctcgttttga gccagcccta caaaaatgaa agtggctcct 1260
tttgaataag ctgaatcggg ctttggatca cgaaatctgc agaggcggag aagggaccgg 1320
gttagtgatg aggaagaagt ctacccctct gttcctacag ccgcacacag gacctgttct 1380
ggcaggggag acggtggtga tgggggaagg agtggaatgg agcaatgtct aactctctcg 1440
cgggaccttc cggagagatg ctcctcatct tcaggcagag gccatgtgga aaaataatat 1500
cgagttcagc agcggccagc cccgcgttgt aggaaccaga cagcggggct tggcagtgcg 1560
cttgggcgca gccgtgccgc tgctgccgga ccccagtgct gcctcctcaa cacgggcagt 1620
gccaggagag gggcataggg gagcacagtg cagagggact ggtctagagt ttactttata 1680
ggaatatggt tcggtgtgac caactagggc ttagcatagt ttggcttacg tggacgggaa 1740
gatgccagag ccgaactggg tgaaattcga gattgcgtat ttcaccaaca caggagcaca 1800
gccctcggga aactcagcct agtcaggcag tagagagttg tcccggagag aagtgatcct 1860
gcagactcga gaaggggcat gatgatagca cacgtctgtt gagcacccag tctgtgtgcc 1920
gggtgtgtta cctctgtgac ctcatttggt caaacgagga ggcagttgct cctctctctc 1980
tctttttttt tcttaagaga cagggtctcc ctctgtcgcc catgctggag tgtagtggtg 2040
tgatcatggc tcactgcagc ctccgacccc tgggctcaat gattctcctg cttcagcctc 2100
ccaagtggct gggactacag gcggatgcca ccacacccag cttctcattc ccgttttaca 2160
gatagcggag ctaaggttga aaaacttgcc caaggtcatt cagctggaat ttaaacccag 2220
acagcctcat tcagaggagt cagcccagca cttaactcca agggtgtggg agaggggtca 2280
ggtgctgtaa atttcctggt gggctggacg tgcatccccc tcagagctgg gaacagcata 2340
cacaaagcct aagacttgtt tggaggtgaa tagatcagtg tggctgggga acgttttggg 2400
agggcagcag gagtgagcca ggctggtggc ccagagtccc agggctgaag aggctggctg 2460
tgccccgtgc cctgtgcgca gatgttcttg aactggagca actcaaagcc tagtgtagtg 2520
tagggctgac ctagcagtgg agtgcggaat gcatccaggg tggagagttt agactactgc 2580
aataatctgg gtgtgaggcg acaacattga aaaagcatgt ttttgtccaa aacaagccag 2640
ctgttactgg tctcgctgtt tgtggtctca tcgcacgggg tcctgagttg ctggcaccat 2700
gcgagccgcc taatttattg ctagtgaggc aagttgctta acaagttttg gagttggctg 2760
agtccctgtg tggaggaaaa caggtccccc attggccatc gggctcacag cgggcccccg 2820
gtgtaccagt gaggggacag ccacagaggg ataagcatgg tggctttgaa aggagggaga 2880
gacagagtgg gtacaatgct tttcttatcc ctccctcctt cttttgcaaa tatttattga 2940
gctctgtagg gtgtctgaca ccgtttgcat gtttgtctgt ctggcacatc ggaggtactt 3000
ggtacgagtg gattagtgaa tgaataaatg aatgaatgaa gacaaacggg aggtgcttgc 3060
gatacacagc cattctgttt ttccttagtg gaaggcactg ctttgctgcg ccccctctct 3120
ggatctcaca ctccaccctt gacttttcgg aggtgtttcc gaggacaggc gcctgggagc 3180
cagcagactt cattcagtcc aagccaggct ccaggactca acagctggtg cccacgggca 3240
ggtcacttga cgtcactgtt aaatgaggtg aattggctgc ctgctctggc tggaagattg 3300
gcgggagagt cactttagct gccatggaca tgagcctttt ctaggggtgc cacttgacta 3360
gaggcctgga gttggagcaa gtcatacacg gatctggaga cagagctctc gaggcaggag 3420
cgggtgctgc gatttcaaat attataaggt ggctttgtct ggggcagagc atgccagggg 3480
atgagaggta gaaatgtcat cagatcaggg gtccccaggg aggtgactag cactttgggt 3540
cacagtagat ctttggatag aggaacatgt caccattcaa aggaaagcac tttcatctgt 3600
aagctgttta ttgaatagac ctcagagaac atctctgctc accgctctgg aaatgaaggc 3660
aaatcatcta tttcagaagt caatgcactg gcagggtttg gatgggaaag tatacaattc 3720
agctagagaa caaagatctg tcatctccag ctgtactggt cagatgatta caaaaaagaa 3780
aggaattgaa atactaatag ggtactaata atgagggcta acatatatgt tgtgcttatt 3840
ctatgccggg tgcatactaa ttcatttgat cctccggaca gtcctatgag tgagtgctgt 3900
agtcttccct gggttacagc tgggcagcta agtcacagag aagtaccttg ctcaggactg 3960
gtggtcccac acaactggat ggagagcctc gttcataacc accatgctgt gctgttgaca 4020
gagcaacaga gattttaaac caaccccagc taagccccag ctaatagctg aaataaacag 4080
ggctccagat ggctgtggct tagagatgga acaggacaga tcacagcctt cactctgcag 4140
gctcaggagc ctgaagacaa ggttgcctcc agttgccgtc agtgcagccc tcactaaaga 4200
aaagcaaaaa gagccgaggg actgtaggaa ggctgtttcc aagccagaga tccagacaaa 4260
ctgctcttga agagagaaag cccttccaga ttcccccatg tcccaaaaga ccagccggga 4320
ttccggacct ctgctaaaac atggacaaga agccaggaac gagacctgaa acagacttcc 4380
caaacagcag aagcctcatc catttctcct gctagtacat cctccaggaa agcccaccct 4440
actccatgca gcagcccaga caagcttgga ggtctgcaag ctgcaggggt gcccagaaac 4500
tccacccctg gaggttttta ggatcgcctg ctcctggtct caccccagag cctctaaagg 4560
cagaggctgt atgtacatac ctggtgaaga accaagggct tagatggttg ctttacttct 4620
tggagccctg gaatgtttgt aaaatttact tttttttttg agacagtgtc tcgttctgtc 4680
gcctacgctg gagtgcagtg gcgcgatctc ggctcactgc aagctccacc tcccgggttc 4740
atgccattct cctgccttag cctccagagt agctgggact acaggcaccc gccaccacgc 4800
ccagctaatt tttttgtatt ttttggtaga gacggggttt caccgtgtta gccaggatgg 4860
tctccatctc ctgaccttgt gatccgcccg ctttggcctc ccaaagtgct gggattacag 4920
gagtgagcca ctgcacccgt gccaaaatgt actttattta ggtgactctt tcgtgggaac 4980
ctcaaacaag caatcattgc tagctgagtg ctgaccctgt actgagctct ggggagacag 5040
ggttgaataa aacaaagtca ctgcccacag gtaacttata ttcaatacaa tgggggaaaa 5100
tacaatcact gcttccctgg ggttgtattt ttccattgtt aaagtgggca gtttgctcga 5160
gagtcatttt cactattggc aattcaaata caccttttgt cagttaaaaa acaagtgtgc 5220
cagggacctg agcttcatct tagggcaggg tgggtggaaa catttgtgag tctccagctt 5280
ttagtcacct gaaacttgga aacttggagg tcttttgagc agtttatgag tctctgcctg 5340
ctctggtcgg ctgccttctt ttattgctct gttggttttg ctaaagagtt aaaatattaa 5400
ggcttcataa aattaggaag ttaacaagct caaaaaccaa gtgtttgagt tacttcattc 5460
cactgagaga gctgtaaatg ggttgcattg gaacttaaaa taactgcatt gagtaagtga 5520
tggtggcggg caccatgagc taactgtggt cagaagcctg atggcctccg ctttggggct 5580
ggattctccg tttggagctg tgtgatcctg gatgagtttc atgccttgga ttcagaaatc 5640
agactttcca tgagcttata tttcaagtga ataaatagct ctggtcaggc ttaatttgaa 5700
gaagaagtaa gcttggcagt gggtgagggt tccttggaag gccaactggg gcggaggggc 5760
tgagggcaag cggctctggc ccttcctggg gtgttacctg accaggtaac agctccctcg 5820
acctctcgga gcctcggcag tgaggggatt gggccagttg atctctgagg ctccttttaa 5880
ctagaatggt ctgggatttt tctaagaaaa caagtctttg aggaggttgt ggtcacctca 5940
ttcctaattt aaagcctggg gaggcttcct tatgagctac ttctttttcc taaattattg 6000
atggttaaag ccaaggctgg catcgaatag atgtgatcca tcttgagcct ggttgctttg 6060
tgtttcagct ttgtactggc tgctgaagtc cccgggagac cacaggggtg acatgttcat 6120
ctccaagaga tgagcttcca cgagactcat accccttgct ccttccctgg ggctccaagg 6180
cctttgggtc atctgaagtg agataccctt gtgtcatttc atcttttcct tctccacctt 6240
ctctgccgtt aaaaaaaaaa gaagaaagag aaaaatccta ttaatagaga aaccgagaag 6300
tgtagccatt ctgaatgtgt ttccaaaagg ctcctggaag tggcatggaa gttacagtga 6360
ttcagcacta cttggtgacg tgtgcctaga accacagggg gacattagcc aggacaacac 6420
gcctcaggac agaagtaagt ggctgcgaag aggcatgtcc atcactgccg gaaagatgca 6480
gagttcagtt tttggagtca gtgctgagag ttccatttct aaattcattc agagcattta 6540
tttaacacct actgtgtgct cagaagtgta tcaggtatgg ggactcagag gtaagggctg 6600
gtggcccctg atctcaaggt actcgtggta gatagtatga tgctcagctt aagggctggg 6660
cttctgaagt cggattgcca ttttctggat gtgtggtgtt tcttgggtga cttcatctct 6720
aagtctcagt ttccccatca gtaagataag agaagtaata gcagatacat acgtagctct 6780
tagggcattg cagaatggaa ggacctcctt atatgaaacg caaagcactg tgcctgatgc 6840
attgctagaa ctcaggcaat attagcgtgt tgtcattgtc atcatcatca tcatcatcat 6900
catcatcatc atcatcatct tcaaggcact gacaaaggag tcagctgtgt gggaggagtg 6960
ctgggacact cttgtctccc tggggatgag gtgggtgggt gggttaggaa atcttcacag 7020
agaaggaggg tgatgtgaga cttctgtccg ggagctgact cggaatttgc catctaatat 7080
gttggaaaag gttctctggg cagaggtatc caaagtcact ttgcctgtca ccctttgagg 7140
tcccagttgt tgcctatatc atgtgaccag tgtgtggctt ctcttgaatt aagagctgca 7200
tgtctggact gcctgggatt ttacagatgt catctcgtta actctccctg gagcttgtga 7260
cacccaggag atggcagttt atagaagccc tggcaccttc ttgaatgatg cttggtttgg 7320
tttctatgca ctgggaattc ctcacaagga aagatttgtc acatcttaag gaaggaaaaa 7380
aaggcaaatt tgggagtcca tggataccct attattttag attccaggac aaattgtcga 7440
ataagcacgt ttcataaaaa caatcctccg cagcatcccg tgacagcagc tggtccctcg 7500
ccacaggata attatgtctc cttgtgcaca caaaagtctc cgagggcata ttgttgtggc 7560
tggagtttct gataatttcc aaattgaaca acctcagtcc taatgagtca gaggcttgtg 7620
caatattttc aaacctcagg aacatctttt tcattagttg tgcaataaag atggtaggcc 7680
tatctctgtg atgagctgtt tttttttctc aaagtttgat gagattcgcc gtagaattcc 7740
ttctcacata gtcttgggca agattttacc cgatcttcca acacatgagt catctcatat 7800
cctgtgacta agaagagctg tctctttggt gccagttttc taagtgcagt caccacttga 7860
tggagacgga tggacacagt tgggattgcc caggcagatg ggcaatcttg ccagctagac 7920
ataggggagg gaagcctcaa tgttcagcgg tcacatctgc ttttctgtgg cacagagtga 7980
gctatacagg aatattgtat tctccaggac agttagggca gtgggaaatg tcatcaaaca 8040
gaacagtgac ccaaagagcc actgccactg ggtgctctgt gggagctggg cactgtgctc 8100
attgtgttat gggccttgct ttgttcttac cttgtagcca cccagagagg cagggcatta 8160
tccttgcttc ctagctgagg ccacagaaga ggctcctaga ggttagctgt aacttgtcca 8220
aggccagcca gtgcaaggag gcagagccag gatttgagcc catgtctgtt tcactcccaa 8280
actattcttc agatttcttt aagtcaagtg ttatttagaa atgttttgtt tattcatcaa 8340
atatttggtg ggtgtttcca gctatctttc tgttattaat ttctagttta attctattgt 8400
gggctgagaa tatattttgt atgatttcta ttctattacg tttgttaggg tgtattttct 8460
ggtctagaat gtggtctgtc ttggtgagtg ttccctgtgt gcttgagagg aatgtgtgtt 8520
ctgtcattgt tgaatggagt gttctataaa tgtcacttag gtctagtgga ttgatagtgc 8580
ggttcaggtc aactgtatcc ttcctgattt tctgcctact gatctatcaa ttcctgaaag 8640
agaagtgttg acgtctcctg agtctattct gaaacactga attgcggtct ccatgatgaa 8700
ccactagagt tagaaaacct gggtcctagc cccatttggg cctttgggat gactcccttc 8760
tgcctcagtt tcctcatcta caacaggggg acaatgatgc tgcctaggag acatcagcag 8820
gatactgtga aagtccagtg gcataagggg tatggaggag cttcgtcaac tcctaaagct 8880
tcagtgctag gaatcctaaa gcattgaaat ccaaagatat aaggaatatg aaggagtttt 8940
gtcaattcct aatgcttcag tgctaggaat cctaaagcat taaagtccaa tgatataagg 9000
aatatgaagg agctttgtca actcctaaag cttcaatgct aggaatccta aagcattgaa 9060
gtccagtgat ataaggaata tgaaggagtt ttatcaactc ccaatgcttc agtgctagga 9120
atcctaaagc actgaagtcc aatgatacaa ggaatatgaa ggagctttgt caactcctaa 9180
agcttcagtg ctttaggagt cctaaagcat tgaagctgta agagattagg acctctagtt 9240
ggcaattcca gactcttcca ggactcctga tagagccaac accaagaata gtgaagccag 9300
aaggatggaa atagtaaaat gcctcctggg tgtcaaagca tgggtctcct ctgggcatgt 9360
tctcttgtcc tactgagaca tgatagctct tggccaaagt gactgaactt gaccctctgt 9420
ttcaggaagg ccaaatgcag ggttcactac catcatgtcc aagggcagat gcgttggtcc 9480
agaacatcag catcccaatc attataccaa gcaaacagcc gtctctgcct gcaccgtgga 9540
gagcacacgc tcctcctggg gtggcctgca tcctgtgttc ttctcaggcc gactttctgt 9600
ttaatgtttg ctggtcagga aatggcctga gctgaggttc ttcagatccc agtctgacct 9660
ttctccacca gcatttgtgg ctctgaaaaa tatagcccag tgtggtttag ccccactgga 9720
tgaaacccag taggaaaagt ctgataatag cagaagacgc acaggaggaa gagtgaggat 9780
ttgagagcat ctgggaagga ccatgtgcct ggatatcgtt ctgtctgtgg gattctgtga 9840
cacttgtcat ttacagtctg ttcccatgga attctcatca ttggccaaac atatagtcct 9900
tctgtcctct gaaaaatatc attctgctcc gacctttcac acccatctct gaccacatca 9960
actccctgtt tgcatgcatc ttgtggatga aggacaccac tttacctgta aagacactgg 10020
tggcttccca aagccaccaa ctgacttgta gagaagacag aatcccagag tatgaaacct 10080
gagggtgaag ggtcctggca ggtcctagag ctcaaccctt cacttcacag gtggggaaac 10140
tgagggagcc aatgggaaca tgactctcac aagctgcaca gctcatctgt aggggccagt 10200
gtggagtctg tttgtcctga gacccagggc tgagcctttg agccctccgc atctcagccg 10260
catcctcctg ttggagcagt taggtgtttg ggagaggcca cggtccatgc tcatggtttt 10320
cctgtaaggc tggagaaaca ggccttgttc ccttagtctc tctaatcaaa atgaggttgc 10380
agaaaaccct tctccctact tctccctaaa ataatttcct tgggttagaa gatgactaaa 10440
agactattca tccgatgact gatgtctccc ttcaagagtt ataagcacat ataaatgcct 10500
ttgaatggta attataataa ttttgctgaa gggaaaatat cagtataaat atcatggtgg 10560
acacatggaa tgaggactga gatgctttca tgtcttttca gctgtggtta gattttcttt 10620
aagcagaata tacaagtttt tcctctccta gcataaggac tctttttttt tgtatctttt 10680
ctctctactt tttagacatg atggaaaatg catttataca tttgatgaca tattgtacta 10740
tctcagttgt ttaaaattat aaatgtaatt taatcatatg aaaaattaag aaaagaagat 10800
tcatatttca ccatcatctc cccagaaata tcatttcttt attactatta ttattattat 10860
tattattatt attattatta ttattatttt gagacagggt cttgctccat cacccaggct 10920
ggagtaaggg gcacgatctt gactccctgc aacctccacc tcccaggttc aagcagttct 10980
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cgctgacaga cctgcccagt ttcttagctc atcccggcct ccatcctggt gagcagacac 16500
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gcacagcttg ccttggctgg agtatgcact gttctggcat tgcagagagg atgggtacct 16800
tgcctccctg caggtggggg actgtatcag cccccgcaga ctgctcctgg gctcctgagt 16860
ttgacagatt tttttttttt ttttttgaga cggactctca ctctgttgcc caggctggag 16920
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gctgtgcctg ttttaatgct ctgctgttgc tctcttgaga ttcttaataa tttttgaaca 17400
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ctgcgttctg ttttccaaat tagctctacg tatcaactca gctgagaaat tggaagcggg 17640
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ccgagtgtga agcatgttcc cacaatggtg tgggctgcgg ggggctggag gctggctgag 17760
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<212> DNA
<213> Macaca fascicularis
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acgtagcgcc cccaaagccg aggctgcatg cacagacctc ccctcccttc tcgtggtggg 38640
cccctgcttg gattcttccc aaacttctcc tttgccctgc tctgtgttat acccactctg 38700
gtcccctgtc cctgtggagt gatccagggc acaaggacag ctgtttcact gctggccgct 38760
gtgtaccccg agcatctggg aggtggggag cgggctgggg agaagaacac ctggagcgga 38820
ggttgggatc agggagggcc gcagtcccgg taccaccacc acctgctgtg ggacctgcag 38880
tctcctcatc agcagaacag ctgtgaagcc atcctgcccg tccacagggt ggtgggttgt 38940
gaaggctgca tacctggcag agctggagaa gctctgggga gatgctggac atgcacgcta 39000
ggagtggttt ccctgccttg cccagactct gctcccatca cctgaacctc cctgtcacca 39060
ccacggaact gctgtgacca ttgctttctt cttaagcaga ttaacagaca tctcctgccc 39120
caccccgcca aacaaacaaa tgaacaaaca aaaaacgtgc ttgaaggagt atgaacttat 39180
acagtctttt ctaaacactg ttaagtgctg gtattgggat cttcttttaa aatgaaccat 39240
attccccagg ctttggatga cactcatggt tgcccaccct ccaacttcct tccctgctgg 39300
cagaaccctg ggtttgtttt cgttccaccc ccgaccccac tgcattcctg actcaggcaa 39360
atctgcaggg tccagtgcag tcagggggcc acgttccctc ctccaacggg tgctgaggtc 39420
gctgcttgat tggatgctgc tgatgacctg cgaggaggag ggcgccaggg cacttttggg 39480
actttgctct tctgaagaga tgcttccaca gcacggtcgc agtcacgtct tgatgtgatg 39540
tctggaatgg tggtggccgt cttgtggctg tgagaacagg ctgaggttga ttggatggaa 39600
ggaaggaagg atccttgttc ttgacactgt ctgtgagcct tcaggttatc gccctggcac 39660
cacccagccc ttggagtaga cacctgtcta ctctacatac tccatttgga gttgggtttt 39720
ttggtcactt gcagttgaaa gcaccctaac tgatatacac aaactatttt tagtgcgggt 39780
ctgtgtttgg cccttatgga agactttggg ctgagctgcc catggtgagg gagacggact 39840
tcgtgtcttc ttaccactct gtgtcctggt ggcttgtatg tgtctctgcc catgaggcaa 39900
aagcctaaag ggcaagggcg gattttctta atcggatgtt ccttgcacca agcacatagg 39960
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cgatgctgcc aggcctgctt gttatttgtc tgttggttgt aatctgcatg aatgcaaaga 40080
gccatcttta atcatgctgt ggaccagcct cttccaaggt attagcatga ctcccactac 40140
ctgctcagca tcctgcctat ggctaggact ttgtaattta catagatacg ctggggagac 40200
agggagccca tgaccaggac tctgacaccc tcactggagc tgtttctaca tctaccctgg 40260
gtggctgtct aggacattag gcgattcgtg tcttcctaaa gtccctctgt tgagagactt 40320
ctggctctgt tgagaggaca ctatttagca ttgtgagtcc ctgcaggctg ggggccagtg 40380
ggcattttcc ttctagatgt cccctctctt cttctggcct cccaggcttc ctgctcctga 40440
gactgtgaga actggcctgt gctgggctca ctgcagaaag accgtcgtct ccaaaggtct 40500
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ttcttctcct cttccccttg gccttttcat ctgtcagtgg aggacagatg tttgccccgt 40740
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gccaccttca agacggcctg tggccagtgc tgctttaaag ggagactcag agatgctttg 40860
ctgtgggtgg cgcgggaacc agcatgggga cagcagtgca gaggccttgg actcagagtg 40920
cgtgggcccc acggggcttc acggcgcctg tggctgtgca cttccagcct tatctgtgct 40980
gcatctcctc cacattcccc tgtggagctg atgtctagac agctatggaa ttaaatgctc 41040
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gaggctcacg gctgagaacg ggccccacct ggctctggaa tgagctgagg ggccccatgc 41160
tcctgcagcc agtggctcct gtggggagtt ggggcagtga cccccaaaag gcagtttgac 41220
ctcatggaga gccataaatc tggcctggtc accatctctg caacacatca ttccattgca 41280
aagatttctg cctgtgattg gaattctggg tgaacgtgta ctgggcatgt gggtctgaga 41340
gctgggaagc ctgttctctt gtttagccag gctgcccatg ggctgtgagg agtgccccca 41400
tctctgagcc tcagtttcca catctttaaa atggggggaa aatacagctc aactcctaag 41460
ggtgccgtga aagtactttg tcacctgcca ggcaaaggct cattcctttc acagaaatgc 41520
aaggtttaca atgtgagacc cctccctact tcgccgcatg tgtccgcttg cttttttctg 41580
tcttagggtt gccctacatg agctaggaaa tgtctgagtg aataaaaacg taaacgagat 41640
gatcactggt ggtgcccatt ggtgcagcct ttgcctaaat ggccactacg tagccacatt 41700
ttctcgtctg tgttcaggtg aggactggtt cctggggaga ctccctgggt tcacattatg 41760
ggtgtctatc ttgtcgaagc ccatatggtc acccaagtgt gactgaacca tggggtgctc 41820
tgggccccat ttttggcagc aggcagcatc ccctggaggc ctggccctcc ccaggagcat 41880
ggagagcagt gcccatggac aagcagtctg cagcctccat ctcctcctcc ctgcccgggg 41940
ggctcccccg ccccagcctc gcagcttctc caaaagtgtt tgtctccttg ccgcatcctc 42000
tgggcctgag ctcagatggt ggaaaagaag agctggaagg agagttgcct ttcggtctgt 42060
ctgccttctg aggtctcctg agacatacag gctgggcctg cctccctttc taggaggcgc 42120
cgatgggtgg taaggatagg ggataagtga gatgtgaatg aggatcacca cagcaagccc 42180
tgactcataa ctttttgatg ggttttcaat gtgtggtgaa gcaggcgcct gctgggcccc 42240
cttcctgagt tgagcttgat ctcctgcctc ctgtctgtct ccttaggcag ccaggctacc 42300
ctgctccagc aacctgtgcc accccgtccc tttacctgtc ccaagcccag ccccgaaggc 42360
ctcaaaggcc tggccttcca gccagtccag ggcctgaagg gatggcagtg tccctggtgg 42420
acctccccca gcatggcgta gcgcacatcc cagccctgcc tcctgccccg cctgcacgcc 42480
atgaatgctg aagtcatgcc tggcaggggc tgctggcccg ggcccagagt aaacaggctg 42540
cgctgagctt gctggtgtgc tgctggatgc tgatgagctt gaggagtgtg ggaagtcagt 42600
gtggggccga gtagggatgc tgcaggcctg catctccccc cagctgccct gcacgctcca 42660
gcctcaggca accccacagg gaaagggtca cccactgtca gggcagacct ttaccatggc 42720
tgggtgacat gggctggctg tgggaaggtg gttggtggtt ccccctgttg gatttgcaca 42780
ggcccagatg ctcacagcaa aactaacacc tagatgatgc ttataggagc cagcgggtaa 42840
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tatgttagtc ccattttcca gatgggaaaa ctgaggacct gagtggtcgt aagctcaggc 42960
ccctatctaa atcacacagc ctggccccag gtctatgctc ttgaccatgg acagtgctct 43020
cctggtcctc ttggtatctg tgatctgagg gaccttcctc ctcctcagtc ttgtatagtc 43080
agttttaggt cttagactct ttcttcacat ccctttcttc tttcgggagc tctctcaccc 43140
agcaccttcc ttatctagta tgtgttgggg gatatttgtg gcatgatgtg gcgctgtgta 43200
gtggatgaga gagtctgttt ttccggtttc agccccaggt ttcaatccct gctctgtctc 43260
aagtcaccca gactcttgga ggctcagttt cctcatctgt taaatgggca tggtggtcac 43320
ctcacctcat cagctggtgt ctgctccatc cctggtggag gagatggctc aagtaacccc 43380
ttggttccac ctgccccacc ccactggtcc cctggctctt tcttttttga gatagacaaa 43440
cgtgaggctc tggatttgca gttcccacga gggctggggt ggctgtctgc tttctgggtc 43500
tggtccatgt tttccagggc agctgctcgt tctaagtgaa caaaggctga aggaactcag 43560
gaggtttgct cggctccgag gatggcagag agggaagggg tgccgatgcc ttccctgata 43620
gagctgggga ggcccttctg tggttccccc cagctccttg gcttgggtga ccctggagct 43680
gacttctgtt ccattttgtt gtgcagagtt gtttggggct cctggctctg cctggccttt 43740
gtgggccact ggagatcagg gcttctggag ttggccaatt agcccgccca gcccagggag 43800
cacaggtgtc tgatggaggg ccttttcagg agaggagaga tggcccgcct gttgggtctt 43860
gctgtcttgg gtcctggagg ccttgctgtc cccatgctcc atccatgccc ttgaccaatg 43920
tggccctgta ctcagcatag gcatgcacct gagtcagtgc aattccctgt ccacagagca 43980
ccccaaatat tccaggcctc aggatgggtg tgcacatgat gagccgggca ggtttcacca 44040
cctgtagctt gggatccttc ccggggcttg gttctcgaag gctgccccag gcagtcacac 44100
cccaaaccct aaattcatgt tgtcttcctc tgtctcttgg cctcaaggtt tcagagtgag 44160
tctgtgctga tagcttcaag atgtgatgag accccgactt ggcctccagt tccctcccca 44220
cggtttcctt ggcgtgtgtg cggcttcagt ggtcactggc tcccacacag cttgtaatgt 44280
gtggattacg ggtgggaggg aagtccggtc ctgcctgcag caaagggatg ttagtcgtga 44340
gctcagttcc ccatcgggcc tggtgtttcc aaatggcccg gcactgtccc tgcttggttt 44400
tccatgatat ctgtgccttt acccatttgg ttaaattaaa caaattcagc aatgccagcc 44460
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gggagagttc gtggtcgcca tcggaagccc gttttccctt caaaacacag tcaccaccgg 44580
gatcgtgagc accacccagc gaggcggcaa agagctgggg ctccggaact cagacatgga 44640
ctacatccag accgacgcca tcatcaacgt gagcctctgt ccctctgcgg gtggggcttg 44700
gggcagggtt ttgccagagg agaggagtca gcatcggtct ctgacttcct tgtagtctgg 44760
gtgaaaggat ggaactagac caagccatgt ggatcctagt gccagcagca cgacaggggt 44820
cacacggcgg ggacagtgac actggagcag gtggacagcc agcctcctcc caggaggaag 44880
aagttgtgtt gggtgcttta gggtgattgc agttggcttc tgggcttcag agagaaaatc 44940
tccccattta cggcacctct aaaactttct gaaaattgtt aaggtcattt ttttccagca 45000
aaatattagg ttaatgggaa tgaatctcag agaagaatca tgccccacac tgtagacacc 45060
atgctcagga gacggccagg cagggacata gattggacca cgttatgaca caatttgtaa 45120
cctttccatt tctgtttaat tgcagtatgg aaactcggga ggcccgttag taaacctggt 45180
aacgtatttt aaacgttatg tcgtttgttt ttatttatgt acacactgtt tttgttttgt 45240
tttgtttttt gatgtagggg gtcttttcaa acataagctt gccaaagcgt gttatcaagt 45300
ttctttaaaa tgagctctgt gaatgtactg catgcttgca aatgacccta tggatctttt 45360
ctggaaagag taaggcaggc tggaggtgag ggttggaaat gttatgccag agagcacact 45420
tgtgtctcag agttacaggt aaacacagtg aaattcaggg ccaatgcagg agtaaggtga 45480
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ctgctgaagg agctggctgg gctcatacac actttctctt ggccaggaat cctcccttaa 45600
ggcctggctg gaatgaggag gagttaccca cccacaaaga tatcatttaa gtctaccctt 45660
aaatacttga gcagaaaaag tgaagcctta gaacatagac catcagcgct agagggcagc 45720
tccggggccg ttcatagagg gcagctccgg ggccatttgt aggggccgtc tttagtaagg 45780
ccttggcatc aggtactgac atcccagcac tcgtgggaag tgcgcacggg gcgatgtatc 45840
cccgcttggc agctttccct tcccagcaga ggggcagctg tgctcccagc tctgccctcc 45900
gcctcccccg cagcaccctg gggatggagt ggagacggct ttgcgggtaa tgaagcatga 45960
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aaatgagaga agcaggaagg tgtaggcagc cacctagagg actctgagcc tttggaaacg 46080
tattccttgt gaaacaggag caaataatat cgtgcatttt gaaactatct gtgcttaccg 46140
cgaggtgagc acccagtggc gacctggagt gtgtgcgatt cttccacagc tgcgcgtggc 46200
ctacgctgcc tgggtgtcct gatgcctctc tccctgctcc cccggggatc ccctccatgc 46260
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gggtgtacct gccggtaagc cttcacgatt cagcaagccg tgtccttctt gcctttcagg 46380
acggtgaagt gattggaatt aacactttga aagtgacagc tggaatctcc tttgcaatcc 46440
catctgataa gattaaaaag tttctcaccg agtcccatga ccgacaggcc aaaggtaggc 46500
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aattggggaa gggaaaagtg gcagccccta agactagcca agccgtcttc gatccagaag 46620
tgaacaggaa tgcacattac taaatccctg gtagaaggtc acagacattg cgccattttt 46680
gtcctccgat catgacaatg tcacttgagt cagtctaata tgtaccagac acgatcctag 46740
gtgatttctg tccattattt cactttattt atgtatgtta cttaattctt ttgccctatc 46800
agttaggaat tactagtccc attttgctga tgagaaaaca ggttcaggga gatcattcta 46860
caaacattta ttgcctaagt caagcaggga gcttggcagt agactgccca actggagcct 46920
ggggctccgc tgaggccttt gccggtgtgt gtttatgttc tgttggggga tgggaaggct 46980
gacagtaaat aatcagacac attagatact attagtgctc ccaagaaaac agatcagggt 47040
ggctggcaag ggagtgactg gacaggcagt tggtagagat ggtgtggcca ggaaatgcct 47100
cccaaactga ggtctgagtg aggaggagcc agcaggtagg gatgtggggg gaacactcca 47160
gaaggaaaga cagaggactc agcatagctg agtgagcaca aggcccctgg agtggcctgg 47220
gggccggagc acagtgacag catggaggtc tctggggtgg aaagctcgcc aaggccaagc 47280
aagcaggctc acagcgggcc atggtgaggg gcctgggttg catcctaacc gcatttaaga 47340
acagggaagt tcatgatctg attgatgtca ctgaaaggac actctgatgg ttggggggag 47400
tctgctggag gagttgctgg aagttgggga ccggagaagg agctctccca gtcatctgga 47460
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attccaggta tacatggggg tagcgcaagc ctggggaagg gccagctgtc aggatgaggc 47580
catgaggaat tgaggatcat gcccaggtat ctgaccatta actgaacgat gagactttcc 47640
tgaggtcccc cagaggggag gggtccaaac caggattcga gccgcaacct ccgtgtgccc 47700
ttctgtggcc cttcctgcaa cctgggggat tgggccccca gcccctggtg tccccagcat 47760
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tgcgtgtgtg tgtcttaaat tttaataaac ctgaacttca gaaggtgctc acgggcaccc 47940
ctgaaagaga aagcttatgc agccttaaga catctcagtt tctgcttata atgaagtagc 48000
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ccccgagctg gtggaactgc ggcctgtggt tggcaggctc acggcatcct ggtgttttaa 48420
cctggatgaa aaattctggt gtaatctcgt gagtcctggt agtatagact caactggcgt 48480
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gtgttcatta ctatgatgaa ttaatgattc actcactgtg aaagtattaa tatattttga 48600
tacacattat gaatgatggt ccctttcttc gcactccaga agatggagcc acttgtcaag 48660
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cccacgggag ccgggatggg acggggcgcg tttgtgcttt tctccaagtc agcacccaaa 52440
ggtcaatgca cagagacccc gggtgggtga acactggctt ctgaaatggc cagagttgac 52500
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<213> artificial
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<213> artificial
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<213> artificial
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gaagtacttt aatagctcaa 20
<210> 105
<211> 16
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Oligonucleotide nucleobase sequence motif
<400> 105
tactttaata gctcaa 16
<210> 106
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Oligonucleotide nucleobase sequence motif
<400> 106
aagtacttta atagctca 18
<210> 107
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Oligonucleotide nucleobase sequence motif
<400> 107
gaagtacttt aatagctca 19
<210> 108
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Oligonucleotide nucleobase sequence motif
<400> 108
agaagtactt taatagctc 19
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<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Oligonucleotide nucleobase sequence motif
<400> 109
aagaagtact ttaatagctc 20
<210> 110
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Oligonucleotide nucleobase sequence motif
<400> 110
gaagtacttt aatagct 17
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<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Oligonucleotide nucleobase sequence motif
<400> 111
taagaagtac tttaatagct 20
<210> 112
<211> 16
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Oligonucleotide nucleobase sequence motif
<400> 112
gcaatgtgta agaagt 16
<210> 113
<211> 275
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 113
gacagtcagc atttgtctcc tcctttaact gagtcatcat cttagtccaa ctaatgcagt 60
cgatacaatg cgtagataga agaagcccca cgggagccag gatgggactg gtcgtgtttg 120
tgcttttctc caagtcagca cccaaaggtc aatgcacaga gaccccgggt gggtgagcgc 180
tggcttctca aacggccgaa gttgcctctt ttaggaatct ctttggaatt gggagcacga 240
tgactctgag tttgagctat taaagtactt cttac 275
<210> 114
<211> 282
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 114
gacagtcagc atttgtctcc tcctttaact gagtcatcat cttagtccaa ctaatgcagt 60
cgatacaatg cgtagataga agaagcccca cgggagccag gatgggactg gtcgtgtttg 120
tgcttttctc caagtcagca cccaaaggtc aatgcacaga gaccccgggt gggtgagcgc 180
tggcttctca aacggccgaa gttgcctctt ttaggaatct ctttggaatt gggagcacga 240
tgactctgag tttgagctat taaagtactt cttacacatt gc 282
<210> 115
<211> 266
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 115
gacagtcagc atttgtctcc tcctttaact gagtcatcat cttagtccaa ctaatgcagt 60
cgatacaatg cgtagataga agaagcccca cgggagccag gatgggactg gtcgtgtttg 120
tgcttttctc caagtcagca cccaaaggtc aatgcacaga gaccccgggt gggtgagcgc 180
tggcttctca aacggccgaa gttgcctctt ttaggaatct ctttggaatt gggagcacga 240
tgactctgag tttgagctat taaagt 266
<210> 116
<211> 235
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 116
caactaatgc agtcgataca atgcgtagat agaagaagcc ccacgggagc caggatggga 60
ctggtcgtgt ttgtgctttt ctccaagtca gcacccaaag gtcaatgcac agagaccccg 120
ggtgggtgag cgctggcttc tcaaacggcc gaagttgcct cttttaggaa tctctttgga 180
attgggagca cgatgactct gagtttgagc tattaaagta cttcttacac attgc 235
<210> 117
<211> 229
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 117
caactaatgc agtcgataca atgcgtagat agaagaagcc ccacgggagc caggatggga 60
ctggtcgtgt ttgtgctttt ctccaagtca gcacccaaag gtcaatgcac agagaccccg 120
ggtgggtgag cgctggcttc tcaaacggcc gaagttgcct cttttaggaa tctctttgga 180
attgggagca cgatgactct gagtttgagc tattaaagtt acttcttac 229
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo Sapies
<400> 118
cttcttctat ctacgcattg 20
<210> 119
<211> 275
<212> DNA
<213> Homo Sapies
<400> 119
gtaagaagta ctttaatagc tcaaactcag agtcatcgtg ctcccaattc caaagagatt 60
cctaaaagag gcaacttcgg ccgtttgaga agccagcgct cacccacccg gggtctctgt 120
gcattgacct ttgggtgctg acttggagaa aagcacaaac acgaccagtc ccatcctggc 180
tcccgtgggg cttcttctat ctacgcattg tatcgactgc attagttgga ctaagatgat 240
gactcagtta aaggaggaga caaatgctga ctgtc 275
<210> 120
<211> 282
<212> DNA
<213> Homo Sapies
<400> 120
gcaatgtgta agaagtactt taatagctca aactcagagt catcgtgctc ccaattccaa 60
agagattcct aaaagaggca acttcggccg tttgagaagc cagcgctcac ccacccgggg 120
tctctgtgca ttgacctttg ggtgctgact tggagaaaag cacaaacacg accagtccca 180
tcctggctcc cgtggggctt cttctatcta cgcattgtat cgactgcatt agttggacta 240
agatgatgac tcagttaaag gaggagacaa atgctgactg tc 282
<210> 121
<211> 266
<212> DNA
<213> Homo Sapies
<400> 121
actttaatag ctcaaactca gagtcatcgt gctcccaatt ccaaagagat tcctaaaaga 60
ggcaacttcg gccgtttgag aagccagcgc tcacccaccc ggggtctctg tgcattgacc 120
tttgggtgct gacttggaga aaagcacaaa cacgaccagt cccatcctgg ctcccgtggg 180
gcttcttcta tctacgcatt gtatcgactg cattagttgg actaagatga tgactcagtt 240
aaaggaggag acaaatgctg actgtc 266
<210> 122
<211> 235
<212> DNA
<213> Homo Sapies
<400> 122
gcaatgtgta agaagtactt taatagctca aactcagagt catcgtgctc ccaattccaa 60
agagattcct aaaagaggca acttcggccg tttgagaagc cagcgctcac ccacccgggg 120
tctctgtgca ttgacctttg ggtgctgact tggagaaaag cacaaacacg accagtccca 180
tcctggctcc cgtggggctt cttctatcta cgcattgtat cgactgcatt agttg 235
<210> 123
<211> 229
<212> DNA
<213> Homo Sapies
<400> 123
gtaagaagta actttaatag ctcaaactca gagtcatcgt gctcccaatt ccaaagagat 60
tcctaaaaga ggcaacttcg gccgtttgag aagccagcgc tcacccaccc ggggtctctg 120
tgcattgacc tttgggtgct gacttggaga aaagcacaaa cacgaccagt cccatcctgg 180
ctcccgtggg gcttcttcta tctacgcatt gtatcgactg cattagttg 229
<210> 124
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 124
atttgtctcc tcctttaact 20
<210> 125
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 125
ttgtctcctc ctttaactga 20
<210> 126
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 126
tgtctcctcc tttaactgag 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 127
gtctcctcct ttaactgag 19
<210> 128
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 128
gtctcctcct ttaactgagt 20
<210> 129
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 129
tctcctcctt taactgagt 19
<210> 130
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 130
ctcctccttt aactgagt 18
<210> 131
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 131
cctcctttaa ctgagtcatc 20
<210> 132
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 132
tcctttaact gagtcatcat 20
<210> 133
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 133
cctttaactg agtcatca 18
<210> 134
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 134
cctttaactg agtcatcatc 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 135
ctttaactga gtcatcatc 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 136
ccaactaatg cagtcgata 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 137
ccaactaatg cagtcgatac 20
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<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 138
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<211> 16
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 139
caactaatgc agtcga 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 140
caactaatgc agtcga 16
<210> 141
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 141
caactaatgc agtcgata 18
<210> 142
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 142
caactaatgc agtcgatac 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 143
caactaatgc agtcgataca 20
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<211> 16
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 144
aactaatgca gtcgat 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 145
aactaatgca gtcgat 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 146
aactaatgca gtcgat 16
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<211> 17
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 147
aactaatgca gtcgata 17
<210> 148
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 148
aactaatgca gtcgatac 18
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<211> 19
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 149
aactaatgca gtcgataca 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 150
aactaatgca gtcgatacaa 20
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<211> 16
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 151
actaatgcag tcgata 16
<210> 152
<211> 16
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 152
actaatgcag tcgata 16
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<211> 17
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 153
actaatgcag tcgatac 17
<210> 154
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 154
actaatgcag tcgataca 18
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<211> 16
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 155
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<211> 16
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 156
ctaatgcagt cgatac 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 157
ctaatgcagt cgatac 16
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<211> 17
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 158
ctaatgcagt cgataca 17
<210> 159
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo Sapies
<400> 159
ctaatgcagt cgatacaa 18
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<211> 19
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 160
ctaatgcagt cgatacaat 19
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<211> 16
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 161
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<211> 16
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 162
taatgcagtc gataca 16
<210> 163
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 163
taatgcagtc gatacaat 18
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<211> 16
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 164
aatgcagtcg atacaa 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 165
aatgcagtcg atacaa 16
<210> 166
<211> 16
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 166
atgcagtcga tacaat 16
<210> 167
<211> 16
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 167
atgcagtcga tacaat 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 168
atgcagtcga tacaat 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 169
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<211> 16
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 170
agtcgataca atgcgt 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 171
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<211> 16
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 172
gtcgatacaa tgcgta 16
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 173
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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gtcgatacaa tgcgtagat 19
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
<400> 178
tcgatacaat gcgtag 16
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<211> 19
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<213> Homo sapiens
<400> 179
tcgatacaat gcgtagata 19
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<211> 16
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<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 181
cgatacaatg cgtaga 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 182
cgatacaatg cgtaga 16
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<211> 17
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 183
cgatacaatg cgtagat 17
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<211> 18
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 184
cgatacaatg cgtagata 18
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<211> 20
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<213> Homo sapiens
<400> 185
cgatacaatg cgtagataga 20
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<211> 16
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<213> Homo sapiens
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gatacaatgc gtagat 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 187
gatacaatgc gtagat 16
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<211> 17
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 188
gatacaatgc gtagata 17
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<211> 18
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 189
gatacaatgc gtagatag 18
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<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 190
gatacaatgc gtagataga 19
<210> 191
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 191
gatacaatgc gtagatagaa 20
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<211> 16
<212> DNA
<213> Homo sapiens
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atacaatgcg tagata 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Homo sapiens
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atacaatgcg tagata 16
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<211> 17
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 194
atacaatgcg tagatag 17
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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atacaatgcg tagataga 18
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<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
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atacaatgcg tagatagaa 19
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<211> 16
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 197
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<211> 16
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 198
tacaatgcgt agatag 16
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<211> 17
<212> DNA
<213> Homo sapiens
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tacaatgcgt agataga 17
<210> 200
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 200
tacaatgcgt agatagaa 18
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<211> 17
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 201
acaatgcgta gatagaa 17
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<211> 19
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<400> 202
acaatgcgta gatagaaga 19
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<213> Homo sapiens
<400> 203
acaatgcgta gatagaagaa 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
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caatgcgtag atagaagaa 19
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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caatgcgtag atagaa 16
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aatgcgtaga tagaaga 17
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<213> Homo sapiens
<400> 208
aatgcgtaga tagaagaa 18
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<211> 16
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<213> Homo sapiens
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atgcgtagat agaaga 16
<210> 210
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<213> Homo sapiens
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atgcgtagat agaagaa 17
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<211> 18
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Claims (15)
- 하기 식의 올리고뉴클레오티드:
TsAs mCsTststsasastsasgscsTs mCsAsA(서열번호 86)
상기 식에서,
대문자는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드이고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드이고, 아래첨자 s는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기이고, mC는 5 메틸 사이토신 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드이다. - 제1항 또는 제2항의 올리고뉴클레오티드의 약학적으로 허용되는 염.
- 제3항에 있어서,
칼륨 염인 약학적으로 허용되는 염. - 제4항에 있어서,
나트륨 염인 약학적으로 허용되는 염. - 하기 식의 올리고뉴클레오티드 및 약학적으로 허용되는 희석제, 담체, 염 및/또는 보조제를 포함하는 약학 조성물:
TsAs mCsTststsasastsasgscsTs mCsAsA(서열번호 86)
상기 식에서,
대문자는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드이고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드이고, 아래첨자 s는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기이고, mC는 5 메틸 사이토신 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드이다. - 제6항에 있어서,
약학적으로 허용되는 희석제를 포함하는 약학 조성물. - 제7항에 있어서,
약학적으로 허용되는 희석제가 포스페이트 완충된 염수인, 약학 조성물. - 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
올리고뉴클레오티드가 약학적으로 허용되는 염의 형태인, 약학 조성물. - 제9항에 있어서,
약학적으로 허용되는 염이 나트륨 염인, 약학 조성물. - 제1항 또는 제2항의 올리고뉴클레오티드 또는 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 약학적으로 허용되는 염, 및 상기 올리고뉴클레오티드에 공유결합으로 부착된 하나 이상의 접합체 모이어티를 포함하는 접합체.
- 약제에서 사용하기 위한 제1항 또는 제2항의 올리고뉴클레오티드, 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 약학적으로 허용되는 염, 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항의 약학 조성물 또는 제11항의 접합체의 용도.
- 황반 변성의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 제1항 또는 제2항의 올리고뉴클레오티드, 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 약학적으로 허용되는 염, 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항의 약학 조성물 또는 제11항의 접합체의 용도.
- 제13항에 있어서,
습성 AMD, 건성 AMD, 지도모양위축, 중기 dAMD 또는 당뇨병성 망막증의 치료를 위한 것인 용도. - 제14항에 있어서,
지도모양위축 또는 중기 dAMD의 치료를 위한 것인 용도.
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